ES2238780T3 - Tratamiento de cancer de vejiga mediante pared celular de mycobacterium phlei. - Google Patents

Abstract

Uso de pared celular delipidada desprotonizadade Mycobacterium phlei (MCC) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria en un animal incluyendo humanos que tengan cáncer de vejiga urinaria.

Description

Tratamiento de cáncer de vejiga mediante pared celular de Mycobacterium phlei.

Campo de la invención

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional estadounidense 60/075,111, depositada el 18 de febrero de 1998.

La presente invención se refiere al uso de pared celular delipidada y desprotonizada de Mycobacterium phlei (MCC) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria en un animal incluyendo humanos que tengan cáncer de vejiga urinaria. La presente invención comprende el uso para la elaboración de un medicamento de un complejo (MCC) de pared celular de M. phlei y DNA (M.DNA) de Mycobacterium phlei (M.phlei), en dónde M-DNA se conserva y se compleja en la membrana celular de M.phlei tal que el MCC es efectivo en la inhibición de la proliferación e inducción de apoptosis en células de cáncer de vejiga.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una acumulación aberrante en red de células atípicas, que puede resultar de un exceso de proliferación, de una insuficiente apoptosis, o de una combinación de los dos. La apoptosis puede ser iniciada por ligandos que se unen a receptores en la superficie celular (Muzio et al. Cell 85:817-827,1996). Mutaciones en estos receptores pueden causar fallos en la apoptosis. La apoptosis también puede ser inducida por proteínas intracelulares incluyendo, pero no limitada a, reguladores de p53/p21 (Levine A. Cell 88:323-331, 1997). La pérdida funcional de p53/p21 se correlaciona con la agresividad en varios cánceres (Fisher D. Cell 78:529-542, 1994). Los agentes quimioterapéuticos se basan primariamente en la inducción de apoptosis en células de cáncer por su efecto terapéutico. La resistencia a fármacos, que disminuye la efectividad de agentes quimioterapéuticos, dirige directa o indirectamente a apoptosis reducida y se asocia generalmente con un pronóstico pobre en varios cánceres.

El cáncer de vejiga es particularmente difícil de tratar de forma satisfactoria (Lamm et al. Journal of Urology 153:1444-1450, 1995). Preparaciones de origen bacteriano utilizadas para tratar cáncer de vejiga incluyen, pero no se limitan a, bacillus Calmette-Guerin (BCG)(Pryor et al. British Journal of Cancer 71:801-807, 1995) y Regressin® (Bioniche, Inc. London, Ontario, Canada), un extracto de pared celular micobacteriana (EPCM) formulado como una emulsión de aceite mineral (Patente estadounidense No 4,744;984; Chin et al. Journal of Urology 156:1189-1193, 1996).

El BCG no induce la apoptosis directamente (Sasaki et al. Urology Internacional 50:142-148, 1997). Más bien, el BCG estimula las células del sistema inmunitario para producir moléculas bioactivas tales como, pero no limitadas a, citocinas y especies reactivas de oxígeno (Kudoh et al. British Journal of Urology 80S2:40, 1997), que luego inducen apoptosis y citolisis.

El EPCM, que se compone primariamente de peptidoglicanos y glicolípidos que contienen N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina y derivados de ácidos micólicos (Chin et al. Journal of Urology 156:1189-1193, 1996), se piensa que estimula el sistema inmunitario por activación de reacciones mediadas por macrófagos y monocitos (Teware et al. Veterinary Parasitology 62:223-230, 1996).

Los beneficios terapéuticos obtenidos utilizando BCG y EPCM son variables e inconsecuentes, y parecen depender del método de preparación y del método de reparto y en la variabilidad en la inmunogenicidad y estabilidad de las preparaciones resultantes. Además, BCG vivo puede causar serios efectos adversos incluyendo, pero no limitados a, fiebre, reacciones graves retardadas (serum sickness like syndromes), infección granulomatosa, sepsis y hasta la muerte (Lamm et al. Journal of Urology 147:596-600, 1992).

Otros agentes anticancerosos de vejiga previos en el campo también se ha demostrado que son menos adecuados para aplicaciones clínicas. Muchos de estos agentes son ineficientes o tóxicos, tienen efectos adversos significativos, resultan en el desarrollo de resistencias a fármacos o inmunosensibilización, y son debilitantes para el receptor. Además, muchos de estos agentes dependen de receptores de ligando de superficie o de p53/p21 para su efectividad.

La WO 99/07383 que se depositó el 05 de agosto de 1998 reivindicando sobre una solicitud prioritaria de 05 de agosto de 1997 y que fue publicada el 18 de febrero de 1999 describe una composición que contiene DNA de Mycobacterium phlei, en donde este DNA inhibe la proliferación e induce la apoptosis en células sensibles y estimula células sensibles del sistema inmunitario para producir moléculas bioactivas.

Por lo tanto, se necesita un agente terapéutico nuevo que inhiba la proliferación e induzca la apoptosis en células cancerosas de vejiga urinaria. Este agente terapéutico debería ser útil como agente anticanceroso células de vejiga urinaria y como adjunto a otros agentes anticancerosos para las células de cáncer de vejiga. Por adjunto se entiende otro agente anticanceroso de células de la vejiga urinaria útil para incrementar la efectividad del tratamiento. Además, tal agente terapéutico debería ser simple y relativamente barato de preparar, su actividad debería ser reproducible entre preparaciones, su actividad debería permanecer estable en el tiempo, y su efecto sobre las células cancerosas de vejiga urinaria debería ser factible con regímenes de dosis asociadas a la mínima toxicidad.

Resumen de la invención

La presente invención satisface las necesidades citadas anteriormente por el uso de la pared celular desproteinizada y delipidada de Mycobacterium phlei (MCC) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria en animales incluyendo humanos que sufren este cáncer.

Respecto a esto, se advierte que MC Fillion et al., British Journal of Cancer (1999) 79 (2), páginas 229-235 es una referencia que se publica después de la fecha de prioridad de la presente solicitud que describe que el complejo de la pared celular de Mycobacterium phlei induce directamente apoptosis en células cancerosas humanas de la veji-
ga.

Más particularmente, la presente invención satisface las necesidades citadas anteriormente por el uso de un complejo (MCC) de pared celular de M. phlei y DNA (M.DNA) de Mycobacterium phlei (M.phlei), en dónde el M-DNA se preserva y se compleja en la pared celular de M. phlei, de tal manera que el MCC es efectivo inhibiendo la proliferación e induciendo la apoptosis en células cancerosas de vejiga. MCC es simple y relativamente barato de preparar, su actividad es reproducible entre preparaciones, permanece terapéuticamente estable en el tiempo, y es efectivo a regímenes de dosis asociadas a una toxicidad mínima incluso en caso de administración repetida.

Para preparar MCC, se hace crecer M. phlei en un medio líquido y se recoge. Los M.phlei se desorganizan, y los componentes sólidos de los M phlei desorganizados se recolectan por sedimentación centrífuga. Los componentes sólidos se desproteinizan, delipidan, y se lavan. Reactivos libres de DNasa se usan para minimizar la degradación de M-DNA durante la preparación.

MCC, en combinación con transportadores farmacéuticamente aceptables, es para ser administrado a un animal, incluyendo un humano, en una dosis suficiente para prevenir, tratar y eliminar las células cancerosas de vejiga. La inesperada y sorprendente capacidad de MCC para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en las células cancerosas de vejiga incluyendo, pero no limitado a, p53/21 anómalo y células resistentes al fármaco dirigen a una necesidad incumplida en el campo médico y proporciona un importante beneficio.

MCC también es efectiva como un adjunto para incrementar la efectividad de otros agentes anticancerosos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, fármacos: inmunoestimulantes; antígenos; anticuerpos; vacunas; radiación; agentes quimioterapéuticos; agentes ácidos nucleicos; agentes diseñados biológicamente; agentes sintetizados químicamente; agentes para la activación o inactivación de moléculas de células diana muertas; y, agentes que inhiben la proliferación e inducen apoptosis en células sensibles.

En consecuencia un objetivo de la invención es proveer un medicamento efectivo para prevenir el cáncer de vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento de composición efectiva para tratar el cáncer de vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento efectivo para eliminar el cáncer de vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que inhiba la proliferación de células cancerosas de la vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que induzca la apoptosis de células cancerosas de vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que estimule células sensibles del sistema inmunitario en la vejiga para producir moléculas bioactivas.

Otro objetivo de la presente invención es proveer una composición y un medicamento que sea efectivo en la inhibición de la angiogénesis del cáncer de vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que sea efectivo como adjunto a otras terapias anticancerosas de vejiga.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento de tamaño de partícula y formulación óptimos para el reconocimiento por las células sensibles.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento de tamaño de partícula y formulación óptimos para la recaptación por las células sensibles.

Otro objetivo de la invención es proveer un medicamento que pueda ser preparado en grandes cantidades.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que sea relativamente barato de preparar.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que tenga actividad reproducible entre preparaciones.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que permanezca estable en el tiempo.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que mantenga su efectividad en el tiempo.

Otro objetivo de la presente invención es proveer un medicamento que sea mínimamente tóxico para el receptor.

Éstos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención empezarán a ser aparentes después de la revisión de la siguiente descripción detallada de la realización revelada y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Inhibición de la proliferación de las células cancerosas HT-1376, HT-1197, B-16F1, THP-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 y HL-60 MX-1 por MCC. Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 2. Inhibición de la proliferación de las células cancerosas de vejiga HT-1376, HT-1197, B-16F1, THP-1, RAW 26A.7, Jurkat, HL-60 y HL-60MX-1 por DNA de M. phlei (2A), DNA de MCC (2B), DNA de timo de ternera (2A & 2B) y DNA de esperma de arenque (2A & 2B). Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 3. Inhibición de la proliferación de células cancerosas de vejiga humana HT-1197 (3A) y HT-1376 (3B) por MCC y LPS. Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 4. Inducción de la fragmentación de DNA en células cancerosas de vejiga humana HT-1197 (4A) y HT-1376 (4B) por MCC sin tratar y tratada con DNasa I y por hIL-12. Los resultados mostrados son para 1 de 3 experimentos, cada uno de los cuales dieron resultados similares.

Fig. 5. Liberación de NuMA de células cancerosas de vejiga humana HT-1197 y HT-1376 con incremento de las concentraciones de MCC. Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 6. Liberación de NuMA de células cancerosas de vejiga humana HT-1197 (6A) y HT-1376 (6B) con 1 \mug/ml de MCC o con 100 \mug/ml de MCC más de 48h. Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 7. Liberación de NuMA de células cancerosas de la vejiga humana HT-1376 con 1 \mug/ml de DNA-MCC y MCC no tratado y tratado con DNasa I. Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 8. Porcentaje de liberación de LDH por células cancerosas de vejiga humana HT-1376 como un indicador de citotoxicidad de MCC. Los resultados son la media \pm DE de los 3 experimentos independientes.

Fig. 9. Estabilidad de MCC durante 6 meses de almacenamiento.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de la pared celular de Mycobacterium phlei desproteinizada y delipidada (MCC) para la elaboración de un medicamento efectivo para prevenir, tratar y eliminar las células cancerosas en la vejiga urinaria de un animal, incluyendo un humano.

Se usa la especie Mycobacterium M. phlei.

Por lo tanto la presente invención comprende un complejo (MCC) de pared celular de M.phlei y un ácido desoxirribonucleico de M.phlei (M-DNA), en donde el M-DNA se preserva y se compleja en la pared celular de M.phlei, de tal manera que el MCC es efectivo para prevenir, tratar y eliminar células cancerosas de la vejiga urinaria. En el MCC, la cantidad de M-DNA se enriquece en relación a la cantidad de M-DNA de una célula intacta de M.phlei. Además, El M-DNA se preserva y se compleja en la pared celular de M. phlei así que es más accesible para células de respuesta que el M-DNA en una célula intacta de M.phlei. Aunque no se quiera que sea enlazado por las siguientes hipótesis, se cree que el M-DNA, en la forma de oligonucleótidos cortos, y su asociación física con la pared celular de M. phlei, ambas contribuyen a la expresión óptima de la actividad terapéutica de MCC.

Métodos para incrementar la actividad terapéutica de MCC incluyen, pero no se limitan a, suplementar químicamente o biotecnológicamente amplificando secuencias estimulantes o confirmaciones de DNA derivado de las mismas o diferentes especies y complejando el M-DNA o MCC a transportadores naturales o sintéticos. Además, MCC puede ser administrado antes, al mismo tiempo, o después de otro agente anticanceroso de vejiga para incrementar la efectividad terapéutica.

Composiciones que comprenden MCC y sus transportadores farmacéuticamente aceptables se preparan asociando uniformemente e íntimamente el MCC con transportadores líquidos, con transportadores sólidos, o con ambos. Los transportadores líquidos incluyen, pero no se limitan a, transportadores acuosos, transportadores no acuosos o ambos. Los transportadores sólidos incluyen, pero no se limitan a, transportadores biológicos, transportadores químicos y transportadores diseñados biotecnológicamente.

Entre sus transportadores farmacéuticamente aceptables, MCC puede ser administrado en suspensión acuosa, emulsión aceitosa, emulsión agua en aceite, emulsión agua en aceite en agua, liposomas, micropartículas, emulsiones específicas de lugar, emulsiones de larga residencia, emulsiones mucilaginosas, microemulsiones, nanoemulsiones, microesferas, nanoesferas, nanopartículas, minibombas, y con varios polímeros naturales o sintéticos que permiten una liberación sostenida de MCC. Además, MCC se puede usar con uno, todos, o cualquier combinación de excipientes independientemente del transportador usado para presentar MCC a las células de respuesta. Éstos incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, tampones, y bacteriostáticos, y pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes.

Preferiblemente, MCC está para ser administrado en forma de una suspensión acuosa. MCC está suspendido en un transportador farmacéuticamente aceptable tal como, pero no limitado a, agua libre de DNasa, salina o fosfato tamponado salina (PBS) y se emulsiona por sonicación. Opcionalmente, la mezcla emulsionada se homogeniza por microfluidificación. Por ejemplo, MCC liofilizado se suspende en agua libre de DNasa y se sonica al 20% de la producción durante 5 minutos (Model W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc). La composición sonicada se homogeniza por microfluidificación a 15.000-30.000 psi a través del flujo (Model M.110Y; Microfluidics, Newton, MA). La mezcla se procesa asépticamente o se esteriliza definitivamente.

Para la administración en un transportador no acuoso, MCC se emulsiona con un aceite mineral o con un aceite neutral tal como, pero no limitado a, un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un lípido, un aceite y mezclas del mismo, en donde el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poliinsaturados y saturados. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, aceite de soja, aceite de canola, aceite de coco, aceite de oliva y miglyol, en donde el número de carbonos de los ácidos grasos está entre 12 y 22 y en donde los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Opcionalmente, se pueden suspender lípidos cargados o fosfolípidos en el aceite neutral. Por ejemplo, se añade fosfatidilcolina libre de DNasa en un aceite de soja con triglicérido libre de DNasa en una proporción de 1 gramo de fosfolípido a 20 ml de triglicérido y se disuelve calentando a 50º-60ºC. Varios gramos de MCC se añaden a un contenedor autoclavado seco y la solución triglicérido-fosfolípido se añade a una concentración de 20 ml por 1 gramo de MCC. La suspensión se incuba durante 60 min. a 20ºC y luego se mezcla con PBS libre de DNasa en una proporción de 20 ml de suspensión de MCC por litro de PBS. La mezcla se emulsiona por sonicación al 20% de producción durante 5 minutos (Model W-385 Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc.). Opcionalmente, la mezcla de MCC emulsionada se homogeniza por microfluidificación a 15.000-30.000 psi a través del flujo (Model M-110Y; Microfluidics). La emulsión MCC se transfiere a una botella autoclavada tapada para su almacenamiento a 4ºC.

El tamaño de las partículas MCC debería ser óptimo para ser reconocida y captada por las células sensibles. Preferiblemente, el diámetro medio de las partículas MCC es entre alrededor de 10 y alrededor de 10.000 nm, más preferiblemente entre alrededor de 100 y alrededor de 1000 nm y lo más preferible alrededor de 250 y alrededor de 600 nm.

El contenido de M-DNA de MCC es preferiblemente entre 0,001 y alrededor de 90 mg/100 mg de MCC seco, más preferiblemente entre alrededor de 0,01 y alrededor de 40 mg/100 mg MCC seco, lo más preferible entre 0,1 y alrededor de 30 mg/100 mg MCC seco. También, es preferible que el contenido en proteína sea menor que 2 mg/100 mg MCC seco y que el contenido en aceites grasos sea menor que 2 mg/100 mg MCC seca. Inesperadamente, encontramos que como mínimo alrededor de 3,6% del peso seco de MCC es M-DNA extraíble.

MCC se debe administrar en una cantidad efectiva para inducir respuesta terapéutica en células sensibles de vejiga. La dosis de MCC administrada dependerá de la condición tratada, la formulación particular, y otros factores clínicos tales como el peso y condición del receptor y la vía de administración. Preferiblemente, la cantidad de MCC administrada es a partir de alrededor de 0,00001 a alrededor de 100 mg/kg por dosis, más preferiblemente a partir de alrededor de 0,0001 a alrededor de 50 mg/kg por dosis, y lo más preferible a partir de alrededor de 0,001 a alrededor de 10 mg/kg por dosis.

Vías de administración incluyen, pero no se limitan a, oral, intravenosa, intra-lesional, intra-tumoral e intra-vejiga. Preferiblemente, MCC se debe administrar por instilación en la vejiga urinaria con, pero no se limita a, un catéter de tracto urinario. Otros métodos para la instilación de MCC en la vejiga urinaria son conocidos para expertos en el campo.

Según la ruta de administración, el volumen por dosis es preferiblemente alrededor de 0,001 a alrededor de 100 ml, más preferiblemente alrededor de 0,01 a alrededor de 70 ml, y lo más preferible alrededor de 0,1 a alrededor de 40 ml. MCC se puede administrar en un tratamiento a dosis única o en tratamiento a dosis múltiples en un cronograma y durante un período de tiempo apropiado a la enfermedad que se está tratando, a la condición del receptor y a la vía de administración.

Cuando se ha administrado en la vejiga urinaria, según el volumen administrado, la dosis debería permanecer en la vejiga preferiblemente alrededor de 1 min. a alrededor de 8 h, más preferiblemente alrededor de 15 min. a alrededor de 4 h, y lo más preferible de 30 min. a alrededor de 2 h.

Los ejemplos siguientes servirán para ilustrar más la presente invención sin, al mismo tiempo, no obstante, constituir alguna limitación de ésta. Por el contrario, se debe entender claramente que puede ser un recurso para otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de ésta que, después de leer la descripción aquí, los expertos en el campo puedan sugerir sin salirse del objetivo de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos subsecuentes que describen M-DNA, MCC-DNA y BBC se indican por comparación.

Ejemplo 1 Preparación de MCC a partir de Mycobacterium phlei y purificación de M-DNA a partir de MCC y a partir de M.phlei

MCC se preparó a partir de Mycobacterium phlei (M.phlei) (cepa 110), se purificó M-DNA a partir de MCC (MCC-DNA) y se purificó M-DNA a partir de M.phlei (M.phlei-DNA) como se describe en la solicitud No. PCT/CA98/00744. Todos los reactivos se seleccionaron para incrementar la conservación del DNA. Si no se indica lo contrario, MCC, MCC-DNA y M.phlei-DNA se resuspendieron en agua libre de DNasa o en un tampón farmacéuticamente aceptable libre de DNasa y se emulsificaron por sonicación. MCC, MCC-DNA y M.phlei-DNA no contenían endotoxinas como se determinó utilizando el Kit QCL-1000 de lisado de amebocitos de Limulus (BioWhittaker, Walkersville,MD).

Ejemplo 2 Preparación de complejo pared celular bacteriana - DNA bacteriano y de DNA bacteriano a partir de otras especies bacterianas

El complejo (BCC) pared celular bacteriana -DNA bacteriano y DNA-bacteriano (B-DNA) se prepararon a partir de M.smegmatis, M.fortuitous, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium parvum, M.kansaasii, M.tubercu- losis y M.bovis como en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Tratamiento con DNasa

MCC-DNA y MCC, cada uno conteniendo 1 \mug de M-DNA, y Regressin® (Patente estadounidense No. 4.744.984) se digirieron con 1 unidad internacional (IU) de DNasa I libre de RNasa (Life Technologies) durante 1h a 25ºC en Tris HCl 20 mM, pH 8,4, MgCl_{2} 2 mM y KCl 50 mM. La DNasa I se inactivó por adición de EDTA a una concentración final de 2,5 mM y calentando durante 10 min. a 65ºC.

Ejemplo 4 Células y reactivos

Las células cancerosas de vejiga humana HT-1197 y HT-1376 se obtuvieron a partir de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en MEM suplementado con aminoácidos no esenciales y vitaminas y conteniendo FCS 10% (MEM-FCS) (Gibco Life Science). Las HT-1197 son células de grado 4 de carcinoma de vejiga transitorio anaplástico desarrollado por un varón humano. Las HT-1197 son células sensibles a agentes quimioterapéuticos tales como, pero no limitado a, doxorubicina. Las HT-1376 son células de grado 3 de carcinoma de vejiga transitorio anaplástico desarrollado en una hembra humana. Las células HT-1376 son p53/p21 anormales y son resistentes a agentes quimioterapéuticos tales como, pero no limitados a, cisplatino y mitomicina. Las células B-16 F1, THP-1, RAW 264-7.Jurkat#L-60 y HL-60MX-1 se obtuvieron a partir de ATCC y se cultivaron en el medio recomendado por la ATCC. Si no se indica lo contrario, las células fueron sembradas en placas de cultivo tisular de base plana de 6 pocillos a concentraciones de entre 3 x 10^{5} y 10^{6} células/ml y se mantuvieron a 37º en una atmósfera de CO_{2} 5%.

DNA de timo de ternera, DNA de esperma de arenque y lipopolisacárido de Escherichia coli (LPS) se obtuvieron a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). IL-12 recombinante humana (hIL-12) se obtuvo a partir de R&D Systems (Minneapolis, MN).

Ejemplo 5 Inhibición de la proliferación celular

La proliferación celular se determinó utilizando la reducción de bromuro de dimetiltiazol-difeniltetrazolio (MTT)
(Mosman et al. Journal of Immunological Methods 65:55-63,1983).

Las células HT-1376, HT-1197, B-16 F1, TPH-1, RAW 264.7, Jurkat, HL-60 y HL-60MX-1 se incubaron durante 24 h con de 0 a 10 \mug/ml de MCC, M.phlei-DNA, MCC-DNA, DNA de esperma de arenque y DNA de timo de ternera. MCC (Fig 1), M.phlei-DNA (Fig.2A) y MCC-DNA (Fig.2B) inhibieron la proliferación de forma dosis dependiente. El DNA de esperma de arenque (Figs. 2A&2B) y DNA de timo de ternera (Figs. 2A&2B) no inhibieron la proliferación. Las células HT-1197 (Fig.3A) y HT-1376 (3B) también se incubaron durante 24 h con de 0 a 100 \mug/ml de MCC y LPS. MCC inhibió la proliferación de forma dosis dependiente, mientras que LPS no inhibió la proliferación (Figs. 3A&3B).

MCC y M-DNA inhibieron la proliferación de células cancerosas de vejiga HT-1197 y de p53/p21 anormal, de HT-1376 resistente a fármaco. Además, la inhibición de la proliferación celular no es común en todos los DNA (DNA de esperma de arenque y DNA de timo de ternera) y no resulta de inmunoestimulación no específica (LPS).

Ejemplo 6 Inducción de apoptosis como se indica por fragmentación de DNA

La fragmentación de DNA celular en fragmentos de tamaño nucleosómico es característico de las células que padecen apoptosis (Newell et al. Nature 357:286-289,1990). Para evaluar la fragmentación del DNA, se recogieron células no adherentes por centrifugación a 200 g durante 10 min. Los pellets de células no adherentes y las células adherentes restantes se lisaron con 0,5 ml de tampón de lisado hipotónico (Tampón Tris 10mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,2%, pH 7,5). Los lisados se centrifugaron a 13.000 g durante 10 min y los sobrenadantes, conteniendo DNA fragmentado, se precipitaron durante toda la noche a -20ºC en isopropanol 50% y NaCl 0,5 mM. Los precipitados se recogieron por centrifugación y se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,7% durante 3 h a 100V.

Células de cáncer de vejiga HT-1197 y HT-1376 se incubaron durante 48 h con 1 \mug/ml MCC o con 1 ng/ml hIL-12 (Fig.4). MCC indujo una fragmentación de DNA significativa en las células no adherentes HT-1197 (Fig. 4A, carril 2) y HT-1376 (Fig.4B, carril 2) pero no en las células adherentes HT-1197 (Fig.4A, carril 3) y HT-1376 (Fig. 4B, carril 3). PBS (Figs. 4A&4B, carril 5), hIL-12 (Figs. 4A&4B, carril 4) y MCC tratada con DNasa I (Figs. 4A&4B, carril 7) no inducieron fragmentación de DNA en células HT-1197 y HT-1376 no adherentes. Las células no tratadas (Figs. 4A&4B, carril 1) no presentaron fragmentación del DNA. Se utilizó un marcador de 123-pb de DNA (Gibco Life Science) para determinar el peso molecular de los fragmentos de DNA de tamaño nucleosómico (Figs. 4A&4B, carril L).

MCC induce apoptosis en células cancerosas de vejiga HT-1197 y HT-1376, mientras que MCC tratada con DNasa I no induce apoptosis en estas células. Ésto sugiere que la estructura oligonucleótida intacta del M-DNA es necesaria para la inducción de la apoptosis. hIL-21 no induce apoptosis en células HT-1197 o en HT-1376.

Ejemplo 7 Inducción de apoptosis como se indica por solubilización del aparato proteico mitótico nuclear (NuMA)

Notables cambios morfológicos en el núcleo de la célula causados por solubilización y liberación de NuMA son característicos de la apoptosis. La liberación de NuMA a partir de células cultivadas se determinó en unidades/ml (U/ml) utilizando un ELISA comercial (Calbiochem, Cambridge, MA) (Millar et al. Biotechniques 15:1042-1047,1993).

Células cancerosas de vejiga HT-1197 y HT-1376, incubadas durante 48 h con 0 a 100 \mug/ml de MCC, liberaron NuMA de una forma dosis dependiente (Fig.5). Células HT-1197 (Fig.6A) y HT-1376 (Fig-6B), incubadas con 1 \mug/ml o con 100 \mug/ml de MCC durante 48 h, mostraron un aumento de la liberación de NuMA en 24 horas. Células HT-1197, incubadas durante 48 h con MCC y con MCC-DNA mostraron significativamente mayor liberación de NuMA con MCC que con MCC-DNA (Fig.7). El tratamiento de MCC con DNasa y de MCC-DNA redujo significativamente la liberación de NuMA (Fig.7).

La inducción de la apoptosis por MCC en células cancerosas de vejiga HT-1197 y en HT-1376 es a la vez dependiente de la dosis y del tiempo. Aunque no se quiera enlazar con la siguiente hipótesis, se cree que tanto la estructura oligonucleótida de M-DNA como la presentación de M-DNA en la pared celular de M.phlei son importantes para la inducción de una apoptosis óptima.

Ejemplo 8 Citotoxicidad del MCC

La citotoxicidad celular se caracteriza por la pérdida de la integridad de la membrana plasmática y la liberación de enzimas citoplasmáticos tales como, pero no limitados a, LDH (Phillips et al. Vaccine 14:898-904).

Para evaluar la citotoxicidad del MCC, las células cancerosas de la vejiga HT-1376 se incubaron durante 48h con desde 0 a 100 \mug/ml de MCC o con tampón de lisis (Tris 10mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,2%, pH 7,5) como un control de la liberación de LDH total (Filion et al. Biochim Biophs Acta 1329:345-356, 1997). LDH se determinó por un ensayo comercial (Sigma-Aldrich). Que MCC no fuera citotóxico (Fig. 8) demuestra que MCC actúa directamente sobre las células cancerosas de la vejiga HT-1197 y HT-1376 para inhibir la proliferación y para inducir la apoptosis.

Ejemplo 9 Tratamiento con MCC y MCC-DNA de cáncer de vejiga humano en ratones atímicos (nu/nu)

El cáncer de vejiga en humanos está establecido como un tumor sólido ectópico en los tejidos subcutáneos de ratones desnudos atímicos inmunodeficientes (ratones nu/nu) y los ratones se dividen en 5 grupos. El grupo 1 recibe sólo el vehículo. El grupo 2 recibe MCC. El grupo 3 recibe MCC tratado con DNasa I. El grupo 4 recibe MCC-DNA. El grupo 5 recibe MCC-DNA tratado con DNasa I. La masa cancerosa se mide antes del tratamiento y semanalmente durante las 4 semanas del tratamiento. Los ratones del grupo 2 y los del grupo 4 muestran regresión de la masa cancerosa. Los ratones de los grupos 1,3 y 5 no muestran regresión de la masa cancerosa.

Ejemplo 10 Tratamiento con MCC del cáncer humano de vejiga

Diez pacientes con tres estados ortotópicos de cáncer de vejiga se dividen en 2 grupos. El grupo 1 recibe la instilación intravesical de MCC semanalmente durante 8 semanas. El grupo 2 recibe tratamiento quimioterapéutico estándar. Los pacientes del grupo 1 muestran una regresión significante del cáncer de vejiga y no comunican efectos adversos debilitantes. Los pacientes del grupo 2 muestran una mínima regresión del cáncer de vejiga y comunican efectos adversos debilitantes significativos.

Ejemplo 11 Estabilidad del MCC

El MCC a 1 mg/ml se almacenó como una suspensión estéril en NaCl 0,85% p/v en la oscuridad a 4ºC durante 6 meses. Se calculó el diámetro medio de de partícula usando espectroscopía de correlación de fotón (N4 Plus, Coulter Electronics Inc.). La suspensión de MCC se diluyó con NaCl p/v 0,85% hasta un recuento partículas entre 5 x 10^{4} y 10^{6} part./seg. El diámetro medio de partícula se calculó con el método del procesador de distribución de tamaño (SDP) usando las siguientes condiciones: índice de refracción del fluido 1,33, temperatura 20ºC, viscosidad 0,93 centipoise, medida de ángulo 90,0, tiempo de la prueba 10,5 \mus, tiempo de fluido 100 seg. El potencial, la carga eléctrica en la interfase hidrodinámica entre las partículas y el volumen de solvente, se midió en una Delsa 440SX (Coulter Electronics Inc.) usando las condiciones siguientes: corriente 0,7 mA, rango de frecuencia 500 Hz, temperatura 20ºC, índice de refracción del fluido 1,33, viscosidad 0,93 centipoise, constante dieléctrica 78,3, conductividad 16,7 ms/cm, a tiempo 2,5 seg., fuera de tiempo 0,5 seg., y tiempo de fluido 60 s.

Como se muestra en la Fig. 9, la carga de MCC y el diámetro de MCC permanece sin cargar durante 6 meses de almacenamiento. Además, la simulación MCC de la producción de IL-12 e inducción de apoptosis en monocitos THP-1 permanecieron invariables durante 6 meses de almacenamiento.

Se debería entender, por supuesto, que el antecedente sólo se refiere a una personificación preferida de la presente invención y que numerosas modificaciones o alteraciones pueden desviarse del propósito de la invención como se anuncia en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (3)

1. Uso de pared celular delipidada desprotonizada de Mycobacterium phlei (MCC) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria en un animal incluyendo humanos que tengan cáncer de vejiga urinaria.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el MCC induce una respuesta en las células cancerosas de la vejiga urinaria seleccionadas del grupo que consiste en la inhibición de la proliferación de células cancerosas de la vejiga e inducción de apoptosis en células cancerosas de la vejiga.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las células cancerosas de vejiga urinarias son resistentes a fármacos o con p53/21 anormal.