DE69829316T2

DE69829316T2 - Behandlung des harnblasenkrebses durch mycobacterium phlei zellwand

Info

Publication number: DE69829316T2
Application number: DE69829316T
Authority: DE
Inventors: C. Nigel PHILLIPS; C. Mario FILION
Original assignee: Bioniche Life Sciences Inc
Current assignee: Telesta Therapeutics Inc
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: DE69829316D1; WO1999042113A1; JP2002503697A; PT1054680E; ES2238780T3; NZ506406A; ATE290390T1; HK1030887A1; EP1054680B1; CA2321296A1; RO122992B1; JP4426097B2; AU751667B2; CN1153576C; CN1290171A; DK1054680T3; EP1054680A1; AU1746599A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität aus US Provisional Anmeldung 60/075111 (eingereicht am 18. Februar 1998).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von von Proteinen befreiter, von Lipiden befreiter Mycobacterium phlei Zellwand (MCC) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harnblasenkrebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, mit Harnblasenkrebs. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines Komplexes aus Mycobacterium phlei (M. phlei) DNA (M-DNA) und M. phlei Zellwand zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei die M-DNA erhalten und an der M. phlei Zellwand so komplexiert bleibt, dass MCC wirksam darin ist, die Proliferation von Harnblasenkrebszellen zu inhibieren und die Apoptose darin zu induzieren.
Hintergrund der Erfindung
Krebs ist eine von der Regel abweichende Nettoanreicherung von atypischen Zellen, die aus übermässiger Proliferation, einem Mangel an Apoptose oder einer Kombination der beiden entstehen kann. Die Apoptose kann durch Liganden ausgelöst werden, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden (Muzio et al., Cell 85: 817–827, 1996). Mutationen in diesen Rezeptoren können ein Versagen der Apoptose auslösen. Die Apoptose kann ferner durch intrazelluläre Proteine ausgelöst werden, inklusive, aber nicht begrenzt auf p53/p21-Regulatoren (Levine A. Cell 88: 323–331, 1997). Verlust von funktionellem p53/p21 korreliert in einer Vielfalt von Krebsarten mit Aggressivität (Fisher D. Cell 78: 529–542, 1994). Chemotherapiemittel beruhen in ihrer therapeutischen Wirkung im Wesentlichen auf einer Induktion der Apoptose in Krebszellen. Arzneimittelresistenz, die die Wirksamkeit von Chemotherapiemitteln vermindert, führt direkt oder indirekt zu einer verminderten Apoptose und geht im Allgemeinen mit einer schlechten Prognose bei einer Vielfalt von Krebsarten einher.
Krebs der Harnblase ist besonders schwer zu behandeln (Lamm et al., Journal of Urology 153: 1444–1450, 1995). Präparate bakteriellen Ursprungs, die zur Behandlung von Harnblasenkrebs eingesetzt werden, schließen, sind darauf jedoch nicht beschränkt, bacillus Calmette-Guerin (BCG) (Pryor et al., British Journal of Cancer 71: 801–807, 1995) und Regressin^® (Bioniche Inc., London, Ontario, Kanada), einen mycobakteriellen Zellwandextrakt (MCWE), in Rezeptur als Mineralölemulsion eingesetzt (U.S. Patentnummer 4,744,984; Chin et al. Journal of Urology 156: 1189–1193, 1996), ein.
BCG induziert die Apoptose nicht direkt (Sasaki et al. Urology International 59: 142–148, 1997). Vielmehr regt BCG Zellen des Immunsystems dazu an, bioaktive Moleküle herzustellen wie, aber nicht begrenzt auf, Cytokine und reaktive Sauerstoffspezies (Kudoh et al. British Journal of Urology 8082: 40, 1997), die dann Apoptose und Zellyse induzieren.
Es wird angenommen, dass MCWE, das hauptsächlich aus Peptidoglykan und Glykolipid besteht, das N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und Mykolsäurederivate enthält (Chin et al. Journal of Urology 156: 1189–1193, 1996), das Immunsystem durch eine Aktivierung von Makrophagen und Monocyten vermittelter Reaktionen stimuliert (Teware et al., Veterinary Parasitology 62: 223–230, 1996).
Der therapeutische Nutzen, der durch den Einsatz von BCGG und MCWE erzielt wird, ist variabel und widersprüchlich, und scheint von der Methode der Herstellung und der Methode der Applikation sowie der Variabilität an Immunogenität und Stabilität der resultierenden Präparation abzuhängen. Darüber hinaus kann lebendes BCG schwere Nebenwirkungen auslösen, inklusive, aber nicht beschränkt auf, Fieber, der Serumkrankheit ähnelnde Syndrome, granulomatöser Infektion, Sepsis und sogar Tod (Lamm et al. Journal of Urology 147; 596–600, 1992).
Andere im Stand der Technik bestehende Harnblasenkrebsmittel stellten sich ebenfalls als weniger als angemessen für klinische Anwendungen heraus. Viele dieser Mittel sind unwirksam oder toxisch, zeigen signifikante Nebenwirkungen, bewirken das Entstehen einer Arzneimittelresistenz oder Immunsensitivierung und sind für den Einnehmenden entkräftend. Ferner sind viele dieser Mittel für ihre Wirksamkeit von Ligandenoberflächenrezeptoren oder von p53/p21 abhängig.
WO 99/07383, die am 5. August 1998 eingereicht wurde, unter anderem unter Beanspruchung des Prioritätsdatums 05. August 1997, und am 18. Februar 1999 veröffentlicht wurde, beschreibt eine Zusammensetzung, die Mycobacterium phlei-DNA umfasst, wobei diese DNA in darauf ansprechenden Zellen die Proliferation inhibiert und die Apoptose induziert sowie darauf ansprechende Zellen des Immunsystems dazu anregt, bioaktive Moleküle zu produzieren.
Es besteht folglich der Bedarf für ein neues therapeutisches Mittel, das in Harnblasenkrebszellen die Proliferation inhibiert und die Apoptose induziert. Dieses therapeutische Mittel sollte als Antiharnblasenkrebsmittel und als Zusatz zu anderen Antiharnblasenkrebsmitteln verwendbar sein. Als „Zusatz" wird verstanden nützlich mit anderen Antiharnblasenkrebsmitteln, um die Effektivität der Behandlung zu erhöhen. Ein solches therapeutisches Mittel sollte des Weiteren einfach und relativ preiswert in der Herstellung sein, seine Wirkung sollte zwischen verschiedenen Präparationen reproduzierbar sein, seine Wirkung sollte im Zeitablauf stabil sein und seine Wirkungen auf Harnblasenkrebszellen sollten mit Dosierungen erreichbar sein, die mit minimaler Toxizität einhergehen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung genügt den oben genannten Anforderungen durch die Verwendung von von Proteinen befreiter, von Lipiden befreiter Mycobakterium phlei Zellwand (MCC) für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Harnblasenkrebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, mit Harnblasenkrebs.
In dieser Hinsicht wird darauf hingewiesen, dass MC Fillion et al., British Journal of Cancer (1999) 79 (2), Seiten 229–235, eine Literaturstelle ist, die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde und die beschreibt, dass der Mycobakterium phlei Zellwandkomplex direkt die Apoptose in humanen Harnblasenkrebszellen induziert.
Insbesondere genügt die vorliegende Erfindung den obengenannten Anforderungen durch die Verwendung eines Mycobakterium phlei (M. phlei)-DNA-(M-DNA)-M. phlei Zellwandkomplexes (MCC) für die Herstellung eines Medikaments, wobei die M-DNA auf der M. phlei Zellwand erhalten und komplexiert wird, so dass die MCC wirksam in der Lage ist, die Proliferation von Harnblasenkrebszellen zu inhibieren und dort die Apoptose zu induzieren. MCC ist einfach und relativ preiswert in der Herstellung, seine Wirksamkeit ist zwischen Präparationen reproduzierbar, es bleibt im Zeitablauf therapeutisch stabil und es ist in Dosierungen wirksam, die mit minimaler Toxizität einhergehen, selbst bei wiederholter Verabreichung.
Zur Herstellung von MCC lässt man M. phlei in Flüssigmedium wachsen und erntet sie. Die M. phlei werden aufgebrochen und die festen Bestandteile der aufgebrochenen M. phlei werden durch Zentrifugensedimentation gewonnen. Die festen Bestandteile werden von Proteinen und Lipiden befreit und gewaschen. Um den Abbau der M-DNA während der Präparation zu minimieren, werden DNase-freie Reagenzien verwendet.
MCC ist in Kombination mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger einem Tier, inklusive eines Menschen, in einer Dosis zu verabreichen, die ausreicht, Krebszellen in der Harnblase zu verhindern, zu behandeln und zu eliminieren. Die unerwartete und überraschende Fähigkeit des MCC, die Proliferation von Harnblasenkrebszellen zu inhibieren und ihre Apoptose zu induzieren, inklusive, aber nicht beschränkt auf p53/21 abnorme und Arzneimittel resistente Zellen, spricht einen seit langem bestehenden, nicht befriedigten Bedarf in der Medizin an und stellt einen bedeutenden Nutzen dar.
MCC ist auch als Zusatz wirksam, um die Wirkung von anderen Antikrebsmitteln zu erhöhen. Diese schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf: Arzneimittel; Immunstimulantien; Antigene; Antikörper; Impfstoffe; Bestrahlung; Chemotherapiemittel, Nukleinsäueremittel; biologisch veränderte Mittel; chemisch synthetisierte Mittel; Mittel, die auf Zelltodmoleküle zwecks Aktivierung oder Inaktivierung abzielen und Mittel, die die Proliferation von reagierenden Zellen inhibieren oder deren Apoptose induzieren.
Dementsprechend ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Medikament bereitzustellen, das wirksam Harnblasenkrebs verhindert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das wirksam Harnblasenkrebs behandelt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das wirksam Harnblasenkrebs entfernt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das die Proliferation von Harnblasenkrebszellen inhibiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das die Apoptose in Harnblasenkrebszellen induziert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das reagierende Zellen des Immunsystems innerhalb der Harnblase dazu anregt, bioaktive Moleküle zu produzieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das wirksam darin ist, die Angiogenese in Harnblasenkrebszellen zu inhibieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das als Zusatz zu anderen Antiharnblasenkrebstherapien wirksam ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament von einer Partikelgröße und Rezeptur bereitzustellen, die optimal für die Erkennung durch reagierende Zellen ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament von einer Partikelgröße und Rezeptur bereitzustellen, die optimal für die Aufnahme in reagierende Zellen ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das sich in großen Mengen herstellen lässt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das relativ preiswert in der Herstellung ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das innerhalb verschiedener Präparationen eine reproduzierbare Wirksamkeit hat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das im Zeitablauf stabil bleibt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das im Zeitablauf seine Wirksamkeit beibehält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Medikament bereitzustellen, das für den Empfänger minimal toxisch ist.
Diese und weitere Gegenstände, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der beigefügten Ansprüche deutlich werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1.: Inhibition der Proliferation von HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 und HL-60 MX-1 Krebszellen durch MCC. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
2.: Inhibition der Proliferation von HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 und HL-60 MX-1 Harnblasenkrebszellen durch M. phlei-DNA (2A), MCC-DNA (2B), Kalbsthymus DNA (2A & 2B) und Heringssperma DNA (2A & 2B). Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
3.: Inhibition der Proliferation von HT-1197 (3A) und HT-1376 (3B) humanen Harnblasenkrebszellen durch MCC und LPS. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
4.: Induzierung der DNA Fragmentierung in HT-1197 (4A) und HT-1376 (4B) humanen Harnblasenkrebszellen durch unbehandeltes und mit DNase I vorbehandeltes MCC und durch hIL-12. Die dargestellten Ergebnisse entstammen einem aus drei Versuchen, von denen jedes entsprechende Ergebnisse ergab.
5.: Freisetzung von NuMA aus HT-1197 und HT-1376 humanen Harnblasenkrebszellen mit steigenden Konzentrationen von MCC und durch hIL-12. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
6.: Freisetzung von NuMA aus HT-1197 (6A) und HT-1376 (6B) humanen Harnblasenkrebszellen mit 1 μg/ml MCC oder mit 100 μg/ml MCC über 48 h. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
7.: Freisetzung von NuMA aus HT-1376 humanen Harnblasenkrebszellen mit 1 μg/ml unbehandeltem und mit DNase I vorbehandelten MCC-DNA und MCC. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
8.: Prozentuale LDH-Freisetzung durch HT-1197 und HT-1376 humanen Harnblasenkrebszellen als Indikator für MCC Zytotoxizität. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen.
9.: Stabilität von MCC während einer Lagerung von 6 Monaten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von von Proteinen und Lipiden befreiter Mycobacterium phlei (M. phlei) Zellwand (MCC) für die Herstellung eines Medikamentes, so dass das Medikament darin ist wirksam, Krebszellen in der Harnblase eines Tieres, inklusive eines Menschen, zu verhindern, zu behandeln und zu beseitigen.
Verwendet wird die Mycobacterium Art M. phlei. Daher umfasst die vorliegende Erfindung einen M. phlei-Desoxyribonukleinsäure (M-DNA)-M. phlei-Zellwandkomplex (MCC), wobei die M-DNA erhalten bleibt und an die M. phlei-Zellwand komplexiert wird, so dass der MCC darin wirksam ist, Krebszellen in der Harnblase zu verhindern, zu behandeln und zu beseitigen. Im MCC ist der Gehalt an M-DNA relativ zum Gehalt an M- DNA in einer intakten M. phlei Zelle erhöht. Des Weiteren ist die M-DNA erhalten und komplexiert an die M. phlei-Zellwand, so dass sie leichter für ansprechende Zellen sehr viel leichter zugänglich ist als die M-DNA in einer intakten M. phlei Zelle. Ohne die Absicht, an die folgende Hypothese gebunden zu sein, wird angenommen, dass beide, die M-DNA, in Form von kurzen Oligonukleotiden, und ihre physikalische Assoziation mit der M. phlei Zellwand, zur optimalen Ausbildung der therapeutischen Wirkung der MCC beitragen.
Verfahren zur Erhöhung der therapeutischen Wirkung von MCC schließen ein chemisches Ergänzen oder biotechnologisches Amplifizieren stimulatorischer Sequenzen oder Bestätigungen von DNA, die von der gleichen oder einer anderen Bakterienart stammen und die Komplexierung der M-DNA oder MCC an natürliche oder synthetische Träger ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Außerdem kann MCC vor, zur gleichen Zeit wie oder nach einem anderen Antiharnblasenkrebsmittel verabreicht werden, um die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen.
Zusammensetzungen, die MCC und seine pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten, werden hergestellt, indem die MCC mit Flüssigkeitsträgern, mit festen Trägern oder mit beidem gleichmäßig und eng in Verbindung gebracht wird. Flüssigkeitsträger schließen wässrige Träger, nicht wässrige Träger oder beide ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Feste Träger schließen biologische Träger, chemische Träger oder biotechnologisch hergestellte Träger ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Unter seinen pharmazeutisch akzeptablen Trägern kann MCC in wässriger Lösung, Ölemulsion, Wasser-in-Öl-Emulsion, Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, Liposomen, Mikropartikel, ortsgerichtete Emulsionen, lang anhaltende (long-residence) Emulsionen, klebrige Emulsionen, Mikroemulsionen, Nanoemulsionen, Mikrosphären, Nanosphären, Nanopartikel, Minipumpen, und mit verschiedenen natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymeren verabreicht werden, die eine anhaltende Freisetzung von MCC erlauben. Des Weiteren kann MCC mit jedem einzelnen, allen oder jeder Kombination von Arzneistoffträgern verwendet werden, unabhängig vom Arzneistoffträger, der verwendet wird, um MCC den ansprechenden Zellen zu präsentieren. Diese schließen Antioxidantien, Puffer und Bakteriostatika ein und können Stellmittel („suspending agents") und Verdickungsmittel umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Vorzugsweise ist MCC als wässrige Suspension zu verabreichen. MCC wird in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger wie, aber nicht beschränkt auf, DNase-freiem Wasser, Salzlösung oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert und wird durch Ultraschallbehandlung emulgiert. Optional wird das emulgierte Gemisch durch Umwandeln in eine unter-mikrometer feine Emulsion („Mikrofluid") homogenisiert. Lyophilisiertes MCC wird beispielsweise in DNase-freiem Wasser suspendiert und bei 20% Leistung für 5 Minuten (Modell W-385 Ultraschallgerät, Heat Systems-Ultrasonics Inc) mit Ultraschall behandelt. Das beschallte Gemisch wird bei 15.000–30.000 psi für einmaliges Durchfluten (Model M-110Y; Microfluidics, Newton, MA) in Form des Verwandelns in eine „Mikrofluid" homogenisiert. Das Gemisch wird entweder aseptisch prozessiert oder begrenzt sterilisiert.
Zur Verabreichung in einem nicht-wässrigen Träger wird MCC mit einem Mineralöl oder mit einem neutralen Öl wie, aber nicht begrenzt auf, einem Diglycerid, einem Triglycerid, einem Phospholipid, einem Lipid, einem Öl und Gemischen davon emulgiert, wobei das Öl eine adäquate Mischung von mehrfach ungesättigten und gesättigten Fettsäuren enthält. Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Sojabohnenöl, Canolaraps-Öl, Palmöl, Olivenöl und Myglyol, wobei die Zahl an Fettsäure-Kohlenstoffatomen zwischen 12 und 22 liegt und wobei die Fettsäuren gesättigt oder ungesättigt sein können. Optional kann ein geladenes Lipid oder Phospholipid im neutralen Öl suspendiert werden. Zum Beispiel wird DNase-freies Phosphatidylcholin zu DNase-freiem Triglycerid-Sojabohnenöl in einem Verhältnis von 1 Gramm Phospholipid auf 20 ml Triglycerid gegeben und durch leichtes Erhitzen auf 50° bis 60°C aufgelöst. Mehrere Gramm MCC werden in einen trocken autoklavierten Behälter gegeben und die Phospholipid-Triglycerid Lösung zu einer Konzentration von 20 ml pro Gramm MCC zugefügt. Die Suspension wird für 60 Minuten bei 20°C inkubiert und anschließend mit DNase-freiem PBS in einem Verhältnis von 20 ml MCC Suspension pro Liter PBS gemischt. Das Gemisch wird durch Ultraschallbehandlung bei 20% Leistung für 5 Minuten (Modell W-385 Ultraschallgerät, Heat Systems-Ultrasonics Inc) emulgiert. Optional wird das emulgierte MCC-Gemisch homogenisiert, indem es bei 15.000–30.000 psi für einmaliges Durchfluten (Model M-110Y; Microfluidics, Newton, MA) in eine unter-mikrometer feine Emulsion („Mikrofluid") verwandelt wird. Das MCC-Gemisch wird in eine autoklavierte, gedeckelte Flasche überführt, für eine Lagerung bei 4°C. Die Größe der MCC Partikel sollte optimal für die Wahrnehmung und Aufnahme durch die ansprechenden Zellen sein. Vorzugsweise liegt der mittlere Durchmesser der MCC-Partikel zwischen etwa 10 und etwa 10.000 nm, bevorzugter zwischen etwa 100 und etwa 1000 nm und am bevorzugtesten zwischen etwa 250 und etwa 600 nm.
Der M-DNA-Gehalt der MCC ist vorzugsweise zwischen etwa 0,001 und etwa 90 mg/100 mg trockenen MCCs, bevorzugter zwischen etwa 0,01 und etwa 40 mg/100 mg trockenen MCCs und am bevorzugtesten zwischen etwa 0,1 und etwa 30 mg/100 mg trockenen MCCs. Des Weiteren ist es vorzuziehen, dass der Proteingehalt unter etwa 2 mg/100 mg trockenen MCCs liegt und das der Fettsäuregehalt unter etwa 2 mg/100 mg trockenen MCCs liegt. Unerwarteterweise fanden wir, dass mindestens etwa 3,6% des Trockengewichts von MCC extrahierbare M-DNA ist.
MCC sind in einer Menge zu verabreichen, die darin wirksam ist, eine therapeutische Wirkung in ansprechenden Zellen der Harnblase zu induzieren. Die Dosierung der verabreichten MCC vom zu behandelnden Zustand abhängen, der jeweiligen Rezeptur und anderen klinischen Faktoren wie etwa dem Gewicht und den Zustand des Empfängers sowie des Applikationsweges. Vorzugsweise ist die applizierte Menge von etwa 0,00001 bis etwa 100 mg/kg pro Dosis, bevorzugter von etwa 0,0001 bis etwa 50 mg/kg pro Dosis und am bevorzugtesten von etwa 0,001 bis etwa 10 mg/kg pro Dosis.
Applikationswege schließen oral, intravenös, intraläsional, intra-tumoral und intravesikal, sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise sind MCC per Instillation in die Harnblase zu applizieren, durch, jedoch nicht beschränkt auf, einen Harnwegskatheter. Andere Methoden, um MCC in die Harnblase zu instillieren, sind dem Fachmann bekannt.
Je nach Applikationsweg ist das Volumen pro Dosis vorzugsweise etwa 0,001 bis etwa 100 ml, bevorzugter etwa 0,01 bis etwa 70 ml, und am bevorzugtesten etwa 0,1 bis etwa 40 ml. MCC kann als Einmaldosis-Behandlung oder als Mehrfachdosis-Behandlung nach einem Zeitplan und über eine Zeitspanne verabreicht werden, die angemessen ist hinsichtlich der Behandlung der Krankheit, dem Zustand des Behandelten und dem Applikationsweg.
Wenn in die Harnblase verabreicht, sollte die Dosis, je nach dem applizierten Volumen, in der Harnblase für vorzugsweise etwa 1 min bis etwa 8 h, bevorzugter von etwa 15 min bis etwa 4 h und am bevorzugtesten von etwa 30 min bis etwa 2 h verbleiben.
Die folgenden Beispiele werden der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen, ohne diese jedoch gleichzeitig in irgendeiner Weise einzugrenzen. Im Gegenteil, es sollte klar verstanden sein, dass auf mancherlei andere Ausführungsbeispiele, Abwandlungen und Entsprechungen zurückgegriffen werden kann, die sich nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung dem Fachmann anbieten, ohne vom Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen. Die nachfolgenden Beispiele, die M-DNA, MCC-DNA und BBC beschreiben, sind für Vergleichszwecke aufgeführt.
Beispiel 1
Präparation von MCC aus Mycobakterium phlei und Reinigung von M-DNA aus MCC und aus M. phlei
MCC wurde aus Mycobakterium phlei (M. phlei) (Stamm 110) präpariert, M-DNA wurde aus MCC (MCC-DNA) gereinigt und M-DNA wurde aus M. phlei (M. phlei-DNA) gereinigt wie in Anmeldung PCT/CA98/0074 beschrieben. Alle Reagenzien wurden ausgewählt um die Bewahrung der DNA zu fördern. Falls nicht anders angegeben, wurden MCC, MCC-DNA und M. phlei-DNA in DNAse-freiem Wasser oder in einem pharmazeutisch zulässigem DNAse-freien Puffer resuspendiert und durch Ultraschall emulgiert. MCC, MCC-DNA und M. phlei-DNA enthielten keine Endotoxine, wie mit Hilfe eines Limulus-Amöbenzellenlysat-QCL-1000-Kits (Bio Whittaker, Walkersville, MD) ermittelt.
Beispiel 2
Präparation von Bakterien-DNA-Bakterienzellwand-Komplexen und von Bakterien-DNA aus anderen Bakterienarten
Bakterien-DNA-Bakterienzellwand-Komplexe (BCC) und Bakterien-DNA (B-DNA) wurden aus M. smegmatis, M. fortuitous, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Cornybacterium parvum, M. kansaasii, M. tuberculosis und M. bovis wie in Beispiel 1 präpariert.
Beispiel 3
DNase-Behandlung
MCC-DNA und MCC, die jeweils 1 μg an M-DNA enthielten, und Regressin^® (US Patent Nr. 4 744 984) wurden mit 1 internationalen Einheit (international unit, IU) RNase-freier DNase I (Life Technologies) für 1 h bei 25°C in 20 mM Tris HCl, pH 8.4, 2 mM MgCl₂ und 50 mM KCl verdaut. DNase I wurde durch das Zufügen von EDTA zu einer Endkonzentration von 2,5 mM und Erhitzen für 10 min bei 65°C inaktiviert.
Beispiel 4
Zellen und Reagenzien
HT-1197 und HT-1376 Harnblasenkrebszellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und wurden in MEM kultiviert, welches um nicht-essentielle Aminosäuren und Vitamine ergänzt worden war und 10% FCS (MEM-FCS) enthielt (Gibco Life Science). HT-1197 sind anaplastische vorübergehende Harnblasenkrebszellen 4. Grades, die von Zellen eines männlichen Patienten abstammen. HT-1197 Zellen sind empfindlich gegenüber chemotherapeutischen Mitteln wie, aber nicht begrenzt auf, Doxorubicin. HT-1376 sind sind anaplastische vorübergehende Harnblasenkrebszellen 3. Grades, die von Zellen eines weiblichen Patienten abstammen. HT-1376 Zellen sind p53/p21 abnorm und resistent gegen chemotherapeutische Mittel wie, aber nicht begrenzt auf, Cisplatin und Mitomycin. B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 und HL-60MX-1 Zellen wurden von ATCC bezogen und in den von ATCC empfohlenen Medien kultiviert. Falls nicht anders angegeben, wurden Zellen in Zellkulturplatten mit 6 flachen Vertiefungen bei Konzentrationen zwischen 3 × 10⁵ und 10⁶ Zellen/ml ausgesäht und bei 37°C in einer 5% CO₂ Atmosphäre gehalten.
Kalbsthymus-DNA, Heringsperma-DNA und Lipopolysaccharid aus Escherichia coli (LPS) wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Rekombinantes humanes IL-12 (hIL-12) wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen.
Beispiel 5
Inhibition der Zellproliferation
Die Zellproliferation wurde mittels Dimethylthiazol-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reduktion bestimmt (Mosman et al. Journal of Immunological Methods 65: 55–63, 1983).
HT-1376, HT-1197, B-16 F1, THP-1, RAW 264.7, HL-60 und HL-60MX-1 Zellen wurden für 24 h mit zwischen 0 und 10 μg/ml an MCC, M. phlei-DNA, MCC-DNA, Heringsperma-DNA und Kalbsthymus-DNA inkubiert. MCC (1), M. phlei-DNA (2A) und MCC-DNA (2B) inhibierten die Proliferation dosisabhängig. Heringsperma-DNA (2A & 2B) und Kalbsthymus-DNA (2A & 2B) inhibierten die Proliferation nicht. HT-1197 (3A) und HT-1376 (3B)-Zellen wurden ebenfalls für 24 h mit zwischen 0 und 100 μg/ml an MCC und LPS inkubiert. MCC inhibierte die Proliferation dosisabhängig, während LPS die Proliferation nicht inhibierte (3A & 3B).
MCC und M-DNA inhibieren die Proliferation von HT-1197 und von p53/p21 abnormen, Arzneimittel-resistenten HT-1376 Harnblasenkrebszellen. Des Weiteren ist eine Inhibition der Zellproliferation nicht allen DNAs gemein (Heringsperma-DNA und Kalbsthymus-DNA) und ist nicht auf eine unspezifische Immunstimulation zurückzuführen (LPS).
Beispiel 6
Induktion der Apoptose, durch DNA-Fragmentierung indiziert
Charakteristisch für Zellen, die die Apoptose durchlaufen, ist eine Fragmentierung zellulärer DNA in Fragmente von Nucleosomen-Größe (Newell et al., Nature 357: 286–289, 1990). Um die DNA-Fragmentierung abzuschätzen, wurden nicht-adhärente Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für 10 min gewonnen. Sedimente nicht-adhärenter Zellen und die verbleibenden adhärenten Zellen wurden mit 0,5 ml eines hypotonen Puffers (10 mM Tris-Puffer, 1 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, pH 7,5) lysiert. Die Lysate wurden bei 13.000 g für 10 min zentrifugiert und die Überstände, die die fragmentierte DNA enthielten, wurden über Nacht bei –20°C in 50% Isopropanol und 0,5 M NaCl präzipitiert. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation gewonnen und mittels Elektrophorese in 0,7% Agarosegelen für 3 h bei 100 V analysiert.
HT-1197 und HT-1376 Harnblasenkrebszellen wurden für 48 h mit 1 μg/ml MCC oder mit 1 ng/ml hIL-12 inkubiert (4). MCC induzierte eine signifikante DNA-Fragmentierung in nicht-adhärenten HT-1197 (4A, Spur 2) und HT-1376-Zellen (4B, Spur 2), nicht jedoch in adhärenten HT-1197 (4A, Spur 3) und HT-1376-Zellen (4B, Spur 3). PBS (4A & 4B, Spur 5), hIL-12 (4A & 4B, Spur 4) und mit Dnase I behandelte MCC (4A & 4B, Spur 7) induzierten in nicht-adhärenten HT-1197- oder HT-1376-Zellen keine DNA-Fragmentierung. Unbehandelte Zellen (4A & 4B, Spur 1) wiesen keine DNA-Fragmentierung auf. Eine 123-Bp-DNA-Leiter (Gibco Life Sciences) wurde verwendet, um das Molekulargewicht der DNA-Fragmente von Nucleosomen-Größe zu bestimmen (4A & 4B, Spur L).
MCC induziert die Apoptose in HT-1197 und HT-1376-Harnblasenkrebszellen, während mit DNase I behandletes MCC nicht die Apoptose in diesen Zellen induziert. Dies legt nahe, dass eine intakte Oligonukleotid-Struktur der M-DNA für die Induktion der Apoptose notwendig ist. hIL-12 induziert in HT-1197- oder in HT-1376-Zellen nicht die Apoptose.
Beispiel 7
Induktion der Apoptose, durch Solubilisierung des nuklearen Mitoseproteinapparates (NuMA) indiziert
Auffallende morphologische Veränderungen im Zellkern, die durch eine Solubilisierung and Freisetzung des NuMA ausgelöst werden, sind charakteristisch für die Apoptose. Die Freisetzung von NuMA aus Zellen in Kultur wurde in Einheiten/ml (Englisch: units/ml, U/ml) mittels eines käulichen ELISA (Calbiochem, Cambridge, MA) bestimmt (Miller et al., Biotechniques 15: 1042–1047, 1993).
HT-1197- und HT-1376-Harnblasenkrebszellen, die für 48 h mit 0 bis 100 μg/ml an MCC inkubiert worden waren, setzten NuMA in einer dosisabhängigen Weise frei (5). HT-1197-(6A) und HT-1376-Zellen (6B), die für 48 h mit 1 μg/ml oder mit 100 μg/ml an MCC inkubiert worden waren, zeigten mit MCC eine signifikant höhere Freisetzung von NuMA als mit MCC-DNA (7).
Die Induktion der Apoptose in HT-1197- und in HT-1376-Harnblasenkrebszellen durch MCC ist sowohl zeit- als auch dosisabhängig. Ohne die Absicht, sich auf die folgende Hypothese festlegen zu wollen, wird angenommen, dass sowohl die Oligonukleotidstruktur der M-DNA als auch die Präsentation der M-DNA auf der M. phlei-Zellwand von Bedeutung für die optimale Induktion der Apoptose sind.
Beispiel 8
MCC-Zytotoxizität
Zellzytotoxizität ist durch den Verlust der Integrität der Plasmamembran und den Verlust zytoplasmatischer Enzyme wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, LDH charakterisiert (Phillips et al., Vaccine 14: 898–904).
Um die Zytotoxizität von MCC abzuschätzen, wurden HT-1197- und in HT-1376-humane Harnblasenkrebszellen für 48 h mit von 0 bis 100 μg/ml an MCC, oder als eine Kontrolle für eine vollständige LDH-Freisetzung mit Lysispuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, pH 7,5) inkubiert (Filion et al., Biochim. Biophys. Acta 1329: 345–356, 1997). LDH wurde mittels eines käuflichen Assays (Sigma-Aldrich) bestimmt. Dass MCC nicht zytotoxisch war (8) zeigt, dass MCC direkt auf HT-1197- und HT-1376-Harnblasenkrebszellen einwirkt, um die Proliferation zu inhibieren und die Apoptose zu induzieren.
Beispiel 9
Behandlung humanen Harnblasenkrebses in nu/nu-Mäusen mit MCC und MCC-DNA
Humaner Harnblasenkrebs (HT-1197) ist als ein ektopischer fester Tumor in den subkutanen Geweben immundefizienter athymischer Nacktmäuse (nu/nu-Mäuse) etabliert und die Mäuse werden in 5 Gruppen unterteilt. Gruppe 1 erhält ausschliesslich das Vehikel. Gruppe 2 erhält MCC. Gruppe 3 erhält MCC, das mit DNase I behandelt wurde. Gruppe 4 erhält MCC-DNA. Gruppe 5 erhält MCC-DNA, die mit DNase I behandelt wurde. Die Krebsmasse wird vor der Behandlung sowie wöchentlich während 4 Wochen Behandlung gemessen. Mäuse der Gruppe 2 und der Gruppe 4 zeigen einen Rückgang der Krebsmasse. Mäuse der Gruppen 1,3 und 5 zeigen keinen Rückgang der Krebsmasse.
Beispiel 10
Behandlung humanen Harnblasenkrebses mit MCC
Zehn Patienten mit orthotopem Harnblasenkrebs im dritten Stadium werden in zwei Gruppen unterteilt. Gruppe 1 erhält für 8 Wochen wöchentlich eine intravesikale Instillation von MCC. Gruppe 2 erhält eine übliche Chemotherapie. Patienten der Gruppe 1 zeigen eine signifikante Verringerrung des Harnblasenkrebses und berichten von keinen entkräftenden Nebenwirkungen. Patienten der Gruppe 2 zeigen eine minimale Verringerrung des Harnblasenkrebses und berichten von deutlichen entkräftenden Nebenwirkungen.
Beispiel 11
Stabilität von MCC
MCC wurde zu 1 mg/ml in Form einer sterilen Suspension in 0,85% w/v NaCl im Dunkeln bei 4°C für 6 Monate gelagert. Der mittlere Partikeldurchmesser wurde mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (N4 Plus, Coulter Electronics Inc.) bestimmt. Die MCC-Suspension wurde mit 0,85% w/v NaCl auf eine Partikelzählrate zwischen 5 × 10⁴ und 10⁶ Zählungen/sec verdünnt. Der durchschnittliche Partikeldurchmesser wurde im Grössenverteilungsmodus (size distribution mode, SDP) unter den folgenden Bedingungen berechnet: Fluidrefraktionsindex 1,33, Temperatur 20°C, Viskosität 0,93 Centipoise, Messwinkel 90,0, Probenzeit 10,5 μs und Probenlaufzeit 100 sec. Das Potential, die elektrische Ladung an der hydrodynamischen Grenzfläche zwischen den Partikeln und der Hauptmasse des Lösungsmittels, wurde unter den folgenden Bedingungen in einem Dels 440SX (Coulter Electronics Inc.) gemessen: Strom 0,7 mA, Frequenzbereich 500 Hz, Temperatur 20°C, Fluidrefraktionsindex 1,33, Viskosität 0,93 Centipoise, Dielektrizitätskonstante 78,3, Leitfähigkeit 16,7 ms/cm, Einschaltdauer 2,5 sec, Abschaltdauer 0,5 sec und Probenlaufzeit 60 sec.
Wie in 9 gezeigt, blieben MCC-Ladung und MCC-Durchmesser während 6 Monaten der Lagerung relativ unverändert. Darüber hinaus blieben die MCC-Stimulation der IL-12 Produktion und die Induktion der Apoptose in THP-1-Monocyten während 6 Monaten der Lagerung unverändert.
Es sollte selbstverständlich berücksichtigt werden, dass das Vorangehende sich nur auf eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht und dass zahlreiche Modifikationen oder Veränderungen daran vorgenommen werden können, ohne dass vom Umfang der Erfindung abgewichen wird, wie er in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist.

Claims

Verwendung von von Proteinen befreiter, von Lipiden befreiter Mycobakterium phlei Zellwand (MCC) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harnblasenkrebs in einem Tier, einschließlich eines Menschen, mit Harnblasenkrebs.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die MCC eine Reaktion in Harnblasenkrebszellen induziert, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus der Hemmung der Proliferation von Harnblasenkrebszellen und der Induktion der Apoptose in Harnblasenkrebszellen besteht.
Verwendung nach Anspruch 2, worin die Harnblasenkrebszellen Arzneimittel-resistent oder p53/21 abnorm sind.