WO2003039444A2 - Topikale verwendung von cytokinen und/oder chemokinen zur behandlung von viralen oder mykotischen hauterkrankungen oder tumorerkrankungen - Google Patents

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Definitions

  • Topical use of cytokines and chemokines for the treatment of viral or mycotic skin diseases or tumors Topical use of cytokines and chemokines for the treatment of viral or mycotic skin diseases or tumors
  • the present invention relates to the topical use of at least one cytokine and / or chemokine for the treatment of viral and / or mycotic skin diseases and / or tumoral diseases as well as a topical drug formulation and its preparation.
  • GM-CSF The cytokine granulocyte-macrophage stimulating factor (GM-CSF) was originally isolated as a factor that stimulated the growth of macrophages or granulocyte-containing colonies.
  • GM-CSF is necessary for the growth and development of the progenitor cells of granulocytes and macrophages. It stimulates myeloblasts and monoblasts and initiates irreversible differentiation of these cells. It supports erythropoietin (EPO) in the proliferation of progenitor cells of erythrocytes and megakaryocytes.
  • EPO erythropoietin
  • GM-CSF is able to attract neutrophils. It enhances antimicrobial activities, oxidative metabolism and phagocytotic activity of neutrophils and macrophages.
  • GM-CSF is produced by cells (T lymphocytes, tissue macrophages, endothelial cells, mast cells) that are present at sites of inflammatory responses, it is believed that GM-CSF is an important mediator of inflammatory responses. Likewise, the function of Langerhans cells of the skin is influenced by GM-CSF. These cells are unable to trigger a primary immune response. However, together with IL4 they are converted by GM-CSF into highly efficient immunostimulatory dendritic cells.
  • GM-CSF works synergistically with other cytokines, including the interleukins IL1, IL3, IL4, and granulocyte-stimulating factor (G-CSF).
  • GM-CSF is used for the physiological reconstitution of hematopoiesis for all diseases associated with insufficient maturation of blood cells or reduced production of leukocytes. Probably the most significant clinical application is GM-CSF in the treatment of life-threatening neutropenia after chemo- and / or radiotherapy. GM-CSF can also be used to treat chemotherapy-induced cytopenias and cytopenia-dependent predispositions to infectious diseases and hemorrhages. In such cases, GM-CSF is usually administered at a dosage of 5 to 10 ⁇ g / kg / day, either by 4 to 6 hours of intravenous infusion or by subcutaneous injection.
  • GM-CSF is used in the reconstitution of the hematopoietic system following autologous or allogeneic bone marrow transplantation.
  • the therapeutic effect is based not only on a shortening of the period of absolute neutropenia, but also on significantly fewer infections, low intravenous administration of antibiotics and a shorter hospitalization of patients.
  • Cytokines such as GM-CSF or IL2, IL12, IL18, as well as the IFN ⁇ and IFN ⁇ interferons are currently being used in various indications in the field of tumors. used or tested.
  • GM-CSF is used variously to stimulate the immune system in combination with antigens, for example in the form of a GM-CSF-expressing tumor cell or in the form of a prior or simultaneous administration of peptidic antigens, eg derived from tumor antigens.
  • GM-CSF acts as a kind of adjuvant for a parallel administered antigen (Lawson D, Kirkwood JM (2000) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: another cytokine with adjuvant therapeutic benefit in melanoma J Clin Oncol 18 (8): 1603-5).
  • cytokines and / or chemokines such as GM-CSF
  • GM-CSF chemokines
  • the present invention thus relates to the use of at least one cytokine and / or chemokine for the preparation of a topical medicament for the treatment of viral and / or mycotic skin diseases and / or tumor diseases.
  • cytokines and / or chemokines Due to the observed synergistic effects between different cytokines and / or chemokines, it is particularly advantageous if two, three or more than three cytokines and / or chemokines are processed simultaneously or staggered in time, in particular three, especially two cytokines and / or chemokines are used.
  • Particularly preferred combinations are GM-CSF, RANTES or MlPl ⁇ with IL4, IL2, IL12; IFN ⁇ or TNF ⁇ .
  • the drug does not contain substantially antigenic components, such as tumor antigens or viral antigens.
  • Antigens or parts thereof which can trigger an immune response in the patient are understood to be antigen-acting constituents.
  • substantially no antigen-acting constituents means components which have little effect on the antigen so that an immune reaction of the patient endangering the treatment can generally be ruled out.
  • cytokine is a generic term for a large group of soluble proteins and peptides that act as humoral regulators, preferably in nano- to picomolar concentrations that modulate the functional activities of individual cells or tissues under normal or pathological conditions Direct interactions between cells and regulate processes that preferentially occur in the extracellular environment.
  • cytokines are a subset of cytokines. They are smaller proteins that i.a. act chemotactically on cells.
  • cytokines includes, for example, GM-CSF, G-CSF, LU, IL2, IL3, L4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, LL10, LL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 , IL19, IL20, IL21, IL22, IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , Flt3 L, Flt3 and TNF ⁇ .
  • a particularly preferred cytokine is GM-CSF.
  • chemokines includes, for example, RANTES, MlPl ⁇ , MlPl ⁇ , MlPl ⁇ , MlPl ⁇ , MIP2, MIP2 ⁇ , MIP2 ⁇ , MIP3 ⁇ , MIP3 ⁇ , MIP4, MIP5, MCP1, MCPl ⁇ , MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, ⁇ cykine, Dcckl and DCDF.
  • Particularly preferred chemokines are GM-CSF, RANTES and MlPl ⁇ .
  • cytokines and chemokines cytokines Online Pathfinder Encyclopedia, Horst Ibelgaufts's Hypertext Information Universe of Cytokines, Version 4.0, August 1999; Website: http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi). Furthermore, in the context of this invention, mutated variants of these cytokines and chemokines as well as fusion proteins of these cytokines and chemokines are understood.
  • tags for example His tag, GST tag, Myc tag, GFP tag, or fusions with functional domains of other polypeptides, for example with Domains of immunoglobulins, other cytokines or chemokines.
  • Topical application is understood as the external application of the active ingredient to the skin.
  • the active ingredient is in the form of an ointment, gel, patch or other skin-friendly formulation.
  • the active ingredient is applied locally in the area in which a skin change and / or disease is present.
  • Viral skin diseases are understood to mean skin diseases which are triggered or caused by viruses and / or associated with viral infections. These include, for example, skin diseases such as skin warts, genital warts, anogenital warts or mucosal warts (see Table 1), of at least one papilloma virus, in particular human papilloma virus, such as HPV1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 , 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 34, 36, 37 , 38, 46, 47, 48, 49, 50, 56 and 58 are triggered.
  • skin diseases such as skin warts, genital warts, anogenital warts or mucosal warts (see Table 1)
  • skin diseases such as skin warts, genital warts, anogenital warts or mucosal warts (see Table 1)
  • papilloma virus in particular human papilloma virus, such as HPV1, 2, 3, 4,
  • herpes virus in particular by herpes simplex virus 1, herpes simplex virus 2, human herpes virus (HHV) 1, HHV2, HHV3, HHV4, HHV7, HHV8 and varicella zoster, ie cold sores, Kaposi -Sarcom, chickenpox and / or shingles, are triggered.
  • herpes simplex virus 1 herpes simplex virus 2
  • human herpes virus (HHV) 1 HHV2
  • HHV3, HHV4, HHV7, HHV8 varicella zoster
  • Tumors that can be treated by topical application of, for example, GM-CSF are tumors of the skin, such as melanoma or acute keratosis, neoplasias of the genital and anal tract, such as cervical intraepithelial neoplasia, anal intraepithelial neoplasia, or penile intraepithelial neoplasia (see also US Pat Table 2).
  • Table 2 Table 2
  • Mycotic skin diseases are understood as skin diseases caused by fungal infections. These include diseases of the skin, the appendages as well as the mucous membranes including the external and internal genitals. These are mainly dermatomycoses (see Table 3) and other mycoses that can cause mycotic skin diseases (see Table 4 and Table 5).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is generally prepared by contacting at least one cytokine and / or chemokine with at least one suitable additive and / or adjuvant, for example by mixing or dissolving.
  • the present invention therefore also relates to a process for the preparation of a topically acting drug in which at least one cytokine and / or chemokine is brought into contact with at least one adjuvant, in particular with human serum albumin, CpG or oxidized glutathione.
  • the cytokine and / or chemokine is preferably produced by genetic engineering according to methods known to those skilled in the art.
  • a corresponding expression construct can be used for the genetic engineering of the cytokine and / or chemokine, comprising a nucleic acid coding for the cytokine and / or chemokine and a suitable promoter for expression in preferably bacteria, for example E. coli, or in eukaryotic cells , such as in yeasts, for example S. cerevisiae or S. pombe or Pichia pastoris, or in higher eukaryotic cells, for example in insect cells or human cells. Then that can Cytokine and / or chemokine are purified under native or non-native condition by methods known to those skilled in the art.
  • the preparation of medicaments containing at least one cytokine and / or chemokine or their use in the use according to the invention sselg is carried out in the usual manner by means of common pharmaceutical-technological process.
  • the active ingredients are preferably processed together with suitable, pharmaceutically acceptable excipients and carriers to the drug forms suitable for the various indications and application sites.
  • the medicaments can be prepared in such a way that the respectively desired release rate, e.g. a rapid flooding and / or a sustained release or depot effect is achieved.
  • Conventional emulsions, gels, ointments, creams of the mixed-phase or amphiphilic emulsion systems (oil / water-water / oil mixed phase) and liposomes and transferosomes or patches, preferably ointments, can be used for conventional application on the skin or mucosa and creams, more preferably an ointment.
  • the active ingredient is applied locally in the area in which there is a skin or mucosal change and / or disease.
  • Pastes, powders or solutions can also be prepared as further topically applicable forms.
  • the pastes often contain hydrophobic and hydrophilic adjuvants as consistency-providing bases, but preferably hydrophobic adjuvants having a very high solids content.
  • the powders or topically applicable powders can be used to increase the dispersity as well as the flowability and lubricity as well as to prevent agglomerates, for example starches, such as wheat or rice starch, flame-dispersed silica or silica, which also serve as diluents.
  • genital, vaginal or rectal in particular genital and vaginally administrable emulsions, creams, ointments, foam tablets or suppositories. It is also possible to provide rectal capsules based on gelatin or other carriers. Suitable suppository bases are, for example, hard fats, such as, for example, Witepsol®, Massa Estarium®, Novavata®, coconut fat, glycerol / gelatine compositions, glycerol / soap gels and polyethylene glycols.
  • the respectively suitable dosage forms can be prepared in accordance with recipe formulas and procedures based on pharmaceutical-physical principles known to the person skilled in the art.
  • Suitable excipients or carriers are, for example, sodium alginate as gelling agent for the preparation of a suitable base or cellulose derivatives, for example guar or xanthan gum, inorganic gelling agents, for example aluminum hydroxides or bentonites (so-called thixotropic gelling agents), polyacrylic acid derivatives, for example Carbopol®, polyvinylpyrrolidone , microcrystalline cellulose or carboxymethylcellulose. Also suitable are amphiphilic lower and higher molecular weight compounds and phospholipids.
  • the gels can be present either as hydrogels based on water or as hydrophobic organogels, for example based on mixtures of low and high molecular weight paraffin hydrocarbons and vaseline.
  • the hydrophilic organogels can be prepared, for example, based on high molecular weight polyethylene glycols. These gel-like shapes are washable. However, among the organogels, the hydrophobic organogels are preferred. Particularly preferred are hydrophobic excipients and additives such as petrolatum, wax, oleyl alcohol, propylene glycol monostearate and propylene glycol monopalmitostearate. Furthermore, dyes can For example, be added yellow and / or red iron oxide and / or titanium dioxide for color matching.
  • emulsifiers are anionic, cationic or neutral surfactants, for example alkali soaps, metal soaps, amine soaps, sulfurized and sulfonated compounds, invert soaps, high fatty alcohols, partial fatty acid esters of sorbitan and polyoxyethylene sorbitan, e.g. Lanette types, wool wax, lanolin or other synthetic products for the preparation of the oil / water and / or water / oil emulsions.
  • Suitable excipients are also, for example, ionic or anionic detergents, e.g. Triton-X-100, Tween, sodium desoxycholate, but also polyols, e.g.
  • Polyethylene glycol or glycerine Sugar, e.g. Sucrose or glucose, lipopolysaccharides, zwitterionic compounds, e.g. Amino acids such as glycine or especially taurine or betaine, or lipids.
  • buffers for example hydrochloric acid, citric acid, sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution, sodium bicarbonate, and also buffer systems, for example citrate, phosphate buffer, tris Buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane, HEPES buffer ([4- (2-hydroxyethyl) -piperazino] ethanesulfonic acid), MOPS buffer (3-morpholino-l propanesulfonic acid) or triethanolamine.
  • Buffer tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • HEPES buffer [4- (2-hydroxyethyl) -piperazino] ethanesulfonic acid
  • MOPS buffer 3-morpholino-l propanesulfonic acid
  • Preservatives such as, for example, methyl or propyl benzoate (parabens), sorbic acid, proteins, e.g. bo- vines, human or synthetic serum albumin, and / or protease inhibitors, e.g. Aprotinin, ⁇ -aminocarponic acid, pepstatin A, EDTA or EGTA, be added.
  • proteins e.g. bo- vines, human or synthetic serum albumin
  • protease inhibitors e.g. Aprotinin, ⁇ -aminocarponic acid, pepstatin A, EDTA or EGTA
  • hydrophobic esters such as isopropyl laureate, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, isopropyl stearate, ethyl myristate, propyl myristate, butyl myristate and / or ethyl oleate, in particular isopropyl myristate.
  • hydrophobic is understood to mean a compound whose solubility in water is at most about 0.2 mg / ml, in particular a maximum of about 0.1 mg / ml.
  • Suitable adjuvants are adjuvants that enhance the immunogenic (sensitizing) effect of an antigen.
  • the antigen against which an immunogenic effect is to be achieved is, in particular, a viral, mycotic and / or tumor-specific antigen which is expressed in the skin at the site of the disease.
  • Suitable adjuvants are, in particular, adjuvants which bring about activation of toll-like receptors, for example adjuvants such as CpG oligonucleotides (Chen Y et al. (2001) Int Immunol 13, 1013-20), lipopolysaccharides (Alexander C and Rietschel ET (US Pat. 2001) J.
  • adjuvants are substances which cause local irritation of the skin, since this increases the effect of cytokines and / or chemokines. This includes, for example, DMSO.
  • the medicament according to the present invention may also be present as a formulation containing at least one cytokine and / or chemokine and a buffer or saline solution and / or an ointment base and optionally at least one suitable adjunct and / or adjuvant.
  • formulation is understood to mean a composition in the form of a solution or suspension of said cytokines and / or chemokines, which is an essentially homogeneous formulation in which no sedimentation of, even after prolonged storage at about 4 ° C Ingredients can be observed.
  • Particularly preferred is a formulation in which the or the contained ⁇ ) cytokine (s) and / or chemokine (s) remains native or active.
  • the activity of the proteins is detectable for each individual protein in a corresponding activity test.
  • the salt as an exemplary constituent of a formulation is generally an alkali metal or alkaline earth metal salt, preferably a halide or phosphate, in particular an alkali halide, especially NaCl and / or KCl.
  • a halide or phosphate in particular an alkali halide, especially NaCl and / or KCl.
  • NaCl is particularly preferred.
  • Preferred ointment bases are, for example, water-in-oil ointments, for example a wool wax alcohol ointment consisting of cetylstearyl alcohol, wool wax alcohol and petrolatum or oil-in-water ointments (hydrophilic ointments), for example consisting of emulsifying cetylstearyl alcohol, paraffin oil sublimidum and vaseline.
  • a previously described formulation in conjunction with an agent for occlusion, i. that after application of the formulation to the skin, mucosa and skin appendages, the treated area is covered.
  • an agent for occlusion i. that after application of the formulation to the skin, mucosa and skin appendages, the treated area is covered.
  • This can be done for example by a wound cover in the form of a patch or spray dressing.
  • another object of the present invention is a treatment kit containing at least one cytokine and / or chemokine and a Occlusionsmit- tel.
  • Fig. 1 shows the graphical evaluation of a skin penetration experiment of 3 GM-CSF formulations in a flow-through diffusion cell.
  • the distribution of the applied [ 125 I] -GM-CSF (in% of the total activity) in the receptor permeation, in the skin and in the ointment residues after 36 h is plotted against the formulation.
  • FIG. 2 shows the graphical evaluation of a stability experiment of formulations 43600 and 43400 compared to GM-CSF at time 0 and after incubation for 7 days at 40 ° C, in which a constant amount of DMSO salbene extract with increasing amounts of GM-CSF was added (X-axis, logarithmic in% for salbene extracts containing GM-CSF and in units / ml for added GM-CSF) and the activation of monocytes was measured at their CDlA expression (Y-axis).
  • FIG. 3 shows the graphical evaluation of a stability experiment of formulation 10101 at time 0 and after incubation for 7 days at 40 ° C., in which a constant amount of DMSO salve extract was mixed with increasing amounts of GM-CSF (X-axis, logarithmic in%) and the activation of monocytes at their CDla expression was measured (Y-axis).
  • DMSO dimethylsulfoxide in pure form
  • 125 I-labeled human GM-CSF (NEN Life Sciences, Cologne, Germany, 125 I-PACAP27, NEX294, lot number GCB1500) was calibrated. The specific activity at the beginning of the experiment was 5.2 ⁇ Ci (192.4 kBq). The protein was obtained in lyophilized form and distilled in 70 .mu.l. Recorded (uptake in 35 ⁇ l did not lead to a homogeneous solution). The resulting specific activity of the solution was 0.074 ⁇ Ci / ⁇ L (2.75 kBq / ⁇ L).
  • Approximately 260 mg of the three different GM-CSF formulations were transferred to a 48-well cell culture dish. 15 ⁇ l 125 I-labeled GM-CSF were added and mixed with the formulation at room temperature using a spatula. Between 3 and 5 mg of the mixture was transferred to a scintillation vial and 2 ml of Packard Microscint-20 were added. The samples were heated to 60 ° C for several minutes and mixed again. They were then measured in a scintillation counter (see Table 7). The mixed formulations were transferred to Eppendorf reaction vessels and stored at 4 ° C. As a control, 2 ⁇ l of the 125 I-GM-CSF solution (0.074 ⁇ Ci / ⁇ l, 2.75 kBq / ⁇ l) was measured immediately in 2 ml Packard Microscint-20.
  • Skin samples of female abdominal origin from cosmetic surgery were used. Skin slices (450 ⁇ m) were prepared by means of a dermatome containing the stratum corneum, the epidermis and part of the Dennis. Skin discs with a diameter of 10 mm were punched out and inserted in a diffusion cell. The pieces of skin were frozen between microscope slides at ⁇ -15 ° C. The thickness of the skin slices was measured between slide suspensions. Since membrane fabrication could be associated with damage to the skin, the integrity of the dermal membrane was microscopically checked before fitting into the diffusion cells.
  • the diffusion cell used was the diffusion cell from BSL BIOSERVICE, Planegg, Germany. It is designed with a PTFE donor and acceptor for flow diffusion for horizontal exposure of the skin surface. The area of skin exposure is 19.63 mm 2 . The temperature of the diffusion cells was kept constant. A multichannel peristaltic pump was connected to the receptor part of the diffusion cell and a programmable fraction collector was used to collect the samples.
  • the frozen skin was washed with PBS and placed on the acceptor portion.
  • the diffusion cell was closed with the receptor part and with degassing Acceptor fluid (physiological phosphate-buffered saline (RT, pH 7.5 ⁇ 0.3) supplemented with 0.1% BSA and 50 ⁇ g / ml gentamycin; degassed) equilibrated in horizontal position for at least 1 h (adjustment of flow rate and temperature to 0.6 ml / and 32 + 1 ° C).
  • a defined amount of the 125 I-labeled GM-CSF formulations mentioned under Example 1.2 was applied to the skin surface by means of a spatula.
  • the acceptor liquid collection was started for 36 with the receptacle changed every 6 hours.
  • the remaining ointment was wiped off the donor side with a cotton swab.
  • the skin membrane was again wiped with a cotton swab and all remaining non-penetrated ointment residues were collected in a scintillation vial.
  • Monocytes were isolated by known methods (see, eg, Current Protocols in Immunology, Editors Coligan JE et al., 1999, pp. 7.32.1-4). These were taken up in medium (RPMI-Gibco, Paisley, Scotland - with 5% FCS), so that a concentration of 175,000-220000 cells per 500 ⁇ l was present. Concentrate human recombinant IL4 twice concentrated (Pharmingen, Heidelberg, Germany) (final conc. 500 units / ml). The extracted ointment samples were equilibrieted to RT, mixed thoroughly by vortexing after 30 min and briefly centrifuged off.
  • the monocyte suspension were added to each well.
  • the plates were incubated for 7 days at 37 ° C, the cells harvested and stained with mouse anti-human CDla (1:50, Pharmingen, Heidelberg, Germany) and anti mouse IgG FITC (3/50, Sigma, Deisenhofen, Germany) , Finally, the cells were analyzed in a FACS (FACS Calibur, Beckton Dickenson, Hamburg, Germany) for their CDla immunostaining.
  • the positive control used was a mixture of 500 ⁇ l of medium with 2.5 ⁇ l of human recombinant GM-CSF, as a negative control without GM-CSF.

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Abstract

Ein Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung mindestens eines Cytokines und/oder Chemokines zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen.

Description

Topikale Verwendung von Cytokinen und Chemokinen zur Behandlung von viralen oder mykotischen Hauterkrankungen oder Tumorerkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die topikale Verwendung mindestens eines Cytokins und/oder Chemokins zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen sowie eine topikal wirkende Arzneimittelformulierung und ihre Herstellung.
Das Cytokin Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor (GM-CSF) wurde ursprünglich als Faktor isoliert, der das Wachstum von Makrophagen bzw. Gra- nulozyten-enthaltenden Kolonien stimulierte. GM-CSF ist notwendig für das Wachstum und die Entwicklung von der Vorläuferzellen von Granulozyten und Makrophagen. Es stimuliert Myeloblasten und Monoblasten und initiiert die irre- versible Differenzierung dieser Zellen. Es unterstützt Erythropoietin (EPO) bei der Proliferation von Vorläuferzellen der Erythozyten und Megakaryozyten. Ferner ist GM-CSF in der Lage, Neutrophile anzulocken. Es verstärkt antimikrobielle Aktivitäten, oxidativen Metabolismus und phagozytotische Aktivität von Neutro- philen und Makrophagen. Es verstärkt ebenso die Zytotoxizität dieser Zellen. Da GM-CSF durch Zellen (T-Lymphozyten, Makrophagen im Gewebe, endotheliale Zellen, Mastzellen) produziert wird, die an Orten von entzündlichen Reaktionen präsent sind, ist davon auszugehen, dass GM-CSF ein wichtiger Mediator von entzündlichen Reaktionen ist. Ebenso ist die Funktion der Langerhans-Zellen der Haut durch GM-CSF beein- flusst. Diese Zellen sind nicht in der Lage, eine primäre Immunreaktion auszulösen. Gemeinsam mit IL4 werden sie jedoch durch GM-CSF in hochwirksame im- munstimulatorische dendritische Zellen umgewandelt.
GM-CSF wirkt synergistisch mit anderen Cytokinen, einschließlich den Interleu- kinen IL1, IL3, IL4 und Granulozyten-stimulierender Faktor (G-CSF).
Klinisch wird GM-CSF eingesetzt zur physiologischen Rekonstituion der Häma- topoese für alle Krankheiten die einhergehen mit einer unzureichenden Reifung von Blutzellen oder mit einer verringerten Produktion von Leukozyten. Die wohl bedeutendste klinische Anwendung findet GM-CSF bei der Behandlung der lebensbedrohlichen Neutropenie nach Chemo- und/oder Strahlentherapie. GM-CSF kann ebenfalls eingesetzt werden, um Chemotherapie-induzierte Cytopenien und Cytopenie-abhängige Prädispositionen für Infektionserkrankungen und Hä- morrhagien zu behandeln. In solchen Fällen wird GM-CSF gewöhnlich in einer Dosierung von 5 bis 10 μg/kg/Tag entweder durch 4 bis 6-stündige intravenöse Infusion oder durch subkutane Injektion verabreicht.
Ferner wird GM-CSF bei zur Rekonstituierung des hämatopoetischen Systems nach autologen oder allogene Knochenmarkstransplantationen eingesetzt. Der therapeutische Effekt beruht hier nicht nur auf einer Verkürzung des Zeitraums einer absoluten Neutropenie, sondern ebenfalls auf signifikant weniger Infektionen, geringer intravenöser Antibiotika-Gabe und einer kürzen Hospitalisierung der Patienten.
Cytokine wie GM-CSF oder IL2, IL12, IL18, sowie die Interferone IFNγ und IFNα werden derzeit in verschiedenen Indikationen auf den Gebieten von Tumo- rerkrankungen eingesetzt bzw. getestet. So wird GM-CSF verschiedentlich zur Stimulation des Immunsystems in Kombination mit Antigenen verwendet, beispielsweise in Form einer GM-CSF-exprimierenden Tumorzelle oder in Form einer vorherigen oder gleichzeitigen Gabe von peptidischen Antigenen, z.B. von Tumorantigenen abgeleitet sind. Diesen Therapieformen liegt zugrunde, dass GM- CSF als eine Art Adjuvans für ein parallel verabreichtes Antigen fungiert (La- wson D, Kirkwood JM (2000) Granulocyte-macrophage colony-stimulating fac- tor: another cytokine with adjuvant therapeutic benefit in melanoma J Clin Oncol 18(8):1603-5).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es folglich, weitere Anwendungen für Cytokine zu finden.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die topikale Anwendung von Cytokinen und/oder Chemokinen, wie beispielsweise GM-CSF, dazu geeignet ist, virale und/oder mykotische Hauterkrankungen sowie Tumorerkrankungen zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von mindestens einem Cytokin und/oder Chemokin zur Herstellung eines topikalen Arzneimittels zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen.
Aufgrund der beobachteten synergistischen Effekte zwischen unterschiedlichen Cytokinen und/oder Chemokinen ist es besonders vorteilhaft, wenn zwei, drei oder auch mehr als drei Cytokine und/oder Chemokine gleichzeitig oder zeitlich gestaffelt verarbeitet werden, wobei insbesondere drei, vor allem zwei Cytokine und/oder Chemokine verwendet werden. Besonders bevorzugte Kombinationen sind GM-CSF, RANTES oder MlPlα mit IL4, IL2, IL12; IFNγ oder TNFα.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Arzneimittel keine im wesentlichen antigen-wirkenden Bestandteile, wie zum Beispiel Tumorantigene oder virale Antigene. Als antigen-wirkende Bestandteile werden Antigene oder Teile davon verstanden, die im Patienten eine Immunantwort auslösen können. Unter dem Begriff "im wesentlichen keine antigen-wirkenden Bestandteile" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung so wenig antigenwirkende Be- standteile, dass eine die Behandlung gefährdende Immunreaktion des Patienten im allgemeinen ausgeschlossen werden kann.
Der Begriff „Cytokin" ist eine allgemeine Bezeichnung für eine große Gruppe löslicher Proteine und Peptide, die als humorale Regulatoren vorzugsweise in nano- bis picomolaren Konzentrationen fungieren. Diese modulieren unter normalen oder pathologischen Zuständen die funktioneilen Aktivitäten von einzelnen Zellen oder Geweben. Ferner vermitteln sie direkt Interaktionen zwischen Zellen und regulieren Prozesse, die bevorzugt in der extrazellulären Umgebung ablaufen. „Chemokine" sind eine Untergruppe der Cytokine. Es sind kleinere Proteine, die u.a. chemotaktisch auf Zellen wirken.
Unter den Begriff Cytokine fällt beispielsweise GM-CSF, G-CSF, LU, IL2, IL3, L 4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, LL10, LL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFNα, IFNß, IFNγ, Flt3 L, Flt3 sowie TNFα. Ein besonders bevorzugtes Cytokin ist GM-CSF. Unter den Begriff Chemokine fällt beispielsweise RANTES, MlPlα, MlPlß, MlPlγ, MlPlδ, MIP2, MIP2α, MIP2ß, MIP3α, MIP3ß, MIP4, MIP5, MCP1, MCPlß, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, όcykine, Dcckl sowie DCDF. Besonders bevorzugte Chemokine sind GM-CSF, RANTES sowie MlPlα. (Zu den Cytokinen und Chemokinen: Cytoki- nes Online Pathfinder Encyclopedia, Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines, Version 4.0, August 1999; Website: http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi). Ferner werden im Rahmen dieser Erfindung mutierte Varianten dieser Cytokine und Chemokine sowie Fusionspro- teine dieser Cytokine und Chemokine verstanden. Diese umfassen beispielsweise Punktmutationen, Insertionen, Deletionen sowie Fusionen mit anderen Polypepti- den, beispielsweise mit sogenannten Tags, beispielsweise His-Tag, GST-Tag, Myc-Tag, GFP-Tag, oder Fusionen mit funktionellen Domänen anderer Polypep- tide, beispielsweise mit Domänen von Immunglobulinen, anderen Cytokinen oder Chemokinen.
Unter topischer Anwendung wird das äußerliche Auftragen des Wirkstoffes auf die Haut verstanden. Vorzugsweise liegt der Wirkstoff in Form einer Salbe, eines Gels, eines Pflasters oder einer anderen hautverträglichen Formulierung vor. Vor- zugsweise wird der Wirkstoff lokal in dem Bereich appliziert, in dem eine Hautveränderung und/oder -erkrankung vorliegt.
Unter viralen Hauterkrankungen werden Hauterkrankungen verstanden, die von Viren ausgelöst bzw. verursacht und/oder mit Virusinfektionen assoziiert sind. Hierzu zählen beispielsweise Hauterkrankungen wie zum Beispiel Hautwarzen, genitale Warzen, anogenitale Warzen oder Schleimhautwarzen (siehe Tabelle 1), die von mindestens einem Papilloma Virus, insbesondere humanen Papilloma Virus, wie zum Beispiel HPV1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 46, 47, 48, 49, 50, 56 und 58 ausgelöst werden. Des weiteren zählen hierzu Erkrankungen, die durch mindestens ein Herpes Virus, insbesondere durch Herpes Simplex Virus 1, Herpes Simplex Virus 2, Humanes Herpes Virus (HHV) 1, HHV2, HHV3, HHV4, HHV7, HHV8 sowie Varicella Zoster, also Lippenherpes, Kaposi-Sarcom, Windpocken und/oder Gürtelrose, ausgelöst werden. Tabelle 1
Figure imgf000007_0001
Tumorerkrankungen, die mittels topikaler Application von beispielsweie GM-CSF behandelt werden können, sind Tumoren der Haut, beispielsweise Melanom oder akute Keratmosis, Neoplasien des Genital- und Analtraktes, wie zum Beispiel Cervical Intraepithelial Neoplasien, Anal Intraepithelial Neoplasien oder Penile Intraepithelial Neoplasien (siehe auch Tabelle 2). Tabelle 2
Figure imgf000008_0001
Unter mykotischen Hauterkrankungen werden Hauterkrankungen verstanden, die durch Pilzinfektionen hervorgerufen werden. Diese umfassen Erkrankungen der Haut, der Hautanhangsgebilde wie auch der Schleimhäute einschließlich der äußeren und inneren Genitale. Hierunter werden vor allem Dermatomykosen (siehe Tabelle 3) sowie andere Mykosen, die mykotische Hauterkrankungen verursachen können, verstanden (siehe Tabelle 4 und Tabelle 5).
Tabelle 3
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Tabelle 4
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Tabelle 5
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Das Arzneimittel wird gemäß der vorliegenden Erfindung im allgemeinen dadurch hergestellt, dass mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin mit mindestens einem geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoff in Kontakt gebracht wird, beispielsweise durch vermischen oder auflösen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels bei dem mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin mit mindestens einem Hilfsstoff, insbesondere mit humanem Serumalbumin, CpG oder oxidiertem Glutathion, in Kontakt gebracht wird. Das Cytokin und/oder Chemokin wird vorzugsweise gentechnisch, nach dem Fachmann bekannten Verfahren, hergestellt.
So kann beispielsweise ein entsprechendes Expressionskonstrukt für die gentechnische Herstellung des Cytokins und/oder Chemokins verwendet werden, enthaltend eine für das Cytokin und/oder Chemokin kodierende Nukleinsäure sowie einen geeigneten Promotor für die Expression in vorzugsweise Bakterien, z.B. E. coli, oder in eukaryotischen Zellen, wie zum Beispiel in Hefen, z.B. S. cerevisiae oder S. pombe oder Pichia pastoris, oder in höheren eukaryotischen Zellen, wie zum Beispiel in Insektenzellen oder humanen Zellen. Anschließend kann das Cytokin und/oder Chemokin unter nativen oder nicht-nativen Bedingung nach dem Fachmann bekannten Methoden gereinigt werden.
Die Herstellung von Arzneimitteln mit einem Gehalt an mindestens einem Cytokin und/oder Chemokin bzw. deren Einsatz bei der erfindungsgemäßen Verwen- düng erfolgt in üblicher Weise anhand geläufiger pharmazeutisch-technologischer Verfahren. Dazu werden die Wirkstoffe bevorzugt zusammen mit geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen zu den für die verschiedenen Indikationen und Applikationsorte geeigneten Arzneiformen verarbeitet. Dabei können die Arzneimittel in der Weise hergestellt werden, dass die jeweils er- wünschte Freisetzungsrate, z.B. eine rasche Anflutung und/oder ein Retard- bzw. Depoteffekt, erzielt wird.
Zur herkömmlichen Applikation auf der Haut oder Schleimhaut lassen sich zum Beispiel übliche Emulsionen, Gele, Salben, Cremes der mischphasigen bzw. am- phiphilen Emulsionssysteme (Öl/Wasser- Wasser/Öl-Mischphase) sowie Liposo- men und Transfersomen oder Pflaster, bevorzugt Salben und Cremes, besonders bevorzugt eine Salbe anführen. Vorzugsweise wird der Wirkstoff lokal in dem Bereich appliziert, in dem eine Haut- bzw. Schleimhautveränderung und/oder - erkrankung vorliegt.
Als weitere topisch applizierbare Formen lassen sich auch Pasten, Puder oder Lösungen herstellen. Die Pasten enthalten als konsistenzgebende Grundlagen oft hydrophobe und hydrophile Hilfsstoffe, bevorzugt jedoch hydrophobe Hilfsstoffe mit sehr hohem Feststoffanteil. Die Puder oder topisch applizierbare Pulver kön- nen zur Erhöhung der Dispersität sowie des Fließ- und Gleitvermögens sowie zur Verhinderung von Agglomeraten, z.B. Stärkearten, wie Weizen- oder Reisstärke, flammendisperses Siliziumdioxid oder Kieselerden, die auch als Verdünnungsmittel dienen, enthalten. Als topisch, lokal oder regional verabreichbare Arzneimittel kommen neben den bekannten Anwendungen auf der Haut und/oder Schleimhaut als spezielle Zubereitungen vorzugsweise die folgenden in Betracht: genital, vaginal oder rektal, insbesondere genital und vaginal applizierbare Emulsionen, Cremes, Salben, Schaumtabletten oder Suppositorien. Auf der Grundlage von Gelatine oder anderen Trägerstoffen lassen sich auch Rektalkapseln bereitstellen. Als Suppositorien- grundlagen kommen z.B. Hartfette, wie z.B. Witepsol®, Massa Estarium®, No- vata®, Kokosfett, Glycerin/Gelatine-Massen, Glycerin/Seifen-Gele und Polyethylenglykole in Betracht.
Die jeweils geeigneten Arzneiformen lassen sich in Einklang mit dem Fachmann bekannten Rezepturvorschriften und Verfahrensweisen auf der Basis pharmazeutisch-physikalischer Grundlagen herstellen.
Als Hilfs- bzw. Trägerstoffe eignen sich beispielsweise Natriumalginat als Gelbildner zur Herstellung einer geeigneten Grundlage oder Cellulosederivate, wie z.B. Guar- oder Xanthangummi, anorganische Gelbildner, wie z.B. Aluminiumhydroxide oder Bentonite (sog. thixotrope Gelbildner), Polyacrylsäurederivate, wie z.B. Carbopol®, Polyvinylpyrrolidon, mikrokristalline Cellulose oder Car- boxymethylcellulose. Weiterhin kommen amphiphile nieder- und höhermolekulare Verbindungen sowie Phospholipide in Betracht. Die Gele können entweder als Hydrogele auf Wasserbasis oder als hydrophobe Organogele, beispielsweise auf Basis von Gemischen nieder- und hochmolekularer Paraffinkohlenwasserstoffe und Vaseline vorliegen. Die hydrophilen Organogele können beispielsweise auf Basis hochmolekularer Polyethylenglykole zubereitet werden. Diese gelartigen Formen sind abwaschbar. Unter den Organogelen sind die hydrophoben Organogele jedoch bevorzugt. Besonders bevorzugt sind hydrophobe Hilfsstoffe- und Zusatzstoffe wie Petrolatum, Wachs, Oleylalkohol, Propylenglykolmonostearat und Propylenglykolmonopalmitostearat. Des weiteren können Farbstoffe bei- spielsweise gelbes und/oder rotes Eisenoxid und/oder Titandioxid zur farblichen Anpassung hinzugegeben werden.
Als Emulgatoren lassen sich beispielsweise anionische, kationische oder neutrale Tenside, beispielsweise Alkaliseifen, Metallseifen, Aminseifen, sulfurierte und sulfonierte Verbindungen, Invertseifen, hohe Fettalkohole, Partialfettsäureester des Sorbitants und Polyoxyethylensorbitans, z.B. Lanette-Typen, Wollwachs, Lanolin oder andere synthetische Produkte zur Herstellung der Öl/Wasser- und/oder Wasser/Öl-Emulsionen einsetzen. Geeignete Hilfsstoffe sind ferner beispielsweise inonisch oder anionische Detergentien, wie z.B. Triton-X-100, Tween, Natrium- desoxycholat, aber auch Polyole, wie z.B. Polyethylengrykol oder Glycerin, Zuk- ker, z.B. Saccharose oder Glukose, Lipopolysaccharide, zwitterionische Verbindungen, wie z.B. Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain, oder Lipide.
Als Lipide in Form fett- und/oder öl- und/oder wachsartiger Komponenten zur Herstellung der Salben, Cremes oder Emulsionen können Vaseline, natürliche oder synthetische Wachse, Fettsäuren, Fettalkohole, Fettsäureester, z.B. als Mono- , Di- oder Triglyceride, Paraffϊnöl oder vegetabilische Öle, gehärtetes Rizinusöl oder Kokosöl, Schweinefett, synthetische Fette, z.B. auf Caprryl-, Caprin-, Lau- rin- und Stearinsäurebasis wie z.B. Softisan® oder Triglyceridgemische wie Miglyol® eingesetzt werden.
Zur Einstellung des pH- Wertes der Formulierung können beispielsweise geeigneten organischen oder anorganischen Puffer, osmotisch wirksame Säuren und Lau- gen, z.B. Salzsäure, Zitronensäure, Natronlauge, Kalilauge, Natrium- hydrogencarbonat, ferner Puffersysteme, wie z.B. Citrat, Phosphat-Puffer, Tris- Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)- piperazinoj-ethansulfonsäure), MOPS-Puffer (3-Morpholino-l- propansulfonsäure) oder Triethanolamin verwendet werden. Die Auswahl des Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten Puffermolarität.
Zur Erhöhung der Stabilität können ferner Konservierungsmittel, wie beispiels- weise Methyl- oder Propylbenzoat (Parabene), Sorbinsäure, Proteine, z.B. bo- vines, humanes oder synthetisches Serumalbumin, und/oder Proteaseinhibitoren, wie z.B. Aprotinin, ε-Aminocarponsäure, Pepstatin A, EDTA oder EGTA, hinzugesetzt werden.
Hilfstoffe können ferner Penetrationsverstärker, beispielsweise hydrophobe Ester wie Isopropyllaureat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Isopropylstearat, Ethylmyristat, Propylmyristat, Butylmyristat und/oder Ethyloleat, insbesondere Isopropylmyristat sein. Unter dem Begriff „hydrophob" wird dabei eine Verbindung verstanden, deren Löslichkeit in Wasser maximal ca. 0,2 mg/ml, insbesonde- re maximal ca. 0,1 mg/ml beträgt.
Weitere geeignete Hilfsstoffe sind Adjuvantien, die die immunogene (sensibilisie- rende) Wirkung eines Antigens verstärken. Hierzu ist anzumerken, dass das Antigen, gegen das eine immunogene Wirkung erzielt werden soll, insbesondere ein virales, mykotisches und/oder Tumor-spezifisches Antigen ist, das in der Haut am Krankheitsherd exprimiert wird. Geeignete Adjuvantien sind insbesondere Adjuvantien, die eine Aktivierung der Toll-like-receptors bewirken, beispielsweise Adjuvantien wie CpG Oligonukleotide (Chen Y et al. (2001) Int. Immunol. 13, 1013-20), Lipopolysaccharide (Alexander C und Rietschel ET (2001) J. Endoto- xin Res. 7, 3, 167-202), Bacillus Calmette-Guerin Zellwandgerüst (Matsumoto M et al (2001) Int. Immunopharmacol. 1, 8, 1559-69) sowie Superantigene (Osanto S et al (2001) Infect. Immun. 69, 11, 6633-42) und Agenzien, die die Signalwirkung von CTLA-4 inhibieren (WO 00/32231, WO 97/20574). Andere geeignete Adju- vantien sind z.B. Freundsches Adjuvans, Aluminium Hydroxid, oxidiertes Glutathion, doppelsträngige RNA oder Iscom.
Bevorzugt als Hilfsstoffe sind ferner Substanzen, die eine lokale Hautreizung be- wirken, da dadurch die Wirkung von Cytokinen und/oder Chemokinen gesteigert wird. Hierzu zählt zum Beispiel DMSO.
Das Arzneimittel kann gemäß der vorliegenden Erfindung auch als Formulie- rung,enthaltend mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin und eine Puffer- oder Salzlösung und/oder eine Salbengrundlage sowie gegebenenfalls mindestens einen geeigneten Zusatz- und /oder Hilfsstoff vorliegen.
Unter dem Begriff Formulierung versteht man eine Zusammensetzung in Form einer Lösung oder einer Suspension der genannten Cytokine und/oder Chemokine, wobei es sich dabei um eine im wesentlichen homogene Formulierung handelt, bei der auch bei längerer Lagerung bei ca. 4°C keine Sedimentation von Inhaltsstoffen beobachtet werden kann.
Besonders bevorzugt ist eine Formulierung, bei der das bzw. die enthaltene^) Cytokin(e) und/oder Chemokin(e) nativ bzw. aktiv bleibt. Die Aktivität der Proteine ist für jedes einzelne Protein in einem entsprechenden Aktivitätstest nachweisbar.
Das Salz als beispielhafter Bestandteil einer Formulierung ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KC1. Die Verwendung von NaCl ist besonders bevorzugt. Bevorzugte Salbengrundlagen sind zum Beispiel Wasser-in-Öl-Salben, beispielsweise eine Wollwachsalkoholsalbe, bestehend aus Cetylstearylalkohol, Wollwachsalkohol und Vaseline oder Öl-in- Wasser-Salben (hydrophile Salben), beispielsweise bestehend aus emulgierendem Cetylstearylalkohol, Paraffinöl subli- quidum und Vaseline.
Besonders bevorzugt ist die Anwendung einer zuvor beschriebenen Formulierung in Verbindung mit einem Mittel für eine Occlusion, d.h. dass die nach Auftragen der Formulierung auf die Haut, Schleimhaut und Hautanhangsorgane die behan- delte Stelle abgedeckt wird. Dies kann beispielsweise durch eine Wundabdeckung in Form eines Pflasters oder Sprühverbands erfolgen.
Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Behandlungskit enthaltend mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin sowie ein Occlusionsmit- tel.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung und ferner bevorzugte Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung eines Hautpenetrationsexperiments von 3 GM-CSF-Formulierungen in einer Durchfluß-Diffusionszelle. Die Verteilung des aufgetragenen [125I]-GM-CSF (in % der Gesamtaktivität) in der Rezeptorfüssig- keit (Permeation), in der Haut und in den Salbenrückständen nach 36 h ist aufgetragen gegen die Formulierung. Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung eines Stabilitätsexperiments von den Formulierungen 43600 und 43400 im Vergleich zu GM-CSF zum Zeitpunkt 0 und nach Inkubation für 7 Tage bei 40°C, bei dem eine konstante Menge DMSO- Salbenextrakt mit ansteigenden Mengen an GM-CSF versetzt wurde (X-Achse, logarithmisch in % für Salbenextrakte enthaltend GM-CSF sowie in Units/ml für zugesetztes GM-CSF) und die Aktivierung von Monozyten an deren CDla- Expression gemessen wurde (Y-Achse).
Fig. 3 zeigt die graphische Auswertung eines Stabilitätsexperiments der Formulie- rung 10101 zum Zeitpunkt 0 und nach Inkubation für 7 Tage bei 40°C, bei dem eine konstante Menge DMSO-Salbenextrakt mit ansteigenden Mengen an GM- CSF versetzt wurde (X-Achse, logarithmisch in %) und die Aktivierung von Monozyten an deren CDla-Expression gemessen wurde (Y-Achse).
Beispiel: 1 GM-CSF enthaltende Formulierungen
1. Beschreibung der Formulierungen
Es wurden folgende Formulierungsansätze mit je 100 μg/g humanem rekombi- nantem GM-CSF (Leucomax 400 von Sandoz AG, Basel, Schweiz) hergestellt:
Tabelle 6
Figure imgf000020_0001
w/o = Wasser in Öl; o/w = Öl in Wasser
Herstellung der Salben:
Alle Salben wurden unter aseptischen Bedingungen (Laminar flow, sterile Handschuhe, Mundschutz etc.) hergestellt. 20 g der Salbe mit der Bezeichnung 43400 wurden wie folgt hergestellt: Zunächst wurde zur Herstellung der Wollwachsalkoholsalbe lg Cetylstearylalkohol, 12 g Wollwachsalkohol sowie 187 g Vaseline weiß in ein Becherglas eingewogen und bei 70°C aufgeschmolzen und unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Glycerinlösung 70% gelöst (5 Gefäße a 400 μg/g = 2000 μg/5g). 15 g Wollwachsalkoholsalbe wurden in Reibschale vorgelegt, 5 g Leucomax / Glycerin-Lösung 400μg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.
20 g der Salbe mit der Bezeichnung 43500 wurden wie folgt hergestellt: Zunächst wurde zur Herstellung der Wollwachsalkoholsalbe lg Cetylstearylalkohol, 12 g Wollwachsalkohol sowie 187 g Vaseline weiß in ein Becherglas eingewogen und bei 70°C aufgeschmolzen und unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Dimethylsulfoxid reinst (DMSO) gelöst (5 Gefäße a 400 μg/g = 2000 μg/5g). 15 g Wollwachsalkoholsalbe wurde in Reibschale vorgelegt, 5 g Leucomax / DMSO-Lösung 400 μg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.
20 g der Salbe mit der Bezeichnung 34600 wurden wie folgt hergestellt:
Zunächst wurden 70 g Vaseline weiß, 70 g Paraffmöl subl. und 60 g Emulgierder Cetylstearylalkohol in einem Becherglas eingewogen, bei 70°C aufgeschmolzen und anschließend bei ständigem Rühren auf Raumterperatur abgekühlt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Glycerinlösung 70% gelöst (5 Gefäße a 400 μg/g = 2000 μg/5g). Von der hydrophilen Salbe wurden 15 g in eine Reibschale vorgelegt, die Leucomax / Glycerin Lösung 400 μg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt. 20 g der Salbe mit der Bezeichnung 10101 wurden wie folgt hergestellt:
Zunächst wurden 100 g Polyethylenglykol 300 und 100 g Polyenthylenglykol 1500 bei 60 bis 70°C unter Rühren geschmolzen und bis zum Erkalten gerührt. Es wurde Leucomax 400 in 1 g Glycerinlösung 70% gelöst (5 Gefäße a 400 μg/g = 2000 μg/5g). Von dem Polyethylenglykolgemisch wurden 15 g in eine Reibschale vorgelegt, die Leucomax / Glycerin Lösung 400 μg/g zugegeben und homogen eingerührt. Die Salbe wurde jeweils zu 1 g in Gefäße abgefüllt.
2. Herstellung 125I-markiertes humanes GM-CSF-enthaltender Formulierungen
125I-markiertes humanes GM-CSF (NEN Life Sciences, Köln, Deutschland, 125I- PACAP27, NEX294, Lot-Nummer GCB1500) wurde kalibriert. Die spezifische Aktivität betrug bei Beginn des Experiments 5,2 μCi (192,4 kBq). Das Protein wurde in lyophilisierter Form bezogen und in 70 μl aqua dest. Aufgenommen (die Aufnahme in 35 μl führte nicht zu einer homogene Lösung). Die resultierende spezifische Aktivität der Lösung betrug 0,074 μCi/μl (2,75 kBq/μl).
Ca. 260 mg der drei verschiedenen GM-CSF-Forumulierungen wurden in eine 48- Well Zellkulturschale transferriert. 15 μl 125I-markiertes GM-CSF wurden zuge- geben und bei Raumtemperatur mittels eines Spatels mit der Formulierung vermischt. Zwischen 3 und 5 mg des Gemisches wurden in ein Szintila ionsgefäß transferriert und 2 ml Packard Microscint-20 wurden hinzugegeben. Die Proben wurden für mehrere Minuten auf 60°C erhitzt und erneut gemischt. Anschließend wurden sie in einem Szintillationszähler gemessen (siehe Tabelle 7). Die ver- mischten Formulierungen wurden in Eppendorf Reaktionsgefäße transferriert und bei 4°C gelagert. Als Kontrolle wurden 2 μl der 125I-GM-CSF Lösung (0,074 μCi/μl, 2,75 kBq/μl) unmittelbar in 2 ml Packard Microscint-20 gemessen.
Tabelle 7
Figure imgf000023_0001
Anhand der Kontrolle ist erkennbar, dass mittels dieser Methode lediglich 23 % der theoretisch zu erwartenden Aktivität messbar sind.
Diese Versuchsreihe macht deutlich, dass wässrig gelöstes GM-CSF (hier vorlie- gend als I-markiertes GM-CSF) in alle drei Formulierungen eingebracht werden konnte. Es gelingt, 125I-GM-CSF homogen in die beschriebenen Formulierungen einzubringen, was daran erkennbar ist, dass die Paralleanalysen der einzelnen Formulierungen lediglich geringe Abweichungen aufweisen. In den unterschiedlichen Formulierungen konnten zwischen 11,8 und 17,6 % der ursprünglich theore- tisch zugegebenen Menge an GM-CSF nachgewiesen werden, wobei die systembedingt maximal nachweisbare Menge bei 23 % liegt. Beispiel 2: Hautpenetration verschiedener GM-CSF Formulierungen
Die Hautpenetration verschiedener GM-CSF Formulierungen wurde anhand eines in vitro Hautpenetrationsassays gemessen (siehe zum Beispiel: Bronaugh RL et al, (1982) Toxicol Appl Pharmacol 15;62(3): 481-488; Bronaugh RL, (2000) Ann N Y Acad Sei 919: 188-191).
Hautproben von weiblicher abdominaler Herkunft aus kosmetischen Operationen wurden verwendet. Hautscheiben (450 μm) wurde mittels eines Dermatoms prä- pariert, die das Stratum corneum, die Epidermis und Teil der Dennis enthielt. Es wurden Hautscheiben mit einem Durchmesser von 10 mm ausgestanzt und in einer Diffusionszelle eingesetzt. Die Hautstücke wurden zwischen Mikroskop- Objektträgern bei unter <-15°C eingefroren. Die Dicke der Hautscheiben wurde zwischen den Objektträgern- Aufhängungen gemessen. Da die Membranherstel- lung mit einer Beschädigung der Haut einhergehen könnte, wurde die Integrität der Hautmembran mikroskopisch überprüft, bevor diese in die Diffusionszellen eingepasst wurden.
Als Diffusionszelle wurde die Diffusionszelle von BSL BIOSERVICE, Planegg, Deutschland, verwendet. Diese ist mit einem PTFE-Donor und -Akzeptor für die Durchflussdiffusion für horizontale Exposition der Hautoberfläche ausgelegt. Die Fläche der Hautexposition beträgt 19,63 mm2. Die Temperatur der Diffusionszel- len wurden konstant gehalten. Eine Multikanal-Peristaltikpumpe wurde mit dem Rezeptorteil der Diffusionszelle verbunden und ein programierbarer Fraktions- sammler wurde für die Sammlung der Proben eingesetzt.
Die gefrorene Haut wurde mit PBS gewaschen und auf den Akzeptorteil plaziert. Die Diffusionszelle wurde mit dem Rezeptorteil geschlossen und mit entgaster Akzeptorflüssigkeit (Physiologischer Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (RT, pH 7,5 ± 0,3), ergänzt mit 0,1% BSA und 50 μg/ml Gentamycin; entgast) in horizontaler Position für mindestens 1 h equilibriert (Einstellung von Flussrate und Temperatur auf 0,6 ml/ und 32+1 °C). Anschließend wurde eine definierte Menge der unter Beispiel 1.2 genannten 125I-markierten GM-CSF-Formulierungen mittels Spatels auf die Hautoberfläche aufgebracht. Die Sammlung der Akzeptorflüssigkeit wurde für 36 gestartet, wobei alle 6 h das Auffanggefäß gewechselt wurde. Am Ende der Messreihe wurde die verbliebene Salbe von der Donorseite mit einem Wattestäbchen abgewischt. Nach dem Abbau der Diffusionszelle wurde die Hautmembran erneut mit einem Wattestäbchen abgewischt und die gesamten verbliebenen, nicht penetrierten Salbenreste wurde in einem Szintillationsgefäß gesammelt.
200 μl jeder gesammelten Fraktion wurden mit 2 ml Szintillationsflüssigkeit (Microscint™20, Canberra Packard, Dreieich, Deutschland) vermischt. Die gesammelte, nicht penetrierten Salbenreste wurden mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit vermischt und in einem Ultraschall- Wasserbad bei 60°C für mindestens 30 min inkubiert. Die exponierten Hautscheiben wurden mit 500 μl Gewebeauflöser (Sol- vable™, Packerd) für mindestens 3 h bei 50°C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 50 μl der aufgelösten Haut zu 4 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben. Die Radioaktivität all dieser Proben wurde in einem Szintillations-
IOC
Zähler gemessen (m cpm) und die Verteilung des [ D-GM-CSF in der Haut, ausgedrückt als Aktivität (nCi), in den nicht-penetrierten Salbenresten wie auch in der Akzeptorflüssigkeit nach der Formel
Aktivität fnCi] - cpm x Verdünnungsfaktor x Quenchfaktor / 60 / 37
bestimmt. P- Werte wurden nach dem unpaired t-test berechnet. In dem beschriebenen Experiment konnte nachgewiesen werden, dass innerhalb von 36 h zwischen 1,4 und 3,7% des aufgetragenen [125I]-GM-CSF durch die exponierten Hautschichten in die Akzeptorflüssigkeit durchdrangen. Dabei zeigte die Formulierung 43600 die niedrigste, 43400 hingegen die höchste Permeation. Nach Versuchsabschluß wurden in der Haut 2,6% (43400), 2,2 % (43500) und 3,5%) (45600) der aufgetragenen [125I]-GM-CSF-Menge nachgewiesen. Geht man davon aus, dass sowohl das in der Haut als auch das durch die Haut hindurchgewanderte GM-CSF therapeutisch wirksam ist, so sind für die Formulierung 43400 >6%, für 43500 <5% und für 43600 <4% des aufgetragenen GM-CSF wirksam.
Beispiel 3: Stabilität verschiedener GM-CSF Formulierungen
Um die Stabilität verschiedener GM-CSF Formulierungen zu testen, wurden ca. 10 mg der unter Beispiel 1.1 genannten Formulierungen steril eingewogen und für 7 Tage bei 40°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit 5 μl DMSO/mg Creme versetzt, um das in der Creme enthaltene GM-CSF zu extrahieren. Die Proben wurden gründlich vermischt (Vortex) und ca. 2h bei RT inkubiert, wobei ca. alle 30 min nochmals per Vortex gemischt wurde. Die Proben wurden kurz abzentrifugiert und bis zur weiteren Bearbeitung bei 4°C gelagert.
Es wurden Monozyten nach bekannten Methoden isoliert (siehe z.B. Current Protocols in Immunology, Editors Coligan JE et al. 1999, Seiten 7.32.1-4). Diese wurden in Medium (RPMI - Gibco, Paisley, Schottland - mit 5%FCS) aufgenom- men, so dass eine Konzentration von 175000-220000 Zellen pro 500 μl vorlag. Humanes rekombinantes IL4 doppeltkonzentriert (Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) hinzugeben (Endkonz. 500 Units/ml). Die extrahierten Salbenproben wurden auf RT equilibriet, nach 30 min gründlich per Vortex gemischt und kurz abzentrifugiert.
In je ein Well einer 48-well Platte wurden zunächst jeweils 1 ml Medium (RPMI mit 5%FCS) vorgelegt und anschließend 2,5 μl der Cremeextrakte oder - als Kontrolle - 0,5 μl humanes rekombinantes GM-CSF (entspricht 0,25 % Extrakt bzw. 500 Units GM-CSF) zugegeben. Von jedem dieser Ausgangsansätze wurden Verdünnungsreihen angesetzt, indem in Wells mit je 500 μl vorgelegtem Medium jeweils 500 μl des jeweils höher konzentrierten Ansatzes zupipettiert wurden. Diese Verdünnungsreihe sah somit wie in Tabelle 8 dargestellt aus.
Tabelle 8
Figure imgf000027_0001
Anschließend wurden in jedes Well 500 μl der Monozyten-Suspension zugege- ben. Die Platten wurde für 7 Tage bei 37°C inkubiert, die Zellen geerntet und mit Maus-anti-Human CDla (1:50, Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) und antiMaus IgG FITC (3/50, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) gefärbt. Abschließend wurden die Zellen in einem FACS (FACS Calibur, Fa. Beckton Dickenson, Hamburg, Deutschland) hinsichtlich ihrer CDla-Immunfarbung analysiert. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz aus 500 μl Medium mit 2,5 μl humanem rekombinanten GM-CSF, als Negativkontrolle ohne GM-CSF.
In den Stabilitätsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Formulierung 43600 nach 7 Tagen bei 40°C deutlich mehr GM-CSF Aktivität besitzt als die Formulierung 43400 (siehe Fig. 2). Auch die Formulierung 10101 besitzt nach der Inkubationszeit kaum noch GM-CSF Aktivität (siehe Fig. 3).

Claims

Patentansprüche
Verwendung mindestens eines Cytokines und/oder Chemokines zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels zur Behandlung von viralen und/oder mykotischen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel mehr als drei, insbesondere drei, vorzugsweise zwei Cytokine und/oder Chemokine enthält.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel im wesentlichen keine antigen-wirkenden Bestandteile enthält.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytokin und/oder Chemokin GM-CSF, G-CSF, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFNα, IFNß, IFNγ, Flt3 L, Flt3, RANTES,
MlPlα, MlPlß, MlPlγ, MlPlδ, MIP2, MIP2α, MIP2ß, MIP3α, MIP3ß, MIP4, MIP5, MCP1, MCPlß, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, 6cykine, Dcckl und/oder DCDF, insbesondere GM-CSF, RANTES und/oder MlPlα ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die viralen Hauterkrankungen und/oder Tumorerkrankungen hervorgerufen werden durch mindestens einen Papilloma Virus, insbesondere durch mindestens einen Humanen Papilloma Virus wie zum Beispiel HPV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 46, 47, 48, 49, 50, 56, 58, durch mindestens einen Herpes Virus, wie zum Beispiel Herpes Simplex
Virus 1, Herpes Simplex Virus 2, Varicella Zoster Virus oder Humanes Herpes Virus 1, 2, 3, 4, 7, 8.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die viralen Hauterkrankungen Warzen, Genital warzen, durch
Papillomaviren verursachte benigne Tumore der Haut oder Schleimhaut, z.B. Verrucae plantares, Verrucae vulgäres, Verrucae planae jeveniles, Epidermodysplasia verruciforis, Condylomata acuminata, Condylomata plana, bowenoide Papulose, Papillome an Larynx oder Mundschleimhaut, fokale epitheliale Hyperplasie, Lippenherpes, Kaposi-Sarcom, Windpocken und/oder Gürtelrose sind.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorerkrankungen Bowen-Krankheit, Penis-, Anal- und Vulvakarzinom, Zervixkarzinom, Larynxkarzinom und/oder
Zungenkarzinom sind.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mykotischen Hauterkrankungen Dermatomykosen, Chromoblastomykose, Sporothrix-Mykose, Eumyzetom oder
Systemmykosen sind.
9. Verfahren zur Herstellung eines topikal wirkenden Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Cytokin und/oder Chemokin mit mindestens einem Hilfsstoff, insbesondere mit humanem Serumalbumin, CpG oder oxidiertem Glutathion, in Kontakt gebracht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytokin und/oder Chemokin gentechnisch hergestellt wird.
11. Topikal wirkende Arzneimittelformulierung enthaltend mindestens ein Cytokin und/oder ein Chemokin sowie Cetylstearylalkohol, Vaseline und
Wollwachsalkohol oder Parafinöl.
12. Behandlungskit enthaltend eine Formulierung gemäß Anspruch 11 sowie ein Occlusionsmittel.
13. Behandlungskit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Occlusionsmittel ein Pflaster oder ein Sprühverband ist.
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