JP2003531166A

JP2003531166A - 細胞傷害剤

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Publication number: JP2003531166A
Application number: JP2001577939A
Authority: JP
Inventors: ラジ，ケニース; ベアルデ，ペーター・マルタン
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 2000-04-20
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2003-10-21
Also published as: AU2001250502A1; US20150037400A1; CA2404998A1; US20030100115A1; GB0009887D0; US20120082716A1; US20060105983A1; WO2001080840A2; WO2001080840A3; US20100081711A1; EP1294365A2

Abstract

(57)【要約】特に野生型に匹敵するような、有効なｐ５３タンパク質活性を欠く細胞を殺す方法であって、細胞内部に取り入れられることが可能な形で、ＤＮＡの３’および５’端いずれに関しても内部に位置する、別の塩基と塩基対形成しない少なくとも１つの塩基を含む部分を含む、一本鎖ＤＮＡを、細胞に搬送することを含む点で特徴付けられる、前記方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、完全にまたは部分的にｐ５３機能性を欠く（ｐ５３（−））細胞に
対して使用を有する、特に、ｐ５３（−）腫瘍細胞およびｐ５３タンパク質の活
性を下方制御するかまたは除去するウイルスに感染している細胞に対して有効で
ある、細胞傷害剤に関する。ウイルスに感染した細胞に対するこれらの剤の作用
により、これらの剤は、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのウイルス
に対する、有効な抗ウイルス剤となる。

【０００２】分子腫瘍学の主要な目的は、ｐ５３機能を欠く細胞を殺す手段を同定すること
である。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、核リンタンパク質をコードし、該タンパク質
は、ＤＮＡ損傷剤に曝露された細胞において、細胞周期進行、ＤＮＡ完全性およ
び細胞生存の調節に関与し、その結果、癌阻害特性を持つ、多機能転写因子であ
る。ヒト癌の発生は、しばしば、遺伝子欠失および点突然変異を含む機構を通じ
た、ｐ５３抑制機能の不活性化を伴い、続いて他のＤＮＡにおける発癌性突然変
異の導入を導く（例えばＧｒｅｅｎｂｌａｔｔら，１９９４．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：４８５５−７８；Ｈａｒｒｉｓ−ＣＣ，１９９６．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１７：１１８７−９８；Ｋｏ−ＬおよびＰｒｉ
ｖｅｓ−Ｃ，１９９６．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１０：１０５４−７２；
Ｌｅｖｉｎｅ−ＡＪ，１９９７．Ｃｅｌｌ，８８：３２３−３３１を参照
されたい）。

【０００３】ＷＨＯ団体、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙｆｏｒＣａｎｃ
ｅｒ（ＩＡＲＣ／ＣＩＲＣ）１５０ＣｏｕｒｓＡｌｂｅｒｔＴｈｏｍａ
ｓ，Ｆ−６９３７２Ｌｙｏｎｃｅｄｅｘ０８，Ｆｒａｎｃｅは、ヒト
腫瘍および細胞株における８０００を越える体細胞ｐ５３突然変異のデータベー
スを提供し、そして維持する。ＩＡＲＣは、点突然変異が２５０以上のコドンに
渡って点在し、そしてヒト癌の多くの型で一般的であることを報告する。ＩＡＣ
Ｒデータベースに報告される突然変異の９０％もが、コアドメインに見出される
。５つの「ホットスポット」コドン（１７５、２４５、２４８、２４９および２
７３）での突然変異は、これまでに見出されているすべての突然変異の約２０％
に相当する。

【０００４】ｐ５３の重要な活性は、ＤＮＡに結合する能力である。ｐ５３ＤＮＡ結合ド
メインは、非連続ループおよびらせんのＤＮＡ結合表面を支持する「足場（ｓｃ
ａｆｆｏｌｄ）」を形成する、２つの逆平行βシートで構成される。突然変異は
、ＤＮＡ結合ドメイン構造への影響力にしたがって、３つの広いクラスに分類可
能である。クラスＩ突然変異は、Ａｒｇ２４８およびＡｒｇ２７３などのＤＮＡ
結合表面の残基に影響を及ぼし、そしてタンパク質−ＤＮＡ接触点を破壊する。
クラスＩＩは、足場および結合表面間の連結に関与する、Ａｒｇ１７５およびＡ
ｒｇ２４９などの、ＤＮＡ結合表面の正しい方向付けに必須の残基に影響を及ぼ
す。これらの突然変異は、ｐ５３タンパク質柔軟性の制御を破壊する可能性があ
る。クラスＩＩＩ突然変異は、「足場」内に属し、そして全ＤＮＡ結合ドメイン
の三次構造を破壊する。

【０００５】これらのカテゴリーに対応する突然変異は、細胞種特異的特性と共に、別個の
機能特性を有するようである（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ−ＭＳ，Ｇｒｏｌｌｍａ
ｎ−ＡＰおよびＨａｒｒｉｓ−ＣＣ，１９９６．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，
５６：２１３０−３６；Ｈａｒｒｉｓ−ＣＣ，１９９６．ＪＮａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８８：１４４２−５５；Ｏｒｙら，１９９４
，ＥＭＢＯ１３：３４９６−３５０４およびＦｏｒｒｅｓｔｅｒら，１９
９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１０：２１０３−２１１１）。数種類の癌におけ
るｐ５３突然変異のパターンの相違は、特定の発癌物質の影響を反映する（Ｇｒ
ｅｅｎｂｌａｔｔら，１９９４．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：４８５
５−７８；Ｈａｒｒｉｓ−ＣＣ，１９９６．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１７：１１８７−９８）。こうした「突然変異誘発物質フィンガープリント
」のよく性質決定された例には、喫煙に関連する肺がんにおける、Ｇ：ＣからＴ
：Ａのトランスバージョン、アフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）への食餌曝露に関
連する肝臓癌における、コドン２４９の第三のヌクレオチドでのＧ：ＣからＴ：
Ａのトランスバージョン、およびＵＶＢ曝露に関連する皮膚癌における、ＣＣ：
ＧＧからＴＴ：ＡＡタンデム二ピリミジン・トランジションが含まれる。何人か
の癌患者の血清にｐ５３抗体が存在するが、これは、癌の診断および追跡調査の
興味深いツールを提供する可能性がある（Ｓｏｕｓｓｉ，１９９６．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７：３５４−３５６）。

【０００６】ＤＮＡ損傷および細胞の運命を決定する際のｐ５３の重要性に関する刊行物に
は、Ｂｕｎｚら，１９９８Ｓｃｉｅｎｃｅ（２８２）：１４９７−１５０１
；Ｗａｌｄｍａｎら，１９９７ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ（３）９：
１０３４−１０３６；Ｓｕｇａｎｕｍａら，１９９９ＣａｎｃｅｒＲｅｓ
ｅａｒｃｈ（５９）：５８８７−５８９１およびＭｕｓｃｈｅｌら，１９９８
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１７）：３３５９−３３６３（概説）が含まれる。

【０００７】本発明を想到する際、本発明者らは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が、野生
型、すなわち損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ｐ５３活性を欠く細胞を選択的
に殺すと結論付けた。本発明者らの共同研究者、ＰＭＯｇｓｔｏｎは、１９
９９年１１月の論文で、損なわれていないｐ５３およびｐＲｂ活性を含む（ｐ５
３＋）が、ｐ１６−であるＵ−２ＯＳ骨芽細胞が、ＡＡＶに感染すると、細胞
周期のＧ２期で停止（ａｒｒｅｓｔ）を経験し、一方、完全に活性ｐ５３（ｐ５
３−）およびｐＲｂ（ｐＲｂ−）を欠く、Ｓａｏｓ−２骨芽細胞は、停止するが
、その後、殺されることを示す実験を記載した。Ｕ−２ＯＳでは、Ｇ２におけ
る停止は、ＣＤＣ２５Ｃのターゲッティングされた破壊とカップリングしたｐ５
３活性の増加によって特徴付けられ、この特徴は、ＤＮＡ損傷剤であるエトポシ
ドによって誘導されるものと同一である。

【０００８】最も驚くべきことに、Ｏｇｓｔｏｎは、もはやタンパク質を産生せず、そして
そのＤＮＡを複製するのが不可能であるように、紫外線照射によって不活性化さ
れたＡＡＶは、両方の細胞を停止する増進された能力およびＳａｏｓ−２細胞を
殺す増進された能力を示し、一方、ウイルスにコードされるタンパク質またはＤ
ＮＡを含まないウイルス粒子、あるいは二本鎖ＤＮＡを含むアデノウイルスは有
効でないことを報告した。Ｓａｏｓ−２に関する何物かが、該細胞をＡＡＶ誘導
アポトーシスに脆弱にし、そしてこれは、ウイルスＤＮＡに結合するＲｅｐタン
パク質によって引き起こされる可能性があると結論付けられた。

【０００９】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は小さい無エンベロープウイルスであり、その
４．７ｋｂのＤＮＡは直線でそして一本鎖であり、両端にヘアピン様構造がある
（１：図１ａ）。ＡＡＶＤＮＡは、ウイルスキャプシドを構成する３つのタン
パク質、ＶＰ１−３、並びにウイルスゲノムの複製および転写を調節するＲｅｐ
７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０と称される４つの非構造タンパ
ク質をコードする（２）。Ｒｅｐタンパク質は、集合してウイルス粒子を形成す
るのに必要でないが、粒子と結合することが見出されている（３）。ＡＡＶは、
効率的に複製するため、別のウイルス（例えばアデノウイルスまたはヘルペスウ
イルス）による同時感染を要するため、随伴ウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕ
ｓ）と分類される。今までのところ、ＡＡＶは、いかなるヒト疾患にも関連付け
られておらず、比較的非免疫原性であり、そしてそのタンパク質のいずれも、発
癌特性を所持することが知られていない。その代わり、ＡＡＶは、細胞分裂を抑
制すると報告されてきている（４−８）。Ｒｅｐ７８が、アデノウイルス発癌活
性を抑制するように、ｐ５３と相互作用可能であることが報告されてきている（
Ｂａｔｃｈｕら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ（１９９９）Ａｕｇ１；５９（１５
）３５９２−５）。

【００１０】ＡＡＶＤＮＡは、両端にヘアピン構造を含む、一本鎖であり（本明細書にお
ける図１を参照されたい）、過去、腫瘍に対する予防法に関与してきた。特に興
味深いのは、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ（１９９４）ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａ
ｒｃｈ３０５，３０３−３１３およびＤｅｌａＭａｚａおよびＣａｒｔ
ｅｒ（６）による論文である。Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒは、子宮頚癌およびＡＡＶ
−２の場合にのみ、データが統計的に有意であるが、癌患者が、ＡＡＶ２、３お
よび５型に対する抗体を示すのは、対照より頻繁でないことを示す、癌患者のＡ
ＡＶ感染の血清疫学に注目した。この論文は、ＡＡＶに感染させることによって
、細胞を化学療法または照射に感作させることが可能である可能性があると結論
付けた。再び、ＡＡＶＲｅｐは、腫瘍抑制効果の候補である可能性があるとみ
なされた。ＤｅｌａＭａｎｚａらは、末端反復を保持する、不完全ビリオン
を含むＡＡＶ−２キャプシド（ＤＩ粒子）が、ハムスターにおいて、アデノウイ
ルス１２での感染に反応した腫瘍形成を抑制可能であることを報告した。動物に
精製ＡＡＶＤＮＡを注射しても、腫瘍発生率は減少しないが、剪断ＡＡＶ−２
ＤＮＡおよびＤＩ粒子ＤＮＡを注射すると減少し、特に、末端ＤＮＡを含むの
みの場合は減少した。著者らは、ここで、アデノウイルス１２腫瘍原性の阻害に
言及する。

【００１１】先に行われたものと対照的に、本発明者らは、特にＤＮＡと、そして特にＡＡ
Ｖ末端ＤＮＡにおけるように比較的に安定に、対形成しない塩基を含む核酸は、
有効なｐ５３機能、すなわちＧ２期に細胞を維持するｐ５３の機能を欠く細胞を
選択的に殺すことが可能であると、今や、結論付けた。これは、ＡＡＶ末端ＤＮ
Ａおよび非対形成塩基を含む同様の構造の治療的療法使用であって、そしてＡＡ
Ｖの単なる予防的使用でない使用を提供する限り、重要である。こうした予防的
使用は、例えば細胞ゲノムへの組込みまたはヌクレアーゼ活性による、活性の除
去を回避するため、ＡＡＶが連続して投与されることを必要とするであろう。本
明細書に提供する療法は、腫瘍が検出された際に投与すると、有効であり、これ
は、潜在的にすべてのｐ５３欠損腫瘍のため、または特にしかし排他的でなく、
ウイルスによる感染によってｐ５３欠損となった細胞を除去する目的のため、先
行技術によってまったく認識されていなかった便宜である。

【００１２】本発明者らは、現在、この構造が、ｐ５３活性の非存在下で、おそらくアポト
ーシスによる、細胞死を導く、ＤＮＡ損傷反応を引き出すと結論付けた。本発明
者らの研究は、この方法で細胞に導入したＤＮＡが、細胞ＤＮＡへの損傷の非存
在下で、Ｇ２停止または細胞死を導くシグナル伝達経路を活性化することが可能
であると示す。この系は、ｐ５３活性を欠く細胞を選択的に除去するため、細胞
に異常なまたは修飾された構造のＤＮＡを搬送する、新規原理を提示する。しか
し、本発明者らは、この原理が、組織、およびウイルスまたは別のものであって
もよいループ化／一本鎖ＤＮＡ搬送ビヒクルの他の組み合わせに適用可能である
可能性があると結論付けた。

【００１３】ＰＭＯｇｓｔｏｎの実験は、ｐ５３活性の存在が、Ｇ２遮断を持続し、そ
してＡＡＶ感染Ｕ２−ＯＳおよびＳａｏｓ−２骨芽細胞の死を妨げるのに明らか
に必要であることを示した。ＡＡＶ−２ＤＮＡと関連するウイルスＲｅｐが、
この効果を引き起こすことが可能であると示唆された。

【００１４】本発明者らは、現在、ウイルスキャプシドタンパク質だけでなく、ウイルスＲ
ｅｐタンパク質およびこれらの組み合わせが、こうした効果を引き出すことが不
能であることを確認した。むしろ、ＡＡＶの効果および細胞ＤＮＡが損傷された
際に観察される効果が類似していることによって、ウイルスＤＮＡは、その異常
な構造のため、ＤＮＡ損傷反応を誘発すると示唆される。今までのところ、報告
される、ＤＮＡ損傷へのｐ５３関連細胞反応は、ｐ２１（１４）、ＧＡＤＤ４５
（２３）および１４−３−３σタンパク質レベル（１８）の増加、並びにサイク
リンＢおよびｃｄｃ２遺伝子発現の阻害（２４、２５）である。ＡＡＶによって
誘導される影響は、ＤＮＡ損傷に反応した新たなレベルの制御を明るみに出し、
そしてこれはＣＤＣ２５Ｃホスファターゼの破壊である。このホスファターゼの
非存在下では、ｃｄｃ２はリン酸化されたままであり、そしてしたがって不活性
化されたままである。したがって、ＤＮＡ損傷反応によって誘導されるＧ２停止
の根底にある特徴は、サイクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼ活性の阻止である。

【００１５】ｐ５３が、特定の状況下で、細胞死を防ぐことが可能であるという知見は、Ｄ
ＮＡ損傷に対する細胞反応に関する研究から支持を得てきている。ｐ５３活性を
欠く細胞が、そのＤＮＡに損傷を受けた際、どのように死ぬのかは、推論に満ち
たままである（２６、２７）。照射および遺伝毒性薬剤の使用は、細胞ＤＮＡに
物理的損傷を引き起こすため、これらの細胞が分裂を試みる際、有糸分裂カタス
トロフィを経ると提唱された（１８）。以下の実施例に記載する実験では、本発
明者らは、細胞のＤＮＡを損傷する代わりに、ＡＡＶを用いて、ＤＮＡ損傷反応
を誘導し、そしてなお、ｐ５３活性を欠く細胞の死を観察した。これは、細胞が
ｐ５３活性を欠く場合に起こるように、ＤＮＡ損傷反応の存在下で、有糸分裂を
経ようとすると、細胞死を誘発する機構を細胞が所持するというアイディアと一
致する。

【００１６】本発明者らは、例えば２５０ｍｏｉの少量のＡＡＶに感染させると、ｐ５３活
性を所持する細胞が、細胞周期のＧ２期で、短時間、停止し、その後、再び周期
に進入し、そして正常な細胞分裂を再開することを示す、一連の実験を行った。
一方、ｐ５３活性を持たない細胞もまた、Ｇ２で停止するが、これはアポトーシ
スを経る前の、一過性の期間のみであった。この一連の実験では、非分裂細胞は
、ＡＡＶ感染に影響を受けなかった。

【００１７】ＡＡＶ感染Ｕ−２ＯＳ細胞由来のタンパク質抽出物を、細胞分裂周期を制御す
る多様なタンパク質を認識する抗体を使用して解析した。特に、ｐ５３およびｐ
２１タンパク質の量が、ＡＡＶ感染後、増加していることが見出された。一方、
ＣＤＣ２５Ｃタンパク質の量は、ＡＡＶ感染に反応して、劇的に減少したが、プ
ロテアソーム活性の阻害は、ＣＤＣ２５Ｃタンパク質の消滅を妨げた。ｐ５３の
欠損を有するＵ２ＯＳｐ５３ＤＤ細胞は、ＡＡＶで感染された際、減少された量
のＣＤＣ２５Ｃタンパク質を含まなかった。解析した他の大部分のタンパク質の
量は、ＡＡＶ感染に反応して変動しなかった。

【００１８】ＤＮＡ損傷の事象で、通常、活性化される、Ｕ２ＯＳ細胞ＡＴＭタンパク質の
活性が、カフェインによって阻害された場合、細胞は、ＡＡＶ感染時、細胞周期
のＧ２で停止するのに失敗した。通常の条件下では、サイクリンＢ−ｃｄｃ２キ
ナーゼ活性は、ＤＮＡ合成の完了後、安定して増加する。ＡＡＶ感染の結果とし
て、このキナーゼの活性は増加するのに失敗した。

【００１９】ＡＡＶ感染に反応して、ｐ５３タンパク質の量および活性は増大し、ｐ２１タ
ンパク質の量の増加を引き起こした。これは、ＡＴＭキナーゼ活性化の結果であ
る可能性がある。細胞分裂の必須の活性化因子であるＣＤＣ２５Ｃタンパク質を
、プロテアソーム経路を介して、分解するようターゲッティングする。これは、
ｐ５３活性がＡＡＶ感染細胞に存在する場合にのみ起こるようであった。これら
の影響の結果は、サイクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼ活性の阻害、およびしたがっ
て細胞分裂の阻害（Ｇ２停止）である。細胞に対するＡＡＶの影響の特徴は、Ｄ
ＮＡ損傷によって誘導されるものを暗示する。

【００２０】したがって、本発明は、その中心として、細胞が、その天然ＤＮＡを損傷する
必要を伴わず、そして好適には隣接するｐ５３適格（ｃｏｍｐｅｔａｎｔ）細胞
のＤＮＡを損傷するリスクを伴わず、おそらくアポトーシスを通じて、死ぬよう
に、ｐ５３活性欠損細胞へのＤＮＡ損傷シグナルの搬送を提供する。

【００２１】前述のＡＡＶが誘導する影響の生成には、細胞へのウイルス進入が必要とされ
る。ＵＶでのウイルスの不活性化は、ウイルスの効力を増進し、一方、ウイルス
キャプシド単独またはＲｅｐタンパク質と一緒のキャプシドは、細胞に対する完
全なウイルスの影響を再現することが不可能であった。さらに、ＡＡＶタンパク
質の合成も、またＡＡＶＤＮＡの複製も、細胞に対するＡＡＶの観察された効
果に必要とされなかった。その代わり、両端に２つのヘアピン様構造を持つ一本
鎖のＡＡＶＤＮＡは、ＤＮＡ損傷剤に誘導されるのと同様、細胞においてＤＮ
Ａ損傷反応を誘導するのに関与するようである。クローニングされた二本鎖ＡＡ
ＶＤＮＡが、トランスフェクションによって細胞に導入されるか、または細胞
がＵＶ照射した二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスに感染すると、細胞
はＧ２で停止せず、また死ななかった。

【００２２】したがって、本発明の第一の側面において、特に野生型と対照して、有効なｐ
５３タンパク質活性を欠く細胞を殺す方法であって、細胞内部に取り入れられる
形である、少なくとも１つの非対形成塩基を含む、一本鎖および／またはループ
化ＤＮＡを、細胞に搬送することを含む点で特徴付けられる、前記方法を提供す
る。好ましくは、該方法は、有効なｐ５３タンパク質活性を有する細胞のバック
グラウンド集団の存在下で、ｐ５３タンパク質活性を欠く細胞を選択的に殺す。
好ましくは、細胞は、哺乳動物種のものであり、そしてより好ましくはヒトのも
のである。より詳細には、細胞は分裂細胞であり、そしてバックグラウンド集団
は、好ましくは非分裂細胞である。したがって、細胞は、分裂していない場合、
本発明のＤＮＡに感染可能であるのに対して、その細胞は、ｐ５３が機能しない
ならば、分裂すると殺されるであろう。

【００２３】好ましくは、一本鎖ＤＮＡは、標的細胞、すなわち殺そうとする細胞種、例え
ばＳａｏｓ−２細胞において、二本鎖ＤＮＡに変換されることに耐性である形で
ある。ＡＡＶＤＮＡはこの例であり、すでに制限されている複製能が、ＵＶ照
射して減少した際、特にそうである。好ましくは、非塩基対形成ＤＮＡの少なく
とも１つの領域を含む一本鎖部分を含み、そしてＤＮＡ複製に必要とされる必須
の酵素または細胞小器官いずれかの結合に必要とされる部位を欠く、いかなるＤ
ＮＡも、本発明に十分であろう。

【００２４】好ましくは、ＤＮＡは、塩基対形成がまったく起こらず、少なくとも長さ１塩
基である、ある長さの一本鎖ＤＮＡを含む形である。一本鎖ＤＮＡは、二本鎖Ｄ
ＮＡ内に一本鎖ループを含む形であってもよいが、都合よくは、すべてのＤＮＡ
が一本鎖である。ＤＮＡはまた、相補的塩基が、本明細書の図の図１（ａ）に示
すように、慣用的な二本鎖ＤＮＡ塩基対関係で、互いに対形成しているという意
味で、二本鎖を形成する一方、これらの鎖は、隣接する塩基対が常にＤＮＡ配列
中で隣接するわけではない、異常な連結部を有する、ループの形であってもよい
。

【００２５】ループ化ＤＮＡにより、その長さのすべてまたは少なくとも部分に渡り、それ
自体と塩基対形成するＤＮＡの一本鎖を意味する。したがって、一本鎖の部分は
、一本鎖の別の部分と塩基対形成していなくてもよく、別個の鎖上の他のＤＮＡ
と塩基対形成していてもよい。ＡＡＶＤＮＡの場合、ループ中の塩基対は、す
べてＤＮＡの同一鎖上にあり、そしてループが「緊密に形成される」限り、ヘア
ピンループを含み、そして非対型のＤＮＡを多くは含まない。当業者には、こう
したループは、一つの鎖が互いに塩基対形成される相補的領域を有する場所で、
二重鎖ＤＮＡを生じるのが可能であることが明らかであろう。

【００２６】ループ化ＤＮＡの１つの好ましい型はＡＡＶ、特にＡＡＶ−２ＤＮＡである
が、同様のループを形成する他のＤＮＡ配列を使用することが可能であり、必要
なのは、少なくとも１つの塩基、最も容易には、鎖内の内部に位置して見られる
塩基が、対形成されないままにされながら、同一の鎖内で塩基対形成することが
可能である、内部パリンドロームのみである。さらなる例において、３’または
５’端がない、完全に環状のＤＮＡが使用可能である。

【００２７】本発明の好ましい型は、ヌクレアーゼおよび分解するであろう他の剤に関して
、安定化された形のＤＮＡを提供するであろう。こうした修飾は、オリゴヌクレ
オチド化学反応の技術分野の当業者に知られるであろうし、特に、ＤＮＡ主鎖の
、３’および／または５’端の少なくとも一方または両方のホスホジエステル基
を、類似であるが、よりヌクレアーゼに耐性である基、例えばペプチド、メチレ
ンまたはメチルイミノ基で、しかし最も好ましくは、ホスホロチオエート基で、
置換することによって、修飾することによる。こうした技術は、ＭｏｌｅｃｕｌａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１３８８４Ｐａｒｋ
ＣｅｎｔｅｒＲｏａｄ，ＨｅｒｄｏｎＶＡ２０１７１，ＵＳＡ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａは正しいスペリングである）またはＭｅｔａｂｉｏｎ，Ｌｅｎ−
Ｃｈｒｉｓｔ−Ｓｔｒａｓｓｅ４４，Ｄ８２１５２Ｐｌａｎｅｇｓ−Ｍａ
ｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，ＤＥなどの会社によって、契約研究に基づいて、提供さ
れる。多くの他の会社が、ホスホロチオエートヌクレオチドを用いたＤＮＡオリ
ゴの注文合成を提供しており、そしてすべての塩基をこうした型で使用すること
が好ましい可能性があるが、細胞に進入する能力に影響を及ぼさず、そして優れ
た薬物動態学的プロフィールを維持しながら、ｉｎｖｉｖｏで安定性を増加さ
せる目的のため、本発明の既定のポリまたはオリゴヌクレオチドにおける、天然
およびホスホチオエート塩基の最適な組み合わせを、日常的な実験が可能にする
であろうことが認識されるであろう。あるいは、ＤＮＡは、架橋によって、例え
ばＵＶまたは化学的架橋によって、分解に耐性にされることが可能である。

【００２８】有効なｐ５３タンパク質活性により、特に、ＤＮＡに結合する能力、または細
胞分裂を妨げる能力、および特に両方の能力を意味する。したがって、活性の損
失は、コードされる有効なｐ５３の発現を欠くためである可能性があるし、また
は突然変異体タンパク質において、１つまたは両方の活性が失われるような、ｐ
５３の突然変異による可能性がある。特に、ｐ５３活性は、細胞周期のＧ２期内
に細胞を維持することである。

【００２９】一本鎖ＤＮＡは、ｐ５３を欠く（ｐ５３−）かまたは損なわれずにｐ５３を有
する（ｐ５３＋）かいずれかの、すべての細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞
のみにより、内部に取り入れられる形であってもよいが、より典型的には、所望
によりｐ５３−およびｐ５３＋細胞両方を含む、哺乳動物またはヒト細胞の下位
集団によって内部に取り入れられる形であろう。例えば、特定の組織種、すなわ
ち、肺、結腸、肝臓、皮膚、膀胱、ＣＮＳ、血液（すなわちリンパ球）、子宮頚
、頚部または骨の細胞の下位集団によって、内部に取り入れられることが可能で
ある。非腫瘍または非感染細胞に比較した際、腫瘍細胞の存在、あるいははｐ５
３活性の枯渇または減少を導く感染にさらされる他の組織種が、当業者に思い浮
かぶであろう。

【００３０】内部に取り入れる目的のため、一本鎖ＤＮＡは、都合よくは、標的細胞壁と結
合する部分に付着するかまたは該部分に結合し、そしてしたがって、細胞へのＤ
ＮＡの進入を促進する形であり、より都合よくは、そのタンパク質が、細胞への
進入のため、細胞表面受容体を使用することが可能である、アデノ関連ウイルス
の形である。他のウイルス由来の他のタンパク質もまた、異なる細胞表面受容体
を用いて、細胞に進入する能力を提供するであろうことが認識されるであろう。
こうしたタンパク質の例は、キャプシドまたは線維タンパク質であり；例えばヒ
トパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来のＬ１またはＬ１／Ｌ２タンパク質は、集
合してキャプシドを形成し、該キャプシドが細胞内部に取り入れられ、そして該
キャプシドは、例えばＡＡＶ型、好ましくは、例えばＵＶなどの照射での、損傷
処理によって、二本鎖ＤＮＡを形成する能力がより劣るようにされている、ＡＡ
Ｖ一本鎖ＤＮＡの、一本鎖ＤＮＡで充填することが可能である。細胞内部に取り
入れ可能な、いかなる他のウイルスキャプシドタンパク質もまた、一本鎖ＤＮＡ
を被包するのに使用してもよく；例には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、
ＨＩＶ、麻疹、ＥＢＶ、ＨＣＶ、ＭＳＶ−２などが含まれる。やはり使用するの
は、内部に取り入れられるのを促進するため、キャプシドタンパク質またはいく
つかの他の搬送ビヒクル、例えばリポソームに付着していてもよい、Ａｄ５ま
たはＡｄ４０または４１（例えば結腸細胞をターゲッティングするため）のも
のなどのウイルス線維であろう。こうした他のビヒクルは、内部に取り入れられ
るのを補助する部分と共に、提供されてもよい。

【００３１】細胞がアポトーシスを開始するのに十分に長く、標的細胞内にＤＮＡの一本鎖
型を維持することが望ましいであろうことが認識されるであろう。ＡＡＶの場合
、ＤＮＡは、その構造のみによって、例えば末端ループによって、分解から保護
される。他のこうした機構が当業者に利用可能であり、ＤＮＡ擬似体（ｍｉｍｉ
ｃｓ）、例えばアイソスターの使用などがあり、そして細胞内部の取り入れを導
くことが可能な部分を真似た、１つまたはそれ以上の末端ループあるいは分解耐
性物質と一本鎖ＤＮＡを、単に、コンジュゲート化することが可能であろう。

【００３２】陽イオン性ペプチドでＤＮＡを凝縮することがさらに可能である。陽イオン性
ペプチドの構造は、ターゲッティング目的のためのリガンド、およびさらに、例
えばＣｏｂｒａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより入手可能であるような、免疫反
応を減少させるペプチド、例えば多グリシンペプチドの付着を可能にする。ｉｎ
ｖｉｖｏでのこの系の有効性は、比較的低い可能性があるが、Ｃｏｂｒａは、
ｉｎｖｉｔｒｏで非常に多様な細胞にＤＮＡを搬送するのに非常に有効な、コ
ード名ＣＬ２２のペプチドに基づく１つの系を開発した。

【００３３】ターゲッティングのためのさらなる陽イオン性リガンドは、本明細書に援用さ
れる、カナダ特許出願２，２５１，６９１およびその米国均等物ＷＯ９７／３
５８７３に記載されるような、ポリリジンコアである。こうしたコアには、部分
を含む中央のリジンが含まれ、この部分が次に、さらなるリジンに連結し、この
リジンが次に、非対形成塩基または塩基類を取り込むオリゴヌクレオチドに凝縮
される。

【００３４】ＤＮＡあるいはそのキャリアーリポソームまたはキャプシドに連結可能な、さ
らなるターゲッティング部分は、ＤＮＡなどの親油性分子にカップリング可能で
あり、そして細胞質膜の横断を促進する、ＤｅｒｏｓｓｉらＴｒｅｎｄｓｉ
ｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｌ８）Ｆｅｂ１９９８，ｐ８４８７
に記載されるようなペネトラチン類である。他のターゲッティングの例は、ＷＯ
９１／１８９８１に解説される。これらの参考文献はどちらも、本明細書に援
用される。

【００３５】十分に記載されるような、こうしたＤＮＡまたはコンジュゲート化ＤＮＡは、
多くの場合で有効であろうと考えられるが、ＤＮＡの有効性は、ＡＡＶ、例えば
ＡＡＶ−２自体のものなどの、核局在化シグナルを内部に含むことによって、改
善可能である。これは、細胞核への損傷反応の通過を増進するであろう。

【００３６】本発明は、したがって、すべて、付随する請求項および上述の本明細書に述べ
たように、ｐ５３活性欠損細胞を殺す方法、ｐ５３活性欠損に関連する疾患にさ
らされた個体を治療する方法、医薬品製造における非対形成一本鎖ＤＮＡを含む
ＤＮＡの使用、療法に使用するためのこうした一本鎖ＤＮＡ、およびこうした一
本鎖ＤＮＡを含む組成物を提供する。

【００３７】ヒトまたは動物において、ｉｎｖｉｖｏで標的ｐ５３欠損細胞を殺すために
投与しようとするウイルスまたは非対形成一本鎖ＤＮＡの用量は、投与経路に応
じるであろう。生きたウイルスでは、これは、典型的には、１０²から１０¹³、
より好ましくは１０⁴から１０¹¹の桁である可能性があり、感染効率は、一般的
に、０．００１から１００の範囲である。非生存ウイルスまたは非複製ＤＮＡを
用いる場合、用量は、ＡＡＶＤＮＡのゲノム重量に基づいて、相当してより高
い可能性がある。

【００３８】ターゲッティング部分にコンジュゲート化していない形であってもよい、精製
ＡＡＶ−２末端ＤＮＡ、例えば末端１４５塩基などの、患者に投与するＤＮＡの
典型的な用量は、好ましくは滅菌および発熱物質不含生理食塩水中で静脈内投与
され、キログラムあたり、０．０１μｇから１００ｍｇ、より好ましくは、キロ
グラムあたり０．１μｇから１ｍｇの桁のものであろう。

【００３９】癌細胞、あるいはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８などのｐ５３阻害ウイルスに感
染した細胞をターゲッティングする本発明のアプローチは、２つの利点を有する
：（ｉ）ｐ５３活性を欠く細胞のみが殺され、そして（ｉｉ）細胞ＤＮＡへの損
傷はまったく伴わない。この原理を、上に述べたように、ウイルスおよび細胞種
の他の組み合わせに拡張すると、異なる組織をターゲッティングするさらなるレ
ベルの特異性もまた、提供されるであろう。

【００４０】ｐ５３活性を欠く細胞で細胞死を誘導するのに現在用いられる方法には、照射
および薬剤などのＤＮＡ損傷剤での処理が含まれる。本発明者による知見は、い
くつかの利点を持つ代替法を提供する。これらの実験の結果は、細胞自体のＤＮ
Ａを故意に損傷することなく、細胞において、ＤＮＡ損傷シグナルを引き出すこ
とが可能であることを示す。これは、ＡＡＶＤＮＡなどの異常な構造を持つＤ
ＮＡを細胞に導入することによって、達成可能である。存在する方法または現在
開発されている方法に勝る、この方法のさらなる利点を以下に列挙する：（ｉ）ウイルスは現在、細胞にＤＮＡを搬送するのに利用可能である、最も有効
な手段である。（ｉｉ）ウイルスはまた、感染する組織において、天然に選択性である。これは
、組織起源に基づいて、腫瘍をターゲッティングする、一団のウイルス（天然ま
たは修飾）を用いる可能性を提示し、これは、現在の癌療法には利用可能でない
手段である。（ｉｉｉ）化学療法の有効性を制限する、多剤耐性の問題は、本技術にはあては
まらない。（ｉｖ）現在の癌療法による細胞ＤＮＡへの損傷は、突然変異細胞の発生を生じ
る可能性がある。本技術は、細胞ＤＮＡを損傷することに基づかないため、これ
はこの技術の問題にはならないであろう。（ｖ）搬送されるＤＮＡ自体が原因となる剤であるため、本技術は、プロモータ
ー特異性、タンパク質の効率的発現、非腫瘍細胞へのタンパク質の毒性などの、
癌療法に対するタンパク質に基づくかまたは遺伝子発現に基づくアプローチが直
面する困難を回避する。（ｖｉ）ＡＡＶはいかなる疾患とも関連付けられていないため、本方法は、安全
性の問題を提示する可能性がありそうではない。（ｖｉｉ）本方法は、静止細胞を傷つけないため、腫瘍にごく近接する非増殖正
常細胞は、危険にさらされない。ｐ５３活性を持つ分裂細胞は、正常活性を再開
する前に、少しの間停止するか、またはせいぜい、殺されることなく、より長い
期間停止するかいずれかであろう。したがって、取り巻く細胞への損傷の可能性
は最小限である。（ｖｉｉｉ）本発明の好ましい型において、ウイルスは、使用前に不活性化され
るため、ウイルス転写、複製およびウイルス血症は、起こらないであろう。した
がって、他のウイルスに基づく療法の場合、そうである可能性があるように、野
生型ウイルスとの、起こりうる相同組換えの問題はないであろう。

【００４１】本発明は、以下の限定されない図、配列表および実施例に言及することによっ
てのみ、例示のために、ここで、さらに記載されるであろう。本明細書に付随す
る請求項の範囲内に属するさらなる態様は、これらに照らし、当業者に思い浮か
ぶであろう。

【００４２】配列表付随する配列表に別個に番号付けされる配列は、以下のような配列を有する：配列番号１：ＡＡＶ−２のゲノムＤＮＡ配列。

【００４３】配列番号２：ＡＡＶ−２ＩＴＲの配列、配列番号１のコードＤＮＡの各端に
見出される二重ループ構造。配列番号３：配列番号２に見られるようなＡＡＶ−２ゲノムＤＮＡの単一ルー
プの第一のものの配列。

【００４４】配列番号４：配列番号２に見られるようなＡＡＶ−２ゲノムＤＮＡの単一ルー
プの第二のものの配列。配列番号５：本発明にしたがった、合成環状ＤＮＡの配列。

【００４５】

【実施例】

方法細胞培養およびｉｎｖｉｖｏのｐ５３活性の不活性化Ｕ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２細胞は、それぞれＨＴＢ−９６およびＨＴＢ−８
５として、ＡＴＣＣから得ることが可能である。これらの細胞は、１０％ウシ胎
児血清を補ったＤＭＥＭ中で培養した。ＮＨＯは、“Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ”より
購入した。ＮＨＯおよびＮＨＯＥ６は、１０％ウシ胎児血清およびアスコルビン
酸を補った骨芽細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で培養した。ｐ５３ＤＤ
タンパク質をコードするＤＮＡは、Ｍ．Ｏｒｅｎ博士より得て、そして続いて
、レトロウイルスベクターｐＢａｂｅｐｕｒｏにクローニングした。候補レトロ
ウイルスは、フェニックス−Ａ細胞（ＧＮｏｌａｎ博士より）にｐＢａｂｅｐ
ｕｒｏｐ５３ＤＤをトランスフェクションすることによって、調製した。４８時
間後に採取した培地３ｍｌを用いて、１０μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、１
５０万のＵ２ＯＳ細胞を感染させた。感染２４時間後、細胞を継代し、そして１
．５μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子を持つレ
トロウイルスは、Ｓ．Ｌａｔｈｉｏｎから得て、そしてｐ５３ＤＤに関して記
載したのと同様の方式で、ＮＨＯに感染させた。

【００４６】ＡＴＭ活性を阻害するため、細胞を、示した時間、２ｍＭカフェインで処理し
た。アネキシンＶ解析は、製造者（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）
の指示にしたがって行った。

【００４７】ＡＡＶの不活性化および骨細胞の感染小さいプラスチックプレート中で、ＡＡＶ（５０００ＭＯＩ）を０．５ｍｌの
ＰＢＳで希釈し、そして“Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）からの２，４００ｍＪ／ｍ２のＵＶ照射に曝露した。不活性化ウイルスをさら
に２．５ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）で希釈し、その後、これを細胞上に３
時間重層し、その後、１０ｍｌまで新鮮な培地を足した。

【００４８】フローサイトメトリー細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、そして７０％エタノールで固定し
た。少なくとも３０分後、遠心分離し、エタノールを除去し、そして細胞を再懸
濁し、そしてＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌＲＮアーゼ中、３７℃でインキュベ
ーションした。３０分後、ヨウ化プロピディウムを１００μｇ／ｍｌまで添加し
た。ＤＮＡ含量は、蛍光活性化細胞分取装置を用いて測定した。

【００４９】ウェスタンブロットおよびサイクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼアッセイ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてラバーポリスマンを用いて、組織培養プレ
ートから掻き取った。微量遠心分離装置中で遠心分離した後、細胞ペレットを、
プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補ったレポーター溶
解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）２体積に再懸濁した。ときどきボルテックスしなが
ら氷上で３０分間インキュベーションした後、微量遠心分離装置中、１２，００
０ｒｐｍで１０分間、試料を遠心分離した。上清を収集し、そしてブラッドフォ
ードアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。試料あた
りタンパク質３０μｇを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして
ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ）に移し、そしてｐ５３（Ｒ．Ｉｇｇｏ）、ｐ２１
、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣ２５Ｂ、アクチン、サイクリンＢおよびｃｄｃ２（Ｓａ
ｎｔａＣｒｕｚ）に対する抗体を用いて解析した。サイクリンＢ−ｃｄｃ２キ
ナーゼアッセイは、先に記載されるように行った（２８）。

【００５０】細胞の注入Ｓａｏｓ−２、Ｕ２ＯＳおよびＵ２Ｏｓｐ５３ＤＤ細胞に、まず０．２μｍフ
ィルターを用いてろ過したＤＮＡを注入した。ＰＣｉｅＧＦＰは、緑色蛍光タン
パク質遺伝子の発現を調節するＣＭＶプロモーターを含んだ。ＡＡＶヘアピンオ
リゴヌクレオチドは、ＡＡＶ−２逆転末端反復（ヌクレオチド位１−１４５）の
配列に基づいて、合成した（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）。ＤＮＡ、ｐＣｉｅＧＦＰ
４００μｇ／ｍｌまたはｐＣｉｅＧＦＰ２００μｇ／ｍｌ＋ヘアピンＤＮＡ
２００μ／ｍｌは、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒを
用いて、細胞に注入した。注入４時間後、緑色の細胞が可視であり、そして細胞
は、連日、計数した。

【００５１】実施例１：ｐ５３骨肉腫細胞を殺すためのＡＡＶの使用２つの骨肉腫細胞株を、ヘルパーウイルスの非存在下で、ＡＡＶ−２に感染さ
せ、そして形態学的変化を示すことに注目した。ＡＡＶ感染Ｓａｏｓ−２細胞（
ｐ５３ヌル、ｐＲｂヌル骨肉腫細胞株）は死に（図１ｂからｄ）、一方、Ｕ２Ｏ
Ｓ細胞（ｐ５３およびｐＲｂに関して野生型）は、非感染細胞の数倍の大きさに
大きくなった（図１ｅからｇ）。フローサイトメトリーによる細胞ＤＮＡ含量の
測定により、Ｓａｏｓ−２細胞は、ＡＡＶに感染すると、短時間で集積し、ＤＮ
Ａ含量が２ｎより大きいことが明らかになった。細胞死は、まもなく起こった（
図２ａ）。一方、Ｕ２ＯＳ細胞の大部分は、４ｎのＤＮＡ含量で、数日停止し、
その後、細胞周期に再進入した（図２ｂ）。しかし、より多量のＡＡＶを用いる
と、大部分のＵ２ＯＳ細胞は延長された期間、Ｇ２期で停止し、続いて細胞周期
に再進入することはなかった（図２ｃ）。

【００５２】実施例２：ｐ５３骨肉腫瘍細胞を殺すためのＵＶ不活性化ＡＡＶＤＮＡの使用ＡＡＶ複製かまたはウイルスタンパク質発現が必要とされるのか決定するため
、我々は、感染前に紫外（ＵＶ）光でＡＡＶを不活性化し、そして細胞に対する
影響が減少せず、むしろ増進することを見出した。ビリオンの構成要素が関与す
ると結論付けられる。したがって、続く実験では、ＵＶ処理ＡＡＶを用いた。

【００５３】実施例３：ｐ５３ＤＤを用いて不活性化したｐ５３を含むＵ２ＯＳｐ５３＋を殺すための、ＵＶ不活性化ＡＡＶＤＮＡの使用Ｓａｏｓ−２細胞は、ｐ５３およびｐＲｂに関してヌルであり、そして非常に
少量のｐ２１しか発現しないため、我々は、これらのタンパク質のいずれかがＡ
ＡＶ感染に対するこれらの２つの骨肉腫細胞株の異なる反応（死またはＧ２停止
）に関与するか疑問を呈した。ＵＶ不活性化ＡＡＶに感染させる前に、Ｓａｏｓ
−２において、レトロウイルスベクターからｐ２１またはｐＲｂを発現させた。
これらのタンパク質のいずれかの存在は、ウェスタンブロット解析によって測定
されるような非常に多量のものであっても（図３ａおよびｂ）、Ｇ２停止を持続
しなかったし、またＳａｏｓ−２が死ぬのを防がなかった（データ未提示）。ｐ
５３の寄与を調べるため、トランス優性ネガティブｐ５３突然変異体、ｐ５３Ｄ
Ｄ（９）を、異所的に過剰発現させることによって、Ｕ２ＯＳにおいて、ｐ５３
タンパク質を不活性化した。これらの細胞における、内因性ｐ５３タンパク質の
安定化およびｐ２１タンパク質の減少したレベルは、内因性ｐ５３の活性が、実
際、ｐ５３ＤＤによって損なわれることを示した（図３ｃ）（１０）。これらの
細胞のＡＡＶでの感染は、一過性Ｇ２停止後、細胞死を生じ（Ｓａｏｓ−２細胞
で見られるように）（図２ｄ）、ｐ５３活性は、Ｇ２停止を開始するのに必要で
ないが、Ｇ２停止を維持し、そして細胞死を妨げるのに必要であることを示唆し
た。

【００５４】実施例４：ＨＰＶ１６Ｅ６に不活性化されたｐ５３を含む、正常ヒト骨芽細胞を殺すための、ＵＶ不活性化ＡＡＶＤＮＡの使用ＡＡＶのこの影響が、Ｓａｏｓ−２およびＵ２ＯＳに特有であるかどうか、ま
たは骨細胞に一般的であるのか知るため、正常ヒト骨芽細胞（ＮＨＯ）をＡＡＶ
に感染させた。これらの細胞もまた、Ｇ２で停止し、大きくなり、そして死ぬこ
となく、２週間以上、そのままであった（図２ｅ）。ＮＨＯ中のｐ５３タンパク
質が、ＡＡＶ感染前に、ＨＰＶ１６Ｅ６タンパク質の発現によって分解された
とき（図３ｄ）、細胞（ＮＨＯＥ６）は、死ぬ前に、短期間、Ｇ２で停止した（
図２ｆ）（Ｓａｏｓ−２およびＵ２ＯＳｐ５３ＤＤ細胞とちょうど同じ）。これ
らの観察によって、細胞分裂に対するＡＡＶの影響は、骨肉腫に特有ではなく、
正常骨細胞でも観察可能であることが示唆された。さらに、ｐ５３ＤＤまたはＨ
ＰＶ１６Ｅ６いずれかによるｐ５３活性の消失は、ＡＡＶに感染した際、細胞
死を引き起こし、ＡＡＶに対する分裂骨芽細胞の反応における決定要因として、
ｐ５３活性が重要であることを強調する。これと一致して、ウェスタンブロット
解析は、Ｕ２ＯＳにおけるｐ５３タンパク質が、ＡＡＶ感染後に安定することを
示した（図３ｅ）。ｐ５３活性の増加を示す（１０）、ｐ２１タンパク質（図３
ｅ）に関して、同様の増加が観察された。

【００５５】実施例５：サイクリン−ｃｄｃ２キナーゼの影響ＡＡＶによって課せられる細胞周期遮断をさらに解析するため、サイクリンＢ
−ｃｄｃ２キナーゼの活性をアッセイした。この酵素は、細胞がＧ２期から有糸
分裂に移行するのを誘発する際、必須である（１１）。有糸分裂中にノコダゾー
ルによって遮断された細胞は、サイクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼの高い活性を示
す（図４ａ）。しかし、ＡＡＶ感染Ｕ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２細胞は、４ｎ
ＤＮＡ含量を有するにもかかわらず、非同調対照集団のものよりさらに低いサイ
クリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼ活性を所持し、ＡＡＶ誘導遮断がＧ２期のものであ
ることが示された（図４ａ）。ｐ５３の活性化およびｐ２１タンパク質レベルの
増加が、サイクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼ活性の減少、そしてしたがってＧ２遮
断に寄与している可能性がある（１２−１４）が、低サイクリンＢ−ｃｄｃ２キ
ナーゼ活性はまた、ｐ５３を欠くＳａｏｓ−２細胞でも観察されたことから、こ
れらは、確かに、関与する唯一の因子ではない。ＡＡＶ感染細胞におけるサイク
リンＢおよびｃｄｃ２のタンパク質レベルは、有糸分裂細胞のものと同じである
（図４ｂ）ため、ｃｄｃ２の低キナーゼ活性は、低下したタンパク質産生の結果
ではなかった。しかし、ＡＡＶでのＵ２ＯＳの感染後、電気泳動上で、ｃｄｃ２
タンパク質のかなりの割合が、対照より遅い速度で移動し、リン酸化されている
可能性が示された（図４ｂ）。ｃｄｃ２を脱リン酸化し、そして活性化するのに
必須である（１５）ＣＤＣ２５Ｃホスファターゼを調べると、このホスファター
ゼのタンパク質レベルが、ＡＡＶ感染に反応して、Ｕ２ＯＳで劇的に減少するこ
とが見出された（図４ｃ）。興味深いことに、Ｕ２ＯＳｐ５３ＤＤ細胞は、ＡＡ
Ｖに感染しても、含むＣＤＣ２５Ｃタンパク質レベルは減少しなかった（図４ｄ
）。プロテアソーム阻害剤、Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ノルロイシナル（
ＮａＬＬＮ）（１６）でＡＡＶ感染Ｕ２ＯＳ細胞を処理すると、ＣＤＣ２５Ｃタ
ンパク質の消失が妨げられ（図４ｅ）、プロテアソーム複合体が、Ｕ２ＯＳ細胞
において、ＣＤＣ２５Ｃの分解に関与することが示された。ＣＤＣ２５Ｂ（図４
ｃ）および試験した多くの他のタンパク質のタンパク質レベルが不変であったた
め、この分解は特異的であった。ＡＡＶに誘発されるＣＤＣ２５Ｃタンパク質の
分解は、機能するｐ５３の存在とカップリングし、そして延長されたＧ２停止に
重要であると結論付けられる。

【００５６】実施例６：比較例−対照ＡＡＶ粒子のどの構成要素が、これらの影響に関与するかを決定するため、細
胞をウイルスの個々の構成要素に感染させた。ＡＡＶ様粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２
、およびＶＰ３を発現する組換えバキュロウイルスから調製した。キャプシドタ
ンパク質およびＲｅｐを含むが、ＡＡＶＤＮＡを含まない、空のＡＡＶ粒子を
、塩化セシウム勾配遠心分離を用いて、ＡＡＶ調製から精製した。これらのいず
れも、Ｓａｏｓ−２またはＵ２ＯＳ細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。細胞に
おけるＲｅｐタンパク質単独のレトロウイルス仲介発現は、ＣＤＣ２５Ｃタンパ
ク質レベルまたはｐ５３活性を変化させなかった（Ｓａｕｄａｎら、投稿）。こ
れらの実験に用いたＵＶ不活性化ＡＡＶは、ウイルスタンパク質またはＤＮＡの
合成を支持不能であり、新規に合成されるウイルスタンパク質が、これらの影響
を誘導するのに関与しないことが示された。その代わり、上に概略した結果は、
ウイルスＤＮＡが原因となる剤であることを示す。いくつかの系統の証拠によっ
て、両端にヘアピンループを持つ一本鎖のＡＡＶＤＮＡが、細胞によって異常
なＤＮＡと感知され（１７）、そしてＤＮＡ損傷反応を誘発する可能性があるこ
とが示唆される。まず、使用前のウイルスのＵＶ不活性化は、影響の度合いを減
少させず、むしろ増加させた。第二の鎖合成を妨げることによって、ＵＶ処理は
、ウイルスＤＮＡを最初の一本鎖型に保持し、そしてこうして、ＤＮＡ損傷チェ
ックポイントの延長された活性化を誘導する。次に、ＤＮＡ損傷に対する細胞反
応（１４、１８）またはＡＡＶ感染に対する細胞反応は、多くの類似点を持つ。
どちらの場合でも、細胞は、ｐ５３が存在する場合、Ｇ２での延長された停止を
確立することによって、またはｐ５３が存在しない場合、死ぬ前にＧ２で一時的
に休止することによって、反応する可能性がある。

【００５７】実施例７：比較例−対照ＡＡＶ調製の塩化セシウム分画を、Ｕ２ＯＳ細胞に感染させるのに用いる前に
、２４００Ｊ／ｍ²でＵＶ照射した。２日後、細胞ＤＮＡの含量を、ＦＡＣＳ解
析によって測定した。分画３に感染させた約６０％の細胞（図５を参照されたい
）は、Ｇ２で停止した。イムノブロットは、この分画にＲｅｐタンパク質が存在
しないが、細胞に影響を及ぼさない分画５およびその上に存在することを示す。
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は分画３に存在したが、これらはまた、反応を生じ
ない分画にも存在した。分画３はＡＡＶ−ＤＮＡを含む。

【００５８】実施例８：ＤＮＡが標的細胞内部に取り入れられるための必要条件ＡＡＶが細胞に進入する表面受容体を遮断する、ヘパラン硫酸の存在下で、Ｕ
Ｖ照射ＡＡＶでの感染を行うと、細胞に対するＡＡＶの影響は、存在するヘパラ
ン硫酸の量に正比例して減少した。

【００５９】ＡＡＶ感染を、ＡＡＶ粒子に対する抗体の存在下で行うと、細胞はいずれもウ
イルスに反応しなかった。感染前にＡＡＶを紫外光によって不活性化すると、細胞に対するウイルスの影
響は減少せず、増加した。

【００６０】実施例９：エトポシドＤＮＡ損傷に対する比較活性化されるのがＤＮＡ損傷経路であることを確認するため、ＡＡＶ感染の代
わりに、ＤＮＡを損傷することが知られる（１９）エトポシドでＵ２ＯＳ細胞を
処理した。ｐ５３、ｐ２１およびＣＤＣ２５Ｃタンパク質レベルを解析すると、
これらは、ＡＡＶによって引き起こされるのと同一の方式で変化することが見出
され（図４ｆ）、ＤＮＡ損傷反応が活性化されたことが確認された。ＡＡＶは、
相補的ウイルスＤＮＡ鎖のいずれかをキャプシド形成するが、別個のウイルス粒
子内に形成する。相補鎖は、ひとたび遊離したら、アニーリング可能であるため
、粒子からのＡＡＶＤＮＡの単離は、ヘアピン形成一本鎖構造を保存しないで
あろう。したがって、ＡＡＶＤＮＡのトランスフェクションは、ＡＡＶ感染の
影響を模倣するとは期待されず、このとおりの結果が、実際に観察された。

【００６１】ＡＡＶ感染骨芽細胞の場合、損傷は、ＣＤＣ２５Ｃタンパク質の破壊とカップ
リングするが、１４−３−３σタンパク質の増加とカップリングしない。ＤＮＡ
損傷ヒト結腸直腸癌細胞において、Ｇ２遮断は、１４−３−３σタンパク質レベ
ルの増加とカップリングし（１８）、一方、ヒト包皮線維芽細胞において、サイ
クリンＢおよびｃｄｃ２遺伝子発現の抑制が報告された（２４）。これらの経路
はすべて、最終的に、サイクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼ活性の不活性化およびＧ
２停止の持続を生じる。

【００６２】実施例１０：さらなる細胞株ＨＴ１０８０、ヒト平滑筋細胞を試験し、そしてＡＡＶに感染した際、細胞周
期のＧ２期で停止することを見出した。ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（野生型
ｐ５３を含む）を試験し、そして細胞周期のＧ２期で停止することを見出した。
ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞をＡＡＶに感染させると、これらはＧ２で一時
的に停止し、そして続いて死んだ（図２ｇおよび２ｈを参照されたい）。ｐ５３
＋株において、ｐ５３、ｐ２１および１４−３−３σレベルは増加したが、ｃｄ
ｃ２およびＣＤＣ２５Ｃは減少した（図６ａを参照されたい）。ｐ５３−細胞に
おけるレベルは、ｐ５３ＤＤＵ２ＯＳにおけるように、不変であった（６ｂを
参照されたい）。ｐ２１を欠くＨＣＴ１１６細胞は、Ｇ２停止を持続するのに失
敗し、そして死んだが、１４−３−３σを欠くものは、停止を持続し、細胞死は
最小限であった。

【００６３】図６ｃは、エトポシドがこの効果を模倣することを示す。ＡＴＭ阻害剤である
カフェインの存在下で感染したＵ２ＯＳ細胞は、Ｇ２期で停止するのに失敗した
が、増殖しつづけた（図２ｋを参照されたい）。これと一致して、ＡＴＭヌル細
胞（ＡＴ５ＢＩ、ＳＶ４０形質転換）は、ＡＡＶに影響を受けなかったが、対照
細胞（ＧＭ８４７およびＭＲＣ５−ＳＶ２）は受けた（図２ｌ−ｎ）。したがっ
て、これは、ＡＡＶがＡＴＭ依存ＤＮＡ損傷反応を誘導することによって、細胞
に影響を及ぼすことと一致する。

【００６４】したがって、ＡＡＶは、間充織（骨および筋肉）および上皮起源の細胞におい
て、同様の影響を誘導することが可能である。実施例１１：ヘアピンループＤＮＡの影響Ｓａｏｓ−２、Ｕ２ＯＳおよびＵ２ＯＳｐ５３ＤＤ細胞に、ＡＡＶコード配列
をまったく含まないＡＡＶヘアピン１４５塩基配列（配列番号２を参照されたい
）に対応するオリゴヌクレオチドをマイクロインジェクションした。Ｓａｏｓ−
２およびＵ２ＯＳｐ５３ＤＤ細胞は殺され（図７を参照されたい）、一方、Ｕ２
ＯＳ細胞は生き残り、この非対形成塩基を含むＤＮＡが、ｐ５３−細胞を殺すの
に有効であることが例示された。精製ＩＴＲ−ＤＮＡが、ハムスター全体のＡｄ
１２感染に反応して、腫瘍形成を抑制することが見出された、先の研究から、こ
うしたＤＮＡが、個々の細胞にマイクロインジェクションする必要を伴わず、ｉ
ｖ注入後、細胞内部に取り入れられると期待可能であるのが明らかである。

【００６５】実施例１２：腫瘍形成に対する影響アイソジェニックＨＣＴ１１６ｐ５３−／−およびＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋
細胞株を、ヌードマウス皮膚下に注入し、その後、２日後に、ＡＡＶまたは対照
としてＰＮＢＳを注入した。−／−株では、対照注入の１００％が腫瘍を生じさ
せたが、これはＡＡＶ処置では１７％に落ちた。＋／＋株では、ＡＡＶで、８０
％の腫瘍がまだ形成され、ｄｅｌａＭａｚａおよびＣａｒｔｅｒ、同書の知
見と一致した。

【００６６】その後、確立された腫瘍に対するＡＡＶの影響を試験すると、腫瘍の大きさは
、−／−株で、対照の３４から７４％であった。さらなるｐ５３株、ＨＴ２９細
胞では、ＡＡＶは、腫瘍の６０％の完全退縮、および残りでは対照の１９から３
４％の大きさの減少を引き起こした。

【００６７】実施例１３：合成ｐ５３選択的細胞傷害性ＤＮＡ必ずしも、ＡＡＶＤＮＡまたは該ＤＮＡ由来のループを使用する必要はない
ことが認識されるだろう。本発明で使用するための以下の提唱されるＤＮＡが思
い浮かび、本発明の精神にありつつ、非対形成塩基を、いかなる他の塩基に対し
て置換してもよく、そして対形成塩基が、いかなる他の塩基対に置換されてもよ
いことが認識される。

【００６８】（ｉ）例えば式に例示するような、１つ、２つまたは３つの非対形成塩基を含
む、ループ端を例外として、すべての塩基が、ＤＮＡの他の塩基と対形成するよ
うな、内部パリンドローム配列を有する一本鎖ＤＮＡ。

【００６９】

【化１】

【００７０】式中、Ｎ¹およびＮ²は、水素であるかまたは互いに塩基対形成する等しい長さ
のオリゴヌクレオチド鎖であり、これらの鎖に連結した、配列ＴＡおよびＡＴは、慣用的な方式で、互いに塩基
対形成し、そして末端の３つの塩基Ｎは、塩基対形成しない。

【００７１】ＴＡおよびＡＴは、ＣＧおよびＧＣ、ＧＴおよびＴＧ、ＴＧおよびＧＴ、ＧＣ
およびＣＧまたはＡＴおよびＴＡに置換してもよいことが理解されるであろう。または（ｉｉ）一般式

【００７２】

【化２】

【００７３】式中、Ｎ₁−Ｎ₄およびＸは、独立に選択されるヌクレオチドであり、そしてｎ
は０から１０、より好ましくは１から４、最も好ましくは１の整数であるの環状一本鎖オリゴヌクレオチド。

【００７４】こうしたオリゴヌクレオチドの一例は

【００７５】

【化３】

【００７６】であり、すべての塩基は、互いに近接して連結するが、１つまたはそれ以上また
はすべてが塩基対形成しない。（ｉ）および（ｉｉ）どちらの場合でも、塩基はヌクレアーゼに耐性である修
飾塩基であってもよい。

【００７７】いかなる点でもターゲッティングを変化させることが望ましい場合、塩基のい
ずれも、しかし特に、（ｉ）の場合の５’または３’塩基は、エステルまたはア
ミドまたは他の適切な連結結合によって、ペプチドまたは他のターゲッティング
部分に連結していてもよい。

【００７８】これらの一本鎖オリゴヌクレオチドをターゲッティング部分に連結させる方法
論は、本明細書に援用される、以下の教科書に提供されるとおりである。ビオチンおよびジゴキシゲニンなどの分子に、ニトロフェニルアジド基および
ＵＶ照射を用いてＤＮＡを連結する方法は、Ｆｏｒｓｔｅｒら（１９８５）、Ｈ
ａｂｉｌｉら（１９８７）、Ａｇｒａｗａｌら（１９８６）、Ｊａｂｌｏｎｓｋ
ｉら（１９８６）、およびＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ（１９８４）、Ｇｕｅｓｄｏ
ｎ（１９９２）、ＶｉａｌｅおよびＤｅｌｌ’Ｏｒｔｏ（１９９２）、Ｒｅｉｓ
ｃｈｌら（１９９４）、およびＭａｎｓｆｉｌｅｄら（１９９５）に記載される
。参考文献の詳細に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，
第９章を参照されたい。

【００７９】タンパク質／ペプチド結合モチーフに対するＤＮＡの使用を使用して、ペプチ
ドのタンパク質にＤＮＡが結合されてきており、例えばＧａｌ４ペプチド結合モ
チーフの使用は、使用しようとするｇａｌ４にペプチドを融合させるのを可能に
する（本明細書に援用されるＷＯ／００２６３７９およびＰＣＴ／ＤＥ９９／０
３５０６を参照されたい）。

【００８０】ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７５３９、１３ページに記載されるものなどの技術を用
いて、シグナルペプチドをＤＮＡにカップリングする。共有チオエステル結合が
特に好ましい。本明細書に援用されるＷＯ９７／２５０７０に記載されるよう
に、ＤＮＡはまた、ペプチドにコーティングしてもまたはペプチド内に絡ませて
もよく、該文献の４６ページを参照されたい。参考文献

【００８１】

【表１】

【００８２】

【００８３】

【００８４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、骨肉腫細胞に対するＡＡＶ−２感染の影響を示す。ＡＡ
ＶＤＮＡの模式的提示（ａ）。Ｓａｏｓ−２（ｂ）またはＵ２ＯＳ（ｅ）は、
５０００の感染効率（ＭＯＩ）で、ＡＡＶに感染させた。感染２日（ｃおよびｆ
）または５日（ｄおよびｇ）後の２００ｘ倍率での細胞の状態。

【図２】ＡＡＶ感染後の細胞のＤＮＡ含量。細胞は２５０（ａおよびｂ）
または５０００（ｃからｎ）いずれかのＭＯＩで、ＡＡＶに感染させた。示した
時間後、細胞を採取し、冷７０％エタノールで固定し、そしてヨウ化プロピディ
ウムで染色した。フローサイトメトリーによる蛍光活性化細胞分取装置により、
ＤＮＡ含量を測定した。

【図３】図３は、ＡＡＶ−２感染Ｕ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２細胞のアポ
トーシスおよびタンパク質解析を例示する。図３ａは非感染（左のカラム）およびＡＡＶ感染（感染２日後、右のカラム）
Ｓａｏｓ−２細胞における、アネキシンＶのＦＡＣＳ解析を示す。円領域は、ア
ポトーシス細胞に相当する。図３ｂは、ｐ５３ＤＤを発現するレトロウイルスに感染させ、抽出物を調製し
、そしてｐ５３（ＤＯ−１）、ｐ５３ＤＤ（Ｐｂ４２１）およびｐ２１に対する
抗体を用いて解析したＵ２ＯＳ細胞のウェスタンブロットを示す。図３ｃは、ｐ５３に対する抗体（ＤＯ−１）を用いて解析した、初代ヒト骨芽
細胞（ＮＨＯ）およびＥ６発現ＮＨＯ（ＮＨＯＥ６）の抽出物における、ｐ５３
レベルを示す。図３ｄは、ＡＡＶ感染後、明示する時点で、ウェスタンブロッティングを用い
て決定した、Ｕ２ＯＳにおけるｐ５３およびｐ２１タンパク質レベルを例示する
。図３ｅは、ヒストンＨ１を基質として用いて決定した、非感染またはＡＡＶ感
染あるいはノコダゾール処理後いずれかのＵ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２細胞のサ
イクリンＢ−ｃｄｃ２キナーゼ活性を例示する。図３ｆは、ウェスタンブロッティングを用いて決定した、サイクリンＢ−ｃｄ
ｃ２キナーゼ活性に関して、上記の（ｅ）で用いたＵ２ＯＳ抽出物における、サ
イクリンＢおよびｃｄｃ２タンパク質を例示する。図３ｇは、ウェスタンブロッティングを用いて決定した、ＡＡＶ感染後、多様
な時点での、Ｕ２ＯＳ抽出物における、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣ２５Ｂおよびアク
チンレベルを例示する。図３ｈは、ＡＡＶ感染後、多様な時点での、Ｕ２Ｏｓｐ５３ＤＤ細胞の抽出物
における、ＣＤＣ２５Ｃレベルの解析を示す。図３ｉは、感染２４時間後に培地に添加され、そして２．５時間放置された、
プロテアソーム阻害剤ＮａＬＬＮの非存在下または存在下での、ＡＡＶ感染Ｕ２
ＯＳにおける、ＣＤＣ２５Ｃタンパク質レベルを例示する。

【図４】ＡＡＶ感染に反応した細胞の運命を決定する際のｐ５３の関与。
ｐＲｂ（ａ）またはｐ２１（ｂ）を発現するレトロウイルスでの感染後、ピュー
ロマイシンで選択したＳａｏｓ−２細胞のウェスタンブロット解析。ピューロマ
イシン選択後、ｐ５３ＤＤを発現するレトロウイルスに感染させたＵ２ＯＳの抽
出物を、ｐ５３（ＤＯ−１）、ｐ５３ＤＤ（Ｐｂ４２１）およびｐ２１に対す
る抗体を用いたウェスタンブロッティングで解析した（ｃ）。初代ヒト骨芽細胞
（ＮＨＯ）およびＥ６発現ＮＨＯの抽出物におけるｐ５３タンパク質レベルは、
ｐ５３に対する抗体（ＤＯ−１）を用いて解析した（ｄ）。ＡＡＶ感染後の明示
する時点の、Ｕ２ＯＳにおけるｐ５３およびｐ２１タンパク質レベルは、各タン
パク質に対する抗体でのウェスタンブロッティングによって解析した（ｅ）。

【図５】ＡＡＶ感染に反応したＧ２／Ｍチェックポイント制御因子の生化
学的解析。（ａ）ＡＡＶに感染したＵ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２のサイクリンＢ−ｃｄｃ
２キナーゼアッセイ。（ｂ）（ａ）で用いたＵ２ＯＳ抽出物のサイクリンＢおよ
びｃｄｃ２タンパク質のウェスタンブロット。（ｃ）ＡＡＶ感染後の多様な時点
でＵ２ＯＳから得た細胞抽出物の、ヒトＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣ２５Ｂおよびアク
チンに対する抗体を用いた、ウェスタンブロット。（ｄ）ＡＡＶ感染後の多様な
時点でＵ２ＯＳｐ５３ＤＤから調製した抽出物における、ＣＤＣ２５Ｃのウェス
タンブロット解析。（ｅ）ＡＡＶ感染の２４時間後、ＮａＬＬＮ（プロテアソー
ム阻害剤）を感染Ｕ２ＯＳの培地に２．５時間添加した。ウェスタンブロッティ
ングによって、ＣＤＣ２５Ｃタンパク質に関して、細胞抽出物を解析した。（ｆ
）Ｕ２ＯＳを、５０００のＭＯＩでＡＡＶに感染させるか、または２μｇ／ｍｌ
のエトポシドで処理した。２４時間後に調製した細胞抽出物を、ウェスタンブロ
ット上で、ｐ５３、ｐ２１およびＣＤＣ２５Ｃに対する抗体で解析した。

【図６】図６は、ＡＡＶ感染結腸癌細胞およびエトポシド処理Ｕ２ＯＳの
タンパク質解析を示し、ＡＡＶ感染ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋結腸癌細胞の抽出
物において、示すような一連の関連する制御タンパク質を、ウェスタンブロッテ
ィングによって解析した（ａ）。（ｂ）ＡＡＶ感染後のＨＣＴ１１６ｐ５３−／
−細胞における、および（ｃ）ＡＡＶに感染したかまたは２μｇ／ｍｌエトポシ
ドで処理したかいずれかのＵ２ＯＳにおける、ＣＤＣ２５Ｃタンパク質レベルの
解析。細胞抽出物は２４時間後に調製し、電気泳動し、そしてｐ５３、ｐ２１お
よびＣＤＣ２５Ｃに対する抗体で探査した。

【図７】図７は、レジェンドに示した剤の注射後の日数に対してプロット
したＧＦＰ発現細胞を示すグラフであり、細胞にマイクロインジェクションした
ＡＡＶＩＴＲ（ＡＡＶ−２ＤＮＡの末端１４５塩基のみ）の影響を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA03 EA02 GA12 HA17 4C076 AA19 CC27 CC35 EE59 4C084 AA13 NA14 ZB262 ZB332

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞がＳａｏｓ−２細胞以外であるという条件で、細胞内
部に取り入れられることが可能な形で、別の塩基と塩基対形成しない少なくとも
１つの塩基を含む部分を含む、一本鎖および／またはループ化ＤＮＡを、細胞に
搬送することを含む点で特徴付けられる、有効なｐ５３タンパク質活性を欠く細
胞を殺す方法。
【請求項２】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、ペプチドまたは
タンパク質を発現するよう設定されておらず、有効なｐ５３タンパク質活性を有
する細胞のバックグラウンド集団の存在下で、ｐ５３タンパク質活性を欠く細胞
を選択的に殺す点で特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】細胞が分裂細胞である点で特徴付けられる、先行する請求
項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、標的細胞壁に結
合する部分に付着しているか、または該部分と結合している形である点で特徴付
けられる、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、アデノ関連ウイ
ルスの形であるか、またはアデノ関連ウイルスタンパク質と結合している点で特
徴付けられる、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、ＤＮＡがもはや
細胞における複製または発現が不能であるように処理されている、アデノ関連ウ
イルスの形である点で特徴付けられる、先行する請求項のいずれか１つに記載の
方法。
【請求項７】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、照射処理アデノ
ウイルス関連ウイルスの形である点で特徴付けられる、先行する請求項のいずれ
か１つに記載の方法。
【請求項８】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、一端または両端
でＤＮＡのループを有する点で特徴付けられる、先行する請求項のいずれか１つ
に記載の方法。
【請求項９】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、標的細胞の内部
に取り入れられるのを促進する部分と結合している点で特徴付けられる、先行す
る請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、標的細胞への
結合または進入のため、細胞表面受容体を使用することが可能であるウイルスタ
ンパク質キャプシド内に被包されている点で特徴付けられる、先行する請求項の
いずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、標的細胞の内
部に該ＤＮＡが取り入れられるのを促進する、１またはそれ以上のウイルス線維
と結合しているか、または該線維と結合するビヒクル内に含まれる点で特徴付け
られる、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、陽イオン性ペ
プチドで凝縮されている点で特徴付けられる、先行する請求項のいずれか１つに
記載の方法。
【請求項１３】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、リポソームと
結合しているか、またはリポソーム内に被包されている点で特徴付けられる、先
行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】一本鎖および／またはループ化ＤＮＡが、ペネトラチン
またはインテグリンと結合している点で特徴付けられる、先行する請求項のいず
れか１つに記載の方法。
【請求項１５】突然変異体ｐ５３に関連する癌、または細胞ｐ５３を阻
害する感染を患う個体を治療する方法であって、その個体に、請求項１から１４
のいずれか１つの方法に記載するような、一本鎖および／またはループ化ＤＮＡ
の療法的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】突然変異体ｐ５３に関連する癌の治療用の医薬品製造の
ための、有効なｐ５３タンパク質活性を欠く標的細胞の内部に取り入れられるの
が可能な形である、一本鎖および／またはループ化ＤＮＡの使用。
【請求項１７】ｐ５３活性を阻害するウイルスでの感染の治療用の医薬
品製造のための、有効なｐ５３タンパク質活性を欠く標的細胞の内部に取り入れ
られるのが可能な形である、一本鎖および／またはループ化ＤＮＡの使用。
【請求項１８】療法で使用するための、標的細胞内に取り入れられるこ
とが可能な形で、ＤＮＡの３’および５’端いずれに関しても内部に位置する、
別の塩基と塩基対形成しない少なくとも１つの塩基を含む部分を含む、一本鎖お
よび／またはループ化ＤＮＡ。
【請求項１９】療法で使用するための、分解に耐性である形である、請
求項１８に記載の一本鎖および／またはループ化ＤＮＡ。
【請求項２０】療法で使用するための、一端または両端にＤＮＡのルー
プを有する点で特徴付けられる、請求項１９に記載の一本鎖および／またはルー
プ化ＤＮＡ。
【請求項２１】療法で使用するための、ｐ５３活性を欠く標的細胞に結
合可能な部分と結合した形である、一本鎖および／またはループ化ＤＮＡ。
【請求項２２】療法で使用するための、ウイルスキャプシドまたはリポ
ソーム内に被包されている形である、請求項１８から２１のいずれか１つに記載
の一本鎖および／またはループ化ＤＮＡ。
【請求項２３】療法で使用するための、細胞中で自己複製不能な形であ
る、請求項１８から２２のいずれか１つに記載の一本鎖および／またはループ化
ＤＮＡ。
【請求項２４】療法で使用するための、細胞中で二本鎖ＤＮＡを形成し
ない形である、請求項１８から２３のいずれか１つに記載の一本鎖および／また
はループ化ＤＮＡ。
【請求項２５】別の塩基と塩基対形成しない、ＤＮＡの３’および５’
端いずれに関しても内部に位置する、少なくとも１つの塩基を含む部分を含む、
一本鎖および／またはループ化ＤＮＡを含む、薬剤組成物。
【請求項２６】ＤＮＡが、ｐ５３活性を欠く標的細胞に結合する部分と
結合しており、前記ＤＮＡがＡＡＶＤＮＡの形でない点で特徴付けられる、請
求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】照射処理への曝露によって、標的細胞中で、二本鎖ＤＮ
Ａを形成することが不可能にされている、ＡＡＶＤＮＡを含む、薬剤組成物。
【請求項２８】ＤＮＡが、発熱物質および／または無菌型の薬学的に許
容しうるキャリアーと共に提供される点で特徴付けられる、請求項２５から２７
に記載の組成物。