EP1053316A1 - Nukleinsäuren zur modulation zellulärer aktivierung - Google Patents

Nukleinsäuren zur modulation zellulärer aktivierung

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EP1053316A1
EP1053316A1 EP99906220A EP99906220A EP1053316A1 EP 1053316 A1 EP1053316 A1 EP 1053316A1 EP 99906220 A EP99906220 A EP 99906220A EP 99906220 A EP99906220 A EP 99906220A EP 1053316 A1 EP1053316 A1 EP 1053316A1
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EP
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nucleic acids
cells
rsk3
dna
acids according
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Withdrawn
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EP99906220A
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English (en)
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Gmbh Abgen
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AbGen GmbH
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Priority claimed from DE1998159056 external-priority patent/DE19859056A1/de
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs

Definitions

  • the invention relates to nucleic acids, their derivatives and sequence-specific binding substances which inhibit the expression of the CD30 antigen and / or the ribosomal S6 kinase pp90rsk3, pharmaceutical compositions which contain such nucleic acids, and the use of such nucleic acids for modulating cellular activation, for suppressing and Prevention of immune dysregulation, reduction of viral load and elimination of CD30 + and / or pp90rsk3 + cells and their tumors.
  • the cell responds to environmental signals with a complex network of cellular activation to ensure an adequate response.
  • the seemingly unlimited variety of physical and chemical influences is contrasted by the cell with a versatile, modulatable physiological pattern of specific responses through cellular activation.
  • Dysregulations of cellular activation are common, however, the environmental factors that trigger them or the deregulated signals of the cell are only rarely known.
  • the spectrum of diseases with deregulated cellular activation is diverse and includes cells from all tissues and differentiations, e.g. Epithelial cells in response to bacterial toxins, or immune cells in response to chronic viral infections, chronic inflammatory and atopic diseases such as e.g. atopic dermatitis (neurodermatitis). Some of these diseases are very common, with manifestations of atopic syndrome affecting up to 15% of the population.
  • the CD30 antigen is a phosphorylated 105-120 kDa membrane glycoprotein that is assigned to the TNF / NGF receptor family based on sequence homologies and is expressed by some lymphocyte subpopulations (Schwab et al., Nature 299, 65-67 (1982); WO93 / 10232; and Dürkop et al., Cell 68, 421-427, 1992).
  • the CD30 antigen is preferred, but not exclusively, found on Th2 T cells, especially in a subpopulation (15-20%) of activated CD45RO + "memory" T cells, of which 85% of the cells coexpress the CD4 antigen. Cells with persistent viral infections and cells from numerous virus-associated tumors also express the CD30 antigen.
  • CD30 cross-linking on the cell surface leads to a confusing variety of cellular functions, e.g. to increase T cell proliferation (Smith et al., Cell 73, 1349-1360, 1993), to induce the transcription factor NFKB (McDonald et al., Europ. J. Immunol.
  • the ribosomal S6 kinases form a family of mitogen-activated protein kinases. They are ubiquitously expressed in cells of different tissues at different levels.
  • the pp90rsk1 kinase is functionally downstream of the MAP kinase in the Ras-Raf-MEK-MAP kinase signaling path (Sturgill et al., Nature 334, 715-718, 1988; Blenis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5889-5892, 1993). It phosphorylates the factor l ⁇ B ⁇ and stimulates its breakdown (Ghoda et al., J. Biol. Chem.
  • nucleic acids oligonucleotides
  • CD30 and / or rsk3 expressing cells can be eliminated with the aid of these nucleic acids.
  • rsk3 + pp90rsk3 +
  • nucleic acids which inhibit the expression of the CD30 antigen or the ribosomal S6 kinase pp90rsk3 ("rsk3"), acids that bind specifically to the CD30 and / or pp90rsk3 mRNA, gene or promoter DNA are preferred;
  • compositions comprising one or more of the nucleic acids defined in (1);
  • Figure 1 shows the from the EMBL database accession no. M83554 known CD30 cDNA sequence. Preferred binding areas to the corresponding RNA or genomic DNA are highlighted.
  • Figure 2 shows the from the EMBL database accession no. X85106 known rsk3 cDNA sequence. Preferred binding areas to the corresponding RNA or genomic DNA are highlighted.
  • Nucleic acid derivatives for the purposes of the present invention are nucleic acids in which, based on the natural nucleic acids, at least one modification to the nucleic acid base, sugar component or phosphate linkage known to the person skilled in the art has been carried out. Such modifications are described in detail below.
  • Sequence-specific binding substances according to the present invention are understood to mean nucleic acids and other substances which are characterized in that they bind selectively to defined DNA and / or RNA sequences. These also include those nucleic acid derivatives in which two or more modifications have been made and therefore can no longer be correctly referred to as nucleic acids in the narrower sense.
  • Preferred nucleic acids for the purposes of the present invention are oligonucleotides and oligonucleotide derivatives, in particular those which specifically bind to the CD30 and / or rsk3 mRNA, gene or promoter DNA.
  • This can preferably be an oligonucleotide that
  • (d) is a CD30 DNA and / or rsk3 triple helix-forming nucleic acids
  • (e) is a ribozyme that binds to CD30 and / or pp90rsk3 mRNA.
  • the preferred length of the oligonucleotides is 8-20, in particular 9 to 15 bases.
  • Single-stranded oligonucleotides with an identical nucleotide sequence (sense orientation) and with a complementary nucleotide sequence (anti-sense orientation) to the CD30 mRNA are particularly preferred in the sense of the present invention. These are able to effectively inhibit the synthesis of the CD30 antigen (example 1).
  • Oligonucleotides which bind to the CD30 mRNA in the regions bp 140-170, bp 200-250, bp 265-300, bp 520-540, bp 600-940, bp 1200-1270, bp 1745-1790, bp 1885- are preferred.
  • Another preferred embodiment of the present invention are oligonucleotides that bind to the rsk3-specific mRNA, gene or promoter DNA. These oligonucleotides suppress the synthesis of the rsk3 protein. Oligonucleotides which bind to the rsk3 mRNA in the regions bp 100-160, bp 1085-1125 or bp 1540-1565 are preferred (numbering of the base pairs in accordance with EMBL database accession No. X85106; FIG. 2 and SEQ ID NO: 3). Examples of particularly effective oligonucleotides are given in Table 2.
  • Oligonucleotides in anti-sense orientation bind to the respective RNA and efficiently prevent CD30 or rsk3 mRNA translation. Oligonucleotides in sense orientation proved to be potent DNA triple helix formers and very efficient suppressors of CD30 and rsk3 RNA transcription.
  • the oligonucleotides mentioned in Table 1 bind to CD30-specific DNA or RNA sequences, the oligonucleotides mentioned in Table 2 to rsk3-specific DNA or RNA sequences.
  • the oligonucleotide AS1 binds to both the CD30 mRNA and the mRNA of the rsk3 kinase and inhibits the translation and function of both proteins, rsk3 and CD30.
  • the oligonucleotides S1 and S1-short bind to both the CD30 gene DNA and the rsk3 gene DNA and inhibit the transcription of both RNA species, the CD30 mRNA and the rsk3 mRNA.
  • the oligonucleotides AS1 and S1 or their derivatives are preferred for the suppression of rsk3 and CD30 and have an outstanding efficiency in the uses according to the invention described below. 7
  • the oligonucleotides can be linear unmodified DNA or RNA molecules or DNA or RNA molecules modified by known methods (Agrawal and Iyer, Pharmakol. Ther. 76, 151-160, 1997). Examples are cyclic oligonucleotides (Kool, J. Am. Chem. Soc. 113, 6265-6266, 1991), phosphorothioate derivatives, 2 ' O-methyl RNA, morpholino-modified oligomers, methyl phosphonates, PNA ("peptide nucleic acids” ), N3 ' -> P5 ' phosphoramidates, or so-called "clamp oligonucleotides” (overview: Cohen, Adv. Pharmakol.
  • oligonucleotides can also be transcribed from viral or non-viral expression vectors, ie the nucleic acids according to the invention can also be present as components of such vectors.
  • nucleic acids according to the invention are present as components of ribozymes or other enzymatically active nucleic acids with specific binding to the CD30 and / or rsk3 mRNA or DNA.
  • Ribozymes are preferred whose specific binding region contains one of the nucleotide sequences mentioned in Table 1 or Table 2.
  • the nucleic acids, oligonucleotides and ribozymes according to the invention do not have the exact sequence of the CD30 and rsk3 mRNAs shown in SEQ ID NO: 1 and NO: 3.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can also contain a pharmaceutically acceptable carrier and / or pharmaceutical adjuvants.
  • Pharmaceutical carriers for nucleic acids are preferably lipids, for example cationic or anionic liposomes or lipids such as DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DC-chol (3 ⁇ [N- (N ' , N ' -dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol or DOTAP (1, 2-dioloyloxy-3- (trimethylammonio) propane).
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DC-chol 3 ⁇ [N- (N ' , N ' -dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol or DOTAP (1, 2-dioloyloxy-3- (trimethylammonio) propane.
  • Lipid DNA particles are also suitable for coupling with a suitable ligand for tissue-specific nucleic acid transfer.
  • nucleic acids for example adenoviral, particles or artificial particles that bind nucleic acids can also be used (
  • the nucleic acids according to the invention can also be transferred without pharmacological carriers, for example by nucleic acid precipitation, electroporation, injection, particle bombardment ("gene gun").
  • CD30 + and / or rsk3 + cells adjust or modulate their specific cellular functions and synthesis functions which are associated with cellular activation (eg cytokine synthesis) (Example 2), CD30-rsk3 - Cells are not impaired in their function.
  • the induced and constitutive cellular activation characterized for example by NFKB activation, is specifically suppressed in the presence of the nucleic acids according to the invention (example 3). It is irrelevant whether the cellular activation took place after chemical or physical effects or after contact with bacteria or viruses or their components or on the basis of unknown stimuli.
  • the cell changes its functions in such a way that the cell type-specific cellular activation is suppressed, which e.g. characterized by suppression of the expression of endothelial cell adhesion molecule or A20, mitochondrial dehydrogenase (or manganese superoxide dismutase in CD30 + cells.
  • nucleic acids according to the invention are therefore the functional suppression of cellular activation of CD30 + and / or rsk3 + cells without the functional activity of others
  • CD30 + and / or rsk3 + (tumor) cells can be converted into a status which makes the cells sensitive to chemotherapeutic, cytokine or radiation-induced cell death.
  • CD30 + and / or rsk3 + cells stop their proliferation in the presence of the oligonucleotides according to the invention (Example 4) and are subject to cell death (Example 5).
  • One use of the nucleic acids according to the invention is therefore the suppression and the prevention of the growth of malignant and benign CD30 + and / or pp90rsk3 + cells, of tumors and of Tissue infiltration, micro-colonization and metastasis of these cells and the prevention of recurrence of tumors of these cells.
  • tumors are Hodgkin's lymphoma, anaplastic large cell lymphoma, T-cell leukemia, germ cell tumors and embryonic carcinomas.
  • CD30 + and / or rsk3 + cells for example from transplants, bone marrow biopsies, etc. during purging or from the blood (Example 7), for example from atopics or pollen allergy sufferers.
  • nucleic acids according to the invention cannot be stimulated to develop CD30 + and / or pp90rsk3 + cells (Example 6). Hyperstimulation of the cells cannot be induced either. It has been shown that a sustained, high secretion of IL-10, as can be observed after repeated stimulation of lymphocytes with antigen, is suppressed in the presence of the nucleic acids according to the invention, while that of IFN-gamma remains unaffected (Example 2).
  • the nucleic acids according to the invention can therefore be used for the specific prevention of an immune hyperstimulation which is associated with the development of CD30 + and / or rsk3 + cells, while other immune stimulations remain unaffected. This form of use is extraordinarily diverse, examples being the use for preventing the accumulation of CD30 + lymphocytes in the blood in at ⁇ pikers or in patients with pollen allergy and associated suppression of the acute symptoms of the disease.
  • ren preferably the nucleic acids mentioned in Table 1 and Table 2
  • rsk3-specific oligonucleotides inhibit the pseudomonas aeruginosa-induced mucin overproduction, preferably of MUC2, in epithelial cells.
  • Preferred applications of the nucleic acids according to the invention are in diseases with overproduction of musk by respiratory epithelial cells, e.g. in patients with cystic fibrosis.
  • the present invention thus relates to the use of the nucleic acids according to the invention or their derivatives for the production of medicaments which are suitable, for example, for modulating the functional activity of CD30 + and / or pp90rsk + cells and for the functional suppression and elimination of CD30 + and / or pp90rsk + cells.
  • “Modulation of the functional activity” and “functional suppression and elimination” of CD30 + and / or 90rsk + cells according to the present invention mean the following parameters (diseases):
  • nucleic acids according to the invention can be used, for example, for the following purposes: for the suppression and prevention of cellular activation and its dysregulation, immune dysregulation, chronic inflammation, colitis, atopic reactions,
  • Neurodermatitis autoimmune reactions, graft rejection, systemic sclerosis; to reduce the virus production and / or viral load of CD30 + and / or rsk3 + cells; to suppress the development, proliferation, tumor formation and tissue penetration of CD30 + and / or rsk3 + cells; to suppress the production of cellular substances which is associated with the cellular activation of CD30 + and / or rsk3 + cells; to change the tissue balance of activated CD30 + and / or rsk3 + cells on the one hand and other activated or resting cells on the other hand, influencing the Th1 / Th2 balance of the immune cells; for the elimination of CD30 + and / or rsk3 + cells in tissues, body fluids, biopsies or transplants in vivo and in vitro; to suppress cellular activation in CD30 + and / or rsk3 + cells; , to suppress the overproduction of cellular substances in CD30 + and / or rsk3 + cells; to change the
  • the present invention also relates to methods for the treatment of the aforementioned diseases, comprising the administration of the nucleic acids according to the invention.
  • the invention relates to methods for the treatment and prevention of the abovementioned diseases or symptoms, comprising the local or systemic administration of the nucleic acids according to the invention or their derivatives, preferably with suitable pharmacological carriers.
  • ointments or lotions containing preferably 10 mM to 1 M of one or more of the oligonucleotides according to the invention, preferably oligonucleotide AS1, applied once to three times a day with a treatment period until the acute symptoms have ended , or preventive ointments or lotions containing 0.1 mM to 100 mM of one or more of the nucleic acids according to the invention, preferably oligonucleotide AS1, applied locally once a day.
  • injections can be administered in or near the efflorescences, preferably in the form of injection infiltrations with solutions which contain the nucleic acids according to the invention in combination with suitable pharmacological carriers.
  • the systemic treatment for example of intestinal chronic inflammatory diseases, comprises the administration of the nucleic acids according to the invention with suitable pharmacological carriers, preferably in doses of 100 ⁇ g to 10 g per dose at 1-6 parenteral or oral doses per day and one Treatment duration until suppression of the current symptoms.
  • suitable pharmacological carriers preferably in doses of 100 ⁇ g to 10 g per dose at 1-6 parenteral or oral doses per day and one Treatment duration until suppression of the current symptoms.
  • treatment with the nucleic acids according to the invention in one or two doses per day is preferred.
  • other dosage schemes are also possible depending on the course of the disease.
  • the nucleic acids according to the invention preferably as phosphorothioate oligonucleotides, can also be systemically administered as a continuous infusion in doses of 0.05-0.5 13
  • the invention also relates to methods for the ex vivo treatment of body fluids and biopsies, for example the purging of bone marrow transplants.
  • the graft is incubated in the presence of the nucleic acids according to the invention.
  • the nucleic acids are preferably incubated with doses of 10 ⁇ M to 10 mM over 1-2 days.
  • the preferred nucleic acid for this method is the oligonucleotide AS1.
  • Example 1 Specific suppression of CD30 and pp90rsk3 expression in Jurkat cells.
  • Jurkat cells (ATCC TIB-152) (CD30 +, pp90rsk3 +) were paralleled at a density of 5 x 10 4 cells per ml RPMI 1640 culture medium (Gibco-BRL), 10% (v / v) fetal calf serum (Gibco-BRL) Batches (batch AF) in the presence of the following oligonucleotides (40 ⁇ M each) incubated for 2 days at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • Approach A Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 5'GACGCGCATCCCCGG3 '
  • CD30 120 kD
  • pp90rsk1 90 kD
  • pp90rsk3 90 kD
  • actin 48 kD
  • anti-rsk3 antibody C-20 (1: 1,000) (Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-1431) anti-actin antibody (1: 2,000) (Calbiochem, Cat # CP01)
  • the oligonucleotides SEQ ID NO: 5, NrO: 9 and NO: 10 suppress CD30 protein expression.
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 15 suppresses pp90rsk3 expression without influencing CD30 expression.
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 9 suppresses CD30 expression without affecting pp90rsk3 expression.
  • Example 2 Lymphocytes secrete an altered spectrum of cytokines in the presence of oligonucleotide SEQ ID NO: 5.
  • Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of healthy donors using density gradient centrifugation and at a density of 10 6 cells / ml RPMI 1640 culture medium (Gibco-BRL), 10% (v / v) fetal calf serum (Gibco-BRL) Incubation for 2 days with immobilized anti-CD3 antibody (OKT3, 1 ⁇ g / ml) and anti-CD28 antibody (15E6, 1 ⁇ g / ml) induced to CD30 + cells.
  • immobilized anti-CD3 antibody OKT3, 1 ⁇ g / ml
  • anti-CD28 antibody 15E6, 1 ⁇ g / ml
  • the cells were simultaneously incubated with the following oligonucleotides (40 ⁇ M each) at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • IL-10 interleukin-10
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 suppresses the IL-10 secretion in stimulated, hyperactivated lymphocytes in vitro, while the secretion of IFN- ⁇ remains unaffected.
  • Example 3 Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 suppresses the activation of NFKB in lymphocytes.
  • Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of healthy donors as described in Example 2, 2 days with immobilized anti-CD28 antibody (15E6, 16
  • the DNA binding activity of NFKB in the cell extract was determined using the "electrophoretic mobility shift assay” (EMSA) using the NFkB-binding double-stranded DNA sequence 5 ⁇ GTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3 ' (Santa Cruz Biotechnology, Cat. No. sc-2505; SEQ ID NO : 19) according to the described method (Naumann and Scheidereit, EMBO J. 13, 4597-4607, 1994).
  • the identity of the DNA-binding proteins was determined by "supershift” using the anti-p65 antibody C-20G (Santa Cruz Biotechnology, Cat. # Sc-372X) and the anti-p50 antibody C-19 (Santa Cruz Biotechnology, Cat. # sc-1190X) and detected by com- petition with blocking peptides (Santa Cruz Biotechnology, Cat. # sc-372P, sc-1190P).
  • the activated, DNA-binding form of p65 and p50 NFKB is suppressed in the presence of the oligonucleotide SEQ ID NO: 5 and the oligonucleotide SEQ ID NO: 10.
  • Example 4 Suppression of proliferation selectively from CD30 + and / or pp90rsk3 + cells.
  • Human normal fibroblasts were obtained from a skin biospy and cultured in DME medium (Gibco-BRL), 10% fetal calf serum (Gibco-BRL).
  • the Jurkat, Molt-4 and Raji lines were cultured in RPMI 1640 medium (Gico-BRL), 10% fetal calf serum.
  • the cells were incubated at a density of 5x10 4 cells / ml in parallel batches (A - E) with the following oligonucleotides (40 ⁇ M each) for 4 days at 37 ° C., 5% CO 2 :
  • the CD30 expression of the cells examined was determined using the FACS analysis
  • Pp90rsk3 is expressed in Jurkat, Molt-4 and Raji cells, but not in skin fibroblasts.
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 suppresses the proliferation of CD30 + and / or pp90rsk3 + cells, but not the proliferation of CD30 and pp90rsk3 cells. Double positive cells are suppressed better than single positive cells.
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 9 suppresses the proliferation of CD30 + cells only, but not of CD30 cells. This suppression is independent of whether pp90rsk3 is expressed.
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 15 suppresses the proliferation of pp90rsk3 + cells, but not pp90rsk- cells, regardless of whether CD30 is expressed.
  • Jurkat cells (10 5 cells / ml) were incubated in RPMI 1640 medium, 10% fetal calf serum in parallel batches (A - D) in the presence of the following oligonucleotides (40 ⁇ M each) at 37 ° C., 5% CO 2 : Approach A oligonucleotide SEQ ID NO: 5 6 ' GACGCGCATCCCCGG3 ' Approach B oligonucleotide SEQ ID NO: 10 5OCGGGGATGCGCGTC3 ' Approach C oligonucleotide NS SEQ ID NO: 18 5 ⁇ ATGGGGGCCCCCCC3 ' Approach D buffer without oligonucleotide
  • Annexin V-binding cells One of the earliest recognizable features of apoptotic cells is the presentation of phosphatidylserine on the cell surface, which creates a high binding affinity for Annexin V.
  • the number of Annexin V-binding cells was determined on day 3 by incubation with FITC-conjugated Annexin V (Coulter-Immunotech, Cat. No. 2375) and subsequent FACS analysis (FACScan, Becton Dickinson). Dead cells were marked by incubation with propidium iodide and excluded from the measurement.
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 and NO: 10 induce cell death by apoptosis in Jurkat cells. NS oligonucleotide does not show this property. 20th
  • Example 6 Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 selectively suppresses the formation of CD30 + cells in a lymphocyte preparation.
  • oligonucleotide SEQ ID NO: 5 5OACGCGCATCCCCGG3 '
  • Batch C buffer without oligonucleotide Batch D contains lymphocytes without antibody stimulation and oligonucleotides.
  • the number of CD30 + cells was then determined using the anti-CD30 antibody HRS4 (Coulter-Immunotech, Cat. No. 0705), the number of CD69 + cells using the FITC-anti-CD69 antibody (Coulter-Immunotech, Cat. No. 1943) , the number of CD4 + cells using the FITC-anti-CD4 antibody (Coulter-Immunotech, Cat. No. 6602393), the number of CD8 + cells using the PE-anti-CD8 antibody (Coulter-Immunotech, Cat. No. 0452) determined in the FACS analysis (FACScan, Becton Dickinson).
  • the proliferation and cellular activation were determined using the "Cell Proliferation Kit II" (XTT Test) (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 465 015).
  • the measured values (absorption A492 nm - 690 nm) of batch D were set equivalent to 1 and the measured values of batches A - C were standardized accordingly (stimulation index).
  • the oligonucleotide SEQ ID NO: 5 specifically suppresses cellular proliferation and cellular activation and prevents the formation of CD30 + cells when stimulated by anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies.
  • Cells with the early activation marker CD69 accumulate in the presence of SEQ ID NO: 5, but do not differentiate into CD30 + cells. The number of CD4 + and CD8 + cells remains unchanged.
  • Example 7 Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 selectively eliminates CD30 + cells in activated lymphocyte populations.
  • Lymphocytes from the peripheral blood of healthy donors were stimulated as described in Example 2 in parallel batches at a density of 106 cells / ml culture medium with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 antibodies for 2 days to induce CD30 + lymphocytes (batch B - D) . After CD30 + cells had formed in these batches, the batches were additionally incubated on day 3-5 in the presence of oligonucleotides (40 ⁇ M each).
  • the number of CD30 + cells was determined using the anti-CD30 antibody HRS4 (Coulter-Immunotech, Cat. No. 0705) and the FACS analysis (FACScan, Becton-Dickinson).
  • Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 reduces the number of activated CD30 + lymphocytes in an activated lymphocyte population.
  • CD30 + The specific elimination of CD30 + also occurs if the stimulation to differentiate into CD30 + cells continues.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, deren Derivate und sequenzspezifische Bindesubstanzen, die die Expression des CD30-Antigens und/oder der ribosomalen S6 Kinase pp90rsk3 hemmen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Nukleinsäuren enthalten, und die Verwendung von derartigen Nukleinsäuren zur Modulation zellularer Aktivierung, zur Unterdrückung und Verhinderung von Immundysregulationen, zur Minderung der Viruslast und zur Beseitigung von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen und deren Tumore.

Description

Nukleinsäuren zur Modulation zellulärer Aktivierung
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, deren Derivate und sequenzspezifische Bindesubstanzen, die die Expression des CD30-Antigens und/oder der ribosomalen S6 Kinase pp90rsk3 hemmen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige Nukleinsäuren enthalten, und die Verwendung von derartigen Nukleinsäuren zur Modulation zellulärer Aktivierung, zur Unterdrückung und Verhinderung von Immun- dysregulationen, zur Minderung der Viruslast und zur Beseitigung von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen und deren Tumore.
Die Zelle antwortet mit einem komplexen Netzwerk der zellulären Aktivierung auf Signale der Umwelt, um eine adäquate Reaktion zu gewährleisten. Der scheinbar unbegrenzten Vielzahl von physikalischen und chemischen Einflüssen steht der Zelle ein vielfältig modulierbares physiologisches Muster spezifischer Antworten durch zelluläre Aktivierung gegenüber. Dysregulationen der zellulären Aktivierung sind jedoch häufig, wobei deren auslösende Umwelteinflüsse oder die deregulierten Sig- nale der Zelle nur selten bekannt sind.
Das Spektrum der Erkrankungen mit deregulierter zellulärer Aktivierung ist vielfältig und umfaßt Zellen aller Gewebe und Differenzierungen, so z.B. Epithelzellen in Antwort auf bakterielle Toxine, oder Immunzellen in Antwort auf chronische virale Infek- tionen, chronisch-entzündliche und atopische Erkrankungen wie z.B. atopische Der- matitis (Neurodermitis). Einige dieser Erkrankungen sind sehr häufig, so Manifestationen des atopischen Syndroms mit bis zu 15% der Bevölkerung.
Aufgrund dieser erheblichen Vielfalt von Dysregulationen zellulärer Aktivierung wur- den bereits zahlreiche Verfahren entwickelt, mit denen die pathophysiologischen Regelkreise gezielt und zell-spezifisch durchbrochen werden. Jedoch sind die meisten Verfahren nur mit sehr begrenztem Erfolg anwendbar oder mit erheblichen Nebenwirkungen behaftet, insbesondere bei Verwendung systemisch wirksamer, sup- pressiver Substanzen, wie z.B. bei Immundysregulationen Corticosteriode oder de- ren Derivate, Vitamin D3, Cyclosporin, 15-Desoxyspergualin, Antikörper oder im- munsuppressive Zytokine (Übersicht: Sigal und Dumont, Fundamental Immunology, 3rd. ed., pp903-915, 1993; Ed: W.E. Paul; Raven Press, New York). Allen genannten Immunsuppressiva ist gemeinsam, daß sie nicht selektiv das gesamte Spektrum der Immunzellen supprimieren mit der Folge, daß ein erhöhtes Risiko für Infektionen und maligne Erkrankungen besteht. Die Entwicklung neuer Strategien wird jedoch auch durch die derzeitig noch ungenügenden Kenntnisse der Regelkreise zellulärer Akti- vierung erheblich erschwert.
Das CD30 Antigen ist ein phosphoryliertes 105 -120 kDa Membran-Glykoprotein, das aufgrund von Sequenzhomologien der TNF/NGF Rezeptor Familie zugeordnet wird und von einigen Lymphozyten-Subpopulationen exprimiert wird (Schwab et al., Nature 299, 65-67 (1982); WO93/10232; und Dürkop et al., Cell 68, 421 - 427, 1992). Das CD30 Antigen wird bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich, auf Th2 T- Zellen gefunden, insbesondere bei einer Subpopulation (15-20%) aktivierter CD45RO+ "memory" T-Zellen, von denen 85% der Zellen das CD4 Antigen koex- primieren. Zellen mit persistierenden viralen Infektionen und Zellen zahlreicher virus- assoziierter Tumore exprimieren ebenfalls das CD30 Antigen. Auch findet man eine hohe CD30 Expression bei den malignen Zellen des Hodgkin-Lymphoms. den sog. Reed-Stemberg Zellen, bei Zellen des anaplastischen Großzell-Lymphoms, und auf Zellen embryonaler und mesenchymaler Keimzell-Tumoren (Suster et al., Hum. Pathol. 29, 737-742, 1998).
Die Funktion des CD30 Moleküls in normalen Immunzellen ist bisher nicht im Detail geklärt (Romagnani, The Immunologist 6, 137 - 141 , 1998). CD30 Kreuzvernetzung auf der Zelloberfläche führt zu einer verwirrenden Vielzahl von zellulären Funktionen, z.B. zu einer Erhöhung der T-Zell Proliferation (Smith et al., Cell 73, 1349-1360, 1993), zur Induktion des Transkriptionsfaktors NFKB (McDonald et al., Europ. J. Im- munol. 25, 2870-2876, 1995), zur Induktion der HIV Genexpression in HIV infizierten T-Zellen (Biswas et al., Immunity 2, 587-596, 1995; Maggi et al., Immunity 3, 251- 255, 1995), zur Erhöhung des intrazellulären Calciums (Ellis et al., J. Immunol. 151 , 2380-2389, 1993) und zur Einleitung des Zelltods (Gruss et al., Blood 83, 2045- 2056, 1994).
Die ribosomalen S6 Kinasen (pp90rsk1 , rsk2, rsk3) bilden eine Familie von Mitogen- aktivierten Protein Kinasen. Sie sind ubiquitär in Zellen verschiedener Gewebe auf unterschiedlichem Niveau exprimiert. Die pp90rsk1 Kinase liegt funktioneil stromab- wärts der MAP Kinase in dem Ras-Raf-MEK-MAP Kinase Signalweg (Sturgill et al., Nature 334, 715-718, 1988; Blenis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 5889-5892, 1993). Sie phosphoryliert u.a. den Faktor lκBα und stimuliert dessen Abbau (Ghoda et al., J. Biol. Chem. 272, 21281-21288, 1997). Die pp90rsk3 Kinase ist im Gegensatz zur pp90rsk1 Kinase bisher wenig untersucht worden. Im Gegensatz zu pp90rsk1 stimulieren Wachstumsfaktoren, nicht aber ERK2/MAP Kinase die pp90rsk3 Autophosphorylierung. Nach Stimulierung der Zellen wird eine nukleare Translokation des pp90rsk3 Proteins beobachtet, was die Vermutung nahelegt, daß pp90rsk3 bisher nicht identifizierte nukleare Proteine phosphoryliert (Zhao et al., Mol. Cell. Biol. 15, 4353 - 4363, 1995).
Die Verwendung von sense und anti-sense orientierten Nukleinsäuren zur spezifi- sehen Hemmung der Gen-Expression ist ein dem Fachmann bekanntes Verfahren. Rationale Strategien zur Generierung derartig wirksamer Moleküle auf der Grundlage bekannter Gesetzmäßigkeiten bestehen jedoch z.Zt. nicht (Branch: "A good antisense molecule is hard to find", TIBS 23, 45-50, 1998). Anders ausgedrückt, ausgehend von einer bekannten DNA oder cDNA können Nukleinsäuren mit einer derartigen funktionellen Eigenschaft nicht zwingend abgeleitet werden.
Bei der Vielfalt möglicher Dysregulationen zellulärer Aktivierung wird ein Mittel zur spezifischen funktioneilen Suppression der Zellen gesucht, mit dessen Hilfe die pathophysiologischen Regelkreise der Autostimulation durchbrochen werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß bestimmte Nukleinsäuren (Oligonukleotide) in vivo an die CD30 und/oder die für die ribosomale S6 Kinase pp90rsk3 spezifische RNA, Gen- oder Promoter-DNA binden und eine gezielte funk- tionelle Suppression der Expression des CD30 Antigens und/oder der ribosomalen S6 Kinase pp90rsk3 (nachfolgend kurz "rsk3") bewirken. Weiterhin wurde gefunden, daß mit Hilfe dieser Nukleinsäuren CD30 und/oder rsk3 exprimierende Zellen eliminiert werden können. Im einzelnen wird durch die genannten Nukleinsäuren eine selektive funktioneile Suppression der Aktivierung von CD30+ und/oder pp90rsk3+ (nachfolgend "rsk3+") Zellen erzielt, die Aktivierung dieser Zellen verhindert, die de- regulierte Produktion zellulärer Substanzen revertiert, die aktivierungsinduzierte Proliferation unterdrückt, die Virusproduktion supprimiert und diese Zelle dem Zelltod zugeführt ohne erkennbare Schädigung anderer Zellen oder Gewebe.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit (1) Nukleinsäuren, deren Derivate und sequenzspezifische Bindesubstanzen (nachfolgend auch kurz "Nukleinsäuren" genannt), die die Expression des CD30-An- tigens oder der ribosomalen S6 Kinase pp90rsk3 ("rsk3") hemmen, wobei Nuklein- säuren, die spezifisch an die CD30 und/oder pp90rsk3 mRNA, Gen- oder Promoter- DNA binden, bevorzugt sind;
(2) pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine oder mehrere der in (1) definierten Nukleinsäuren; (3) Verwendung der in (1) definierten Nukleinsäuren zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der funktionellen Aktivität von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen und
(4) Verwendung der in (1) definierten Nukleinsäuren zur Herstellung eines Medikaments zur funktioneilen Unterdrückung und Elimination von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt die aus der EMBL database accession No. M83554 bekannte CD30 cDNA Sequenz. Bevorzugte Bindungsbereiche an die korrespondierende RNA oder genomische DNA sind unterlegt.
Figur 2 zeigt die aus der EMBL database accession No. X85106 bekannte rsk3 cDNA Sequenz. Bevorzugt Bindungsbereiche an die korrespondierende RNA oder genomische DNA sind unterlegt.
"Nukleinsäurederivate" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei Nukleinsäuren, bei denen ausgehend von dem natürlichen Nukleinsäuren mindestens eine dem Fachmann bekannte Modifikation an Nukleinbase, Zuckerkomponente oder Phos- phatverknüpfung vorgenommen wurde. Solche Modifikationen werden nachfolgend detailiert beschrieben. Unter "sequenzspezifische Bindesubstanzen" gemäß der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuren und andere Substanzen verstanden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie selektiv an definierte DNA- und/oder RNA- Sequenzen binden. Diese schließen auch solche Nukleinsäurederivate mit ein, bei denen zwei oder mehrere Modifikationen vorgenommen wurden und daher korrekterweise nicht mehr als Nukleinsäuren im engeren Sinne bezeichnet werden können. Bevorzugte Nukleinsäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotide und Oligonukleotidderivate, insbesondere solche die spezifisch an die CD30 und/oder rsk3 mRNA, Gen- oder Promoter-DNA binden. Dies kann dabei vorzugs- weise ein Oligonukleotid sein, das
(a) an CD30 mRNA, CD30 Gen DNA oder CD30 Promoter DNA bindet;
(b) an rsk3 mRNA, rsk3 Gen DNA oder rsk3 Promoter DNA bindet; (c) an CD30 und an rsk3 mRNA oder GenDNA bindet;
(d) eine CD30 DNA und/oder rsk3 Tripelhelix bildende Nukleinsäuren ist; oder
(e) ein Ribozym ist, das an CD30 und/oder pp90rsk3 mRNA bindet.
Die bevorzugte Länge der Oligonukleotide beträgt 8 - 20, insbesondere 9 bis 15 Basen. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung sind einzelsträngige Oligonukleotide mit identischer Nukleotidsequenz (sense-Orientierung) und mit komplementärer Nukleotidsequenz (anti-sense Orientierung) zur CD30 mRNA. Diese sind in der Lage, die Synthese des CD30 Antigens effektiv zu hemmen (Beispiel 1). Bevorzugt sind Oligonukleotide, die an die CD30 mRNA in den Regionen bp 140 - 170, bp 200 - 250, bp 265 - 300, bp 520 - 540, bp 600 - 940, bp 1200 - 1270, bp 1745 - 1790, bp 1885 - 1920 oder bp 2985 - 3005 binden (Numerierung der Basen entsprechend EMBL database accession no. M83554; Dürkop et al., Cell 68, 421- 427, 1992; Fig. 1 und SEQ ID NO:1). Als besonders effektiv erwiesen sich die in Ta- belle 1 genannten Oligonukleotide. Jedoch sind beliebige weitere Oligonukleotidse- quenzen möglich, die von der CD30 mRNA, Gen- oder Promotersequenz ableitbar sind.
Tabelle 1: CD30 Oligonukleotide
Bez. Sequenz Position zur CD30 Orientierung mRNA (M83554)
AS1 5'GACGCGCATCCCCGG3' 217-231 anti-sense
AS1 (2M) 5 'GACGCACAACCCCGG3 ' 217-231 anti-sense (mutiert)
ASA 5 'GGCCGGACGTGAGGT3 ' 202-216 anti-sense
ASL 5 'CAGCGCGGCGAGGAG3 ' 232-246 anti-sense
AS2 5OCTGTGGGAAGGCTC3' 273-288 anti-sense
S1 5OCGGGGATGCGCGTC3' 217-231 sense
S1-short 5ΑTGCGCGTC3' 223-231 sense
S5 5'CGCGTCCTCCTCGC3' 226-239 sense
S9 5'GTCCGGCCCCGGGG3' 208-222 sense
S16 5TGGGCGCCGCGCGCT3' 151-165 sense Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotide, die an die rsk3 spezifische mRNA, Gen- oder Promoter-DNA binden. Diese Oligonukleotide supprimieren die Synthese des rsk3 Proteins. Bevorzugt sind Oligonukleotide, die an die rsk3 mRNA in den Regionen bp 100 - 160, bp 1085 - 1125 oder bp 1540 - 1565 binden (Numerierung der Basenpaare entsprechend EMBL database accession No. X85106; Fig. 2 und SEQ ID NO:3). Beispiele besonders wirksamer Oligonukleotide sind in Tabelle 2 genannt.
Tabelle 2: rsk3 Oligonukleotide
Bez. Sequenz Position zur Orientierung rsk3 mRNA
AS1 5'GACGCGCATCCCCGG3' 122-136 anti-sense
S1 5'CCGGGGATGCGCGTC3' 127-136 sense
S1 -Short 5ΑTGCGCGTC3' 128-136 sense
RSK3ASA 5OATCCCAGGCGCGGG3' 107-121 anti-sense
RSK3ASB 5'GGCCGGGGGACGCGC3' 130-144 anti-sense
RSK3ASC 5OCCGCAGGGCCGGGG3' 137-151 anti-sense
Oligonukleotide in anti-sense Orientierung binden an die jeweilige RNA und verhindern effizient die CD30 bzw. rsk3 mRNA Translation. Oligonukleotide in sense Orientierung erwiesen sich als potente DNA Triple-Helix Bildner und als sehr effiziente Suppressoren der CD30 bzw. rsk3 RNA Transkription.
Die in Tabelle 1 genannten Oligonukleotide binden an CD30 spezifische DNA oder RNA Sequenzen, die in Tabelle 2 genannten Oligonukleotide an rsk3 spezifische DNA oder RNA Sequenzen. Das Oligonukleotid AS1 bindet sowohl an die CD30 mRNA als auch an die mRNA der rsk3 Kinase und hemmt die Translation und Funktion beider Proteine, rsk3 und CD30. Die Oligonukleotide S1 und S1-short binden sowohl an die CD30 Gen DNA als auch an die rsk3 Gen DNA und hemmen die Transkription beider RNA Spezies, der CD30 mRNA und der rsk3 mRNA. Die Oligonukleotide AS1 und S1 oder deren Derivate sind für die Suppression von rsk3 und CD30 bevorzugt und weisen eine herausragende Effizienz in den nachfolgend beschriebenen erfindungsgemäßen Verwendungen auf. 7
Die Oligonukleotide können lineare unmodifizierte DNA oder RNA Moleküle oder nach bekannten Verfahren modifizierte DNA oder RNA Molekül sein (Agrawal und lyer, Pharmakol. Ther. 76, 151 - 160, 1997). Beispiele sind zyklische Oligonukleotide (Kool, J. Am. Chem. Soc. 113, 6265-6266, 1991), Phosphorothioat Derivate, 2' O- methyl RNA, morpholino-modifizierte Oligomere, Me.thylphosphonate, PNA ("peptide nucleic acids"), N3'->P5' Phosphoramidate, oder sog. "clamp oligonucleotides" (Übersicht: Cohen, Adv. Pharmakol. 25, 319-339, 1993, Matteucci, Ciba Found. Symp. 209, 5-14, 1997, Sun et al., Curr. Opin. Stuct. Biol. 6, 327 - 333, 1996; Helene et al., Ciba Found. Symp. 209, 94 -102, 1997). Die Oligonukleotide können auch von viralen oder nicht-viralen Expressionsvektoren transkribiert werden, d. h., daß die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch als Bestandteile derartiger Vektoren vorliegen können.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Bestandteile von Ribozymen oder anderen enzymatisch aktiven Nukleinsäuren mit spezifischer Bindung an die CD30 und/oder rsk3 mRNA oder DNA vorliegen. Bevorzugt sind Ribozyme, deren spezifische Binderegion eines der in Tabelle 1 oder Tabelle 2 genannten Nukleotidsequenzen enthält. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Oligonukleotide und Ribozyme weisen dabei jedoch nicht die exakte Suequenz der in SEQ ID NO:1 und NO:3 gezeigten CD30 und rsk3 mRNAs auf.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann dabei neben einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren noch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten. Pharmazeutische Träger für Nukleinsäuren sind bevorzugt Lipide beispielsweise kationische oder anionische Liposomen oder Lipide wie DOPE (Dioleoyl-phosphatidyl- ethanolamin), DC-Chol (3ß[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]-Cholesterol oder DOTAP (1 ,2-Dioloyloxy-3-(Trimethylammonio)propan). Lipid-DNA Partikel eig- nen sich außerdem nach Kopplung mit einem geeigneten Liganden für den gewebespezifischen Nukleinsäuretransfer. Auch können virale, beispielsweise adenovirale, Partikel oder artifizielle Partikel genutzt werden, die Nukleinsäuren binden (komplexieren) und den DNA-Transfer in die Zellen erleichtern. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch ohne pharmakologische Träger übertragen werden, z.B. durch Nukleinsäurepräzipitation, Elektroporation, Injektion, Partikelbombardierung ("gene gun"). 8
In Experimenten konnte eine Vielzahl pharmakologischer Effekte für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gezeigt werden:
1. Es wurde gefunden, daß in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren CD30+ und/oder rsk3+ Zellen ihre spezifischen zellulären Funktionen und Syntheseleistungen, die mit der zellulären Aktivierung einhergehen (z.B. die Zytokinsyn- these), einstellen oder modulieren (Beispiel 2), CD30-rsk3- Zellen werden in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt.
2. Die induzierte und konstitutive zelluläre Aktivierung, beispielhaft gekennzeichnet durch NFKB Aktivierung, wird in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren spezifisch supprimiert (Beispiel 3). Dabei ist es unerheblich, ob die zelluläre Aktivierung nach chemischen oder physikalischen Einwirkungen erfolgt ist oder nach Kontakt mit Bakterien oder Viren oder deren Bestandteile oder auf der Grundlage unbe- kannter Stimuli erfolgt. In Folge der Applikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren verändert die Zelle ihre Funktionen dahingehend, daß die zelltypspezifische zelluläre Aktivierung supprimiert wird, was z.B. durch Suppression der Expression von endothelial cell adhesion molecule oder A20, mitochondriale Dehydrogenase (oder Mangansuperoxid Dismutase in CD30+ Zellen gekennzeichnet ist. Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist daher die funktionelle Suppression zellulärer Aktivierung selektiv von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen, ohne die funktionelle Aktivität anderer Zellen unmittelbar zu verändern. CD30+ und/oder rsk3+ (Tumor)zellen können in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in einen Status überführt werden, der die Zellen empfindlich macht für Chemotherapeutika-, Zytokin- oder strahleninduzierten Zelltod.
3. Es wurde gefunden, daß bei bestehender Immundysregulation das physiologische Th1/Th2 T-Zell Gleichgewicht durch eine spezifische funktionelle Suppression von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren wieder hergestellt wird, was gekennzeichnet ist durch die Änderung der Sekretion bestimmter Zytokine und anderer Effektorsubstanzen (Beispiel 2).
4. Es zeigte sich weiterhin, daß selektiv CD30+ und/oder rsk3+ Zellen in Gegenwart der erfindungsgemäßen Oligonukleotide ihre Proliferation einstellen (Beispiel 4) und dem Zelltod unterliegen (Beispiel 5). Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist daher die Suppression und die Verhinderung des Wachstums von malignen und benignen CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen, von Tumoren und von Gewebe-Infiltrationen, Mikroabsiedlungen und Metastasierungen dieser Zellen und die Verhinderung der Rezidivierung von Tumoren dieser Zellen. Beispiele für derartige Tumore sind das Hodgkin-Lymphom, das anaplastische Großzell-Lymphom, T- Zell-Leukämie, Keimzelltumore und embryonale Karzinome. Eine weitere Verwen- düng ist beispielsweise die Elimination von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen, beispielsweise aus Transplantaten, Knochenmarksbiopsien, etc. beim Purging oder aus dem Blut (Beispiel 7), beispielsweise von Atopikem oder Pollenallergikern.
5. Es wurde gefunden, daß Blutlymphozyten in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht zur Entwicklung von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen stimuliert werden können (Beispiel 6). Auch kann keine Hyperstimulation der Zellen induziert werden. Es wurde gezeigt, daß eine anhaltende, hohe Sekretion von IL-10, wie sie nach wiederholter Stimulation von Lymphozyten mit Antigen zu beobachten ist, in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren unterdrückt wird, während die von IFN-gamma unbeeeinflußt bleibt (Beispiel 2). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können daher zur spezifischen Prävention einer Immunhyperstimulation, die mit der Entwicklung von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen einhergeht, verwendet werden, während andere Immunstimulationen unbeeinflußt bleiben. Diese Verwendungsform ist außerordentlich vielfältig, beispielhaft sind genannt die Verwendung zur Verhinderung der Akkumulation von CD30+ Lymphozyten im Blut bei Atσpikern oder bei Patienten mit Pollenallergie und damit verbunden eine Unterdrückung der akuten Symptomatik der Erkrankung.
6. Es wurde gefunden, daß in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren die Produktion zahlreicher Viren in virusinfizierten Zellen supprimiert ist. Bevorzugt ist diese Anwendungsform bei Zellen mit persistierender Virusinfektion zur Unterdrük- kung der Virusproduktion und der Verringerung der "Viruslast" (virus load) der Zellen. Das Anwendungsspektrum dieser Ausführungsform der Erfindung ist sehr vielfältig, da zahlreiche persistierende Virusinfektionen mit permanenter oder induzierbarer Produktion infektiöser Viruspartikel bekannt sind. Beispielhaft sind hier genannt die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Unterdrückung der Produktion von Human Immundefizienz Virus (HIV), Epstein-Barr Virus, von Hepatitis Viren, Human T-Leukämie-Viren I und II, sowie die Anwendung zur Verringerung der Viruslast in infizierten Zellen und zur Minderung der Neuinfektionen mit dem Ziel der Reduktion der Zahl infizierter Zellen. Beispielsweise wurde durch Bestimmung der reversen Transkriptase gefunden, daß im zellfreien Kulturüberstand von Blut-Lym- phozyten HlV-infizierter Spender in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäu- 10
ren, bevorzugt die in Tabelle 1 und Tabelle 2 genannten Nukleinsäuren, ein um den Faktor 10-100 verminderter Titer von HI-Viren vorliegt im Vergleich zur Inkubation ohne Nukleinsäuren oder der "non-sense" Nukleinsäure. Dieses demonstriert, daß die Freisetzung von HI-Viren (Virusproduktion) einer infizierten Lymphozyten-Popu- Iation in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren supprimiert ist. Weiterhin wurde mit Hilfe der RT-PCR gefunden, daß die Kopienzahl der HI-Virus Genome in dieser Kultur um den Faktor 10-100 reduziert ist, was demonstriert, daß die „Viruslast" (virus load) dieser Lymphozyten-Population supprimiert ist.
7. Es wurde weiterhin gefunden, daß rsk3 spezifische Oligonukleotide die Pseudo- monas aeruginosa-induzierte Mucin-Überproduktion, bevorzugt von MUC2, in Epithelzellen hemmen. Bevorzugte Anwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind bei Erkrankungen mit Überproduktion von Muchen durch respiratorische Epithelzellen, z.B. bei Patienten mit zystischer Fibröse.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder deren Derivate zur Herstellung von Medikamenten, die zum Beispiel zur Modulation der funktioneilen Aktivität von CD30+ und/oder pp90rsk+ Zellen sowie zur funktionellen Unterdrückung und Elimination von CD30+ und/oder pp90rsk+ Zellen geeignet sind. Unter "Modulation der funktioneilen Aktivität" und "funktioneller Unterdrückung und Elimination" von CD30+ und/oder 90rsk+ Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung sind dabei unter anderen die folgenden Parameter (Krankheiten) zu verstehen:
- Unterdrückung und Verhinderung zellulärer Aktivierung; - Modulation der funktioneilen Aktivität von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen;
- Minderung der Viruslast und Virusproduktion;
- Unterdrückung des Entstehens und der Proliferation von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen;
- Einleitung des Zelltods von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen; - Unterdrückung und Verhinderung von Dysregulationen zellulärer Aktivierung, bevorzugt Immundysregulationen, atopischer Reaktivität, chronisch entzündlichen Erkrankungen, bevorzugt Colitis, Transplantatabstoßung;
- Behandlung von Virus-, Bakterien- und Parasiteninfektionen;
- Behandlung und Verhinderung von Tumoren von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zel- len; und
- funktioneilen Unterdrückung und Elimination von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen. 11
Im einzelnen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beispielhaft für die folgenden Zwecke verwendet werden: zur Suppression und Prävention zellulärer Aktivierung und deren Dysregulationen, Immundysregulationen, chronischen Entzündungen, Colitis, atopische Reaktionen,
Neurodermitis, Autoimmunreaktionen, Transplantatabstoßungen, systemische Sklerose; zur Verringerung der Virusproduktion und/oder Viruslast von CD30+- und/oder rsk3+- Zellen; zur Unterdrückung der Entstehung, Proliferation, Tumorbildung und Gewebepenetration von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Unterdrückung der Produktion zellulärer Substanzen, die mit der zellulären Aktivierung von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen einhergeht; zur Veränderung des Gewebegleichgewichts von aktivierten CD30+- und/oder rsk3+- Zellen einerseits und anderen aktivierten oder ruhenden Zellen andererseits, Beeinflussung des Th1/Th2-Gleichgewichts der Immunzellen; zur Elimination der CD30+ und/oder rsk3+ Zellen in Geweben, Körperflüssigkeiten, Biopsaten oder Transplantaten in vivo und in vitro; zur Unterdrückung zellulärer Aktivierung bei CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; . zur Unterdrückung der Überproduktion zellulärer Substanzen bei CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Veränderung des Spektrums synthetisierter zellulärer Substanzen bei CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Hemmung der Proliferation von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Elimination der Zellen von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Einleitung des Zelltods von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Minderung der Viruslast ("virus-load") und der Produktion von Viren bei CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Verhinderung zellulärer Aktivierung; zur Beeinflussung des Gleichgewichts von Immunzellen; zur Verhinderung der Entstehung von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Unterdrückung und Verhinderung von Immundysregulationen, atopischen Reaktivität, Neurodermitis, atopische Dermatitis, Autoimmunerkrankungen, systemischer Sklerose, chronisch entzündlichen Erkrankungen, bevorzugt Colitis; zur Behandlung von chronischen Virus und Bakterien Infektionen; zur Unterdrückung und Präventition von Transplantatabstoßung (allograft rejection); 12
zur Unterdrückung und Prävention zellulärer Aktivierung bei chemischen und physikalischen Einwirkungen, Umwelt-Noxen, ionisierende Strahlen, Bakterien oder Viren oder deren Bestandteile; zur Behandlung von malignen und benignen Tumoren von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen, Suppression oder Verhinderung der Tumorbildung von CD30+ und/oder rsk3+ Zellen; zur Elimination von Zellen aus Körperflüssigkeiten oder Geweben; und zur Suppression der Mucin-Überproduktion.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Behandlung der vorstehend genannten Krankheiten, umfassend die Verabreichung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung und zur Prävention der vorstehend genannten Erkrankungen oder Symptome, umfassend die lokale oder systemische Verabreichung der erfindungsgemäßen Nuklein- säuren oder deren Derivate, bevorzugt mit geeigneten pharmakologischen Trägern.
Hierzu werden bei lokalen Anwendungen, beispielsweise bei der atopischen Derma- titis, Salben oder Lotionen, enthaltend bevorzugt 10 mM bis 1 M eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Oligonukleotide, vorzugsweise Oligonukleoditd AS1 , einmal bis dreimal täglich aufgetragen bei einer Behandlungsdauer bis zur Beendigung der akuten Symptomatik, oder präventiv Salben oder Lotionen, enthaltend 0,1 mM bis 100 mM eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, vorzugsweise Oligonukleotid AS1 , einmal täglich lokal aufgetragen. Alternativ können Injektionen in oder in Nähe der Efflorezenzen verabreicht werden, bevorzugt in Form von Injek- tions-Infiltrationen mit Lösungen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in Verbindung mit geeigneten pharmakologischen Trägern enthalten.
Die systemische Behandlung, beispielsweise von intestinalen chronisch-inflammato- rischen Erkrankungen, umfaßt die Verabreichung der erfindungsgemäßen Nuklein- säuren mit geeigneten pharmakologischen Trägern, bevorzugt in Dosen von 100 μg bis 10 g pro Dosis bei 1 - 6 parenteralen oder oralen Dosen pro Tag und einer Behandlungsdauer bis zur Suppression der aktuten Symptomatik. Zur Prävention oder Erhaltung eines Status ist eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in ein- bis zweimaligen Dosen pro Tag bevorzugt. Andere Dosierungsschemata sind entsprechend dem Verlauf der Erkrankungen jedoch ebenso möglich. So können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, bevorzugt als Phosphorothioate Oligonukleotide, auch systemisch als kontinuierliche Infusion in Dosen von 0,05 - 0,5 13
mg/kg Köpergewicht/h für eine Dauer von 5-10 Tagen verabreicht werden. Alternative Dosierungsschemata sind die Infusion von 0,2 - 6 mg Oligonukleotid/m2 Körperoberfläche/Tag bei einer Dauerinfusion über 2-8 Tage. Bevorzugt werden kontinuierliche Infusionen bei der systemischen Immunmodulation und bei dissimierten benig- nen und malignen Proliferationen von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen.
Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur ex vivo Behandlung von Körperflüssigkeiten und Biopsaten, beispielsweise das Purging von Knochenmarkstransplantaten. Hierbei wird das Transplantat in Gegenwart der erfindungsgemäßen Nuklein- säuren inkubiert. Die Inkubation der Nukleinsäuren erfolgt vorzugsweise mit Dosen von 10 μM bis 10 mM über 1 - 2 Tage. Die bevorzugte Nukleinsäure für dieses Verfahren ist das Oligonukleotid AS1.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 : Spezifische Suppression der CD30 und pp90rsk3 Expression in Jurkat Zellen.
Jurkat Zellen (ATCC TIB-152) (CD30+, pp90rsk3+) wurden in einer Dichte von 5 x 104 Zellen pro ml RPMI 1640 Kulturmedium (Gibco-BRL), 10% (v/v) fötales Kälberserum (Gibco-BRL) in parallelen Ansätzen (Ansatz A-F) in Gegenwart folgender Oligonukleotide (je 40 μM) für 2 Tage bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Ansatz A: Oligonukleotid SEQ ID NO:5 5'GACGCGCATCCCCGG3'
Ansatz B: Oligonukleotid SEQ ID NO:10 5OCGGGGATGCGCGTC3'
Ansatz C: Oligonukleotid SEQ ID NO:9 5 'CCTGTGGGAAGGCTC3 '
Ansatz D: Oligonukleotid SEQ ID NO:15 5OATCCCAGGCGCGGG3'
Ansatz E: "non-sense" Oligonukleotid (NS Oligonukleotid) SEQ ID NO: 18 5ΑATGGGGGCCCCCCC3'
Ansatz F: kein Oligonukleotid
In der anschließenden Western Blot Analyse wurde CD30 (120 kD), pp90rsk1 (90 kD), pp90rsk3 (90 kD), Aktin (48 kD) unter Verwendung folgender Antikörper nach- gewiesen: anti-CD30 Antikörper HRS4 (1 :2.000) (Coulter-Immunotech; Cat # 0705) anti-rskl Antikörper C-21 (1 :1.000) (Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-231) 14
anti-rsk3 Antikörper C-20 (1:1.000) (Santa Cruz Biotechnology; Cat # sc-1431) anti-Aktin Antikörper (1 :2.000) (Calbiochem, Cat # CP01 )
Die spezifischen Banden der Western Blots wurden densitometrisch vermessen, die Signalstärke der jeweiligen Banden in Ansatz F wurde äquivalent 1 gesetzt.
Tabelle 3
Ansatz: A B C D E F
Protein Nr. 5 Nr. 10 Nr. 9 Nr. 15 NS —
CD30 0,3 0,3 0,4 1 ,0 1 ,1 1 pp90rsk3 n.t. n.t. 0,9 0,4 1 ,0 1 pp90rsk1 1 ,0 1 ,1 n.t. 1 ,0 0,9 1
Aktin 1 ,1 1 ,0 1 ,1 0,9 1 ,0 1
n.t. nicht getestet
Ergebnis
1. Die Oligonukleotide SEQ ID NO:5, NrO:9 und NO:10 supprimieren die CD30 Protein- Expression.
2. Oligonukleotid SEQ ID NO:15 supprimiert die pp90rsk3 Expression, ohne die CD30 Expression zu beeinflussen. 3. Oligonukleotid SEQ ID NO:9 supprimiert die CD30 Expression, ohne die pp90rsk3 Expression zu beeinflussen.
4. Die Wirkung der getesteten Oligonukleotide ist spezifisch, da die Expression von pp90rsk1 und von Aktin nicht verändert ist.
Beispiel 2: Lymphozyten sezernieren ein verändertes Spektrum von Zytokinen in Gegenwart von Oligonukleotid SEQ ID NO:5.
Lymphozyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern mit Hilfe einer Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und in einer Dichte von 106 Zellen/ml RPMI 1640 Kulturmedium (Gibco-BRL), 10% (v/v) fötales Kälberserum (Gibco-BRL) durch Inkubation für 2 Tage mit immobilisiertem anti-CD3 Antikörper (OKT3, 1 μg/ml) und anti-CD28 Antikörper (15E6, 1 μg/ml) zu CD30+ Zellen induziert. In parallelen 15
Ansätzen wurden die Zellen zugleich mit folgenden Oligonukleotiden (je 40 μM) bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
Ansatz A Oligonukleotid SEQ ID NO:5 5OACGCGCATCCCCGG3'
Ansatz B NS Oligonukleotid SEQ ID NO: 18 5YAATGGGGGCCCCCCC3' Ansatz C Puffer ohne Oligonukleotid
Anschließend wurde die Konzentration von lnterleukin-10 (IL-10) und Interferon- gamma (IFN-γ) im zellfreien Kulturüberstand mit Hilfe von ELISA Tests (Biotrend, Cat.Nr. CY-1 IA35-K, CYTO 07) bestimmt.
Tabelle 4: Konzentration von IL-10 und IFN-γ im Kulturüberstand
IL-10 (pg/ml) IFN-γ (pg/ml)
Ansatz A 277 1461
Ansatz B 567 1464 Ansatz C 834 1507
Ergebnis
Oligonukleotid SEQ ID NO:5 supprimiert die IL-10 Sekretion bei stimulierten, hyper- aktivierten Lymphozyten in vitro, während die Sekretion von IFN-γ unbeeinflußt bleibt.
Dieses demonstriert eine selektive Modulation der Sekretion definierter Zytokine, wodurch eine veränderte Reaktivität der Lymphozyten herbeigeführt wird (spezifische Immunmodulation).
Beispiel 3: Oligonukleotid SEQ ID NO:5 supprimiert die Aktivierung von NFKB in Lymphozyten.
Lymphozyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert, 2 Tage mit immobilisiertem anti-CD28 Antikörper (15E6, 16
1 μg/ml) und anti-CD3 Antikörper (OKT3, 1 μg/ml) bei 37°C, 5% CO2 aktiviert und anschließend für weitere 2 Tage in einer Dichte von 106 Zellen/ml in parallelen Ansätzen (A - D) in Gegenwart folgender Oligonukleotide (je 40 μM) inkubiert: Ansatz A Oligonukleotid SEQ ID NO:5 5OACGCGCATCCCCGG3' Ansatz B Oligoonukleotid SEQ ID NO:10 5OCGGGGATGCGCGTC3'
Ansatz C NS Oligonukleotid SEQ ID NO:18 ' 5ΑATGGGGGCCCCCCC3'
Ansatz D Puffer ohne Oligonukleotid
Die DNA-Bindungsaktivität von NFKB im Zeil-Extrakt wurde mit Hilfe des "electrophoretic mobility shift assays" (EMSA) unter Verwendung der NFkB bindenden doppelsträngigen DNA-Sequenz 5ΑGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3' (Santa Cruz Biotechnology, Cat. Nr. sc-2505; SEQ ID NO: 19) nach beschriebenem Verfahren (Naumann und Scheidereit, EMBO J. 13, 4597-4607, 1994) bestimmt. Die Identität der DNA-bindenden Proteine wurde durch "supershift" unter Verwendung des anti-p65 Antiköpers C-20G (Santa Cruz Biotechnology, Cat.# sc-372X) und des anti- p50 Antikörpers C-19 (Santa Cruz Biotechnology, Cat. # sc-1190X) und durch Kom- petition mit blockierenden Peptiden (Santa Cruz Biotechnology, Cat. # sc-372P, sc- 1190P) nachgewiesen.
Tabelle 5: DNA-Bindung von NFKB in der EMSA Analyse
NFKB p65 p50
Ansatz A
Ansatz B
Ansatz C + +
Ansatz D + +
keine nachweisbare DNA-Bindung + DNA-Bindung
Ergebnis 17
Die aktivierte, DNA-bindende Form von p65 und p50 NFKB wird in Gegenwart des Oligonukleotids SEQ ID NO:5 und des Oligonukleotids SEQ ID NO: 10 supprimiert.
Da die aktivierte Form von NFKB für wesentliche Schritte der zellulären Aktivierung benötigt wird, demonstriert dieses Ergebnis, daß in Gegenwart der Oligonukleotide SEQ ID NO:5 und NO: 10 die zelluläre Aktivierung in einem zentralen Schritt unterbrochen wurde.
Beispiel 4: Suppression der Proliferation selektiv von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen.
Menschliche normale Fibroblasten wurden aus einer Haut-Biospie gewonnen und in DME-Medium (Gibco-BRL), 10% fötales Kälberserum (Gibco-BRL) kultiviert. Die Zellen der Linien Jurkat, Molt-4 und Raji wurden in RPMI 1640 Medium (Gico-BRL), 10% fötales Kälberserum kultiviert. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5x104 Zellen/ml in parallelen Ansätzen (A - E) mit folgenden Oligonukleotiden (je 40 μM) 4 Tage bei 37°C, 5% CO2 inkubiert:
Ansatz A Oligonukleotid SEQ ID NO:5 5'GACGCGCATCCCCGG3'
Ansatz B Oligonukleotid SEQ ID NO:9 5OCTGTGGGAAGGCTC3' Ansatz C Oligonukleotid SEQ ID NO:15 5OATCCCAGGCGCGGG3'
Ansatz D Oligonukleotid NS SEQ ID NO:18 5ΑATGGGGGCCCCCCC3'
Ansatz E Puffer ohne Oligonukleotid
Am Tag 4 wurde die Proliferation der Zellen mit Hilfe des "Cell Proliferation Kit II" (XTT Test) (Boehringer Mannheim, Kat.Nr. 1 465 015) bestimmt. Die Meßwerte
(Absorption A492 nm - A690 nm) des Ansatzes E wurden äquivalent 1 gesetzt und die Meßwerte der Ansätze A - D entsprechend normiert.
Die CD30 Expression der untersuchten Zellen wurde mit Hilfe der FACS Analyse
(FACScan, Becton Dickinson) unter Verwendung des Antikörpers HRS4 (Coulter- Immunotech, Cat.Nr. 0705) bestimmt. Die pp90rsk3 Expression wurde mit Hilfe der
Western Blot Analyse unter Verwendung des anti-rsk3 Antikörpers C-20 (Santa Cruz
Biotechnology, Cat. # sc-1431) bestimmt. 18
Tabelle 6: Proliferation von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen in Gegenwart der Oligonukleotide
Zeil-Linie Ansatz A B D
Jurkat CD30+ 0,29 0,44 0,28 0,89 (ATCC TIB-152) pp90rsk3+
Molt-4 CD30+ 0,56 0,79 0,56 1 ,05
(ATCC CRL-1582) pp90rsk3+
Raji CD30- 0,63 0,91 0,53 0,92
(ATCC CCL-86) pp90rsk3+
Haut-Fibroblasten CD30- 0,98 0,92 1 ,0 1 ,0 1 pp90rsk3-
Ergebnis
1. Jurkat Zellen exprimieren das CD30 Antigen sehr stark auf der Oberfläche, Molt-4 Zellen nur sehr schwach. Bei Raji-Zellen und Haut-Fibroblasten konnte keine CD30
Expression auf der Zelloberfläche gemessen werden. In Jurkat, Molt-4 und Raji Zellen ist pp90rsk3 exprimiert, jedoch nicht in Haut-Fibroblasten.
2. Oligonukleotid SEQ ID NO:5 supprimiert die Proliferation von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen, jedoch nicht die Proliferation von CD30- und pp90rsk3- Zellen. Doppelt-positive Zellen werden besser supprimiert als einfach-positive Zellen.
3. Oligonukleotid SEQ ID NO:9 supprimiert die Proliferation ausschließlich von CD30+ Zellen, nicht aber von CD30- Zellen. Diese Suppression ist unabhängig davon, ob pp90rsk3 exprimiert ist.
4. Oligonukleotid SEQ ID NO: 15 supprimiert die Proliferation pp90rsk3+ Zellen, nicht aber pp90rsk- Zellen, unabhängig davon, ob CD30 exprimiert ist.
5. Zellen, die durch die Oligonukleotide in ihrer Proliferation gehemmt wurden, unterliegen dem Zelltod, während ungehemmt proliferierende Zellen keine Anzeichen einer erhöhten Frequenz von Zelltod zeigten. 19
Beispiel 5: Apoptose-Induktion von Jurkat Zellen
Jurkat-Zellen (105 Zellen/ml) wurden in RPMI 1640 Medium, 10% fötales Kälberserum in parallelen Ansätzen (A - D) in Gegenwart folgender Oligonukleotide (je 40 μM) drei Tage bei 37°C, 5% CO2 inkubiert: Ansatz A Oligonukleotid SEQ ID NO: 5 6 'GACGCGCATCCCCGG3 ' Ansatz B Oligonukleotid SEQ ID NO: 10 5OCGGGGATGCGCGTC3' Ansatz C Oligonukleotid NS SEQ ID NO: 18 5ΑATGGGGGCCCCCCC3' Ansatz D Puffer ohne Oligonukleotid
Eines der frühesten erkennbaren Merkmale apoptotischer Zellen ist die Präsentation von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche, wodurch eine hohe Bindungsaffinität zu Annexin V entsteht. Zum Nachweis apoptotischer Zellen wurde am Tag 3 die Anzahl Annexin V bindender Zellen durch Inkubation mit FITC-konjugiertem Annexin V (Coulter-Immunotech, Cat. Nr. 2375) und anschließender FACS Analyse (FACScan, Becton Dickinson) bestimmt. Tote Zellen wurden durch Inkubation mit Propidiumjo- did markiert und aus der Messung ausgeschlossen.
Tabelle 7
Oligonukleotid Annexin V+ Zellen
Ansatz A SEQ ID NO:5 12,5 %
Ansatz B SEQ ID NO:10 9,4 %
Ansatz C SEQ ID NO:18 1 ,0 %
Ansatz D - 0,6 %
Ergebnis
Oligonukleotid SEQ ID NO:5 und NO: 10 induzieren Zelltod durch Apoptose bei Jurkat Zellen. NS Oligonukleotid zeigt nicht diese Eigenschaft. 20
Beispiel 6: Oligonukleotid SEQ ID NO:5 unterdrückt selektiv die Entstehung von CD30+ Zellen in einer Lymphozyten-Präparation.
Ruhende Lymphozyten aus dem peripheren Blut gesunder Spender wurden wie in Beispiel 2 beschrieben in parallelen Ansätzen (A-C) in einer Dichte von 106 Zellen /ml Kulturmedium mit immobilisierten anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern zur CD30 Expression stimuliert. Zugleich wurden die Zellen in parallelen Ansätzen in Gegenwart von Oligonukleotiden (je 40 μM) 4 Tage bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Ansatz A Oligonukleotid SEQ ID NO:5 5OACGCGCATCCCCGG3'
Ansatz B NS Oligonukleotid SEQ ID NO:18 5ΑATGGGGGCCCCCCC3'
Ansatz C Puffer ohne Oligonukleotid Ansatz D enthält Lymphozyten ohne Antikörper-Stimulation und Oligonukleotide.
Anschließend wurde die Anzahl CD30+ Zellen mit Hilfe des anti-CD30 Antikörpers HRS4 (Coulter-Immunotech, Cat. Nr. 0705), die Anzahl CD69+ Zellen mit Hilfe des FITC-anti-CD69 Antikörpers (Coulter-Immunotech, Cat. Nr. 1943), die Anzahl CD4+ Zellen mit Hilfe des FITC-anti-CD4 Antikörpers (Coulter-Immunotech, Cat. Nr. 6602393), die Anzahl CD8+ Zellen mit Hilfe des PE-anti-CD8 Antikörpers (Coulter- Immunotech, Cat. Nr. 0452) in der FACS Analyse (FACScan, Becton Dickinson) bestimmt.
Parallel zu diesen Ansätzen wurde die Proliferation und zelluläre Aktivierung mit Hilfe des "Cell Proliferation Kit II" (XTT Test) (Boehringer Mannheim, Kat.Nr. 1 465 015) bestimmt. Die Meßwerte (Absorption A492 nm - 690 nm) des Ansatzes D wurden äquivalent 1 gesetzt und die Meßwerte der Ansätze A - C entsprechend normiert (Stimulationsindex).
Tabelle 8: FACS Analyse
CD30+ Zellen CD69+ Zellen CD4+ Zellen CD8+ Zellen
Ansatz A 16,6 % 64,0 % 47 % 32 %
Ansatz B 49,8 % 45,4 % 45 % 30 % Ansatz C 51,3 % 35,6 % 48 % 31 % 21
Ansatz D 0,6 % 1 ,3 % 44 % 35 %
Tabelle 9: "Cell proliferation assay"
Stimulation Oligonukleotid Stimulationsindex
Ansatz A anti-CD3, anti-CD28 SEQ ID NO: 5 0,78
Ansatz B anti-CD3, anti-CD28 SEQ ID NO.J8 1 ,35
Ansatz C anti-CD3, anti-CD28 — 1 ,50
Ansatz D — — 1
Ergebnis
Das Oligonukleotid SEQ ID NO:5 unterdrückt spezifisch die zelluläre Proliferation und zelluläre Aktivierung und verhindert die Entstehung von CD30+ Zellen bei Sti- mulation durch anti-CD3 plus anti-CD28 Antikörper.
Zellen mit dem frühen Aktivierungsmarker CD69 akkumulieren in Gegenwart von SEQ ID NO:5, differenzieren aber nicht zu CD30+ Zellen. Die Anzahl der CD4+ und der CD8+ Zellen bleibt unverändert.
Beispiel 7: Oligonukleotid SEQ ID NO:5 eliminiert selektiv CD30+ Zellen in aktivierten Lymphozyten-Populationen.
Lymphozyten aus dem peripheren Blut gesunder Spender wurden wie in Beispiel 2 beschrieben in parallelen Ansätzen in einer Dichte von 106 Zellen /ml Kulturmedium mit immobilisierten anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern 2 Tage zur Induktion von CD30+ Lymphozyten stimuliert (Ansatz B - D). Nachdem CD30+ Zellen in diesen Ansätzen entstanden waren, wurden die Ansätze am Tag 3 - 5 zusätzlich in Gegenwart von Oligonukleotiden (je 40 μM) inkubiert. Ansatz A Ansatz B anti-CD3, anti-CD28 Antikörper -
Ansatz C anti-CD3, anti-CD28 Antikörper Oligonukleotid SEQ ID NO:5 Ansatz D anti-CD3, anti-CD28 Antikörper NS Oligonukleotid SEQ ID NO: 18 22
Die Anzahl CD30+ Zellen wurde mit Hilfe des anti-CD30 Antikörpers HRS4 (Coulter- Immunotech, Cat. Nr. 0705) und der FACS Analyse (FACScan, Becton-Dickinson) bestimmt.
Tabelle 10
Stimulation Oligonukleotid CD30+ Zellen
Ansatz A — ~ 0,7 %
Ansatz B anti-CD3, anti-CD28 — 52 %
Ansatz C anti-CD3, anti-CD28 SEQ ID NO:5 13 %
Ansatz D anti-CD3, anti-CD28 SEQ ID NOJ8 48 %
Ergebnis
1. Oligonukleotid SEQ ID NO:5 verringert die Anzahl aktivierter CD30+ Lymphozyten in einer aktivierten Lymphozyten-Population.
2. Die spezifische Elimination von CD30+ geschieht auch dann, wenn die Stimulation zur Differenzierung zu CD30+ Zellen fortbesteht.

Claims

23Patentansprüche
1. Nukleinsäure, deren Derivate und sequenzspezifische Bindesubstanzen (Nukleinsäuren), die die Expression des CD30-Antigens oder der ribosomalen S6
Kinase pp90rsk3 (rsk3) hemmen.
2. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 , die spezifisch an die CD30 und/oder rsk3 mRNA, Gen- oder Promoter-DNA binden.
3. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 oder 2, die Oligonukleotide oder Oligonuleotid- derivate, insbesondere mit 8 bis 20 Basen sind.
4. Nukleinsäuren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, die ausge- wählt sind aus Nukleinsäuren, die
(a) an CD30 mRNA, CD30 Gen DNA oder CD30 Promoter DNA binden;
(b) an rsk3 mRNA, rsk3 Gen DNA oder rsk3 Promoter DNA binden;
(c) an CD30 und an rsk3 mRNA binden;
(d) CD30 DNA und/oder rsk3 DNA Tripelhelix bildende Nukleinsäuren sind; oder (e) Ribozyme sind, die an CD30 und/oder pp90rsk3 mRNA binden.
5. Nukleinsäuren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, die eine Teilsequenz der CD30 mRNA, Gen DNA oder Promoter DNA umfassen, oder die eine Sequenz umfassen, die komplementär zu einer solchen Teilsequenz der CD30 mRNA, Gen DNA oder Promoter DNA ist.
6. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 5, wobei die Teilsequenz ein mindestens 8 konsekutive Basen langes Fragment aus den Regionen bp 140 - 170, bp 200 - 250, bp 265 - 300, bp 520 - 540, bp 600 - 940, bp 1200 - 1270, bp 1745 - 1790, bp 1885 - 1920 oder bp 2985 - 3005 der SEQ ID NO:1 ist.
7. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die Teilsequenz ein mindestens 9 konsekutive Basen langes Fragment aus den Regionen bp 140 - 170, bp 200 - 250 oder bp 265 - 300 der SEQ ID NO:1 ist.
8. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 7, die eine der folgenden Sequenzen 5'GACGCGCATCCCCGG3\ 24
5OACGCACAACCCCGG3', 5 'GGCCGGACGTGAGGT3 ', 5OAGCGCGGCGAGGAG3', 5OCTGTGGGAAGGCTC3', 5OCGGGGATGCGCGTC3', 5ΑTGCGCGTC3', 5OGCGTCCTCCTCGC3', 5OTCCGGCCCCGGGG3' oder 5TGGGCGCCGCGCGCT3' aufweisen.
9. Nukleinsäuren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, die eine Teilsequenz der rsk3 mRNA, Gen DNA oder Promoter DNA umfassen, oder die eine Sequenz umfassen, die komplementär zu einer Teilsequenz der rsk3 mRNA, Gen DNA oder Promotor DNA ist.
10. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 9, wobei die Teilsequenz ein mindestens 8 konsekutive Basen langes Fragment aus der Region bp 100 - 160, bp 1085 - 1125 oder bp 1540 - 1565 der SEQ ID NO:3 ist.
11. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Teilsequenz ein mindestens 9 konsekutive Basen langes Fragment aus der Region bp 100 - 160 der SEQ ID NO:3 ist.
12. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 11 , die eine der folgenden Sequenzen
5'GACGCGCATCCCCGG3',
5'CATCCCAGGCGCGGG3',
5OCGGGGATGCGCGTC3',
5ΑTGCGCGTC3', 5OGCCGGGGGACGCGC3' oder
5OCCGCAGGGCCGGGG3' aufweisen.
13. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 4, die an CD30 und an rsk3 mRNA binden.
14. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 13, die die Sequenz 5OACGCGCATCCCCGG3' 25
aufweisen.
15. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 4, die eine CD30 DNA und/oder rsk3 DNA Tri- pelhelix bildende Nukleinsäure sind.
16. Nukleinsäure gemäß Anspruch 15, die die Sequenz 5OCGGGGATGCGCGTC3', 5ΑTGCGCGTC3', 5OGCGTCCTCCTCGC3', 5OTCCGGCCCCGGGG3' oder 5TGGGCGCCGCGCGCT3' aufweisen.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere der in An- Sprüchen 1 bis 16 definierten Nukleinsäuren.
18. Verwendung der in Ansprüchen 1 bis 16 definierten Nukleinsäuren zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der funktionellen Aktivität von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen.
19. Verwendung der in Ansprüchen 1 bis 16 definierten Nukleinsäuren zur Herstellung eines Medikaments zur funktionellen Unterdrückung und Elimination von CD30+ und/oder pp90rsk3+ Zellen.
EP99906220A 1998-02-06 1999-02-05 Nukleinsäuren zur modulation zellulärer aktivierung Withdrawn EP1053316A1 (de)

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