KR20140031168A - 세균 리보핵산 세포벽 조성물 및 이들의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

세균 리보핵산 세포벽 조성물 및 이들의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 및 세포벽을 함유하는 신규한 마이코박테리아 조성물, 및 이들 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 이들 조성물은 면역 자극 및 항암 활성을 갖는다. 본 발명은 또한 마이코박테리아의 배양을 위한 합성 배지에 관한 것이다.

Description

세균 리보핵산 세포벽 조성물 및 이들의 제조 및 사용 방법{BACTERIAL RIBONUCLEIC ACID CELL WALL COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND USING THEM}
본 발명은 세균 RNA 및 세균 세포벽을 포함하는 신규 조성물 및 이들 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 이들 조성물은 면역 자극 및 항암 활성을 갖는다.
암의 치료는 임상 및 수의학 의약에 대한 지속적인 문제가 되고 있다. 오늘날 이용가능한 치료 요법(regimen)들은 수술, 방사선, 화학치료요법, 면역치료요법(자가 및 이종 세포 치료요법 포함) 또는 이의 조합을 포함한다.
수술은, 종양 조직이 인식되지 않고 제거되지 않음으로 인하여 종종 실패한다. 방사선 및 화학치료요법 또한 흔히 실패하며, 당해 치료들의 부작용들은 환자들에 대한 삶의 질을 종종 저하시킨다. 수술 및 화학치료요법은 면역계의 유의적이고 종종 비-특이적인 억제와 관련되어 있다(참조: Hammer 등, Eur. Surg. Res., 1992 24:133-137; Joos and Tam, Proc. Am. Thorac. Soc., 2005 2:445-448). 이러한 면역 억제는 고-투여량의 전신 조사(irradiation)를 겪고 있는 개인들에 있어서 감염성 합병증들의 공지된 높은 비율에 의해 예시되는 바와 같은, 기회 감염들의 발생과 흔히 관련되어 있다(참조: Gil 등, Infection, 2007 35:421-427). 방사선, 수술 및 화학치료요법은 백혈구감소증, 호중구감소증, 혈소판감소증 및/또는 빈혈증과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 다중계통 조혈 및 골수 억제(myeloid suppression)[골수억제(myelosuppression)]와 추가로 관련되어 있다(참조: Montoya. J. Infus. Nurs. 2007 30:168-172). 이들 상태들은 환자들에 있어 생명을 위협할 수 있다. 화학치료요법은 상이한 부류들의 약물들을 포괄할 수 있는(다중약물 내성), 내성의 존재 또는 내성의 후속적인 발달에 의해 흔히 절충된다.
암에 대한 면역치료요법은 다수 해 동안 사용되어 왔다. 제1의 면역 치료들 중 하나는 혼합된 세균 백신[콜리 백신(Coley's vaccine)]이었으며, 이의 활성 성분은 세균 지다당류이다. 규제 기관들은 원치않는 및 흔한 독성 효과들로 인하여 약제학적 제제들로부터 지다당류의 존재를 제한하거나 제거하기 위해 노력해왔음을 주목하여야 한다. 보다 최근에, 조사된 악성 흑색종 세포의 혼합물들을 사용하여, 악성 흑색종 환자들에서 면역 반응들을 유도시켜 왔으며, 이는 몇몇 환자들에 있어 생존을 증가시켰다(참조: Morton, 등 Ann. Surg. 1992, 216:463-482). 면역 치료요법(immune therapy)[면역치료요법(immunotherapy)]에 의해 제공된 한가지 중요한 잇점은, 이것이 수술, 방사선 또는 화학치료요법의 부작용들과 일반적으로 관련되어 있지 않다는 것이다. 암 환자들에서 수지 세포 면역치료요법을 사용한 3가지 연구들에서, 부작용들이 최소이거나 없음이 보고되었다[참조: Hsu, 등 Nature Medicine, 1996 2:52-58; Murphy, 등 The Prostate, 1996 29:371-380; Nestle, 등 Nature Medicine, 1998, 4(3):328-332].
마이코박테리아 세포 벽은 숙주 면역 방어 메카니즘들[병원체 관련된 분자 패턴 수용체들 - PAMP들과의 상호작용을 통한 선천능(innate), 및 면역원성 분자 종들의 존재를 통한 후천능(acquired)]을 자극하는 것으로 알려져 있다. 전체의 실행가능한 마이코박테리아를 사용한 면역치료요법이 방광암의 치료시 임상적으로 사용된다. 마이코박테리움 보비스(마이코박테리움 보비스)의 약독화된 균주인, 마이코박테리움 바실러스 칼메테-구에린(mycobacterium bacillus Calmette-Guerin: BCG)은 방광암을 지닌 개인들의 방광내에, 여기서 가능하게는 및 바람직하게는 수술에 의한 종양 제거 후 설정되는 보조제 속에서 상기 개인들의 방광내에 반복적으로 주입된다(예를 들면, the European Association of Urology Guidelines 2007 edition, 페이지 8-9에 기술된 바와 같음). 그러나, 이의 용도는 이의 실행가능한 특성(참조: Koya, 등 J. Urology 2006, 175:2004-2010) 및 또한 특히 치료 재발을 경험하는 환자들에서 반응율의 흔히 낮은 임상 효능 및 기간과 관련된 광범위한 부작용들과 관련되어 있다(참조: Witjes and Hendricksen. Eur. Urol. 2008, 53:24-26). 다른 암들의 치료를 위한 이의 용도는, 이것이 살아있는 마이코박테리아를 함유하고 있기 때문에 사용이 금지되어 있고, 치명적인 전신 감염들을 유발할 수 있다(참조: Orifice, 등 Tumori 1978, 64:437-443). 완전하지만 불활성화된 마이코박테리아를 사용한 암의 면역치료요법이 마이코박테리움 마이코박테리움 박카에(mycobacterium vaccae)를 사용하여 시도되어 왔지만 이의 사용 후 명확한 장기간 생존은 지금까지 임상 연구들에서 확인되지 않고 있다(참조: Stanford 등, Eur. J. Cancer 2008, 44:224-227). 생존하거나 비활성화되어 있거나에 상관없이, 완전한 마이코박테리아가 암의 치료를 위한 면역치료요법의 가장 효과적인 형태를 나타내지 않는다는 것은 명백하다.
세균 세포벽과 세균 추출물들을 이용하는 면역치료요법은 동물 종양 모델들, 암으로 고생하는 환자들에서(참조: 미국 특허 제4,503,048호, 제5,759,554호 및 제6,326,357호), 및 세균 및 바이러스 감염들과 같은, 감염성 질병들에 대한 치료들로서(참조: 미국 특허 제3,172,815호 및 제4,744,984호) 집중적으로 평가되어 왔다.
면역 자극성 및 항암 활성을 지닌 마이코박테리아 세포 벽 조성물(예를 들면, 미국 특허 제4,503,048호, 제5,759,554호 및 제6,329,347호 또는 Ribi 등, J. Bacteriol. 1965, 91:975-983에 기술된 바와 같음)은, 생물학적 시약들 및 물질들, 화학적 시약들, 용매들 또는 희석제들 및 효소적 치료들이 유해한 화학물질 및 외부 단백질 오염에 대한 잠재성과 함께, 이들의 제조에 요구된다는 단점으로 고생한다. 더우기, 고도로 정제된 마이코박테리아 세포 벽(집중적인 화학적 및 효소적 처리)을 사용한 최적의 항암 활성을 수득하기 위하여 오일 유제(oil emulsion)로서의 제형이 요요구된다는 것이 보고되어 있다(참조: Yarkoni and Rapp, Cancer Res., 1979 39:535-7). 마이코박테리아 세포 벽을 함유하는 오일 유액들은 흔히 생리학적으로 불안정하고 재생가능하게 제조하기가 어려우며, 과민감성(hypersensitivity) 반응들을 유도하는 잘 공지된 잠재성으로 인하여 수령자들에게 독성일 수 있다. 면역치료학적 및 항암 활성 둘다를 지니고 오일의 존재에 의존하지 않는 생물학적으로 활성인 복합화된 DNA를 함유하는 마이코박테리아 세포벽이 또한 기술되어 있으나(참조: 미국 특허 제6,326,357호), 이들은 유해한 화학물질 및 외부 단백질 오염 가능성과 함께, 이들의 제조를 위해 화학적 및 효소적 처리가 요구된다는 단점으로 다시 고생한다. 또한, 이러한 조성물을 사용하여 면역치료학적 활성 또는 항암 활성을 우선적으로 최적화하는 것이 가능한지 입증되지 않고 있다.
미생물들의 파괴가 작은 샘플 용적들 및 평방인치(PSI, 276 내지 317mPa와 동일함)당 40,000 내지 45,000 파운드의 고압에서의 냉장된 가압 세포 [예를 들면, 소르발 가압 세포(Sorvall pressure cell)]을 사용하여 달성될 수 있다는 사실은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 인식되어 있다(참조: Ribi 등, J. Bacterial., 1966, 91:975-983). 이러한 공정들은 시간 소모적이고, 비효율적이며 저용적이고, 이러한 유형의 장치의 현재 이용불가능성으로 인하여 또한 방해되고 있다. 고압 균질화를 사용하는 보다 효율적인 공정들이 유전적으로 가공된 미생물들(참조: Peternel and Komel: Isolation of biologically active nanomaterial [inclusion bodies] from bacterial cells. Microbial Cell Factories 2010 9:66)로부터의 단백질들(봉입체들로서)의 분리를 위해 기술되어 왔다. 그러나, 그람-양성 유기체들은 이들의 펩티도글리칸 함량 및 구조로 인하여 이러한 공정들에 대해 내성이 있음이 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식되어 있다(참조: Diels and Michaels: High pressure homogenization as a non-thermal technique for the inactivation of microorganisms. Crit. Rev. Microbiol., 2006; 32:201-216). 다수의 균질화 주기들을 최소화시키기 위한 기술들의 사용이 당해 분야의 숙련가들에 의해 또한 교시되어 있다(참조: Bailey 등, Improved homogenization of recombinant Escherichia coli following pretreatment with guanidinium chloride: Biotech. Prog., 1995; 11:533-539). 이러한 과정들의 사용은 실제로 세포 벽 분획들을 보존하는 것이 아닌, 제거하기 위해 명확하게 설계되어 있다. 고압 파괴 기술들을 사용하는 DNA와 같은 핵산들의 존재는 보존하는 것이 아닌 제거하기 위한 오염 물질로 또한 교시되어 있다(참조: Rathore 등, Analysis for residual host cell proteins and DNA in process streams of a recombinant protein product expressed in Escherichia coli cells: J. Pharm. Biomed. Anal., 2003; 32:1199-1211). 필요한 것은 확장가능하고, 수 mL로부터 수-리터 용적들의 범위인 작업 용적들을 사용하며, 새로운 세균 핵산 및 세포 벽 조성물의 효율적인 생산을 초래하는 신규 세균 핵산 조성물의 제조를 위한 신규 과정들이다.
마이코박테리아 세포 벽 및 이의 성분들은 대식구들, 단핵구들 및 수지 세포를 자극하고 활성화시켜 면역 시스템의 반응성 세포를 개시하고, 가속화시키며, 증폭시키고 자극함으로써 면역 자극 효과가 달성되도록 하는 생활성 분자들을 생산할 수 있다. 이들 생활성 분자들은 조혈 및 골수 성장 인자, 사이토킨들 및 케모킨들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
성장 인자는 세포 증식 및/또는 분화의 활성화의 주요 결과와 더불어, 세포 표면 상의 수용체들과 결합하는 단백질들이다. 사이토킨들은 유일한 계열의 조절 단백질들이다. 백혈구와 같지만 이에 한정되지 않는 면역계의 세포로부터 주로 분비되어 세포내 매개인자들로서 작용하여, 사이토킨들은 포식세포의 활성화 뿐만 아니라 체액 및 세포 면역 반응도 자극한다. 백혈구들로부터 분비되는 사이토킨들은 림프구들이라고 명명되는 반면, 단핵구들 또는 대식구들에 의해 분비된 것들은 모노킨들로 불린다. 많은 림프구들은 백혈구들에 의해서만 분비되는 것이 아니라 백혈구들의 세포 반응들에 영향을 미칠 수도 있기 때문에, 인터루킨들(IL)이라고 공지되어 있다. 케모킨들은 특히 감염에 대한 반응[주화성(chemotaxis)으로 명명된 공정]시 백혈구들을 끌어들여 활성화시키는 능력을 지닌 사이토킨들의 부류이다. 이들은 공유된 시스테인 모티프(motif)내 변형들에 따라서 적어도 3개의 구조적 가지들: c(케모킨들, c), cc(케모킨들, cc), 및 cxc(케모킨들, cxc)로 나누어질 수 있다(참조: Johrer 등 Exp. Opin. Biol. Ther. 2008 8:269-290.). 이들 조혈 및 골수 성장 인자를 생산하는데 관여하는 면역계의 세포의 생산시 화학치료제들 또는 방사선 치료요법의 유해한 효과들은 기회 감염들에 대해 증가된 민감성을 초래한다.
암(이중에는 100개 이상의 질병들이 존재한다)은 조절되지 않은 세포 분열, 세포자멸사(apoptosis)의 부족 또는 결핍성 세포자멸사, 또는 이들 둘다의 조합으로부터 초래하는, 비정형 세포의 비정상적인 순(net) 축적물이다. Fas, TNFR1 및 p53/p21와 같지만, 그러나 이에 한정되지 않는 세포자멸사-관련 유전자들에 있어서 돌연변이들은 각각 암들의 발병과 연관되어 왔다(참조: Levine, A. Cell 88:323-331, 1997; Fisher, D. Cell 78:529-542, 1994). 비정상적인 세포자멸사는 암들의 발병뿐 아니라, 많은 항암 치료요법들에 대한 암의 내성 경향성에 있어서도 중요하다.
세포자멸사 유도에 대한 내성은 치료 실패들의 유의적인 일부분을 설명할 공산이 있는, 다중 약물 내성(MDR)의 중요한 범주로 드러났다. 화학치료제의 구조적으로 및 기능적으로 관련되지 않은 부류들에 대한 MDR인 동시 내성은 선천능 및 후천능 둘다일 수 있다. 즉, 일부 암들은 치료요법에 결코 반응하지 않는 반면, 치료요법에 대해 초기에 민감성인 다른 암들은 내성 클론들의 선택을 통해 약물 내성을 후속적으로 발달시킨다. 화학치료제들은 주로 이들의 치료 효과에 대해 암 세포내에서 세포자멸사의 유도에 주로 의존하므로, 화학치료제들의 효능을 약화시키는 약물 내성은 직접 또는 간접적으로 감소된 세포자멸사를 초래하고 일반적으로 다양한 암들에서 불량한 임상 예후와 관련되어 있다.
선행 기술의 항암제들은 임상 적용들에 거의 적절하지 않은 것으로 입증되어 왔다. 많은 이들 제제들은 비효율적이거나(참조: Bischoff 등 Science 274:373-376, 1996) 독성이 있으며, 유의적인 부작용들을 가져서(참조: Lamm 등 Journal of Urology 153:1444-1450, 1995), 약물 내성 또는 면역 민감화 및 과민감성 반응들의 발달을 초래하고, 수령자를 약화시킨다.
따라서, 사이토킨들, 케모킨들 및 조혈 및 골수 성장 인자를 생산하고, 암 세포의 증식을 억제하며 암 세포내에서 세포자멸사를 유도하기 위한 면역계의 반응성 세포를 자극하는 신규한 치료학적 조성물에 대한 필요성이 존재한다. 이들 치료학적 조성물은 이들 자체로서 항암제로 유용하여야 하며 다른 항암제들과 관련하여 보조 활성을 가져야 한다. 이러한 치료학적 조성물은 암, 수술, 방사선 또는 화학치료요법과 관련된 골수억제를 예방하거나 치료하는데 유용하여야 한다. 또한, 이러한 치료학적 조성물은 제조하기가 단순하고 비교적 저렴하여야 하며, 이의 활성은 제제들 중에서 재생가능하여야 하고, 이의 활성은 시간에 걸쳐 안정하게 남아야 하며, 암 세포에서 이의 효과들은 최소의 부정적인 반응성 및 독성과 관련된 투여량 요법들로 달성될 수 있어야 한다. 또한, 이들의 제조시 사용된 효소들 또는 화학물질들의 존재하에서 초래되지 않고 효율적인 신규한 치료학적 조성물을 제조하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
또한 자가면역 질환들, 염증성 또는 감염성 질병, 골수억제 또는 조혈 및 골수 이상들을 치료하거나, 예방하거나, 약화시키거나 완화시키는 신규한 치료학적 조성물에 대한 필요성이 존재한다. 치료학적 조성물은 다른 치료제들과 함께 보조제로서 유용하여야 한다. 더우기, 이러한 치료학적 조성물은 제조하기가 간단하고 비교적 저렴하여야 하며, 이의 활성은 제제들 중에서 재생가능하여야 하고, 이의 활성은 시간에 걸쳐 안정하게 잔류하여야 하며, 이의 효과들은 최소의 독성과 관련된 투여량 요법들로 달성될 수 있어야 한다.
발명의 요약
본 발명은 세균 또는 마이코박테리아로부터 기원한 리보핵산(RNA) 및 세포 벽(본원에서 RNC로 정의됨)을 포함하는 신규 조성물을 제공함으로써 상기 요구들을 만족시킨다. 본 발명은 세균 리보핵산(RNA) 및 세균 세포벽(BRNC로 정의됨)을 포함하는 신규 조성물 및 이들 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공함으로써 상기 필요성들을 충족시킨다. 본 발명은 또한 마이코박테리아 RNA 및 마이코박테리아 세포 벽(MRNC로 정의됨)를 포함하는 신규 조성물 및 이들 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공함으로써 상기 필요성들을 충족시킨다. 이들 신규 조성물은 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태인 세균 또는 마이코박테리아 RNA를 포함하며, 여기서 RNA는 단일가닥(ss), 이중가닥(ds), 또는 단일가닥-이중가닥 하이브리드 가닥(hs)로서 존재하고, 세균 또는 마이코박테리아 및 세균 또는 마이코박테리아 세포 벽로부터 분리되며, 여기서, RNA는 약제학적으로 허용되는 비히클로 제형화되거나 약제학적으로 허용되는 담체 시스템으로 복합체화(여기서 용어 복합체는 2개 이상의 분자 종들의 화학적 연합을 기술하기 위해 사용된다)된다. 비록 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 약제학적 담체 시스템들이 사용될 수 있다고 해도, 하나의 양태에서 담체 시스템은 세균 세포 벽 또는 마이코박테리아 세포 벽을 기초로 한다. 본 발명의 조성물은 완전한 세균 또는 마이코박테리아 세포를 또한 함유할 수 있으며, 이의 함량은 목적하는 치료학적 의도에 따라 선택된다.
본 발명의 조성물은 항암 활성을 소유한다. 본 발명의 조성물은 또한 면역계 자극 활성을 함유한다. 본 발명의 조성물은 다른 치료학적 양식에 대해 보조제들로서 또한 작용한다.
3개의 상이한 명칭들이 본 출원에서 이들 신규 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 첫째로, 용어 세균 RNA 조성물(BRNC)는 세균의 상이한 종들로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 일반적으로 사용된다. BRNC는 본원에 기재된 방법을 사용하여 상이한 그람-음성 또는 그람-양성 세균으로부터 제조될 수 있다. 둘째로, 용어 마이코박테리아 RNA 조성물(MRNC)은 상이한 마이코박테리아로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 상이한 양태들에서, MRNC는 어떠한 마이코막테이움으로부터도 제조될 수 있다. 셋째로, 다른 양태들에서, 구체적인 마이코박테리아 종들, 마이코박테리아 복합체들 또는 마이코박테리아 균주들을 사용하여 MRNC를 제조한다. 이들 그러나 이에 한정되지 않는 예들은 본원에 기재된 방법을 사용한 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium)[일반적으로 MAP로 명명된 아종 파라투베르쿨로시스(paratuberculosis) 포함], 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG, 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis ), 또는 마이코박테리움 박카에(Mycobacterium vaccae)이다. 본원에 기술된 조성물을 제조하는 방법이 상세한 설명 및 실시예들에 기술된 것들 이외에 마이코박테리아로부터 MRNC의 제조에 적용가능하다는 것은 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 것이다.
용어 마이코박테리아 RNA 조성물(MpRNC)은 마이코박테리움 플레이로부터 제조된 RNA 및 세포 벽을 포함하는 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 용어 마이코박테리움 보비스 균주 BCG RNA 조성물(MbRNC), 마이코박테리움 스메그마티스 RNA 조성물(MsRNC), 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis: MAP) RNA 조성물(MapRNC) 및 마이코박테리움 박카에 RNA 조성물(MvRNC)은 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 및 마이코박테리움 박카에 각각으로부터 제조된 RNA 및 세포벽을 포함하는 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 각각의 조성물, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC에서, RNA는 올리고리보뉴클레오타이드과 폴리리보뉴클레오타이드의 효율적인 생산을 초래하는 과정을 사용하여 마이코박테리아로부터 분리된다.
다른 양태에서, 각각의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC는 또한 상이한 양의 완전한 마이코박테리아 세포를 함유할 수 있다. 완전한 세포는 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC 속에 대략 0 내지 99 중량%, 0.05 내지 95 중량%, 0.07 내지 50 중량%, 0.1 내지 20 중량% 또는 0.19 내지 19 중량%의 양, 또는 이들 범위들 중 어느 것 이내의 양, 또는 0.75 중량% 미만 또는 0.2 중량% 미만의 양으로 존재할 수 있다.
다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 길이가 2 내지 4000 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 RNA 성분(이는 총 핵산 함량의 대략 30% 내지 100%의 범위일 수 있다)을 소유한다. 다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 길이가 2 내지 150개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 성분(총 핵산 함량의 대략 30 내지 100%)을 소유한다. 여전히 다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 길이가 150 초과, 또는 151 내지 4000개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 성분(총 핵산 함량의 대략 30 내지 100%)을 소유한다. 다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 대부분 길이가 20 내지 40개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 성분(총 핵산 함량의 대략 30 내지 100%)을 소유한다.
본 조성물의 항암 활성은, 완전한 마이코박테리아 세포의 최소 함량이 존재하는 경우 최대가 된다. 면역 자극 활성은, 완전한 마이코박테리아 세포의 함량이 5 내지 50% w/w의 범위인 경우 최대이다. 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포의 바람직한 함량은 실시예들에 상세히 설명한 바와 같이 제조 공정을 조절하거나, 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC에 가함으로써 달성할 수 있다. MRNC는 하나의 마이코박테리아 종들, 균주, 아-균주 또는 복합체로부터 제조된 조성물로서 단독으로, 또는 다른 마이코박테리아 종들, 균주, 아-균주 또는 복합체로부터의 MRNC와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, MpRNC 및 MvRNC의 조합은 면역 자극 및 사이토킨 유도를 위한 최적의 NOD2 및 TLR2 활성화를 제공할 것이다. 유사하게, MpRNC 및 MvRNC의 조합은 최적의 항암 활성 및 면역 자극을 제공할 것이다.
이들 신규 조성물은 면역 자극성, 항암 및 조혈 및 골수 줄기 세포 성장 인자 자극 활성을 소유한다. 선행 기술의 제제들과는 대조적으로, 이들 신규 조성물은 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드[단일가닥(ss), 이중가닥(ds) 또는 이들의 혼합물들과 같지만 이에 한정되지 않는 것과 같음]를 함유하며, 의도된 적용에 적절한 수준들의 완전한 마이코박테리아를 함유한다. 또한, 선행 기술과는 대조적으로, 합성 제제들의 조합들이 요구되는 경우(참조: Uehara 등, Muramyldipeptide and diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides in combination with chemically synthesized Toll-like receptor agonists synergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2- and NOD-dependent manner, respectively, in human monocytic cells in culture: Cell. Microbiol., 2005; 7:53-61), 이들 신규 조성물은 뉴클레오타이드-결합 올리고머화 도메인(nucleotide-binding oligomerization domain) 2(NOD2) 및 톨-유사 수용체(Toll-like receptor) 2(TLR2) 수용체들 둘다를 활성화시키는 능력을 가짐으로써 면역계의 자극에 유용한 면역계 수용체들에 대한 예상치못한 이기능성(bifunctional) 효능제 활성을 입증하며, 조혈 및 골수 줄기 세포 증식을 자극하고 예방 또는 치료학적 치료 요법들 둘다로 암을 치료한다. 상이한 양태들에서, 이들 조성물은 동물 면역계의 반응성 세포에서 반응을 유도하고 세포 주기 정지 또는 세포자멸사를 유도하며 세포 증식을 억제하는데 효과적이다. 이들 조성물은 면역계의 반응성 세포를 유도함으로써 사이토킨들, 케모킨들 및 조혈 및 골수 줄기 세포 성장 인자를 생산한다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 제조하기에 비교적 저렴하며 이들의 활성은 제제들 중에서 재생가능하다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 시간에 따라서 및 최소 독성과 관련된 투여량 요법들에서 안정하게 및 효과적으로 잔존한다.
본 발명의 하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 마이코박테리아 또는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 각각으로부터 다음과 같이 제조된다: 마이코박테리아를 성장시키고 수거한다. 마이코박테리아를 파괴하여 고압 균질화에 이은 원심분리 공정의 이용을 통해 요구된 완전한 마이코박테리아로서 제거하여 요구된 어떠한 잔류하는 완전한 마이코박테리아 세포를 제거한다. 중요하게는, RNase가 없거나 비특이적인 뉴클레아제가 없는 시약들을 사용하여 RNC의 회수를 최적화한다.
낮은 상대적 원심분리력을 사용하여, 필요한 경우, 완전한 마이코박테리아를 제거한다. 이후에, 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 통상의 추출 기술들, 예를 들면, 구아니디늄 티오시아네이트-페놀 클로로포름 추출을 사용하여 분리할 수 있거나, 높은 상대적인 원심분리력을 완전한 마이코박테리아의 제거 후 상층액에 적용시켜 세포 파괴 후 마이코박테리아 세포 벽과 함께 제형화되어 잔존하는 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 분리한다. 중요하게는, 뉴클레아제 오염물(비-특이적인 엔도- 및 엑소-뉴클레아제들 또는 리보뉴클레아제들)을 함유하지 않는 시약들을 사용하여 RNA 분해를 제거하거나 최소화함으로써 제조 단계 동안 수율을 최적화한다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 악성, 자가면역 및 면역결핍성 질환들, 골수억제 및 조혈 및 골수 이상들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 질병들의 충격을 예방하고, 치료하며, 약화시키고 이들 질병들을 제거하는데 있어서 효과적인 치료제들이다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암과 같은 바람직하지 않고 조절되지 않는 세포 증식에 의해 매개된 질병들 및 공정들을 치료하는데 특히 유용하다. 이들 조성물은 또한 다른 항암제들의 효능을 향상시키기 위한 보조제들로서 효과적이다. 이러한 항암제들은 약물들, 면역 자극인자들, 항원들, 항체들, 백신들, 방사선, 화학체료제들, 유전물질, 생물학적으로 가공되고 화학적으로 합성된 제제들, 및 활성화 또는 불활성화를 위해 세포 사멸 분자들을 표적화하는 제제들, 암 세포의 증식을 억제하고, 암 세포에서 세포자멸사를 유도하는 제제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 또한 자체로서 암 또는 암의 치료와 관련된 골수억제(단핵구감소증 및/또는 호중구감소증)의 예방 또는 치료, 및 후천성 면역결핍증후군(AIDS), 골수이형성 증후군들, 자가면역질환, 말기 신장병들 또는 바이러스 감염증들과 같지만 이에 한정되지 않는 질병들 또는 의학상태들과 관련된 다양한 조혈 및 골수 이상들의 예방 또는 치료에 효과적이다.
약제학적으로 허용되는 담체 중의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC는 동물 또는 사람에게 면역계의 반응성 세포에서 반응을 자극시키고, 반응성 세포에서 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도하기에 효과적인 용량으로 투여될 수 있다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC는 오일 또는 다른 소수성 액체 제형들 속에 유화시키고, 리포좀들 속에 봉입하고, 천연 또는 인공 담체들과, 조직- 또는 세포-특이적인 리간드와 또는 조직- 또는 세포-특이적인 항체들과 복합체화시킴으로써 수성 제형들 중 현탁제, 크림제들 및 겔제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법로 투여될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC를 포함하는 신규 조성물, 및 이들 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 마이코박테리아 세포 덩어리의 제조를 위한 배양 배지 속의 탄소, 질소 및 철 공급원들의 함량을 최적화하는 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC 조성물의 제조를 위한 신규 제조 과정들을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 마이코박테리아 세포 덩어리를 성장시키기에 유용한 신규 합성 배지를 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 배양 배지 속의 탄소, 질소 및 철의 함량을 최적화하고 마이코박테리아 세포 덩어리의 제조를 위한 외인성 생물학적 물질들에 대한 요구를 제거하며, 후속 제조 과정 동안 외인성 생물학적 제제들 또는 화학적 제제들의 사용을 제거하는 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC 조성물의 제조를 위한 신규 제조 과정들을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 속에 신규 치료학적 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC를 포함하는 치료학적 조성물, 및 이들 치료학적 조성물을 사용하여 동물 또는 사람의 반응성 세포에서 치료학적 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이들 치료학적 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함으로써 면역계의 반응성 세포를 자극하기 위한 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 이들 치료학적 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함으로써 면역계의 반응성 세포를 자극시켜 사이토킨들, 케모킨들, 인터루킨들 및/또는 조혈 및 골수 성장 인자과 같은 생활성 분자들을 생산하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이들 치료학적 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함으로써 동물 또는 사람에서 질병을 치료하기에 효과적인 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 이들 치료학적 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함으로써 동물 또는 사람에서 암을 치료하기에 효과적인 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물의 반응성 세포의 증식을 억제하는 조성물 및 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물의 반응성 세포에서 세포자멸사를 유도하는 조성물 및 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 다른 항-암 치료요법들에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 다른 면역 자극 치료요법들에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 면역결핍성 질병들의 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 골수억제(백혈구감소증, 호중구감소증, 혈소판감소증 또는 빈혈) 또는 조혈 및 골수 이상들의 예방 또는 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 골수억제 또는 조혈 및 골수 이상들의 예방 또는 치료를 위한 다른 치료요법들에 대한 보조제로서 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이들 치료학적 조성물을 동물 또는 사람에게 투여함으로써 동물 또는 사람에서 자가면역 질환을 치료하는데 효과적인 방법을 제공한다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명은 조성물 속에 화학물질들 또는 효소들의 존재를 초래하지 않는 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 목적들, 특징들 및 장점들은 기재된 양태의 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위를 검토한 후 명백해질 것이다.
도 1. 마이코박테리움 플레이(1a), MCWE(1b), MCC(1c), MpRNC 저(1d), MpRNC 중간(1e) 및 MpRNC 고(1f)의 투과 전자현미경 사진(TEM). 바아는 1a, 1b 및 1c의 경우 1μm이고, 1d, 1e 및 1f의 경우 2μm이다.
도 2. 핵산 올리고뉴클레오타이드 길이의 전기영동 분석. 2a. RNA 래더(ladder) 표준 및, RNA 나노 6000 키트(kit)를 사용하여 오토클레이빙(autoclaving)하기 전 MpRNC 중간. 2b. 소 RNA 키트(4개의 뉴클레오타이드에서 피크는 내부 올리고뉴클레오타이드 표준이고 MpRNC 속의 핵산들과 관련되지 않는다. FU = 형광성 단위, nt=뉴클레오타이드 길이)를 사용한 오토클레이빙 후 오토클레이빙된 엠. 플레이 세포의 다양한 비율을 함유하는 MpRNC(MpRNC 고-, MpRNC 저- 또는/및 MpRNC 중간-).
도 3. RNase-A 처리 전 및 후에 측정된 것으로서 완전한 오토클레이빙된 엠. 플레이 세포 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이(3d)의 다양한 비율(3a 고-, 3b 저- 또는 3c 중간)을 함유하는 MpRNC의 RNA 및 DNA 함량.
도 4. MpRNC, MbRNC, MsRNC 및 MvRNC에서 RNase-민감성 핵산(NA). 4a: 추출된 대조군-처리된 및 RNase-처리된 핵산들의 우레아-PAGE 겔 전기영동; 4b: 주사 밀도계로 측정된 것으로서 추출된 핵산들 중 RNA의 비율.
도 5. MpRNC 중간의 마이콜산 프로파일. 5a: 추출가능한 지질들의 정량화를 위한 베헨산 표준물을 사용한 마이콜산 프로파일; 5b: 비누화가능한 지질들의 정량화를 위한 저 및 고 마이콜산 탄소 수 표준물들을 사용한 마이콜산 프로파일(~C40 및 ~C110으로 추정됨).
도 6. 마이코박테리아 RNC에 의한 NOD2 활성화. NOD2를 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 4개의 마이코박테리아 종들 - 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 균주 BCG, 마이코박테리움 스그메그마티스, 및 마이코박테리움 박카에로부터 제조한 RNC의 NOD2 효능제 활성을 측정하였다. NOD2 활성화는 NF-κB-기원한분비성 배아 알칼린 포스파타제(SEAP) 유도를 초래한다. 세포 배양물 상층액 속에서 SEAP에 의한 기질의 가수분해 후, 효소 활성을 630nm에서 O.D.로서 나타내며, 이는 NOD2 활성화와 비례한다. 3회 측정치들의 평균 ±.
도 7. 마이코박테리아 RNC에 의한 TLR2 활성화. TLR2 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 4개의 마이코박테리아 종들 - 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 균주 BCG, 마이코박테리운 스그메그마티스, 및 마이코박테리움 박카에로부터 제조한 MRNC의 TLR2 효능제 활성을 측정하였다. TLR2 활성화는 NF-κB-기원한 SEAP 유도를 초래한다. 세포 배양물 상층액 속에서 SEAP에 의한 기질의 가수분해 후, 효소 활성을 630nm에서 O.D.로 나타내며, 이는 NOD2 활성화에 비례한다. 3회 측정치들의 평균 ±.
도 8. 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이의 다양한 비율들을 함유하는 MpRNC 중간에 의한 사람 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 속에서 IL-10 및 IL-12 생산의 자극. MpRNC 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이를 사용한 처리 후 사람 PBMC에 의한 IL-10 및 IL-12p40 소단위 생산을 ELISA로 측정하였다.
본 발명은 세균 또는 마이코박테리아로부터 기원한 리보핵산(RNA) 및 세포벽(본원에서 RNC로 정의됨)을 포함하는 신규 조성물을 제공한다. 본 발명은 세균 RNA 및 세균 세포벽(BRNC로 정의됨)을 포함하는 신규 조성물 및 이들 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 마이코박테리아 RNA 및 마이코박테리아 세포벽(MRNC로 정의됨)를 포함하는 신규 조성물 및 이들 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 이들 조성물은 담체들, 및/또는 세포과 함께 제형화될 수 있다. 이들 신규 조성물은 세균 또는 마이코박테리아로부터의 세포벽 및 세균 또는 마이코박테리아 RNA로부터의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 RNA를 포함하며, 여기서 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드은 단일가닥(ss), 이중가닥(ds), 또는 단일가닥-이중가닥 하이브리드 가닥(hs)로서 존재할 수 있다. 이들 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클 속에 제형화되거나 약제학적으로 허용되는 담체 시스템으로 복합체화(여기서 용어 복합체는 2개 이상의 분자 종들의 화학적 연합을 기술하기 위해 사용된다)될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 완전한 세균 또는 마이코박테리아 세포를 함유할 수 있으며, 이의 함량은 목적하는 치료학적 의도를 위해 최적화된다.
이들 신규 조성물은 면역 자극, 항-암 및 조혈 및 골수 줄기 세포 성장 인자 자극 활성을 소유한다. 선행 기술의 제제들과는 대조적으로, 이들 신규 조성물은 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드(단일가닥(ss), 이중가닥(ds) 또는 이의 혼합물들과 같지만 이에 한정되지 않는 것과 같음)을 함유하며, 의도된 적용에 적절한 완전한 마이코박테리아의 선택된 수준들을 임의로 함유한다. 또한, 선행기술과는 대조적으로, 합성 제제들의 조합들이 요구되는 경우(참조: Uehara 등, Muramyldipeptide and diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides in combination with chemically synthesized Toll-like receptor agonists synergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2- and NOD-dependent manner, respectively, in human monocytic cells in culture: Cell. Microbiol., 2005; 7:53-61), 이들 신규 조성물은 뉴클레오타이드-결합 올리고머화 도메인 2(NOD2) 및 톨-유사 수용체 2(TLR2) 수용체들 둘다를 활성화시키는 능력을 가짐으로써, 면역계의 자극에 유용한 면역계 수용체들에 대한 예상치못한 이기능성 효능제 활성을 입증하고, 조혈 및 골수 줄기 세포 증식을 자극하며 예방학적 또는 치료학적 치료 요법들 둘다에서 암을 치료한다. 상이한 양태들에서, 이들 조성물은 동물 면역계의 반응성 세포에서 반응을 유도하고, 세포 주기 정지 또는 세포자멸사를 유도하며 세포 증식을 억제하는데 효과적이다. 이들 조성물은 면역계의 반응성 세포를 유도함으로써 사이토킨들, 케모킨들 및 조혈 및 골수 줄기 세포 성장 인자를 생산한다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 악성, 자가면역 및 면역결핍성 질환들, 골수억제 및 조혈 및 골수 이상들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 질병들의 충격을 예방하고, 치료하며, 약화시키고 이들 질병들을 제거하는데 있어서 효과적인 치료제들이다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암과 같은 바람직하지 않고 조절되지 않는 세포 증식에 의해 매개된 질병들 및 공정들을 치료하는데 특히 유용하다. 이들 조성물은 다른 항암제들의 효능을 향상시키기 위한 보조제들로서 또한 효과적이다. 이러한 항암제들은 약물들, 면역 자극인자들, 항원들, 항체들, 백신들, 방사선, 화학치료제들, 유전적, 생물학적으로 가공된 및 화학적으로 합성된 제제들, 및 활성화 또는 불활성화를 위한 세포 사멸 분자들을 표적화하는 제제들, 암 세포의 증식을 억제하고, 암 세포에서 세포자멸사를 유도하는 제제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암 또는 자체로서 암의 치료와 관련된 골수억제(단핵구감소증 및 또는 호중구감소증)의 예방 또는 치료, 및 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 골수이형성 증후군들, 자가면역질병들, 말기 신장병들 또는 바이러스 감염증들과 같지만, 이에 한정되지 않는 의학상태들 또는 질병들과 관련된 다양한 조혈 및 골수 이상증들의 예방 또는 치료에 효과적이다.
약제학적으로 허용되는 담체 중의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC는 동물 또는 사람에게 면역계의 반응성 세포에서 반응을 자극하고, 반응성 세포의 증식을 억제하고 이들 세포 속에서 세포자멸사를 유도하는데 효과적인 용량으로 투여될 수 있다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC는 오일 또는 다른 소수성 액체 제형들 속에 유화시키고, 리포좀들 속에 봉입하고, 천연 또는 인공 담체들과, 조직- 또는 세포-특이적인 리간드과 또는 조직- 또는 세포-특이적인 항체들과 복합체화시킴으로써 수성 제형들 중 현탁제, 크림제들 및 겔제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법로 투여될 수 있다.
정의들
용어 제조 공정들의 최적화는, 마이코박테리아 세포 덩어리를 수득하기 위한 발효가 마이코박테리아 세포 덩어리의 증진된 수율들을 생성하는 적절한 탄소, 질소 및 철 함량이 존재하는 배양 배지를 이용하는 공정을 기술하기 위해 사용된다.
용어 제조 공정의 최적화는 마이코박테리아 세포 벽 조성물의 제조시 화학물질들 또는 효소들의 사용을 위한 요건의 제거를 또한 말한다.
3개의 상이한 명칭들이 본 출원에서 이들 신규 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 첫째로, 용어 세균 RNA 조성물(BRNC)은 세균들의 상이한 종들로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 일반적으로 사용된다. BRNC는 본원에 기재된 방법을 사용하여 상이한 그람-음성 또는 그람-양성 세균들로부터 제조될 수 있다. 둘째로, 용어 마이코박테리아 RNA 조성물(MRNC)은 상이한 마이코박테리아로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 상이한 양태들에서, MRNC는 어떠한 마이코박테리움으로부터도 제조될 수 있다. 셋째로, 다른 양태들에서, 구체적인 마이코박테리아 종들, 마이코박테리아 복합체들 또는 마이코박테리아 균주들을 사용하여 MRNC를 제조한다. 이들의 예는 본원에 기재된 방법을 사용하는 마이코박테리움 아비움(일반적으로 MAP로 명명된 아종 파라투베르쿨로시스 포함), 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리운 스메그마티스, 또는 마이코박테리움 박카에이나, 이들에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 조성물의 제조 방법이 상세한 설명 및 실시예들에 기술된 것들 이외의 마이코박테리아로부터의 MRNC의 제조에 적용가능함은 당해 분야의 숙련가에게 인식될 것이다.
용어 마이코박테리움 RNA 조성물(MpRNC)은 마이코박테리움 플레이로부터 제조된 RNA 및 세포벽을 포함하는 조성물을 기술하는데 사용된다. 용어들 마이코박테리움 보비스 균주 BCG RNA 조성물(MbRNC), 마이코박테리움 스메그마티스 RNA 조성물(MsRNC), 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스(MAP) RNA 조성물(MapRNC) 및 마이코박테리움 박카에 RNA 조성물(MvRNC)은 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 및 마이코박테리움 박카에 각각으로부터 제조된 RNA 및 세포 벽을 포함하는 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 각각의 조성물, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC에서, RNA는 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 효율적인 생산을 초래하는 과정을 사용하여 마이코박테리아로부터 분리된다.
용어 마이코박테리아 RNA 조성물(MRNC)은 상이한 마이코박테리아로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 상이한 양태들에서, MRNC는 어떠한 마이코박테리움으로부터도 제조될 수 있다. 다른 양태들에서, 구체적인 마이코박테리아 종들, 마이코박테리아 복합체들 또는 마이코박테리아 균주들이 MRNC를 제조하기 위해 사용된다. 이들의 예들은 본원에 기재된 방법을 사용한 마이코박테리움 아비움(일반적으로 MAP로 명명된, 아종 파라투베르쿨로시스 포함), 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 스메그마티스, 또는 마이코박테리움 박카에이나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 조성물을 제조하는 방법은 상세한 설명 및 실시예들에 기술된 것들 외의 마이코박테리아로부터의 세포 벽 조성물의 제조에 적용가능함이 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 것이다.
용어 마이코박테리움 플레이 RNA 조성물(MpRNC)은 마이코박테리움 플레이로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 용어들 마이코박테리움 보비스 균주 BCG RNA 조성물(MbRNC), 마이코박테리움 스메그마티스 RNA 조성물(MsRNC), 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 (MAP) RNA 조성물(MapRNC) 및 마이코박테리움 박카에 RNA 조성물(MvRNC)은 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 및 마이코박테리움 박카에 각각으로부터 제조된 조성물을 기술하기 위해 사용된다. 각각의 조성물, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC에서, RNA는 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 효율적인 생산을 초래하는 과정을 사용하여 마이코박테리아로부터 분리된다.
본원에 정의된 것으로서, 마이코박테리아 배양 배지 조성물(MCMC)은 마이코박테리아 세포 덩어리를 제조하는데 사용되는 최적화된 탄소, 질소 및 철 공급원들을 함유하는 신규 합성 배양 배지를 말하며, 여기서 배지 속의 탄소, 질소 및 철 함량은, 탄소의 최적 이용 및 최적의 마이코박테리아 습윤 세포 덩어리 수율이 존재하도록 하는 한다.
본원에 정의된 것으로서, 배양은, 마이코박테리아가 세균 또는 마이코박테리아의 최적의 분열을 보증하는 탄소, 질소 및 철 함량으로 최적화되지만 이에 한정되지 않는 배지 속에서 배양되는 마이코박테리아 세포 덩어리의 생성 공정을 말한다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 장치 및 배양 조건들을 사용할 수 있다.
본원에 정의된 것으로서, 하부 공정 또는 제조는 고압 균질화, 차등적 원심분리 및 열 처리의 적절한 조합들의 사용에 의해 배양으로 제조된 마이코박테리아 세포 덩어리를 취하고, RNA-함유 조성물 또는 RNA-함유 세포 벽 조성물을 제조하는 공정을 말한다. 본 발명의 영역 또는 교시들로부터 벗어남이 없이 고압 균질화에 대한 효과에 있어 비교가능한 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기술들을 사용할 수 있다.
본원에 정의된 것으로서, 세균 세포벽은 세포벽 분자 성분들을 함유하는 세균 계의 구성원으로부터의 세포벽을 말하며, 여기서 최소한 이들 분자들은 다당류 및 알라닌(ALA)-함유 펩타이드 가닥, 일반적으로 불리는 펩티도글리칸을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같이, 마이코박테리아 세포벽은 최소한 펩티도글리칸 및 마이콜산을 함유하는 마이코박테리아세아에 과 및 마이코박테리움 속의 구성원으로부터 제조된 어떠한 세포벽 조성물을 말하며, 여기서 펩티도글리칸은 [N-아세틸그루코사민-N-아실무람산]n(여기서, N-아실은 N-아세틸 또는 N-글리콜릴이다)으로 이루어진 중합체로 구성되고, 여기서 중합체 가닥은 펩타이드 브릿지들에 의해 연결되며 여기서 마이콜산은 α-치환된 β-하이드록실화된 매우 장쇄 지방산들이다. 이들 펩타이드 브릿지들의 정확한 아미노산 조성물은 상이한 마이코박테리아 종들과 이들의 가닥 사이에서 고도로 보존되어 있으며, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있지만, 흔히 디아미노피멜산(DAP)를 포함하고, 지금까지 알려진 한, 락트산 잔기를 통해 N-아실무람산에 연결된 알라닌(ALA)을 항상 포함한다. 마이콜산의 유형들은 개개 마이코박테리아 종들에 대해 특이적이며, 분자의 길이(탄소수 ~60 내지 90개 범위)에 따라 무리로 세분된다.
본원에 정의된 바와 같이, 외인성 오염은 세균- 또는 마이코박테리아-기원한 조성물의 제조(세균 또는 마이코박테리아 세포 생물량 및 세균 또는 마이코박테리아 세포 벽 조성물 포함)에 통상적으로 사용된, 단백질들, 생화학물질들, 또는 화학물질들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 외인성 물질들의 존재를 말한다. 세균 및 마이코박테리아 세포 벽 조성물의 선행의 제조 방법과는 대조적으로, 본 방법로 제조된 RNC 조성물과 관련된 세균 및 마이코박테리아 단백질들은 외인성 단백질분해 효소 처리의 부재로 인하여 보존된다. 세균 및 마이코박테리아 세포 벽 조성물의 선행의 제조 방법과는 대조적으로, 세균 및 마이코박테리아 세포벽 지질들은 외인성 탈지 용매 처리의 부재로 인하여 보존된다.
본원에서 정의된 바와 같이, 용어 제조는, RNC가 분리되는 공정을 말하며, 여기서 완전한 세균 또는 마이코박테리아 세포는 파괴되어 세포 벽 분획들을 형성하고, 여기서 이러한 분획들은 이후에 RNA와 함께 분리되어 세균 또는 마이코박테리아 세포벽 RNC를 제공한다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드은 각각 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 균주 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에로부터 수득한, 길이가 2 내지 약 20개 염기 또는 20 내지 약 4000개 염기인 RNA 분자들을 말한다. 세균 또는 마이코박테리아 세포 벽과 함께 RNA는 RNC로 정의된다. RNA는 단일가닥(ss), 이중가닥(ds), 단일가닥-이중가닥 하이브리드 가닥(hs)로 구성될 수 있으며, RNA는 세균, 보다 바람직하게는 마이코박테리아 및 가장 바람직하게는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에로부터 수득된다. RNC는 상이한 세균 또는 마이코박테리아로부터의 하나 이상의 RNC를 포함할 수 있으며, 상이한 세균 또는 마이코박테리아로부터의 완전한 세포를 추가로 포함할 수 있다. RNC는 또한 하나 이상의 세균 또는 마이코박테리아로부터의 세포 벽을 사용하여 제형화될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 세균 또는 마이코박테리아의 고압 균질화는, 수성 부형제 속에 완전한 세균 또는 마이코박테리아의 현탁액이 세균 또는 마이코박테리아를 세포 벽 단편들로 붕해시켜 단백질 및 지질을 포함하는 세포질 성분들을 방출시키는, 고 난류(turbulence) 및 전단력의 조건들을 생성하는 밸브내에서 극미한 갭(gap)을 통한 압력하에서 통과된다.
본원에 정의된 것으로서, 저속 원심분리는 파괴되지 않은 세균 또는 마이코박테리아를 침강시키기에 충분한 상대적인 원심력(RCF)을 말한다.
본원에 정의된 것으로서, 고속 원심분리는, 세균 또는 마이코박테리아 세포 벽 RNC를 침강시키기에 충분한 상대적인 원심분리력을 말한다.
본원에 정의된 것으로서, 면역 자극은 선천성 및 또는 후천성 면역계의 자극으로 면역 반응을 유발되는 것을 말한다. 당해 면역 반응은 다음 중 하나 이상으로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: 면역 세포 분화 및 분열, 톨-유사 수용체들의 활성화, NOD 수용체들의 활성화, 톨-유사 또는 NOD 이외의 수용체들의 활성화, 사이토킨 및 사이토킨 합성의 유도, 성장 인자 합성의 유도, 세포 표면 마커들의 증가된 발현, 세포 표면 마커들의 감소된 발현, 세포파괴성 또는 세포독성 활성의 활성화, 항체 생산의 자극 또는 세포-매개된 면역성의 자극.
본원에 정의된 것으로서, 항암 활성은, 암 세포의 억제 및 또는 사멸을 초래하는 어떠한 공정도 말한다. 이러한 항암 활성은 암 세포 표적물들에서 직접적인 효과의 결과, 또는 면역계의 자극으로 인한 간접적인 효과의 결과일 수 있다.
용어 동물은 본 출원에서 사람을 포함한다.
용어 '생산한다'는 본 출원에서 합성하고/하거나 방출함을 의미한다.
마이코박테리아의 배양을 위한 신규 조성물
본 발명은 마이코박테리아 세포 덩어리를 시의적절한 방식으로 생성하기 위한 탄소, 질소 및 철의 최적화된 수준들 및 비율들을 함유하는 마이코박테리아를 배양하기 위한 신규 배지를 제공한다. 이들 신규 배지는 유기 질소 공급원들 또는 무기 질소 공급원들을 이용하며, 추가의 탄소, 질소 및 철이 하나의 분자내에서 제공될 수 있는 과정들을 위해 제공한다. 이들 신규 배양 배지는 마이코박테리아 세포 덩어리의 효율적인 생산을 위한 소 알부민 또는 카탈라제와 같은 외인성 단백질들의 첨가를 필요로 하지 않는다.
하나의 양태에서, 최적화된 질소는 황산암모늄을 포함하나, 이에 한정되지 않는 무기 암모늄 염들의 첨가로 제공된다. 최적화된 탄소는 글루코즈(덱스트로즈)와 같은 당들, 글리세롤과 같은 글리콜들 또는 시트르산과 같은 산들을 포함하나 이에 한정되지 않는 유기 분자들의 첨가로 제공되며, 마이코박테리아에 의해 대사될 수 있는 탄소를 함유한다.
다른 양태에서, 최적화된 질소 및 탄소는 시트르산암모늄(이염기성) 또는, 아스파라긴과 같지만 이에 한정되지 않는 아미노산들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 원자들 둘다를 함유하는 분자들에 의해 제공된다.
여전히 다른 양태에서, 최적화된 탄소, 질소 및 철은 시트르산철 암모늄을 포함하나 이에 한정되지 않는 모두 3개의 원자들을 함유하는 분자들에 의해 제공된다.
추가의 양태에서, 최적화된 탄소, 질소 및 철뿐만 아니라, 칼슘 및 마그네슘을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가의 2가 탄소들도 제공하는 배양 배지를 사용할 수 있다.
여전히 다른 양태에서, 배양 배지는 알부민들, 효소들 또는, 마이코박틴을 포함하나 이에 한정되지 않는 성장 향상 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가의 외인성 생물제들의 부재하에서 제형화된다.
여전히 다른 양태에서, 세균 또는 마이코박테리아의 신속한 호기성 성장을 보증하도록 산소에 대한 접근을 최적화하는 혼합 및 통기 과정들을 사용한다.
신규 세균 및 마이코박테리아 조성물
본 발명은 세균 또는 마이코박테리아로부터 분리된 RNA, 세균 또는 마이코박테리아 세포 벽을 포함하는 신규한 세균 및 마이코박테리아 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 앞서 정의한 바와 같은 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함한다. 이들 조성물은 상이한 양들의 완전한 세균 또는 마이코박테리아 세포를 임의로 함유한다. 다른 양태에서, 각각의 조성물, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC는 상이한 양들의 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG , 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스, 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 또한 함유할 수 있다. 완전한 세포는 MRNC, MpRNC, MbRNC MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC 속에 0 내지 99 중량%, 0.05 내지 95 중량%, 0.07 내지 50 중량%, 0.1 내지 20 중량% 또는 0.19 내지 19 중량%, 또는 이들 범위들 이내의 양들로 존재할 수 있다.
다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 길이가 2 내지 4000개 염기의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태인 RNA 조성물 함량(이는 총 핵산 함량의 대략 30% 내지 100%의 범위일 수 있다)을 소유한다. 여전히 다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 길이가 150개 초과인 염기, 또는 151 내지 4000개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 RNA 함량(총 핵산 함량의 30 내지 100%)을 소유한다. 다른 양태에서, 이들 신규 조성물은, 대부분 길이가 20 내지 40개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태인 RNA 함량(총 핵산 함량의 30 내지 100%)를 소유한다.
하나의 양태에서, 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 약 90% 이상의 RNA를 함유하는 신규 RNC 조성물은 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 (MAP) 또는 마이코박테리움 박카에로부터, 예를 들면 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출을 사용하는 RNA 추출에 의해 제조된다. 이러한 RNA 제제들은, 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 쇄 길이가 2 내지 4000개 염기인 RNC 조성물을 제공하기 위하여 열처리(예를 들면, 121℃로 5 내지 30분 동안, 그러나 이에 한정되지 않음)될 수 있다. 당해 RNC 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다.
항암 활성은, 완전한 마이코박테리아 세포의 최소 함량이 존재하는 경우 최적화된다. 면역 자극 활성은, 완전한 마이코박테리아 세포의 함량이 5 내지 50% w/w인 경우 최적화된다. 다수의 완전한 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG , 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 (MAP) 또는 마이코박테리움 박카에 세포는 실시예들에 설명된 제조 공정을 조절함으로써, 또는 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 (MAP) 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC, 또는 MvRNC에 가함으로써 조절될 수 있다.
이들 신규 조성물, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC, 또는 MvRNC는 면역 자극, 항암 및 조혈 및 골수 세포 성장 인자 자극 활성을 소유한다. 선행 기술의 제제들과는 대조적으로, 이들 신규 조성물은 단일의, 단일가닥(ss), 이중가닥(ds) 및 단일가닥-이중가닥 하이브리드 가닥(hs)을 함유하며, 면역 자극 및 항암 활성을 위해 최적화되어 있고, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG , 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 (MAP) 또는 마이코박테리움 박카에 세포 벽과 함께 제형화된다. 하나의 양태에서, 이들 조성물은 의도된 적용에 적절한 수준들의 완전한 마이코박테리아 세포를 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물은 면역계를 자극하고, 조혈 및 골수 성장 인자 합성을 자극하며, 암을 치료하는데 효과적이다. 상이한 양태들에서, 이들 조성물은 동물의 면역계의 반응성 세포에서 반응을 유도하고, 세포 주기 정지 또는 세포자멸사를 유도하며 세포 증식을 억제하는데 효과적이다. 이들 조성물은 면역계의 반응성 세포를 유도하여 사이토킨들, 케모킨들 및 조혈 및 골수 성장 인자를 생산한다.
본 발명의 조성물은, 약제학적으로 허용되는 담체와 조합되어 치료학적 조성물을 형성하고 동물에 투여되는 경우 면역계를 자극하고 암을 치료하는데 효과적이다. 상이한 양태들에서, 이들 치료학적 조성물은 동물 면역계의 반응성 세포에서 반응을 유도하고, 세포 주기 정지 또는 세포자멸사를 유도하며 암 세포 증식을 억제한다. 이들 조성물은 면역계의 반응성 세포를 유도하여 사이토킨들, 케모킨들 및 조혈 및 골수 세포 성장 인자를 생산한다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 악성, 자가면역 및 면역결핍성 질환들, 골수억제 및 조혈 및 골수 이상들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 질병들을 예방하고, 치료하며, 약화시키고 제거하는데 있어서 효과적인 치료제들이다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암과 같지만 이에 한정되지 않는 바람직하지 않고 조절되지 않는 세포 증식에 의해 매개된 질병들 및 공정들을 치료하는데 특히 유용하다. 이들 조성물은 또한 다른 항암제들의 효능을 향상시키기 위한 보조제들로서 효과적이다. 이러한 항암제들은 약물들, 면역 기능 자극인자들, 면역 기능 억제제들, 항원들, 항체들, 백신들, 방사선, 화학치료제들(단독 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 적절한 배합물들), 유전적, 생물학적으로 가공되고 화학적으로 합성된 제제들, 및 활성화 또는 불활성화를 위한 세포 사멸 분자들을 표적화하는 제제들, 암 세포의 증식을 억제하는 제제들, 및 암세포 들에서 세포자멸사를 유도하는 제제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암의 치료와 관련되거나 암 자체에 의해 유도된 골수억제(백혈구감소증, 호중구감소증)의 예방 또는 치료, 및 후천성 면역결핍증후군(AIDS), 골수이형성 증후군들, 자가면역질병들, 말기 신장병들 또는 바이러스 감염증들과 같지만 이에 한정되지 않는 질병들 또는 의학상태와 관련된 다양한 조혈 및 골수 이상들의 예방 또는 치료에 효과적이다. 본 발명의 2개 이상의 조성물의 조합물들을 사용하여 면역계의 조절을 최적화시키고 암을 치료할 수 있다. 예를 들면, MpRNC 및 MvRNC의 조합물은 면역 자극 및 사이토킨 유도를 위한 최적의 NOD2 및 TLR2 활성화를 제공할 것이다. 유사하게, MpRNC 및 MvRNC의 조합물은 최적의 항암 활성 및 면역 자극을 제공할 것이다.
하나의 양태에서, 세균을 사용하여 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드, 세균 세포 벽의 형태의 세균 RNA, 및 약제학적 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 BRNC 조성물을 제공할 수 있다. 다른 양태에서 마이코박테리아를 사용하여 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드, 마이코박테리아 세포 벽의 형태의 마이코박테리아 RNA, 및 약제학적 담체, 비히클을 포함하는 MRNC 조성물을 제공할 수 있다. 다른 양태에서, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC 조성물은 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의, 각각의 마이코박테리움 플레이 RNA, 마이코박테리움 보비스 BCG RNA, 마이코박테리움 스메그마티스 RNA, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 RNA 또는 마이코박테리움 박카에 RNA, 이들 종들로부터의 세포벽, 및 약제학적 담체, 부형제 또는 비히클을 포함한다.
하나의 양태에서, BRNC, MRNC, MpRNC MbRNC, MsRNC 또는 MvRNC 조성물은 키토산 나노입자들 또는 양이온성 리포좀들과 같지만 이에 한정되지 않는 약제학적 전달 시스템과 함께 제형화된다.
이들 조성물 각각, BRNC, MRNAC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 동물 또는 사람에게 투여될 수 있는 조성물을 형성하기 위해 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 비히클 또는 다른 전달 시스템과 같은 약제학적 담체와 함께 조합될 수 있다. 이들 조성물 각각, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 선택된 양들의 완전한 세균 세포, 마이코박테리아 세포, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 각각과 조합되어 동물 또는 사람에게 투여될 수 있는 조성물을 형성할 수 있다.
BRNC, MRNAC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 동물에서 면역계의 반응성 세포를 유도하여 사이토킨들, 케모킨들 및 조혈 및 골수 성장 인자를 생산하고, 암 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 반응성 세포의 증식을 억제하며 이들 세포에서 세포자멸사를 유도하는데 효과적이다.
BRNC 또는 MRNC를 제조하기 위한 코리네포름 종들(Coryneform species), 코리네박테리움 종들(Corynebacterium species), 로도코쿠스 종들(Rhodococcus species), 보르데텔라 종들(Bordetella species), 에스케리키아 종들(Escherichia species), 리스테리아 종들(Listeria species), 노카르디아 종들(Nocardia species) 및 마이코박테리아 종들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 진정 세균성 종들을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 포르투이툼(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 칸사이이(Mycobacterium kansaii), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 박카에, 마이코박테리움 아비움 및 관련된 아종 및 마이코박테리움 플레이를 포함하나, 이에 한정되지 않는 마이코박테리아 종들을 사용하여 MRNC를 제조할 수 있다. 여전히 다른 양태에서, 마이코박테리움 종들 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종, 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에를 사용하여 MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 또는 MvRNC를 제조한다. 여전히 다른 양태에서 아르카에박테리아 종들(Archaebacterial species)을 사용하여 BRNC를 제조할 수 있다.
마이코박테리아 세포 벽 RNA를 함유하는 조성물(MRNC)의 제조 방법
본 발명은 어떠한 마이코박테리아 종들로부터 마이코박테리아 세포벽 RNA 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여 마이코박테리아 세포벽-RNA를 제조하는데 사용될 수 있는 마이코박테리아 종들, 마이코박테리아 복합체들, 마이코박테리아 아종 및 마이코박테리아 균주들의 포괄적인 목록들은 예를 들면, 미국의 NCBI(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 의해 유지되며 이로부터 용이하게 이용가능하다. 비록 본 발명은 모든 마이코박테리아 종들 및 균주들로부터 MRNC를 제조하는 방법을 제공한다고 해도, 바람직한 마이코박테리아 종들 및 균주들은 배양물 속에서 신속하게 성장함으로써 단시간내에 마이코박테리아 세포 생물량을 제공할 수 있는 것으로 공지된 것들이다. 또한 신속하게 성장하고 면역적격 개인들에 대해 추가로 비-병원성인 것으로 공지된 마이코박테리아 종들 및 균주들이 또한 바람직하다.
BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 제조하기에 비교적 저렴하며, 이들의 활성은 제조들 동안 재생가능하고 시간에 걸쳐 안정하게 유지되며, 이들은 마이코박테리아 세포 벽 조성물을 제조하기 위해 당해 분야의 통상의 기술자들에 의해 사용된 단백질들, 효소들, 생화학물질들 또는 화학물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는 외인성 물질들에 의해 오염되지 않는다. 추가로, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들은 전적으로는 아니지만, 수용체에 대해 최소한으로 독성이다.
BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 제조하기 위하여, 세균 종들, 마이코박테리아 종들, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 각각을, 탄소 공급원들의 완전한 이용을 보증하는 최적화된 탄소, 질소 및 철 함량을 지닌 적절한 액체 배지 속에서 성장시키고 수거한다. 아미노산들은 질소 공급원을 제공한다. 아스파라긴을 포함하나 이에 한정되지 않는 이염기성 아미노산들이 질소의 바람직한 공급원들이다. 질소의 다른 공급원들은 암모늄 염들 또는 이들의 등가물을 포함한다. 철의 추가의 공급원들은 무기 염들, 또는 탄소의 추가의 공급원들을 제공하는, 시트레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 유기 염들이다. 시트르산철 암모늄(시트르산암모늄철)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 철 복합체들은 추가의 철, 질소 및 탄소 공급원들을 제공한다. 탄소(글루코즈 또는 다른 대사가능하게 이용가능한 탄소 공급원과 같음)의 바람직한 농도들은 500 내지 2500 mMol/리터이다. 상이한 양태들에서, C 대 N의 비들은 약 1:0.0095 내지 1:0.06, 약 1:0.02 내지 1:0.06 또는, 또는 약 1:0.06 또는 약 당해 비이다. 상이한 양태들에서, C 대 Fe의 비들은 약 1:1.8×10-4 내지 1:3.2×10-3 또는 약 당해 비; 1:1.8×10-3 내지 2.7×10-4 또는 약 당해 비; 또는 약 1:2.7×10-4 또는 약 당해 비이다. 이용은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 탄소, 질소 또는 철의 어떠한 허용되는 공급원으로 이루어질 수 있다. 이러한 배지는 추가의 염들 뿐만 아니라 비타민들을 또한 함유할 수 있으며, 이들의 존재 및 농도들은 특수 요구들에 따라 조절될 것임이 예측되어야 한다.
세균 또는 마이코박테리아는 파괴되어 RNA를 유리시키고 완전한 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포의 조절된 제거를 보증한다. 파괴는 고압 균질화 공정에 이은 원심분리 공정의 사용을 통해 발생한다. 낮은 상대적인 원심분리력은 완전한 세균 또는 마이코박테리아를 제거한다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC로부터의 RNA는 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 유사한 과정들을 사용하는 당해 단계에서 추출될 수 있다. 달리는, 높은 상대적인 원심분리력들을 사용하여, 세균 또는 마이코박테리아 세포 파괴 후 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 벽과 함께 제형화된 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 분리할 수 있다. 중요하게는, 뉴클레아제-, 및 DNase/RNase-유리된(둘다 엔도- 및 엑소-뉴클레아데 활성) 시약들을 사용하고 당해 공정을 4℃에서 또는 약 4℃에서 수행하여 제조 단계 동안 RNA 분해를 최소화한다.
세균 RNA의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 서열들, 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 길이, 및 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 구조들(단일가닥 분자들, 이중가닥 분자들, 단일가닥 및 이중가닥을 함유하는 하이브리드 또는 올리고리보뉴클레오타이드-내 및 폴리리보뉴클레오타이드-내 염기-쌍 구조들)은 BRNC의 생물학적 활성에 필수적이다. 보다 구체적으로, 마이코박테리아 RNA의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 서열들, 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 길이, 및 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 구조들(단일가닥 분자들, 이중가닥 분자들, 단일가닥 및 이중가닥을 함유하는 하이브리드 또는, 올리고리보뉴클레오타이드-내 및 폴리리보뉴클레오타이드-내 염기-쌍 구조들과 같으나 이에 한정되지 않음)은 MRNC의 생물학적 활성에 필수적이다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 세포벽을 제형화하기 위한 세균, 마이코박테리아 또는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종, 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에의 사용은 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 생물학적 활성(면역 자극 및 항암 활성)을 최대화하는데 중요한 생물학적 담체 및 전달 시스템을 생성한다.
다수의 완전한 세균 또는 마이코박테리아 세포를 함유하는 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 제조 방법
본 발명은 어떠한 세균 종들 및 균주로부터 BRNC를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 어떠한 마이코박테리아종 들로부터도 MRNC를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여 마이코박테리아 세포 벽-RNC를 제조하는데 사용될 수 있는 마이코박테리아 종들, 마이코박테리아 복합체들, 마이코박테리아 아종 및 마이코박테리아 균주들의 포괄적인 목록들은 예를 들면, 미국의 NCBI(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 의해 유지되고 있으며 이로부터 용이하게 이용가능하다. 바람직한 마이코박테리아 종들은 배양시 신속히 성장하여, 단기간에 마이코박테리아 생물량을 제공할 수 있는 것으로 알려진 것들이다. 또한, 신속하게 성장하며 면역적격 개인들에 대해 비-병원성인 것으로 인식된 종들이 바람직하다.
하나의 양태에서, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 속에 존해하는 다수의 완전한 세균 세포는 균질화 동안 정의된 고압의 적절한 사용 및 세균, 마이코박테리아 또는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 벽을 함유하는 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제형들의 제조시 사용되는 정의된 다수의 균질화 주기들과 함께 조절될 수 있다. 본 발명의 발명자들은, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 속에 존재하는 다수의 완전한 세균 세포가 이들 조성물의 면역 자극 및 항암 활성에 영향을 미침으로써 바람직하고 최적의 면역 조절 또는 바람직하고 최적의 항암 활성을 달성할 수 있음을 예상치않게 발견하였다.
하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 벽 제형들 중 다수의 완전한 마이코박테리아 세포는 고압 균질화 및 저속 원심분리 처리를 겪지 않은 마이코박테리아의 등가물 샘플과 비교하여 적어도 20배 감소될 수 있다. 다른 양태에서, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 속의 다수의 완전한 마이코박테리아 세포는 세균 세포 제제의 고압 균질화, 저속 원심분리에 이은 추가의 고압 균질화 처리를 겪지 않은 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에의 등가물 샘플과 비교하여 적어도 30배 감소될 수 있다. 추가의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 중 다수의 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포는 마이코박테리아 또는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 제제의 고압 균질화, 저속 원심분리에 이은 추가의 고압 균질화 처리를 겪지 않은 마이코박테리아의 등가물 샘플과 비교하여 적어도 35배 감소될 수 있다.
하나의 양태에서, 고 수준들의 완전한 마이코박테리아 세포 함량 또는 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 함량(예를 들면 약 대략 1 내지 50 % w/w)을 함유하는 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물 각각을 제조할 수 있다. 이러한 기술들은 예를 들면, 고압 균질화의 4회 주기들을 포함하며, 여기서, 고압 균질화의 4회 주기들 중 2회는 고압 원심분리 단계 전에 수행되고, 고압 균질화 단계 중 2회는 고속 원심분리 단계 후 수행된다.
다른 양태에서, 중간 수준들의 완전한 마이코박테리아 세포 함량, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 함량(예를 들면, 약 0.2 내지 약 0.9 % w/w)을 함유하는 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들 각각을 제조할 수 있다. 이러한 기술들은 예를 들면, 고압 균질화의 7회 주기들을 포함하며, 여기서, 고압 균질화의 7회 주기들 중 5회, 및 2회의 고압 균질화 단계는 고속 원심분리 단계 후 수행된다.
추가의 양태에서, 초 저 수준들의 완전한 마이코박테리아 세포 함량, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 함량(예를 들면, 약 0.2 % w/w 미만)을 함유하는 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들을 제조할 수 있다. 이러한 기술들은 예를 들면, 고압 균질화의 10회 주기들을 포함하며, 여기서, 고압 균질화의 10회 주기들 중 5회는 저속 원심분리 단계 전에 수행되고, 고압 균질화의 3회 주기들은 저속 원심분리 후에 수행되며 2회의 고압 균질화 단계는 고속 원심분리 단계 후에 수행된다.
상기 기술들에서, '고압 균질화'는 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에의 효율적인 파괴를 유발함으로써 RNA를 함유하는 세포 벽 단편 조성물이 수득되기에 충분한 고압 균질화의 주기를 의미한다. 미세유동화(microfluidization)와 같지만, 이에 한정되지 않는 고압 균질화와 비교가능한 다른 공정들을 또한 사용할 수 있다. 세균 및 마이코박테리아 세포 파괴의 당해 분야의 통상의 기술자는 구체적인 마이코박테리아 종들, 균주, 아균주, 또는 파괴될 복합체에 대한 최적압을 용이하게 결정할 수 있다.
본원에 정의된 것으로서, 저속 원심분리는 파괴되지 않은 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에를 침강시키기에 충분한 상대적인 원심력(RCF)을 말한다. 원심분리의 당해 분야의 통상의 기술자는, 본 발명을 읽은 후, 위에서 기술한 바와 같은 세포 파괴 후 잔존하는 어떠한 완전한 세균 또는 마이코박테리아의 침강을 위한 최적의 RCF를 용이하게 측정할 수 있다.
본원에 정의된 것으로서, 고속 원심분리는 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 벽을 침강시키기에 충분한 상대적인 원심분리력을 말한다. 원심분리 분야에서 통상의 기술자는, 본 발명을 읽은 후, 위에서 기술한 바와 같은 저속 원심분리에 의한 바람직한 양의 완전한 세균 및 마이코박테리아의 파괴 및 제거 후 세균 또는 마이코박테리움으로부터 세포 벽의 침강을 위한 최적의 상대적인 원심력을 용이하게 측정할 수 있다.
상기 고압 균질화 기술들의 용도를 사용하여 고압 균질화 압력들, 저속 원심분리 및 고속 원심분리, 또는 이의 조합들의 적절한 사용으로 상이한 수준들의 완전한 마이코박테리아(예를 들면, 고, 중간 또는 저)를 함유하는 MRNC를 제조할 수 있다. 추가로, 기술된 고압 균질화 기술들을 사용하여 고, 저 또는 중간 수준들의 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에를 함유하는 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 각각을 제조해왔다.
하나의 양태에서, 위에서 기술한 고압 균질화 방법을 통해 제조된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들은 제제로부터 완전한 마이코박테리아 세포, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 제거하기 위한(즉, 고압 균질화 처리가 없는) 차등적 원심분리를 겪은 마이코박테리아 제제들과 비교하여, 감소된 수들의 완전한 마이코박테리아 세포, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포 각각을 함유한다. 하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제(w/w) 각각 당 완전한 마이코박테리아 세포, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포의 퍼센트는 약 50% w/w 미만, 약 40 % w/w 미만, 약 30 % w/w 미만, 약 20 % w/w 미만, 약 10 % w/w 미만, 약 5 % w/w 미만, 약 1 % w/w 미만, 또는 약 0.5 % w/w 미만이다.
다른 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들은 조성물 속에 잔존하는 어떠한 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에도 불활성화시키기에 충분한, 예를 들면, 95℃에서 5 내지 30분 동안 가열, 또는 121℃에서 5 내지 30분 동안 가열과 같지만, 이에 한정되지 않는 열 처리의 공정에 적용된다.
다른 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들의 열 처리(예를 들면, 121℃, 5 내지 30분 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다른 조건들)을 사용하여 길이가 약 2 내지 150개 염기, 약 10 내지 100개 염기, 또는 약 20 내지 40개 염기의 범위의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 생성한다.
하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 제조하는 방법은 마이코박테리아 세포 생물량, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에를 파괴하여 이로부터 세포 벽 및 관련된 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 제조하고, 완전한 파괴되지 않은 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 분리하며; 세포벽로부터 파괴된 세균 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포의 가용성의, 세포질 성분들 및, 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 분리하여 세균, 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포벽 RNC BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC)를 수득함을 포함한다.
다른 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들을 제조하는 방법은 마이코박테리아 세포 생물량을 파괴하여 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 방출하고; 파괴되지 않은, 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포로부터 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 분리하며; 당해 단계를 반복하여 다수의 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 조절한 후; 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 길이가 약 20 내지 40개 뉴클레오타이드 염기가 수득되기에 충분한 온도로 가열함을 포함한다.
조성물의 핵산 함량
이들 조성물, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 핵산 함량은 약 500 내지 50000 ng/mg, 약 500 내지 5000 ng/mg 또는 약 500 내지 3000 ng/mg이다. 상이한 양태들에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 추출된 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 길이는 약 2 내지 약 4000개 염기 길이, 약 2 내지 약 150개 염기 길이, 또는 150개 염기 초과 길이이다. 상이한 양태들에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 중 추출된 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 길이는 약 150개 염기 내지 약 4000개 염기 길이, 또는 약 10 내지 약 50개 염기 길이, 또는 약 20 내지 약 40개 염기 길이이다. 상이한 양태들에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 중 추출된 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 길이는 150개 미만의 염기, 또는 100개 미만의 염기가다.
당해 분야의 통상의 기술자에게는, 상기 과정들을 변형시켜 이들이 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 품질 및 전체 회수에 부정적으로 영향을 미치지 않도록 제공하는 다른 단계가 포함되도록 할 수 있음이 명백할 것이다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는, 고압 균질화 과정이 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 생성시킴으로써 추출된 RNA 분자들의 길이를 감소시키고, 각각의 제제로부터 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포를 제거하기 때문에, 고압 균질화 및 저속 원심분리시 이들의 치료학적 효능에 있어 증가한다. 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 길이에 있어서의 감소들은 열처리(예를 들면, 121℃에서 30분 동안 열 처리), 그러나 이에 한정되지 않는 것의 사용, 또는 염기-서열 제한된 엔도뉴클레아제들의 적절한 사용에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명의 발명자들은, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들이 RNA를 분해하는, RNase 처리 후 면역 자극인자들 또는 항암제들로서 작용하기 위한 이들의 능력에 있어 유의적으로 감소되어 있다. 따라서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들은, RNA가 RNase(엔도 또는 엑소) 또는 뉴클레아제들의 분해작용에 대해 RNA의 접근을 제한하는 담체 시스템들 및 제형들의 사용에 의해 보호되지 않는 한 RNase 처리 또는 리보뉴클레아제들에 대한 부적합한 노출시 제한된 치료학적 효능을 가진다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 면역 자극 및 항암 활성
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들 중에 존재하는 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포의 전체 수에 있어서의 감소는 사이토킨 유도 검정들에 의해 측정된 것으로서 면역 자극 활성에 있어서 유의적인 효과를 갖는 것으로 발혀졌다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 속에 존재하는 완전한 마이코박테리아 세포의 총 수에 있어서의 감소는 또한 말초 혈액 단핵 세포에서 증가된 IL-10 및 IL-12p40 유도와 같은, 면역 자극 활성에 있어 유의적인 양성 효과를 가지는 것으로 또한 밝혀졌다. 또한, 상기 제제들 속에 존재하는 완전한 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 박카에 세포의 전체 수에 있어서의 감소는 암 세포 증식의 억제에 의해 측정된 것으로서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 항암 활성에 있어서 양성의, 향상 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
하나의 양태에서, 동물 또는 사람에서 조혈 및 골수 성장 인자에서 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 면역 자극 활성은 사이토킨 유도 검정들을 사용하여 측정할 수 있다. 다른 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 IL-10 및 IL-12를 포함하나 이에 한정되지 않는 사이토킨들의 면역 자극 활성을 유도한다.
추가의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 치료학적 조성물은 항암 활성을 지닌다. 하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC C의 항암 활성은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 암 세포 증식 검정들을 사용하여 측정할 수 있다. 항암 활성을 확인하기 위한 이러한 검정들의 사용은 생체내 항암 활성의 지표인 것으로 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있다.
예방학적 또는 치료학적 셋팅에서 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 조성물의 투여는 자체로 면역화 공정이 아니다. 이는 면역계의 반응성 세포에서 반응을 자극하고, 암 세포과 같지만, 이에 한정되지 않는 반응성 세포의 증식을 억제하고, 이들 세포에서 세포자멸사를 유도하는 예방학적 또는 치료학적 치료이다. 당해 예방학적 또는 치료학적 치료는 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는 질병을 예방하거나, 치료하거나, 근절시키거나 제거하는데 유용하다.
그러나, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 제제들의 투여는 제형 속에서 사용되는 경우, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 면역 자극 활성(면역 보조제 효과)에 의해 추가로 향상되는 마이코박테리아 세포벽 성분들에 대해 면역 반응을 유발할 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 이러한 반응이 MRNC가 이로부터 제조되는 경우 기회적 또는 병원성 마이코박테리아 감염들에 있어 효과적일 것임을 인식할 것이다. 구체적으로, 결핵, 존병(Johne's disease) 또는 크론병(Crohn's disease)과 관련되나 이에 한정되지 않는 염증 및 이환률을 감소시킬 수 있는 치료가 요구되고 있다. 보다 구체적으로, 최적화된 면역 자극 및 백신 항원 및 백신 보조제 활성을 지닌 MapRNC를 포함하는 조성물의 사용은 가축 및 사람들에서 MAP 감염들을 예방하거나 치료하는 장점과 함께 사용될 수 있다. MAP의 것들과 교차-반응하는 항원들을 함유하는 하나 이상의 마이코박테리아 종들로부터의 RNC를 포함하는 조성물을 사용하여 MAP 감염을 조절하는 보호 반응을 생성시킬 수 있다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 조성물의 치료학적 효과들은 면역계 세포의 활성화를 초래하고 후속적으로 반응성 세포에서 카스파제들 및 세포자멸사의 활성화를 초래할 수 있는, 사이토킨들을 생산하기 위한 면역계의 반응성 세포의 자극을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포질분해 및 세포자멸사는, 개별적으로 및 조합하여 둘다 항암 활성 및 보조제 활성 둘다를 갖는다. 즉, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, and MvRNC를 포함하는 치료학적 조성물은 항암제로서 단독으로 투여될 수 있으며 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 조성물은 치료 효능을 증가시키기 위하여 다른 항암제 전에, 동시에, 또는 후에 투여할 수 있다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 악성, 자가면역 및 면역결핍성 질환들, 골수억제 및 조혈 및 골수 이상들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 각종 질병들을 예방하고, 치료하며, 저하시키고 제거하는데 있어 효과적인 예방학적 및 치료학적 제제들이다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 다른 제제들의 효능을 향상시키기 위한 보조제들로써 또한 효과적이다. 이러한 제제들은 약물들, 항생제들, 다른 면역 조절제들, 항원들, 항체들, 백신들, 방사선 및 화학치료적, 유전적, 생물학적으로 가공된 및 화학적으로 합성된 제제들, 및 암 세포의 증식을 억제하고, 이들 세포내에서 세포자멸사를 유도하는, 활성화 또는 불활성화를 위한 세포 사멸 분자들을 표적화하는 제제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 위에서 언급한 국면들 및 양태들 중 각각에서, 위에서 기술된 것들 외에 조합 보조제들 또는 치료제들이 또한 본원에 구체적으로 고려된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 하나 이상의 시판되는 화학치료제들과 함게 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항생제들, 항-진균제들, 항-바이러스제들, 항-기생충제들, 소염제들 또는 면역 자극 약물들 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 제제들과 함께 투여될 수 있다.
여전히 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 골수억제 또는 조혈 및 골수 이상들의 예방 또는 치료를 위해 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 하나 이상의 약물들 또는 제제들과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 동물 피검자들 또는 환자들, 보다 바람직하게는, 사람들을 포함하는 포유동물들, 및 비-사람 영장류들, 개들, 고양이들, 말들, 가축, 돼지, 설치류들 및 어류와 같은 포유동물들의 치료를 위해 사용될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체들 및 조성물의 투여 방법
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 용이하게 제형화되거나, 제조되거나, 투여될 수 있다. 이러한 제제들은 각종 기술들로 제조할 수 있다. 이러한 기술들은 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC와 이의 담체의 조성물의 연합을 포함한다. 하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물은, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물을 액체 담체들, 고체 담체들 또는 이들 둘다와 균일하게 및 친밀하게 연합시켜 제조한다. 액체 담체들은 수성 제형들, 비-수성 제형들, 또는 이들 둘다를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고체 담체들은 생물학적 담체들, 화학적 담체들, 또는 이들 둘다를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물은 수성 현탁제, 오일 유제, 유중수 유제(water in oil emulsion) 및 수중 유중수 유제(water-in-oil-in-water emulsion)로서, 및 크림제들, 겔제들, 리포좀제들(중성, 음이온성 또는 양이온성), 지질 나노구들 또는 미세구들, 중성, 음이온성 또는 양이온성 중합체성 나노입자들 또는 미세입자들, 부위-특이적인 유제들, 장기-체류 유제들(long-residence emulsions), 점성-유제들, 미세-유제들, 나노-유제들, 미세구들, 나노구들, 나노입자들, 및 미니펌프들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 담체들로, 및 음이온성, 중성 또는 양이온성 다당류들 및 음이온성, 중성 양이온성 중합체들 또는 공중합체들, 조성물 전달이 요구되는 부위와 근접하여 이식되는 미니펌프들 또는 중합체들을 포함하는 조성물의 지속적인 방출을 허용하는 다양한 천연 또는 합성 중합체들과 함께 투여될 수 있다. 중합체들 및 이들의 용도는 예를 들면, 문헌[참조: Brem 등 (Journal of Neurosurgery 1991, 74:441-446)]에 기술되어 있다. 또한, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 담체들 중 어느 하나, 또는 어느 조합과 함께 사용될 수 있다. 이들은 항산화제들, 완충제들, 및 세균정제제들을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 현탁화제들 및 증점제들을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물 또는 담체-계 제제들은 RNase-유리된, 수성 현탁제로서 투여된다. 수성 현탁제로서 투여를 위해 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 주사용수, 생리학적 염수 또는 덱스트로즈 용액들을 포함하나 이에 한정되지 않는 RNase-유리되고 뉴클레아제 유리된 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충제 또는 담체 속에, 또는 고압 균질화, 초음파 및 미세유동화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기술들에 의해 현탁되며, 무균적으로 가공되거나 말기에 멸균될 수 있다. 다른 예에서, 동결-건조된(동결건조시킨) MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 사용 직전에, 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충제 또는 담체, 예를 들면, RNase-유리되고 뉴클레아제-유리된 멸균수의 첨가만을 필요로 하는 밀봉된 앰플들 또는 바이알(vial) 들 속에 저장할 수 있다.
비-수성 담체로 투여하기 위해, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 무기 오일과 함께 또는 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 인지질, 지질, 오일 및 이의 혼합물들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 천연 오일과 함께 유화시킬 수 있으며, 여기서 오일은 다중불포화된 및 포화된 지방산들의 적절한 혼합물을 함유한다. 예들은 대두 오일, 카놀라 오일, 야자 오일, 올리브 오일 및 미글리올을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 지방산 탄소들의 수는 12 내지 22이고, 여기서 지방산들은 포화되거나 불포화될 수 있다. 임의로, 하전된 지질 또는 인지질을 천연 오일 속에 현탁시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 사용은 대식구들 위에서 수용체들을 표적화하는 포스파티질세린으로 이루어질 수 있다. 수성 매질 속에서 제형화된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 또는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 기술들을 사용하는 유제들을 제조하는데 있어서 동결건조된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 분말을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체들 및, 임의로, 다른 치료학적 및/또는 예방학적 성분들과 함께 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물을 제공한다. 담체 및 다른 치료학적 성분들은 조성물의 다른 성분들과 혼합성이고 이의 복용자에 대해 유해하지 않아야 하는 관점에서 허용되어야 한다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물은 사람을 포함하는 동물에서 치료학적 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여한다. 투여된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물의 용량은 치료되는 상태, 특수 제형, 및 복용자의 체중 및 상태와 같은 다른 임상 인자들 및 투여 경로에 의존할 것이다. 하나의 양태에서, 투여된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 양은 투여량당 약 0.00001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg이다. 다른 양태에서, 투여된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 양은 투여량당 약 0.0001 mg/kg 내지 약 50 mg/kg이다. 추가의 양태에서, 투여된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 양은 투여량당 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다. 다른 양태에서, 투여된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 양은 투여량당 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다. 추가의 양태에서, 투여된 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 양은 투여량당 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다.
본 발명의 화합물들의 유용한 용량들은 동물 모델들에서 생체내 활성, 및 시험관내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 본 발명의 화합물들사람에 대해 마우스, 및 다른 동물들에게 효과적인 용량들의 외삽(extrapolation) 방법은 당해 분야; 예를 들면, 미국 특허 제4,938,949호에 공지되어 있다.
본 발명에서 사용된 조성물의 투여 방식들은 하기 예시된다. 그러나, 조성물은 주사(예를 들면, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내)에 의해, 연속적인 정맥내 주입에 의해, 피하로, 피부로, 경피로, 경구로[예를 들면, 정제, 환제, 액체 의약, 식용가능한 필름 스프립(edible film strip)], 이식된 삼투압 펌프들에 의해, 좌제 또는 에어로졸 스프레이에 의해서를 포함하는 각종 경로들 중 어느 것으로 전달될 수 있다. 투여 경로들은 국소, 피내, 수막내, 병변내, 종양내, 방광내, 질내, 안구내, 직장내, 폐내, 척수내, 피부로, 피하로, 동맥내, 신체의 강(cavity)들내 치환, 비강 흡입, 폐 흡입, 피부내로 압흔 및 전기천공(electroporation)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
투여 경로에 따라서, 투여량 당 허용되는 담체 중 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 용적은 약 0.001 ml 내지 약 100 ml이다. 하나의 양태에서, 투여량당 허용되는 담체 중 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 조성물의 용적은 약 0.01 ml 내지 약 50 ml이다. 다른 양태에서, 투여량당, 허용되는 담체 중 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 조성물의 용적은 약 0.1 ml 내지 약 30 ml이다. 허용되는 담체 중 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 포함하는 조성물은 스케쥴에 있어서, 또는 치료되는 질병에 대해 적절한 기간에 걸쳐서, 복용자의 상태 및 투여 경로에 있어서 단일 투여량 치료 또는 다중 투여량 치료들로 투여될 수 있다. 바람직한 투여량은 편리하게는 단일 투여량으로 또는 적절한 간격들, 예를 들면 1일에 2회, 3회, 4회 이상의 아-투여량(sub-dose)들로서 투여된 분할된 투여량들로 존재할 수 있다. 아-투여량 자체는 또한 예를 들면, 다수의 별개의 느슨하게 공간을 둔 투여들로 추가로 나눌 수 있다.
면역계 수용체들을 활성화하는 방법
본 발명은 이를 필요로 하는 피검자에게 치료학적 유효량의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여함을 포함하여, 면역계 수용체들을 활성화시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 활성화될 수 있는 면역계 수용체들은 뉴클레오타이드-결합 올리고머화 도메인 2(NOD2), 병원체-관련 분자 패턴(PAMP) 분자 무라밀 디펩타이드를 감지하는데 관여하는 패턴 인식 수용체(PRR), 면역 자극 활성을 지닌 세균 펩티도글리칸의 최소 구조 성분, 및 톨-유사 수용체 2(TLR2), 펩티도글리칸, 리포만난(LM), 리포아라비노만난(LAM), 및 (팔미트산)n-기원한 N-말단 시스테인 또는 시스테인들을 함유하는 지단백질들 및 지질펩타이드를 감지하는데 관여하는 패턴 인식 수용체(PRR)이다(그러나, 이에 한정되지 않는다). 이들 2개의 면역계 수용체들의 활성화는 당해 분야의 통상의 기술자들에 의해 인식되어 항암 활성 및 항-감염성 활성(세균, 진균 및 바이러스 감염들을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 및 또한 백신 보조제 활성 및 사람 골수 CD14+ 세포의 분화를 초래한다. 이들 수용체들 둘다에 대한 효능제로서 기능하는 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 능력은 충족되지 않는 필요성을 제공하며 종양학, 감염성 질병들 또는 백신들의 분야들에서 치료제들로서 사용되는 단일기능성 NOD2 또는 TLR2 효능제들을 능가하는 유의적인 장점들을 추가로 제공한다.
암 및 면역계의 질환들을 포함하는 질병들을 치료하는 방법
본 발명은 이를 필요로 하는 피검자에게 치료학적 유효량의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여함을 포함하여, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 국면에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 암, 및 면역계의 질병들 또는 질환들의 치료학적 치료에 유용하다. 여전히 추가의 양태에서, 일부 암들은 증상들의 발병 전, 또는 암 질환의 심각한 증상들 또는 징후들의 발병 전에, 예방제로서 조성물의 시의적절한 투여에 의해 예방될 수 있다. 따라서, 특수 암 질환에 걸릴 위험이 있는 환자를 예방 조치 방법으로서 본 발명의 조성물 중 하나 이상을 사용하여 치료할 수 있다.
여전히 추가의 국면에서, 본 발명은 위에서 정의한 암 질환들 또는 암 증상중 어느 하나 이상으로 고생하는 피검자에서 암 또는 종양 발달, 전이, 암 세포에서 세포 증식을 완화시키거나 개선시키고/시키거나 하나 이상의 위에서 확인된 암 질환들 및/또는 암 징후들과 관련된 증상들을 억제하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 이를 필요로 하는 피검자에게 약제학적으로 허용되는 담체 중의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 단독으로 또는 하나 이상의 소염 화합물들, 면역 자극제들, 또는 항암제들과 함께 투여할 수 있으며, 여기서, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암 또는 종양 발달, 전이를 억제하고/하거나 암 세포에서 세포 증식을 억제하기에 충분하다.
MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는 질환을 치료하거나, 근절시키거나 제거하기 위한 치료제들로서 효과적이다. 암들은 원시 또는 전이 암들, 편평 세포 암종, 섬유육종, 유육종, 흑생종, 유암, 폐암, 결장직장암, 신장암, 골육종, 피하 흑색종, 기저 세포 암종, 췌장암, 방광암, 요도의 암, 경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립샘암, 백혈병, 림프종 및 이들로부터 기원한 전이들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 국면에서, 본 발명의 MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 암 질병들 및 암 질환들은 예를 들면, AIDS-관련 암들, 방광암, 골암, 뇌암 및 척추암들, 전이성 뇌 종양들, 소아 뇌 종양들, 유방암, 남성 유방암, 경부암, 결장직장암, 자궁내막 및 다른 자궁 암들, 식도암, 담낭 및 담즙관 암들, 위(위장)암, 두부 및 목 암들, 신장암, 백혈병, 간암, 간 전이들, 폐암, 림프종, 유 샘암종, 흑색종, 다발성 흑색종, 골수형성이상증후군, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 소아 암들, 하수체 종양들, 전립샘암, 간 질환들, 육종, 고형 종양들, 망막모세포종, 피부암, 연조직 육종, 고환암, 갑상선암, 자궁암들, 윌름스 종양(Wilms' tumor), 기관지암, 결장 및 직장 암, 요도암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 피부의 흑색종, 콩팥 및 신장암, 골반암, 췌장암, 구강암 및 인두암, 위 식도암, 간내 담즙관 암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 심장을 포함하는 연 조직 암, GIST(위-장 간질 종양들), 소장암, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 항문 및 항문관의 암, 항문직장관 암, 외음암, 흉막암, 악성 중피종, 골들 및 관절들의 암, 하인두 암, 눈 및 안와 암, 코 및 비강 암, 중이암, 코인두암, 요관암, 복막암, 그물막 및 장간막 암, 및 위장 암종 종양들 또는 이의 어떠한 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
여전히 다른 국면에서, 본 발명을 사용하여 치료할 수 있는 암 질병들 및 암 질환들은 결장직장암, 위암, 난소암, 골육종, 간세포 암종, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 원발성 삼출액 림프종, 혈관면역아세포성림프절증, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)-관련 림프종, T-세포 림프종, 구강 모상 백반증, 림프증식성 질환, 림프상피성 암종, 체강계 림프종 또는 B-세포 림프종, 비-각질화 암종(non-keratinizing carcinoma), 편평 세포 비인두 암종, 콩팥 이식체-관련 상피 종양들, 혈관육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 혈관림프과형성, 전립샘 신생물(prostatic neoplasm), 망막아종, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 가드너 증후군(Gardner's syndrome), 베르너 증후군(Werner's syndrome), 너보이드 기저 세포 암종 증후군(nervoid basal cell carcinoma syndrome), 신경섬유종증 제1형, 자궁경부이형성, 신경아세포종, 원발성 고분자글로불린혈증, 인슐린종, 균상식육종, 골육종, 전암성 피부 병변들(국소), 횡문근육종, 골원성, 진성다혈구증, 필수 혈소판증가증(essential thrombocytosis) 또는 이의 어떠한 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 항-감염제들로서 사용될 수 있다. 본 발명은 바이러스들 및 세균들과 같은 병원성 물질들에 대한 노출시 동물들을 보호하는데 또한 유용하다. 본 발명은 조사(irradiation), 수술 또는 화학치료학적 치료로부터 회복중인 암을 지닌 동물들에서 포유동물 조혈을 조절하거나 조혈 및 골수 회복(백혈구감소증, 호중구감소증, 혈소판감소증 또는 빈혈)을 유도하는데 유용하다. 본 발명은 후천성 면역결핍증후군(AIDS), 골수이형성증후군, 자가면역병들, 말기 단계 신장병들 또는 바이러스 감염들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 의학상태들 또는 질병들과 관련된 다양한 조혈 및 골수 이상들의 예방 또는 치료에 유용하다.
본 발명은 자가면역 질환들, 염증성 및 감염성 질병들의 치료 또는 경감에 또한 유용하다. MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 바이러스들, 세균들, 마이코박테리아들(마이코박테리움 투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스), 또는 헤르페스 바이러스에 의한 감염을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 유기체들에 의해 유발된 광범위한 감염들, 예를 들면, 말기관지 폐렴, 소의 감염성 코기관염, 자궁내막염, 헤르페스 단성(herpes simplex), 헤르페스 조스터(herpes zoster), 안구 헤르페스, 고양이바이러스성비기관염, 및 고양이들의 기관지를 감염시키는 헤르페스들을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 강아지들의 파르보바이러스 감염들의 치료에 또한 효과적이다. 본 발명의 조성물은 사람들의 생식기 헤르페스 감염들 및 후천성 면역결핍성 증후군, 및 또한 동물들 및 사람들의 다른 바이러스 감염들에 대한 치료제로서 효과적이다. 예를 들면, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 말 헤르페스 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 단성, 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus)와 같은 스트렙토코쿠스 종들, 이. 콜라이(E. coli), 및 라마 바베시아(Llama Babesia)와 같지만 이에 한정되지 않는 바이러스, 세균, 원생생물 및 진균 감염들을 치료하는데 사용될 수 있다.
다음 실시예들은 본 발명을 추가로 설명하기 위해서 그러나, 동시에 이의 어떠한 제한을 구성함 없이 제공될 것이다. 반대로, 본원의 설명을 읽은 후, 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 특허청구범위의 영역에 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가들에게 자체들로서 제안할 수 있는 각종의 다른 양태들, 변형들 및 이의 등가물들에 의존할 수 있음이 명확하게 이해되어야 한다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 상세한 설명 및 실시예들을 읽고 본 발명의 취지 및 의도 또는 첨부된 특허청구범위의 영역에서 벗어남이 없이 그람-양성 및 그람-음성 세균들로부터 면역 자극 및 항암 RNC의 제조에 대해 본원에서의 발견들을 적용할 것임이 이해되어야 한다.
실시예 1
합성 배지 속에서 마이코박테리아의 배양
미국 특허 제4,744,984호 및 미국 특허 제6,326,357호에 교시된 바와 같이 마이코박테리아 세포 벽 조성물의 제조는 마이코박테리아 세포 덩어리의 제조를 위해 BACTOTM AC 브로쓰(broth)(제조원: Difco Labs, now Becton Dickenson)의 사용을 명시하였다. 당해 브로쓰는 프로테오스 펩톤(proteose pepton) 3번, 소고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아 추출물(참조: DifcoTM & BBLTM Manual of Microbiological Culture Media, second edition, 2009, pp 35-36)을 함유한다. 또한, 이들 특허들에서 예로서 사용된 마이코박테리움 플레이의 종균 스톡(seed stock)은 생물량 생성 전에 우유(bovine milk) 속에 저장하였다. 전술한 특허들은 또한, 배양이 정적이며, 마이코박테리아 배양물들이 배양 배지 위에서 표면 박피로서 성장함을 교시한다.
전술한 물질들에 의한 마이코박테리아 생물량의 오염 가능성을 제거하기 위하여, 신규한 합성 배지가 마이코박테리아의 배양을 위해 개발되었다. Middlebrook 7H9 브로쓰는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 마이코박테리아의 순수한 배양물들의 배양에 적합한 것으로 공지되어 있지만 동물 공급된 물질(소 혈청 알부민 및 카탈라제를 함유하는 Middlebrook ADC 농축물) 및 추가로 폴리소르베이트 80 또는 글리세롤(DifcoTM & BBLTM Manual of Microbiological Culture Media, second edition, 2009, pp355-356)의 사용으로 이점이 있다. 그러나, Middlebrook ADC 농축물 배지에서 발견되는 외인성 단백질들인 소 알부민 또는 카탈라제, 또는 비-이온성 세제 폴리소르베이트 80의 사용없이도 마이코박테리아의 효율적인 성장이 Middlebrook 7H9 속에서 발생하였음이 예상치않게도 발견되었다. 또한 추가의 철(시트르산철 암모늄으로서) 및 추가의 탄소 및 질소(아스파라긴 또는 시트르산암모늄과 같지만, 이에 한정되지 않는 것과 같음)의 공급원의 사용이 Middlebrook 7H9 브로쓰만을 사용한 배양과 비교하여 마이코박테리아 덩어리의 보다 우수한 수율들을 초래함이 예상치않게도 발견되었다. 추가의 탄소, 질소 및 철의 적절한 비의 사용은 단백질들, 핵산들 및 다른 세포 성분들의 합성을 위한 탄소 대 질소 비의 최적화를 통해 대사 활성 및 세포 분열을 촉진시킬 뿐만 아니라, 증가된 철 이용가능성을 통해 대사를 향상시킴으로써 마이코박테리아 분열율 및 마이코박테리아 세포 덩어리를 증가시키는데에도 사용된다.
다음 결과들은 본원에서 대표적인 마이코박테리아 종들의 예로서 사용된 마이코박테리움 플레이의 성장시 배양 배지속의 C:N:Fe 비의 변화의 충격을 입증하기 위해 제공된다. 하기 기술된 발견들은 C, N 및 Fe의 다른 공급원들을 사용함으로써 반복할 수 있으며, 본 발명의 영역 및 의도에서 벗어남이 없이 다른 마이코박테리아에 적용될 수 있음이 실현되어야 한다.
Middlebrook 7H9 브로쓰 및 ADC의 조성물은 예를 들면, Difco and BBL Manual of Microbiological Culture Media, 제2판, 2009, 페이지 355-356에서 이용가능하다. 마이코박테리움 플레이의 성장은 다음의 새로이 개발된 배양 배지 속에서 측정되었으며, 당해 배지는 이후에 마이코박테리아 배양 배지 조성물(MCMC)로 본원에서 정의된다:
A. Middlebrook 7H9(제조원: BD Canada, 미국 온타리오주 미시사우가 소재), 글루코즈 및 글리세롤을 함유하는 MCMC 조성물.
B. Middlebrook 7H9 글루코즈, 글리세롤 및 추가의 Fe(시트르산철암모늄으로서) 및 철로서의 아스파라긴, 탄소 공급원들 및 질소 공급원들을 함유하는 MCMC 조성물.
C. 글루코즈, 글리세롤을 함유하고 Fe(시트르산철암모늄으로서), 철로서 아스파라긴 및 시트르산암모늄(이염기성), 탄소 및 질소 공급원들을 함유하는 MCMC 조성물.
D. 글루코즈, 글리세롤, Fe(시트르산철암모늄으로서) 및 철로서 시트르산암노늄(이염기성), 탄소 및 질소 공급원들을 함유하는 MCMC 조성물.
별도의 연구에서 철 및 L, DL 또는 D 입체이성체로서 아스파라긴을 함유하는 MCMC 조성물의 충격을 또한 위에서 기술한 조성물 C를 사용하여 측정하였다.
MCMC A 및 MCMC B, Middlebrook 7H9 브로쓰를 제조하기 위하여, 9.4g의 Middlebrook 7H9 분말화된 배지들을 글루코즈를 제외한 첨가제들과 배합하고, 글리세롤 및 첨가제들과 배합하며, 물(900 mL) 속에 용해하고 스팀 오토클레이빙(steam autoclaving)으로 멸균시켰다. 글로코즈를 물 속에 용해하고 항상 별도로 여과기-멸균시키고 이후에 가하여 1000 mL의 최종 용적을 수득하였다. MCMC C 및 MCMC D는 Middlebrook 7H9 분말화된 배지를 함유하지 않는다. 표 1은 위에서 기술한 글리세롤, 글루코즈 및 첨가제들을 함유하는 Middlebrook 7H9 브로쓰용 배양 배지들, 및 또한 Middlebrook 7H9 브로쓰 분말을 함유하지 않는 2개의 배양 배지들 리터당 C, N 및 Fe의 몰 함량을 나타낸다.
[표 1]
마이코박테리아 세포 덩어리를 제조하는데 사용된 합성 배지들 중 C, N 및 Fe 함량
Figure pct00001
Middlebrook 7H9 분말은 온타리오 미씨사우가 소재의 BD Canada로부터 수득하였으며 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 약 900mL의 DifcoTM Middlebrook 7H9 브로쓰를 제조하기 위한 대략적인 제형은 다음과 같다:
황산암모늄(0.5 g), L-글루탐산(0.5 g), 시트르산나트륨(0.1 g), 피리독신(1.0 mg), 바이오틴(0.5 mg), 인산이나트륨(2.5 g), 인산일칼륨(1.0 g), 시트르산철암모늄(0.04 g), 황산마그네슘(0.05 g), 염화칼슘(0.5 mg), 황산아연(1.0 mg), 황산구리(1.0 mg).
모든 다른 시약들은 온타리오 오크빌 소재의 Sigma로부터 입수하였다. MCMC-A, MCMC-B, MCMC-C 및 MCMC-D를 제조하기 위해 사용된 배양 배지의 조성(g/L)은 하기 나타낸다. 그러나, 나열된 각각의 구체적인 수는 MCMC-A, MCMC-B, MCMC-C 및 MCMC-D 중의 하나의 방안이며, 이들 수들 각각을 약 10% 내지 약 20% 증가시키거나 감소시켜 C:N 및 C:Fe 비들에서 상응하는 변화들을 가진 MCMC-A, MCMC-B, MCMC-C 및 MCMC-D 배양 배지들의 변형들을 제조할 수 있음을 이해하여야 한다.
MCMC-A.
Middlebrook 7H9 분말 9.5 g
글리세롤 2 mL
글루코즈 20 g
증류수 1 L가 되도록 하는 양
MCMC-B
Middlebrook 7H9 분말 9.5 g
DL-아스파라긴 0.75 g
시트르산철암모늄 0.03 g
글리세롤 2 mL
글루코즈 20 g
증류수 1 L가 되도록 하는 양
MCMC-C
시트르산암모늄 4.84 g
DL-아스파라긴 0.75 g
L-글루탐산 1.0 g
피리독신 0.002 g
바이오틴 0.0005 g
인산이나트륨 5 g
인산일칼륨 2.0 g
시트르산철암모늄 0.12 g
황산마그네슘 0.25 g
염화칼슘 0.0005 g
황산아연 0.005 g
올레산 0.125 g
글리세롤 2 mL
글루코즈 20 g
증류수 1 L가 되도록 하는 양
MCMC-C (D-아스파라긴)
시트르산암모늄 4.84 g
D-아스파라긴 0.75 g
L-글루탐산 1.0 g
피리독신 0.002 g
바이오틴 0.0005 g
인산이나트륨 5 g
인산일칼륨 2.0 g
시트르산철암모늄 0.12 g
황산마그네슘 0.25 g
염화칼슘 0.0005 g
황산아연 0.005 g
올레산 0.125 g
글리세롤 2 mL
글루코즈 20 g
증류수 1 L가 되도록 하는 양
MCMC-C (L 아스파라긴)
시트르산암모늄 4.84 g
L-아스파라긴 0.75 g
L-글루탐산 1.0 g
피리독신 0.002 g
바이오틴 0.0005 g
인산이나트륨 5 g
인산일칼륨 2.0 g
시트르산철암모늄 0.12 g
황산마그네슘 0.25 g
염화칼슘 0.0005 g
황산아연 0.005 g
올레산 0.125 g
글리세롤 2 mL
글루코즈 20 g
증류수 1 L가 되도록 하는 양
MCMC-D
시트르산암모늄 4.84 g
L-글루탐산 1.0 g
피리독신 0.002 g
바이오틴 0.0005 g
인산이나트륨 5 g
인산일칼륨 2.0 g
시트르산철암모늄 1.2 g
황산마그네슘 0.25 g
염화칼슘 0.0005 g
황산아연 0.005 g
올레산 0.125 g
글리세롤 2 mL
글루코즈 20 g
증류수 1 L가 되도록 하는 양
다음 과정은 마이코박테리움 플레이로부터의 마이코박테리아 세포 덩어리의 제조를 기술하므로, 일반적으로 마이코박테리아로부터의 마이코박테리아 세포 덩어리의 제조를 위한 일반적인 예를 제공한다. 당해 분야의 통상의 숙련가는 본 실시에를 읽고 개개의 마이코박테리아 종들, 복합체들 및 균주들의 구체적인 요구들에 맞춰 과정들을 적절히 변형시킬 것임이 인식된다.
마이코박테리움 플레이(균주 110)를 4℃에서 페트리아가니 슬랜트들(Petriagani slants) 위의 콜로니들로서 또는 -80℃에서 20% 글리세롤을 함유하는 Middlebrook 7H9 중 현탁액으로서 저장하였다. 최적의 배양 탄소, 질소 및 철 비들의 측정은 페트리아가니 슬랜트들로부터 제조된 종균 배양물들을 사용하여 수행하였다. 페트리아가니 슬랜트로부터의 콜로니들을 1.2L의 M 배지 속에 두고 이후 현탁액을 7일 동안(오비탈 진탕기 속에서 250 rpm, 37℃, 제조원: Lab-Line Instruments, 미국 일리노이주 멜로즈 파크 소재) 배양하였다. 표준화된 OD로 조절한 후, 200 mL를 1L의 각각의 MCMC를 함유하는 일련의 배양 플라스크들에 가하였다. 배양을 지속시키고(LAB-Line 오비탈 진탕기 속에서 250 rpm, 37℃), 중복된 플라스크들을 10일의 기간에 걸친 간격들에서 제거하였다. 마이코박테리아 덩어리를 저속 원심분리 세척으로 분리하고, 동결건조시키고 건조 중량을 측정하였다. 동결건조가 비현실적인 경우, 건조 중량은 전환 인자 습식 세포 덩어리//6.81=무수 세포 덩어리(당해 인자에 대한 평균±SD는 실험에 의해 6.81±1.16인 것으로 이미 측정되었다, n=7)로부터 계산하였다.
표 2의 결과들은 마이코박테리움 플레이의 수율 및 또한 일(day)들에서 최적 수율의 시간에 있어 MCMC내 상이한 탄소, 질소 및 철 비들의 영향을 나타내고, 표 3의 결과는 마이코박테리아 세포 덩어리의 수율에 있어서 라세미 DL-, D- 또는 L -아스파라긴을 사용한 영향을 나타낸다. 이들 연구들은 상이한 시간들에서 수행되었으며 마이코박테리아 세포 덩어리의 절대 수율들은 연구에 따라 변함이 이해되어야 한다.
마이코박테리움 플레이 세포 덩어리의 수율에 있어서 C, N 및 Fe 함량의 영향
MCMC 조성물 수율, g/L* (A에 대한 배 증가) 일
A 4.52 10
B 4.16 (0.9) 6
C 6.24 (1.4) 6
D 6.20 (1.4) 4
* 수율은 배양 브로쓰의 리터당 마이코박테리움 플레이의 무수 중량 g으로서 나타낸다.
마이코박테리움 플레이의 수율에 있어서 아스파라긴 입체이성체 D, L 또는 DL 라세미 혼합물의 영향
MCMC 조성물 수율, g/L(DL 아스파라긴에 대한 배 증가) 최적 수율, 일
DL-아스파라긴을 사용한 C 4.9 6
D-아스파라긴을 사용한 C 4.9 (0) 6
L-아스파라긴을 사용한 C 5.73 (1.2) 6
표 2에 나타낸 결과들은, 이용가능한 탄소, 질소 및 철의 양이 세포 덩어리의 수율에 있어서 증가들을 초래하며, 또한 시간의 감소가 최대 수율을 수득하기 위해 요구되었음도 입증한다. 당해 결과들은, 예를 들면 아스파라긴 또는 시트르산암모늄(즉, 유기 또는 무기 분자의 형태와 상관없이, 질소의 이용가능한 공급원)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 사용이 수율을 증가시킴을 나타낸다. 황산암모늄대신 시트르산암모늄의 사용과 관련된 2개의 장점들은 시트르산염(배지에 실질적인 완충능을 제공하는, 약산의 염)의 탄소들의 비교적 느린 대사 및, 대사가능하지 않은 황산염(강산의 염)으로부터의 황산의 생성과 일치하는 배양 동안 브로쓰의 pH에 있어서 관찰된 감소된 변동들이다.
표 3에 나타낸 결과들은, D-아스파라긴 또는 DL 아스파라긴의 라세미 혼합물의 사용이 L-입체이성체를 사용하는 경우보다 더 낮은 마이코박테리아 세포 덩어리 수율을 제공하였음을 입증한다. 이들 데이타는 D-입체이성체 또는 라세미 혼합물보다는 오히려 아스파라긴의 L-입체이성체의 보다 효율적인 이용과 일치한다. 시트르산암모늄은, 암모늄 이온들이 라세미체가 아니라는 점에서 질소의 공급원으로서의 추가의 장점을 지니는 것으로 여겨질 수 있다.
제3의 연구는 최적화된 MCMC-C를 사용하여 수행하였으며, 여기서 마이코박테리움 플레이 및 마이코박테리움 스메그마티스 수율들을 비교하였다. 마이코박테리움 스메그마티스(ATCC, 마나사스, VA, 균주 ATCC14468)을 마이코박테리움 플레이에 대해 기술된 바와 같이 제조하고, 정면 배양들(head-to-head cultivations)을 위에서 기술한 바와 같이 수행하였다.
마이코박테리움 플레이 및 마이코박테리움 스메그마티스 세포 덩어리의 제조를 위한 MCMC-C의 용도
마이코박테리움 수율, g 무수 중량/L 최적 수율, 일
마이코박테리움 플레이 7.6 6
마이코박테리움 스메그마티스 9.6 6
표 4에 나타낸 결과들은, MCMC 조성물 C의 사용이 비교적 단기간내에 마이코박테리아 세포 덩어리의 유의적인 양들을 생성하며, 이러한 수율들은 마이코박테리움 플레이에 한정되지 않음을 입증한다.
별도의 연구를 수행하여 배양 동안 배지들의 추가의 통기의 효과를 측정하였다. 마이코박테리움 플레이의 배양은, 삼중 칸막이( tripled baffled ) Fermbach 플라스크들을 사용하여 배지의 혼합 및 대기 산소에 대한 접근을 증가시킨다는 것을 제외하고는, 위에서 기술된 바와 같이 수행하였다. MCMC -C 배지 중 마이코박테리움 플레이의 성장은 Bacto TM AC 브로쓰 및 MCMC -A 속에서 이의 성장과 비교하였다. 120 시간째에 마이코박테리움 플레이 세포 덩어리 수율을 마이코박테리아 세포 덩어리의 무수 중량 g/배양 배지의 리터로 측정하였다. 결과들은, Bacto TM AC 브로쓰의 사용으로 수율은 5.0 g/L이었으며, MCMC -A 사용으로 수율은 3.15 g/L이었고, MCMC-C의 사용으로 수율은 9.2 g/L( MCMC -A에 대해 2.9배 증가 및 Bacto TM AC 브로쓰에 대해 1.84배 증가)이었음을 나타내었다. 이들 데이타들은 , 혼합 및 통기( Fermbach 플라스크들과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 것과 같음)를 증가시키는 배양 조건들 하에서 마이코박테리움 플레이의 수율에 있어 추가의 증가가 존재하며, 신규 배지 조성물에서 수율은 Bacto TM AC 브로쓰 또는 MCMC -A를 사용하여 발견된 것보다 더 큼을 입증한다.
본 발명의 마이코박테리아 세포벽 RNC 의 제조는 동결된 스톡들로부터 제조된 마이코박테리아의 종균 배양물들을 사용하여 수행하였다. 종균 배양물은 1개 바이알의 동결된 스톡을 600 mL 의 변형된 배양 배지에 가함으로써 동결된 스톡으로부터 제조하였으며, 배양은 37℃에서 오비탈 진탕기 속에서 160 내지 250 rpm(제조원: Lab-Line, 미국 일리노이주 멜로즈 파크 소재)에서 교반하면서 7일 동안 수행하였다. 이후에, 종균 배양물을 사용하여 보다 큰 배양 용적에 1:10 희석에서 접종하고, 배양을 동일한 조건들을 사용하여 7일 동안 수행하였다. 마이코박테리아 생물량을 저속 원심분리 세척에 의해 수거하고, 이후 펠렛화된 마이코박테리아를 주사용수(뉴클레아제 비함유 ) 속에 재현탁시켜 10% w/v 현탁액을 수득하였다. 본 발명의 조성물은 하기 실시예들에 기술된 바와 같이 당해 현탁액으로부터 제조하였다.
전형적으로, 미국 특허 제6,326,357호에 기술된 바와 같은 마이코박테리움 플레이의 배양은 종균 배양물의 생성을 위해 7 내지 10일이 걸렸고 마이코박테리아 세포 생물량의 생성을 위해 추가로 10 내지 20일이 걸렸다(총 배양 시간은 17 내지 30일). 당해 제조 공정의 수율은 대략 20g의 마이코박테리움 플레이 습식 중량/배양 배지 리터이며, 이는 대략 2 내지 3g의 마이코박테리움 플레이의 건식 중량/리터에 상응한다. MCMC 조성물 및 배양 조건들을 사용하는 위에 기술된 신규 제조 공정은 총 14일이 걸리며, 수율은 대략 6.5 내지 7.6 g의 마이코박테리움 플레이의 무수 중량/리터이므로, 마이코박테리아 세포 덩어리의 수율에 있어서 유의적인 증가외에 생물량을 제조하는데 요구되는 시간에 있어 유의적인 감소를 제공한다. 이러한 개선들은 기존의 교시내용들과 비교하는 경우 생물량 생산 효율에 있어서 예상치못한 증가를 제공한다.
본 실시예에 기술된 중요한 원리들은 외인성 동물, 식물 또는 진균 물질을 함유하지 않는 마이코박테리아 세포 덩어리의 제조용 배양 배지의 사용, 및 정지 성장 배양 조건들의 특징인 박피로서보다는, 현탁액 속에 마이코박테리아를 유지시키기 위한 교반과 함께 최적화된 배지의 사용을 통한 마이코박테리아의 성장을 최적화시키는 배양 공정이다. 이들 원리들에 대한 변형은 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 특허청구범위의 영역에 벗어남이 없이 특수한 마이코박테리아 종들, 복합체 또는 균주의 최적 성장을 생성하는 본 실시예를 읽은 후 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다.
실시예 2
면역 자극 및 항암 조성물의 제조 동안 완전한 마이코박테리아의 수의 조절
다음 실시예는 확장가능하고, 수 mL로부터 다수 리터 용적들의 범위이며, 핵산들 및 세포벽을 포함하는 신규 세균 조성물의 효율적인 생산을 초래하는 작업 용적들을 사용하는 본 발명의 조성물의 제조를 위한 신규 과정들을 확인한다.
마이코박테리아 세포 덩어리(마이코박테리움 플레이를 마이코박테리아 세포 덩어리의 예시적이고 대표적인 예로 사용한다)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 저속 원심분리에 의해 펠렛화하여 배양 배지 성분들을 제거한 후, 엠. 플레이 세포(DNase- 및 RNase-가 없는 주입용수 속에서 10% w/v 현탁액으로서 제조됨)을 Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기(제조원: Avestin, 카나다 온타리오주 오타와 소재)를 사용하여 고압 균질화(평방인치[PSI] 당 18,000 파운드, 5회 주기, 4℃의 온도에서)로 파괴하였다. 본 발명으로부터 벗어남이 없이 유사하거나 등가인 시스템들에 대해 의존할 수 있다. 이후에, 균질물을 완전한 마이코박테리아의 제거를 취해 최적인 것으로 확인된 상대적인 원심분리력(4℃에서 30분 동안 3,160×g)에서 원심분리하였다. 당해 실시예에서, 10% w/v의 엠. 플레이 현탁액의 샘플들, 고압 균질화 후 균질물, 저속 원심분리(완전하고 오염된 엠. 플레이 함유) 및 고압 균질화의 추가의 주기들을 적용시킨 저속 원심분리로부터의 상층액을 일련 희석(주사용수 속에 10-2 내지 10-7의 희석물들)시키고 콜로니-형성 단위들(CFU)의 수를 트립신 대두 아가 성장 배지들(typtic soy agar grwoth media) 상에 플레이팅(plating)하고, 72 내지 96 시간 동안 37℃에서 배양하고, 콜로니들을 계수하고 이들을 CFU/mL로 나타냄으로써 측정하였다.
아베스틴 고압 균질화 시스템은 효모 및 에스케리키아 콜라이 세포를 1 내지 3회 주기 후 거의 100% 파괴함이 보고되어 있다(참조: http://www.avestin.com/English/efapplications.html#Rupture). 마이코박테리움 플레이의 100% 파괴를 달성하기 위한 5회 균질화 단계의 실패는, 이것들이 당해 미생물에 대한 효능을 제한할 수 있음을 당해 분야의 숙련가에게 암시할 수 있다. 그러나, 예상치않게도 고압 균질화의 5회 주기들에 대해 명백하게 내성이었던 완전한 마이코박테리움 플레이 세포를 함유하는 저속 원심분리 상층액을 4℃의 온도에서 18,000 PSI에서 고압 균질화의 추가의 단계(2 내지 3회)에 적용시켜 완전한 마이코박테리움 플레이 세포에 있어서의 추가의 감소들을 초래하였음이 밝혀졌다(표 5). 추가의 고압 균질화 단계의 예상치못한 잇점들은 또한 다수의 완전한 마이코박테리움 플레이 세포에서 추가로 조절된 감소들 및 마이코박테리아 세포벽-RNC의 수율에 있어서의 증가이다.
마이코박테리움 플레이는 현탁 배양물 속에서 세포의 응집체들로 성장하므로, 마이코박테리아 현탁액 속에서 CFU의 수를 직접 측정하는 것은 불가능하다(대략 100배 과소평가되는 것으로 측정됨). 다음과 같이 측정된 계산 평가를 사용하였다: 도 1에 나타낸 바와 같은 미생물의 크기는 에스케리키아 콜라이의 것과 유사하므로(0.5×2μm: 단일 입자 x-선 회절을 사용함에 의한 전체 에스케리키아 콜라이 세균들의 영상화(imaging). Miao J, 등 PNAS 2003, 100:110-112), 665 펜토그람(fg)인, 개개 에스케리키아 콜라이의 중량을 기준으로 한 마이코박테리움 플레이의 10% w/v 현탁액의 추정된 CFU의 계산을 허용한다(미세기계적 진동자들을 사용한 단일 세포 검출. Illic, B, 등, J. Vac. Sci. Technol. B. 2001, 19(6):2825-2828).
완전한 마이코박테리아의 수에 있어서 고압 균질화의 효과
샘플 CFU/mL
10% w/v의 현탁액(계산된 추정치) 1.5×1011
고압 균질화(5회 주기) 8.7×108
저속 원심분리 상층액 3.0×107
저속 원심분리 원심분리 상층액 이후의 3회의 추가의 고압 균질화 주기들 1.9×107
표 5에 나타낸 결과들은, 고압 균질화의 5회 주기들이 현탁액 속에서 마이코박테리아의 효율적인 파괴와 일치함(상기 계산을 기준으로 99.42 %)을 입증한다. 고압 균질화의 5회 주기 후 저속 원심분리는 고압 균질화를 겪지않는 등가물 엠. 플레이 샘플과 비교하여 완전한, 생 마이코박테리아 세포의 수에 있어서 5,000배 감소를 생성하였다. 저속 원심분리로부터의 상층액을 사용한 추가의 고압 균질화 단계의 사용은 고압 균질화를 겪지않은 등가물 마이코박테리움 플레이 샘플들과 비교하여 완전한, 생 마이코박테리아 세포의 수에 있어서 2,875배 감소를 나타내는 추가의 0.007% 함량을 생성하였다.
당해 실시예에서 입증된 중요한 원리들은, 추가의 균질화 단계의 사용으로부터 발생하는 예상치못한 잇점들이 그람-양성 미생물들로서 고압균질화에 대해 내성인 것으로 고려되는 완전한 마이코박테리아의 추가의 파괴, 및 저속 원심분리 상층액 속에 함유된 마이코박테리아 세포벽 RNC 분획내 완전한 마이코박테리아의 수준을 상이한 균질화 단계의 사용을 통해 조절하는 능력임이 인식되어야 한다.
실시예 3
마이코박테리아 세포벽 및 RNA (MpRNC)를 포함하는 조성물의 제조
마이코박테리아 세포벽 조성물을 제조하기 위해 위에서 기술한 새로운 접근방식의 유용성을 추가로 입증하기 위하여, 마이코박테리아 세포벽로 제형화되고 a) 완전한 마이코박테리아 세포 함량에 있어서의 조절된 감소; b) 정의된 길이의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이들의 생성, 및 c) 예상치못한 면역 자극제 활성의 생성을 포함하는 신규 마이코박테리아 세포벽-RNA 조성물(MRNC)의 제조를 가능하도록 한 상이한 균질화 압력들과 다수의 균질화 주기들의 사용을 필요로 하는 신규 과정들을 개발하였다.
당해 실시예에서 마이코박테리아 세포 덩어리(마이코박테리움 플레이는 마이코박테리아 세포 덩어리의 예시적이고 대표적인 예로서 사용되며, 본 실시예에 기술된 제조 과정들은 세균 및 마이코박테리아 둘다에 적용가능함이 인식되어야 한다)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 우선, 완전한 마이코박테리움 플레이 세포를 저속 원심분리로 세척하여 배양 배지 성분들을 제거한 후 Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기(제조원: Avestin, 캐나나 온타리오주 오타와 소재)를 사용하는 고압 균질화를 사용하여 파괴하였다. 고압 균질화 후 잔존하는 완전한 마이코박테리아 세포를 어떠한 잔류하는, 완전하고 파괴되지 않은 마이코박테리아의 조절된 제거 및 또한 가용성 물질(단백질들을 포함하는 세포질 성분들)의 제거를 위해 최적화된 상대적인 원심분리력들을 사용한 차등 원심분리로 제거하였다. 마이코박테리아 세포벽 단편들과 관련된 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태의 마이코박테리움의 RNA를 포함하는 완전한 마이코박테리아 세포가 없는 제제를 고 상대적 원심분리력에서 원심분리 세척으로 추가로 정제하여 가용성 오염물질들을 제거하였다. MpRNC 분획을 고 상대적 원심분리력에서 원심분리 세척 후 펠렛으로서 분리하였다. MpRNC 분획 중 생 마이코박테리아의 수는 마이코박테리아 완전한 세포-유리된 분획의 일련 희석물들을 트립신 대두 아가 성장 배지들 위에 플레이팅하고, 72 내지 96시간 동안 37℃에서 항온처리하고, 콜로니 형성 단위들(CFUs)의 수를 측정함으로써 측정하였다. 이후에, MpRNC 현탁액을 121℃에서 5 내지 30분 동안 열처리하였다. 표 6은 고-, 중간-, 또는 저 함량의 완전한 마이코박테리아 세포 함량(이후에 각각 MpRNC 고, MpRNC 중간 및 MpRNC 저로 언급됨)을 지닌 MpRNC를 제조하는데 사용된 단계를 나타낸다.
[표 6]
고, 중간 및 저 수준들의 완전한 마이코박테리움 플레이를 함유하는 MpRNC의 제조
Figure pct00002
표 7에 나타낸 결과들은 표 6에 기술된 각종 과정들을 사용하여 제조된 MpRNC에서 CFU들의 수를 나타낸다.
[표 7]
완전한 마이코박테리아 세포 함량의 수준들이 상이한 MpRNC의 제조
Figure pct00003
당해 데이타는, 균질화 압력 및 다수의 균질화 주기들을 증가시킴으로써, MpRNC가 MpRNC에 존재하는 생존가능한 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 수에 있어서 유의적이고 보다 중요하게는 조절된 감소를 겪음을 나타낸다. 완전한 마이코박테리아의 중량%의 계산(665 fg의 세균 중량을 기준으로 함)은 <0.2% (MpRNC 저) 내지 19.6%(MpRNC 고)의 조절된 범위를 나타내었다. 따라서, 당해 분야의 숙련가들은, MpRNC 속에서 생존가능한 마이코박테리아 세포의 수가 본 발명에 기술된 바와 같이 균질화 압력의 조절된 사용, 균질화 주기들의 수 및 차등적 원심분리의 사용과 같은 정의된 방법의 적절한 사용에 의해 100배 범위 이상 용이하게 조절될 수 있음을 인식할 것이다.
실시예 4
마이코박테리움 보비스 균주 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스 및 마이코박테리움 박카에로부터의 MRNC의 제조
당해 실시예에서, 3개의 상이한 마이코박테리아, 즉, 배양물 속에서 느리게 성장하는 것으로 알려진 1개 및 배양물 속에서 신속하게 성장하는 것으로 알려진 2개를 사용하여 상이한 MRNC 조성물을 제조하였다. 이로써, 본 발명의 실시예들 1, 2 및 3과 함께 당해 실시예는 당해 분야의 숙련가에게 어떠한 마이코박테리아 종들 또는 균주로부터 MRNC를 제조하는 방법을 교시한다. 핵산 조성물을 보존시키기 위하여, 뉴클레아제가 없는(RNase가 없고 DNase가 없는) 시약들을 전체에서 사용하였다. 당해 분야의 통상의 기술자는 본 발명을 읽고서 마이코박테리움 플레이로부터 MpRNC의 제조를 위한 실시예들 1, 2 및 3에서 상세히 기술된 바와 같은, 상이한 균질화 주기들과 압력들의 사용, 및 차등적 원심분리의 선택적 사용의 적용이 바람직한 적용을 위한 다른 종들로부터 완전한 마이코박테리아 세포의 최적 수준을 함유하는 RNC 조성물의 제조를 가능하게 함을 인식할 것이다.
마이코박테리아 생물량으로부터 또는 시판되는 이용가능한 공급원들로부터의 마이코박테리움 보비스 BCG를 사용하여 MbRNC 조성물을 제조할 수 있다. 당해 실시예에서 BCG의 콘노트 균주(Connaught strain)를 사용하였다. BCG는 2 내지 10×108 CFU/mg을 함유하는 동결건조된 분말(제조원: Immucyst, Aventis, 캐나다 온타리오주 토론토 소재)로서 상업적으로 이용가능하다. 동결건조된 분말을 우선 주사용수(제조원: Wisent) 속에 30분 동안 20℃에서 간헐적인 와동으로 재현탁시켰다. 현탁된 세포를 저속 원심분리로 펠렛화한 후 Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기를 사용한 고압 균질화에 이은 차등적 원심분리로 파괴하여 MpRNC 중간에 대해 약간의 변형과 함께 기술된 바와 같이 MbRNC를 분리하였다. 구체적으로, 주사용수 중 0.243% w/v 마이코박테리움 보비스 BCG 현탁액을 4℃에서 열 교환기 순환수를 사용하여 18,000 psi에서 5 주기들의 고압 균질화에 적용시켰다. 이후에, 균질물을 3,160×g에서 30분 동안 원심분리하여 어떠한 잔류하는, 완전하고 파괴되지 않은 마이코박테리움 보비스 BCG도 파괴하였다. 이후에, 마이코박테리아 세포벽 단편들과 관련된 마이코박테리움의 RNC를 함유하는 상층액을 38,400×g에서 1시간 동안 원심분리하여 가용성 오염물질들을 제거하고 RNC 및 마이코박테리움 보비스 BCG 세포벽(MbRNC)을 펠렛화하였다. 이후에, 펠렛을 주사용수 속에 재현탁시키고 위에서 기술한 바와 같이 추가의 2회 주기들 동안 균질화하였다. 마이코박테리움 보비스 MbRNC를 함유하는 현탁액을 121℃에서 5 내지 30분 동안 열처리하였다.
배양된 마이코박테리아 생물량으로부터 마이코박테리움 스메그마티스(버지니아주 마나사스 소재의 ATCC로부터 입수, 균주 14468)를 사용하여 MsRNC를 제조하였다. 마이코박테리움 스메그마티스 세포는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 우선 완전한 마이코박테리아(마이코박테리움 스메그마티스)를 저속 원심분리로 세척하여 배양 배지 성분들을 제거한 후, MpRNC에 기술된 바와 같이 Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기를 사용한 고압 균질화에 이어 차등적 원심분리를 사용하여 파괴하였다. 상세하게는, 주사용수 중 10% w/v 마이코박테리움 스메그마티스 세포 현탁액을 18,000psi에서 5 주기들의 고압 균질화에 적용시켰다. 이후에, 균질물을 4℃에서 30분 동안 3,160×g에서 원심분리하여 완전하고 파괴되지 않은 마이코박테리움을 침강시켰다. 이후에, 마이코박테리아 세포벽 단편들과 관련된 마이코박테리움의 RNA를 함유하는 상층액을 4℃에서 1시간 동안 38,400×g에서 원심분리하여 가용성 오염물질들을 제거하고 MsRNC를 펠렛화하였다. 이후에, MsRNC 펠렛을 주사용수 속에 재현탁시키고 위에서 기술한 바와 같이 추가의 2회 주기들 동안 균질화하였다. 마이코박테리움 스메그마티스 RNC (MsRNC)를 함유하는 현탁액을 121℃에서 5 내지 30분 동안 열처리하였다.
마이코박테리움 박카에(균주 ATCC15483, 미국 버지니아주 마나사스에 소재하는 아메리칸 타이핑 컬쳐 컬렉션즈(American Typing Culture Collections))를 OADC 농축물이 보충된 Middlebrook 7H9 브로쓰(제조원: BD Diagnostic System, 미국 매릴랜드주 스파크스 소재) 속에서 배양하였다. 펠렛화된 세균들을 사용 전에 -20℃에서 저장하였다. OADC 농축물(BD)이 보충왼 Middlebrook 7H9 브로쓰는 OADC 농축물중 아직 알려지지 않은 성장 인자(들)의 존재로 인하여 합성 배지 속에서의 성장과 비교하여 마이코박테리움 박카에의 최적 성장을 허용하였다. 당해 실시예에서는, 본원에 기술된 신규 제조 방법을 사용하여 외인성 물질들에 대한 추가의 노출이 없도록 하였다. 우선, 세포를 저속 원심분리로 세척하여 배양 배지 성분들을 제거한 후, MpRNC에 대해 기술된 바와 같이 Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기를 사용한 고압 균질화에 이어 차등적 원심분리를 사용하여 파괴하였다. 상세하게는, 주입용수 중 10% w/v 마이코박테리움 박카에 현탁액을 18,000 psi에서 고압 균질화의 5회 통과들에 적용시켰다. 이후에, 마이코박테리아 세포벽 단편들과 관련된 마이코박테리움의 RNA를 함유하는 상층액을 38,400×g에서 1시간 동안 원심분리하여 가용성 오염물질들을 제거하고 MvRNC를 펠렛화하였다. 이후에, 펠렛을 주사용수 속에 재현탁시키고 위에서 기술한 바와 같이 추가의 2회 주기들 동안 균질화시켰다. 마이코박테리움 박카에 RNC (MvRNC)를 함유하는 현탁액을 121℃에서 5 내지 30분 동안 열처리하였다.
실시예 5
그람-음성 세균들로부터 BRNC의 제조
본 발명의 BRNC 조성물은 예를 들면, 세균의 파괴에 이은 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출 및 에탄올 침전(Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, Ausubel 등 Eds., John Wiley & Sons Inc., New York, USA에 기술된 바와 같음)에 의해 1개 또는 수개의 그람 음성 세균들로부터 제조할 수 있다. 핵산을 함유하는 조성물의 추출 전에 원치않는 화학물질 종들을 분해시켜 수율을 최적화시키기 위해 설계된 효소 과정들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 그람-음성 세균들을 5 mL의 RNase가 없는 50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0 속에 현탁시키고, RNase가 없는 라이소자임(제조원: Sigma-Aldrich)을 1 mg/mL의 농도로 첨가하고 90분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이후에, RNase가 없는 프로테이나제 K(제조원: Invitrogen, 캐나다 온타리오주 부를링톤 소재)을 가하여 0.1 mg/mL의 최종 농도를 수득하고, RNase가 없는 나트륨 도데실 설페이트(제조원: BioRad, 미국 캘리포니아주 리치몬드 소재)를 가하여 1% w/v의 최종 농도를 수득하고, 항온처리를 10분 동안 65℃에서 지속하였다. 이후에, 핵산을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출로 분리한다. RNA를 함유하는 조성물은 임의 처리하여(예를 들면, 고압 균질화, 기계적 전단, 초음파, 또는 오토클레이빙의 사용에 의해) 본 발명의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 생성시킬 수 있다.
세균 RNA를 임의로 사용하여 본 발명의 실시예 1, 2, 3 및 4에 기술된 바와 같은 고압 균질화 및 차등적 원심분리 및 열처리의 사용에 의해 세균 세포벽 RNC 제형(BRNC)을 제조함으로써, 이들이 항암 및 면역 자극제 활성을 가지도록 할 수 있다. BRNC는 실시에 36 및 37에 기술된 바와 같이 양이온성 리포좀들 또는 나노입자들과 같지만 이에 한정되지 않는 약제학적 담체들과 추가로 조합시킬 수 있다.
실시예 6
그람-양성 세균들로부터 BRNC 또는 MRNC의 제조
본 발명의 BRNC 조성물 및 MRNC 조성물은 예를 들면, 세균 또는 마이코박테리움의 파괴에 이은 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출 및 에탄올 침전에 의해 1개 또는 수개의 그람 양성 세균(마이코박테리아 포함)으로부터 제조할 수 있다(Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, Ausubel 등 Eds., John Wiley & Sons Inc., New York, USA에 기술된 바와 같음). RNA의 추출 전에 원치않는 화학물질 종들을 분해함으로써 수율을 최적화하도록 설계된 효소 과정들을 사용할 수 있다. 위에서 기술된 신규 과정들의 적용능의 예로서, 그람-양성 세균을 5 mL의 RNase가 없는 50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0 속에 현탁시키고, RNase가 없는 라이소자임(제조원: Sigma-Aldrich)을 1 mg/mL의 농도로 가하고 90분 동안 37℃에서 항온처리하였다. RNase가 없는 프로테이나제 K(트리티라키움 알붐(Tritirachium album)으로부터 제조, 제조원: Invitrogen, 캐나다 온타리오주 부를링톤 소재)를 이후에 가하여 0.1 mg/mL의 최종 농도를 수득하고, RNase가 없는 나트륨 도데실 설페이트(제조원: BioRad, 캐나다 온타리오주 미씨싸우가 소재)를 가하여 1% w/v의 최종 농도를 수득하고, 항온처리를 65℃에서 10분 동안 지속하였다. 이후에, RNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출 및 에탄올 침전으로 분리하였다.
BRNC 및 MRNC는 (예를 들면, 고압 균질화, 기계적 전단, 초음파 처리, 또는 열 처리의 사용에 의해) 임의 처리하여 본 발명의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 생성시킬 수 있다.
세균 RNA를 임의로 사용하여 본 발명의 실시예들 1, 2, 3 및 4에 기술된 바와 같이 고압 균질화 및 차등적 원심분리의 사용에 의해 BRNC 제형들을 제조함으로써 이들이 항암 및 면역 자극제 활성을 갖도록 할 수 있다. 세균 RNC는 실시예 36 및 37에 기술된 바와 같이 양이온성 리포좀들 또는 나노입자들과 같지만 이에 한정되지 않는 약제학적 담체들과 추가로 조합할 수 있다.
마이코박테리아 RNA를 임의로 사용하여 본 발명의 실시예들 1, 2, 3 및 4에 기술된 바와 같은 고압 균질화 및 차등적 원심분리 및 열 처리의 사용에 의해 MRNC 제형들을 제조함으로써, 이들이 항암 및 면역 자극 활성을 가지도록 할 수 있다. MRNC는 실시예 36 및 37에 기술된 바와 같이 양이온성 리포좀들 또는 나노입자들과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 약제학적 담체들과 조합시킬 수 있다.
실시예 7
완전한 마이코박테리아 세포에 대한 마이코박테리아 세포 벽 조성물의 형태학적 시험
마이코박테리아 세포벽 조성물의 형태학적 비교는 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 수행하였다. 당해 실시예에서 MpRNC는 BRNC 및 MRNC의 완전한 세포 성분의 예시적이고 대표적인 실시예로 사용한다.
마이코박테리움 플레이 생물량의 샘플을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, MpRNC 고, 중간 및 저의 샘플을 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하며, MCC의 샘플을 미국 특허 제6,326,357호에 기술된 바와 같이 제조하고, MCWE의 샘플을 미국 특허 제5,759,554호에 기술된 바와 같이 제조하였다. 2개의 후자의 제조 방법 둘다는 프로나제/트립신 분해 및 페놀/우레아 처리를 이용하는 과정들을 사용한다. 모든 샘플들을 TEM을 사용하여 형태학적으로 시험하였다. 주사용 수 중 현탁액으로서 제조한 샘플들(1 mg/mL w/v)을 5% w/v의 글루타르알데하이드로 1시간 동안 예비고정(용적 비: 1:1)시켰다. 원심분리(8,000×g에서 10분 동안) 후 펠렛들을 신선한 2.5% v/v 글루타르알데하이드 속에 현탁시키고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리 후, 샘플들을 세척 완충액으로 세척하고 추가의 공정 전에 4℃에서 세척 완충액 속에 유지시켰다. 세척 완충액 속에서 3회 세척 후, 샘플들을 사산화오스뮴 및 페로시안화칼륨으로 2시간 동안 예비-염색하고, 세척하며, 아세톤 속에서 탈수시켰다. 이후에, 샘플들을 아세톤 중 증가하는 농도들의 EponTM으로 침윤시키고, 58℃에서 48시간 동안 중합시켰다. 두꺼운 단면들(90 내지 100 nm)을 200-메쉬(mesh) 구리 격자들 위에 두고, 아세트산우라닐에 이어 레이놀즈 리드(Reynolds lead)로 염색하였다. 샘플들을 JEOL JEM-2011 200kV w/Fas TEM w/ Quartz XOne 미세분석 시스템(Microanalytical System) 및 Gatan DualView 300W 1.3k×1k CCD 카메라 또는 AMT 2k×2k CCD 카메라가 장착된 Philips CM200 200 kV TEM으로 시험하였다.
형태학적 분석의 결과들은 도 1에 나타낸다. 도 1a는 완전한 마이코박테리움 플레이(참조 물질로서 사용됨)를 나타내고, 도 1b는 미국 특허 제6,326,357호에 따라 제조된 MCC를 나타내며, 도 1c는 미국 특허 제5,759,554호에 따라 제조된 MCWE를 나타낸다. 파괴되지 않은 엠. 플레이 세포는 전자 집적 구조(electron dense structure)로서 관측하며, 어떠한 세포막 또는 세포벽 단편들도 거의 함유하지 않았다. 예상치않게도, MCWE 및 MCC의 제조시 사용된 차등적 원심분리 단계로, 이들의 조성물이 완전한 마이코박테리아 및 세포벽 단편들의 혼합물(각각 8.5 및 3.0%의 완전한 세균인 것으로 추정됨)과 일치한 전자 집적 및 전자 투명 구조들의 혼합물이었음이 관찰되었다. 도 1d, 1e 및 1f는, MpRNC 저, 중간 및 고 각각에서 완전한 마이코박테리아의 수가 본 발명의 실시예 3의 제조 과정들의 사용을 통해 조절됨을 나타낸다(각각 0.0, 2.5 및 12.5%인 것으로 추정됨).
당해 형태학적 분석의 결과들은, 본 발명의 제조 공정이 MpRNC 제형들의 조절가능한 완전한 마이코박테리아 세포 함량을 생성함을 입증한다.
실시예 8
마이코박테리아 세포벽 조성물에서 오염물질들의 제조
미국 특허 제5,759,554호( MCWE ) 및 미국 특허 제6,326,357호( MCC ) 둘다에 따라 제조되는 마이코박테리아 세포벽은 단백질분해 효소 분해( 스트렙토마이세스 그리세우스( Streptomyces griseus ) 프로나제 /소 트립신)과 함께 페놀/ 우레아 처리 단계를 사용한다. 이러한 과정은, 이들 특허들 둘다가 이들 및 다른 오염물질들을 제거하기 위한 세척 과정들의 사용을 교시하고 있다고 해도, 최종 세포벽 조성의 단백질분해성 효소 및 페놀 오염을 초래할 수 있다.
당해 실시예에서 , 미국 특허 제5,759,554호, 미국 특허 제6,326,357호에 따라 제조된 마이코박테리아 세포벽의 페놀 성분/오염, 및 본 발명의 실시예 3에 따라 제조된 MRNC 는 HPLC 로 측정하였다. MpRNC 중간은 MRNC 의 대표적인 실시예로 사용하였으며, 본 발명의 실시예 3에 교시된 제조 원리들은 모든 MRNC 및 또한 BRNC 에 적용가능함이 인식되어야 한다.
상이한 마이코박테리아 세포벽 조성물(주사용 수 중의 1 mg / mL ) 또는 수중 적절한 페놀 표준물들(0 내지 10㎍/ mL )을 12 M HCl 로 100℃에서 60분 동안 처리하였다. 냉각 후, 마이코박테리아 세포벽 조성물 또는 페놀 표준물들을 디에틸 에테르(2 mL의 디에틸 에테르/mg의 세포벽 조성물)로 추출하였다. 디에틸 에테르 상을 제거하고 메탄올 중 0.05 M NaOH(3 mL / mg 의 세포벽 조성물)와 혼합하였다. 질소 스트림을 사용하여 증발 건조시킨 후, 잔사를 물(0.2 mL / mg 의 마이코박테리아 세포벽) 속에 용해하고, 100μL를 페놀 함량에 대해 HPLC 로 분석하였다. 분석용 HPLC 시스템은 717 플러스 자동 샘플러( plus auto sampler ), Waters 1525 이원( Binary ) HPLC 펌프 및 C-18 역상 분석 4.6×150 mm 컬럼(제조원: Waters , Nova - Pak C18 , WAT 044375)에 연결되고, 4μm 실리카(제조원: Waters Ltd ., 캐나다 퀘벡주 라친에 소재)로 충전된 Waters 248L 이중 파장 흡광도 검출기로 이루어진 Waters Breeze HPLC를 이용하였다 HPLC 분리들을 실온에서 100μL 샘플 용적들을 사용하여 다음의 구배 용출 조건들을 사용하는 1.0 mL /분의 유속에서 수행하였다: 용출제 A는 1% 아세트산(v/v)으로 산성화된 물이었고 용출제 B는 100% 아세토니트릴이었다. 용출제 A를 95%에서 2분 동안 유지시킨 후 60%로 15분에 걸쳐 선형으로 감소시켰으며, 여기서 이를 3분 동안 유지시켰다. 페놀의 UV 검출은 270 nm에서 수행하였다.
외인성 단백질들의 검출을 위해, 20 mL의 상이한 마이코박테리아 세포벽 조성물을 72 시간의 기간 동안 동결건조시켰다. 단백질들을 변형된 RIPA 추출 완충액(1% 트리톤 X-100, 0.5% NP-40%, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 트리스 pH 7,5, 4℃에서)을 사용하여 동결건조된 마이코박테리아 세포벽 조성물로부터 추출하였다. 추출물의 총 단백질 함량은 마카르트 방법(Macart method)(참조: Macart and Gerbaut, 1982 Clin. Chim. Acta 122:93-101)에 따라 측정하였다. 샘플들을 램플린 샘플 완충액(Laemmli sample buffer)(62.5 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 25% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀블루 및 5% 머캅토에탄올)로 희석하여 mL당 1mg의 단백질의 농도를 수득하였다. 총 60μL의 희석 샘플들을 10% 내지 20% 구배 SDS-PAGE 겔들(제조원: Bio-Rad, 캐나다 온타리오주 미씨싸우가 소재)에 로딩하고 전기영동을 실온에서 140V에서 6 내지 8시간 동안 수행하였다. 교정을 위해, 분자량 표준 혼합물들(제조원: Bio-Rad, 캐나다 온타리오주 미씨싸우가 소재)을 샘플들과 평행하게 이동시켰다. 겔들을 콜로이드성 블루 염료(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 38시간 동안 실온에서 사용하여 단백질을 염색하였다. 목적한 밴드(80, 분자량들이 상이한 단백질들을 함유)을 겔들로부터 절개하고 96-웰 플레이트들에 둔 후 물로 세척하였다. 트립신 분해를 마쓰프렙 액체 핸들링 로보트(MassPrep liquid handling robot)(제조원: Waters, 미국 매사츄세츠주 밀포드 소재) 위에서 제조업자의 명세들에 따라 수행하였다. 요약하면, 단백질들을 10mM DTT로 환원시키고 55mM 요오도아세트아미드로 알킬화하였다. 트립신 분해를 105 mM 변형된 돼지 트립신(서열분석 등급, 제조원: Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 58℃에서 1시간 동안 수행하였다. 분해 생성물들을 1% 포름산, 2% 아세토니트릴에 이어 1% 포름산, 50% 아세토니트릴을 사용하여 추출하였다. 회수된 추출물들을 혼주(pooling)시키고, 진공 원심분리 건조시킨 후 8μL의 0.1% 포름산 속에 현탁시키고 4μL를 질량 분광법으로 분석하였다. 펩타이드 샘플들을 온라인 역상(online reversed-phase(RP)) 나노규모 모세관 액체 크로마토그래피(nanoLC)로 분리하고 전기분무 질량 분광법(electrospray mass spectrometry)(ES MS/MS)으로 분석하였다. 실험들을 나노전기분무 이온 공급원(제조원: ThermoFisher)이 장착된 LTQ 선형 이온 트랩 질량 분광계(linear ion trap mass spectrometer)(제조원: ThermoFisher, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)에 연결된 Thermo Surveyor MS 펌프를 사용하여 수행하였다. 펩타이드 분리를 PicoFrit 컬럼 BioBasic C18, 10 cm×0.075 mm 내부 직경(제조원: New Objective, 미국 매사츄세츠주 워번 소재) 위에서 2 내지 50%의 용매 B(아세토니트릴, 0.1% 포름산)의 선형 구배를 사용하여 30분 내에, 200 nL/분(유동-스플리팅(flow-splitting)으로 수득함)내에 수행하였다. 질량 스펙트럼을 Xcalibur 소프트웨어 버젼 2.0을 사용하여 데이타 의존적 획득 방식을 사용하여 획득하였다. 각각의 완전한 주사(scan) 질량 스펙트럼(400 내지 2000 m/z)에 이어 7개의 가장 강렬한 이온들의 충돌-유도된 해리를 수행하였다. 역학적 배제(30 초 배제 기간) 함수가 가능하였으며, 상대적인 충돌 단편화 에너지를 35%로 설정하였다. 모든 MS/MS 샘플들을 Mascot(제조원: Matrix Science, 영국 런던 소재; 버젼 2.2.0)를 사용하여 분석하였다. Mascot를 설정하여 분해 효소가 트립신이었던 것으로 추정되는 Uniref100 데이타베이스를 조사하였다. Mascot를 0.50 Da의 단편 이온 질량 공차(tolerance) 및 2.0 Da의 모 이온 공차를 사용하여 조사하였다. 시스테인의 요오도아세트아미드 유도체를 고정된 변형으로 규정하고 메티오닌의 산화를 가변성 변형으로 규정하였다. 2개의 손실된 트립신 분해 절단 부위들이 허용되었다. Scaffold(제조원: Proteome Software Inc., 미국 오레곤주 포트랜드 소재)를 사용하여 MS/MS계 펩타이드 및 단백질 확인들을 입증하였다. 펩타이드 확인들은, 이들이 펩타이드 프로펫 알고리즘(Peptide Prophet algorithm)(참조: Keller, A et al Anal. Chem. 2002; 74(20):5383-92)에 의해 규정된 것으로서 95.5% 초과의 가능성을 확립할 수 있는 경우 허용하였다. 단백질 확인들은, 이들이 95.0% 초과의 가능성에서 확립될 수 있고 적어도 2개의 확인된 펩타이드를 함유하는 경우 허용하였다. 단백질 가능성들은 단백질 프로펫 알고리즘(Protein Prophet algorithm)[참조: Nesvizhskii, AI Anal Chem. 2003 Sep 1;75(17):4646-58]에 의해 지정하였다. 유사한 펩타이드를 함유하고 MS/MS 분석만을 기초로 분화될 수 없었던 단백질들을 그룹화하여 최소한의 수의 단백질들을 생성하였다.
수득된 결과들(표 8)은, MCWE 및 MCC 둘다가 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로나제 속에서 발견된 주요 단백질분해 효소인, 페놀 및 프로테아제 아미노펩티다제로 오염되어 있음을 나타낸다. 실시예 3, 표 7에 기술된 바와 같이 제조된 MpRNC는 어떠한 검출가능한 프로나제 성분들 또는 페놀도 함유하지 않았다.
마이코박테리아 세포벽 조성물의 페놀, 프로나제 및 트립신 오염
마이코박테리아 세포벽 조성물
 페놀, ppm
(ng/mg의 세포벽)		 스트렙토마이세스 그리세우스 프로나제(아미노펩티다제 단백질)(아미노펩티다제)*
MCWE 미국 특허 제5,759,554호 652.53 있음
MCC 미국 특허 제6,326,357호 657.89 있음
MpRNC 본 발명의 실시예 3 0.00 없음
표 8의 데이타는, 마이코박테리아 세포벽의 제조시 페놀의 사용이, MCWE 및 MCC의 경우에 비교가능했던 검출가능한 페놀 및 외인성 단백질(프로나제 아미노펩티다제) 오염을 초래함을 입증한다. RNase가 없는 주사용 수만이 MRNC 조성물을 수득하는데 사용되는 본 발명의 제조 과정들을 사용하는 한가지 장점은, 수득되는 조성물이 페놀과 외인성 단백질 오염을 함유하지 않는다는 것이다.
페놀은 양쪽성이며 마이코박테리아 세포벽내 이의 후속적인 존재는 마이코박테리아 세포벽의 소수성 영역들(공유결합적으로 연결된 마이콜산들)내 국재화와 일치하며, 여기서 이는 반복된 원심분리-계 세척들에도 불구하고 트랩되어(trapped) 잔존한다.
MCWE 및 MCC내에서 오염 단백질들, 구체적으로 스트렙토마이세스 그리세우스 아미노펩티아제의 분석은 양성이었으므로, 마이코박테리아 세포벽의 제조시 사용된 효소 처리가 외인성 및 잠재적으로 면역원성 단백질들의 존재를 생성함을 확인한다.
실시예 9
전기영동으로 측정된 MpRNC 조성물의 핵산 함량 및 프로파일
MpRNC 중간체를 MRNC의 대표적인 예로 사용하였으며, 당해 실시예에 교시된 분석들은 모든 MRNC 및 BRNC 조성물에 적용가능함이 인식되어야 한다.
열 처리(121℃, 30분) 전 및 후에 수집된 주사용 수 중 MpRNC 중간 현탁액을 Bioanalyzer system (Bioanalyzer model # 2100, 제조원: Agilent, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)을 사용하여 이의 핵산 프로파일에 대해 전기영동적으로 분석하였다. 핵산 분획을 실시예 6에서 기술한 바와 같이 수득하였다. 핵산 분획을 30 ng/μL의 농도로 희석시켰다. 추출된 핵산의 길이의 전기영동적 분석을 RNA 6000 나노 키트(Agilent # 5067-1511)를 사용하는 Bioanalyzer 전기영동 단위를 사용하여 달성하였다. 당해 키트는 25 내지 6000개 뉴클레오타이드 범위의 RNA의 품질에 있어서의 정보를 제공한다. 이후에 오토클레이빙 후 MpRNC 중간을 6 내지 150개 뉴클레오타이드의 크기 범위의 작은 핵산들의 분석을 위해 설계된 Small RNA Kit(제조원: Agilent Technologies Canada Inc., 캐나다 퀘벡주 생-로랑 소재, kit # 5067-1548)를 사용하여 추가로 분석하였다. MpRNC 고 및 MpRNC 저를 또한 열 처리(121℃, 30 분) 후 Small RNA kit(제조원: Agilent)를 사용하여 분석하였다. 상이한 전기영동 분석들의 결과는 도 2a 및 도 2b에 나타낸다.
도 2a는, RNA nano 6000 kit를 사용하여 분석하는 경우 오토클레이빙 전 MpRNC 중간이 대략 25개 염기 내지 4000개 염기에 근접한 핵산 프로파일을 소유함을 입증한다. 당해 결과는, MpRNC 중간을 제조하기 위한 고압 균질화 단계(상이한 가압 및 사이클들의 수)의 사용이, 길이가 25 내지 4000개 염기인 폴리리보뉴클레오타이드 쇄 길이를 함유하는 조성물을 생성함을 입증한다. 오토클레이빙 후, MpRNC 중간은, 25개 염기 내지 200개 염기 범위의 보다 조밀한 핵산 분포를 나타낸다 (도 2b). Small RNA Kit를 사용한 추가의 분석은, 오토클레이빙 전 제제로부터 수득한 프로파일과는 대조적으로, 모든 MpRNC 제제들(고, 중간 및 저)이 비교가능하지만(도 2b) 양에 있어서 상이한(고>중간>저) 핵산 프로파일을 소유함을 입증하였다.
도 2b는, MpRNC 중간이 최대 20 내지 40개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 피크를 소유하며, 핵산 프로파일이 5 내지 60개 염기의 길이임을 입증한다. MpRNC 조성물은 100개 염기에서 용출되는 단지 미량들의 핵산 물질만을 가졌으며, 심지어 길이가 약 150개 염기에서 용출되는 올리고리보뉴클레오타이드 물질은 거의 가지지 않았다. 당해 결과들은, MpRNC를 제조하기 위한 고압 균질화 및 열 처리 단계(열처리와 함께 상이한 가압 및 다수의 주기들)의 사용이, 쇄 길이가 60개 미만의 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 함유하는 조성물을 생성함을 입증한다. 비교가능한 핵산 프로파일들이 또한 MpRNC 저 및 MpRNC 고에서 관찰된다(도 2b).
실시예 10
마이코박테리움 플레이 및 MpRNC 조성물에서 핵산들의 분석
당해 실시예에서 마이코박테리움 플레이 및 MpRNC 조성물(고-, 저- 및 중간-)의 핵산 함량을 측정하였다. MpRNC 조성물을 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. 당해 실시예에서 MpRNC는 MRNC의 핵산 함량의 예시적이고 대표적인 예로서 사용된다.
핵산들을 다음 과정을 사용하여 각각의 조성물로부터 추출하였다. 각각의 조성물(1 mg/ml의 농도에서 700μL)을 DNase- 및 RNase가 없는 라이소자임으로 분해한 후 불활성화시키고 DNase- 및 RNase가 없는 프로테이나제 K(둘다의 제조원: Sigma-Aldrich Canada, 캐나다 온타리오주 아크빌 소재)로 분해하였다. 핵산들을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1 v/v)로 추출하고 글리코겐, 아세트산나트륨 및 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 침전물들을 80% 빙냉 에탄올로 세척하고 50μL의 증류수로 가용화시켰다. 농도를 UV 분광광도계 속에서 260/280 nm에서의 흡광도를 측정하여 측정하였다. 각각의 조성물의 핵산 함량을 표 9에 나타낸다.
MpRNC의 핵산 함량
조성물 핵산 함량, ng/mg
마이코박테리움 플레이 44,786
MpRNC 저 2,683
MpRNC 중간 4,470
MpRNC 고 15,686
이들 결과들은, MpRNC(예를 들면, MpRNC 고) 중 완전한 마이코박테리아 세포의 증가하는 양이 MpRNC 조성물 중 핵산들의 증가하는 양과 관련되어 있음을 입증한다. 당해 결과들은 또한, MpRNC(2,683 내지 15,686 ng/mg)의 핵산 함량이 완전한 마이코박테리움 플레이의 것(44,786 ng/mg)과는 유의적으로 상이함을 나타낸다.
실시예 11
MpRNC 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이에서 DNA 대 RNA 비의 측정
MpRNC 조성물을 MRNC의 대표적인 예들로 사용하였으며, 당해 실시예에 교시된 분석들은 MRNC 및 BRNC 조성물 모두에 적용가능함이 인식되어야 한다.
실시예 3에서 제조한 MpRNC 고, MpRNC 중간 및 MpRNC 저 및 또한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포(실시예 1에 기술된 바와 같이 제조함)의 DNA 대 RNA 비의 분석은 우선 추출된 핵산들의 RNase-A를 사용한 효소 분해에 이은 Bioanalyzer 2100 전기영동 프로파일 및 Agilent Small RNA Kit(kit # 5067-1548)를 사용함에 의한 올리고리보뉴클레오타이드 함량 정량화를 수행하였다.
추출된 핵산들(RNase 완충액 중 1260 ng/μL)의 RNase-A 분해를 DNase가 없는 리보뉴클레아제 A(RNAse-A, 100℃에서 30분 동안 처리하여 DNase 활성을 제거함)(0.1㎍의 효소, 37℃에서 2시간)를 사용하여 수행하였다. RNAse-A를 Ameresco(미국 오하이오주 솔론 소재)로부터 수득하였다. RNase A-처리된 핵산의 샘플(20 ng/μL)을 바이오분석기를 사용하여 분석하였다. DNA 및 RNA의 양을 MpRNC 고, MpRNC 중간 및 MpRNC 저 및 또한 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포 속에서 하기 식을 사용하여 측정하였다:
DNA 함량 = (총 핵산 함량 - RNase-A 처리 후 핵산 함량).
바이오분석기 분석의 결과들을 MpRNC 고의 경우 도 3a에, MpRNC 중간의 경우 3b에, MpRNC 저의 경우 3c에 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 전체 세포의 경우 3d에 나타낸다. RNA 및 DNA 함량과 관련하여 MpRNC(고-, 저- 및 중간-)의 분석의 결과들을 표 10에 나타낸다.
MpRNC 조성물의 DNA 및 RNA 함량
조성물 DNA 함량(총 핵산 %) RNA 함량(총 핵산 %)
MpRNC 저 0 100
MpRNC 중간 0.24 99.76
MpRNC 고 3.6 96.4
오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 4.0 96.0
둘째로, 본 발명의(저,중간 및 고) MpRNC의 핵산 함량 및 DNA 대 RNA 비의 분석을 다음과 같이 보다 민감한 정량적 방법을 사용하여 수행하였다: 실시예 6에서 수득한 핵산 분획을 Microsep 1K 단위[분자량 컷오프(cutoff) =1000 Da, 제조원: Pall® Life Sciences, 미국 미주리주 안 아버 소재]를 사용한 한외여과에 의해 회수하였다. 이후에, 핵산 용액을 뉴클레오사이드 5'-모노포스페이트들의 혼합물에 대해 뉴클레아제 P1(제조원: Sigma-Aldrich, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)을 사용한 후 리앙(Liang)이 보고한 과정(참조: Liang 등, Ann. Chim. Acta 2009, 650:106-110)에 따라 분해하였다. 최적의 뉴클레아제 P1 분해를 보증하기 위해, 시험할 총 50μL의 핵산 수용액들을 수욕 속에서 95 내지 100℃에서 10분 동안 가열한 후 빙상에서 즉시 급냉시켰다. 뉴클레아제 P1을 5 단위/μL에서 0.5mM ZnCl2, pH 5.3을 함유하는 30mM 아세트산나트륨 완충액 속에서 제조하였다. 효소 분해를 위해, 수용액 중 핵산 50μL를 동일한 용적의 뉴클레아제 P1 용액과 혼합한 후 50℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 수득되는 혼합물을 실온으로 냉각시키고 HPLC 분석 전에 Nanosep 10K 여과기를 통해 10,000g에서 20분 동안 실온으로 여과하였다.
DNA 및 RNA 속에 존재하는 모노뉴클레오타이드 각각 100, 10, 5, 2.5, 1 ng/μL를 함유하는 모노뉴클레오타이드 표준물들(데옥시리보- 및 리보뉴클레아제들, 제조원: Sigma-Aldrich)의 혼합물의 일련 희석물들을 또한 뉴클레아제 P1 처리로 처리하고 HPLC 분석에서 표준물들로서 사용을 위해 여과하였다. 이들 뉴클레오타이드의 용출 순서는 개개 뉴클레오타이드의 보유 시간을 동일한 HPLC 조건하에서 비교하여 확인하였다. HPLC 분석을 탈기기(degasser), 자동 샘플러(auto sampler), 컬럼 가열기, 및 다중-파장 UV 검출기가 장착된 1200 시리즈 HPLC 시스템(제조원: Agilent, 캐나다 퀘벡주 생-로랑 소재)을 사용하여 수행하였다. Zorbax Bonus-RP 컬럼(제조원: Agilent)을 사용하였으며 이동 상은 선형 구배의 10 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2 및 메탄올(0 내지 10% 메탄올)로 구성되었다. 모노뉴클레오타이드를 260 nm에서 검출하였다.
DNA:RNA 비를 DNA 및 RNA 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드의 정량화 후에 측정하였다(표 11).
MpRNC 고, MpRNC 중간 및 MpRNC 저에서 양 및 DNA/RNA 비
샘플 DNA
ng/mg 		RNA
ng/mg 		총
ng/mg 		DNA:RNA 비
MpRNC 고 969.9 1241.3 2211.2 0.78
MpRNC 중간 907.1 542.6 1449.7 1.67
MpRNC 저 649.7 309.5 959.2 2.10
당해 결과들은, MpRNC 고로부터 MpRNC 저까지, 감소된 완전한 마이코박테리움 플레이 세포 함량과 일치하는, ~50%의 핵산 함량에 있어서의 전체적인 감소가 존재함을 입증한다. 당해 분석에서 모든 MpRNC 조성물은 DNA 및 RNA를 MpRNC 중간 및 MpRNC 저가 비교가능한 비로 소유하였다. 이들 데이타는 MpRNC 고로부터 MpRNC 저까지 제거되는 전체 마이코박테리아 세포 핵산과 일치함으로써 MpRNC 중 RNA는 세포벽에 결합하였으므로 생물학적 활성과 관련하여 최적으로 활성이다.
실시예 12
MpRNC, MbRNC, MsRNC 및 MvRNC의 RNA 및 DNA 비율들
마이코박테리아 RNC 조성물을 이들의 RNA:DNA 비에 대해 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 사용하여 전기영동적으로 분석하였다. 당해 실시예에 사용된 마이코박테리아는 일반적으로 마이코박테리아를 대표하는 것으로 사용됨을 이해하여야 한다. 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 균주 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스 및 마이코박테리움 박카에로부터의 MRNC를 실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. 핵산 분획을 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조하였다. 핵산 분획(50 μL)을 각각 25μL의 2개의 분취량들로 분리하였다. 1개의 분취량을 10㎍의 RNase A(제조원: Amresco, 미국 오하이오주 솔론 소재)로 처리하였고 다른 것은 주입용수(제조원: Wisent, RNase 및 DNase가 없음)로 37℃에서 2시간 동안 처리한 후 예비-이동(pre-run) 변성된 우레아-PAGE 겔 위에서 25V/cm로 2.5 시간 동안 로딩하였다. 당해 겔을 1x 트리스 완충액(89mM 트리스, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8.0) 속에서 10,000x로 희석된 SYBRGold® 용액(제조원: Invitrogen)으로 15분 동안 염색한 후 UV에 의해 312 nm의 파장에서 가시화하였다. 겔 영상을 NIH(미국 매릴랜드주 베테스다 소재)로부터의 ImageJ 영상 프로세싱 및 분석 소프트웨어를 사용하여 디지털화하였다. 결과들은 도 4에 나타낸다. 변성 PAGE 전기영동에 의해 입증된 핵산들의 크기 분포(도 4a)를 마이코박테리움 플레이 RNC에 대해 실시예 11에 기술된 바와 같이 미세유동 칩 RNA 분석으로 확인하였다.
RNase-민감성 RNA의 비율을 도 4b에 나타낸다. 마이코박테리아 RNC들의 RNA 분획의 RNase A를 사용한 처리는 시그날 강도에 있어서 MbRNC의 경우 26.3% 감소, MsRNC의 경우 46.1% 감소, MpRNC의 경우 53% 감소, 및 마이코박테리움 스메그마티스 RNC의 경우 60% 감소를 초래하였다. 따라서, 본 발명의 MRNC 조성물은 RNAse-민감성 RNA를 함유한다.
마이코박테리움 박카에 RNC, 마이코박테리움 플레이 RNC 및 마이코박테리움 스메그마티스 RNC 중 보다 높은 비율의 RNA는, 마이코박테리움 보비스 BCG RNC와 비교하는 경우 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 스메그마티스 및 마이코박테리움 박카에가 모두 마이코박테리움 보비스 BCG와 비교하여 신속하게 성장하는 종들이며 이들이 보다 강력한 리보소옴 RNA 발현 프로모터 및 추가의 리보소옴 RNA 오페론을 가지고 있다는 사실과 일치한다(참조: Gonzalez-Y-Merchand, 등 1997. J. Bacteriol. 179(22): 6949-6958). 이러한 데이타는 보다 신속하게 성장하는 마이코박테리아 종들의 mRNA 및 rRNA 혼주물들 둘다 속에서 증가된 RNA 수준들로 표현된, 증가된 대사 요건과 일치한다.
실시예 13
MpRNC의 지질 함량
MpRNC 속에 존재하는 분자 부류들 및 지질 함량을 측정하였다. 당해 실시예에서 MpRNC 중간은 본 발명의 실시예 2 및 3에 기술된 과정들을 사용하여 제조한 MRNC의 지질 함량의 예시적이고 대표적인 예로 사용된다. 상이한 마이코박테리아 종들은 상이한 마이콜산 프로파일들을 가지지만, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과 및 마이코박테리운 종에 적용가능함이 또한 인식되어야 한다.
마이코박테리아로부터의 세포벽 조성물은 흔히 이들의 제조시 용매들로 처리하여 지질들을 제거한다(참조: 예를 들면, Ribi 등, 1966, J. Bacteriol., 91:975-983, 여기서, 석유 에테르 또는 아세톤의 사용이 기술되어 있다). 이러한 과정들은 공유결합적으로 부착되고 추출할 수 없는 지질 종들 속에서 화학물질들의 가용화로 인한 용매 오염의 위험을 동반한다. 마이코박테리아의 지질들은 통상적으로 2개 그룹들로 분리된다: 비-공유결합으로 결합됨으로써 유기 용매 또는 세제가 추출가능한 것들(트레할로즈 모노- 및 디아밀콜레이트들 및 지단백질들 포함), 및 세포 벽에 공유 결합된 것들(마이콜산들). 비누화가 수행되지 않는 경우, 유기 용매 또는 세제 추출은 공유결합되지 않은 지질들만을 제거한다. MpRNC의 지질 함량에 대한 본 발명의 실시에 3에 기술된 MpRNC에 대한 제조 공정의 영향을 측정하였다.
인지질들, 당지질들 및 유리 지방산들을 포함하는 비-공유적으로 결합된 유리 지질들의 추출을 위한 돌(Dole) 과정의 변형을 사용하였다(참조: Dole and Meinertz, 1960, J. Biol. Chem. 235:2595-2599, Puttmann 등,1993 Clin. Chem. 39:825-832에 의해 변형된 바와 같음). 주사용 수 중 10 mg/mL의 MpRNC 중간 현탁액으로부터 제조되고 고속 원심분리에 적용된 실시예 3에서의 제조 공정의 단계 3으로부터의 MpRNC 중간 펠렛 또는 상층액 1 mL를 3 mL의 용매 혼합물 n-헵탄/이소프로판올/인산(10/40/1, v/v/v)에 가하고 Teflon® 라인드 캡(lined cap)이 있는 유리 튜브 속에서 격렬하게 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 1 mL의 n-헵탄을 가하고, 1 mL의 물을 가한 후, 튜브를 단단히 뚜껑을 닫고, 골고루 혼합하고 침전되도록 두었다. 상부 유기 상을 수집하고 탈지된 세포벽 또는 상층액을 함유하는 나머지 수성상을 1 mL의 헵탄을 첨가하여 추출하였다. 추출가능한, 비-공유결합적으로 부탁된 유리 지질들을 함유하는 2개의 헵탄 상들을 이후에 혼주시키고 50℃에서 질소 스트림하에 Teflon® 라인드 캡이 있는 유리 튜브 속에서 완전히 건조될 때까지 건조시켰다. 건조된 지질 추출물들을 유도체화될 때까지 4℃에서 저장하고 광으로부터 보호하였다. 유리 지질-고갈된 MpRNC를 함유하는 잔사를 수집하여, -20℃에서 유지시키고 공유 결합된 지질들(공유결합적으로 연결된 마이콜산 세포 벽 분획으로서 정의됨)의 추출을 위해 사용하였다.
HPLC 용 지방산들의 유도체화를 다음과 같이 수행하였다. 첫째로, 0.1 mL의 KHCO3 용액(98 mL의 물 및 98 mL의 메탄올 속에 용해된 4 g의 KHCO3)을 가하여 유리 지질 추출물들에 가하고 여과된 공기의 스트림하에 50℃에서 공기 건조시켰다. 이후에, 1 mL의 n-헵탄 및 50μl의 p-브로모펜아실-8 시약(제조원: Pierce Chemical Co. 미국 일리노이주 록포드 소재)를 가하고, 완전히 혼합하였다. 튜브들을 밀봉하고 85℃에서 30분 동안 가열하였다. 실온에서 냉각한 후, 용액을 1 mL의 HCl(6 M)-메탄올-물 혼합물(1:2:1)을 가하고 격렬하게 와동시켜 선명하게 하였다. 튜브들을 5분 동안 두어 정치시킨 후 유기 층을 유리 바이알 속에 수집하고 질소의 스트림하에 건조시켰다. 건조된 p-브로모펜아실 유도체화된 유리 지질들을 4℃에서 유지시키고 UV 검출 분석을 사용한 역상-HPLC(RP-HPLC-UV)까지 광으로부터 보호하였다.
비-공유결합적으로 결합된 지질들 및 유리 지방산들의 p-브로모펜아실 에스테르 유도체들의 RP-HPLC-UV 분석을 2원 펌프가 있는 Waters Breeze HPLC 시스템, 및 이중 파장 흡광도 UV 검출기(제조원: Waters Ltd., 캐나다 퀘벡주 라친 소재)를 사용하여 수행하였다. 4 마이크론 역상 분리 컬럼(Waters, Nova-Pak, C18 4.6 mm×150 mm)을 분석에 사용하였다. 건조된 p-브로모펜아실-에스테르 지방산 유도체들을 100μL의 아세토니트릴 속에 용해하고 5μL를 77% 아세토니트릴 및 23% 물의 구배 혼합물을 사용하는 분리용 컬럼내에 0 내지 20분 동안 주입하고: 20분으로부터 25분까지 아세토니트릴의 농도가 77%로부터 96%까지 상승한 후 분석의 마지막 5분 동안 96%로부터 77%로 0.25 mL/분의 유동 속도로 감소되었다. 컬럼 온도는 30℃이었고 피크들은 254 nm에서 검출하였다. 미리스트산(C14:0)(제조원: Sigma-Aldrich, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)을 유리 지질들을 정량화하기 위한 지방산 표준물로서 사용하였다.
비-공유결합적으로 결합된 지질의 추출 후 잔류하는 단계 3의 펠렛 및 단계 3의 상층액으로부터의 분획을 질소의 스트림하에 50℃에서 건조시킨 후 2 mL의 가수분해 시약(수중 수산화칼륨 50% w/v 및 50% 메탄올, 1:1, v/v)으로 1시간 동안 100℃에서 테플론® 라인드 캡이 있는 유리 튜브 속에서 가수분해하여 공유결합된 지질을 방출시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 2 mL의 클로로포름을 가한 후 1.5 mL의 산성화 시약(농축된 HCl/메탄올(1:1, v/v))을 가하였다. 격렬히 교반한 후, 튜브들을 상 분리를 위해 5분 동안 정치시켰다. 클로로포름 상(하부 상)을 회수하여 Teflon® 라인드 캡이 있는 새로운 유리 튜브내로 이전시켰다. 이후에, 잔류하는 수성 상을 1 mL의 클로로포름으로 2회 이상 재-추출하였다. 3개의 클로로포름 상들을 혼주시키고 80℃에서 질소의 스트림하에 건조시키고 4℃에서 유지시키고 유도체화될 때까지 광으로부터 보호하였다.
가수분해된 공유결합적으로 부착된 지방산들의 유도체화는, 클로로포름을 n-헵탄 대신 사용한 것을 제외하고는 추출가능한 지질들에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다. 무수 p-브로모펜아실 유도체화된 지방산들을 4℃에서 유지시키고 RP-HPLC-UV 유리 지질 분석때까지 광으로부터 보호하였다.
공유결합적으로 부착된 지질들(당해 분석에서 마이콜산 분획으로 정의됨)의 p-브로모펜아실 에스테르 유도체들의 RP-HPLC-UV 분석을 이원 펌프가 있는 Waters Breeze HPLC 시스템, 및 이중 파장 흡광도 UV 검출기를 사용하여 수행하였다. 4 마이크론 역상 분리 컬럼(Waters, Nova-Pak, C18 4.6 mm×150 mm)을 분리에 사용하였다. 건조된 p-브로모펜아실 에스테르 마이콜산 유도체들을 100μL의 디클로로메탄 속에 용해하고, 20μL를 컬럼내로 주입하고 254 nm에서 검출하였다. 베헨산(C22:0, 제조원: Sigma-Aldrich)을 공유결합적으로 결합된 지질들의 정량화를 위한 내부 표준물로서 사용하였다. 컬럼을 메탄올/디클로로메탄 구배(20분에 걸쳐 98% 메탄올/2% 디클로로메탄 내지 20% 메탄올/80% 디클로로메탄)을 사용하여 2.5 mL/분의 유속에서 용출시켰다. 베헨산(C22:00, 제조원: Sigma-Aldrich, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)를 정량화용 내부 표준물로서 사용하고, 내부 저 및 고 마이콜산 표준물들(일반적으로 각각 ~C40:n 및 ~C110:n으로서 허용되며, 미국 워싱톤 소재의 Corixa Corporation Seattle에 의해 원래 공급됨)을 사용하여 집단 1 및 집단 2에서 마이콜산들의 탄소 쇄 길이를 추정하였다.
MpRNC 중간에 대한 비공유결합적으로 연결된 지질(추출가능한) 및 공유결합적으로 연결된 지질 분석들의 결과들은 도 5a 및 도 5b 및 표 5에 나타낸다. 도 5a는 추출 및 가수분해 후 결합된 지질들이, 탄소 쇄 길이가 C22 미만인 단쇄 지방산들 대부분으로 구성되며, 마이코박테리움 플레이의 특징인 마이콜산의 2개 집단들이 존재함을 나타낸다. 도 5b는, 비누화 후 수득된 가수분해가능한 지질이 저 및 고 분자량 종들 둘다로 구성되며, 2개의 마이콜산 집단들이 2개의 마이콜산 표준물들 사이에 속함을 나타낸다(도 5b). 마이콜산 표준물들에 대한 보유 시간과 탄소 쇄 길이 사이의 관계는 선형인 것으로 측정되었다.
비누화 후 수득된 지질들 피크들을 0.5 내지 5분의 용출 시간을 갖는 단쇄 지방산들(가수분해 동안 마이콜산 왁스 에스테르들의 저 분자량 디카복실산들 및 알코올로의 파괴의 결과로서 정의됨), 마이콜산 집단 1(탄소수가 45 내지 55개인 마이콜산들을 포함하는, 용출 시간 7 내지 9분) 및 마이콜산 집단 2(탄소수가 70 내지 85개인 마이콜산들을 포함하는, 용출 시간 10.5 내지 13.5분)로 분류되었다. 단계 3의 펠렛 및 상층액 중 이들 분획들 각각의 양들을 표 12에 나타낸다.
[표 12]
MpRNC 중간에서 비-공유결합 및 공유결합적으로 결합된 지질들
Figure pct00004
MpRNC 조성물을 함유하는, 실시예 3의 단계 3으로부터의 MpRNC 중간의 고속 원심분리 펠렛은 추출가능한 지질, 및 또한 공유 결합된 지질을 함유하였다. 공유-결합된 지질은 총 지질의 90%를 나타내는 마이콜산들을 나타내는 것으로 고려되었다. 대조적으로, 고속 상층액은 매우 적은 공유 결합된 지질을 함유하였으며, 지질의 대부분은 비-공유 결합되어 있다(93%).
다른 실험에서, 총 30 mg의 MpRNC 중간 및 MCC를 50℃에서 질소의 스트림하에 건조시킨 후 2 mL의 가수분해 시약(수 중 50% w/v의 수산화칼륨 및 50% 메탄올, 1:1, v/v)으로 100℃에서 1시간 동안 Teflon® 라인드 캡이 있는 유리 튜브 속에서 가수분해하여 공유-결합된 지질을 방출시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 2 mL의 클로로포름을 가한 후 1.5 mL의 산성화 시약(농축된 HCl/메탄올(1:1, v/v))을 가하였다. 격렬하게 혼합한 후 튜브들을 상 분리를 위해 5분 동안 정치시켰다. 클로로포름 상(하부 상)을 회수하고 Teflon® 라인드 캡이 있는 신규 유리 튜브내로 이전시켰다. 이후에, 잔류하는 수성 상을 1 mL의 클로로포름으로 2회 이상 재-추출하였다. 3개의 클로로포름 상들을 혼주시키고 80℃에서 질소의 스트림하에 건조시키고 칭량하였다. 추출을 2회 수행하였으며 이의 지질 함량은 14.1±5.1 mg/30 mg MCC 및 9.7±0.14 mg/30 mg MpRNC 중간이었다.
상층액 중 이러한 고 지질 함량(및 저 마이콜산 함량)의 존재는 비-세포벽 지질들(추출가능하고, 비-공유-결합된 지방산들 및 비-공유결합적으로 연결된 마이콜레이트들)의 유리(liberation) 후 고압 균질화에 의한 마이코박테리아의 파괴와 일치하며, 이는 실시예 3에 기술된 차등적인 고속 원심분리들 단계에 의해 세포벽 조성물로부터 제거된다. 따라서, 당해 과정은 유기 용매 또는 세제 추출의 필요성 및 마이코박테리아 세포벽 조성물의 지질 함량을 감소시키는 수단으로서 오염의 위험을 제거한다. 그러나, 마이코박테리아 세포벽의 필수 성분인, 공유결합적으로 부착된 마이콜산들은 실시예 3의 제조 방법으로 보존되므로 마이콜산 집단 분석에 의해 제공된 마이코박테리아 종들로부터 세포벽의 정의된 확인의 잇점을 제공한다.
실시예 14
MpRNC 고, MpRNC 중간, MpRNC 저 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이의 디아미노피멜산(DAP) 및 알라닌 함량
당해 실시예에서 MpRNC 중간 조성물을 MRNC의 대표적인 예로서 사용하였으며, 당해 실시예에 교시된 분석들은 노카르디아 종들, 로도코쿠스 종들, 및 코리네박테리아 종들로부터 그러나 이에 한정되지 않는 모든 MRNC, 및 많은 BRNC 조성물에 적용가능함을 인식해야 한다.
디아미노피멜산(2,6-디아미노헵탄디오트산, DAP) 및 알라닌(ALA)은 마이코박테리움 플레이의 펩티도글리칸의 주요 성분들이다. 펩티도글리칸 자체는 마이코박테리아 세포벽의 주요 성분이다. DAP는 펩타이드내 쇄 연결들에 관여하며 ALA는 펩티도글리칸의 펩타이드 쇄의 성분이다. 따라서, DAP 및 ALA 함량의 측정은 완전한 마이코박테리아 세포 함량의 정도의 간접적인 측정을 제공함으로써 마이코박테리아 세포 함량의 증가가 감소된 DAP 함량을 초래한다. MpRNC 고, MpRNC 중간, MpRNC 저 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포의 DAP 및 ALA 함량은 HPLC 분석으로 측정하였다. MpRNC 고, MpRNC 중간, MpRNC 저 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포를 HPLC 등급 수(grade water) 속에 0.2 mg/mL의 농도로 희석시켰다. 20 μL의 분취량의 각각의 희석된 샘플 제제와 함께 각각의 가수분해 블랭크 및 소 혈청 알부민 대조군을 진공하에 열분해 튜브들 속에서 건조시키고 165℃에서 60분 동안 6M HCl 증기를 사용하여 가수분해하였다. DAP 및 ALA를 6-아미노퀴올릴-N-하이드록시석신이미딜 카바메이트(AQC)(AccQ Fluor Reagent kit, 제조원: Waters, 미국 매사츄세츠주 밀포드 소재)로 유도체화하였다. 표준 곡선들을 합성 및 시판되는 DAP 및 ALA를 사용하여 제조하였다. MpRNC 고, MpRNC 중간, MpRNC 저 및, 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포의 DAP 및 ALA 함량을 3개의 샘플들을 사용하여 HPLC(ACCQ-Tag Novo-Pak C18 4μm, 3.9×150 mm 컬럼[Waters] 및 형광성 및 UV 검출기들이 장착된 Agilent Model 1100(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) HPLC를 사용한 5μL의 주입 용적의 각각의 샘플)로 측정하였다. DAP 및 ALA 함량 결정인자들의 결과들은 표 13에 나타낸다.
MpRNC 고, MpRNC 중간, MpRNC 저 및 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이의 DAP 및 ALA 함량.
조성물 ALA ( mol %) * DAP ( mol % ) *
MpRNC 고 15.8 2.6
MpRNC 중간 21.6 7.0
MpRNC 저 23.8 10.1
오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 14.8 2.7
*ALA 및 DAP에 대한 결과들은 아미노산 분석의 mol%로 나타낸다.
표 13은, MpRNC(고 내지 저) 속에 존재하는 완전한 마이코박테리아 세포의 수의 감소화 함께 ALA 및 DAP 함량 둘다에 있어 상응하는 증가가 존재함을 입증한다. 당해 결과들은 완전한 마이코박테리아 세포에 있어서의 감소와 수반되는 MpRNC 고 내지 MpRNC 저로 진행되는 MpRNC 조성물내 세포벽 펩티도글리칸 함량에 있어서의 증가와 일치한다. 표 11 및 표 13은 함께 또한, 세포벽을 함유하는 올리고리보뉴클레오타이드/폴리리보뉴클레오타이드 제형 조성물의 분리가 펩티도글리칸의 증가하는 양들(DAP 및 알라닌 측정들로 결정됨), 또는 알라닌 측정들(DAP를 함유하지 않는 이들 세균 및 마이코박테리아의 경우)과 관련되며 DAP 및 알라닌의 감소하는 양들이 완전한 마이코박테리아의 증가하는 수준들과 관련됨을 나타낸다. 따라서, 이러한 측정들을 사용하여 이러한 조성물 중 완전한 마이코박테리아(또는 세균) 함량을 정밀하게 확인하고 조절할 수 있다.
실시예 15
MpRNC 단백질 함량
당해 실시예에서 MpRNC 중간 조성물을 MRNC의 대표적인 예로서 사용하였으며, 당해 실시예에 교시된 분석들은 모든 MRNC 및 BRNC 조성물에 적용가능함이 인식되어야 한다.
본 발명의 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 MpRNC 중간의 단백질 함량을 마이코박테리움 플레이 세포의 것과 비교하였다. 단백질 함량의 정밀한 측정을 보증하기 위하여, 샘플들을 주사용 수 중 1 mg/mL 현탁액으로서 제조하고 프로브 초음파 처리에 적용시켜 어떠한 완전한 마이코박테리아의 파괴도 보증함으로써 단백질의 정밀한 측정을 보증하였다. 단백질 함량은, 엠. 플레이 완전한 세포(MCMC-C를 사용하여 본 발명의 실시예 1에 따라 성장시킴) 및 본 발명의 실시예 3에 따라 제조된 MpRNC 중간(둘다 주사용수 중 1 mg/mL의 농도)을 프로브 초음파처리(제조원: Misonix Inc, ¼'' 프로브, 8에 셋팅, 빙상에서 1 내지 15분)에 적용시켰다. 샘플들을 마카르트 방법(Macart method)을 사용하여 단백질 분석을 위한 다양한 시점들에서 제거하였다. 요약하면, 단백질 함량은 15μL의 적절한 마이코박테리움 플레이 또는 MpRNC 중간과 300μL의 MACART 용액(참조: L. Gerbaut and M. Macart, Clinical Chemistry (1982) 32, 353-355)을 미세역가 플레이트들의 웰들 속에서 혼합하고 실온에서 5분 동안 항온처리함으로써 측정한 후, OD를 미세플레이트 판독기를 사용하여 630nm에서 측정하였다. 각각의 샘플 중 단백질의 양은 소 혈청 알부민(2 mg/mL의 단백질 표준물, 제조원: Sigma)의 참조 일련 희석물로서 사용하여 측정하였다. 분석의 결과들은 표 14에 나타낸다.
[표 14]
마이코박테리움 플레이 및 MpRNC 중간의 단백질 함량
Figure pct00005
표 14에 나타낸 데이타들은, 실시예 3에 기술된 방법에 따라 제조된 MpRNC 중간이 마이코박테리움 플레이와 비교하여 유의적으로 상이한 단백질 함량(각각 13% w/v 대 45% w/v)을 가졌으므로, 제조 공정들이 수득되는 세포 생물량과 비교하여 단백질 함량에 있어서 감소를 초래함을 입증한다. 이들 데이타는 또한, 추가의 파괴 과정의 사용없이, MpRNC의 단백질 함량이 대략 30%로 과소평가되었음을 나타낸다. MpRNC 중간의 초음파 처리 후 수득된 단백질내 약간의 증가는 단백질 분석 시약, 및 잔류하는 완전한 마이코박테리아내 단백질들에 대해 접근가능하지 않은 세포벽 단편들내 단백질들에 접근가능한 3개의 단백질을 함유하는 구획들-세포벽 단편 단백질들의 존재와 일치하며, 또한 단백질 분석 시약에 접근가능하지 않는다. 이들 단백질들은 세포벽 단편들 또는 세포의 초음파 처리 또는 다른 수단들에 의한 파괴 후 접근가능하게 된다. MpRNC 저 및 MpRNC 중간 및 MpRNC 고의 단백질 수준은 각각의 제형들 속에서 완전한 세포 대 세포벽 단편들의 비의 반영일 것임을 이해하여야 한다.
실시예 16
MpRNC는 사람 병원체 관련된 분자 양식 수용체(PAMP) NOD2의 활성화를 유도한다.
뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인 2(NOD2)는 미생물 병원체들과 관련된 병원체-관련 분자 양식들(PAMPs) 또는 세포 스트레스를 감지하는데 관여하는 다양한 수용체의 계열들 중 하나인, 양식 인식 수용체(PRR)이다. NOD2는 면역 자극인자 활성을 소유하는 세균 펩티도글리칸의 최소 구조인 것으로 알려진, 무라밀 디펩타이드(MDP)의 최소 구조로 밝혀진 무라밀 디펩타이드(MDP)에 대한 수용체이다. NOD2 MDP 효능제들은 완전한 면역계 세포(단핵구들, 대식구들 및 수지 세포)을 활성화시키고, 염증을 조절하며, 진통 활성을 가지고, 항암 활성을 지니며, 항-감염 활성을 지니고, 사람 골수 CD34+ 세포의 분화를 유도하고 이들의 면역 보조인자 활성을 통해 백신 보호를 증가시키는 것으로 알려져 있다. MDP 및 다수의 유사체들 및 유도체들은 암 및 감염의 치료를 위한 효과적인 제제들인 것으로 알려져 있으며, 백신 보조제들로서 작용할 수 있다.
MpRNC의 NOD2 활성화 활성은 NOD2-기원한 NF-κB의 조절하에 사람 NOD2 수용체 및 하부 시그날링 마커 IL-8을 발현하도록 가공된 HEK-293 세포를 사용하여 평가하였다. MpRNC는 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 계열로부터의 MRNC에 적용가능함이 이해되어야 한다. NOD2를 활성화시키기 위한 MpRNC 중간의 능력을 미국 특허 제6,326,357호에 따라 제조된 MCC와 비교하였다.
사람 HEK293-NOD2 세포주(제조원: InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 배양하고 10% 태아 소 혈청(둘다의 제조원: Wisent, 캐나다 퀘벡주 세인트 브루노 소재), 100㎍/mL의 NormocinTM 및 10㎍/mL의 블라스티시딘(둘다의 제조원: InvivoGen)이 보충된 고 글루코즈 DMEM 속에서 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기하에 유지시켰다. HEK293-NOD2 세포를 5×105개의 세포/mL에서 0.2 mL의 용적으로 멸균 96-웰 평편 바닥 조직 배양 미세플레이트들 속에서 위에서 기술한 세포 배양 배지 속에서 종균시키고, 48시간 동안 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160㎍/mL의 MpRNC 중간 또는 MCC와 함께 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리하였다. 상층액들을 항온처리 후 수집하고, 4,000×RCF에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 및 부스러기를 제거하고 상층액을 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다. 상층액 중 사람 IL-8을 MpRNC 중간 현탁액과 함께 48시간 배양(cultivation)한 후 시판되는 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)(공급원: BioSource, 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재)를 사용하여 측정하였다. 데이타를 ELISA 플레이트 판독기(ELx-808IU 제조원: BioTek Instruments, 미국 버몬트주 위누스키 소재)로부터 KC Junior software package(제조원: BioTek Instruments, 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 포착하고 pg/mL의 합성된 IL-8로 나타내었다.
표 15는, MpRNC 중간이 NOD2-기원한 IL-8 방출을 농도-의존적 방식으로 유도함으로써 강력한 NOD 효능제로서 투여량-관련된 방식으로 기능하는 반면, 미국 특허 제6,326,357호에 따라 제조한 MCC는 시험한 최대 농도에서만 관찰된 미미한 활성과 함께, NOD 효능제로서 유의적으로 강력하지 않았음을 나타낸다.
마이코박테리아 세포벽 조성물의 NOD2 활성화 활성
조성물 IL-8 (pg/mL)
세포벽 농도, ㎍/mL
0.625 1.25 2.5 5.0 10 20 40 80 160
MpRNC 중간 45.1 42.7 51.7 78.3 110.0 124.7 133.2 160.1 186.9
MCC (미국 특허 제6,326,357호) 27.7 20.5 23.8 16.3 14.9 11.2 13.4 16.3 36.6
MpRNC는 NOD2 수용체를 통해 매개된 면역 자극 인자 활성과 관련하여 MCC와 같은 다른 마이코박테리아 세포벽 조성물보다 유의적으로 및 예상치않은 장점들을 가짐이 명백하다.
별도의 연구에서 MpRNC 고, MpRNC 중간 및 MpRNC 저의 NOD2-활성화 활성을MpRNC 중간의 것에 대한 MpRNC 고 및 MpRNC 저의 효능을 측정함으로써 비교하였다. NOD2-활성화 활성은 위에서 기술한 바와 같이, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 및 80㎍/mL의 투여량 범위에서 측정하였고, 상대적인 효능들을 PHARM/PCS 버젼 4.2 소프트웨어(제조원: Microcomputer Specialists, 미국 펜실바이나주 필라델피아 소재)를 사용하여 계산하였다. 표 16에 나타낸 결과들은, MpRNC 고 및 MpRNC 저의 NOD2 활성화 활성이 MpRNC 중간의 것과 상이하지 않음을 입증한다.
NOD2의 활성화에 대한 MpRNC(고, 중간 및 저)의 상대 효능들
MpRNC 상대 효능
MpRNC 중간 1.0
MpRNC 고 0.9
MpRNC 저 1.1
이들 데이타는, 상이한 MpRNC 조성물 중 다양한 수준들의 완전한 마이코박테리아의 존재가 NOD2를 활성화시키는 이들의 능력에 영향을 미치지 않으며, 모든 MpRNC 조성물(고, 중간 및 저)이 이러한 선천성 면역계 수용체를 활성화시키기 위한 동일한 능력을 지님을 입증한다.
실시예 17
마이코박테리아 RNC는 사람 병원체-관련된 분자 양식 수용체(PAMP) NOD2의 활성화를 유도한다
마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스 및 마이코박테리움 박카에로부터 제조된 마이코박테리아 RNC의 NOD2 활성화 활성을 마이코박테리움 플레이로부터의 RNC와, 이의 활성화가 NOD2-기원한 NF-κB의 조절하에 분비성 배아 알칼린 포스페이트(SEAP)의 합성을 유도하는 사람 NOD2 수용체를 발현하도록 가공된 HEK-BlueTM NOD2 세포(제조원: InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 사용하여 비교하였다. 상등액에 함유된 SEAP의 측정은 NOD2 활성화의 척도를 제공한다.
마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스 및 마이코박테리움 박카에로부터의 MRNC가 마이코박테리아세아에 과의 대표적인 예들로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들 및 나타낸 데이타는 다른 마이코박테리아로부터의 MRNC에 적용가능함이 이해되어야 한다. 마이코박테리움 플레이(MpRNC)로부터의 MRNC 중간 조성물을 당해 실시예에서 사용하였으며, 실시예 16에서 MpRNC 고, 중간 및 저 사이의 활성의 비교능을 입증한다.
HEK293-NOD2 세포주를 배양하고 10% 태아 소 혈청(둘다의 제조원: Wisent, 캐나다 퀘벡주 세인트-브루노 소재), 30㎍/mL의 블라스티시딘, 100㎍/mL의 NormocinTM 및 ZeocinTM(둘다의 제조원: InvivoGen) 및 또한 50U/mL의 페니실린 및 50㎍/mL의 스트렙토마이신(모두의 제조원: Wisent)이 보충된 고 글로코즈 DMEM 속에서 37℃로 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 0.2 mL의 용적으로 1×105개의 세포/mL에서 멸균 96-웰 평편-바닥 조직 배양 미세플레이트 속에 위에서 기술한 세포 배양 배지 속에 종균하고, 72시간 동안 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 및 80㎍/mL의 MRNC 중간과 함께 항온처리하였다. 상층액들을 항온처리 후 분석을 위해 수집하고, 4,000×RCF에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포과 부스러기를 제거하였다. 20μL의 상층액을 180μL의 QUANTI-BlueTM(제조원: InvivoGen)과 96-웰 평편 바닥 미세역가 플레이트들 속에서 37℃에서 2시간 동안 혼합하였다. SEAP 발현을 630 nm에서 KC Junior software package(제조원: BioTek Instruments)를 사용하는 ELx-808IU 미세플레이트 판독기(제조원: BioTek Instrument, 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 측정하였다. 도 6은 모든 4개의 MRNC 조성물에 의한 NOD2의 투여량-관련된 활성화를 나타낸다.
모든 MRNC 조성물은 NOD2 활성화 활성을 입증하였다. 마이코박테리움 플레이 RNC는 NOD2에 이어, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 보비스 BCG 및 마이코박테리움 박카에의 가장 효과적인 활성인자였다. 마이코박테리움 보비스 BCG 및 마이코박테리움 박카에는 시험한 최대 투여량(80㎍/mL)에서 NOD2의 미미한 활성화를 나타내었다. NOD2의 활성화를 위한 마이코박테리움 플레이 RNC에 대한 마이코박테리아 RNC 조성물의 효능을 PharmPC V4.2(제조원: Microcomputer Specialists, 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재)를 사용하여 측정하고 표 17에 나타낸다.
마이코박테리움 플레이 MpRNC에 대한 마이코박테리아 RNC NOD2 활성화
마이코박테리아 RNC 마이코박테리움 플레이 RNC에 대한 NOD2 효능
MpRNC 중간 1.00
MbRNC 중간 0.014
MsRNC 중간 0.021
MvRNC 중간 0.013
실시예 18
MpRNC는 사람 병원체-관련된 분자 양식 수용체(PAMP) TLR2의 활성화를 유도한다.
톨-유사 수용체 2(TLR2)는 미생물 병원체들과 일반적으로 관련된 병원 체-관련 분자 양식들( PAMPs )을 감지하는데 관여하는 양식 인지 수용체( PRR )이다. 펩티도글리칸 , 리포만난 ( LM ), 리포아라비노만난 ( LAM ), 지단백질들 및 지펩타이드과 같은 세균 및 마이코박테리아 세포벽 구조 성분들은 TLR2 의 활성화에 크게 관여하는 것으로 여겨진다. 당해 분야의 숙련가들에 의해, TLR2 가 대식구를 포함하는 많은 면역계 세포에서 발현되며, TLR2 의 효능제들은 이러한 세포에 의한 다수의 케모킨들 및 사이토킨들의 합성을 유도할 수 있음이 공지되어 있다. 본 발명의 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 MpRNC 중간 및 미국 특허 제6,326,357호에 따라 제조된 MCC 의 TLR2 활성화 활성을 사람 TLR2 수용체를 발현하도록 가공된 HEK293 세포를 사용함으로써 면역 자극인자 잠재성을 측정하는 편리하고 허용된 방법을 제공하여 비교하였다.
MpRNC 중간은 MRNC 의 예로서 사용되며, 당해 실시예에서 교시된 원리들은 다른 마이코박테리아 , 및 또한 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC 에 적용가능함을 이해하여야 한다.
사람 HEK293 - TLR2 세포주를 InvivoGen (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수하였다. HEK293 - TLR2 세포를 TLR2 유전자 및 수용체-기원한 분비된 배아 알칼린 포스파타제 유전자( SEAP )로 안정하게 형질감염시키고, NF -κB 유전자의 조절하에 두었다. 따라서, TLR2 의 활성화는 세포 배양 배지들 속에서 알칼린 포스페이트 활성의 생성을 초래하며, 이는 수용체 활성화를 정량화하는데 사용된다. 세포를 10% 태아 소 혈청( 둘다의 제조원: Wisent , 캐나다 퀘벡주 세인트-브루노 소재) 및 1x Normocin TM (제조원: InvivoGen )이 보충된 고 글루코즈 DMEM 속에서 37℃로 5% CO 2 를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 배양하고 유지시켰다. HEK293 - TLR2 세포를 5×10 5 개 세포/ mL 에서 0.2 mL 의 용적으로 멸균 96-웰 평편 바닥 조직 배양 미세플레이트들 속에서 HEK - Blue TM 검출 배지(제조원: InvivoGen ) 속에 종균시키고 , 18시간 동안 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160㎍/ mL MpRNC 중간 또는 MCC와 함께 37℃에서 5% CO 2 를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리하였다. 웰들에 첨가된 HEK - Blue TM 검출 배지는 NF -κB 유도된 가용성 배아 알칼린 포스파타제 효소 활성( SEAP 활성)의 검출을 위해 설계된 웰들에 가하였다. 18시간 항온처리한 후, 광학 밀도(이는 TLR2 관여를 통해 NF -κB의 활성화와 비례한다)를 630 nm 에서 미세플레이트 판독기( ELx -808 IU model , 제조원: BioTek Instrument , 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 측정하였다. 데이타를 KC Junior software package(제조원: BioTek Instruments )을 사용하여 포착하였다.
표 18은 TLR2 의 활성화(630 nm 에서 OD 로 나타냄)를 나타내며 실시예 3에 기술된 과정을 사용하여 제조한 MpRNC 중간이 투여량-관련된 TLR2 활성화 활성을 가짐을 입증한다. MCC 에 대한 MpRNC 중간의 효능의 측정은, 활성들이 미국 특허 제6,326,357호에 기술된 바와 같이 제조된 MCC 의 것과 비교가능하였음을 나타내었다. MpRNC 중간은 TLR2 활성인자로서 MCC 보다 10.6배 더 강력하였다( PHARM / PCS version 4.2 software 를 사용하여 측정함, 제조원: Microcomputer Specialists , 미국 펜실바이아주 필라델피아 소재).
MpRNC 중간 및 MCC의 TLR2 활성화 활성
조성물 TLR2 활성화(SEAP O.D.)
마이코박테리아 세포벽 조성물, ㎍/mL
0 0.625 1.25 2.5 5.0 10 20 40 80 160
MpRNC 중간 0.15 0.60 0.38 0.52 0.50 0.59 0.55 0.64 0.71 0.74
MCC, 미국 특허 제6,326,357호 0.15 0.42 0.40 0.40 0.49 0.45 0.56 0.51 0.57 0.61
실시예 16에 나타낸 바와 같이 NOD2를 활성화시키기 위한 MpRNC의 능력의 평가로부터의 데이타와 관련한 당해 데이타는, MpRNC 세포벽 조성물이 선천성 면역계의 2개의 주요 수용체들에 대해 이중 효능제 활성, 특히 합성 효능제들의 사용에 의지하지 않고 NOD2 및 TLR2 둘다를 활성화시키는 능력을 지님을 입증한다.
실시예 19
마이코박테리아 RNC는 사람 병원체-관련된 분자 양식 수용체(PAMP) TLR2의 활성화를 유도한다
실시예 4에서 제조된 바와 같은 마이코박테리아 RNC 조성물의 TLR2 활성화 활성을 사람 TLR2 수용체를 발현하도록 가공된 HEK-293 세포 수용체 시스템을 사용하여 측정하고 마이코박테리움 플레이 RNC 중간과 비교하였다.
사람 HEK293-TLR2 세포주를 InvivoGen(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수하였다. HEK293-TLR2 세포를 TLR2 유전자 및 수용체-기원한 분비된 배아 알칼린 포스파타제 유전자(SEAP)로 안정하게 형질감염시키고, NF-κB의 조절하에 두었다. 따라서, TLR2의 활성화는 세포 배양 배지 속에서 알칼린 포스페이트 활성의 생성을 초래하며, 이는 수용체 활성화를 정량화하는데 사용된다. 세포를 10% 태아 소 혈청(둘다의 제조원: Wisent, 캐나다 퀘벡 세인트-브루노 소재) 및 1x NormocinTM(제조원: InvivoGen)으로 보충된 고 글루코즈 DMEM 속에 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 배양하고 유지시켰다. HEK293-TLR2 세포를 5×105개 세포/mL에서 0.2 mL의 용적으로 멸균 96-웰 평편-바닥 조직 배양 미세플레이트 속에서 HEK-BlueTM 검출 배지(제조원: InvivoGen) 속에서 종균하고, 18시간 동안 2.5, 5, 10, 20, 40, 및 80㎍/mL의 마이코박테리아 RNC와 함께 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리하였다. 웰들에 첨가된 HEK-BlueTM 검출 배지는 TLR2/NF-κB 유도된 가용성 배아 알칼린 포스파타제 효소 활성(SEAP 활성)의 검출을 위해 설계된다. 18시간 항온처리 후, 광학 밀도(이는 TLR2 관여를 통해 NF-κB의 활성화에 비례한다)를 630 nm에서 미세플레이트 판독기(ELx-808IU 모델, 제조원: BioTek Instrument, 미국 버몬트 위누스키 소재)를 사용하여 측정하였다. 데이타를 KC Junior software package(제조원: BioTek Instruments)를 사용하여 포착하였다.
도 7은, 모든 4개의 마이코박테리아 RNC가 2.5 내지 80㎍/mL의 투여량 범위에서 투여량-관련된 방식으로 TLR2의 활성화를 유도하였음을 나타낸다. 마이코박테리움 박카에 RNC가 가장 활성이었으며, 이어서 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 보비스 BCG 및 마이코박테리움 플레이 RNC의 순서로 감소하였다. TLR2의 활성화에 대한 마이코박테리움 플레이 RNC에 대해 상대적인 마이코박테리아 RNC 조성물의 효능을 PharmPC v4.2(제조원: Microcomputer Specialists, 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재)를 사용하여 측정하고 표 19에 나타낸다.
마이코박테리움 플레이 MpRNC에 대한 마이코박테리아 RNC TLR2 활성화
마이코박테리아 RNC 마이코박테리움 플레이 RNC 중간에 대한 TLR2 활성화 효능
MpRNC 중간 1.00
MbRNC 중간 1.56
MsRNC 중간 3.06
MvRNC 중간 5.86
TLR2의 활성화에 대해 관찰된 효능들의 범위(< 6배 차이 범위)는, 모든 4개의 마이코박테리아 RNC 조성물이 비교가능한 TLR2 효능제 활성을 가짐을 나타낸다. 당해 분야의 숙련가가 본원에서 당해 및 다른 실시예들을 읽고서(예를 들면, NOD2 활성화) 구체적인 마이코박테리아 RNC의 적용능 또는 특수하거나 구체적인 예방 또는 치료학적 적용을 위한 이의 조합을 측정하는데 있어서 특수한 마이코박테리아 RNC 조성물과 관련된 면역 자극인자 활성들 및 면역계 수용체 효능체 기능의 가장 적절한 조합을 사용할 것임이 명백하다.
실시예 20
MpRNC 중간에 의한 TLR들의 자극
TLR2 효능제들은 그람 양성 세균 및 마이코박테리아로부터의 세포벽 PAMP들과 관련된 것으로 일반적으로 인식되어 있다. TLR3 효능제들은 일반적으로 이중가닥 바이러스 RNA로 인식된다. TLR4 효능제들은 일반적으로 지질다당류인 것으로 인식된다. TLR5는 세균 플라젤린과 특이적으로 상호작용한다. TLR7 및 TLR8 효능제들은 단일가닥 RNA인 것으로 일반적으로 인식된다. TLR9 효능제들은 CpG 디뉴클레오타이드 서열들(CpG 모티프)을 함유하는 메틸화되지 않은 DNA로 일반적으로 인식된다. 실시예 18은, MpRNC 중간이 TLR2를 자극하였음을 나타내었다. MpRNC 중간은 또한 RNA 및 DNA 둘다를 함유한다(실시예 10). 따라서, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 및 TLR9를 자극하는 MpRNC 중간의 능력을 측정하여 MpRNC 중간내 RNA 및 DNA의 존재가 핵산-특이적인 TLR들의 활성화, 또는 어떠한 다른 TLR의 활성화를 초래하는지를 관찰하였다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에서 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터 MRNC에 적용가능함이 이해되어야 한다.
MpRNC 중간의 TLR 자극 활성을 하나의 구체적인 TLR(제조원: InvivoGen)을 발현시키도록 가공되는 HEK293 세포에서 시험하였다. 제공된 TLR의 활성화는 SEAP의 NF-κB 기원한 합성을 초래하며, 이의 효소 활성은 실시예 19에 기술된 바와 같이 상층액 속에서 검출된다. MpRNC 중간을 사용한 상이한 TLR들을 발현하는 HEK293 세포의 처리는 실시예 18에 기술된 바와 같이 90㎍/mL의 최종 농도를 사용하여 수행하였다. 당해 연구에서 사용된 양성 대조군 TLR 효능제들을 표 20에 나타내며, 또한 최종 농도를 검정에 사용하였다.
TLR 효능제 양성 대조군들
TLR 효능제 최종 농도
TLR2 열-사멸된 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes ) 10 8세포 / mL
TLR3 Poly (I:C) 1.0㎍/ mL
TLR4 에스케리키아 콜라이 K12 LPS 0.1 ㎍/mL
TLR5 스타필로코쿠스 티피무리움(Staphylococcus typhimurium) 플라겔린 0.1㎍/mL
TLR7 가르디퀴모드(이미다조퀴놀린 TLR7 효능제) 1.0㎍/mL
TLR8 CLO75 (티아졸로퀴놀론 TLR8 효능제) 1.0㎍/mL
TLR9 CpG 올리고뉴클레오타이드 2006 0.1㎍/mL
평가의 결과들은 표 21에 나타낸다. TLR 효능제 대조군들 모두는 양성 반응들을 제공하였다. TLR2를 발현하는 HEK293 세포의 유의적인 자극은 MpRNC 중간으로 관찰되었으며, 비록 TLR3 또는 TLR5를 발현하는 HEK293 세포의 일부 약한 자극이 관찰되었다고 해도 이는 각각의 양성 대조군들인, 폴리(I:C) 및 플라겔린보다 유의적으로 낮았다(각각 3% 및 4%의 양성 대조군 활성). TLR3 및 TLR5의 명백한 자극은 재생가능하거나 투여량-관련되지 않으며, 표준물들의 농도에서 활성이 아님을 나타내므로, 인공인 것으로 고려되었다. MpRNC 중간은 RNA-특이적인 TLR7 및 TLR8, 및 또한 DNA CpG-모티프 특이적인 TLR9를 포함하는 어떠한 다른 TLR을 자극하지 않았다.
MpRNC 중간의 TLR 효능제 활성
TLR을 발현하는 HEK293: SEAP 활성, OD 630
MpRNC 중간* 양성 대조군
2 3.787 3.315
3 0.101 3.212
4 -0.001 2.205
5 0.129 3.231
7 0.042 2.384
8 0.020 3.446
9 0.026 2.334
* 시험한 4개의 제조된 샘플들의 평균
3개의 결론들이 당해 데이타로부터 유추되어야 한다. 첫째로, MpRNC 단독은 TLR TLR2를 활성화시키며; 둘째로 MpRNC 중간내 RNA의 존재는 RNA-특이적인 TLRs TLR3, TLR7 또는 TLR8의 활성화를 초래하지 않으며; 셋째로 MpRNC 중간내 DNA의 존재는 CpG 수용체 TLR9의 활성화를 초래하지 않고, MpRNC 중간내 기능성 CpG 모티프들의 부재를 입증한다.
실시예 21
MpRNC 조성물의 면역 자극 활성에 있어서 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 영향
실시예 2에 기술된 바와 같이 제조한 MpRNC의 면역 자극 활성에 있어서 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 존재의 영향을 사이토킨/케모킨-유도 검정을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 다양한 비율들의 완전한 마이코박테리움 플레이 세포를 함유하는 MpRNC 조성물의 면역 자극인자 활성을 측정하였다. 당해 실시예는 MRNC의 면역 자극 활성에 있어서 완전한 마이코박테리아 세포의 영향의 예시적이고 대표적인 예로서 사용됨이 인식되어야 한다. MpRNC는 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함이 이해되어야 한다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)을 Ficoll-Hypaque(제조원; GE Healthcare, 캐나다 퀘벡주 스테-안-데-벨레뷰 소재)에서 밀도-원심분리에 의해 6명의 건강한 개인들로부터 분리하였다. 항응고된 혈액(헤파린의 리튬 염)을 저속에서 원심분리하여 혈소판들을 제거하고, PBMC를 큐션 원심분리(cushion centrifugation)에 의해 Ficoll-Hypaque를 사용하여 분리하였다. 분리된 PBMC를 10% 열-불활성화시킨 태아 소 혈청(제조원: Wisent Inc.) 및 10㎍/mL 겐타마이신(제조원: Sigma-Aldrich, 캐아다 온타리오주 오크빌 소재)를 함유하는 RPMI 1640(제조원: Wisent Inc., 캐나다 퀘벡주 브루노 소재) 속에서 저속 원심분리 (4℃에서 10분 동안 150×RCF)에 의해 세척하고, 5×105개의 생존가능한 세포/mL의 배지의 농도에서 현탁시켰다. 1 mL를 24-웰 조직 배양 플레이트들의 웰들 속에 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 5% CO2의 대기하에 배양하였다. 다양한 양들의 열 처리된 마이코박테리움 플레이 세포(121℃, 30분)을 함유하는 MpRNC 중간 또는 MpRNC 중간을 조직 배양 플레이트들(IL-10 유도의 경우 10㎍/mL, IL-12p40 유도의 경우 1㎍/mL의 최종 농도)에 가하고, 세포를 37℃에서 5% CO2의 대기 속에서 추가로 48 시간동안 배양하였다. 상층액들을 제거하고, 0.2 마이크론 막 여과로 선명하게 하고, IL-10 및 IL-12p40의 수준들을 키트 ELISA(제조원: BioSource, 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재, 제품 번호 각각 KHC0102 및 KHC0122)로 공급업자의 추천된 과정들을 사용하여 측정하였다.
결과들은 도 8에 나타낸다. 다양한 비율들의 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포(시험한 범위는 신규 제조 과정들 및 조성물에서 고유한 완전한 마이코박테리아의 잠재적 수준들을 반영하기 위한 100 % MpRNC 중간 내지 100 %의 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포가다)을 함유하는, MpRNC 중간(계산된 0.7% w/w의 완전한 마이코박테리아 함유)은 벨-형 반응으로 IL-10 생산(도 8의 상부 패널)을, 약 5 내지 30 % w/w의 범위인 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포의 최적 비율로 유도하였음을 알 수 있다. 약 5 내지 30 % w/w의 비율로 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포를 함유하는 MpRNC 중간을 사용한 IL-10 유도는 100%의 MpRNC 중간 조성물 또는 100%의 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포를 포함하는 조성물보다 더 높음이 밝혀졌다.
도 8(하부 패널)은, 다양한 비율들의 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포(시험한 범위: 100% MpRNC 중간 내지 100% 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이)을 함유하는 MpRNC 중간 조성물이 IL-12p40 생산을 벨-형 반응으로 유도하며, 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포의 최적 비율은 약 10 내지 50 %w/w의 범위이다. 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포를 약 10 내지 50%w/w의 비율로 함유하는 MpRNC 중간 조성물을 사용한 IL-12 유도는 100%의 MpRNC 중간을 포함하는 조성물 또는 100%의 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포를 포함하는 조성물보다 더 높았다.
변이성의 분석(ANOVA, 중복물이 없는 2개-방식)은, MpRNC 속에서 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 비율이 사이토킨 유도에 유의적으로 영향을 미쳤으며(0.05의 알파에서 p<0.025), MpRNC에 의해 유도된 IL-10 및 IL-12의 수준들은 통계적으로 상이(0.05의 알파에서 p<0.05E-6)하였음을 나타내었다.
실시예 22
MpRNC는 면역 효과기 세포에서 케모킨 및 사이토킨 합성을 유도한다.
MpRNC 의 케모킨 - 및 사이토킨 -유도 활성을 Milliplex ® 케모킨 / 사이토킨 분석 키트를 사용하여 분석하였다. MpRNC 는 MRNC 의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC 에 적용가능함을 이해하여야 한다.
사람 PBMC 를 전혈(총 13명의 건강한 개인들)의 피콜 밀도- 구배 원심분리( Ficoll density - gradient centrifugation )로 분리하였다. PBMC 를 10% v/v 열-불활성화시킨 태아 소 혈청(56℃/30분)( 둘다의 제조원: Wisent , 캐나다 퀘벡주 세인트-브루노 소재) 및 50㎍/ mL 의 겐타마이신 설페이트(제조원: Sigma - Aldrich Canada, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)를 함유하는 RPMI 1640 배지 속에서 제조하였다. PBMC (1×10 6 세포 )를 6-웰 평편 -바닥 미세플레이트들 속에 1.0 mL 의 용적으로 종균하고 37℃/5% CO 2 /100%의 습도에서 위에서 기술한 세포 배양물 배지 속에서 (처리되지 않은 대조군들) 160㎍/ mL 의 최종 농도의 MpRNC 중간의 존재 또는 부재하에 항온처리하였다. 배양 배지 속에서 사이토킨 , 케모킨 및 조혈 성장 인자 수준들을 항온처리 48시간 후 Milliplex ® MAP 키트를 사용하여 사람 케모킨들 /사이토킨들(제조원: Millipore Corporation , 미국 매사츄세츠주 빌레리카 소재)에 대해 Bio-Plex 200 system (제조원: BioRad Laboratories , 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재) 위에서 측정하였다. 나타낸 결과들은 처리되지 않은 PBMC 에 대한 케모킨 / 사이토킨 수준들에 있어서의 평균 배-증가( mean fold - increase )로 나타낸다.
표 22에 나타낸 결과들은, MpRNC 중간이 PBMC 에 존재하는 면역 효과기 세포로부터 케모킨들 , 사이토킨들 및 세포 성장 인자의 범위를 자극하는 능력을 가짐으로써 케모킨들 , 사이토킨들 및 세포 성장 인자의 유도를 위한 면역 자극인자로서 작용하는 이의 능력을 입증한다.
[표 22]
MpRNC 중간에 의한 케모킨, 사이토킨 및 세포 성장 인자 유도
Figure pct00006
실시예 23
MpRNC에 의한 사람 말초 혈액 단핵 세포에서 GM-CSF, MU-CSF, M-CSF, G-CSF, SDF-1a 및 LIF 합성의 자극
적혈구들, 수지 세포, 과립구들, 거핵구들 및 단핵구들, 대식구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 간질 세포 기원한 인자-1알파(SDF-1a) 및 백혈병 억제 인자(LIF)의 생산을 자극하는 것 외에 다능성 조혈 세포의 골수성 전구세포로의 분화를 자극하는 다중-콜로니 자극 인자(MU-CSF; 또한 IL-3으로 공지됨)는, 상이한 유형들의 표적 세포(전구 세포)의 성장 촉진 및 세포 분화, 조혈의 자극 및 줄기 세포 가동화(mobilization)의 자극을 포함하는 광범위한 생물학적 활성들을 나타내는 사람 조혈 성장 인자가다. 면역 세포로부터 이들 성장 인자의 합성을 자극하기 위한 MpRNC 중간의 능력을 측정하였다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함을 이해하여야 한다.
말초 혈관 단핵 세포(PBMC)을 6명의 건강한 개인들로부터 Ficoll-Hypaque 위에서 밀도-원심분리에 의해 분리하였다. PBMC를 1.6 내지 160㎍/mL의 MpRNC 중간(본원에 기술된 바와 같이 제조됨, 참조: 표 2 및 3)이 들어있는 6개-웰 조직 배양 플레이트들 속에서 mL 당 0.5×106개의 세포에서 48시간 동안 배양하였다. MU-CSF, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, SDF-1a 및 LIF의 수준들을 48시간 후 상층액들 속에서 적절한 비드를 지닌 Bioplex® 시스템(제조원: Bio-Rad, 캐나다 온타리오주 미씨싸우가 소재) 및 Bi-Rad 또는 Millipore 시약들을 사용하는 항체를 사용하여 측정하였다. 대조군-처리된 세포에 대한 PBMC와 MpRNC 중간의 처리 후 상층액 속에서 성장 인자의 수준에 있어서 50% 증가(≥ 1.5배 증가)를 사용하여 양성 자극 효과를 정의하였다.
표 23은, MpRNC 중간이, 측정된 모든 성장 인자의 합성에 있어서 투여량-관련된 자극(> 1.5배 증가)을 유도하였음을 나타낸다.
[표 23]
사람 MpRNC 중간에 의한 사람 PBMC에 있어서 GM-CSF, MU-CSF, M-CSF, G-CSF, SDF-1a 및 LIF 합성의 자극
Figure pct00007
표 23으로부터의 데이타는, MpRNC가 말초 혈액에서 발견된 면역 세포로부터의 조혈 성장 인자의 합성을 자극하며, GM-CSF 및 G-CSF에 이어서 다능성 성장 인자 MU-CSF에 의해 최대 배 증가들이 관찰됨을 나타낸다. M-CSF, SDF-1a 및 LIF는 정의된 반응 역치 수준(response threshold level)을 나타내었다.
실시예 24
MpRNC에 의한 정상의 사람 뇨관 상피 세포에서 GM-CSF, MU-CSF 및 LIF 합성의 자극
비-면역 세포에 의한 성장 인자 합성을 자극하기 위한 MpRNC 중간의 능력을 사람 방광 상피 세포를 사용하여 시험하였다. 이들은 일반적으로 상피 세포의 예로서 사용되었다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 본 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함을 이해하여야 한다.
정상의 사람 뇨관 상피 세포주 SV-HUC-1(버지니아주 마나사스 소재의 ATCC로부터 입수함)을 1.0×105의 세포/mL의 조직 배양 배지(ATCC에 의해 추천됨)에서 0.016 내지 160㎍/mL의 최종 농도의 MpRNC 중간(실시예 3에서 기술한 바와 같이 제조함)이 들어있는 96-웰 조직 배양 플레이트 속에서 48 시간 동안 항온처리하였다. MU-CSF, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, SDF-1a 및 LIF를 48시간 후 상층액들 속에서 적격한 Milliplex® 비드를 지닌 Bioplex® 시스템[제조원: Bio-Rad Laboratories (Canada) Inc., 캐나다 온타리오주 미씨싸우가 소재] 및 항체들(제조원: Millipore Corporation, 미국 매사츄세츠주 빌레리카 소재)를 사용하여 측정하였다. 대조군-처리된 세포에 대한 성장 인자의 수준에 있어서 50%의 증가를 사용하여 MpRNC 중간 처리 후 양성 자극을 확인하였다(≥1.5배 증가).
표 24는 MpRNC 중간을 사용한 처리 후 정상 사람 방광 상피 세포로부터 성장 인자 생산에 있어서의 증가를 나타낸다.
MpRNC 중간을 사용한 처리 후 사람 SV-HUC-1 세포에서 성장 인자 합성의 자극
성장 인자 성장 인자에 있어서 배 증가
MpRNC 중간(㎍/mL)
0.016 1.6 160
MU-CSF 0.6 2.5 1.6
M-CSF 1.2 1.1 1.1
GM-CSF 1.0 1.0 4.0
G-CSF 1.0 1.0 1.0
SDF-1a 1.0 1.1 1.0
LIF 1.2 3.1 2.7
표 24로부터의 데이타는, > 1.5배 증가의 역치로 정의된 바와 같이, MpRNC 중간을 사용한 정상의 사람 요관 상피 세포의 처리가 MU-CSF(벨-형 반응), GM-CSF 및 LIF(벨-형 반응)의 합성의 투여량-관련된 자극을 생성하였음을 나타낸다.
실시예 25
MpRNC에 의한 사람 방광 암 세포에서 GM-CSF 및 MU-CSF 합성의 자극
비-면역 세포에서 성장 인자 합성을 자극하기 위한 MpRNC 중간의 능력을 사람 방광 암 세포를 사용하여 시험하였다. 이들은 일반적으로 암 세포의 예로서 사용되었다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 본 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함을 이해하여야 한다.
사람 방광암 세포주들 SV-HUC-2 및 T24(둘다 ATCC로부터 입수, 버지니아주 마나사스 소재)를 1.0×105 세포/ml에서 96-웰 조직 배양 플레이트들(ATCC에 의해 추천된 조직 배양 배지 사용) 속에서 0.016 내지 160㎍/ml의 최종 농도의 MpRNC 중간과 함께 48시간 동안 항온처리하였다. MU-CSF, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, SDF-1a 및 LIF의 수준들을 48시간 후에 적절한 비드를 지닌 Bioplex® 200 시스템 및 Bio-Rad 및/또는 Millipore 시약들을 사용하는 항체들을 사용하여 상층액들 속에서 측정하였다. 대조군-처리된 세포에 대한 성장 인자의 수준에 있어서 50%의 증가(≥ 1.5배 증가)를 사용하여 MpRNC 중간 처리 후 양성 자극을 확인하였다.
표 25는 MpRNC 중간을 사용한 처리 후 SV-HUC-2 세포로부터의 성장 인자 생산에 있어서의 증가를 나타내고, 표 23은 MpRNC 중간을 사용한 처리 후 T24 세포로부터 성장 인자 생산에 있어서의 증가를 나타낸다.
MpRNC를 사용한 처리 후 사람 SV-HUC-2 세포에서 성장 인자 합성의 자극
성장 인자 성장 인자에 있어서 배 증가
MpRNC 중간 (㎍/mL)
0.016 1.6 160
MU-CSF 1.3 3.4 2.4
M-CSF 1.0 1.0 1.1
GM-CSF 1.0 1.0 1.9
G-CSF 1.0 1.0 1.0
SDF-1a 1.1 1.1 1.2
LIF 1.3 1.2 1.2
표 26에 나타낸 데이타로부터, 사람 방광암 세포주 SV-HUC-2와 MpRNC 중간의 항온처리가 GM-CSF 및 MU-CSF의 합성의 투여량-관련된 자극을 생성하였음이 명백하다.
MpRNC를 사용한 처리 후 사람 T24 세포에서 성장 인자 합성의 자극
성장 인자 성장 인자에 있어서 배 증가
MpRNC 중간 (㎍/mL)
0.016 1.6 160
MU-CSF 0.6 1.4 0.8
M-CSF 0.9 1.0 1.0
GM-CSF 0.9 1.5 2.0
G-CSF 1.0 1.0 1.0
SDF-1a 0.9 1.1 1.2
LIF 0.7 1.4 1.2
표 26에 나타낸 데이타는, MpRNC 중간을 사용한 사람 방광암 세포주 T24의 처리가 GM-CSF 합성의 유도를 투여량-관련된 방식(1.6㎍/mL의 MpRNC에서 50% 증가 및 160㎍/mL MpRNC에서 100% 증가)으로 자극함을 입증한다. 따라서, MpRNC는 암 세포로부터 조혈 성장 인자 합성을 자극한다.
실시예 26
마우스에서 복강내(IP) 투여 후 MpRNC에 의한 콜로니 자극 인자들의 자극
당해 실시예는, MpRNC 중간이 생체내에서 성장 인자의 생산을 자극한다는 것을 나타내기 위하여 제공한다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함을 이해하여야 한다.
2마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹들을 1.0 mg/kg의 체중의 MpRNC 중간(실시예 3에 기술된 바와 같이 주사용수 중 1mg/mL의 농도에서 제조함)을 사용하여 IP 경로로 처리하였다. 혈청 중 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 수준들을 적절한 비드 및 항체들(Bio-Rad 및/또는 Millipore 시약들)을 지닌 Bioplex® 시스템을 사용하여 주사 후 1, 4, 7 및 24 시간째에 측정하였다. 대조군-처리된 마우스에 대한 성장 인자의 수준에 있어서 50% 증가(≥ 1.5배 증가 역치 수준)를 사용하여 MpRNC 처리 후 양성 성장 인자 자극을 확인하였다.
표 27은 MpRNC 중간의 주사 후 다양한 시간들에서 처리된 마우스의 혈청에서 GM-CSF 및 G-CSF 수준들에 있어서의 증가를 나타낸다.
암컷 C57BL/6 마우스에 대한 MpRNC 중간의 IP 투여 후 GM-CSF 및 G-CSF 합성의 자극
주사 후 시간들 배 증가(평균±SD)*
GM-CSF G-CSF
1 7.6±9.3 16.5±3.3
4 56.2±28.6 307.1±97.8
7 0.7±0.5 296.2±287.8
24 2.5±2.1 50.3±34.1
*처리 그룹 당 2마리의 마우스.
표 27로부터의 데이타는, MpRNC 중간이 생체내에서 GM-CSF 및 G-CSF의 합성을 자극하며, GM-CSF의 경우 처리 후 4시간째에 및 G-CSF의 경우 처리 후 4 내지 7시간째에 피크에 이름을 나타낸다. 당해 결과들은, 대조군 처리된 마우스와 비교하여 MpRNC 중간 주사 후 4시간째에 GM-CSF 혈청 수준들에 있어서 평균 최대 56배 증가 및 대조군 마우스와 비교하여 주사 후 4 내지 7시간째에 G-CSF 혈청 수준에 있어서 평균 최대 300배 증가가 존재하였음을 나타내었다. 이들 데이타는, MpRNC 중간이 전신 투여후 생체내에서 면역 자극인자 활성(콜로니 자극 인자 유도)을 가짐을 입증한다.
실시예 27
MpRNC의 항암 활성 및 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 영향
당해 실시예는, MpRNC가 항암 활성을 가짐을 나타내기 위해 제공된다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함을 이해하여야 한다. 실시예 3에서 제조된 바와 같은(즉, 마이코박테리아 RNC 세포벽 제형을 사용하는) MpRNC 중간 또는 MpRNC 저의 항암 활성에 있어서 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 존재의 영향을 증식 검정의 암 세포 억제를 사용하여 측정하였다. 당해 실시예는 일반적으로 MRNC의 항암 활성에 있어서 완전한 마이코박테리아 세포의 영향의 예시적이고 대표적인 예로서 사용됨을 이해하여야 한다.
RT4 사람 방광암 세포(ATCC, 버지니아주 마나사스 소재, 제품 번호 # HTB-2TM)을 10%의 열-불활성화된 FBS(둘다의 제조원: Wisent) 및 10㎍/mL의 겐타마이신(제조원: Sigma-Aldrich)이 보충된 DMEM 배양 배지속에 5×105개의 세포/ml의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트들(50μL 용적) 속에 플레이팅하고 37℃의 온도에서 5% CO2의 대기 속에서 밤새 웰들의 표면에 부착하도록 하였다. 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포(121℃, 30분), 50μL의 조직 배양 배지의 용적 속에서 열처리된 MpRNC 중간 또는 저(121℃, 30분) 또는, 오토클레이빙된 MpRNC 중간 또는 저와 혼합된 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 세포의 조합물들을 세포에 가하여 0.01, 0.1, 1.0 및 10㎍/mL의 MpRNC의 최종 농도들을 수득하였다. 이후에, 세포를 48시간 동안 37℃에서 5% CO2의 대기하에 항온처리하였다. RT4 방광암 세포주에 대한 항-증식 활성을 MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 환원 검정을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 10μL의 MTT 용액(PBS 중 5 mg/mL)을 각각의 웰에 48시간의 항온처리 후에 가하고 항온처리를 추가로 4시간 동안 지속하였다. 이후에, 반응을 100μL의 이소프로판올:HCl(24:1 v/v)을 첨가하여 중지하였다. MTT의 환원은 포르마잔의 생산을 초래한다. 포르마잔을 미세피펫을 사용하여 가용화시키고, 광학 밀도(O.D.)를 적절한 대조군들에 대한 570nm의 파장에서 미세플레이트 판독기 속에서 측정하였다. 세포 증식의 억제 퍼센트를 다음 식을 사용하여 측정하였다:
억제% = 100 - [(시험 O.D. - 대조군 O.D.)/대조군 O.D.].
사람 방광암 세포주 RT4를 사용한 MpRNC 저(참조: 실시예 3, 표 6; 제3 조성물) 및 조절된 마이코박테리움 플레이 세포 함량 및 MpRNC 중간(실시예 3, 표 6; 제2 조성물) 및 조절된 마이코박테리움 플레이 세포 함량을 각각 표 28 및 29에 나타낸다. 마이코박테리움 플레이에 대해 상대적인 효능 측정들을 PharmPC v4.2(제조원: Microcomputer Specialists, 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재)를 사용하여 측정하였다.
오토클레이빙된 MpRNC 저, 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 또는, 오토클레이빙된 MpRNC(저)와 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이의 다양한 비율들의 조합에 의한 RT4 방광암 세포 증식의 억제
마이코박테리움 플레이:MpRNC 저:(비율) 즉식 억제 % 상대 효능
농도,㎍/ mL
0.01 0.1 1.0 10
100:0 17.6 18.1 25.8 33.8 1
99:1 11.9 16.2 24.2 34.5 2.5
90:10 18.3 20.0 30.4 35.5 2.2
70:30 18.0 25.5 35.8 43.7 1
50:50 19.1 25.4 35.6 40.2 24.1
30:70 16.2 23.2 34.6 36.6 8.1
10:90 23.9 32.5 42.4 48.7 5.9
5:95 20.6 30.6 43.01 46.7 37.4
1:99 20.2 29.7 41.9 46.3 145.
0:100 17.6 30.8 38.8 42.9 91.0
MpRNC 중간, 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이 또는, 오토클레이빙된 MpRNC 중간과 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이의 다양한 비율들에 의한 RT-4 방광암 세포 증식의 억제
마이코박테리움 플레이:MpRNC 중간 (비율) 증식 억제 % 상대 효능
농도, ㎍/ mL
0.01 0.1 1.0 10
100:0 8.2 16.9 24.7 33.3 1
99:1 13.2 17.8 27.6 37.3 2.6
90:10 15.8 22.0 34.4 40.4 11.6
70:30 20.6 24.2 37.5 38.8 6.2
50:50 22.3 27.5 38.6 43.4 72.0
30:70 18.9 26.0 33.1 32.4 8.8
10:90 22.6 33.2 38.8 43.2 37.1
5:95 19.4 32.5 40.9 43.5 39.7
1:99 23.6 34.6 43.1 47.9 151.0
0:100 24.4 33.0 43.0 47.1 263.3
결과들은, MpRNC 저 및 MpRNC 중간이 항암 활성을 가지며, 오토클레이빙된 마이코박테리움 플레이(즉, 완전한 마이코박테리아 세포를 포함하는 제제)가 MpRNC 저 또는 MpRNC 고에서와 동등한 첨가된 마이코박테리움 플레이를 함유하는 MpRNC보다 RT4 방광암 세포에 대해 항-증식 활성을 거의 지니지 않음을 나타낸다. 또한, 완전한 마이코박테리움 플레이와의 MpRNC 조성물은 최적 미만의 항-증식 활성을 가졌다. 완전한 마이코박테리아 세포 함량이 증가하는 MpRNC에 대해 상대적인 완전한 마이코박테리아 세포가 첨가되지 않은 MpRNC의 상대 효능의 계산은, 마이코박테리아 RNC들 둘다가 완전한 마이코박테리움 플레이보다 상당히 더 큰 효능을 지녔음을 입증하였다(MpRNC 저 및 중간 각각에 대해 91-배 및 263-배). 완전한 마이코박테리아 세포의 첨가는, 10% w/w 이상인 경우 효능에 있어서 유의적인 감소를 초래하였으며, 최적의 완전한 마이코박테리아 세포 함량은 완전한 마이코박테리아 세포 함량의 초기 정도(MpRNC 중간의 경우 0%, 및 MpRNC 저의 경우 1%)에 따라 ≤1.0% w/w이었다. 따라서 항암 적용들을 위해 의도된 MRNC 조성물 및 제형들은 낮은 완전한 마이코박테리아 세포 함량으로부터 유리하다.
실시예 28
루이스 폐 암종에 대한 MpRNC 중간의 항암 활성
당해 실시예는, MpRNC 중간이 시험관내 및 생체내 둘다에서 항암 활성을 지님을 나타내기 위해 제공한다. MpRNC 중간은 MRNC의 예로서 사용되며, 당해 실시예에 교시된 원리들은 마이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC에 적용가능함을 이해하여야 한다.
본 발명의 방법에 따라 제조되고 RNase가 없는 물 속에서 제형화된 MpRNC 중간의 직접적인 항암 활성을 루이스 폐 암종(LLC) 세포주를 사용하여 측정하였다. LLC 세포를 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 입수하였다. LLC는 화학치료제 및 면역치료학적 항암제들의 개발시 집중적으로 사용되고 있다(참조: 예를 들면, Kimura, Y. New Anticancer agents: In vitro and in vivo evaluation of antitumor and antimetastatic action of various compounds isolated from medicinal plants. in vivo 2005; 19:37-60). LLC 세포를 10% v/v 열-불활성화된 태아 소 혈청(56℃에서 30분 동안)(둘다의 제조원: Wisent, 캐나다 퀘벡주 세인트-브루노 소재), 및 10.0㎍/mL의 겐타마이신 설페이트(제조원: Sigma-Aldrich, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)을 함유하는 DMEM 배지 속에 37℃에서 5% CO2의 대기하에 유지시켰다. 겐타마이신이 없는 DMEM/10% 열-불활성된 FBS 중 LLC 세포를 4.0×104개의 세포에서 0.1 mL의 용적으로 96-웰 평편-바닥 조직 배양 미세플레이트들 속에서 종균하고, MpRNC 중간 현탁액(0.1 mL)을 3개의 웰들에 가하여 최종 농도가 0.01 내지 100.0㎍/mL가 되도록 하였다. 이후에, 플레이트들을 48시간 동안 37℃에서 5% CO2의 대기하에 항온처리하였다. MpRNC의 항증식 활성을 실시예 27에서 RT4 방광암 세포주(포르마잔 환원)에 대해 기술한 바와 같이 측정하였다. 결과들을 표 30에 나타낸다.
MpRNC 중간에 의한 LLC 세포 증식의 억제
MpRNC 중간 (㎍/mL)
0.01 0.1 1.0 10 100
LLC 증식의 억제 % 9.5±4.9 23.0 ±5.7 38.5 ±9.2 45.0 ±11.3 49.0 ±5.7
나타낸 결과들은 2개 실험들의 평균 ±SD이다.
표 30에 나타낸 결과들은, MpRNC가 증식의 억제의 측정으로 측정되는 바와 같이, LLC 세포에 대한 투여량-관련 항암 활성을 지님을 입증한다. 따라서, 실시예 27 및 당해 실시예(실시예 28)는, MpRNC의 직접적인 항암 활성이 암 세포 유형-이 아니고 더 나아가 암 특이적이 아님을 입증한다.
먼 부위 전이들은 암 관련 사망률의 선도 원인이다(참조: Kim 등, Carcinoma produced factors activate myeloid cells via TLT2 to stimulate metastasis. Nature 2009;457:102-106). 실험적 간 전이들은 LLC 세포를 비장내로 주사함으로써 생산할 수 있다(참조: Ligo 등, Therapeutic activity and tissue distribution of ME2303, a new anthracycline containing fluorin, and its metabolites in mice bearing hepatic metastases of Lewis lung carcinoma. Anti - Cancer Drugs 1990;1:77-82 및 Alino et al Morpho-functional study of vascular fluorochrome delivery to lung and liver metastases of Lewis lung carcinoma (3LL), Tumori 1991;77:206-211). LLC 세포의 비장내 주사에 의한 간내에서 유도된 종양 부위는 간으로 확산된 전이의 모델로 간주되며, 여기서 종양 촛점들의 수는 쿠퍼 세포(Kupffer cells)의 활성(간의 굴모양 혈관 라이닝(lining)의 특수한 대식구들)을 카라기난으로 차단함으로써 증가된다. 따라서, 당해 모델은 간 전이들의 상이한 국면들을 연구하기 위한 유용한 도구를 제공한다(참조: Kopper 등, Experimental model for liver metastasis formation using Lewis lung tumor. J. Cancer Res and Clin . Oncol . 1982;103:31-38). 다음 연구들의 목적은 C57BL/6 마우스에서 LLC 세포의 비장내 주사에 의해 유도된 실험적 간 전이들에 대한 치료로서, 정맥내(IV) 투여 후, MpRNC 현탁액의 효능을 측정하기 위한 것이었다.
LLC 세포를 위에서 기술한 바와 같이 10% v/v 열-불활성화된 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 속에 유지시켰다. 세포를 매 3 내지 4일마다 일련 계대배양(serially passaged)하고, 2 내지 3회 계대에서 사용하였다. 세포를 수거하고 트립신처리(37℃에서 4분)하며, 태아 소 혈청 및 겐타마이신 설페이트가 없는 DMEM 배지 속에서 2회 세척하고, 250 xg에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하고 세포 펠렛을 태아 소 혈청 및 겐타마이신 설페이트가 없는 DMEM 배지 속에 현탁시켰다. 세포의 수를, 세포 생존능을 트립판 블루 배제를 사용하고 혈구계산기에서 계수하여 측정한 후 요구된 농도로 조절하였다. 세포를 비장내 주사할 때까지 빙상에 유지시켰다.
10 내지 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 캐나다 퀘벡주 세인트 콘스탄트 소재의 Charles River Laboratories Ltd.로부터 입수하였다. 당해 마우스 균주는 LLC 세포에 대해 동계이다. 간 전이들을 일반적인 마취하에서, LLC 세포(100μL의 용적 중 1.0-3.0×105개의 LLC 세포)의 비장내 주사로 유도시켰다. 비장을 암 세포 주사 후 절개하였다. LLC 주사 전(예방학적 처리) 또는 LLC 세포 주사 후(치료학적 처리) 마우스의 처리 효과를 우선 시험하였다. MpRNC 중간을 10마리의 마우스들의 그룹을 사용한 LLC 세포 주사 후 1일 전(예방학적 요법), 2, 5, 7, 9 및 12일(치료학적 요법), 또는 -1, 2, 45, 7, 9 및 12일(예방학적 및 치료학적 요법)에 주사하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 RNase가 없는 주사용 수 속에 제형화된 MpRNC 중간을 5 mg/kg의 체중의 투여량에 상응하는, 100μL의 투여량 용적으로 투여하였다. 간 전이들의 수를 LLC 세포 주사 후 15일째에 측정하였다. 결과(표 31)는, 치료학적 + 예방학적 투여 프로토콜이 예방학적 치료 요법 후 가장 효과적인 치료 요법이며, 치료학적 처리 요법은 최소한 효과적이었음을 나타낸다. 따라서 예방학적 요법과 치료학적 요법의 조합은 간 LLC 전이들의 치료를 위해 가장 효과적이다.
MpRNC 중간에 의한 실험적 LLC 간 전이들의 치료
그룹 1:
비처리		 그룹 2: MpRNC 중간 예방학적 그룹 3: MpRNC 중간 치료학적 그룹 4: MpRNC 중간 예방학적 + 치료학적
종양들의 평균 수 26 11 21 6
이들 데이타는, 암의 치료를 위한 표준 단독 치료요법 또는 신생보조제와 보조제 셋팅들로서 MRNC 중간의 사용이 원시 암종의 전이로부터 생성되는 종양들을 감소시키는데 있어서 유리할 수 있음을 입증한다. 표 31에 나타낸 결과들은 암 세포에 대한 노출 전 표적 기관에서 숙주-방어 메카니즘들의 활성화와 일치하므로(예방학적 활성), 간에서 감소된 종양 세포 종균, 및 또한 표적 기관내 이들의 초기 이식 후 암 세포에서 치료학적 효과를 생성한다. 표 30에 입증된 LLC 세포 표적들에 대한 직접적인 항암의 입증은 이러한 작용 방식을 지지한다.
제2 연구를 수행하여 보다 많은 수의 동물들에서 예방학적/치료학적 요법을 사용한 LLC 간 전이들에 있어서 MpRNC 중간 현탁액 치료의 효과를 측정하였다. 실험적 LLC 간 전이들을 위에서 기술한 바와 같이 20마리의 마우스들의 그룹들을 사용하여 확립하고, 5 mg/kg의 체중의 투여량에서 MpRNC 중간을 사용한 예방학적/치료학적 처리를 수행하였다.
당해 연구의 결과들은, 대조군 그룹에서 141±72(평균±SD) 전이들이 존재하였으며, 위에서 기술한 바와 같은 예방학적 및 치료학적 치료 프로토콜을 사용함으로써, MpRNC 중간 처리가 전이들의 수를 62±41(평균±SD, p<0.0002, Mann-Whitney U-시험)까지 유의적으로 감소시킴을 나타내었으며, 따라서 실험적으로 유도된 간 전이들에 대한 생체내 유의적인 항암 활성을 입증한다. 따라서, 시험관내에서 LLC 세포에 대해 입증된 항암 활성은 생체내에서 간 전이들의 발달에 대한 억제 효과의 예측된 척도로서 입증된다.
실시예 29
마이코박테리아 RNC의 항암 활성
당해 실시예는 , MRNC 가 항암 활성을 지님을 나타내기 위해 제공한다. 당해 실시예에 교시된 원리들은 마 이코박테리아세아에 과로부터의 MRNC 에 적용가능함이 이해되어야 한다.
실시예 3 및 4에서 제조된 바와 같은 마이코박테리아 RNC 의 항암 활성을 암세포 증식 검정의 억제를 사용하여 측정하였다. 당해 분야의 숙련가들은 , 이러한 연구들이 생체내 항암 활성을 예측하는 것으로 알려져 있음을 인식한다. 당해 실시예에서 , 방광암 세포주들을 일반적으로 대표적인 암 세포주들로서 사용하였으며, 당해 분야의 숙련가는 , 이러한 암 세포주들을 사용한 항암 활성 연구들이 다른 암 세포주들에 대해 용이하게 추론될 수 있음을 즉시 이해할 것이다.
총 4명의 사람 방광암 세포를 실시예에서 사용하였으며, 모두 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 입수하였다. 세포주들의 배양은 ATCC 에서 추천한 바와 같이 수행하였다. 방광암 세포주들의 세부사항은 표 32에 나타낸다.
[표 32]
방광암 세포주 특징들
Figure pct00008
방광암 주 세포를 10%의 열-불활성화된 FBS(둘다의 제조원: Wisent) 및 10㎍/mL의 겐타마이신(제조원: Sigma-Aldrich)이 보충된 DMEM 배양 배지 속에 5×105개의 세포/ml의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트들(50μL의 용적) 속에 플레이팅하고, 웰들의 표면에 밤새 37℃의 온도에서 5% CO2의 대기 속에서 부착되도록 하였다. 50μL의 조직 배양 배지의 용적 속에 실시예 3 및 실시예 4에서 기술된 바와 같이 제조된 마이코박테리아 RNC 중간을 세포에 가하여 0.0016, 0.016, 0.16, 1.6, 16, 및 80㎍/mL의 MpRNC의 최종 농도들을 수득하였다. 이후에, 세포를 48시간 동안 37℃에서 5% CO2의 대기 속에서 항온처리하였다. 항-증식 활성을MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 환원 검정을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 10μL의 MTT 용액(PBS 중 5 mg/mL)을 48시간 항온처리 후 각각의 웰에 가하고, 항온처리를 추가로 4시간 동안 지속하였다. 이후에 반응을 100μL의 이소프로판올:HCl(24:1 v/v)의 첨가로 중지시켰다. MTT의 환원은 포르마잔의 생산을 초래한다. 포르마잔을 미세피펫을 사용하여 가용화시키고, 광학 밀도(O.D.)를 KC Junior software package(제조원: BioTek Instruments)를 사용하는 ELx-808IU 미세플레이트 판독기(BioTek Instrument, 제조원: Winooski, 미국 버몬트주 소재)를 사용하여 적절한 대조군들에 대해 570 nm의 파장에서 측정하였다. 암 세포 증식의 억제 퍼센트를 다음 식을 사용하여 측정하였다:
억제 % = 100 - [(시험 O.D. - 대조군 O.D.)/대조군 O.D.].
MRNC 조성물의 효능을 PharmPC v4.2(제조원: Computer Associates, 펜실바이나주 필라델피아 소재)를 사용하여 측정하였다.
4개의 사람 방광암 세포주들을 사용하는 MRNC를 사용하여 수득한 결과들을 표 33에 나타낸다. 모든 MRNC 조성물은 방광암 세포주들에 대해 투여량-의존적인 항-증식 활성을 입증하였다. 마이코박테리움 보비스 균주 BCG로부터의 MbRNC는 최소한 효과적이었으며, 이는, 시험한 최대 투여량에서 ~20 내지 40% 억제(방광암 세포주에 좌우됨)로, 투여량-관련 항증식 활성을 입증한다. 모든 다른 MRNC는 시험한 최대 투여량에서 ~35 내지 70% 억제(방광암 세포주에 좌우됨)로, 투여량-관련된 항-증식 활성을 입증하였다. 이러한 이유로, 마이코박테리움 보비스 균주 BCG로부터의 MRNC에 대한 상이한 MRNC의 효능을 측정하였고, 결과들을 표 33에 나타낸다.
마이코박테리움 보비스 BCG MbRNC에 대한 MRNC의 항증식 효능
　마이코박테리아 RNC 마이코박테리움 보비스 BCG MbRNC에 대한 효능
HT1376 RT4 ScaBER SW780 평균 효능, 4개의 암 세포주들 (± SD)
MbRNC 중간 1 1 1 1 1
MpRNC 중간 716.00 1430.00 7590 6220 3987±3428
MsRNC 중간 214.00 145.00 637 1530 631±635
MvRNC 중간 4190.00 1170.00 11900 9890 6794±4978
방광암 증식의 억제에 대한 가장 강력한 MRNC는 마이코박테리움 박카에로부터의 것이었으며, 이어서 마이코박테리움 플레이로부터의 MpRNC, 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 MsRNC, 및 마이코박테리움 보비스 균주 BCG로부터의 MbRNC의 감소하는 순서이었다. 마이코박테리아 RNC 조성물에 대한 효능의 크기 및 순서는 이들의 기원(저-등급, 고-등급) 또는 돌연변이 상태와 상관없이, 모든 4개의 방광암 세포주들에 대해 유지되었으며, 마이코박테리움 박카에 MvRNC 및 마이코박테리움 플레이 MpRNC는 마이코박테리움 보비스 BCG MbRNC보다 ~6800-배 및 ~4000-배 더 강력하였다.
당해 실시예는 3개의 중요한 원리들을 교시함을 인식하여야 한다. 첫째로, 이질적인 마이코박테리아 종들(병원성, 비-병원성, 신속하게 성장하는, 느리게 성장하는)로부터 제조된 MRNC는 항암 활성을 지니므로, 따라서, 이러한 활성은 마이코박테리아세아에 과의 구성원 종들로부터 제조된 MRNC에 적용가능하다. 둘째로, 암 세포 표적의 돌연변이 상태는 항암 활성을 측정하는데 있어서 역활을 하는 것으로 여겨지지 않는다. 실제로, 유의적인 항암 활성이 공지된 치료 내성 유전형들(p53 및 p21 돌연변이들) 및 MDR 표현형들(예를 들면 HT1376)을 지닌 암 세포주들을 사용하여 관찰된다. 당해 분야의 숙련가들은, 이러한 돌연변이들 및 내성 표현형들이 일반적으로 암의 특징이며, 방광암 세포에 제한되지 않음을 인지하고 있으며, 따라서, MRNC의 항암 활성이 많은 다른 암 유형들에 적용가능함을 인식할 것이다. 셋째로, 3개의 신속하게 성장하는 마이코박테리아 종들로부터 제조된 MRNC는 마이코박테리움 보비스 균주 BCG와 같은 느리게 성장하는 마이코박테리아 종들로부터 제조된 MRNC보다 더 효과적이다.
실시예 30
마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 RNA를 함유하는 조성물(MapRNC)의 제조 및 항암 활성의 측정
당해 실시예에서, 완전한 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 세포를 우선 저속 원심분리로 세척하여 배양 배지 성분들을 제거한 후, 실시예 3에 기술된 바와 같은, Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기를 사용한 고압 균질화를 사용하여 파괴시켰다. 고압 균질화 후, 잔류하는 완전한 마이코박테리아를 어떠한 잔류하는 완전하고 파괴되지 않은 마이코박테리움의 조절된 제거를 위해 최적화된 상대적인 원심분리력들을 사용한 차등적 원심분리에 의해 제거한다. 마이코박테리아 세포벽 단편들과 관련된 마이코박테리움의 핵산들을 포함하는, 마이코박테리아 세포 고갈된 분획 및, 최적의 항암 활성을 위한 완전한 마이코박테리아 세포의 조절된 양들을 보다 높은 상대적 원심분리력에서 원심분리 세척으로 추가로 정제하여 가용성 오염물질들을 제거하였다. MapRNC를 고 상대적 원심분리력에서 원심분리 세척후 펠렛으로 분리한다. 이후에, MapRNC를 121℃에서 5 내지 30분 동안 열처리하였다. MapRNC의 항암 활성을 실시예 8 및 9에 기술된 바와 같이 주요 암 세포 유형들을 대표하는 암 세포주들을 사용하여 측정하였다. 결과들은, 열처리된 MapRNC가 암 세포주들 및 간 전이들에 대한 투여량-관련된 항-증식 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 31
마이코박테리움 플레이의 총 RNA의 항암 활성
마이코박테리움 플레이 세포로부터의 총 RNA 제제의 생물학적 활성을 암 세포 증식 검정을 사용하여 측정하였다. RNA를 트리졸 시약(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 제조한 후 FastRNA Blue-Tubes(제조원: Bio-101 Inc.) 속에서 FastPrep FP120(bead-beater apparatus)(Savant, 제조원: Thermo-Fisher, 캐나다 온타리오주 네페안 소재)를 사용하여 1분 동안 4.5 수준에서 세포 분해하였다. 이후에, RNA 제제를 'DNA가 없는" 시약으로 처리하여 제조업자의 지시(제조원: Ambion, 미국 텍사스주 오스틴 소재)에 따라 잔류하는 게놈 DNA를 제거하였다. RT4(ATCC 제품 번호 HTB-2)와 HT1376 사람 방광암 세포(ATCC 제품 번호 CRL-1472)를 10% FBS(둘다의 제조원: Wisent) 및 10㎍/ml의 겐타마이신(제조원; Sigma-Aldrich)이 보충된 DMEM 배지 속에서 2×105개의 세포/ml의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트들(50μL의 용적) 속에 플레이팅하고, 웰들의 표면에 밤새 37℃에서 5% CO2의 대기하에 부착하도록 하였다. 50μL 용적의 조직 배양 배지중 총 RNA를 세포에 가하여 0.01, 0.1, 1.0㎍/mL의 RNA의 최종 농도들을 수득하였다. 이후에, 세포를 37℃에서 72시간 동안 5% CO2의 대기하에 항온처리하였다. 암 세포주들에 대한 항-증식 활성을 MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 환원 검정을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 10μL의 MTT 용액(PBS중 5 mg/mL)을 각각의 웰에 72시간 항온처리 후 가하고, 항온처리를 추가로 4시간 동안 지속하였다. 이후에, 반응을 100μL의 이소프로판올:HCl(24:1 v/v)의 첨가로 중지시켰다. MTT의 환원으로 포르마잔을 생산한다. 포르마잔을 미세피펫의 사용으로 가용화시키고, 광학 밀도(O.D.)를 미세플레이트 판독기 속에서 적절한 대조군들에 대해 570 nm의 파장에서 측정하였다. 세포 증식의 억제 퍼센트를 다음 식을 사용하여 측정하였다:
억제 % = 100 - [(시험 O.D. - 대조군 O.D.)/대조군 O.D.].
당해 결과들은 각각 0.1㎍/mL, 1.0㎍/mL 및 10.0㎍/mL RNA에서 2.2%, 7.1% 및 6.8%의 억제 활성으로 HT1376에 대해 마이코박테리움 플레이의 총 RNA의 중간 항암 활성을 나타내고 RT4에 대해 각각 0.1㎍/mL, 1.0㎍/mL 및 10.0㎍/mL RNA에서 3.1%, 7.6% 및 18.6%의 증식의 억제로 RT4에 대해 약간 더 억제 활성을 나타내었다. 마이코박테리아 RNA가 마이코박테리아 세포벽과 함께 제형화된 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태이었던, 실시예 27 또는 실시예 29에서 수득된 결과들과 비교하는 경우, 마이코박테리아 세포벽 RNA 조성물(또는 키토산 또는 양이온성 리포좀들과 같은 다른 약제학적으로 허용되는 담체들)을 사용하는 경우의 생물학적 활성과 관련하여 수득될 명백하고 예상치못한 장점들이 존재함이 명백하다.
실시예 32
마이코박테리아 세포벽 RNC의 통합된 효능 지표의 측정
본 발명의 마이코박테리아 세포벽 RNC들(MRNCs)은 2개의 명백한 수용체 시스템들을 통해 면역계를 자극하고 암 세포 분열을 억제하는 능력을 지니므로, 삼기능성 치료학적 조성물이다. 실시예 29, 17 및 19로부터의 데이타(각각 항-증식 효능, NOD2 활성화 효능 및 TLR2 활성화 효능)을 사용하여, MbRNC 중간에 대한 MpRNC 중간, MsRNC 중간 및 MvRNC 중간에 대한 통합된 효능 지표를 전체 항암 및 면역 자극인자 활성들을 통합하는 수단으로서 측정하였다. 상이한 검정들 사이의 상대적 효능들에 대한 광범위한 수치들(≥3 크기들)로 인하여, 자연 로그(log) 변환을 당해 측정시 사용하였으며, 각각의 활성에 대한 값들을 합하였다. MbRNC를 효능 1로 지정하고, 다른 MRNC의 효능을 MbRNC에 대해 측정하였다. 1의 자연 로그는 0인 것으로 이해하여야 한다. 결과들은 표 34에 나타낸다.
MRNC 중간의 통합된 효능 지표
MRNC 중간 항-증식 효능(자연 로그) NOD2 효능(자연 로그) TLR2 효능(자연 로그) 통합된 효능 지표(자연 로그)
MbRNC 0 0 0 0
MpRNC 8.29 4.25 -0.45 12.09
MsRNC 6.45 -0.09 0.67 7.30
MvRNC 8.82 0.37 1.32 10.52
모든 MRNC가 TLR2 활성화와 관련하여 유사한, 비교가능한 효능들을 가진 반면, MpRNC, MsRNC 및 MvRNC는 항암 활성과 관련하여 모두 MbRNC 보다 더 강력함이 명백하다. 그러나, MpNAC는 NOD2 활성화와 관련하여 가장 강력한 MRNC이었다. 통합된 효능 지표의 측정은, MpRNC가 최대 전체 효능을 가지며, 이어서, MvRNC, MsRNC 및 MbRNC의 순서로 감소함을 나타내었다.
실시예 33
면역 자극을 위한 완전한 마이코박테리아 세포의 조절된 양들을 지닌 MRNC 조성물의 제조
MpRNC는 MpRNC 저(실시예 2 및 실시예 3에 상세히 설명한 바와 같음)를 제조하고 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리아 세포를 MpRNC에 가하여 면역 반응들의 유도에 최적인 바람직한 비율을 수득함으로써 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리아의 조절된 양들을 사용하여 편리하게 제조하였다. 일반적으로, 본원의 발명자들은, 면역 반응을 유도하는데 요구되는 완전한 마이코박테리움 플레이 세포의 최적 비율이 약 5 내지 50 중량%의 범위내이며, 이러한 비율들은 최적의 면역 자극 활성을 유발함을 발견하였다.
실시예 34
면역 자극을 위한 완전한 마이코박테리아 세포의 조절된 양들을 지닌 MRNC 조성물의 제조
MRNC는 MRNC 저(MpRNC에 대해 실시예 3에서 기술한 바와 같음)를 제조하고 완전한 오토클레이빙된 마이코박테리아 세포를 MRNC에 가하여 면역 반응들의 유도에 최적인 바람직한 비율을 수득함으로써 마이코박테리움 보비스 균주 BCG, 마이코박테리움 아비움 아균주 파라투베르쿨로시스, 마이코박테리움 스메그마티스 또는 마이코박테리움 박카에와 같지만 이에 한정되지 않는 마이코박테리아세아에 과의 제공된 마이코박테리아 종들로부터 제조하였다. 일반적으로, 본원의 발명자들은, 면역 반응을 유도하는데 요구된 완전한 마이코박테리아 세포의 최적 비율이 약 5 내지 50 중량%의 범위내이며, 이러한 비율들이 최적의 면역 자극 활성을 제공함을 발견하였다.
실시예 35
리보뉴클레아제-A를 사용한 MpRNC의 처리
리보뉴클레아제(예를 들면, 실시예 10에 기술된 효소 분해 조건들)을 사용한 MpRNC의 처리는 MRNC 또는 MpRNC 조성물 속에 함유된 RNA의 양에 있어서 유의적인 감소를 초래한다. 이러한 감소들은 치료제들로서 작용하는 MRNC 또는 MpRNC의 능력을 유의적으로 감소시킨다.
MpRNC 중간은 고압 균질화의 최종 2회 주기들 전에, 세척된 MpRNC 중간 펠렛을 RNase A(제조원: Sigma, 10㎍/mL의 최종 농도; 각각 MpRNC-RNase 및 MpRNC-대조군)의 존재 또는 부재하에 주사용 수 속에 37℃에서 3시간 동안 재현탁시키는 것을 제외하고는, 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. 이후에, MpRNC들을 고속 원심분리로 세척하여 RNase A를 제거하고 주사용 수 속에 1 mg/mL의 농도에서 재현탁시켰다. 현탁액들을 후속적으로 균질화하고 최종적으로 멸균하였다. MpRNC-RNase 및 MpRNC 대조군의 항암 활성을 실시예 27에 기술된 바와 같이 방광암 세포주들 HT1376 및 RT-4를 사용하여 측정하였다. 2개의 MpRNC 제형들의 상대 효능을 PharmPC v4.2(제조원: Microcomputer Specialists, 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재)를 사용하여 투여량-반응 곡선의 선형 부분으로부터 계산하였다.
MpRNC 제형들 둘다는 HT1376 및 RT-4 방광암 세포의 증식을 투여량-관련된 방식으로 억제하였다(각각 표 35 및 36). 그러나, RNase 처리는 방광암 세포주들 둘다에 대해 MpRNC의 항-증식 활성에 있어서의 감소를 초래하였다.
RNase 처리는 HT1376 방광암 세포에 대한 MpRNC의 항-증식 활성을 감소시킨다
MpRNC 농도
(㎍/mL)		 억제 %
MpRNC-대조군 MpRNC-RNase 처리됨
0 0.00 0.00
0.0016 14.29 8.51
0.016 15.51 10.97
0.16 25.99 16.31
1.6 45.71 37.52
16 56.60 50.65
RNase 처리는 RT-4 방광암 세포에 대한 MpRNC의 항-증식 활성을 감소시킨다
MpRNC 농도
(㎍/mL)		 억제 %
MpRNC-대조군 MpRNC-RNase 처리됨
0 0.00 0.00
0.0016 11.05 1.47
0.016 16.94 7.83
0.16 27.90 14.87
1.6 43.39 36.20
16 49.82 42.86
HT-1376 및 RT-4 방광 암 세포주들에 대해 처리된 MpRNC 중간-대조군에 대한 처리된 MpRNC 중간-RNase의 항-증식 효능을 표 37에 나타낸다.
RNase 처리는 MpRNC 중간의 항암 효능을 감소시킨다
방광암 세포주 MpRNC에 대한 RNase-처리된 MpRNC의 효능
HT1376 0.25
RT-4 0.14
RNase 처리의 결과로서 MpRNC 중간에서 RNA의 제거는 항암 효능에 있어서 상당한 감소(HT1376 및 RT-4 방광암 세포의 경우 각각 4배 및 7배)를 초래하였으며, 이는, MpRNC내에서 RNA의 보존이 최적 항암 활성을 위한 요건임을 입증한다.
실시예 36
BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC와 양이온성 리포좀들의 제형 및 항암 활성의 측정
다음 과정들 모두를 멸균 무균 조건들하에서 수행한다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 고압 균질화를 사용한 완전한 세균, 마이코박테리아 또는 엠. 플레이의 파괴, 저 RCF에서 원심분리에 의한 파괴되지 않은 세균, 마이코박테리아 또는 엠. 플레이의 제거, 및 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 및 에탄올 침전을 사용한 RNC 조성물의 추출에 의해 제조한다. RNC 조성물 중 추출된 RNA는 121℃에서 5분 동안 열 처리에 의해 쇄 길이를 감소시킴으로써 대략 20 내지 40개 염기를 함유하는 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 제조하였다. 몰 비가 1:1인 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민/1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOPE/DOTAP)으로 구성된 양이온성 리포좀들은 인지질과 양이온성 지질을 무수 클로로포름(1 mg/mL) 속에 용해한 후 환저 플라스크들 속에서 감압하에 회전 증발시켜 박(thin) 인지질/지질 필름을 형성함으로써 제조한다. 대조군 리포좀들은 필요한 용적의 NaCl(0.85% w/v)을 박 인지질/지질 필름에 가하고, 65℃에서 진탕시켜 리포좀들을 형성시킴으로써 제조한다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 양이온성 인지질들은 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 NaCl 용액을 0.1 mg/mL의 농도에서 박 인지질/지질 필름에 가하고 65℃에서 진탕시켜 리포좀들을 형성시킴으로써 제조한다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 양이온성 리포좀들은, 평균 직경이 대략 825 nm이고 ξ-포텐셜(potential)이 대략 +36 mV일 것이다. 증식 검정의 쥐 B16 흑색종 억제는 실시예 27에 기술된 바와 같이, 리포좀 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 0.01 내지 10㎍/mL의 농도 범위에서 사용하여 수행한다. 대조군 항온처리는 상응하는 농도들의 대조군 양이온성 리포좀들 또는 비-리포좀성 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 사용하여 수행한다. MTT 감소는 실시예 27에 기술된 바와 같이 수행하고, 세포 증식의 억제량을 측정하였다. 결과들은, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 양이온성 리포좀들이 B16 흑색종 세포를 투여량-의존적 방식으로 억제하며, 양이온성 리포좀들 만이 억제 활성을 지니지 않음을 나타낸다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 양이온성 리포좀들의 억제 활성은 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 단독보다 유의적으로 더 크다. 이들 데이타는, 양이온성 리포좀 제형이 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC에 대한 약제학적 전달 시스템으로서 작용함을 입증한다.
RNA가 그람-음성 및 그람-양성 세균으로부터, 및 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 및 마이코박테리움 박카에로부터 분리될 수 있으며, 당해 실시예에 기술된 바와 같이 이들 종들로부터의 세포벽을 첨가하지 않고 양이온성 리포좀들과 함께 제형화될 수 있음을 이해하여야 한다.
B16 흑색종 세포가 당해 실시예에서 전형적인 암 세포를 대표하며, 양이온성 리포좀들이 당해 실시예에서 NA용의 전형적인 약제학적 전달 시스템으로서 사용되며, 당해 분야의 숙련가가 일반적인 암의 치료시 이러한 유형들의 약제학적 전달 시스템들 및 제형들을 사용하는 적용능을 인식할 것임을 이해하여야 한다.
실시예 37
BRNC, MRNC, MRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC와 키토산 나노입자들의 제형 및 항암 활성의 측정
앞서의 과정들 모두를 멸균 무균 조건들하에서 수행한다. BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC는 완전한 세균, 마이코박테리아 또는 엠. 플레이를 고압 균질화를 사용하여 파괴하고, 파괴되지 않은 세균, 마이코박테리아 또는 엠. 플레이를 저 RCF에서 원심분리하여 제거하며, RNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 및 에탄올 침전을 사용하여 추출함으로써 제조한다. 추출된 RNA는 121℃에서 5분 동안 오토클레이빙하여 쇄 길이를 감소시킴으로써 대략 20 내지 40개 염기를 함유하는 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 제조한다. 키토산 나노입자들은 동 용적들의 트리폴리포스페이트(수중 0.5 mg/mL) 및 키토산(평균 분자량 500,000, 수중 농도 1 mg/mL)를 20℃에서 2분 동안 혼합함으로써 대조군 키토산 나노입자들을 형성시키거나 동일한 용적들의 세균, 마이코박테리아 또는 엠. 플레이 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 (BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC, 수 중 0.5 mg/mL) 및 키토산(평균 분자량 500,000, 수 중에서 1 mg/mL의 농도)을 20℃에서 2분 동안 혼합함으로써 제조한다. 키토산 나노입자들 속에 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 혼입은 100%이다. 키토산 나노입자들을 원심분리에 의해 세척하고 이들의 크기 및 ξ-퍼텐셜(입자 표면 전하의 간접적인 척도)을 측정한다. 키토산 나노입자들은, 크기가 대략 200 내지 1000 nm의 범위이며 ξ-포텐셜이 대략 -20 내지 -35 mV이다. B16 흑색종 세포를 MEM 비-필수 아미노산들, 겐타마이신(50㎍/mL) 및 10% v/v 열-불활성화된 태아 혈청이 보충된 MEM 속에서 37℃에서 및 5% CO2에서 합치(confidence)로 성장시킨다. 세포를 트립신처리하여 수거하고, MEM 조직 배양 배지 속에 재현탁시키고 조직 배양 플레이트들의 웰들(96 웰 플레이트들, 5×103개의 세포를 함유하는 100μL) 속에 플레이팅하고 37℃에서 3시간 동안 5% CO2 속에서 부착되도록 한다. 이후에, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 키토산 나노입자들을 B16 흑색종 세포(ATCC)에 가하여 0.001 내지 100㎍/mL 범위의 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC의 최종 농도를 수득한다. 대조군 키토산 나노입자들 또는, 키토산 나노입자의 부재하의 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 B16 흑색종 세포에 가하여 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 키토산 나노입자들과 비교가능한 농도들을 수득한다. 쥐 B16 흑색종 세포를 48 시간 동안 37℃/5% CO2에서 항온처리하고, 시간에 따른 세포 성장을 MTT 환원 검정을 사용하여 측정하였다. 생존가능한 세포의 수에 상응하는 환원된 MTT의 수준을 570 nm에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정한다. 당해 결과들은, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 키토산 나노입자들이 B16 흑색종 세포의 증식을 투여량-의존적 방식으로 억제하며, 키토산 나노입자들만이 억제 활성을 가지지 않고, BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC를 함유하는 키토산 나노입자들의 억제 활성이 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC 단독보다 유의적으로 더 큼을 나타낸다. 이들 데이타는, 키토산 나노입자 제형이 BRNC, MRNC, MpRNC, MbRNC, MsRNC, MapRNC 및 MvRNC에 대한 약제학적 전달 시스템으로서 작용함을 입증한다.
RNA는 그람-음성 및 그람-양성 세균으로부터, 및 마이코박테리아, 마이코박테리움 플레이, 마이코박테리움 보비스 BCG, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 및 마이코박테리움 박카에로부터 분리될 수 있으며, 당해 실시예에 기술된 바와 같이 이들 종들로부터의 세포벽을 첨가하지 않고 키토산 나노입자들과 제형화될 수 있음을 이해하여야 한다.
B16 흑색종 세포는 당해 실시예에서 전형적인 암 세포로서 사용되며, 키노산 나노입자들은 당해 실시예에서 NA에 대한 전형적인 약제학적 전달 시스템으로서 사용되고, 당해 분야의 숙련가는 일반적인 암의 치료시 이러한 유형들의 약제학적 전달 시스쳄들 및 제형들을 사용한 적용능을 인식할 것임이 인지하여야 한다.
실시예 38
마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 RNA를 함유하는 조성물(MapRNC)의 제조
당해 실시예에서, 완전한 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스 세포를 우선 저속 원심분리로 세척하여 배양 배지 성분들을 제거한 후, Avestin EmulsiFlex-C5 고압 균질화기를 사용한 고압 균질화를 사용하여 파괴한다. 고압 균질화 후, 잔류하는 완전한 마이코박테리아를 어떠한 잔류하는 완전하고 파괴되지 않은 마이코박테리아의 조절된 제거를 위해 최적화된 상대적인 원심분리력들을 사용한 차등적 원심분리에 의해 제거한다. 마이코박테리아 세포벽 단편들과 관련된 마이코박테리움의 핵산들 및 바람직하고 조절된 양들의 완전한 마이코박테리아 세포를 포함하는 마이코박테리아 세포 고갈된 분획을 보다 높은 상대적 원심분리력에서 원심분리 세척으로 추가로 정제하여 가용성 오염물질들을 제거한다. 마이코박테리아 세포-고갈된 분획은 고 상대적 원심분리력에서 원심분리 세척 후 펠렛으로서 분리한다. 이후에, 마이코박테리아 세포-고갈된 분획을 121℃에서 5 내지 30분 동안 열처리하고 마이코박테리움 아비움 파라투베르쿨로시스로부터의 마이코박테리아 RNC(MapRNC)로서 사용한다.
실시예 39
MapRNC에서 핵산들의 분석
당해 실시예에서, 핵산 유형, 올리고리보뉴클레오타이드 쇄 길이 및 MapRNC의 함량을 측정한다. MapRNC는 실시예 38에 기술된 바와 같이 제조한다. 핵산들을 다음 과정을 사용하여 추출한다. 1 mg/ml의 농도에서 700μL의 분취량을 DNase- 및 RNase가 없는 라이소자임으로 분해한 후 불활성화시키고 DNase- 및 RNase가 없는 프로테이나제 K(둘다의 제조원: Sigma-Aldrich Canada, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)를 사용하여 추가로 분해한다. 핵산들을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1 v/v)로 추출하고, 글리코겐, 아세트산나트륨 및 에탄올을 첨가하여 침전시킨다. 침전물들을 80% 빙냉 에탄올로 세척하고, 50μL의 증류수 속에 재현탁시킨다. 농도는 260/280 nm에서의 흡광도를 UV 분광광도계 속에서 측정하여 측정한다. 각각의 조성물의 핵산 함량을 측정한다.
열처리(121℃, 30분) 전 및 후에 수집된 MapRNC 제제들은 이들의 핵산 프로파일에 대해 Bioanalyzer system(Bioanalyzer model # 2100, 제조원: Agilent, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)을 사용하여 전기영동적으로 분석한다. 핵산 분획을 30 ng/μL의 농도로 희석시킨다. 추출된 핵산의 길이의 전기영동 분석을 RNA 6000 나노 키트(Agilent # 5067-1511)를 사용하여 바이오분석기 전기영동 장치를 사용하여 달성한다. 당해 키트는, 크기 범위가 25 내지 6000개 뉴클레오타이드인 RNA의 품질에 대한 정보를 제공한다. 이후에 오토클레이빙 후 MapRNC를 크기 범위가 6 내지 150개 뉴클레오타이드인 소 핵산들의 분석을 위해 설계된 Small RNA Kit(제조원: Agilent Technologies Canada Inc., 캐나다 퀘벡주 생-로랑 소재, kit # 5067-1548)를 사용하여 추가로 분석한다. 열처리 전의 MapRNC는 RNA 나노 6000 키트를 사용하여 분석하는 경우 대략 25개 내지 40000개 염기에 근접한 핵산 프로파일을 지닌다. 결과는, MapRNC를 제조하기 위한 고압 균질화 단계(상이한 가압 및 주기들의 수)의 사용이 25 내지 4000개 염기의 폴리리보뉴클레오타이드 쇄 길이를 함유하는 조성물을 생성함을 입증한다. 열처리에 이어서, MapRNC는 보다 조밀한 분포를 나타낸다. MapRNC는 20 내지 40개 염기 사이에서 최대인 올리고리보뉴클레오타이드 피크를 지니며, 길이가 5 내지 60개 염기인 핵산 프로파일을 갖는다. MapRNC 조성물은 100개 염기에서 용출하는 단지 소량들의 핵산을 지니며 길이가 약 150개 염기에서 용출하는 올리고리보뉴클레오타이드 물질을 거의 지니지 않는다. 당해 결과들은, MapRNC를 제조하기 위한 고압 균질화 및 열처리 단계(상이한 가압 및 주기들의 수와 함께 오토클레이빙)의 사용이 60개 미만의 염기의 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드 쇄 길이를 함유하는 조성물을 생성함을 입증한다.
실시예 38에서와 같이 제조된 MapRNC의 DNA 대 RNA의 비의 분석을 추출된 핵산들의 RNase-A를 사용한 효소 분해에 이어 Bioanalyzer 2100 전기영동 프로파일링 및 Agilent Small RNA Kit(kit # 5067-1548)를 사용함에 의한 올리고리보뉴클레오타이드 함량 정량화에 의해 먼저 수행한다. 추출된 핵산들의 RNase-A 분해는 DNase-유리된 리보뉴클레아제 A(RNase A, 100℃에서 30분 동안 처리하여 DNase 활성을 제거한다)(0.1㎍의 효소, 37℃에서 2시간)를 사용하여 수행한다. RNase A는 Ameresco(미국 오하이오주 솔론 소재)로부터 입수한다. RNase A-처리된 핵산의 샘플(20ng/μL)를 Bioanalyzer를 사용하여 분석한다. DNA 및 RNA의 양을 다음 식을 사용하여 MapRNC에서 측정한다:
DNA 함량 = (총 핵산 함량 - RNase-A 처리 후 핵산 함량). MapRNC의 분석은 MapRNC의 추출물 속에서 DNA 및 RNA의 존재를 나타낸다.
본 발명의 MapRNC의 DNA 대 RNA의 비의 분석을 다음과 같이 수행한다. 핵산 분획을 Microsep 1K 단위(분자량 컷 오프 = 1000 Da, 제조원: Pall® Life Sciences, 미국 미주리주 안 아버 소재)를 사용하는 한외여과에 의해 회수한다. 이후에 핵산 용액을 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트들의 혼합물에 대해 뉴클레아제 P1(제조원: Sigma-Aldrich, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)을 사용하여 리앙(Liang)에 의해 보고된 과정(참조: Liang 등, Ann. Chim. Acta 2009, 650:106-110)에 따라 분해한다. 최적의 뉴클레아제 P1 분해를 보증하기 위하여, 시험할 총 50μL의 핵산 수용액들을 수욕 속에서 95 내지 100℃로 10분 동안 가열한 후 빙상에서 즉시 급냉시킨다. 뉴클레아제 P1을 5 단위/μL에서 0.5mM ZnCl2을 함유하는 30mM의 아세트산나트륨 완충액, pH 5.3 속에서 제조한다. 효소 분해를 위해, 수용액 중 50μL의 핵산을 동일한 용적의 뉴클레아제 P1 용액과 혼합한 후 50℃에서 30분 동안 항온처리한다. 수득되는 혼합물을 실온으로 냉각시키고 Nanosep 10K 여과기를 통해 10,000g에서 20분 동안 실온으로 HPLC 분석 전에 여과한다.
DNA 및 RNA 속에 존재하는 100, 10, 5, 2.5, 1 ng/μL의 뉴클레오타이드 각각을 함유하는 모노뉴클레오타이드 표준물들(5'-데옥시리보뉴클레오타이드 및 5'-리보뉴클레오타이드, 제조원: Sigma-Aldrich)의 혼합물의 일련 희석물들을 또한 뉴클레아제 P1 처리로 처리하고 HPLC 분석에서 표준물들로서 사용하기 위해 여과한다. 이들 뉴클레오타이드의 용출 순서는 개개의 뉴클레오타이드를 동일한 HPLC 조건하에서 비교함으로써 확인한다. HPLC 분석은탈기제가 있는 4급 펌프, 자동샘플러, 컬럼 가열기, 및 다중-파장 UV 검출기가 장착된, 1200 시리즈 HPLC 시스템(제조원: Agilent, 캐나다 퀘벡 생-로랑 소재)을 사용하여 수행한다. Zorbax Bonus-RP 컬럼(제조원: Agilent)을 사용하고 이동 상들은 10 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2 및 메탄올(0 내지 10% 메탄올)의 선형 구배를 포함하였다. 모노뉴클레오타이드를 260 nm에서 검출한다. DNA:RNA 비는 DNA 및 RNA 함량을 측정한 후 측정한다. 결과는, RNA가 DNA 외에 MapRNC 속에 존재함을 입증한다.
실시예 40
MapRNC는 사람 병원체-관련된 분자 양식 수용체(PAMP) NOD2의 활성화를 유도한다
실시예 38에서 제조한 바와 같은 MapRNC의 NOD2 활성화 활성을 NF-κB 및 하부 시그날링 마커 IL-8을 구동하는 사람 NOD2 수용체를 발현하도록 가공된 HEK-293 세포를 사용하여 평가한다.
사람 HEK293-NOD2 세포주(제조원: InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 배양하고 10% 태아 송아지 혈청(둘다의 제조원: Wisent, 캐나다 퀘벡주 세인트-브루노 소재), 100㎍/mL의 NormocinTM 및 10㎍/mL의 블라스티딘(둘다의 제조원: InvivoGen)이 보충된 고 글루코즈 DMEM 속에서 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 유지시켰다. HEK293-NOD2 세포를 5×105개의 세포/mL에서 0.2 mL의 용적으로 멸균 96-웰 평편 바닥 조직 배양 미세플레이트들 속에서 위에서 기술된 세포 배양 배지 속에서 종균하고, 48 시간 동안 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160㎍/mL의 MapRNC와 함께 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리한다. 상층액들을 항온처리 후 수집하고, 4,000×RCF에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포과 부스러기를 제거하고 상층액을 -20℃에서 분석을 위해 저장한다. 상층액 중 사람 IL-8을 MapRNC와 함께 48시간 배양 후 시판되는 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)(제조원: BioSource, 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재)을 사용하여 측정한다. 데이타를 ELISA 플레이트 판독기(ELx-808IU Bio Tek Instruments, 미국 버몬트주 위누스키 소재)로부터 KC 주니어 소프트웨어 패키지(Junior software package)(제조원: Bio Tek Instruments, 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 포착하고 pg/mL의 합성된 IL-8로 나타낸다. MapRNC는 IL-8의 합성 및 분비를 투여량-의존적 방식으로 유도한다. 따라서, 당해 결과는, MapRNC가 NOD2-기원한 IL-8 방출을 투여량-의존적 방식으로 유도함으로써 NOD2 효능제로서 기능함을 나타낸다.
실시예 41
MapRNC는 사람 TLR2 활성화 활성을 갖는다
실시예 38에서 제조된 바와 같은 MapRNC의 TLR2 활성화 활성을 사람 TLR2 수용체를 발현하도록 가공된 HEK-293 세포를 사용하여 측정한다.
사람 HEK293-TLR2 세포주를 InvivoGen(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)으로부터 입수한다. HEK293-TLR2 세포는 TLR2 유전자 및 TLR2 수용체-구동된 분비된 배아 알칼린 포스파타제 유전자(SEAP)로 안정하게 형질감염시키고, NF-κB 유전자의 조절하에 위치시킨다. 따라서, TLR2의 활성화는 세포 배양 배지 속에서 알칼린 포스페이트 활성의 생성을 초래하며, 이는 수용체 활성화를 정량화하는데 사용된다. 세포를 배양하고 10% 태아 송아지 혈청(둘다의 제조원: Wisent, 캐나나 퀘벡주 세인트-브루노 소재) 및 1x Normocin(제조원: InvivoGen)이 보충된 고 글루코즈 DMEM 속에서 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에 유지시킨다. HEK293-TLR2 세포를 5×105개의 세포/mL에서 0.2 mL의 용적으로 멸균 96-웰 평편 바닥 조직 배양 미세플레이트들에서 HEK-BlueTM 검출 배지(제조원: InvivoGen) 속에서 종균시키고, 18 시간 동안 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160㎍/mL의 MapRNC와 함께 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리한다. 웰들에 첨가된 HEK-BlueTM 검출 배지를 NF-κB 유도된 가용성 배아 알칼린 포스파타제 효소 활성(SEAP 활성)의 검출을 위해 설계한다. 18시간 항온처리 후, 광학 밀도(이는 TLR2 관여를 통해 NF-κB의 활성화와 비례한다)를 630 nm에서 미세플레이트 분광광도계 판독기(ELx-808IU model, 제조원; Bio Tek Instrument, 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 측정한다. 데이타를 KC 주니어 소프트웨어 패키지(제조원: Bio Tek Instruments)을 사용하여 포획한다. 세포 상층액 속에서 SEAP 활성은 MapRNC 처리 후 투여량-관련된 방식으로 증가한다. 따라서, 결과들은, MapRNC가 TLR2를 투여량-의존적 방식으로 활성화시킬 수 있음을 나타낸다(즉, MapRNC는 TLR2 효능제로서 작용한다).
실시예 42
MapRNC의 항암 활성
실시예 38에서 제조된 바와 같은 MapRNC의 항암 활성을 주요 암 세포 유형들의 대표적인 암 세포주들을 사용하여 측정한다. RT4 사람 방광암 세포(ATCC 제품 번호 HTB-2TM)을 DMEM 배양 배지 속에 및 CT26 쥐 결장암 세포주들(ATCC 제품 번호 CRL-2638TM)을 10% 열-불활성화된 FBS(둘다의 제조원: Wisent) 및 10㎍/mL의 겐타마이신(제조원; Sigma-Aldrich)이 둘다 보충된 RPMI 1640 배지 속에 5×105개의 세포/mL의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트들(50μL의 용적) 속에서 플레이팅하고, 처리 전에 웰의 표면에 밤새 37℃의 온도에서 5% CO2의 대기 속에서 부착하도록 한다. 사람 백혈병 세포 Jurkat(ATCC TIB-152TM)을 10% 열-불활성화된 FBS 및 10㎍/mL의 겐타마이신이 보충된 DMEM 배양 배지 속에 1x106개의 세포/mL의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트들(50μL의 용적) 속에서 현탁시킨다. 50μL의 조직 배양 배지의 용적 속에서 열처리된 MapRNC(예를 들면, 121℃, 30분)를 세포에 가하여 0.01, 0.1, 1.0 및 10㎍/mL의 MapRNC의 최종 농도들을 수득한다. 이후에, 세포를 37℃에서 48 시간동안 5% CO2의 대기 속에서 항온처리한다. 암 세포주들에 대한 항-증식 활성을 MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 환원 검정을 사용하여 측정한다. 요약하면, 10μL의 MTT 용액(PBS중 5 mg/mL)을 각각의 웰에 48시간 항온처리한 후에 가하고, 항온처리를 추가로 4시간 동안 지속한다. 이후에, 반응을 100μL의 이소프로판올:HCl(24:1 v/v)을 첨가하여 중지시킨다. MTT의 환원은 포르마잔의 생산을 초래한다. 포르마잔을 미세피펫의 사용으로 용해시켜, 광학 밀도(O.D.)를 적절한 대조군들에 대해 570 nm의 파장에서 미세플레이트 판독기 속에서 측정한다. 세포 증식의 억제 퍼센트를 다음 식을 사용하여 측정한다:
억제 % = 100 - [(시험 O.D. - 대조군 O.D.)/대조군 O.D.].
결과들은, 열처리된 MapRNC가 RT4 방광암 세포 및 CT26 결장암 세포 및 또한 Jurkat 백혈병 세포에 대해 투여량-관련된 항-증식 활성을 가짐을 나타낸다. 따라서, MapRNC는 암 유형에 제한되지 않는 항암 활성을 갖는다.
실시예 43
면역 자극을 위한 조합 MRNC 제형들
당해 분야의 숙련가는 상기 실시예들을 읽은 후 MRNC의 적절한 조합을 사용하여 바람직한 지표를 위한 최적의 치료학적 활성을 달성할 것이다. 따라서, MpRNC와 MvRNC의 조합은 면역 자극 및 사이토킨 유도를 위한 최적의 NOD2 및 TLR2 활성화를 제공할 것이다. 유사하게, MpRNC와 MvRNC의 조합은 최적의 항암 활성 및 면역 자극을 제공할 것이다.
실시예 44
암의 치료에 사용된 치료학적 제제들과 MRNC의 조합
본 발명의 MRNC 조성물을 화학치료요법 및/또는 면역치료요법과 조합하여 임상 효능을 향상시킨다. 다음 화학치료요법적 요법들에 대한 MRNC의 첨가는 포괄적인 나열(이러한 나열은 예를 들면, 암의 치료시 일반적인 220개 이상의 약물 요법들을 기술하는 The Elsevier Guide to Oncology Drugs and Regimens, 2006에서 이용가능하다)인 것으로 의도되지 않으며, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 실시예들을 읽은 후, 신생보조제 또는, 가장 적절한 화학치료요법 요법들과의 보조제 셋팅들에서 암의 치료시 본 발명의 조성물을 사용할 것임을 이해하여야 한다. 다음 2개의 프로토콜들은, MRNC가 화학치료요법 및 면역치료요법과 함께 사용되는 방법의 원리를 설며?기 위해 제공한다.
결장 및 직장암들: 국소적으로 진전된 질병을 가진 결장 및 직장 암들을 지닌 환자들은 간의 간 문맥 종균(seeding)을 통해 간 전이들에 대한 고 위험 상태에 있다. 화학치료요법은 흔히 간 전이들 및, 다른 기관들에 대한 후속적인 2차 전이의 발생 정도를 감소시킬 목적으로 수술 절제 전 또는 후에 개시된다(신생보조제 또는 보조제 셋팅들). 5-플루오로우라실은 흔히 매 28일마다 반복되는 5일 동안의 매일 연속적인 IV 주입에 의한 1000mg/m2의 요법을 사용하여 전이 또는 진전된 질병의 치료에 사용된다. 본 발명의 MRNC는 치료학적으로 활성인 투여량(임상 평가 연구들을 통해 측정됨)에서 정맥내 거환 또는 주입으로서, 5-플루오로우라실을 사용한 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후에 제공될 수 있다. MRNC 제형들은 전임상 시험 및 임상 평가들(제1상, 제2상 및 제3상 임상 연구들)에서 가장 효과적인 것으로 측정된 투여량에서 투여할 수 있다. 이러한 투여량들은 투여량당 0.00001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. 조합된 치료요법을 제공받는 환자들은 5-플루오로우라실 치료요법만을 제공받는 환자들과 비교하는 경우 재발까지의 증가된 시간, 감소된 전이들, 감소된 종양 부담(burden) 또는 근절로부터 잇점을 지닌다. 베바키주마브의 존재 또는 부재하의 5-플루오로우라실, 루코보린 및 옥살리플라틴; 세툭시마브의 존재 또는 부재하의 이리노테칸, 류코보린 및 5-플루오로우라실; 또는 MRNC의 효능을 제한하지 않은 미토마이신 c 및 5-플루오로우라실과 같지만, 이에 한정되지 않는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다른 화학치료요법 요법들을 사용할 수 있다.
폐암: 다른 화학치료제들과 함께 사이클로포스파미드를 앞서 치료되지 않은 환자들, 또는 진전된, 재발된 또는 전이 암을 지닌 환자들의 치료를 위해 사용한다. 대표적인 요법들은 사이클로포스파미드, 독소루비신(아드리아마이신) 및 에토포시드(CAE)이나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 사이클로포스파미드는 1일째에 1000 mg/m2의 투여량으로 I.V.로 투여하고, 독소루비신은 1일째에 45 mg/m2의 투여량으로 I.V.로 투여하며, 에포포시드는 1일 내지 3일 째에 100 mg/m2의 투여량으로 I.V.로 투여한다. 치료 주기는 매 28일마다 반복된다. 본 발명의 MRNC는 각각의 화학치료학적 약물 치료 주기 전, 동안 또는 후에 MU-CSF, G-CSF 및 GM-CSF의 자극을 통해 대식구 및 과립구 생산을 향상시키는데 가장 효과적인 최적 투여량(측정된 MRNC 제형들은 전임상 시험 및 임상 평가들(제1상, 제2상 및 제3상 임상 연구들)에서 측정된 투여량에서 투여될 수 있다)에서 I.V. 거환으로서 투여된다. 이러한 투여량들은 투여량당 0.00001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. MRNC로 치료한 환자들은 화학치료요법만으로 치료한 환자들과 비교하는 경우 전염성 에피소드(infectious episodes)의 발생 정도가 감소되고 단핵구 및 호중구 수들에 있어서 화학치료요법-유도된 감소들과 관련된 치료 주기들이 지연된다. MRNC의 효능을 제한하지 않고 폐암(원발성 또는 전이성)의 치료를 위한 다른 화학치료요법 요법들을 사용할 수 있다.
경부암: 경부암은 HPV 감염과 관련된다. 일부 15개의 HPV 유형들이 종양원성이라고 해도, HPV16 및 16은 모든 경부 암들의 70%에 대해 관여하는 것으로 여겨진다. 현재의 면역화 프로토콜들은 감염을 예방하는데 효과적이지만 확립된 감염들을 치료하는데 효과적이지 않다. 경부 기능이 보존되어야 하는 경우 암 세포 및 진행중인 바이러스 감염에 대한 치료요법이 요구되는 경부 암의 치료시 충족되지 않는 필요성이 존재한다. 진전된, 재발성 또는 전이성 질병은 1일째에 카르보플라틴 50 내지 100 mg/m2을 I.V.로 치료하고 독소루비신 45 내지 60 mg/m2을 I.V.로 사용하여 치료하며, 당해 주기를 매 21일마다 반복한다. MRNC는 화학치료요법 전, 동안 또는 후에 앞선 임상 시험을 통해 면역 자극을 위해 최적인 것으로 측정된 투여량에서 경부내 주사에 의해 경부내로 국소 투여된다. NRNC 제형들은 전임상 및 임상 평가들(제1상, 제2상 및 제3상 연구들)에서 측정한 투여량에서 가장 효과적인 것으로 측정된 투여량에서 투여될 수 있다. 이러한 투여량들은 투여량당 0.00001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. MRNC는 2개의 효과들을 가지는데, 첫째는 면역 반응의 유도를 통한 바이러스-감염된 세포에 대한 면역 반응의 생성을 통해 경부내에서 HPV 바이러스들(HPV 16 및 18 포함)의 바이러스 하중이 감소되는 것이고, 둘째는, MU-CSF, G-CSF 및 GM-CSF의 유도를 통한 화학치료제들의 임상 효능의 증강이다.
상기 인용된 모든 특허들, 공보들 및 초록들은, 이의 전문이 참조로 본원에 혼입된다. 앞서의 것들은 단지 본 발명의 상이한 양태들에 관한 것이며 다수의 변형들 또는 변경들이 다음 특허청구범위에서 정의한 바와 같은 본 발명의 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 본원에서 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.

Claims (21)

  1. 마이코박테리아 RNA; 및,
    마이코박테리아 세포벽을 포함하며, 페놀 또는 프로나제(pronase)를 함유하지 않는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 완전한 마이코박테리아 세포를 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RNA가 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태이고, 여기서 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 길이가 약 2 내지 약 4000개 염기, 약 2 내지 약 150개 염기, 또는 약 20 내지 약 40개 염기인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 완전한 마이코박테리아 세포가 조성물의 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%(wt%)를 구성하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 전달 시스템을 추가로 포함하는 조성물.
  6. A) 마이코박테리아 세포 생물량을 파괴하여 파괴된 마이코박테리아 세포, 완전한 마이코박테리아 세포, 파괴된 마이코박테리아 세포벽 및 RNA를 생성시키는 단계;
    B) 완전한 마이코박테리아 세포를 파괴된 마이코박테리아 세포벽 및 RNA로부터 분리하는 단계; 및,
    C) 파괴된 마이코박테리아 세포의 일부의 가용성, 세포질 성분들을 파괴된 마이코박테리아 세포벽 및 RNA로부터 분리하여 마이코박테리아 세포벽, 리보핵산 조성물을 수득하는 단계의 연속 단계를 포함하는, 제1항에 따른 조성물의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RNA가, 길이가 약 2 내지 약 4000개 염기, 약 2 내지 약 150개 염기, 또는 약 2 내지 약 40개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드의 형태인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 단계 B 후에 완전한 마이코박테리아 세포를, 길이가 약 2 내지 약 150개 염기 또는 약 2 내지 약 40개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 생성하기에 충분한 온도에서 가열하며, 여기서 완전한 마이코박테리아 세포가 불활성화되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 파괴 단계 A가 약 10,000 psi 이상에서 고압 균질화를 포함하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 파괴 단계가 분리 단계 B 또는 C 전에 2 내지 5회 반복되는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 분리 단계 C 후에 파괴 단계 2 내지 5를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 분리 단계 B가 고속 원심분리이고 분리 단계 C가 고속 원심분리인 방법.
  13. 제6항에 있어서,
    단계 A) 및 B)를 반복하여 완전한 마이코박테리아 세포의 수를 조절하는 단계; 및
    마이코박테리아 세포벽, 리보핵산 조성물을, 길이가 약 2 내지 약 150개 염기 또는 약 2 내지 약 40개 염기인 올리고리보뉴클레오타이드 및 폴리리보뉴클레오타이드를 수득하기에 충분한 온도로 가열하는 단계의 연속 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 5항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 암을 지닌 동물에게 당해 동물에서 암 세포의 성장을 억제하거나 암 세포에서 세포자멸사를 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하여, 암을 지닌 동물을 치료하기 위한, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  15. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 당해 동물에서 면역계를 자극시키기에 충분한 양으로 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 동물에서 면역계를 자극시키기 위한, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 동물에서 면역계의 자극이 조혈 후대세포(들)의 분화를 자극하거나, 사이토킨들 또는 케모킨들의 분비를 증가시키거나, 조혈 성장 인자의 합성을 증가시키거나, 뉴클레오타이드에 결합하는 올리고머화 도메인 2(NOD2) 수용체를 활성화시키거나, 톨-유사 수용체(Toll-like receptor) 2(TLR2) 수용체를 활성화시킴을 포함하는 용도.
  17. 암 치료요법 또는 면역 자극 치료요법에 대한 보조제로서의, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  18. 미들브룩(Middlebrook) 7H9 분말화된 배지; 글루코즈; 글리세롤; 추가의 철; 추가의 탄소; 추가의 질소; 및 물을 포함하는 마이코박테리아의 배양을 위한 합성 배지.
  19. 제18항에 있어서, 추가의 철이 시트르산철암모늄이고, 추가의 탄소가 시트르산철암모늄, 시트르산암모늄 또는 아스파라긴이고, 추가의 질소가 시트르산철암모늄, 시트르산암모늄 또는 아스파라긴인 합성 배지.
  20. 시트르산암모늄; L-글루탐산; 피리독신; 바이오틴; 인산이나트륨; 인산일칼륨; 시트르산철암모늄; 황산마그네슘; 염화칼슘; 황산아연; 올레산; 글리세롤; 글루코즈; 및 물을 포함하는, 마이코박테리아의 배양을 위한 합성 배지.
  21. 제20항에 있어서, 아스파라긴을 추가로 포함하는 합성 배지.
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