JP4426097B2 - 膀胱癌の治療のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
[発明の分野]
本出願は、1998年2月18日に出願された米国の予備出願第60/075,111号の完全な利益を求め、かつ、参考として取り込む。
本発明は、マイコバクテリアデオキシリボ核酸(B−DNA)−マイコバクテリア細胞壁複合体(BCC)を含み、ここでB−DNAは細菌細胞壁上に、BCCが膀胱癌を治療するのに有効であるように保存され、複合体化される。さらに特に、本発明は、マイコバクテリウム・フレイ(M. phlei)−DNA(M−DNA)−M. phlei細胞壁複合体(MCC)を含み、ここでM−DNAはM. phlei細胞壁上に、MCCが膀胱癌細胞の増殖を阻害し、膀胱癌細胞中のアポプトーシスを誘発するのに有効であるように保存され、複合体化される。
【0002】
[発明の背景]
癌は、変則的な細胞の異常な最終的な蓄積であり、これは過度の増殖、不完全なアポプトーシス、またはこれら2つの組合せから生じ得る。アポプトーシスは、細胞表面上のレセプターに結合するリガンドにより開始され得る(Muzio et al. Cell 85:817-827, 1996)。これらのレセプターにおける突然変異は、アポプトーシスの損傷を生じ得る。アポプトーシスはまた、p53/p21調節因子を含むが、これには限定されない細胞内タンパク質により誘発され得る(Levine A. Cell 88:323-331, 1997)。機能的p53/p21の損失は、種々の癌における攻撃性と相関する(Fisher D. Cell 78:529-542, 1994)。化学療法剤は、主としてこの治療的効果のために癌細胞中でアポプトーシスの誘発に依存する。化学療法剤の有効性を消失させる薬剤耐性は、低下したアポプトーシスを直接的にまたは間接的に誘発し、一般的に種々の癌における不良な予後と関連する。
【0003】
膀胱の癌は、良好に治療するのが特に困難である(Lamm et al. Journal of Urology 153:1444-1450, 1995)。膀胱癌を治療するのに用いられる細菌起源の調製物には、バチルス カルメット ゲーリン(BCG:bacillus Calmette-Guerin)(Pryor et al. British Journal of Cancer 71:801-807, 1995)およびレグレッシン(Regressin)(商標)(Bioniche, Inc. London, Ontario, Canada)、鉱油乳濁液として処方されたマイコバクテリア細胞壁抽出物(MCWE)(米国特許第4,744,984号:Chin et al. Journal of Urology 156:1189-1193, 1996)が含まれるが、これらには限定されない。
【0004】
BCGは、直接的にはアポプトーシスを誘発しない(Sasaki et al. Urology International 59:142-148, 1997)。むしろ、BCGは免疫系の細胞を刺激して、生物活性分子、例えばサイトカインおよび反応性酸素種(これらには限定されない)を生成し(Kudoh et al. British Journal of Urology 80S2:40, 1997)、これが次にアポプトーシスおよび細胞溶解を誘発する。
【0005】
ペプチドグリカン、並びにN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンおよびミコール酸誘導体を含む糖脂質から主として構成されるMCWE(Chin et al. Journal of Urology 156:1189-1193, 1996)は、マクロファージおよび単球媒介反応の活性化により免疫系を刺激すると考えられている(Teware et al. Veterinary Parasitology 62:223-230, 1996)。
【0006】
BCGおよびMCWEを用いて得られる治療学的利点は、種々であり、矛盾し、製造方法および送達方法並びに得られた調製物の免疫原性および安定性の変異に依存ようである。さらに、生きたBCGは、発熱、血清病状症候群、肉芽腫性感染症、敗血症(セプシス)およびさらには死を含むが、これらには限定されない重大な副作用を引き起こし得る(Lamm et al. Journal of Urology 147:596-600, 1992)。
【0007】
他の従来技術の抗膀胱癌剤もまた、臨床的適用のために比較的適切ではないことが明らかになった。これらの薬剤の多くは、有効でなく、あるいはまた有毒であり、顕著な副作用があり、薬剤耐性または免疫感作の発生を生じ、および受容体を衰弱させる。さらに、これらの薬剤の多くは、それらの有効性について、リガンド表面レセプターまたはp53/p21に依存する。
【0008】
従って、膀胱癌細胞の増殖を阻害し、膀胱癌細胞におけるアポプトーシスを誘発する新規な治療薬剤の必要性がある。この治療薬剤は、抗膀胱癌細胞剤として、および他の抗膀胱癌細胞剤への付加物として有用でなければならない。付加物は、治療効果を高めるのに、他の抗膀胱癌細胞剤と共に有用となるるものを意味する。さらに、このような治療剤は、簡素であり、製造するのが比較的安価でなければならず、この活性は製造中に再現性を有しなければならず、この活性は長時間にわたり安定なままでなければならず、かつこの膀胱癌細胞に対する効果は、最小の毒性と関連する投与計画と共に達成可能でなければならない。
【0009】
[発明の概要]
本発明は、マイコバクテリアデオキシリボ核酸(B−DNA)−マイコバクテリア細胞壁複合体(BCC)を含み、ここでB−DNAが、BCCが膀胱癌細胞を治療するのに有効であるように、細菌細胞壁上に保存され、複合体化された組成物および方法を提供することにより、前述の必要性を満たす。さらに特に、本発明は、MCCが膀胱癌細胞の増殖を阻害し、膀胱癌におけるアポプトーシスを誘発するのに有効であるように、M−DNAがM. phlei細胞壁上で保存され、複合体化された、マイコバクテリウム・フレイ(M. phlei)−DNA(M−DNA)−M. phlei細胞壁複合体(MCC)を提供することにより、前述の必要性を満たす。MCCは簡素であり、製造するのが比較的安価であり、その活性は製剤間で再現性があり、MCCは長時間にわたり治療的に安定なままであり、かつMCCは、繰り返しの投与に際してさえ、最小毒性と関連する投与計画において有効である。
【0010】
MCCを調製するために、M. phleiを液体培地中で生育させ、採取する。M. phleiは破壊され、破壊されたM. phleiの固体成分は、遠心沈降により採取される。固体成分は脱タンパク質化および脱脂質化され、洗浄される。DNase非含有試薬を用いて、調製中のM−DNA分解を最小にする。
【0011】
MCCは、薬学的に許容可能な担体と組合せて、ヒトを含む動物に、膀胱内の癌細胞を、防げ、治療し、消失させるのに十分な投与量で投与される。p52/21異常、および薬剤耐性の細胞を含むがこれらには限定されない膀胱癌細胞の増殖を阻害し、この膀胱癌細胞におけるアポプトーシスを誘発する、MCCの予期されず、驚異的な能力は、医薬業界において長期にわたり満たされないと感じられていた必要性に向けられており、重要な利点を提供する。
【0012】
MCCはまた、他の抗癌剤の有効性を高める付加物として有効である。それらは、薬物;免疫促進剤;抗原;抗体;ワクチン;放射線;化学療法剤;核酸剤;生物学的に工作された薬剤;化学的に合成された薬剤;活性化または不活性化のために細胞死分子を標的する薬剤;並びに応答性細胞の増殖を阻害し、応答性細胞におけるアポプトーシスを誘発する薬剤を含むが、これらには限定されない。
【0013】
従って、本発明の目的は、膀胱癌を防止するのに有効な組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、膀胱癌を治療するのに有効な組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、膀胱癌を消失させるのに有効な組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、膀胱癌細胞の増殖を阻害する組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、膀胱癌細胞におけるアポプトーシスを誘発する組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、膀胱内に免疫系の応答細胞を刺激して生物活性分子を生成する組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、膀胱癌において新脈管形成を阻害するのに有効な組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、他の抗膀胱癌療法への付加物として有効な組成物および方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、応答細胞による認識に最適な粒度および組成を有する組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、応答細胞による取り込みに最適な粒度および組成を有する組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、大量に製造することができる組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、製造するのが比較的安価な組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、製剤間で再現性のある活性を有する組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、長時間にわたり安定なままである組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、長時間にわたりその有効性を維持する組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、受容体に最小の毒性を有する組成物を提供することにある。
【0014】
本発明のこれらのおよび他の目的、特徴および利点は、以下の開示された実施態様および添付した特許請求の範囲を検討すればに明らかになる。
【0015】
[発明の詳細な説明]
本発明は、細菌のデオキシリボ核酸(B−DNA)−細菌細胞壁複合体(BCC)を含み、ここで、B−DNAは細菌細胞壁上に、この複合体がヒトを含む動物の膀胱の癌細胞を予防、治療および消失するのに有効であるように保存され、複合体化される。
【0016】
コリネホルム(Coryneform)の各種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)の各種、ロドコッカス(Rhodococcus)の各種、ユーバクテリウム(Eubacterium)の各種、ボルデテッラ(Bordetella)の各種、エシェリヒア(Escherichia)の各種、リステリア(Listeria)の各種、ノカルディア(Nocardia)の各種およびマイコバクレリウム(Mycobacterium)の各種を含むが、これらに限定されない多くの細菌種を使用して本発明を実施することができる。好ましくは、M. smegmatis、M. fortuitum、M. kansaasii、M. tuberculosis、M. bovis、M. vacciae、M. aviumおよびM. phleiを含むがこれらに限定されないMycobacterium種が使用される。最も好ましくは、Mycobacterium種のM. phleiが使用される。
【0017】
したがって、本発明は、より詳細には、M. phleiデオキシリボ核酸(M−DNA)−M. phlei細胞壁複合体(MCC)を含み、ここで、M−DNAはMCCが膀胱の癌細胞を予防、治療および消失させるのに有効であるようにM. phlei細胞壁上に保存され、複合体化される。MCCにおいて、M−DNAの量は、無傷のM. phlei細胞におけるM−DNAの量に応じて増加される。さらに、M−DNAは、無傷のM. phlei細胞内のM−DNAよりも応答細胞に作用しやすいように、M. phlei細胞壁上に保存され、複合体化される。以下の仮説に拘束されることを望まないが、短鎖のオリゴヌクレオチドの形態で、M−DNAとそのM. phlei細胞壁との物理的関連の両方がMCCの治療活性の最適な発現に寄与すると考えられる。
【0018】
MCCの治療活性を増大させる方法には、同一または異なる細菌種由来の刺激配列又はDNA構造の化学的な補足、もしくは生物工学的な増幅、及び、M−DNAまたはMCCの天然または合成担体との複合体化が含まれるが、これらに限定されない。さらに、治療有効性を増大させるために、MCCを別の抗膀胱癌剤の前、同時、または後に投与することができる。
【0019】
MCCおよびその薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、MCCと液体担体、固体担体、またはその両方と均一かつ密接に関連させることにより調製される。液体担体には、水性担体、非水性担体またはその両方が含まれるが、これらに限定されない。固体担体には、生物学的担体、化学的担体および生物工学的に操作された担体が含まれるが、これらに限定されない。
【0020】
薬学的に許容可能な担体のうち、MCCは、水性懸濁液、油性乳濁液、水−油乳濁液、水−油−水乳濁液、リポソーム、微小粒子、部位特異的乳濁液、長期持続性乳濁液、粘着性乳濁液、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノパーティクル、ミニポンプ中およびMCCの放出を維持させる種々の天然または合成ポリマーとともに投与することができる。さらに、MCCは、応答細胞にMCCを供与するために使用された担体に関係なく賦形剤の任意の1つ、全部、または任意に組み合わせて使用することができる。これらには、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤(これらに限定されない)が含まれ、懸濁剤および増粘剤を含んでもよい。
【0021】
好ましくは、MCCは、水性懸濁液として投与される。MCCは、DNase非含有水、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)など(これらに限定されない)の薬学的に許容可能な担体中に懸濁され、超音波処理によって乳化される。必要に応じて、乳化された混合物を微小流動化(microfluidization)によってホモジナイズする。例えば、凍結乾燥MCCを、DNase非含有水に懸濁し、20%出力で5分間超音波処理する(Model W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.)。超音波処理した組成物を、15,000〜30,000psiで1貫流の微小流動化によってホモジナイズする。(Model M-110Y; Microfluidics, Newton, MA)。混合物は、無菌的に処理されるか、または最終的に滅菌される。
【0022】
非水性担体での投与のために、MCCを、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびその混合物(これらに限定されない)などの鉱油または中性油で乳化される。前記油は、ポリ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸と適切に混合されている。例として、ダイズ油、キャノーラ油、パーム油、オリーブ油およびミグリオール(myglyol)(これらに限定されない)が含まれ、ここで、脂肪酸の炭素数は12と22との間であり、この脂肪酸は飽和でも不飽和であってもよい。必要に応じて、中性油中に荷電した脂質またはリン脂質を懸濁させることができる。例えば、DNase非含有ホスファチジルコリンを、DNase非含有トリグリセリドダイズ油に1gリン脂質/20mlトリグリセリドの比率で添加し、50℃〜60℃で穏やかに加熱しながら溶解させる。数グラムのMCCを、乾燥オートクレーブ処理コンテナに添加し、リン脂質−トリグリセリド溶液を20ml/1gMCCの濃度で添加する。懸濁物を20℃で60分間インキュベートし、20mlMCCの懸濁物/1LのPBSの比率でDNase非含有PBSと混合する。混合物を、20%出力で5分間超音波処理(Model W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.)することにより、乳化する。必要に応じて、乳化MCC混合物を、15,000psi〜30,000psiで1回貫流する微小流動化(Model M-110Y; Microfluidics)によってホモジナイズする。MCC乳濁物をオートクレーブ処理した蓋付き瓶に移し、4℃で保存する。
【0023】
MCC粒子のサイズは、応答細胞が認識し、取り込むために最適でなければならない。好ましくは、MCC粒子の平均直径は、約10〜約10,000nm、より好ましくは約100〜約1,000nm、最も好ましくは約250〜約600nmである。
【0024】
MCCのM−DNA含有量は、好ましくは約0.001〜約90mg/100mg乾燥MCC、より好ましくは約0.01〜約40mg/100mg乾燥MCC、最も好ましくは約0.1〜約30mg/100mg乾燥MCCである。また、タンパク質含有量は、約2mg/100mg乾燥MCC未満であり、脂肪酸含有量は約2mg/100mg乾燥MCC未満であることが好ましい。予期されないことに、本発明者らは、MCCの乾燥重量の少なくとも約3.6%が抽出可能なM−DNAであることを見出した。
【0025】
MCCおよび/またはM−DNAは、膀胱の応答細胞において治療的応答を誘発するのに有効な量を投与される。投与されるMCCおよび/またはM−DNAの投与量は、治療される症状、特定の処方および受容体の体重および健康状態ならびに投与経路などの他の臨床的因子に依存する。好ましくは、MCCおよび/またはM−DNAの投与量は1投与あたり約0.00001〜約100mg/kg、より好ましくは1投与あたり約0.0001〜約50mg/kg、最も好ましくは1投与あたり約0.001〜約10mg/kgである。
【0026】
投与経路には、経口、静脈内、病変内、腫瘍内および膀胱内が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、MCCおよび/またはM−DNAは、尿管カテーテル(これに限定されない)による膀胱内注入によって投与される。膀胱内へのMCCおよび/またはM−DNA注入の他の方法は、当業者に公知である。
【0027】
投与経路に依存して、1投与あたりの体積は、好ましくは、約0.001〜約100ml、より好ましくは約0.01〜約70ml、最も好ましくは約0.1〜約40mlである。MCCおよび/またはM−DNAは、治療される疾患、受容体の健康状態および投与経路に適切なスケジュールおよび期間で単回投与および複数回投与することができる。
【0028】
膀胱内へ投与する場合、投与体積に依存して、膀胱への用量は、約1分〜約8時間、より好ましくは約15分〜約4時間、最も好ましくは約30分〜約2時間を維持すべきである。
【0029】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提供されるが、それと同時に、いかなる限定もされない。これに対して、本明細書を読解後、本発明の精神および/または添付の請求の範囲から逸脱することなく、当業者は種々の他の実施形態、改変および等価物を行い、提案できることが明確に理解されるべきである。
【実施例1】
Mycobacterium phleiからのMCCの調製、並びにMCCおよびM. phleiからのM−DNAの精製
PCT出願番号CA981/00744号に記載されているように、MCCを、Mycobacterium phlei(M. phlei)(110株)から調製し、M−DNAを、MCCから精製し(MCC−DNA)、M−DNAをM. phleiから精製した(M. phlei−DNA)。DNAの保存を促進するようにすべての試薬を選択した。別記しない限り、MCC、MCC−DNAおよびM. phlei−DNAをDNase非含有水または薬学的に許容可能なDNase非含有緩衝液中に再懸濁し、超音波処理によって乳化した。カブトガニ遊走細胞(Limulus amebocyte)ライゼートQCL−1000キット(BioWhittaker, Walkersville, MD)を用いて測定したところ、MCC、MCC−DNAおよびM. phlei−DNAはエンドトキシンを含んでいなかった。
【実施例2】
細菌DNA−細菌細胞壁複合体および他の細菌種由来の細菌DNAの調製
実施例1と同様にして、細菌DNA−細菌細胞壁複合体(BCC)および細菌DNA(B−DNA)を、M. smegmatis、M. fortuitous、Nocardia rubra、Nocardia asteroides、Cornybacterium parvum、M. kansaasii、M. tuberculosisおよびM. bovisから調製した。
【実施例3】
DNase処理
MCC−DNAおよびMCC(それぞれ1μgのM−DNAを含む)およびレグレッシン(商標)(米国特許第4,744,984号)を、1国際単位(IU)のRNase非含有DNaseI(Life Technologies)を用いて20mM トリスHCl(pH8.4)、2mM MgCl2および50mM KCl中、25℃で1時間消化した。DNaseIを、最終濃度2.5mMのEDTAの添加および65℃で10分間の加熱により不活化した。
【実施例4】
細胞および試薬
HT−1197およびHT−1376ヒト膀胱癌細胞?????を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC, Rockville, MD)から入手し、非必須アミノ酸およびビタミンを補充し10%FCSを含むMEM(MEM−FCS)(Gibco Life Science)中で培養した。HT−1197は、男性のヒトで発症した未分化の移行膀胱癌の第4段階の細胞である。HT−1197細胞は、ドキソルビシン(doxorubicin)(これに限定されない)などの化学療法剤に感受性を有する。HT−1376は、女性のヒトで発症した未分化の移行膀胱癌の第3段階の細胞である。HT−1376細胞は、p53/p21異常であり、シスプラチンおよびマイトマイシン(これらに限定されない)などの化学療法剤に耐性を有する。B−16F1、THP−1、RAW264.7、Jurkat、#L−60およびHL−60MX−1細胞をATCCから入手し、ATCCで推奨されている培地中で培養した。別記しない限り、細胞を6ウェルの平底組織培養プレートに、3×105〜106細胞/mlの濃度で播種し、5%のCO2中37℃で維持した。
【0030】
仔牛胸腺DNA、ニシン精子DNAおよびEscherichia coliリポ多糖(LPS)を、Sigma Chemicals Co.(St. Louis, MO)から入手した。組換えヒトIL−12(hIL−12)を、R & D Systems(Minneapolis, MN)から入手した。
【実施例5】
細胞増殖の阻害
細胞増殖を、ジメチルチアゾール−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)還元(Mosman et al. Journal of Immunological Methods 65:55-63, 1983)を用いて測定した。
【0031】
HT−1376、HT−1197、B−16F1、THP−1、RAW264.7、Jurkat、HL−60およびHL−60MX−1細胞を、0〜10μg/mlのMCC、M. phlei−DNA、MCC−DNA、ニシン精子DNAおよび仔牛胸腺DNAと共に24時間インキュベートした。MCC(第1図)、M. phlei−DNA(第2図A)およびMCC−DNA(第2図B)は、用量に依存して増殖を阻害した。ニシン精子DNA(第2図Aおよび第2図B)および仔牛胸腺DNA(第2図Aおよび第2図B)は、増殖を阻害しなかった。HT−1197(第3図A)およびHT−1376(第3図B)細胞もまた、0〜100μg/mlのMCCおよびLPSと共に24時間インキュベートした。MCCは、用量に依存して増殖を阻害したが、LPSは、増殖を阻害しなかった(第3図Aおよび3B)。
【0032】
MCCおよびM−DNAは、HT−1197およびp53/p21異常で薬物耐性のHT−1376膀胱癌細胞の増殖を阻害した。さらに、細胞増殖の阻害はすべてのDNA(ニシン精子DNAおよび仔牛胸腺DNA)に共通ではなく、非特異的免疫刺激(LPS)由来の結果ではない。
【実施例6】
DNA断片化によって示されるアポプトーシスの誘発
細胞DNAのヌクレオソームサイズ化されたフラグメントへの断片化は、アポプトーシスを受ける細胞に特有である(Newell et al. Nature 357:286-289, 1990)。DNA断片化を評価するために、非接着性細胞を、200gで10分間の遠心分離によって回収した。非接着性細胞および残存した接着性細胞のペレットを、0.5mlの低浸透圧性の溶解緩衝液(10mM トリス緩衝液、1mM EDTA、0.2% Triton(トライトン)X−100、pH7.5)で溶解した。溶解物を、13,000gで10分間遠心分離し、上清(断片化DNAを含む)を50%イソプロパノールおよび0.5M NaCl中、−20℃で一晩沈殿させた。沈殿物を、遠心分離にて回収し、100Vで3時間0.7%のアガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
【0033】
HT−1197およびHT−1376膀胱癌細胞を、1μg/ml MCCまたは1ng/ml hIL−12で48時間インキュベートした(第4図)。MCCは、非接着性HT−1197細胞(第4図A、レーン2)およびHT−1376細胞(第4図B、レーン2)ではDNA断片化を顕著に誘発するが、接着性HT−1197細胞(第4図A、レーン3)およびHT−1376細胞(第4図B、レーン3)では誘発しなかった。PBS(第4図Aおよび4B、レーン5)、hIL−12(第4図Aおよび4B、レーン4)およびDNaseI処理MCC(第4図Aおよび4B、レーン7)は、非接着性HT−1197またはHT−1376細胞におけるDNA断片化を誘発しなかった。未処理細胞(第4図Aおよび4B、レーン1)は、DNA断片化が認められなかった。123bpのDNAラダー(Gibco Life Science)を使用してヌクレオソームサイズのDNAフラグメントの分子量を測定した(第4図Aおよび4B、レーンL)。
【0034】
MCCは、HT−1197およびHT−1376膀胱癌細胞のアポプトーシスを誘発するが、DNaseI処理MCCは、これらの細胞においてアポプトーシスを誘発しない。これは、M−DNAの無傷のオリゴヌクレオチド構造は、アポプトーシスの誘発に必要であることを示唆する。hIL−12は、HT−1197またはHT−1376細胞においてアポプトーシスを誘発しない。
【実施例7】
核有糸分裂タンパク質装置(nuclear mitotic protein apparatus)(NuMA)の可溶化によって指示されるアポプトーシスの誘発
細胞核における顕著な形態的変化は可溶化によって生じ、NuMAの放出はアポプトーシスに特有である。培養細胞からのNuMAの放出を、市販のELISA(Calbiochem, Cambridge, MA)を用いて単位/ml(U/ml)で測定した(Miller et al. Biotechniques 15:1042-1047, 1993)。
【0035】
HT−1197およびHT−1376膀胱癌細胞(0〜100μg/mlのMCCと共に48時間インキュベート)は、用量に依存してNuMAを放出した(第5図)。HT−1197(第6図A)およびHT−1376(第6図B)細胞(1μg/mlまたは100μg/mlのMCCと共に48時間インキュベート)は、24時間以内にNuMA放出の増大が認められた。HT−1197細胞(MCCおよびMCC−DNAと共に48時間インキュベート)は、MCC−DNAよりもMCCを用いた方が有意に大きいNuMAの放出が認められた(第7図)。MCCおよびMCC−DNAのDNaseI処理は、NuMA放出を顕著に減少させた(第7図)。
【0036】
HT−1197およびHT−1376膀胱癌細胞におけるアポプトーシスのMCC誘発は時間および用量の両方に依存する。以下の仮説に拘束されることを望まないが、M−DNAのオリゴヌクレオチド構造およびM. phlei細胞壁上のM−DNAの供与は、最適なアポプトーシス誘発に重要であると考えられる。
【実施例8】
MCC細胞毒性
細胞毒性を、原形質膜の完全性の喪失およびLDH(これに制限されない)などの原形質酵素の放出によって特徴付けた(Phillips et al. Vaccine 14:898-904)。
【0037】
MCCの細胞毒性を評価するために、全LDH放出を対照としてHT−1197およびHT−1376ヒト膀胱癌細胞を、0〜100μg/mlのMCCまたは溶解緩衝液(10mM トリス、1mM EDTA、0.2%トライトンX−100、pH7.5)と共に48時間インキュベートした(Filion et al. Biochim Biophys Acta 1329:345-356, 1997)。LDHを、市販のアッセイ(Sigma-Aldrich)で同定した。MCCが細胞毒性ではないことは(第8図)、MCCがHT−1197およびHT−1376膀胱癌細胞に直接作用して増殖を阻害し、アポプトーシスを誘発することを示す。
【実施例9】
nu/nuマウスにおけるヒト膀胱癌のMCCおよびMCC−DNA治療
ヒト膀胱癌(HT−1197)を、免疫不全無胸腺症ヌードマウス(nu/nuマウス)の皮下組織の異所性固体腫瘍として確立し、マウスを、5つの群に分けた。第1群には、賦形剤のみを投与する。第2群には、MCCを投与する。第3群には、DNaseI処理MCCを投与する。第4群には、MCC−DNAを投与する。第5群には、DNaseI処理MCC−DNAを投与する。癌の質量を、治療前および治療後4週間週毎に測定する。第2群のマウスおよび第4群のマウスには、癌の質量の退行が認められる。第1、3、および5群のマウスには、癌の質量の退行が認められない。
【実施例10】
ヒト膀胱癌のMCC治療
10人の第3段階の正所性膀胱癌患者を、2つの群に分ける。第1群には、MCCを8週間週毎に静脈注入する。第2群には、標準的な化学療法治療を行う。第1群の患者には、膀胱癌の顕著な退行が認められ、身体を衰弱させるような顕著な副作用は報告されなかった。第2群の患者には、膀胱癌の最小の退行が認められ、身体を衰弱させるような顕著な副作用が報告された。
【実施例11】
MCCの安定性
1mg/mlのMCCを0.85%w/vNaClの滅菌懸濁液として4℃で6ヶ月間暗所で保存した。平均粒子直径を、光子相関分光法(N4 Plus, Coulter Electronics Inc.)を用いて計算した。MCC懸濁液を、5×104〜106カウント/秒の粒子計数率まで0.85%w/vNaClで希釈した。平均粒子直径を、以下の条件を用いた粒度分布プロセッサモード(SDP)において計算した:流体屈折率1.33、温度20∞C、粘度0.93センチポイズ、測定角度90.0∞、サンプル時間10.5μs、サンプル実行時間100秒。電位、即ち粒子とバルク(bulk)溶媒との間の水力学的境界面での電荷を、以下の条件を用いてDelsa 440SX(Coulter Electronics Inc.)で測定した:電流0.7mA、周波数域500Hz、温度20∞C、流体屈折率1.33、粘度0.93センチポイズ、誘電率78.3、導電率16.7ms/cm、オンタイム2.5秒、オフタイム0.5秒、サンプル実行時間60秒。
【0038】
第9図に見られるように、MCC電荷およびMCCの直径は、6ヶ月間の保存の間に比較的変化しないままであった。さらに、THP−1単球におけるMCCによるIL−12産生の刺激およびアポプトーシスの誘発は、6ヶ月間の保存では変化しないままであった。
【0039】
上記が本発明の好ましい実施形態のみに関連し、かつ添付の請求の範囲に記載のように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく多数の改変および変更を行うことができると当然理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 第1図。HT−1376、HT−1197、B−16F1、THP−1、RAW264.7、Jurkat、HL−60およびHL−60MX−1癌細胞のMCCによる増殖阻害に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図2】 第2図A。HT−1376、HT−1197、B−16F1、THP−1、RAW26A.7、Jurkat、HL−60およびHL−60MX−1膀胱癌細胞のM. phlei−DNA(2A)、MCC−DNA(2B)、仔牛胸腺−DNA(2Aおよび2B)およびニシン精子−DNA(2Aおよび2B)による増殖阻害に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図3】 第2図B。第2図の続きである。
【図4】 第3図A。HT−1197(3A)およびHT−1376(3B)ヒト膀胱癌細胞のMCCおよびLPSによる増殖阻害に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図5】 第3図B。第3図の続きである。
【図6】 第4図。HT−1197(4A)およびHT−1376(4B)ヒト膀胱癌細胞における未処理およびDNaseI処理MCCならびにhIL−12によるDNA断片化の誘発に関する図である。示した結果は3つの実験のうちの1つについてのものであり、それぞれ類似の結果を示した。
【図7】 第5図。漸増濃度のMCCを用いたHT−1197およびHT−1376ヒト膀胱癌細胞からのNuMAの放出に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図8】 第6図A。1μg/mlのMCCまたは100μg/mlのMCCを用いて48時間処理したHT−1197(6A)およびHT−1376(6B)ヒト膀胱癌細胞からのNuMAの放出に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図9】 第6図B。第6図の続きである。
【図10】 第7図。1μg/mlの未処理およびDNaseI処理のMCC−DNAおよびMCCを用いて処理したHT−1376ヒト膀胱癌細胞からのNuMAの放出に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図11】 第8図。MCC細胞毒性の指標としてのHT−1197およびHT−1376ヒト膀胱癌細胞によるLDH放出%に関する図である。結果は、3つの独立した実験の平均±SDである。
【図12】 第9図。6ヶ月間の保存の間のMCCの安定性に関する図である。
Claims (20)
- 膀胱ガンを有するほ乳類の膀胱中のガン細胞の成長を阻害するための医薬組成物であって、
a. マイコバクテリウム・フレイ(M. phlei)デオキシリボ核酸(M-DNA);
b. 脱タンパク質化、脱脂質化されたM. phleiの細胞壁であって、前記M-DNAが保持され、複合体化されたM. phleiの細胞壁、および
c. 薬学的に許容される担体
を含み、膀胱ガンを有するほ乳類の膀胱に投与されるための医薬組成物。 - 免疫系細胞が生物活性分子を生産するように刺激されることにより前記ガン細胞成長が抑制される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記生物活性分子がサイトカインおよび活性酸素種からなる群から選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記サイトカインがIL-6、IL-10およびIL-12からなる群から選択される、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記サイトカインがIL-12である請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記ガン細胞成長はガン細胞へのアポトーシス誘導により抑制される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記アポトーシス誘導が異常p53/p21に依存しない、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記アポトーシス誘導が薬剤耐性に依存しない、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記の薬学的に許容される担体が液体担体および固体担体からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ガン細胞成長がガン細胞増殖の阻害により抑制される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 膀胱ガンを有するほ乳類の膀胱内のガン細胞の成長を阻害するための医薬組成物であって、
a. マイコバクテリウム・フレイ(M. phlei)デオキシリボ核酸(M-DNA)および、
b. 薬学的に許容される担体を含み、
ガンを有するほ乳類の膀胱に投与されるための医薬組成物。 - 前記の薬学的に許容される担体が、液体担体および固体担体からなる群から選択される請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記ガン細胞成長がガン細胞中へのアポトーシス誘導により抑制される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記アポトーシス誘導が異常p53/p21に依存しない、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記アポトーシス誘導が薬物耐性に依存しない、請求項13に記載の医薬組成物。
- 免疫系細胞が生物活性分子を生産するように刺激されることにより前記ガン細胞成長が抑制される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記生物活性分子がサイトカインおよび活性酸素種からなる群から選択される、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記サイトカインが、IL-6、IL-10およびIL-12からなる群から選択される、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記サイトカインがIL-12である請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記ガン細胞成長がガン細胞の増殖阻害により抑制される請求項11に記載の医薬組成物。
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