CN1290171A - 用于治疗膀胱癌的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物和方法,用于治疗膀胱内的癌症。更确切地说,本发明涉及组合物,该组合物包含一种草分枝杆菌脱氧核糖核酸(M－DNA)－草分枝杆菌细胞壁复合物(MCC)和一种药学上可接受的载体,其中该M－DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的。该MCC组合物能抑制动物膀胱内的癌细胞增殖和诱发细胞程序死亡。

Description

用于治疗膀胱癌的组合物和方法

发明领域

本申请引用1998年2月18日提交的美国临时申请60／075111作为参考文献，并要求保护它的全部利益。

本发明包含一种分枝杆菌脱氧核糖核酸(B-DNA)-分枝杆菌细胞壁复合物(BCC)，其中该B-DNA是保存和复合在细菌细胞壁上的，使BCC能有效地治疗膀胱癌。更确切地说，本发明包含一种草分枝杆菌(Mycobacterium Phlei(M．phpei))-DNA(M-DNA)-草分枝杆菌细胞壁复合物(MCC)，其中该M-DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的，使MCC能有效地抑制膀胱癌细胞的增殖和诱发细胞程序死亡。

发明背景

癌症是非典型细胞的一种异常净蓄积，其原因可以是过度增殖、细胞程序死亡不充分、或二者兼而有之。细胞程序死亡是由与细胞表面上的受体结合的配体起始的(Muzio等《细胞》85：817-827，1996)。这些受体的突变可导致细胞程序死亡的失败。细胞程序死亡也可以由细胞内蛋白包括但不限于p53／p21调节物所诱发(Levine A．《细胞》88：323-331，1997)。功能性p53／p21的丧失与各种癌症的侵占有关(Fisher D．《细胞》78：529-542，1994)。化疗剂主要依靠诱发癌细胞的细胞程序死亡来发挥其治疗作用。耐药性，降低化疗剂的效力，直接或间接地减少了细胞程序死亡，一般与各种癌症预后不良有关。

膀胱癌是特别难以治疗成功的(Lamm等《泌尿科学杂志》153：1444-1450，1995)。用于治疗膀胱癌的细菌来源的制剂包括但不限于卡介苗(BCG)(Pryor等《英国癌症杂志》71：801-807，1995)和Regressin(Bioniche，Inc．London，Ontario，Canada)、配制成矿物油乳剂的分枝杆菌细胞壁提取物(MCWE)(美国专利4744984；Chin等《泌尿科学杂志》156：1189-1193，1996)。

BCG不直接诱发细胞程序死亡(Sasaki等《国际泌尿科学》59：142-148，1997)。反而，BCG刺激免疫系统细胞产生生物活性分子，例如但不限于细胞活素和活性氧(Kudoh等《英国泌尿科学杂志》80S2：40，1997)，后者再诱发细胞程序死亡和细胞溶解。

MCWE，主要由含有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺和分枝菌酸衍生物的肽聚糖和糖脂组成(Chin等《泌尿科学杂志》156：1189-1193，1996)，被认为是通过激活巨噬细胞和单核细胞介导的反应而刺激免疫系统的(Teware等《兽医寄生物学》62：223-230，1996)。

利用BCG和MCWE所得到的治疗效果是可变的和不一致的，似乎取决于制备方法与释放方法和免疫原性的可变性与所得制剂的稳定性。而且，活体BCG可能导致严重的副作用，包括但不限于发热、血清病样综合征、肉芽肿性感染、脓毒症甚至死亡(Lamm等《泌尿科学杂志》147：596-600，1992)。

其他现有技术中的抗膀胱癌剂也已证实不适合于临床应用。这些试剂中很多是无效的或有毒的，具有明显的副作用，导致耐药性或免疫致敏作用的发展，使接受者衰弱。此外，这些试剂中的很多试剂的效力依赖于配体表面受体或p53／p21。

因此，需要一种新颖的治疗剂，可抑制膀胱癌细胞的增殖和诱发细胞程序死亡。这种治疗剂作为抗膀胱癌细胞剂和其他抗膀胱癌细胞剂的附属物应当是有效的。所述附属物的含义是与其他抗膀胱癌细胞剂一起能增加疗效。此外，就制备而言，这样的一种治疗剂应当是简单的和相对廉价的，其活性在制剂中应当是可再现的，经过一定时间后其活性应当保持稳定，且其对膀胱癌细胞的作用在具有最低毒性的剂量供应方案下是可达到的。

发明概述

本发明通过提供一种组合物和方法满足了上述需要，该组合物包含一种分枝杆菌脱氧核糖核酸(B-DNA)-分枝杆菌细胞壁复合物(BCC)，其中该B-DNA是保存和复合在细菌细胞壁上的，使BCC能有效地治疗膀胱癌细胞。更确切地说，本发明通过提供一种草分枝杆菌-DNA(M-DNA)-草分枝杆菌细胞壁复合物(MCC)满足了上述需要，其中该M-DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的，使MCC能有效地抑制膀胱癌细胞的增殖和诱发细胞程序死亡。就制备而言，MCC是简单的和相对廉价的，其活性在制剂中是可再现的，经过一定时间后其活性仍能保持治疗学上的稳定，即使反复给药，在最低毒性的剂量供应方案下也是有效的。

为了制备MCC，使草分枝杆菌生长在液体培养基中，再加以收获。将草分枝杆菌破裂，通过离心沉降收集破裂后的草分枝杆菌的固体组分。将固体组分脱蛋白、脱脂并洗涤。不含脱氧核糖核酸酶的试剂可用于减少制备过程中M-DNA的降解。

MCC，和一种药学上可接受的载体结合，可以足够预防、治疗和消除膀胱内的癌细胞的剂量，对动物、包括人给药。MCC抑制膀胱癌细胞的增殖和诱发细胞程序死亡这一意外的和令人惊奇的能力，满足了医学领域中长期未实现的需要，提供了重要的有益效果，其中膀胱癌细胞包括但不限于p52／21异常的和耐药性的细胞。

MCC作为提高其他抗癌剂效力的一种附属物也是有效的。所述抗癌剂，包括但不限于药物；免疫刺激剂；抗原；抗体；疫苗；放射线；化疗剂；核酸试剂；生物工程剂；化学合成剂；以用于活化或灭活的细胞死亡分子为目标的试剂；和抑制效应细胞增殖和诱发细胞程序死亡的试剂。

因此，本发明的一个目的是提供一种有效预防膀胱癌的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种有效治疗膀胱癌的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种有效消除膀胱癌的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种抑制膀胱癌细胞增殖的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种诱发膀胱癌细胞的细胞程序死亡的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种刺激膀胱内的免疫系统效应细胞产生生物活性分子的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种有效抑制膀胱癌血管生成的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种有效作为其他抗膀胱癌疗法的附属物的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供一种最适合被效应细胞识别的具有一定粒径和配方的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种最适合被效应细胞摄取的具有一定粒径和配方的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种能够被大量制备的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种可相对廉价制备的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种在制剂中具有可再现活性的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种经过一定时间后保持稳定的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种经过一定时间后保持其效力的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种对接受者毒性最低的组合物。

本发明的这些和其他目的、特征和优点在下列所公开的实施方式和所附加的权利要求书的详细说明之后将变得显而易见。

附图的简要说明

图1：MCC对HT-1376、HT-1197、B-16 F1、THP-1、RAW 264．7、Jurkat、HL-60和HL-60 MX-1癌细胞增殖的抑制作用。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图2：草分枝杆菌-DNA(2A)、MCC-DNA(2B)、小牛胸腺-DNA(2A&2B)和鲱鱼精液-DNA(2A&2B)对HT-1376、HT-1197、B-16 F1、THP-1、RAW 264．7、Jurkat、HL-60和HL-60 MX-1膀胱癌细胞增殖的抑制作用。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图3：MCC和LPS对HT-1197(3A)和HT-1376(3B)人膀胱癌细胞增殖的抑制作用。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图4：未处理的与用脱氧核糖核酸酶I处理过的MCC和hIL-12对HT-1197(4A)和HT-1376(4B)人膀胱癌细胞DNA断裂的诱发作用。所示结果为3次实验之一，每次得出近似结果。

图5：NuMA从具有高浓度MCC的HT-1197和HT-1376人膀胱癌细胞中的释放。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图6：NuMA经过48小时从具有1μg／ml MCC或100μg／ml MCC的HT-1197(6A)和HT-1376(6B)人膀胱癌细胞中的释放。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图7：NuMA从具有1μg／ml未处理的和用脱氧核糖核酸酶I处理过的MCC-DNA和MCC的HT-1376人膀胱癌细胞中的释放。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图8：HT-1197和HT-1376人膀胱癌细胞的LDH释放百分率作MCC细胞毒性的标记。结果是3次独立实验的平均值±SD。

图9：MCC在6个月贮藏过程中的稳定性。

发明的详细说明

本发明包含一种细菌脱氧核糖核酸(B-DNA)-细菌细胞壁复合物(BCC)，其中该B-DNA是保存和复合在细菌细胞壁上的，使该复合物能有效地预防、治疗和消除动物、包括人膀胱内的癌细胞。

很多菌种可以用于实施本发明，包括但不限于棒状菌种(Coryneform species)、棒杆菌种(Corynebacterium species)、红球菌种(Rhodococcus species)、真杆菌种(Eubacterium species)、博德特氏菌种(Bordetella species)、埃希氏菌种(Escherichiaspecies)、利斯特氏菌种(Listeria species)、诺卡氏菌种(Nocardia species)和分枝杆菌种(Mycobacterium species)。优选使用的分枝杆菌种包括但不限于耻垢分枝杆菌(M．smegmatis)、偶发分枝杆菌(M．fortuitum)、堪萨斯分枝杆菌(M．kansaasii)、结核分枝杆菌(M．tuberculosis)、牛分枝杆菌(M．bovis)、母牛分枝杆菌(M．vacciae)、鸟分枝杆菌(M．avium)和草分枝杆菌。最优选使用的是分枝杆菌种中的草分枝杆菌。

因此，更确切地说，本发明包含一种草分枝杆菌脱氧核糖核酸(M-DNA)-草分枝杆菌细胞壁复合物(MCC)，其中该M-DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的，使MCC能有效地抑制、治疗和消除膀胱内的癌细胞。在MCC内，M-DNA的量相对于完整草分枝杆菌细胞内的M-DNA量是富足的。进而，M-DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的，使其比完整草分枝杆菌细胞内的M-DNA更易受应答细胞的影响。据信，以短链低聚核苷酸形式的M-DNA及其与草分枝杆菌细胞壁的物理缔合作用都有助于MCC治疗活性的最佳表现，不过并不希望受到这一假设的局限。

增加MCC治疗活性的方法包括但不限于化学方法补加或生物工程方法扩增来源于相同或不同菌种的DNA的刺激序列或构象(原文为confirm ation)，和将M-DNA或MCC复合到天然或合成载体上。进而，MCC可以在另一种抗膀胱癌剂之前、与之同时或之后给药，以增加治疗效力。

制备包含MCC及其药学上可接受的载体的组合物的方法是，使MCC与液体载体、固体载体或这两种载体均匀和紧密地缔合。液体载体包括但不限于含水载体、不含水载体或这两种载体。固体载体包括但不限于生物载体、化学载体和生物工程载体。

MCC在其药学上可接受的载体内可以以下列方式：含水混悬液、油乳剂、油包水乳剂、水包油包水乳剂、脂质体、微粒子、部位特异性乳剂、长效乳剂、粘性乳剂、微乳剂、毫微乳剂、微球、毫微球、毫微粒子、微药泵，并与各种天然或合成聚合物一起给药，实现MCC的持续释放。进而，MCC可以与任意一种、全部或任意组合的赋形剂一起使用，而与用于向应答细胞提供MCC的载体无关。赋形剂包括但不限于抗氧化剂、缓冲剂和制菌剂，还可以包括悬浮剂和增稠剂。

优选地，MCC以含水混悬液的方式给药。将MCC悬浮在一种药学上可接受的载体中，例如但不限于不含脱氧核糖核酸酶的水、盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，用声处理进行乳化。可选地，乳化后的混合物用微流化作用进行均化。例如，将冻干的MCC悬浮在不含脱氧核糖核酸酶的水中，在20％输出功率下声处理5分钟(W-385型声处理仪，Heat Systems-Ultrasonics公司)。将声处理后的组合物用微流化作用在流通式、15000-30000psi下(M-110Y型；Microfluidics，Newton，MA)均化。混合物在无菌条件下处理或者最后进行灭菌。

对在不含水的载体内给药来说，将MCC用一种矿物油或中性油乳化，例如但不限于甘油二酯、甘油三酯、磷脂、类脂、油和它们的混合物，其中的油含有适当的多不饱与饱和脂肪酸的混合物。实例包括但不限于大豆油、低芥酸菜子油、棕榈油、橄榄油和myglyol，其中脂肪酸的碳数在12与22之间，其中该脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。可选地，可以将带电类脂或磷脂悬浮在中性油中。例如，向不含脱氧核糖核酸酶的甘油三酯大豆油中加入不含脱氧核糖核酸酶的磷脂酰胆碱，加入比例是向20ml甘油三酯中加入1克磷脂，然后慢慢地在50-60℃下加热使其溶解。向干燥的压热处理过的容器中加入几克MCC，加入磷脂-甘油三酯溶液，加入的浓度是20ml含1克MCC。将混悬液在20℃下恒温60分钟，然后与不含脱氧核糖核酸酶的PBS混合，混合比例是每升PBS加20ml MCC混悬液。将混合物在20％输出功率下用声处理法乳化5分钟(W-385型声处理仪，HeatSystems-Ultrasonics公司)。可选地，将乳化后的MCC混合物用微流化作用在流通式、15000-30000psi下(M-110Y型；Microfluidics)均化。再将MCC乳剂转移至压热处理过的、贮藏在4℃下的带盖瓶子内。

MCC粒子的大小应当最适合被效应细胞识别和摄取。优选地，MCC粒子的平均直径在约10与约10000nm之间，更优选在约100与约1000nm之间，最优选在约250与约600nm之间。

MCC的M-DNA含量优选在约0．001与约90mg／100mg干MCC之间，更优选在约0．01与约40mg／100mg干MCC之间，最优选在约0．1与约30mg／100mg干MCC之间。另外，也优选蛋白质含量低于约2mg／100mg干MCC，其脂肪酸含量低于约2mg／100mg干MCC。我们意外地发现，干重MCC的至少约3．6％是可提取的M-DNA。

MCC和／或M-DNA的给药量应有效诱发膀胱效应细胞的治疗应答。MCC和／或M-DNA的给药剂量将取决于所治疗的疾病状态、特定的配方和其他临床因素，例如接受者的体重与状态以及给药途径。优选地，MCC和／或M-DNA的给药量从约0．00001至约100mg／kg每剂，更优选从约0．0001至约50mg／kg每剂，最优选从约0．001至约10mg／kg每剂。

给药途径包括但不限于口服、静脉内、损伤部位内(intra-lesional)、肿瘤内和膀胱内。优选地，MCC和／或M-DNA通过滴注到膀胱内给药，利用但不限于泌尿道导管。其他用于将MCC和／或M-DNA滴注到膀胱内的方法是本领域技术人员已知的。

根据给药途径的不同，每剂体积优选为约0．001至约100ml，更优选为约0．01至约70ml，最优选为约0．1至约40ml。根据给药方案和适合于所治疗疾病的时间、接受者的状态和给药途径，MCC和／或M-DNA可以分单剂或多剂给药。

当向膀胱内给药时，根据给药体积的不同，制剂应当在膀胱内停留的时间优选从约1分钟至约8小时，更优选从约15分钟至约4小时，最优选从约30分钟至约2小时。

下列实施例将起到进一步阐述本发明的作用，不过与此同时不构成对本发明的任何限制。相反，可清楚地理解的是，本领域技术人员在阅读本说明书之后，在不背离本发明精神和／或所附加的权利要求书范围的前提下，可以采取各种其他不同的实施方式、变更和等效方式。

实施例1

从草分枝杆菌制备MCC和从MCC与草分枝杆菌纯化M-DNA

如专利申请PCT／CA981／00744所述，从草分枝杆菌(110株)制备MCC，从MCC纯化M-DNA(MCC-DNA)，从草分枝杆菌纯化M-DNA(草分枝杆菌-DNA)。所有的试剂都经过选择以提高DNA的保存。除非另有所述，将MCC、MCC-DNA和草分枝杆菌-DNA再悬浮在不含脱氧核糖核酸酶的水或一种药学上可接受的不含脱氧核糖核酸酶的缓冲剂中，通过声处理进行乳化。按利用鲎阿米巴样细胞溶解产物QCL-1000试剂盒(BioWhittaker，Walkersville，MD)的测定，MCC、MCC-DNA和草分枝杆菌-DNA不含有内毒素。

实施例2

从其他菌种制备细菌-DNA-细菌细胞壁复合物和细菌DNA

如实施例1所述，从耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)、堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌制备细菌DNA-细菌细胞壁复合物(BCC)和细菌-DNA(B-DNA)。

实施例3

脱氧核糖核酸酶处理

在25℃下，在20mM Tris HCl、pH 8．4、2mM MgCl₂和50mM KCl中，将各含有1μg M-DNA的MCC-DNA与MCC和Regressin(美国专利4744984)用1国际单位(IU)不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I(Life Technologies)消化1小时。灭活脱氧核糖核酸酶I的方法是加入EDTA至最终浓度为2．5mM，在65℃下加热10分钟。

实施例4

细胞和试剂

从美国典型菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD)得到HT-1197和HT-1376人膀胱癌细胞?????(原文在细胞一词后所注)，在MEM中培养，MEM中补充有非必需氨基酸和维生素，并含有10％FCS(MEM-FCS)(Gibco Life Science)。HT-1197是男性退行发育的过渡型膀胱癌4级细胞。HT-1197细胞对例如但不限于阿霉素的化疗剂是敏感的。HT-1376是女性退行发育的过渡型膀胱癌3级细胞。HT-1376细胞是p53／p21异常的，对例如但不限于顺铂和丝裂霉素的化疗剂是耐受的。从ATCC得到B-16 F1、THP-1、RAW 264．7、Jurkat、HL-60和HL-60 MX-1细胞，在ATCC推荐的培养基中培养。除非另有所述，将细胞接种在6孔平底组织培养皿中，浓度在3x10⁵与10⁶个细胞／ml之间，并保持在37℃和5％CO₂气氛下。

从Sigma Chemical公司(St．Louis，MO)得到小牛胸腺-DNA、鲱鱼精液-DNA和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)脂多糖(LPS)。从R&D Systems(Minneapolis，MN)得到重组人IL-12(hIL-12)。

实施例5

对细胞增殖的抑制作用

利用溴化二甲基噻唑-二苯基四唑鎓(MTT)还原反应测定细胞增殖(Mosman等《免疫学方法杂志》65：55-63，1983)。

将HT-1376、HT-1197、B-16 F1、THP-1、RAW 264．7、Jurkat、HL-60和HL-60 MX-1细胞用0至10μg／ml MCC、草分枝杆菌-DNA、MCC-DNA、鲱鱼精液-DNA和小牛胸腺-DNA培养24小时。MCC(图1)、草分枝杆菌-DNA(图2A)和MCC-DNA(图2B)以依赖于剂量的方式抑制增殖。鲱鱼精液-DNA(图2A&2B)和小牛胸腺-DNA(图2A&2B)不抑制增殖。HT-1197(图3A)和HT-1376(图3B)细胞也用0至100μg／ml MCC和LPS培养24小时。MCC以依赖于剂量的方式抑制增殖，而LPS不抑制增殖(图3A&3B)。

MCC和M-DNA抑制HT-1197和p53／p21异常的、耐药性HT-1376膀胱癌细胞的增殖。进而，细胞增殖的抑制作用不为所有的DNA(鲱鱼精液-DNA和小牛胸腺-DNA)所共有，而且不是由非特异性免疫刺激作用(LPS)引起的。

实施例6

对表现为DNA断裂的细胞程序死亡的诱发作用

细胞DNA断裂为核小体大小的片段是细胞经历细胞程序死亡的特征(Newell等《自然》357：286-289，1990)。为了判定DNA断裂，通过以200g离心10分钟收集非粘连细胞。将非粘连细胞颗粒物和其余的粘连细胞用0．5ml低渗溶解缓冲剂(10mM Tris缓冲剂，1mMEDTA，0．2％Triton X-100，pH 7．5)溶解。溶解产物以13000g离心10分钟，将含有断裂后的DNA的上清液在-20℃的50％异丙醇与0．5MNaCl中沉淀过夜。离心收集沉淀，再通过100V、在0．7％琼脂糖凝胶中电泳3小时进行分析。

HT-1197和HT-1376膀胱癌细胞用1μg／ml MCC或1ng／ml hIL-12培养48小时(图4)。MCC诱发非粘连的HT-1197(图4A，道2)和HT-1376(图4B，道2)细胞显著的DNA断裂，但不诱发粘连的HT-1197(图4A，道3)和HT-1376(图4B，道3)细胞。PBS(图4A&4B，道5)、hIL-12(图4A&4B，道4)和用脱氧核糖核酸酶I处理过的MCC(图4A&4B，道7)不诱发非粘连的HT-1197或HT-1376细胞的DNA断裂。未处理的细胞(图4A&4B，道1)显示没有DNA断裂。123-bp DNA梯状物(Gibco Life Science)用于测定核小体大小的DNA片段(图4A&4B，道L)的分子量。

MCC诱发HT-1197和HT-1376膀胱癌细胞的细胞程序死亡，而用脱氧核糖核酸酶I处理过的MCC不诱发这些细胞的细胞程序死亡。这暗示M-DNA的完整低聚核苷酸结构是诱发细胞程序死亡所必需的。hIL-12不诱发HT-1197或HT-1376细胞的细胞程序死亡。

实施例7

对表现为核有丝分裂蛋白器(NuMA)的增溶作用的细胞程序死亡的诱发作用

由NuMA增溶作用和释放导致的明显的细胞核形态学改变是细胞程序死亡的特征。利用商品ELISA(Calbiochem，Cambridge，MA)测定NuMA从培养细胞中的释放，以单位／ml(U／ml)表示(Miller等《生物工程》15：1042-1047，1993)。

用0至100μg／ml MCC培养48小时的HT-1197和HT-1376膀胱癌细胞，以剂量相关的方式释放NuMA(图5)。用1μg／ml或100μg／ml MCC培养48小时的HT-1197(图6A)和HT-1376(图6B)细胞显示，NuMA在24小时内的释放增加了。用MCC和MCC-DNA培养48小时的HT-1197细胞显示，用MCC培养过的细胞的NuMA释放显著大于用MCC-DNA培养过的细胞(图7)。MCC和MCC-DNA的脱氧核糖核酸酶I处理显著减少了NuMA的释放(图7)。

MCC诱发HT-1197和HT-1376膀胱癌细胞的细胞程序死亡既是依赖于时间的又是依赖于剂量的。据信，M-DNA的低聚核苷酸结构和草分枝杆菌细胞壁上M-DNA的呈现对优化诱发细胞程序死亡来说都是重要的，不过并不希望受到这一假设的局限。

实施例8

MCC的细胞毒性

细胞毒性是以质膜完整性的丧失和胞质酶的释放为特征的，胞质酶例如但不限于LDH(Phillips等《疫苗》14：898-904)。

为了判定MCC的细胞毒性，将HT-1197和HT-1376人膀胱癌细胞用0至100μg／ml MCC或溶解缓冲剂(10mM Tris，1mM EDTA，0．2％Triton X-100，pH 7．5)培养48小时，溶解缓冲剂用作总LDH释放的对照(Filion等《生物化学与生物物理学学报》1329：345-356，1997)。利用工业测定法(Sigma-Aldrich)测定LDH。MCC没有细胞毒性(图8)，证明MCC直接作用于HT-1197和HT-1376膀胱癌细胞，从而抑制增殖和诱发细胞程序死亡。

实施例9

nu／nu小鼠内人膀胱癌的MCC和MCC-DNA治疗

在免疫缺陷的无胸腺裸鼠(nu／nu小鼠)的皮下组织内以一种异位固体肿瘤建立人膀胱癌(HT-1197)，将小鼠分成5组。第1组仅接受载体。第2组接受MCC。第3组接受用脱氧核糖核酸酶I处理过的MCC。第4组接受MCC-DNA。第5组接受用脱氧核糖核酸酶I处理过的MCC-DNA。在治疗前和4周治疗过程中的每周测量癌块质量。第2组小鼠和第4组小鼠显示癌块消退。第1、3和5组小鼠没有显示癌块消退。

实施例10

人膀胱癌的MCC治疗

将十名3期同位膀胱癌患者分成2组。第1组每周接受MCC的膀胱内滴注，共8周。第2组接受标准化疗法治疗。第1组患者显示膀胱癌显著消退，没有报告使人衰弱的副作用。第2组患者显示膀胱癌微弱消退，报告显著的使人衰弱的副作用。

实施例11

MCC稳定性

将1mg／ml MCC作为0．85％w／v NaCl中的无菌混悬液贮藏在4℃暗处或6个月。利用光子关联能谱法(N4 Plus，Coulter Electronics公司)计算平均粒径。将MCC混悬液用0．85％w／v NaCl稀释至粒子计数率在5x10⁴与10⁶个／秒之间。利用下列条件以粒度分布处理器模式(SDP)计算平均粒径：流体折射率1．33，温度20°(原文记载∞)C，粘度0．93厘泊，测量角度90．0°(原文记载∞)，抽样时间(sampletime)10．5μs，样品运行时间100秒。利用下列条件以Delsa 440SX(Coulter Electronics公司)测量电位，即粒子与本体溶剂之间的流体力学界面上的电荷：电流0．7mA，频率范围500Hz，温度20°(同上∞)C，流体折射率1．33，粘度0．93厘泊，介电常数78．3，电导率16．7ms／cm，接通持续时间(on time)2．5秒，停止时间(off time)0．5秒，样品运行时间60秒。

如图9所示，MCC电荷和MCC直径在6个月的贮藏过程中保持相对稳定。而且，MCC刺激产生IL-12的作用和诱发THP-1单核细胞程序死亡的作用在6个月的贮藏过程中保持稳定。

当然，不言而喻的是，前述内容仅仅涉及本发明优选的实施方式，在不背离如所附权利要求书阐明的本发明精神和范围的前提下，可以进行大量改进或变更

Claims (16)

1、组合物，包含：

a．一种分枝杆菌脱氧核糖核酸(B-DNA)；

b．一种脱蛋白、脱脂的分枝杆菌细胞壁，其中所述B-DNA是保存和复合在所述分枝杆菌细胞壁上的(BCC)；和

c．一种药学上可接受的载体，

其中所述BCC能有效地诱发一种动物膀胱内的癌细胞的应答。

2、按权利要求1所述的组合物，其中所述分枝杆菌DNA是草分枝杆菌-DNA(M-DNA)。

3、按按权利要求1所述的组合物，其中所述分枝杆菌细胞壁是草分枝杆菌细胞壁。

4、按权利要求1所述的组合物，其中所述应答选自由癌细胞增殖的抑制作用和癌细胞的细胞程序死亡的诱发作用组成的组。

5、按权利要求4所述的组合物，其中所述应答是癌细胞增殖的抑制作用。

6、按权利要求4所述的组合物，其中所述应答是癌细胞的细胞程序死亡的诱发作用。

7、按权利要求1所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体选自由含水载体和不含水载体组成的组。

8、用于诱发一种动物膀胱内的癌细胞应答的方法，该方法包括将一种组合物对该动物给药，所述组合物包含：

a．一种分枝杆菌脱氧核糖核酸(B-DNA)；

b．一种脱蛋白、脱脂的分枝杆菌细胞壁，其中所述B-DNA是保存和复合在所述分枝杆菌细胞壁上的(BCC)；和

c．一种药学上可接受的载体，

给药量能有效地诱发一种动物膀胱内的癌细胞的应答，该动物在膀胱内具有癌细胞。

9、按权利要求8所述的方法，其中所述B-DNA是草分枝杆菌-DNA(M-DNA)。

10、按权利要求8所述的方法，其中所述分枝杆菌细胞壁是草分枝杆菌细胞壁。

11、按权利要求8所述的方法，其中所述应答选自由癌细胞增殖的抑制作用和癌细胞的细胞程序死亡的诱发作用组成的组。

12、按权利要求11所述的方法，其中所述应答是癌细胞增殖的抑制作用。

13、按权利要求11所述的方法，其中所述应答是癌细胞的细胞程序死亡的诱发作用。

14、按权利要求8所述的方法，其中所述药学上可接受的载体选自由含水载体和不含水载体组成的组。

15、组合物，包含：

a．MCC，其中草分枝杆菌-DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的；和

b．一种药学上可接受的载体。

16、用于治疗动物膀胱内的癌细胞的方法，所述动物在膀胱内具有癌细胞，所述方法包括将一种组合物对需要接受所述治疗的动物给药，该组合物包含：

a．MCC，其中草分枝杆菌-DNA是保存和复合在草分枝杆菌细胞壁上的；和

b．一种药学上可接受的载体，

给药量能有效地治疗动物膀胱内的癌细胞，该动物在膀胱内具有癌细胞。

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