DE2834893A1

DE2834893A1 - Verfestigtes (festes) pharmazeutisches mittel und verfahren zu seiner herstellung

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Publication number: DE2834893A1
Application number: DE19782834893
Authority: DE
Inventors: Yuichi Yamamura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-08-09
Filing date: 1978-08-09
Publication date: 1979-02-22
Also published as: GB2002229B; CH643459A5; IT7826609A0; GB2002229A; US4543253A; JPS5428813A; JPS631291B2; CA1118348A; SE447629B; FI65370C; FI65370B; HU179726B; DK153443B; BE869610A; SE7808414L; DE2834893C2; AU3879178A; FR2399844A1; FR2399844B1; DK153443C

Description

Anmelder t

1. Yuichi Yamamura, 1-9-22, Nikawatakadai, Takarazuka,Japan

2. Ichiro Azuraa, 1-2, Aoyamadai, Suita, Japan

3. Katsusuke Ennyu, 2-27, Besshoshinmachi, Takatsuki, Japan

4. Osamu Aoki, 2-3-5-302, Hibarigaoka, Takarazuka, Japan

Verfestigte (festes) pharmazeutisches Mittel und Verfahren zu

seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein· verfestigtes bzw. fest gewordenes bzw. festes pharmazeutisches Mittel (nachfolgend als erstarrtes pharmazeutisches Mittel bezeichnet), das ein Mikrobenzellwand-GerUst bzw. -Skelett enthält, das starke Adjuvans- und Antitumor-Aktivitäten aufweist/ die Erfindung betrifft insbesondere ein erstarrtes pharmazeutisches Mittel, das besteht aus oder enthält das Mikrobenzellwand-Gerüst, ein Trägeröl, ein Suspendiermittel und ein Dispergiermittel, das als immunotherapeutisches Mittel gegen Humantumor verwendet werden kann, sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.

Es wurde bereits darauf hingewiesen, oaß das Zellwand-Gerüst bzw. -Skelett (nachfolgend stets als Zellwand-Gerüst, abgekürzt mit "CVJS¹¹J bezeichnet), das aus Mikroorganismen, wie z.B. solchen des Genus Mycobacterium (wie Mycobacterium bovis BCG), Nocardia (wie Nocardia rubra) oder dgl. gewonnen worden ist, Adjuvans- und Antitumor-Aktivitäten aufweist. Da jedoch das CWS eine in

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"Jt-

Wasser unlösliche Substanz darstellt, konnte sie nicht in Form eines konventionellen wäßrigen Injektionspräparats dem Menschen verabreicht werden und es war daher für die wirksame Verabreichung an Menschen für die Therapie unerläßlich, es in Form einer Suspension zu verabreichen.und das CWS wurde formuliert als eine an öl gebundene Form und dann zu einer Öl-in-Wasser-Suspension verarbeitet als wirksames Präparat für die Verwendung. So wurde beispielsweise darauf hingewiesen, daß das CWS von Mycobacterium bovis BCG, das mit einem Mineralöl (wie Drakeol 6VR) behandelt und in einer Lösung von Kochsalz-0,2 % Tween 80 (Handelsname) suspendiert wurde, ein wirksames Mittel für die Unterdrückung des Tumorwachstums oder für die Rückbildung eines bereits vorhandenen Tumors bei Tieren darstellt (vgl. I. Azuma et al, "Gann ( Cancer)') 65, 493-505 (1974); T. Yoshimoto et al, "Gann (Cancer)", &J 441-445 (1976), und B. Zbar et al, "J. Nath. Cancer Inst.", 52, 1571-1577 (1974)) und daß dieses an Öl gebundene BCG-WS wirksam war in bezug auf die Verlängerung der Überlebensdauer und in bezug auf die Verbesserung des immunologischen Zustandes von einen Tumor tragenden Patienten (vgl. Y. Yamamura et al, "Gann (Cancer)", 67_, 669-677 (1976), Y. Yamamura et al, "Gann (Cancer)", 66j 355-363 (1975) und K. Yasumoto et al, "Gann (Cancer)", 67_, 787-795 (1976)). Kürzlich wurde ferner darauf hingewiesen, daß die Suspension des an Öl gebundenen CWS von Nocardia rubra, das im wesentlichen auf die gleiche Weise wie oben angegeben hergestellt worden war, wirksam ist als immunotherapeutisches Mittel bei Humantumor (vgl. I. Azuma et al, "Gann (Cancer)", §7, 669-677 (1976)).

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Obgleich, wie oben angegeben, das an Öl gebundene GiIS viele Vorteile in bezug auf Komplikationen und die Qualitätskontrolle als immunotherapeutische Mittel im Vergleich zu lebenden Mikroorganismen aufweist, traten Störungen und Mangel auf, wie z.B. diejenigen, daß die Suspension des an Öl gebundenen OVS instabil v/ar und nicht in der Lage war, sich unter den gleichen Bedingungen mehr als einen Tag zu halten, so daß die Qualität der Präparate abnahm und die Stärke seiner Aktivitäten sank. Es war daher erforderlich, die Suspension des an öl gebundenen CVJS jedesmal unmittelbar vor der Verv/endung, d.h. vor der Verabreichung an Patienten, herzustellen, daß es aber, da dies für die Therapie sehr kompliziert und unbequem ist, sich im wesentlichen als unmöglich erwiesen hat, ein solches Suspensionspräparat für die praktische Therapie an der jeweiligen Stelle des Krankenhauses zu verwenden.

Um die Störungen und Mangel des Suspensionspräparats des an Öl gebundenen OVS, wie oben angegeben, zu überwinden, so daß dieses auf wirksame und praktikable Weise in einem Krankenhaus verwendet werden kann, wurden umfangreiche Untersuchungen zur Herstellung von stabilen Präparaten des an öl gebundenen OVS angestellt, die ohne Verlust an Stärke ihrer Aktivitäten für einen ziemlich langen Zeitraum, haltbar sind. _

Bei diesen umfangreichen Untersuchungen wurde nun eine erstarrte (verfestigte bzw. feste) Zubereitung des an Öl gebundenen GVS gefunden, die stabil ist und in idealer Weise den industriellen Herstellungsanforderungen und den Anforderungen bei der Verwendung in einem Krankenhaus entspricht.

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Das erfindungsgemäße erstarrte bzw. feste pharmazeutische Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus oder enthält mikrobielle CWS, ein Trägeröl, ein Suspendiermittel und ein Dispergiermittel, und es kann hergestellt werden durch Lyophilisieren einer Suspension aus dem CWS, dem Trägeröl, dem Suspendiermittel und dem Dispergiermittel.

Bei dem erfindungsgemäß verwendeten CWS handelt es sich um ein solches, das von Mikroorganismen, v/ie z.B. solchen des Genus Nocardia (wie Nocardia rubra, Nocardia paraffinica, Nocardia asteroides und dgl.), Mycobacterium (wie Mycobacterium bovis und dgl.), Corynebacterium (wie Corynebacterium diphtheriae und dgl.), Arthrobacter (wie Arthrobacter paraffineus und dgl.) oder dgl. abgeleitet ist.

Das erfindungsgemäß verwendbare CWS kann hergestellt werden durch Fraktionieren und Reinigen von Zellwänden von Zellen der kultivierten Bakterien auf konventionelle Weise (vgl. I. Azuma et al, "J. Nath. Cancer Inst¹.¹, 52, 95 (1974), und I. Azuma et al, "Biken J.", ]_§, 1 (1975)). Ein Beispiel für eine solche Herstellung des CWS ist weiter unten beschrieben.

Unter dem erfindungsgemäß verwendeten Trägeröl ist ein Öl zu verstehen, das die Fähigkeit hat, die Adjuvans- und Antitumor-Aktivitäten zu stimulieren. Dieses Trägeröl kann umfassen ein natürliches und synthetisches oder halbsynthetisches Öl und Beispiele für solche öle sind in "Immunology", 27, 311-329 (1924), angegeben und bevorzugt verwendet werden ein tierisches Öl (z.B. Squalen, Vitamin Α-Öl, Vitamin Ε-Öl, Ubichinon und dgl., und ein

' 2

Metabölit davon, ein pflanzliches öl (z.B. Miglyol, AD-65 (Handelsname für eine Mischung aus Erdnußöl, Aracel und Aluminiummonostearat) und dgl.), ein synthetisches oder halbsynthetisches öl davon (z.B. Squalan, Vitamin A-Palmitat und dgl.), ein Mineralöl (z.B. flüssiges Paraffin, Bayol F (Handelsname), Drakeol 6VR (Handelsname fur ein Produkt der Firma Pennsylvania Refining Co.) und dgl.) und dgl..und besonders bevorzugt sind Squalen, Squalan, Miglyol, Drakeol 6VR und Vitamin A-Palmitat. Bezüglich des oben genannten Trägeröls sei bemerkt, daß diese öle wirksam und brauchbar sind zum Stimulieren des Transports des QiS in den Bereich (z.B. in den Thymuszellenbereich), um zu bewirken, daß das G/S in dem Bereich einen ziemlich langen Zeitraum verbleibt und das Immunisierungsvermögen desselben verlängert. Unter den Trägerölen, wie sie oben beispielhaft genannt sind, kann ein tierisches Öl, insbesondere Squalen, erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden im Hinblick darauf, daß ein solches Trägeröl aus einer natürlichen Quelle stammt und daher eine Affinität gegenüber einem menschlichen Körper hat.

Das erfindungsgemäß verwendete Suspendiermittel kann umfassen ein konventionelles Emulgiermittel, wie z.B. einen Kohlenwasserstoff (wie pulverförmiges Akaziengummi, Tragantpulver, Agar, Pectinsubstanzen, Natriumalginat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und dgl.), ein Protein oder Phospholipid (wie Deutoplasma, Casein, Gelatine, Lecithin und dgl.), einen Polyalkoholester (wie Polyoxyäthylensorbitan-monolaurat (Tween-20), -monopaImitat (Tween-40), -monostearat (Tween-60), -monooleat (Tween-80), Sorbitan-monolaurat (Span-20), -monopalmitat (Span-40), -monostearat (Span-60), -monooleat (Span-80) und dgl.) und dgl.,

-Ur-

unter denen der Polyalkoholester erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden kann und insbesondere ein Polyoxyäthylensorbitanester, wie Polyoxyäthylensorbitan-monooleatj besonders bevorzugt verwendet wird.

Zu bevorzugten Beispielen für das Dispergiermittel, die verwendet werden können, können gehören Zucker und Zuckeralkohol, wie Glukose, Mannit, Sorbit oder dgl., vorzugsweise Zuckeralkohol und besonders bevorzugt Mannit.

Bezüglich der Wirksamkeit des Dispergiermittels, das in dem erstarrten (festen) pharmazeutischen Mittel enthalten ist, sei bemerkt, daß dieses Mittel brauchbar ist nicht nur um die Überführung desselben wieder in eine Suspension leichter zu machen, sondern auch, um die wiederhergestellte Suspension isotonisch zu machen. -.""'-

Das Mengenverhältnis jeder Komponente, die in dem erfindungsgemäßen erstarrten bzw. festen Mittel enthalten ist (d.h. von· CWS, Trägeröl, Suspendiermittel und Dispergiermittel), kann in beliebiger Weise festgelegt werden und bevorzugte und vernünftige Verhältnisse desselben untereinander gehen aus den nachfolgend angegebenen Ausführungsbeispielen hervor.

Das erfindungsgemäße erstarrte pharmazeutische Mittel kann beispielsweise hergestellt werden durch Suspendieren einer Mischung jeder Komponente, wie oben erwähnt, auf konventionelle Weise und Lyophilisieren der so hergestellten Suspension. So..wird"" beispielsweise insbeondere das CWS in einen Gewebehomogenisator

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eingeführt und das Trägeröl wird zugegeben, wonach die Mischung gewünschtenfalls zu einer glatten Paste gemahlen wird; zu der Mischung wird eine wäßrige Lösung des Dispergiermittels, die ein Suspendiermittel enthält, zugetropft und die Mischung wird gemahlen und homogenisiert zur Erzielung einer gleichmäßigen Suspension und dann wird die so hergestellte Suspension in eine Phiole überführt, unter Verwendung von beispielsweise flüssigem Stickstoff schnell ausgefroren (abgekühlt) und lyophilisierte

Das erfindungsgemäß hergestellte erstarrte pharmazeutische Mittel kann durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor der Verabreichung an Patienten wieder suspendiert werden und es weist einige Anwendungsgebiete und Vorteile auf, die aus den nachfolgend angegebenen Punkten hervorgehen:

1.) Das erfindungsgemäße erstarrte pharmazeutische Mittel

kann für einen viel längeren Zeitraum aufbewahrt werden als

die frisch hergestellte Suspension des an Öl gebundenen CWS, wobei es nicht nur seine physikalische Stabilität, sondern auch die Stärke der Aktivitäten im wesentlichen unverändert beibehält. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß die frisch hergestellte Suspension des an Öl gebundenen CWS in der Regel mindestens eine Stunde zersetzt wird zu einer uneinheitlichen und ungleichmäßigen Suspension, aus der nur schwer wieder eine einheitliche und gleichmäßige Suspension hergestellt werden kann, was dazu führen kann, daß sie daher nach Ablauf einer längeren Konservierungsdauer derselben nicht die ursprüngliche therapeutische Wirksamkeit des CWS selbst mehr aufweist;

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2.) das erfindungsgemäße erstarrte pharmazeutische Mittel kann leicht wieder zu einer einheitlichen Suspension des an Öl gebundenen CWS verarbeitet werden, die in dem gleichen Zustand hochstabil ist wie die frisch hergestellte Suspension durch einfache Zugabe von sterilisiertem Wasser dazu auch nach Ablauf eines längeren Konservierungszeitraumes (Aufbewahrungszeitraumes) und das wieder suspendierte Präparat kann die gleiche Aktivität wie die frisch hergestellte Suspension des an öl gebundenen ClVS und eine höhere therapeutische Wirksamkeit des CWS selbst aufweisen als die Suspension des an öl gebundenen CWS, die für einen langen Zeitraum aufbewahrt worden ist, wie oben angegeben/

3.) bisher wurde die Suspension des an öl gebundenen CWS jedesmal

unmittelbar vor der Verabreichung wie oben angebeben, hergestellt. Da eine Einzeldosis des CWS eine sehr kleine Menge ist (z.B. von etwa 100 bis 300 μg)_>ii_st die Herstellung' . der Suspension des an Öl gebundenen CWS sehr umständlich , und es isVandererseits sehr schwierig, eine Suspension der gleichen Qualität, welche die gegebene Menge enthält, herzustellen. Auch wenn eine größere Menge der Suspension des an Öl gebundenen CWS auf einmal hergestellt wird, um diese Menge zu überwinden, ist die Suspension selbst sehr instabil und kann nicht über einen langen Zeitraum hinweg wie oben angegeben aufbewahrt werden und deshalb kann ein Teil der Suspension nicht therapeutisch verwendet werden und wird weggeworfen. Erfindungsgemäß ist es jedoch leicht und möglich, ein erstarrtes (festes) Mittel herzustellen, welches die gegebene geringe Menge des an öl gebundenen CWS enthält, in einem großen Maßstabe und die Produktqualität zu kontrollieren.

Wegen der höheren Stabilität und der größeren Stärke der Aktivitäten der aus dem erfindungsgemäßen erstarrten (festen) Mittel wieder hergestellten Suspension besteht einer der erfindungsgeinäßen Vorteile oder eine der unerwarteten und überraschenden Eigenschaften, v/ie oben erläutert, darin, daß diese beibehaltone höhere Stabilität und Stärke offenbar auf die Tatsache zurückzufuhren sind, daß das an öl gebundene CWS in einer solchen wiederhergestellten Suspension gleichmäßig dispergiert sein kann und ύοΒ das dispergierte, an Öl gebundene G\'S in Form von feinen Kugelchen (mit einem Durchmesser von beispielsweise etwa 5 |Am) vorliegen kann, ohne daß eine Agglutination desselben zu größeren Teilchen auftritt.

Wie aus der obigen Erläuterung der Erfindung ersichtlich, sei darauf hingewiesen und betont, daß es mit der vorliegenden Erfindung zum erstenmal gelungen ist, leicht in einem großtechnischen Maßstabe ein Antitumormittel des an Öl gebundenen G/S in einer guten Qualität herzustellen und dadurch die praktische Verwendung dee CWS im Krankenhaus zu ermöglichen. Diese Tatsache ist epochemachend und bedeutet, daß die vorliegende Erfindung eine Hoffnung für die Krebspatienten ist.

Die nachfolgend angegebenen pharmakologischen und pharmazeutischen Testergebnisse sollen die erfinderischen und technichen Vorteile des erfindungsgemäßen erstarrten pharmazeutischen Mittels erläutern.

Materialien und Verfahren

Adjuvantien: Die Herstellung des CWS von Nocardia rubra (nachfolgend abgekürzt mit N. rubra) ist vorstehend beschrieben»

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Drakeol 6VR (der Firma Pennsylvania Refining Co«, Butler, USA), Squalen (der Firma Tokyo Kasei Co., Ltd., Japan) und Squalan (der Firma Katayama Kagaku Co., Ltd., Japan) wurden als Öle für die Herstellung des an öl gebundenem CWS von N. rubra verwendet.

Antigene; m-[4-(4'-Monophenylazo)phenyl]-N-acetyl~L-tyrosin (ABA-N-Acetyltyrosin) und ΑΒΑ-bakterielle a-Amylase (ABA-B-ccA) wurden nach dem in "J. Biol. Chem.", 238, 1726-1730 (1959), beschriebenen Verfahren hergestellt. Die bakterielle a-Amylase (vom VerflUssigungs-Typ, Charge Nr. E5X01), gereinigt, von Bacillus subtilis wurde von der Firma Seikagaku Kogyo Co., Ltd», Japan,bezogen.

Tympre: Leukemia EL4 von C57BL/6J-Mäusen, Mustocytoma Ρ8Ί5-Χ2 von DBA/2-Mäusen, Meth A von BALB/c-Mäusen, Fibrosarcom^ induziert durch 3-Methyl-cholanthren in C57BL/6J-Mäusen, bezeichnet als MC104, wurden verwendet. EL4, Mastocytoma P815-X2 und Meth A wurden serienmäßig aufrechterhalten durch Passage des Ascites

in jeweils syngenetischen weiblichen Mäusen. MC104 wurde serienmäßig aufrechterhalten durch subkutane Transplantation in syngenetischen Mäusen.

Mäuse; Die Mäuse, 6 bis 8 Wochen alte weibliche Mäuse von BALB/c, C578BL/6J und DBA/2 wurden erhalten von der Firma Shizuoka Jikken Dobutsu Nokyo, Shizuoka, Japan. Den Tieren wurde Futter (von der Firma Oriental Yeast Ind., Japan) und Wasser zur freien Verfugung gegeben*

Mediumlösungt Das Eagle-Minimal-Essential-Medium (MEM), das 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, wurde bezogen von der Research Foundation for Microbial Diseasis, Osaka University, Japan. Das Medium RPMI-I640 für die Gewebekultur

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wurde bezogen von der Firma Nissui Seiyaku Co«, Ltd., HJapaiT. Das Fötus-Kalbserum (Charge Nr. 4055722) v/urde von Flow Laboratories (Rockville, USA) bezogen und es wurde durch 30-minütiges Erhitzen vor der Verwendung auf 56 C inaktiviert« Direkter Zytotoxizitäts-Test; Eine Tumorzellen (MethA)-Suspension in einer MEM-Lösung wurde mit einer gleichen Volumenmenge an öl gebundenem CWS oder Öltröpfchen gemischt und 60 Minuten lang in einem eiskalten Wasserbad gehalten. Die Lebensfähigkeit der Tumorzellen v/urde durch den Eosin Y-Ausschlußtest bestimmte Bestimmung der Adjuvans-Aktivität bei der Induktion_der Hyper-Sensibilität vom verzögerten Typ; In die vier Fußpfoten von Meerschweinchen wurde eine primäre Immunisierung verabreicht unter Verv/endung einer Gesamtmenge von 50 μg ABA~N-Acetyltyrosin mit oder ohne das CWS von N₀ rubra in verschiedenen Trägerölen als Wasser-in-Öl-Emulsion«, Zwei Wochen später wurden Hauttests mit 100 μg ABA-BccA durchgeführt und die Reaktion wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach der intradermalen Injektion des Testantigens bestimmt«

Zellen-induzierter Zytotoxizitätstest; C57ßL/6J-Mäuse (H~2 ) wurden intraperitoneal immunisiert mit lebensfähigen Zellen von Mastocytoma P815-X2 (H<-2 ) mit oder ohne an Öl gebundenes CWS von Nf rubra. Am Ho Tage nach der Immunisierung v/urde der Zellen-induzierte Zytotoxizitätsversuch durchgeführt unter

. . 51

Verv/endung der Milzzellen von immunisierten Mäusen und von Crmarkiertem Mastozytoma PSl 5-X2-Zellen nach dem Verfahren von Brunner et al, "Immunology", 1_8/ 501-515 (1970), mit einigen Modifikationen (vgl. T. Taniyama et al, "Jpn₀ J« Microbiolo", ]9j 255-264 (1975)). Das Verhältnis zwischen den Milzzellen (Effektor-Zellen) und den Cr-markierten Mastocytoma P815-X2*=

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IS

Zellen (Target-Zellen)- betrug 100:1. Die Target-Zellen lysis wurde ausgedrückt in % der spezifischen Target-Zellenlysis unter Anwendung der folgenden Formel: % der spezifischen Target-Zellenlysis =

Freisetzung^ der spezifischen Target-Zellenlysis «„„ maximale Freisetzung - spontane Freisetzung

Die maximale Chromfreisetzung wurde gemessen durch vollständige Zellenlysis, wo nur Target~Zellen zweimal eingefroren und aufge» taut wurden.

HersteHunc; des an Öl gebundenen CWS yon N. rubra; Das.erstarrte (feste) Präparat des CWS von N. rubra wurde hergestellt wie in den nachfolgend angegebenen Ausfuhrungsbeispielen beschrieben»

Ergebnisse

Einfluß des mit verschiedenen Ölen behandelten CWS von N. rubra auf die Zellen-induzierte Zytotoxizität bei allogenetischen Hausen Das CWS von N. rubra wurde mit Squalen oder Drakeol 6VR behandelt und in einer 0,9 5&gen Kochsalzlösung suspendiert, die 0,2 % einer Tween 80-Lösung enthielt. C57B!_/6J-Müuse wurden mit einer Mischung von Mastocytoma-Zellen und Adjuvantien, wie oben angegeben, immunisiert. Wie in der folgenden Tabelle I angegeben, waren die Präparate von CWS von N. rubra, die mit Drakeol 6VR-Kochsalz, Squalen-Kochsalz oder Squalen-Mannit behandelt worden waren, eindeutig wirksam als Adjuvans für die Induktion der Effektor-Zellen in der Milz von allogenetischen Mäusen. Es wurde

auch gezeigt, daß die lyophilisierten Adjuvantien, die durch Zugabe von sterilisiertem Wasser vor der Verwendung wieder suspendiert wurden, ebenso wirksam waren wie die vor der Verwendung frisch hergestellten Adjuvantien.

Direkte Zytotoxizität für Tumorzellen

Wie in der folgenden Tabelle II angegeben, wiesen alle getesteten Präparate, welche das CWS von N. rubra enthielten, keine Zytotoxizität auf, v/enn diese Adjuvantien und Tumorzellen (MethA von BALB/c) 60 Minuten lang in einem Eiswasserbad gehalten wurden, das lyophilisierte Präparat von Squalen-0,9 % Kochsalzlösung, das 0,2 % Tween 80 enthielt, zeigte jedoch eine gewisse Toxizität gegenüber Tumorzellen. Das frisch hergestellte Präparat war unter den gleichen Bedingungen nicht zytotoxisch. Das lyophilisierte Präparat des CWS von N. rubra, das mit Squalen-Mannit behandelt v/orden war, v/ar nicht zytotoxisch.

Antitympr-Aktivität von an Öl gebundenem N. rubra-CWS Die Antitumor-Aktivität von N. rubra-CWS, das mit Squalen, Squalan oder Trakeol 6VR behandelt und in einer 5,6 /Jigen Kannit-Lösung, die 0,2 % Tween 80 enthielt, suspendiert worden war, wurde unter Verwendung von transplantierbaren Tumoren in syngenetischen Mäusen getestet. Wie in den folgenden Tabellen III, IV, V und VI angegeben, wiesen die Präparate von N. rubra — CWS, die mit verschiedenen Arten von Ölen behandelt v/orden waren, nahezu die gleiche Aktivität für die Unterdrückung des Tumorwachstums von EL 4-Leukäitiie, Meth A und MC 104 in den jeweiligen syngenetischen Mäusen auf* Wie in der Tabelle III angegeben, war die Unterdrückungsaktivität des CWS von N. rubra

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auf das Wachstum von tieth A bei BALB/c-Mäusen, v/ie gefunden wurde, nicht unterschiedlich zwischen einem frisch hergestellten Drakeol-Kochsalz-PrSparat und den Squalen-Mannit- oder Squalan-Mannit-Präparaten, die vor der Verwendung lyophilisiert und in sterilisiertem Wasser suspendiert worden waren.

Wirksamkeit der ölzusammensetzung auf die Hypersensibilität

vom verzögerten Typ bei Meerschweinchen '

Das CWS von N. rubra wurde in der Mischung aus öl ( wie z«B. Trakeol 6VR,.Squalen oder Squalan) und Arlacel A in einem Verhältnis von 85:15 suspendiert und dann mit einer Lösung von ABA-N-Acetyltyfosin mit oder ohne das Cl-JS von N. rubra als Wasser-iη-Öl-Emulsion gemischt* Die Meerschweinchen wurden durch intramuskuläre Injektion der obigen Mischung aus dem Adjuvans und dem Antigen immunisiert. Zwei Wochen später wurde der Hauttest mit ABA-BaA durchgeführt und die Hautreaktion wurde 24 und 48 Stunden nach der intradermalen Injektion des Testantigens bestimmt. Wie in der Tabelle VII angegeben, wurde eine positive Hautreaktion gegenüber ABA-BaA bei Meerschweinchen beobachtet, die mit ABA-N-Acetyltyrosin zusammen mit dem ClVS von N.rubra und Squalen oder Squalan sowie Drakeol 6VR als Wasser-in-01-Emulsion immunisiert worden waren.

Die bei den Tests erhaltenen Daten sind in den folgenden Tabellen angegeben*

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Tabelle I

Einfluß des an Öl gebundenen N. rubra-CWS auf die Zellenmodifizierte Zytotoxizität gegenüber Mastocytoma P815-X2 bei C57BL/6J-Mäusen

Die Mäuse wurden immunisiert mit: spez. Target-ZeHeηlysis [%}_

Mastocytoma P815-X2-Zellen (1x10 ) + N. rubra CWS-Squalen-Mannit + N. rubra CWS-Drakeol 6VR-Mannit + N. rubra CWS-Squalen-Kochsalz + N. rubra CWS=Drakeol 6VR~Kochsalz + Squalen-Mannit

+ Drakeol OVR-Nannit

+ Squalen-Kochsalz

+ Drakeol 6VR-Kochsalz

Mastocytoma P815~X2-Zellen (3x1O⁷) allein 87,9

*■ ·~'\—* Versuch 1	Versuch T*	•	16,8
64,2	41,1	67,5
-	58,3
50,4	-
26,9	28,4
8,2	14,1
-	8,7
2,3
0,7
in 87,9

Fußnote: Drei C57BI_/6J-Mäuse in jeder Gruppe wurden intraperitoneal mit einer Mischung von Mastocytoma-Zellen und an Öl gebundenem CWS von N. rubra immunisiert. 11 Tage später wurde die durch Zellen induzierte Zytotoxizität durch die Inkuba-

51 tion der Milzzellen aus immunisierten Mäusen und Crmarkierten Mastocytoma-Zellen in einem Verhältnis von 100:1 für einen Zeitraum von 20 Stunden bestimmt. Alle Versuche wurden doppelt durchgeführt.

Es wurden frisch hergestellte Adjuvantien verwendet.

Die lyophilisierten Materialien wurden vor der Verwendung durch Zugabe von sterilisiertem Wasser erneut suspendiert.

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-Mr-

Tabelle II

Direkte Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen (Meth A) von an Öl gebundenem N. rubra-CWS in vitro

Die Tumorzellen wurden gemischt mit:	Konzen-.· Lebensfähigkeit^) tration des CWS ' frisch her- Lyophi- von N.rubra gestelli lisiert	Drakeol 6VR- Kochsalz	mg/ml	90.0	89.7
N. rubra CWS-Squalen·-	2	MBM	4 mg/ml	88.8	85.0
Mannit..-	0.		mg/ml 4 mg/ml	92.3 87.9	87.0 . 91.7
N. rubra CliS-Squalen. Kochsalz	- 2 0.	mg/ml	86.7	85.8
N. rubra CWS-Drakeöl	2	4 mg/ml	86.4	84.7
6VR-Kochsalz	0.		83.3 .	■'87.1
oltröpfchen Squalcn - Mannit .-		-	75.7	45.5
Squalcn -Kochsalz		-	87.1	79.1
	100	100

Fußnote: Eine Tumorzellen (Meth A aus BALB/c~Mäusen)-Suspension (4 χ 10 /ml in MEM) wurde mit an öl gebundenem N. rubra-CWS oder oltröpfchen gemischt und 60 Minuten lang in einem Eiswasserbad gehalten und dann wurde die Lebensfähigkeit der Tumorzellen durch den Eosin Y-Ausschlußtest geprüft. Die Zahlenwerte geben die Prozentsätze der Lebensfähigkeit der Tumorzellen in der MEM-Lösung an.

QIT

Tabelle ΠΙ"-

Unterdrückung des Tumorwachstums (Meth A) mit an Öl gebundenem QiS von W. rubra in weiblichen BALB/c-Mäusen

Präparate"	frisch hergestellt Sl)	Lyo- philisiej b)
N. rubra CWS (100 μg) behandelt
mi ti -
Squalen	10/10	9/Iu⁰)
Squa3an · '	9/10	10/10
Di-akcül 6VR	10/10	—
Kontrolle (Öltröpfchen) ^:
Squalen ^:	"0/10	0/10
Squalan	0/10	0/10
Drakeol 6VR	0/1D	—

Fußnote: Eine Mischung von Tumorzellen (Meth A, 2 χ 10 ) und μg an Öl gebundenem CWS von N. rubra oder Öltröpfchen wurde intraderma.l in weibliche BALB/c-Mäuse inokuliert. Die Zahlenwerte geben die Ergebnisse 4 Wochen nach der Inokulation wieder.

N. rubra-rCWS, behandelt mit verschiedenen Ölen und suspendiert in einer 0,9 /Sigen Kochsalzlösung, die 0,2 % Tween 80 enthielt. Das Präparat wurde vor der Verwendung hergestellt;

N. rubra-CWS, behandelt mit verschiedenen ölen und suspendiert in 5,6 % Mannit, der 0,2 % Tween 60 enthielt, und lyophilisiert. Die Präparate wurden vor der Verwendung mit sterilisiertem Wasser erneut suspendiert;

Anzahl der tumorfreien Mäuse/Anzahl der getesteten Mäuse.

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~ J-θ .-

Tabelle IV

Unterdrückung des Tumorwachstums (Meth A) mit an Öl gebundenem OJS von R. rubra in BALß/c-Mäusen

•Präparate a)	Versuch	Nr. -
	0823	1108
N. rubi-a ClVS (100 pg) behandelt	mit: ··
Squalen -Mannitr	10/10	8/10^b)
Squalan -_Mannit	—	10/10
Drakeol 6VR-M.ann.it	10/10	10/10
Miglyol-Mannit -.	. 10/10	10/10
Kontrolle (öltröpfchen)
Squalen -.Muuiit.J	2/10	0/10
Squalan.- Mannit■	—	0/10
Drakeol 6VR-Mannit	0/10	0/10
Miglyol- Mannit-.	2/10	-" 0/10
MEM	0/10	0/10

Fußnote: Eine Mischung von durch 3-Methylcholanthren induziertem

Fibrosarkom (Meth A) (l χ 10^J) und 100 μg an Öl gebundenem CWS von N. rubra oder öltröpfchen wurde intradermal in weibliche BALB/c-Mäuse inokuliert. Die Zahlenwerte geben die Ergebnisse 42 Tage nach der Inokulation wieder. Die lyophilisierten Materialien wurden vor der Verwendung mit sterilisiertem Wasser erneut suspendiert; Anzahl der tumorfreien Mäuse/Anzahl der getesteten Mäuse.

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Tabelle V

Unterdrückung des Tumorwachstums (MCI04) mit an öl gebundenem CWS von N. rubra bei weiblichen C57ß!_/6J-Mäusen

Präparate ^a^	Versuch	Nr. ...
	0819	1109
N. rubra CWS (100 ug) behandelt	mit:
Squalen -Mannit . ·	6/10	10/10
Squalan -Mannit	—	10/10
Drakeol 6VR-Mannit	7/10	7/10
Miglyol-Mannit	7/10	10/10
Kontrolle (Öltröpfchen)
Squalen -Mannit	0/10	0/10
Squalan - Mannit	—	0/10
Drakeol 6VR-Mannit	0/10	0/10
Miglyol-Mannit.1	0/10	0/10

Fußnote: Eine Mischung von mit 3-Methylcholanthren induziertem Fibrosarkorn (MCI04) (ixiO ) und 100 μ9 Öl-gebundenem N. rubra-CWS oder öltröpfchen wurde in weibliche C57BI_/6J-Mäuse intradermal inokuliert. Die Zahlenangaben geben die Ergebnisse 42 Tage nach der Inokulation wieder. Die lyophilisierten Materialien wurden vor der Verwendung mit sterilisiertem V/asser wieder suspendiert; Anzahl der tumorfreien Mäuse/Anzahl der getesteten Mause.

zi

Tabelle

Unterdrückung'des TvmorwdöWsturns' (EL-4^LeUkämie) mit an öl gebundenem QJS von N; rubrd bei weiblichen C57BL/6J-Mäusen

: ^; \ Präparate". ^aJ

Versuch- .Mr. ■-0824 0830 0907

rub r a CWS ClOO yg). be handelt jnit;"

Squstlpn /-Mannit · 8/10 9/10, 7/10^b

Drajcopl 6VR-Mannit 5/10 7/10.5/10

Miglyol-.Mannit , 4/10 8/10 8/10.

(Öltröpfchen) _; · ■; ; _: ;

Squalen -Mannit ' ·_:0/1ΐ), -0/1,0 .0/10;..

DxafcoDl 6VR-Maimit ' 0/10 .0/10 0/10

Miglypl-Mannit - 0/10 0/10 O/IO

MEM ; ■;,'/,; ,0/10 O/lO^fl/10

Fußnote: Eine Mischung von EL-4-Leukämie-Zellen (l χ ΊΟ ) und 100 μg ν _{L :}/ iJlgebundenem CWS von N. rubra oder iJltröfpchen wurde ;-. hdntraaernial in weibliche €57BL/<5J-Mäuse inokuliert.

geben die Ergebnisse 28 Tage nach der

äön wieder· * ■ : .

a) b)

. fiieilyophiiisierten Materialien wurden vor der Verwendung mit"sterilisiertem Wasser wieder suspendiert; Anzahl der tumörfreien Mäuse/Anzahl der getesteten Mäuse. - -^; "

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Tabelle VII

Einfluß der Ö'lzusammensetzung auf die Hypersensibilität vom
verzb*gei*ten Typ gegenüber ABA~N~Acetyltyrosin bei Meerschweinchen

Die Meerschweinchen wurden immunisiert mit ADA-M-Äce- . ±.y 1 t-Yvo sin 7U s nmme η mi + ·	23	Hautreaktion gegenüber ABA- bakterieller a-Ämylasc
N. rubra CIfS (100 μβ)	20
in Drakeol 6VR- Arlaccl A (85:15)	18	.410.8^mm 25.7±0.7^mina)
in Squalen - Arlacel A (85:15)		.1±1.3 17.9+1.0
in Squalan· - Arlacel A (85:15)	.9+0.5- 16.6+0.6
Kontrolle fDrakeol 6VR- Arlaccl A (85:15)]	0 0

Fußnote: 5 Meerschweinchen in jeder Gruppe wurden mit 50 jig ABA-N-Acetyltyrosin mit oder ohne 100 μg QlS von N. rubra, suspendiert in verschiedenen Arten von öltra'gern als Wasser-in-öl-Emulsion^immunisiert· 2 Wochen nach der Immunisierung wurde der Hauttest mit 100 μg ABA-bakterieller c^-Amylase durchgeführt.

Durchschnittliche Hautreaktion (Verhärtung, mm im Durchmesser) + Standardabweichung.

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-.22'-

as

Das in den folgenden Beispielen verwendete Mocardia rubra» CWS wurde wie folgt hergestellt:

Noeardia rubra wurde in einem Medium, das 2 % Polypep'ton und

1 % Hsfeextrakte enthielt (pH 7,0) 3 Tage lang bei 30°C kultiviert (gezüchtet) und die Kulturbrühe (18 l) wurde filtriert. Etwa 400 g feuchtes Mycel wurden in 1 1 Wasser suspendiert und mit einer Dynomühle (0,1 bis 0,2 mm~Perlen, 3000 UpM,

2 l/Std.) 3 mal gemahlen. Die dabei erhaltene Substanz wurde abgepuffert (pH 7,5), mit Nukleinacidase (DN-ase und RN-ase) 30 Minuten lang behandelt und dann zentrifugiert (800 χ g, 15 Minuten). Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt und weiter zentrifugiert (i0 000 bis 20 000 χ g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden gesammelt und in 1 1 Aceton suspendiert und 24 Stunden lang gerührt. Die Niederschläge wurden durch Filtrieren gesammelt, in 2 % Triton X-100 (l l) suspendiert, 24 Stunden lang gerührt und dann zentrifugiert (i0 000 bis 20 000 χ g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden erneut mit Triton X-100 auf die gleiche Weise wie vorstehend angegeben behandelt. Die dabei erhaltenen Niederschläge wurden mit einer Mischung (i l) von Äthanol und K'asser (i:l) und danach zweimal mit 1 1 Wasser gewaschen und zentrifugiert (i0 000 bis 20 χ g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden in Veronal-Puffer (pH 9,5) suspendiert, mit Pronase (50 mg) unter Rühren bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von 24 Stunden behandelt und dann zentrifugiert (l0 000 bis 20 000 χ g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden mit 1 1 Wasser 3 mal gewaschen und zentrifugiert (10 000 bis 20 000 χ g, 30 Minuten). Die Niederschläge wurden mit einer Mischung (l l) von Diäthyläther und Äthanol (l:i) gewaschen, unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur 3 Tage lang

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getrocknet, puverisiert und dann gesiebt, 125 μπι), wobei ein feines Pulver von N. rubra~CWS (etwa 7 g) erhalten wurde»

Das erstarrte (feste) erfindungsgemäße Mittel (Zubereitung) wurde in sterilisiertem Wasser wieder suspendiert und intrapleural, intralesional, intradermal_f subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal in einer Einzeldosis von 10 bis 2000 μg_/ vorzugsweise von 100 bis 200 μg CWS an Patienten verabreicht.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, " ohne sie jedoch darauf zu beschränken*

Beispiel 1

N. rubra-CWS 4 mg

Miglyol 2 Tropfen

5,ό %ige Mannitol-Lösung, enthaltend 0,2 % Tween 80 1 ml

Das CWS von N. rubra (140 mg) wurde in einen Gewebehomogenisator eingeführt, der mit einem Teflon-Pistill (der Firma Takashima Shoten Co., Ltd., Japan) ausgestattet war. Miglyol (70 Tropfen) wurden mittels einer 27 Gauge~Injektionsnadel einer Spritze dem CWS zugesetzt und diese Mischung wurde mit 1000 UpM zu einer glatten Paste gemahlen. Dann wurde eine 5,6 7&ge wäßrige Mannit-Lösung (35 ml), die 0,2 % Twoen 80 enthielt, zu der Paste zugegeben und das Mahlen wurde fortgesetzt, bis eine gleichmäßige Suspension von kleinen Öltröpfchen, die an CWS von N. rubra assoziiert waren, erhalten wurde. Zur Herstellung des lyophilisierten Materials wurde die an Öl gebundene Suspension von

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Th

N. rubra-CWS in 35 Phiolen (mit einem Volumen von 10 ml) überführt, unter Verwendung von flüssigem Stickstoff schnell ausgefroren und dann bei Raumtemperatur lyophilisieyt. Zur Herstellung einer Suspension vor der Verwendung wurde 1 ml sterilisiertes Wasser dem lyophilisierten Material zugesetzt.

Beispiel 2

N." rubra-CWS 4 mg

Drakeο1-6VR 2 Tropfen

5,6 /Sige liannit-Lösung, enthaltend 0,2 % Tween 80 1 ml

Anstelle des in dem obigen Beispiel 1 verwendeten Miglyols wurde Drakeol-6VR verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man ein erstarrtes (festes) Präparat (Mittel) erhielt.

Beispiel 3

N-rubra-CWS 4 mg

Squalen 2 Tropfen

5,6 Jöige Mannit-Lösung, die

0,2 % Tween 80 enthielt 1 ml

Anstelle des in dem obigen Beispiel 1 verwendeten Miglyol wurde Squalen verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man eine erstarrte (feste) Zubereitung (Mittel) erhielt.

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Beispiel 4

N. rubra-CWS 4 mg

Vitamin A-Palmitat 2 Tropfen

5,6 %ige Mannit-Lösung, die 0,2 % Tv/een 80 enthielt 1 ml

Anstelle des in dem Beispiel 1 verwendeten Miglyols wurde Vitamin A-Palmitat verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man ein erstarrtes (festes) Präparat (Mittel) erhielt·

Beispiel 5

N.rubra-CWS 4 mg

Miglyol 2 Tropfen

5,6 %ige Glukose-Lösung, die ' '

0,2 % Tween 80 enthielt 4 ml

Anstelle der in Beispiel 1 verwendeten 5,6 ^igen wäßrigen Mannit-Lösung wurde eine 5 /äge wäßrige Glukoselösung verwendet und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man ein erstarrtes (festes) Präparat (Mittel) erhielt.

Das Produkt "Miglycol" wird von der Firma Dynamit Nobel vertrieben. Bevorzugt ist "Miglycol 812".Es handelt sich um ein neutrales Öl, das ein Gemisch von Triglycerinen von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren mittlerer Kettenlänge ist. Die Säurezahl beträgt maximal 0,1; Verseifungszahl 325 bis 345; Jodzahl maximal 1; Jodfarbzahl maximal 2,0; Dichte bei 20⁰C 0,94 bis 0,96; Viskosität bei 20⁰C 28 - 32cP; Refraktion bei 20⁰C 21,448 bis 21,450.

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Drakeol 6VR ist im einzelnen u.a. beschrieben in lyakuhin Kaihatsu Kiso Koza XI, Yakuzai Seizoho (last volume), page 599, (published by Chijin Shokan in Tokyo). Es handelt sich um ein flüssiges Paraffin. Eine ähnliche Zusammensetzung hat das Produkt Bayol F.

Die für das Zellwand-Gerüst verwendete Abkürzung "CWS" ist abgeleitet von der englischen Bezeichnung "cell wall skeleton" von Mikroorganismen.

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Claims

51 595-Dr.T Anmelder;

1. YuicM Yamamura, 1-9-22, Nikawatakadai, Takarazuka, Japan

2. Ichiro Azuma, 1-2, Aoyamadai, Suita, Japan

3. Katsusuke Ennyu, 2-27, Besshoshinmachi, Takatsuki, Japan

4. Osamu Aoki, 2-3-5-302, Hibarigaoka, Takarazuka, Japan

Patentansprüche

1 · Verfestigtes (festes) pharmazeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet _r daß es besteht aus oder enthält ein Mikrobensellwand-Gerüst mit Adjuvans- und Antitumor-Aktivitäten, ein Trägeröl, ein Suspendiermittel und ein Dispergiermittel·

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zellwandgerüst um dasjenige handelt, das vom Genus Nocardia gewonnen wurde.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägeröl um ein tierisches öl, ein pflanzliches öl, ein Mineralöl oder ein halbsynthetisches Öl davon handelt.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägeröl um Drakeol 6VR, Squalen^ Squalan, Miglyol oder Vitamin A-Palmitat handelt.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Suspendiermittel um einen Polyalkoholester handelt.

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6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Suspendiermittel um einenPolyoxyäthylensorbitanester handelt.

7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Dispergiermittel um Zucker oder einen Zuckeralkohol handelt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Dispergiermittel um Mannit, Sorbit oder Glukose handelt.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus oder enthält das Zellwand-Gerüst von Nocardia rubra, ein tierisches öl,einen Polyoxyäthylensorbitanester und Zuckeralkohol.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus oder enthält das Zellwand-Gerüst von Nocardia rubra, Squalen, Polyoxyäthylensorbitanmonooleat und Mannit«

11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt worden ist durch Lyophilisieren einer Suspension, die besteht aus oder enthält das Zellwand-Gerüst, das Trägerb'l, das Suspendiermittel und das Dispergiermittel.

12. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es hergestellt worden ist durch Lyophilisieren einer Suspension, die besteht aus oder enthält das Zellwand-Gerüst von Nocardia

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rubra, Squalen, Polyoxyäthylensorbitanmonooleat und Mannit.

13. Verfahren zur Herstellung eines verfestigten (festen) pharmazeutischen Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension lyophilisiert, die besteht aus oder enthält das Mikrobenzellwand-Gerüst, ein Trägeröl, ein Suspendiermittel und ein Dispergiermittel.

14. Verwendung einer Zubereitung (Komposition) gemäß Ansprüchen 1 Ms 13 zur Herstellung einer injizierbaren Suspension.