TW202111122A - 藉靶向dmpk基因治療肌肉萎縮症之方法 - Google Patents

藉靶向dmpk基因治療肌肉萎縮症之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202111122A
TW202111122A TW109117727A TW109117727A TW202111122A TW 202111122 A TW202111122 A TW 202111122A TW 109117727 A TW109117727 A TW 109117727A TW 109117727 A TW109117727 A TW 109117727A TW 202111122 A TW202111122 A TW 202111122A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
promoter
base sequence
polynucleotide
sequence
Prior art date
Application number
TW109117727A
Other languages
English (en)
Inventor
吉見英治
大江智也
山形哲也
基思 Ｍ 康諾利
Original Assignee
日商安斯泰來製藥股份有限公司
日商摩大力斯醫療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商安斯泰來製藥股份有限公司, 日商摩大力斯醫療公司 filed Critical 日商安斯泰來製藥股份有限公司
Publication of TW202111122A publication Critical patent/TW202111122A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本發明係關於聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之表現調控區中如以下所列區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119， 預期該等聚核苷酸適用於治療肌肉萎縮症。

Description

藉靶向DMPK基因治療肌肉萎縮症之方法
本發明係關於用於藉靶向人類肌緊張素(myotonin)蛋白激酶(DMPK；強直性肌肉萎縮蛋白激酶，dystrophia myotonica protein kinase)基因及類似者來治療肌肉萎縮症的方法。更特定言之，本發明係關於用於藉由使用靶向人類DMPK基因之特定序列之嚮導RNA以及轉錄抑制因子與CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat，有規律間隔成簇短回文重複序列)效應蛋白之融合蛋白及類似者抑制人類DMPK基因之表現來治療或預防肌肉萎縮症的方法及醫藥組合物。
肌肉萎縮症為與進行性肌肉萎縮及肌無力相關之遺傳疾病的通用術語。直至今日，仍不存在對肌肉萎縮症有效之基本治療藥物，且僅進行症狀治療。在肌肉萎縮症中，1型強直性肌肉萎縮症(myotonic dystrophy type 1，DM1)係由DMPK基因之突變引起。
DM1為由DMPK基因之3'非轉譯區(3'UTR)之CTG重複序列之拉伸引起的一種常染色體顯性遺傳疾病且為一種三核苷酸重複序列疾病。已報導，在DM1中，含有擴增之CUG重複序列之RNA自內源性RNA目標分離CUG重複序列結合蛋白，諸如MBNL (肌盲蛋白樣，Muscleblind-like)，從而引起異常剪接模式、RNA穩定性/定位變化及類似者。此等發現表明擴增之重複序列基因座之靜默具有治療價值，且諸如反義寡核苷酸、小RNA、小分子及類似者之各種方法用於使有毒RNA靜默(參見Pinto B等人, Mol Cell. 2017年11月2日, 68(3):479-490，其以全文引用之方式併入本文中)。
舉例而言，Jauvin等人用靶向DMPK基因之3'UTR的反義寡核苷酸(ASO)處理作為DM1小鼠模型的DMSXL小鼠，且顯示DMPK mRNA含量降低、核RNA聚集體(RNA集落)減少及肌肉強度增加，而未偵測到明顯毒性(參見Jauvin D等人, Mol Ther Nucleic Acids. 2017年6月16日, 7:465-474，其以全文引用之方式併入本文中)。
WO2018/002812揭示一種用於藉由基因組編輯，例如使用CRISPR/Cas9系統編輯細胞中之DMPK基因的方法，其可用於治療DMPK相關病況或病症，諸如DM1 (參見WO2018/002812，其以全文引用之方式併入本文中)。
Pinto等人及Batra等人證明應用去活化/核酸酶失活Cas9 (dCas9)治療DM1之可能性。特定言之，Pinto等人將dCas9及gRNA組合至CTG重複序列區，且顯示dCas9有效地阻斷擴增微衛星重複序列之轉錄，由此因重複序列擴增所致的DM1之表現型特性可活體外及活體內(在作為DM1小鼠模型之HSALR 小鼠中)進行改善(參見Pinto B等人, Mol Cell. 2017年11月2日, 68(3):479-490，其以全文引用之方式併入本文中)。另一方面，Batra等人顯示，與RNA核酸內切酶融合之dCas9及DMPK mRNA之CUG重複序列區之gRNA的組合可降低CUG重複序列擴增RNA之含量且改善DM1患者細胞中之剪接異常(參見Batra R等人, Cell. 2017年8月24日, 170(5):899-912，其以全文引用之方式併入本文中)。
因此，本發明之一個目的在於提供肌肉萎縮症(特定言之DM1)之新穎治療方法。
本發明之另一目標在於提供適用於治療肌肉萎縮症之新穎藥劑。
已藉由發明人之以下發現達成此等及其他將在以下詳細描述中變得顯而易見之目標：可使用靶向人類DMPK基因(基因ID：1760)之特定序列之嚮導RNA及轉錄抑制因子與核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白之融合蛋白強有力地抑制人類DMPK基因之表現。基於此等發現，本發明人已完成本發明。
因此，本發明提供以下各者： (1)一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。 (2)如上文提及之(1)之聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。 (3)如上文提及之(1)或(2)之聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111。 (4)如上文提及之(1)之聚核苷酸，其中編碼該嚮導RNA之該鹼基序列包含：SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列。 (5)如上文提及之(1)至(4)中任一項之聚核苷酸，其包含至少兩個編碼該嚮導RNA之鹼基序列，其中該至少兩個鹼基序列不同。 (6)如上文提及之(1)至(5)中任一項之聚核苷酸，其中該轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A。 (7)如上文提及之(6)之聚核苷酸，其中該轉錄抑制因子為KRAB。 (8)如上文提及之(1)至(7)中任一項之聚核苷酸，其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dCas9。 (9)如上文提及之(8)之聚核苷酸，其中該dCas9係來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。 (10)如上文提及之(1)至(9)中任一項之聚核苷酸，其進一步包含編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之啟動子序列及/或編碼該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及該轉錄抑制因子之該融合蛋白的該鹼基序列之啟動子序列。 (11)如上文提及之(10)之聚核苷酸，其中編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之該啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (12)如上文提及之(11)之聚核苷酸，其中編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之該啟動子序列為U6啟動子。 (13)如上文提及之(10)至(12)中任一項之聚核苷酸，其中編碼該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及該轉錄抑制因子之該融合蛋白的該鹼基序列之該啟動子序列為廣泛啟動子或肌肉特異性啟動子。 (14)如上文提及之(13)之聚核苷酸，其中該廣泛啟動子係選自以下之群：EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子。 (15)如上文提及之(13)之聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子係選自以下之群：CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子及Des啟動子。 (16)如上文提及之(15)之聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。 (17)如上文提及之(10)至(16)中任一項之聚核苷酸， 其中編碼該嚮導RNA之該鹼基序列包含SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之該鹼基序列， 該轉錄抑制因子為KRAB， 該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之該啟動子序列為U6啟動子，且 編碼該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及該轉錄抑制因子之該融合蛋白的該鹼基序列之該啟動子序列為CK8啟動子。 (18)如上文提及之(17)之聚核苷酸， 其中編碼該嚮導RNA之該鹼基序列包含SEQ ID NO: 83中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 83中所列之該鹼基序列。 (19)一種載體，其包含如上文提及之(1)至(18)中任一項之聚核苷酸。 (20)如上文提及之(19)之載體，其中該載體為質體載體或病毒載體。 (21)如上文提及之(20)之載體，其中該病毒載體係選自以下之群：腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體及慢病毒載體。 (22)如上文提及之(21)之載體，其中該AAV載體係選自以下之群：AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、AAV587 MTP、AAV588 MTP、AAV-B1、AAVM41及AAVrh74。 (23)如(22)之載體，其中該AAV載體為AAV9。 (24)一種醫藥組合物，其包含如上文提及之(1)至(18)中任一項之聚核苷酸或如上文提及之(19)至(23)中任一項之載體。 (25)如上文提及之(24)之醫藥組合物，其用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症(myotonic dystrophy type 1)。 (26)一種用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之方法，其包含向有需要之個體投與如上文提及之(1)至(18)中任一項之聚核苷酸或如上文提及之(19)至(23)中任一項之載體。 (27)一種如上文提及之(1)至(18)中任一項之聚核苷酸或如上文提及之(19)至(23)中任一項之載體的用途，其用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症。 (28)一種如上文提及之(1)至(18)中任一項之聚核苷酸或如上文提及之(19)至(23)中任一項之載體的用途，其用於製造用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之醫藥組合物。 (29)一種核糖核蛋白，其包含以下： (c)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。 (30)如上文提及之(29)之核糖核蛋白，其包含以下： (c)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。 (31)如上文提及之(29)或(30)之核糖核蛋白，其包含以下： (c)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111。 (32)如上文提及之(29)之核糖核蛋白，其中該嚮導RNA包含：SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列。 (33)如上文提及之(29)至(32)中任一項之核糖核蛋白，其中該轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A。 (34)如上文提及之(29)至(33)中任一項之核糖核蛋白，其中該轉錄抑制因子為KRAB。 (35)如上文提及之(29)至(34)中任一項之核糖核蛋白，其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dCas9。 (36)如上文提及之(35)之核糖核蛋白，其中該dCas9係來源於金黃色葡萄球菌。 (37)如(29)至(36)中任一項之核糖核蛋白， 其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列， 其中該轉錄抑制因子為KRAB，且 其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9。 (38)如(37)之核糖核蛋白，其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列。 (39)一種用於抑制人類DMPK基因之表現的組合物或套組，其包含以下： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。 (40)如上文提及之(39)之組合物或套組，其包含以下： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。 (41)如上文提及之(39)或(40)之組合物或套組，其包含以下： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。 (42)如上文提及之(39)之組合物或套組，其中該嚮導RNA包含：SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之該鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之該鹼基序列。 (43)如上文提及之(39)至(42)之組合物或套組，其包含至少兩種不同嚮導RNA，或編碼至少兩種不同嚮導RNA之聚核苷酸，或至少兩種編碼該等嚮導RNA之聚核苷酸，其中該至少兩種聚核苷酸不同。 (44)如上文提及之(39)至(43)中任一項之組合物或套組，其中該轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A。 (45)如上文提及之(44)之組合物或套組，其中該轉錄抑制因子為KRAB。 (46)如上文提及之(39)至(45)中任一項之組合物或套組，其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dCas9。 (47)如上文提及之(46)之組合物或套組，其中該dCas9係來源於金黃色葡萄球菌。 (48)如上文提及之(39)至(47)中任一項之組合物或套組， 其中該組合物或套組包含編碼該融合蛋白之聚核苷酸及編碼該嚮導RNA之聚核苷酸，且 其中編碼該融合蛋白之該聚核苷酸進一步包含該融合蛋白之啟動子序列，及/或編碼該嚮導RNA之該聚核苷酸進一步包含該嚮導RNA之啟動子序列。 (49)如上文提及之(48)之組合物或套組，其中該嚮導RNA之該啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (50)如上文提及之(48)之組合物或套組，其中該融合蛋白之該啟動子序列為廣泛啟動子或肌肉特異性啟動子。 (51)如上文提及之(50)之組合物或套組，其中該廣泛啟動子係選自以下之群：EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子。 (52)如上文提及之(50)之組合物或套組，其中該肌肉特異性啟動子係選自以下之群：CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子及Des啟動子。 (53)如上文提及之(48)至(52)中任一項之組合物或套組，其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列， 其中該轉錄抑制因子為KRAB， 其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 其中該嚮導RNA之該啟動子序列為U6啟動子，且 其中該融合蛋白之該啟動子序列為CK8啟動子。 (54)如上文提及之(53)之組合物或套組，其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列。 (55)一種用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之方法，其包含投與以下(e)及(f)之步驟： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。 (56)如上文提及之(55)之方法，其包含投與以下(e)及(f)之步驟： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。 (57)如上文提及之(55)或(56)之方法，其包含投與以下(e)及(f)之步驟： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。 (58)如上文提及之(55)之方法，其中該嚮導RNA包含：SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列。 (59)如上文提及之(55)至(58)之方法，其包含投與至少兩種不同嚮導RNA，或編碼至少兩種不同嚮導RNA之聚核苷酸，或至少兩種編碼該等嚮導RNA之聚核苷酸，其中該至少兩種聚核苷酸不同。 (60)如上文提及之(55)至(59)之方法，其中該轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A。 (61)如上文提及之(60)之方法，其中該轉錄抑制因子為KRAB。 (62)如上文提及之(55)至(61)中任一項之方法，其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dCas9。 (63)如上文提及之(62)之方法，其中該dCas9係來源於金黃色葡萄球菌。 (64)如上文提及之(55)至(63)中任一項之方法， 其中該方法包含投與編碼該融合蛋白之聚核苷酸及編碼該嚮導RNA之聚核苷酸，且 其中編碼該融合蛋白之該聚核苷酸進一步包含該融合蛋白之啟動子序列，及/或編碼該嚮導RNA之該聚核苷酸進一步包含該嚮導RNA之啟動子序列。 (65)如上文提及之(64)之方法，其中該嚮導RNA之該啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (66)如上文提及之(64)之方法，其中該融合蛋白之該啟動子序列為廣泛啟動子或肌肉特異性啟動子。 (67)如上文提及之(66)之方法，其中該廣泛啟動子係選自以下之群：EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子。 (68)如上文提及之(66)之方法，其中該肌肉特異性啟動子係選自以下之群：CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子及Des啟動子。 (69)如上文提及之(64)至(68)中任一項之方法，其中該嚮導RNA包含：SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列， 其中該轉錄抑制因子為KRAB， 其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 其中該嚮導RNA之該啟動子序列為U6啟動子，且 其中該融合蛋白之該啟動子序列為CK8啟動子。 (70)如上文提及之(69)之方法，其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列。 (71)以下之用途： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸， 其用於製造用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之醫藥組合物。 (72)如上文提及之(71)之以下(e)及(f)之用途： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸， 其用於製造用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之醫藥組合物。 (73)如上文提及之(71)或(72)之以下(e)及(f)之用途： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之該表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸， 其用於製造用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之醫藥組合物。 (74)如上文提及之(71)之用途，其中該嚮導RNA包含：SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之該鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之該鹼基序列。 (75)如上文提及之(71)至(74)之用途，其包含至少兩種不同嚮導RNA、或編碼至少兩種不同嚮導RNA之聚核苷酸、或至少兩種編碼該等嚮導RNA之聚核苷酸之用途，其中該至少兩種聚核苷酸不同。 (76)如上文提及之(71)至(75)之用途，其中該轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A。 (77)如上文提及之(76)之用途，其中該轉錄抑制因子為KRAB。 (78)如上文提及之(71)至(77)中任一項之用途，其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dCas9。 (79)如上文提及之(78)之用途，其中該dCas9係來源於金黃色葡萄球菌。 (80)如上文提及之(71)至(79)中任一項之用途， 其中該用途包含編碼該融合蛋白之聚核苷酸之用途及編碼該嚮導RNA之聚核苷酸之用途，且 其中編碼該融合蛋白之該聚核苷酸進一步包含該融合蛋白之啟動子序列，及/或編碼該嚮導RNA之該聚核苷酸進一步包含該嚮導RNA之啟動子序列。 (81)如上文提及之(80)之用途，其中該嚮導RNA之該啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (82)如上文提及之(80)之用途，其中該融合蛋白之該啟動子序列為廣泛啟動子或肌肉特異性啟動子。 (83)如上文提及之(82)之用途，其中該廣泛啟動子係選自以下之群：EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子。 (84)如上文提及之(82)之用途，其中該肌肉特異性啟動子係選自以下之群：CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子及Des啟動子。 (85)如上文提及之(80)至(84)之用途，其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之該鹼基序列， 其中該轉錄抑制因子為KRAB， 其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 其中該嚮導RNA之該啟動子序列為U6啟動子，且 其中該融合蛋白之該啟動子序列為CK8啟動子。 (86)如上文提及之(85)之用途，其中該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 171中所列之該鹼基序列。
本發明之作用 根據本發明，可抑制人類DMPK基因之表現，因此，預期本發明能夠治療及/或預防DM1。
1. 聚核苷酸 本發明提供一種包含以下鹼基序列之聚核苷酸(在下文中有時亦稱為「本發明之聚核苷酸」)： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域內長度為18至24個核苷酸之連續區(亦即，18至24個連續核苷酸)：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。
將本發明之聚核苷酸引入至所需細胞中且轉錄以產生核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，以及靶向人類DMPK基因之表現調控區之特定區的嚮導RNA。此等融合蛋白及嚮導RNA形成複合體(該複合物在下文中有時稱作「核糖核蛋白；RNP」)且協作地作用於前述特定區，因此抑制人類DMPK基因之轉錄。在本發明之一個實施例中，可將人類DMPK基因之表現抑制例如不低於約40%、不低於約50%、不低於約60%、不低於約70%、不低於約75%、不低於約80%、不低於約85%、不低於約90%、不低於約95%或約100%。
(1)定義 在本說明書中，「人類DMPK基因之表現調控區」意謂其中人類DMPK基因之表現可藉由使RNP與彼區域結合而抑制的任何區域。亦即，人類DMPK基因之表現調控區可存在於任何區域中，諸如人類DMPK基因及人類DMPK基因之相鄰基因(例如人類DMWD (DM1基因座，含有WD重複序列)基因)之啟動子區、強化子區、內含子、外顯子，只要人類DMPK基因之表現係藉由RNP之結合抑制即可。在本說明書中，當藉由特定序列展示表現調控區時，該表現調控區在概念上包括有義股序列及反義股序列兩者。
在本發明中，核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白係藉由嚮導RNA募集至人類DMPK基因之表現調控區中之特定區域中。在本說明書中，「靶向...之嚮導RNA」意謂「募集融合蛋白至...中之嚮導RNA」。
在本說明書中，「嚮導RNA (亦稱作『gRNA』)」為包含基因組特異性CRISPR-RNA (稱為「crRNA」)之RNA。crRNA為結合(下文描述之)靶向序列之互補序列的RNA。當Cpf1用作CRISPR效應蛋白時，「嚮導RNA」係指包含由crRNA及連接至其5'端之特定序列組成的RNA之RNA (例如在FnCpf1之情況下SEQ ID NO: 138中所列之RNA序列)。當Cas9用作CRISPR效應蛋白時，「嚮導RNA」係指包含crRNA及連接至其3'端之反式活化crRNA (稱作「tracrRNA」)的嵌合體RNA (稱作「單嚮導RNA (sgRNA)」) (參見例如Zhang F.等人, Hum Mol Genet. 2014年9月15日; 23(R1):R40-6及Zetsche B.等人, Cell. 2015年10月22日; 163(3): 759-71，其以全文引用之方式併入本文中)。
在本說明書中，人類DMPK基因之表現調控區中與crRNA所結合之序列互補的序列稱作「靶向序列」。亦即，在本說明書中，「靶向序列」為存在於人類DMPK基因之表現調控區中且鄰近於PAM (前間隔序列鄰近基序)的DNA序列。當Cpf1用作CRISPR效應蛋白時，PAM鄰近於靶向序列之5'側。當Cas9用作CRISPR效應蛋白時，PAM鄰近於靶向序列之3'側。靶向序列可存在於人類DMPK基因之表現調控區之有義股序列側或反義股序列側(參見例如前述Zhang F.等人, Hum Mol Genet. 2014年9月15日; 23(R1):R40-6及Zetsche B.等人, Cell. 2015年10月22日; 163(3): 759-71，其以全文引用之方式併入本文中)。
(2)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白 在本發明中，使用核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白，將融合於其上之轉錄抑制因子募集至人類DMPK基因之表現調控區。待用於本發明中之核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白(在下文中優勢簡稱為「CRISPR效應蛋白」)不受特定限制，只要其形成與gRNA之複合體且募集至人類DMPK基因之表現調控區即可。舉例而言，可包括核酸酶缺失型Cas9 (在下文中有時亦稱作「dCas9」)或核酸酶缺失型Cpf1 (在下文中有時亦稱作「dCpf1」)。
上文提及之dCas9之實例包括(但不限於)化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes )源性Cas9 (SpCas9；PAM序列：NGG (N為A、G、T或C，在下文中同樣))、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )源性Cas9 (St1Cas9；PAM序列：NNAGAAW (W為A或T，在下文中同樣)，St3Cas9；PAM序列：NGGNG)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis )源性Cas9 (NmCas9；PAM序列：NNNNGATT)或金黃色葡萄球菌源性Cas9 (SaCas9；PAM序列：NNGRRT (R為A或G，在下文中同樣))及類似者之核酸酶缺失型變異體(參見例如Nishimasu等人, Cell. 2014年2月27日; 156(5): 935-49, Esvelt KM等人, Nat Methods. 2013年11月; 10(11):1116-21, Zhang Y. Mol Cell. 2015年10月15日; 60(2):242-55及Friedland AE等人, Genome Biol. 2015年11月24日; 16:257，其以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，在SpCas9之情況下，可使用其中第10位之Asp殘基轉化為Ala殘基且第840位之His殘基轉化為Ala殘基的雙重突變體(有時稱作「dSpCas9」) (參見例如前述Nishimasu等人, Cell. 2014，其以全文引用之方式併入本文中)。或者，在SaCas9之情況下，可使用其中第10位Asp殘基轉化為Ala殘基且第580位Asn殘基轉化為Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 139)或其中第10位Asp殘基轉化為Ala殘基且第557位His殘基轉化為Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 140) (在下文中此等雙重突變體中之任一者有時稱作「dSaCas9」) (參見例如前述Friedland AE等人, Genome Biol. 2015，其以全文引用之方式併入本文中)。
另外，在本發明之一個實施例中，亦可使用呈dCas9形式的藉由修飾前述dCas9之一部分胺基酸序列而獲得的變異體，其與gRNA形成複合體且募集至人類DMPK基因之表現調控區。此等變異體之實例包括具有部分缺失之胺基酸序列的截短變異體。在本發明之一個實施例中，以全文引用之方式併入本文中的WO2019/235627及WO2020/085441中所描述之變異體可用作dCas9。特定言之，亦可使用藉由自dSaCas9刪除第721個至第745個胺基酸而獲得之dSaCas9 (其為其中第10位Asp殘基轉化為Ala殘基且第580位Asn殘基轉化為Ala殘基的雙重突變體(SEQ ID NO: 141))，或其中的刪除部分被肽連接子取代的dSaCas9 (例如SEQ ID NO: 143中所列之其中的刪除部分被GGSGGS連接子(SEQ ID NO: 142)取代的dSaCas9) (在下文中，此等雙重突變體中之任一者有時稱作「dSaCas9[-25]」)，或藉由刪除dSaCas9之第482個至第648個胺基酸而獲得的dSaCas9 (其為前述雙重突變體(SEQ ID NO:144 ))，或其中的刪除部分被肽連接子取代的dSaCas9 (SEQ ID NO: 145中所列之其中的刪除部分被GGSGGS連接子取代的dSaCas9)。
上文提及之dCpf1之實例包括(但不限於)源自新澤西弗朗西斯氏菌(Francisella novicida )之Cpf1之核酸酶缺失型變異體(FnCpf1；PAM序列：TTN)、源自胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp. )之Cpf1 (AsCpf1；PAM序列： TTTN)或源自毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium )之Cpf1 (LbCpf1；PAM序列：TTTA、TCTA、TCCA或CCCA)及類似者(參見例如Zetsche B.等人, Cell. 2015年10月22日; 163(3):759-71、Yamano T等人, Cell. 2016年5月5日; 165(4):949-62及Yamano T等人, Mol Cell. 2017年8月17日; 67(4):633-45，其以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，在FnCpf1之情況下，可使用其中第917位Asp殘基轉化為Ala殘基且第1006位Glu殘基轉化為Ala殘基之雙重突變體(參見例如前述Zetsche B等人, Cell. 2015，其以全文引用之方式併入本文中)。在本發明之一個實施例中，亦可使用呈dCpf1形式的藉由修飾前述dCpf1之一部分胺基酸序列而獲得的變異體，其形成與gRNA之複合體且募集至人類DMPK基因之表現調控區。
在本發明之一個實施例中，dCas9用作核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白。在一個實施例中，dCas9為dSaCas9，且在一特定實施例中，dSaCas9為dSaCas9[-25]。
包含編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白之鹼基序列的聚核苷酸可藉由例如合成oligoDNA引子及藉由PCR方法使用由產生蛋白作為模板之細胞製備的總RNA或mRNA部分擴增聚核苷酸來選殖，該oligoDNA引子覆蓋編碼基於其cDNA序列資訊之所需蛋白部分之區域。另外，藉由利用已知定點突變誘發方法將突變引入至編碼經選殖CRISPR效應蛋白之核苷酸序列中以將對於核酸酶活性而言至關重要之位點處的胺基酸殘基(可包括例如在SaCas9之情況下，第10位Asp殘基、第557位His殘基及第580位Asn殘基；在FnCpf1之情況下，第917位Asp殘基及第1006位Glu殘基；及類似者，但不限於此等殘基)轉化成其他胺基酸，可獲得包含編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白之鹼基序列的聚核苷酸。
或者，包含編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白之鹼基序列的聚核苷酸可藉由化學合成或化學合成與PCR方法或吉布森組裝(Gibson Assembly)方法之組合基於其cDNA序列資訊來獲得，且亦可進一步構築為經受密碼子最佳化以得到適合於在人類中表現之密碼子的鹼基序列。
(3)轉錄抑制因子 在本發明中，人類DMPK基因表現係藉由與核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白融合之轉錄抑制因子之作用來抑制。在本說明書中，「轉錄抑制因子」意謂具有抑制人類DMPK基因之基因轉錄的能力或保留其功能的肽片段之蛋白。用於本發明中之轉錄抑制因子不受特定限制，只要其可抑制人類DMPK基因之表現即可。其包括例如Kruppel相關框(Kruppel-associated box，KRAB)、MBD2B、v-ErbA、SID (包括SID之鏈狀態(SID4X))、MBD2、MBD3、DNMT族(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb、MeCP2、ROM2、LSD1、AtHD2A、SET1、HDAC11、SETD8、EZH2、SUV39H1、PHF19、SALI、NUE、SUVR4、KYP、DIM5、HDAC8、SIRT3、SIRT6、MESOLO4、SET8、HST2、COBB、SET-TAF1B、NCOR、SIN3A、HDT1、NIPP1、HP1A、ERF抑制因子域(ERD)及其具有轉錄抑制能力之變異體、其融合體及類似者。在本發明之一個實施例中，KRAB用作轉錄抑制因子。
包含編碼轉錄抑制因子之鹼基序列的聚核苷酸可藉由化學合成或化學合成與PCR方法或吉布森組裝方法之組合來構築。此外，包含編碼轉錄抑制因子之鹼基序列的聚核苷酸亦可構築為經密碼子最佳化之DNA序列以得到適合於在人類中表現之密碼子。
包含編碼轉錄抑制因子及核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白之融合蛋白之鹼基序列的聚核苷酸可藉由將編碼CRISPR效應蛋白之鹼基序列直接接合至編碼轉錄抑制因子之鹼基序列或在添加編碼連接子之鹼基序列、NLS (核定位信號)(例如，SEQ ID NO: 189或SEQ ID NO: 191中所列之鹼基序列)、標籤及/或其他之後進行接合來製備。在本發明中，轉錄抑制因子可與核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白之N端或C端融合。可使用胺基酸數目為約2至50之連接子作為連接子，且其特定實例包括(但不限於)其中甘胺酸(G)及絲胺酸(S)交替連接之G-S-G-S連接子及類似者。在本發明之一個實施例中，可使用SEQ ID NO: 151中所列的編碼呈融合蛋白形式之SV40 NLS、dSaCas9、NLS及KRAB的鹼基序列作為包含編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白之鹼基序列的聚核苷酸。
(4)嚮導RNA 在本發明中，核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白可藉由嚮導RNA募集至人類DMPK基因之表現調控區。如前述「(1)定義」中所描述，嚮導RNA包含crRNA，且crRNA結合於靶向序列之互補序列。crRNA可能不完全與靶向序列之互補序列互補，只要嚮導RNA可將融合蛋白募集至目標區且可包含其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至3個鹼基的序列即可。
當將dCas9用作核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白時，例如，可使用公開的gRNA設計網站(CRISPR Design Tool、CRISPR direct等)來確定靶向序列。特定言之，根據目標基因(亦即，人類DMPK基因)及其相鄰基因之序列，列舉PAM (例如在SaCas9之情況下，NNGRRT)鄰近於其3'側的長度為約20個核苷酸之候選靶向序列，且此等候選靶向序列當中在人類基因組中具有較小數目之偏離目標位點的序列可用作靶向序列。靶向序列之鹼基長度為18至24個核苷酸，較佳地長度為18至23個核苷酸，更佳地長度為18至22個核苷酸。作為用於偏離目標位點數目之預測的初次篩選，許多生物資訊學工具為吾人所知且可公開獲得，且可用以預測具有最低偏離目標作用之靶向序列。其實例包括諸如Benchling (https://benchling.com)及COSMID (具有錯配、插入及刪除之CRISPR偏離目標位點)之生物資訊工具(在網際網路https://crispr.bme.gatech.edu上可獲得)。使用此等工具，可彙總與由gRNA靶向之鹼基序列的相似性。當待使用之gRNA設計軟體不具有搜尋目標基因組之偏離目標位點的功能時，例如可藉由根據候選靶向序列(具有經靶向核苷酸序列之高辨別能力之種子序列)之3'側上的8至12個核苷酸對目標基因組進行Blast搜尋來搜尋偏離目標位點。
在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體19 (Chr19)之GRCh38.p12位中的區域中，DMPK基因之轉錄起始點附近之區域：45,777,342至45,784,715可為人類DMPK基因之表現調控區。如實例中所示，本發明人發現，人類DMPK基因之表現可藉由靶向上文提及之區域中的區域45,778,884至45,783,985 (圖3中之分區2)調控。在本發明之一個實施例中，因此，靶向序列可為長度為連續的18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸之鹼基序列，其在存在於人類染色體19 (Chr19)之GRCh38.p12位中的區域中之以下區域中：45,778,884至45,783,985。
此外，本發明人發現，作為用於設計用於抑制DMPK基因之表現的靶向序列的區域，存在於上文提及之區域45,778,884至45,783,985中之SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之區域較佳。在本發明之一個實施例中，因此，靶向序列可為此等區域中長度為連續18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸的鹼基序列。人類DMPK基因之表現調控區中的各序列之位置如表1及圖1中所描述。
在本發明之一個實施例中，靶向序列可為存在於上文提及之區域45,778,884至45,783,985中的SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之區域中長度為連續18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸之鹼基序列，認為該區域顯示人類DMPK基因表現之不低於50%之降低。人類DMPK基因之表現調控區中的各序列之位置如表1及圖1中所描述。
在本發明之另一實施例中，靶向序列可為存在於上文提及之區域45,778,884至45,783,985中的SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之區域中長度為連續18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸的鹼基序列，認為該區域顯示人類DMPK基因表現之不低於75%之降低。人類DMPK基因之表現調控區中的各序列之位置如表1及圖1中所描述。
在本發明之再一實施例中，靶向序列可為以下中所列之鹼基序列：SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。SEQ ID NO: 43及44中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 127中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 62及63中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 128中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 66至68中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 129中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 70至73中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 130中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 80至83中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 131中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 85及86中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 132中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 95至100中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 133中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 103、105及106中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 134中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 105及106中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 135中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 70及71中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 136中所列之區域中的靶向序列。SEQ ID NO: 103至112中所列之鹼基序列為包含於SEQ ID NO: 137中所列之區域中的靶向序列。人類DMPK基因之表現調控區中的各序列之位置如表1及圖1中所描述。
在本發明之一個實施例中，編碼crRNA之鹼基序列可為與靶向序列相同的鹼基序列。舉例而言，當SEQ ID NO: 5中所列之靶向序列(CCCAGTCGAGGCCAAAGAAGA)作為編碼crRNA之鹼基序列經引入至細胞中時，自該序列轉錄之crRNA為CCCAGUCGAGGCCAAAGAAGA (SEQ ID NO: 146)且結合至為與SEQ ID NO: 5中所列之鹼基序列互補之序列且存在於人類DMPK基因之表現調控區中的TCTTCTTTGGCCTCGACTGGG (SEQ ID NO: 147)。在另一實施例中，鹼基序列為其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至3個鹼基)之靶向序列，其可用作編碼crRNA之鹼基序列，只要嚮導RNA可將融合蛋白募集至目標區即可。因此，在本發明之一個實施例中，可使用SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列作為編碼crRNA之鹼基序列。在本發明之另一實施例中，可使用SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之鹼基序列作為編碼crRNA之鹼基序列。在本發明之再一實施例中，可使用SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之鹼基序列作為編碼crRNA之鹼基序列。在本發明之一個實施例中，可使用SEQ ID NO: 83中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 83中所列之鹼基序列作為編碼crRNA之鹼基序列。
在本發明之一個實施例中，SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列可用作編碼crRNA之鹼基序列，以分別產生包含SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之crRNA或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之crRNA的gRNA。在本發明之另一實施例中，gRNA可包含SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列。在本發明之一個實施例中，gRNA可包含SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 184中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 184中所列之鹼基序列。在本發明之另一實施例中，gRNA可包含SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之鹼基序列。在本發明之再一實施例中，gRNA可包含SEQ ID NO: 171中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 171中所列之鹼基序列。
當將dCpf1用作核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白時，編碼gRNA之鹼基序列可經設計為編碼crRNA之DNA序列，其中特定RNA連接至crRNA之5'端。連接至crRNA之5'端的此等RNA及編碼該RNA之DNA序列可藉由一般熟習此項技術者根據待使用之dCpf1來適當選擇。舉例而言，當使用dFnCpf1時，其中SEQ ID NO: 148；AATTTCTAC TGTTGTAGA T連接至靶向序列之5'側的鹼基序列可用作編碼gRNA之鹼基序列(當轉錄成RNA時，加底線部分之序列形成鹼基對以形成莖環結構)。待添加至5'端之序列可為其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至6個鹼基的一般用於各種Cpf1蛋白之序列，只要在轉錄之後gRNA可將融合蛋白募集至表現調控區即可。
當將dCas9用作核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白時，編碼gRNA之鹼基序列可經設計為DNA序列，其中編碼已知tracrRNA之DNA序列連接至編碼crRNA之DNA序列的3'端。此tracrRNA及編碼tracrRNA之DNA序列可藉由一般熟習此項技術者根據待使用之dCas9適當選擇。舉例而言，當使用dSaCas9時，將SEQ ID NO: 149中所列之鹼基序列用作編碼tracrRNA之DNA序列。編碼tracrRNA之DNA序列可為其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至6個鹼基的一般用於各種Cas9蛋白的編碼tracrRNA之鹼基序列，只要在轉錄之後gRNA可將融合蛋白募集至表現調控區即可。
以此方式設計的包含編碼gRNA之鹼基序列的聚核苷酸可使用已知DNA合成方法來化學合成。
在本發明之另一實施例中，本發明之聚核苷酸可包含至少兩個不同鹼基序列，其分別編碼靶向人類DMPK基因之表現調控區中的SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區域的gRNA。舉例而言，聚核苷酸可包含至少兩個分別編碼嚮導RNA之不同鹼基序列，其中該至少兩個不同鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之序列的鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列。在本發明之一個實施例中，聚核苷酸可包含至少兩個分別編碼嚮導RNA之不同鹼基序列，其中該至少兩個不同鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之序列的鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之鹼基序列。在本發明之一個實施例中，聚核苷酸可包含至少兩個分別編碼嚮導RNA之不同鹼基序列，其中該至少兩個不同鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之序列的鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之鹼基序列。
(5)啟動子序列 在本發明之一個實施例中，啟動子序列可以可操作地連接於編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列及/或編碼gRNA的鹼基序列中之各者上游。可能連接之啟動子不受特定限制，只要其在目標細胞中顯示啟動子活性即可。可能連接至編碼gRNA之鹼基序列的上游之啟動子序列之實例包括(但不限於) U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子、H1啟動子及為pol III啟動子的tRNA啟動子以及類似者。在本發明之一個實施例中，U6啟動子可用作編碼嚮導RNA之鹼基序列的啟動子序列。在本發明之一個實施例中，當聚核苷酸包含兩個或更多個分別編碼嚮導RNA之鹼基序列時，單個啟動子序列可以可操作地連接於該等兩個或更多個鹼基序列上游。在另一實施例中，當聚核苷酸包含兩個或更多個分別編碼嚮導RNA之鹼基序列時，啟動子序列可以可操作地連接於兩個或更多個鹼基序列中之各者上游，其中該啟動子序列可操作地連接於可能相同或不同之各鹼基序列。
可使用廣泛啟動子或肌肉特異性啟動子作為可能連接於編碼融合蛋白之鹼基序列上游的前述啟動子序列。廣泛啟動子之實例包括(但不限於) EF-1α啟動子、EFS啟動子、CMV (巨細胞病毒)啟動子、hTERT啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CAG啟動子、RSV (勞氏肉瘤病毒)啟動子及類似者。在本發明之一個實施例中，EFS啟動子、CMV啟動子或CAG啟動子可用作廣泛啟動子。肌肉特異性啟動子之實例包括(但不限於) CK8啟動子、CK6啟動子、CK1啟動子、CK7啟動子、CK9啟動子、心肌肌鈣蛋白C啟動子、α肌蛋白啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子(例如MHCK7啟動子等)、MHC啟動子、肌凝蛋白輕鏈2A啟動子、肌縮蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、dMCK啟動子、tMCK啟動子、enh348 MCK啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子、Myf5啟動子、MLC1/3f啟動子、MLC-2啟動子、MYOD啟動子、Myog啟動子、Pax7啟動子、Des啟動子、cTnC啟動子及類似者(對於肌肉特異性啟動子之詳情，參見以全文引用之方式併入本文中之US2011/0212529A、McCarthy JJ等人, Skeletal Muscle. 2012年5月; 2(1):8、Wang B.等人, Gene Ther. 2008年11月; 15(22):1489-99及類似者)。在本發明之一個實施例中，CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子或Des啟動子可用作肌肉特異性啟動子。在本發明之一個實施例中，CK8啟動子可用作肌肉特異性啟動子。前述啟動子可具有任何修飾及/或改變，只要其在目標細胞中具有啟動子活性即可。
在本發明之一個實施例中，U6用作編碼嚮導RNA之鹼基序列的啟動子，且CK8啟動子可用作編碼融合蛋白之鹼基序列的啟動子序列。特定言之，對於U6啟動子，可使用以下鹼基序列：(i) SEQ ID NO: 155中所列之鹼基序列；(ii)在目標細胞中具有啟動子活性的其中刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)鹼基的SEQ ID NO: 155中所列之鹼基序列；或(iii)與在目標細胞中顯示啟動子活性的SEQ ID NO: 155中所列之鹼基序列一致性不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)之鹼基序列。對於CK8啟動子，可使用以下鹼基序列；(i) SEQ ID NO: 187中所列之鹼基序列；(ii)在目標細胞中具有啟動子活性的其中刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)鹼基的SEQ ID NO: 187中所列之鹼基序列；或(iii)與在目標細胞中顯示啟動子活性的SEQ ID NO: 187中所列之鹼基序列一致性不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)之鹼基序列。
(6)其他鹼基序列 此外，出於改善藉由編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列之轉錄而產生之mRNA之轉譯效率的目的，本發明之聚核苷酸可進一步包含除上文所提及之彼等以外的諸如聚腺苷酸化(polyA)信號、Kozak共同序列及類似者之已知序列。另外，本發明之聚核苷酸可包含編碼連接子序列之鹼基序列、編碼NLS之鹼基序列及/或編碼標籤之鹼基序列。
(7)本發明之例示性實施例 在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列， 編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列， 一或兩個分別編碼嚮導RNA之鹼基序列，其中該一或兩個鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之序列的鹼基序列或包含其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111中所列之序列的鹼基序列，及 編碼gRNA的鹼基序列之啟動子序列， 其中核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dSaCas9或dSaCas9[-25]， 其中轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A， 其中編碼融合蛋白之鹼基序列的啟動子序列係選自以下之群：EFS啟動子、CMV啟動子、CAG啟動子、CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12(Syn)啟動子及Des啟動子，及 其中編碼gRNA之鹼基序列的啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列， 編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 一或兩個分別編碼嚮導RNA之鹼基序列，其中該一或兩個鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之序列的鹼基序列或包含其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之序列的鹼基序列，及 編碼嚮導RNA的鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dSaCas9，且 其中轉錄抑制因子為KRAB。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列， 編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA包含SEQ ID NO: 83中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 83中所列之鹼基序列，及 編碼嚮導RNA的鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dSaCas9，且 其中轉錄抑制因子為KRAB。
在本發明之聚核苷酸之一實施例中，聚核苷酸自5'端依序包含(i)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列及(ii)編碼gRNA的鹼基序列。在另一實施例中，聚核苷酸自5'端依序包含(ii)編碼gRNA的鹼基序列及(i)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列。
2. 載體 本發明提供一種包含本發明之聚核苷酸的載體(在下文中有時稱作「本發明之載體」)。本發明之載體可為質體載體或病毒載體。
當本發明之載體為質體載體時，待使用之質體載體不受特定限制且可為任何質體載體，諸如選殖質體載體及表現質體載體。質體載體係藉由已知方法將本發明之聚核苷酸插入質體載體中來製備。
當本發明之載體為病毒載體時，待使用之病毒載體之實例包括(但不限於)腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、仙台病毒(Sendaivirus)載體及類似者。在本說明書中，「病毒載體(virus vector或viral vector)」亦包括其衍生物。考慮在基因療法中之使用，AAV載體較佳地係出於使得其可長期表現轉殖基因且其來源於非病原性病毒並具有高安全性之原因而使用。
包含本發明之聚核苷酸的病毒載體可藉由已知方法來製備。簡言之，製備用於病毒表現之已插入本發明之聚核苷酸的質體載體，將載體轉染至適當之宿主細胞中以使得瞬時產生包含本發明之聚核苷酸的病毒載體，且收集病毒載體。
在本發明之一個實施例中，當使用AAV載體時，AAV載體之血清型不受特定限制，只要可抑制人類DMPK基因在個體中之表現即可，且可使用AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10及類似者中之任一者(對於AAV之各種血清型，參見例如WO 2005/033321及EP2341068 (A1)，其以全文引用之方式併入本文中)。在本發明之另一實施例中，亦可使用自猴分離之AAV(例如AAVrh74 (參見Mol Ther. 2017年4月5月; 25(4): 855-869等，其以全文引用之方式併入本文中))、自豬分離之AAV(例如AAVpo1 (例如參見Gene Ther. 2009年11月; 16(11): 1320-8，其以全文引用之方式併入本文中))、預測為AAV1、AAV2、AAV8及AAV9之祖先的Anc 80 (參見Cell Rep. 2015年8月11日; 12(6):1056-68，其以全文引用之方式併入本文中)及類似者，只要可抑制個體中人類DMPK基因之表現。AAV之變異體之實例包括(但不限於)具有經修飾衣殼的新穎血清型(例如WO 2012/057363，其以全文引用之方式併入本文中)及類似者。舉例而言，在本發明之一個實施例中，可使用改善肌肉細胞之感染性的具有經修飾衣殼之新穎血清型，諸如AAV587 MTP、AAV588 MTP、AAV-B1、AAVM41及類似者(參見Yu等人, Gene Ther. 2009年8月;16(8):953-62、Choudhury等人, Mol Ther. 2016年8月;24(7):1247-57及Yang等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009年3月10日;106(10):3946-51，其以全文引用之方式併入本文中)。
當製備AAV載體時，可使用已知方法，諸如(1)使用質體之方法；(2)使用桿狀病毒(baculovirus)之方法；(3)使用單純疱疹病毒(herpes simplex virus)之方法；(4)使用腺病毒之方法；或(5)使用酵母之方法(例如Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054等，其以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，當藉由使用質體之方法製備AAV載體時，首先，製備載體質體，其包含在野生型AAV基因組序列之兩端的反向末端重複序列(ITR)及插入編碼Rep蛋白及衣殼蛋白之DNA的位置中之本發明之聚核苷酸。另一方面，編碼Rep蛋白及衣殼蛋白之DNA為形成病毒粒子所必需，將其插入至其他質體中。此外，將AAV之增殖所需的負責腺病毒之輔助作用對包含基因(E1A、E1B、E2A、VA及E4orf6)的質體製備為腺病毒輔助質體。將此等三個種類之質體共轉染至宿主細胞中引起在細胞中產生重組AAV (亦即AAV載體)。較佳地使用能夠供應負責前述輔助作用之基因的基因產物(蛋白質)之一部分的細胞(例如293細胞等)作為宿主細胞。當使用此等細胞時，其不必攜帶編碼可由前述腺病毒輔助質體中之宿主細胞供應之蛋白的基因。產生之AAV載體存在於培養基及/或細胞中。因此，藉由在利用冷凍-解凍或類似者破壞宿主細胞之後自培養基收集病毒，隨後藉由使用氯化銫之密度梯度超速離心方法、管柱方法或類似者對病毒部分進行分離及純化來製備所需AAV載體。
就安全性、基因轉導效率及類似者而言，AAV載體具有極大優勢，且將其用於基因療法。然而，眾所周知可封裝之聚核苷酸之大小受限。舉例而言，在本發明之一個實施例中，包括聚核苷酸之鹼基長度之全長為約4.9kb，該鹼基長度包含編碼dSaCas9及KRAB之融合蛋白的鹼基序列、編碼靶向人類DMPK基因之表現調控區之gRNA的鹼基序列以及作為啟動子序列之CK8啟動子序列及U6啟動子序列、以及ITR區，且聚核苷酸可攜帶於單個AAV載體中。
3. 用於治療或預防DM1之醫藥組合物 本發明亦提供一種包含本發明之聚核苷酸或本發明之載體的醫藥組合物(在下文中有時稱作「本發明之醫藥組合物」)。本發明之醫藥組合物可用於治療或預防DM1。
本發明之醫藥組合物包含本發明之聚核苷酸或本發明之載體作為活性成分，且可製備為包含此等活性成分(亦即本發明之聚核苷酸或本發明之載體)及(一般而言)醫藥學上可接受之載劑的調配物。
在一實施例中，本發明之醫藥組合物係非經腸投與的，且可局部或全身性投與。本發明之醫藥組合物可藉由(但不限於)例如靜脈內投與、動脈內投與、皮下投與、腹膜內投與或肌肉內投與來投與。
給個體之本發明之醫藥組合物之劑量不受特定限制，只要其為用於治療及/或預防之有效量即可。其可根據活性成分、劑型、個體之年齡及體重、投與時程、投與方法及類似者來適當最佳化。
在本發明之一個實施例中，可不僅向受DM1影響之個體投與且亦向基於基因背景分析及類似者在未來可能罹患DM1之個體預防性地投與本發明之醫藥組合物。在本說明書中，除治癒疾病以外，術語「治療」亦包括緩解疾病。此外，除預防疾病之發作以外，術語「預防」亦可包括延遲疾病之發作。本發明之醫藥組合物亦可稱作「本發明之藥劑」或類似者。
4. 用於治療或預防DM1之方法 本發明亦提供一種用於治療或預防DM1之方法(在下文中有時稱作「本發明之方法」)，其包含向有需要之個體投與本發明之聚核苷酸或本發明之載體。另外，本發明包括將本發明之聚核苷酸或本發明之載體用於治療或預防DM1。此外，本發明包括本發明之聚核苷酸或本發明之載體的用途，其用於製造用於治療或預防DM1之醫藥組合物。
本發明之方法可藉由向受DM1影響之個體投與本發明之前述醫藥組合物來實踐，且劑量、投與途徑、個體及類似者與上文所提及之彼等相同。
可在開始使用本發明之方法治療之前及治療之後的任何時候進行症狀之量測以確定個體對治療之反應。
本發明方法可改善(但不限於) DM1之任何症狀，諸如骨骼肌及/或心肌之功能。待改善其功能之肌肉或組織不受特定限制，且可提及任何肌肉及組織以及肌肉群。
5. 核糖核蛋白 本發明提供一種包含以下之核糖核蛋白(在下文中有時稱作「本發明之RNP」)： (c)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。
可使用上文提及之章節「1.聚核苷酸」中詳細解釋之核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白、轉錄抑制因子及嚮導RNA作為本發明之RNP中所包含的核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白、轉錄抑制因子及嚮導RNA。待包含於本發明之RNP中的核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白可藉由例如將編碼融合蛋白之聚核苷酸引入至細胞、細菌或其他生物體中以允許表現而產生或藉由使用聚核苷酸利用活體外轉譯系統而產生。另外，本發明之RNP中所包含之嚮導RNA可藉由例如化學合成或藉由使用編碼嚮導RNA的聚核苷酸之活體外轉錄系統來產生。將由此製備之融合蛋白與嚮導RNA混合以製備本發明之RNP。必要時，可混合其他物質，諸如金粒子。為將本發明之RNP直接遞送至目標細胞、組織及類似者，可藉由已知方法將RNP囊封於脂質奈米粒子(LNP)中或裝載於細胞外囊泡中。可藉由已知方法將本發明之RNP引入目標細胞、組織及類似者中。舉例而言，對於囊封於LNP中及引入方法，可參考以全文引用之方式併入本文中的Lee K.等人, Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901、WO 2016/153012及類似者。
在本發明之一個實施例中，本發明之RNP中所包含之嚮導RNA靶向存在於人類染色體19 (Chr 19)之GRCh38.p12位中的以下區域中連續18至24個核苷酸長度，較佳地18至23個核苷酸長度，更佳地18至22個核苷酸長度：45,778,884至45,783,985。
在一個實施例中，嚮導RNA靶向以下中所列之區域中長度為連續18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸的鹼基序列：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。在另一實施例中，嚮導RNA靶向以下中所列之區域中長度為連續18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸的鹼基序列：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。在再一實施例中，嚮導RNA靶向以下中所列之區域中長度為連續18至24個核苷酸、較佳地長度為18至23個核苷酸、更佳地長度為18至22個核苷酸的鹼基序列：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111。在又一實施例中，嚮導RNA靶向包含以下中所列之完整或一部分序列的區域：SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。在本發明之另一實施例中，嚮導RNA靶向包含以下中所列之完整或一部分序列的區域：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111。在本發明之再一實施例中，嚮導RNA靶向包含以下中所列之完整或一部分序列的區域：SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99。在本發明之一個實施例中，嚮導RNA靶向包含SEQ ID NO: 83中所列之完整或一部分序列的區域。
在本發明之一個實施例中，可使用包含以下之嚮導RNA：SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列或其中分別刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185或SEQ ID NO: 186中所列之鹼基序列。在本發明之一個實施例中，可使用包含以下之嚮導RNA：SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 184中所列之鹼基序列或其中分別刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 184中所列之鹼基序列。在本發明之另一實施例中，可使用包含以下之嚮導RNA：SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之鹼基序列或其中分別刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 177中所列之鹼基序列。在本發明之再一實施例中，可使用包含以下之嚮導RNA：SEQ ID NO: 171中所列之鹼基序列或其中分別刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 171中所列之鹼基序列。
6. 其他 本發明亦提供一種用於抑制人類DMPK基因之表現的組合物或套組，其包含以下： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之表現調控區中以下所列區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。
本發明亦提供一種用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之方法，其包含投與以下(e)及(f)之步驟： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸。
本發明亦提供以下(e)及(f)之用途： (e)核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類DMPK基因之表現調控區中的以下中所列之區域中長度為18至24個核苷酸之連續區的嚮導RNA：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119；或編碼該嚮導RNA之聚核苷酸， 其用於製造用於治療或預防DM1之醫藥組合物。
可使用上文提及之章節「1.聚核苷酸」、「2.載體」及「5.核糖核蛋白」中詳細解釋之彼等作為此等發明中的核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白、轉錄抑制因子、嚮導RNA以及編碼其之聚核苷酸及攜帶其之載體。上文所提及之(e)及(f)之劑量、投與途徑、個體、調配物及類似者與章節「3.用於治療或預防DM1之醫藥組合物」中解釋之彼等相同。
本發明之其他特徵在例示性實施例的以下描述過程中將變得顯而易見，該等例示性實施例為了說明本發明而給出且不欲對其進行限制。
實例 實例1.使用iCM及iDM細胞篩選人類DMPK基因之gRNA (1)實驗方法 DMPK靶向序列之選擇 針對可由與本文中定義為靶向序列之gRNA複合的核酸酶缺失型SaCas9 (D10A及N580A突變體；dSaCas9 (SEQ ID NO: 139))靶向之序列掃描人類DMPK基因(Chr19: GRCh38.p12；45,777,342至45,784,715)之啟動子區周圍的大約7.4 kb之序列。靶向序列係藉由鄰近於具有序列NNGRRT (5'-19-21nt靶向序列-NNGRRT-3')之前間隔序列鄰近基序(PAM)的19-21-核苷酸片段指定，且經過濾以僅包括具有食蟹獼猴(長尾獼猴)基因組之對應區的完美匹配之彼等序列(靶向序列及PAM序列) (在表1中列為「真」)。亦選擇額外21-核苷酸靶向序列，其將RNP導引至在藉由ENCODE項目(The ENCODE Project Consortium, Nature. 2012年9月6日; 489(7414): 57-74; https://www.encodeproject.org)策展之DNase-Seq實驗中展現高DNA酶敏感度的區域。
慢病毒轉移質體(pED162)之構築 pLentiCRISPR v2係購自Genscript (https://www.genscript.com)，且進行以下修飾：SpCas9 gRNA骨架序列經SaCas9 gRNA骨架序列(SEQ ID NO: 150)置換；SpCas9經與具有兩個包夾dSaCas9之NLS的Krüppel相關框轉錄抑制域(KRAB)融合之dSaCas9 (SV40 NLS-dSaCas9-NLS-KRAB [SEQ ID NO: 151 (DNA)及152 (蛋白質)])置換；且puroR卡匣經blastR卡匣[SEQ ID NO: 153 (DNA)及SEQ ID NO: 154 (蛋白質)]置換。使dSaCas9在其N端(胺基酸序列由SEQ ID NO: 188展示，DNA序列由SEQ ID NO: 189展示)及C端(胺基酸序列由SEQ ID NO: 190展示，DNA序列藉由SEQ ID NO: 191展示)中與兩個核定位信號(NLS)連接以能夠將效應分子有效定位至細胞核。當藉由抑制轉錄定位至啟動子時，KRAB可抑制基因表現(Gilbert LA等人, Cell, 2013年7月18日; 154(2):442-51)。KRAB繫栓至dSaCas9 (D10A及N580A突變體)之C端，其在下文中稱作dSaCas9-KRAB，且如由靶向序列所導引靶向至人類DMPK啟動子區(圖1)。產生之質體命名為pED162。
gRNA選殖 將三個對照非靶向靶向序列(表1，SEQ ID NO: 1至3)及123個靶向序列(表1，SEQ ID NO: 4至126)選殖至pED162中。藉由整合式DNA技術按以下型式合成正向及反向寡核苷酸：正向：5' CACC(G)-19-21鹼基對靶向序列-3'，及反向：5' AAAC-19-21鹼基對反向互補靶向序列-(C)- 3'，其中若目標不以G開始，則添加括號中之鹼基。使寡核苷酸再懸浮於100 µM之Tris-EDTA緩衝液(pH 8.0)中。將1.5 µl之各互補寡核苷酸合併於含50 µl反應物之NE緩衝液3.1 (新英格蘭生物實驗室(NEB)#B7203S)中。於1 L H2 O中將反應物加熱至95℃且使其冷卻至25℃，因此使寡核苷酸黏接至與選殖至pED162相容之黏性末端突出端。將黏接之寡核苷酸與已用BsmBI消化且凝膠純化之慢病毒轉移質體pED162組合，且根據製造商的方案與T4 DNA接合酶(NEB #M0202S)接合。根據製造商之方案將2 µl之接合反應物轉化成NEB® 穩定勝任細胞(NEB # C3040I)。所得構築體驅動sgRNA之表現，該sgRNA包含其3'端與tracrRNA (GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCACGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU) (SEQ ID NO: 156)融合的由個別靶向序列編碼之crRNA，該tracrRNA藉由U6啟動子(SEQ ID NO: 155)自添加有U6聚合酶TTTTTT之終止信號的SaCas9 gRNA骨架序列編碼。
慢病毒產生 將Lenti-Pac 293Ta細胞株(Genecopoeia # LT008)以0.8至1.0×106 個細胞/孔接種在6孔細胞培養皿(VWR # 10062-892)中之2 ml生長培養基(補充有10% FBS及2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及MEM非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher # 11140050))中且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，根據製造商之方案用1.5 µg封裝質體混合物[1 µg封裝質體(pCMV δ R8.2；addgene Plasmid #12263)及0.5 µg包膜表現質體(pCMV-VSV-G；addgene Plasmid #8454)]及1 µg之含有編碼dSaCas9-KRAB之序列及所指示sgRNA的轉移質體pED162建立TransIT-VirusGEN® 轉染反應(Mirus Bio # MIR6700)。在轉染後48小時藉由使培養基上清液穿過0.45 µm PES過濾器(VWR # 10218-488)來採集慢病毒。
iCM及iDM細胞之轉導 永生化非DM對照(Ctrl)肌母細胞(稱為iCM)及永生化DM1肌母細胞(稱為iDM)係自藉由以全文引用之方式併入本文中之Dis Model Mech. 2017年4月1日; 10(4):487-497中所描述之方法形成此等細胞株的Institut de Myologie獲得。為了轉導，將細胞以0.05×106 個細胞/孔接種於12孔細胞培養皿(VWR # 10062-894)中之1 ml含有生長培養基之培養基[PromoCell骨骼肌細胞生長培養基套組；部件編號：C-23160 (注意：培養基補充有20%而非由套組指導之5% FBS以及30 µg /ml慶大黴素S)]中，且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，將培養基替換為補充有10 µg/ml凝聚胺(Sigma # TR-1003-G)及0.3 ml對應於包含與tracrRNA融合的由個別靶向序列(表1)編碼之crRNA的各sgRNA之慢病毒上清液(參見上文)的1 ml生長培養基，將其添加至各孔。將細胞與慢病毒一起培育48小時，之後移除病毒培養基且替換為選擇培養基[補充有10 µg /ml殺稻瘟菌素(Thermo Fisher # A1113903)之生長培養基]。在於選擇培養基中培育48小時之後，將三分之一細胞傳遞至新孔(來自12孔培養盤)中之生長培養基中。在允許細胞接種24小時之後，將生長培養基替換為選擇培養基。在選擇培養基中培養48小時之後，採集細胞且如製造商所指導用RNeasy® 96套組(Qiagen # 74182)提取RNA。
基因表現分析 為了基因表現分析，根據高容量cDNA反轉錄套組(Thermo Fisher # 4368813)方案以20 µl體積自0.2 µg之總RNA產生cDNA。將cDNA稀釋10倍且根據製造商之方案使用TaqmanTM 快速進階主混合物(Fast Advanced Master Mix)(Thermo Fisher # 4444557)來分析。Taqman探針(DMPK：分析Id Hs01094336_m1 FAM；HPRT：分析Id Hs99999909_m1 VIC_PL)係自Thermo Fisher獲得。進行基於Taqman探針之即時PCR反應且如由Taqman快速進階主混合物方案所指導藉由QuantStudio 5即時PCR系統分析。
資料分析 對於各樣本及三個對照組，藉由自DMPK探針減去來自HPRT探針之3個技術複製物之平均Ct值(平均Ct DMPK-平均Ct HPRT)來計算deltaCt值。使用公式2-(deltaCt) 來確定各樣本之表現值。隨後針對各實驗以3個對照表現值(表1；SEQ ID NO: 1至3)之平均值標準化樣本表現值(表1；SEQ ID NO: 4至126)以確定各樣本之相關DMPK表現。分析各細胞株之兩個生物複製物，且計算所有實驗之平均值(表1)。
(2)結果 RNP對DMPK基因表現之抑制 產生慢病毒，其將用於dSaCas9-KRAB之表現卡匣及用於各靶向序列之sgRNA遞送至iCM及iDM細胞。針對對殺稻瘟菌素之抗性選擇經轉導細胞，且使用Taqman分析定量DMPK表現(表1)。以用對照sgRNA(表1；SEQ ID NO: 1、2及3)轉導之細胞中的DMPK表現之平均值標準化各樣本之表現值。在iCM及iDM細胞株之複製物中量測平均表現量(表1；平均DMPK ALL及圖2)。 表1.用於篩選DMPK基因之表現調控區的靶向序列 表1-1
Figure 02_image001
表1-2
Figure 02_image003
表1-3
Figure 02_image005
表1-4
Figure 02_image007
表1-5
Figure 02_image009
在表1中，「座標」指示SEQ ID NO: 4至126中所列之各序列之5'端之座標。
30個靶向序列顯示不低於50%之DMPK表現降低(SEQ ID NO: 43、44、46、62、63、66、68、70、71、72、73、80、81、82、83、85、86、88、91、96、99、100、103、105、106、108、109、111、117及119)，九個靶向序列顯示不低於75%之DMPK表現降低(SEQ ID NO: 63、70、71、83、99、105、106、109及111)，且一個靶向序列顯示不低於80%之DMPK表現之降低(SEQ ID NO: 109)。
基於上文所描述之抑制DMPK表現之系統的似然度來鑑別及表徵各分區。在分區1 (圖3：Chr19: GRCh38.p12；45,777,342至45,778,884)中，吾人發現靶向序列在調節DMPK之表現方面無效。然而，在分區2 (圖3：GRCh38.p12；45,778,884至45,783,985)中，靶向dSaCas9-KRAB能夠抑制DMPK表現。如所預期，此區域涵蓋DMPK啟動子及轉錄起始位點，表明靶向此區域對DMPK表現具有最大影響。最後，分區3 (圖3；Chr19: GRCh38.p12；45,783,985至45,784,715)對DMPK表現具有最小影響且更遠離DMPK啟動子區。
實例2 腺相關病毒(AAV)產生 (1)實驗方法 用於遞送及表現dSaCas9-KRAB:gRNA以及產生AAV之質體的構築 pAAV-CMV係購自Takara (# 6230)，且自pED162次選殖具有額外末端終止密碼子的EFS啟動子序列(SEQ ID NO: 204)及SV40 NLS-dSaCas9-NLS-KRAB (SEQ ID NO: 151) [SEQ ID NO: 200 (DNA)及SEQ ID NO: 152 (蛋白質)](參見實例1)。自pED0001 (SEQ ID NO: 203)次選殖bGlobin polyA序列(SEQ ID NO: 201)、U6啟動子序列(SEQ ID NO: 202)及SaCas9 gRNA骨架序列(SEQ ID NO: 150)，因此置換ITR之間的編碼pAAV-CMV之所有功能組分(亦即，CMV啟動子、β-血球蛋白內含子、MCS及hGH polyA)的序列。最後，藉由限制酶選殖(XhoI及AgeI)用CK8啟動子(SEQ ID NO: 187)置換EFS啟動子，產生質體pED148。藉由用BsaI消化pED148來選殖SEQ ID NO: 83、70、81或99中所列之靶向序列，因此產生與黏接之合成寡核苷酸相容之突出端。設計合成寡核苷酸，以使得正向引子在5'端具有CACC(G)序列[5'CACC-(G)-靶向序列-3']，且反向引子在5'端含有額外AAAC序列[5'AAAC -反向互補靶向序列-(C)-3']。將額外G添加至靶向序列之起點以增強自U6啟動子之表現。產生之質體分別命名為pED148-h695 (包含SEQ ID NO: 83中所列之靶向序列)、pED148-h245 (包含SEQ ID NO: 70中所列之靶向序列)、pED148-h257 (包含SEQ ID NO: 81中所列之靶向序列)及pED148-h269 (包含SEQ ID NO: 99中所列之靶向序列)。
腺相關病毒(AAV)產生 使用以0.86×107 個細胞/Hyperflask (Corning # 10030)之密度接種且在補充有10% FBS之DMEM培養基(Sigma # D5796)中培養的293T細胞(ATCC # CRL-3216)產生腺相關病毒血清型9 (AAV9)粒子。接種後四天，將培養基變成補充有2% FBS及63 mM HEPES (Gibco # 15630-080)之DMEM培養基。如下構築pRC9質體：將AAV9衣殼序列(參見JP5054975B)次選殖至替換為AAV2衣殼序列之載體的pRC2-mi342載體(Takara # 6230)中。使用每Hyperflask 135 μg pRC9質體、包括於AAVpro® Helper Free系統(Takara # 6230)中之121 μg pHelper載體及133 μg pED148-h695中之一者以及388 μl PEIpro® 活體外DNA轉染試劑(Polyplus # 115-010)來轉染細胞。3天後，將0.2% TritonX-100添加至Hyperflask中，且採集細胞。
採集後，用濾筒(GE Healthcare # KGF-A-0506GG、KMP-HC9206GG)使其上清液及細胞溶解物澄清。澄清之後，使用中空纖維、使用XamplerTM 超濾濾筒750 kD (GE Healthcare # UFP-750-C-6MA)藉由切向流過濾來進行超濾。減小體積之後，對樣本進行親和層析(POROSTM CaptureSelectTM AAVX親和樹脂(ThermoFisher Scientific # A36739))以純化AAV。在親和層析步驟之後，對經溶離樣本進行密度梯度離心以自中間AAV粒子分離AAV。利用磷酸鹽緩衝生理鹽水之透析來對藉由CsCl密度梯度離心分離之AAV粒子進行緩衝液更換。緩衝液更換之後，使用Amicon® Ultra-4離心過濾器單元(Merck millipore # UFC801024)濃縮AAV樣本且使用Millex-GV針筒過濾器單元0.22 µm (Merck millipore # SLGV033RS)滅菌。使用DNeasy血液及組織套組(DNeasy Blood and Tissue Kit)(QIAGEN # 69506)純化AAV基因組。使用AAVpro® 滴定套組(用於即時PCR) (Takara # 6233)來量測經純化AAV基因組之滴度。所得AAV標示為AAV9-695。
如上文所描述製造使用pED148-h245、pED148-h257或pED148-h269之AAV，且分別命名為AAV9-245、AAV9-257及AAV9-269。兩次製造AAV9-695、AAV9-245及AAV9-257中之各者且將其用於活體外及活體內實驗。
(2)結果 AAV之基因組滴度展示於表2中。 表2
AAV名稱 濃度(vg/mL) 批號
AAV9-695 2.8 x 1012 第1批
AAV9-245 3.6 x 1012 第1批
AAV9-257 4.5 x 1012 第1批
AAV9-269 5.5 x 1012 第1批
AAV9-695 3.6 x 1013 第2批
AAV9-245 3.7 x 1013 第2批
AAV9-257 4.6 x 1013 第2批
實例3.攜帶編碼dSaCas9、轉錄抑制因子及sgRNA之鹼基序列之重組AAV9對於DMPK基因抑制之活體外藥理學評估 (1)實驗方法 細胞培養及AAV感染 使iCM細胞懸浮於骨骼肌細胞生長培養基套組(Promocell # C23060)(注意：培養基補充有20%而非如套組所指導之5% FBS及50 µg /ml慶大黴素S)中且以20,000個細胞於900 μl培養基/孔中之密度接種至經I型膠原蛋白塗佈之24孔盤(IWAKI #4820-010)中。對於AAV感染，將含有2.8、3.6、4.5或5.5×1012 vg /ml之AAV9-695、AAV9-245、AAV9-257或AAV9-269的具有0.001% PluronicTM F-68 (GE healthcare # SH30594.01)之100 μl PBS添加至培養基，且在37℃/5% CO2 下培養及培育2天。對於對照孔，將具有0.001% Pluronic F-68之100 μl PBS添加至培養基中。重複進行三次實驗。將該培養基替換為分化培養基(補充有10 µg /ml胰島素(Sigma # I9278)之DMEM培養基(Thermo Fisher # 61965-026))，且在37℃及5% CO2 下培養細胞4天。用500 μl PBS洗滌後，使用RNeasy Plus Mini套組(Qiagen # 74134)根據製造商之說明書提取總RNA。將來自無AAV感染之細胞的RNA設定為對照組且在圖4中展示為Ctrl。
基因表現分析 對於Taqman qPCR，使用SuperScript™ VILO™ cDNA合成套組(Thermo Fisher # 11754250)以20 μl反應體積將80 ng之總RNA轉化成cDNA。將cDNA用水稀釋160倍且將2 μl用於qPCR。以含有用於DMPK (Thermo Fisher # Hs01094329_m1，FAM)或GAPDH (Thermo Fisher # Hs99999905_m1，FAM)之Taqman探針及Taqman™基因表現主混合物(Gene Expression Master Mix)(Thermo Fisher # 4369016)之5 μl最終體積用QuantStudio™ 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher)執行qPCR。qPCR循環條件如下：在50℃保持2分鐘之後，在95℃保持10分鐘，接著為45個循環：在95℃保持15秒及在60℃保持1分鐘。用QuantStudio™ 12K Flex軟體(Thermo Fisher)分析資料。用各基因之標準曲線分析表現值且以GAPDH基因之表現量標準化DMPK基因之表現量。
(2)結果 藉由將AAV9-695、AAV9-245、AAV9-257或AAV9-269應用於iCM細胞，發現DMPK mRNA下調，其表明攜帶dSaCas9、KRAB及sgRNA之轉殖基因的AAV9對人類肌肉細胞中之DMPK下調具有藥理學作用(圖4)，該sgRNA包含由SEQ ID NO: 83、70、81或99中所列之靶向序列編碼之crRNA。
實例4.DMSXL小鼠中DMPK基因表現之抑制 (1)實驗方法 動物處理 將AAV9-695、AAV9-245或AAV9-257靜脈內注射至DMSXL同源小鼠(稱為DMSXL小鼠)，其為攜帶人類DM1基因座且具有＞1,000 CTG之極大擴增的轉殖基因小鼠(PLoS Genet. 2012;8(11):e1003043)(分別地，雄性n=2，且雌性n=2，總計n=4)。劑量如下：AAV9-695、AAV9-245及AAV9-257分別為1.5×1013 vg/kg、5×1013 vg/kg、1.5×1014 vg/kg及5 × 1014 vg/kg。作為對照組，注射含有0.001% Pluronic F-68 (GE healthcare # SH30594.01)之PBS。4週之後，犧牲DMSXL小鼠，且自此等小鼠收集樣本(脛前肌(TA)、心臟及肝)。如下對此等樣本進行基因表現分析。樣本儲存於-80℃之冷凍室中直至RNA提取為止。
RNA提取及基因表現分析 使用TissueLyser II (Qiagen)於1 ml之ISOGEN (NIPPON GENE # 319-90211)中將組織樣本均質化。離心分離之後，將700 μl上清液轉移至含有150 μl氯仿(Wako # 034-02603)之1.5 ml管中。渦旋及離心之後，將187 μl水層添加至150 μl異丙醇(WAKO # 166-04836)中且混合。將RNA提取物轉移至RNeasy® Plus Mini套組(QIAGEN # 74134)之RNeasy自旋管柱，且遵循製造商之方案進一步純化。
對於Taqman qPCR，使用SuperScript™ VILO™ cDNA合成套組(Thermo Fisher # 11754250)以20 μl反應體積將700至1,000 ng之總RNA轉化為cDNA。將cDNA用水稀釋20倍且將3至4 μl用於qPCR。以含有用於DMPK (Thermo Fisher # Hs01094329_m1，FAM)或GAPDH (Thermo Fisher # Mm99999915_g1，FAM)之Taqman探針及Taqman基因表現主混合物(Thermo Fisher # 4369016)之10 μl最終體積用QuantStudio™ 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher)執行qPCR。qPCR循環條件如下：在50℃保持2分鐘之後，在95℃保持10分鐘，接著為40至45個循環：在95℃保持15秒及在60℃保持1分鐘。用QuantStudio™ 12K Flex軟體(Thermo Fisher)分析資料。用各基因之標準曲線分析表現值且以GAPDH基因之表現量標準化DMPK基因之表現量。
(2)結果 AAV9-695、AAV9-245及AAV9-257在小鼠中表現各轉殖基因。在肝中未發現但在骨骼肌肉及心肌中發現DMPK mRNA下調，其表明攜帶dSaCas9、KRAB及sgRNA之轉殖基因的AAV9對DMSXL小鼠中之DMPK下調具有藥理學作用(圖5至圖7)，該sgRNA包含由SEQ ID NO: 83、70或81中所列之靶向序列編碼之crRNA。
實例5.藉由向DMSXL小鼠投與AAV9-695改善RNA集落形成。 (1)實驗方法 螢光原位雜交：FISH 如實例4中所描述進行AAV9-695 (5×1014 vg/kg)或作為對照組之媒劑(含有0.001% Pluronic F-68之PBS)向DMSXL小鼠之投與。投與後4週，切下DMSXL小鼠之脛前(TA)肌且進行收集。在即刻包埋於Tissue-Tek® O.C.T.化合物(Sakura Finetek Japan，# 4583)之後，將組織冷凍於在液氮中預先冷卻之低溫異戊烷中且儲存於-80℃。
藉由恆冷箱切片機來製備組織之10 μm之冷凍切片，且將薄切片置於玻璃載片上。將載片風乾且在室溫下用4%多聚甲醛固定15分鐘，用PBS洗滌2分鐘，洗滌兩次，且儲存於4℃。
在室溫下於含有2%丙酮之PBS中培育5分鐘之後，在室溫下將載片於含有30%甲醯胺之2×檸檬酸鈉生理鹽水緩衝液(SSC)(300 mM NaCl及30 mM檸檬酸鈉)中培育10分鐘。在37℃下將載片於探針溶液(含有0.02%牛血清白蛋白(SIGMA # A7030-100G)、0.066 mg/ml酵母tRNA (Thermo Fisher # 15401-011)、2 mM釩醯核糖核苷複合物(SIGMA # R3380-5ML)及1 ng/μl Cy3-(CAG)5-2'-OMe探針(y_C(M)A(M)G(M)C(M) A(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)A(M)G(M)，y意謂Cy3且N(M)意謂2'-OMe RNA。此探針由日本GeneDesign公司合成)且含有30%甲醯胺之2× SSC)中培育2小時。雜交後，移除探針溶液，且在50℃下將載片於含有30%甲醯胺之2× SSC中培育30分鐘。用1× SSC洗滌載片一次，且在室溫下於1× SSC中培育30分鐘。用PBS洗滌載片三次，持續10分鐘，且將ProLong™金剛石抗淬滅封片劑+DAPI (ProLong™ Diamond Antifade Mountant with DAPI)(Thermo Fisher # P36971)添加至載片。用蓋玻片覆蓋載片且儲存於4℃。
使用共焦雷射顯微鏡LSM700 (ZEISS)觀測到RNA集落形成。
(2)結果 經投與媒劑或AAV9-695之DMSXL小鼠的TA肌肉切片之典型影像展示於圖8中。箭頭指示RNA集落(RNA集落定義為位於著色為藍色之細胞核中的明顯可偵測紅色斑點)。
投與AAV9-695之DMSXL小鼠之TA肌肉中觀測到的RNA集落數目低於投與媒劑之DMSXL小鼠之TA肌肉中的數目，表明AAV9-695投與改善DMSXL小鼠之RNA集落形成。
實例6.表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中DMPK基因表現之抑制。 (1)實驗方法 慢病毒產生 以5×106 個細胞/培養皿將Lenti-XTM 293T細胞(Takara # 632180)接種於經I型膠原蛋白塗佈之培養皿100 mm (IWAKI # 4020-010)中之補充有10% FBS及MEM非必需胺基酸溶液(Thermo Fisher # 11140050)的10 ml DMEM (Thermo Fisher # 10569-010)中，且在37℃/5% CO2 下培育過夜。次日，根據製造商之方案，用7 µg慢病毒高滴度封裝混合物(Takara # 6194)及5.5 µg含有編碼dSaCas9-KRAB之序列及SEQ ID NO: 1或83中所列之經指示靶向序列的轉移質體pED162建立LipofectamineTM 3000轉染試劑(Thermo Fisher # L3000008)(實例1)。質體如表3中所描述而命名。在轉染後48小時藉由使培養基上清液穿過0.45 µm過濾器來採集10 ml含有慢病毒之培養基。為濃縮病毒溶液，添加1/4體積之PEG-itTM 病毒沈澱溶液(SBI # LV810A-1)且在4℃培育過夜。以1,500× g離心上清液30分鐘。捨棄上清液之後，將200 µl DMEM添加至管中，且輕緩地使病毒溶液再懸浮病儲存於-80℃。 表3
質體 SEQ ID NO
pED162-C1 1
pED162-695 83
慢病毒滴度範圍為5×1010 至7×1010 個粒子/毫升，藉由使用NucleoSpin® RNA病毒(MACHEREY-NAGEL #740956.250)及Lenti-XTM qRT-PCR滴定套組(Clontech # 631235)來量測。
iDM細胞之轉導 以50,000個細胞/孔將iDM細胞接種於經I型膠原蛋白塗佈之12孔盤(IWAKI # 4815-010)中之含有生長培養基[PromoCell骨骼肌細胞生長培養基套組；部件編號C-23060 (注意：培養基補充有20%而非如由套組指導之5% FBS及50 µg /ml慶大黴素S)]之1 ml培養基中，且在37℃/5% CO2 下培育過夜。次日，將培養基替換為補充有5 µg/ml凝聚胺(Sigma，# TR-1003-G)及0.03 ml對應於包含與tracrRNA融合的由個別靶向序列((SEQ ID NO: 1或83)編碼之crRNA的各sgRNA之慢病毒上清液(參見上文)的1 ml生長培養基，將其添加至各孔。將細胞與慢病毒一起培育48小時，之後移除病毒培養基且替換為選擇培養基[補充有10 µg /ml殺稻瘟菌素(Nacalai # 03759-71)之生長培養基]。在於選擇培養基中培育24小時之後，將三分之一細胞傳遞至具有生長培養基之新孔中。在允許細胞接種72小時之後，將生長培養基替換為選擇培養基。於選擇培養基中培養48小時之後，採集且儲備細胞。
iCM細胞之轉導 以50,000個細胞/孔將iCM細胞接種於經I型膠原蛋白塗佈之6孔盤(IWAKI # 4810-010)中之含有生長培養基[PromoCell骨骼肌細胞生長培養基套組；部件編號C-23060 (注意：培養基補充有20%而非如由套組指導之5% FBS及50 µg /ml慶大黴素S)]之2 ml培養基中，且在37℃/5% CO2 下培育過夜。次日，將培養基替換為補充有5 µg/ml凝聚胺(Sigma # TR-1003-G)及2×109 vg對應於包含與tracrRNA融合的由個別靶向序列((SEQ ID NO: 1)編碼之crRNA的對照sgRNA之慢病毒上清液(參見上文)的2 ml生長培養基，將其添加至各孔。將細胞與慢病毒一起培育48小時，之後移除病毒培養基且替換為選擇培養基[補充有10 µg /ml殺稻瘟菌素(Nacalai # 03759-71)之生長培養基]。於選擇培養基中培育24小時之後，將三分之二細胞傳遞至含有生長培養基之經I型膠原蛋白塗佈之培養皿100 mm (iwaki # 4020-010)中。在允許細胞接種72小時之後，將生長培養基替換為選擇培養基。於選擇培養基中培養48小時之後，採集且儲備細胞。
細胞培養、RNA提取及cDNA製備 將表現dSaCas9及包含由SEQ ID: 83中所列之靶向序列編碼之crRNA之hDMPK sgRNA的iDM細胞、表現dSaCas9及包含由SEQ ID NO: 1中所列之靶向序列編碼之crRNA之對照sgRNA的iDM細胞、及表現dSaCas9及包含由SEQ ID NO: 1中所列之靶向序列編碼之crRNA之對照sgRNA的iCM細胞(分別稱為iDM-695細胞(iDM_695)、iDM-Ctrl細胞(iDM_Ctrl)及iCM-Ctrl細胞(iCM_Ctrl))以25,000個細胞於500 µl或50,000個細胞/孔之密度接種至經I型膠原蛋白塗佈之24孔盤(IWAKI # 4820-010)中的補充有20%非加熱不活化FBS之1 ml骨骼肌細胞生長培養基套組(Promocell # C23060)中且在37℃/5% CO2 下培育2天(以50,000個細胞/孔接種)或3天(以25,000個細胞/孔接種)。
用200 µL PBS洗滌之後，根據製造商之說明書使用RNeasy Mini套組(Qiagen # 74106)提取總RNA。
根據製造商之說明書使用SuperScript™ VILO™ cDNA合成套組(Thermo Fisher # 11754-250)將500 ng 總RNA轉化為cDNA。將cDNA儲存於-20℃。
基因表現分析 將cDNA用水稀釋100倍且將2 μl用於qPCR。以含有用於DMPK (Thermo Fisher # Hs01094329_m1，FAM)或用於GAPDH (Thermo Fisher # Hs99999905_m1，FAM)之Taqman探針及Taqman基因表現主混合物(Thermo Fisher # 4369016)之10 μl最終體積用ViiA7即時PCR系統(Thermo Fisher)執行qPCR。qPCR條件如下：以50℃預熱2分鐘且在95℃保持10分鐘，接著為45個循環：在95℃保持15秒及在60℃保持1分鐘。用各基因之標準曲線分析表現值且以GAPDH基因之表現量標準化DMPK基因之表現量。
(2)結果 iDM-695細胞中DMPK基因之表現及iDM-Ctrl細胞中之表現展示於圖9中。
表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中的DMPK基因表現得以抑制。
實例7.表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中RNA集落形成之改善。 實驗方法 螢光原位雜交：FISH 將實例6中構築之iDM-695細胞、iDM-Ctrl細胞及iCM-Ctrl細胞以2,500個細胞或5,000個細胞/孔之密度一式四份接種至經膠原蛋白塗佈之96孔培養盤(Thermo Fisher Scientific # 152038)中之補充有20%非加熱不活化FBS之骨骼肌細胞生長培養基套組(Promocell # C23060)中，且在37℃5% CO2 下培育2天(以5,000個細胞/孔接種)或3天(以2,500個細胞/孔接種)。
用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)洗滌細胞兩次，在室溫下用4%多聚甲醛固定15分鐘，用PBS洗滌兩次，且儲存於4℃。
在室溫下於含有0.2% Triton X-100之PBS中培育10分鐘之後，洗滌細胞且在室溫下於含有40%甲醯胺之2× SSC中培育10分鐘。將50 μl探針溶液(含有0.02%牛血清白蛋白(SIGMA # A7030-100G)、0.066 mg/ml酵母tRNA (Thermo Fisher Scientific # 15401-011)、2 mM釩醯核糖核苷複合物(SIGMA # R3380-5ML)及0.1 ng/μl Cy3-(CAG)5-LNA探針(y_5(L)A(L)G(L)cagcagcag5(L)A(L)G(L)，y意謂Cy3，5(L)意謂LNA-mC，N(L)意謂LNA，且小寫字母意謂DNA。此探針由GeneDesign公司合成)且含有40%甲醯胺之2× SSC)添加至各孔，且在37℃下培育細胞2小時。雜交後，移除探針溶液，且在37℃下於含有40%甲醯胺之2× SSC中培育細胞30分鐘。用1× SSC洗滌細胞一次且在室溫下於1× SSC中培育30分鐘。將含有2 μg/ml DAPI (Dojindo # 340-07971)之50 μl PBS添加至各孔中，且在室溫下培育細胞30分鐘。在室溫下用PBS洗滌細胞兩次，持續5分鐘，且儲存於4℃。
使用IN Cell分析儀6000 (GE Healthcare)偵測及分析RNA集落之形成。捕捉各孔中9個點之影像，且計數各影像中RNA集落陽性細胞核之數目及細胞核之總數目。分析各孔中集落陽性細胞核之比率，且計算平均值。
(2)結果 iDM-695細胞及iDM-Ctrl細胞之典型影像展示於圖10A中。
各細胞中之RNA集落陽性細胞核之比率展示於圖10B中。
iDM-695細胞中RNA集落陽性細胞核之比率低於iDM-Ctrl細胞中之比率。
實例8.表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中剪接缺陷之改善。 (1)實驗方法 剪接分析 cDNA自iDM-695細胞、iDM-Ctrl細胞及iCM-695細胞之製備描述於實例6中。
根據製造商之說明書使用PrimeSTAR® GXL DNA聚合酶(TaKaRa # R050A)進行PCR。將cDNA用水稀釋10倍且使用1 μl。所用PCR引子如下： 表4
目標 正向5'→3' 反向5'→3'
DMD外顯子78 TTAGAGGAGGTGATGGAGCA (SEQ ID NO: 192) GATACTAAGGACTCCATCGC (SEQ ID NO: 193)
MBNL1外顯子7 GCTGCCCAATACCAGGTCAAC (SEQ ID NO: 194) TGGTGGGAGAAATGCTGTATGC (SEQ ID NO: 195)
KIF13A外顯子21 ACCTGTGCAGCATTCAGGGACAC (SEQ ID NO: 196) CTCGTCGTTTAATGAGTGCATCTG (SEQ ID NO: 197)
TNNT2外顯子5 ATAGAAGAGGTGGTGGAAGAGTAC (SEQ ID NO: 198) GTCTCAGCCTCTGCTTCAGCATCC (SEQ ID NO: 199)
PCR循環條件如下：35個循環：在98℃保持10秒，在60℃保持15秒及在68℃保持30秒，接著在72℃保持7分鐘。
將PCR產物裝載於Agilent DNA1000套組( # 5067-1504)上，進行電泳且根據製造商之說明書使用Agilent 2100生物分析儀系統進行分析。
量測正常及異常剪接之產物之峰的AUC，且計算各細胞中正常剪接之產物之比率。
(2)結果 各基因(亦即DMD、MBNL1、KIF13A及TNNT2)之凝膠影像及外顯子型態展示於圖11A中。
各細胞中之正常剪接之產物的比率展示於圖11B中，該等正常剪接之產物在iCM細胞中更充足且在iDM細胞中較少。
所測試之所有基因之剪接缺陷在iDM-695細胞中得以改善。
當本文中陳述數字界限或範圍時，包括端點在內。而且，在數字界限或範圍內的所有值及子範圍均特定地包括在內，就如同明確寫出一般。
如本文所用，詞語「一」及類似者具有「一或多個」之含義。
顯然，根據以上教示，本發明之眾多修改及變化為可能的。因此應理解，在隨附申請專利範圍之範疇內，可以不同於本文中特定描述之方式的其他方式實踐本發明。
上文所提及之所有專利及其他參考文獻均以此引用方式全部併入本文中，如同詳細闡述此參考文獻一般。
工業適用性 根據本發明，可抑制來源於DM1患者及DM1模型小鼠之細胞中的DMPK基因之表現。因此，預期本發明極其適用於治療及/或預防DM1。
相關申請案之交叉引用 本申請案主張2019年5月28日申請之美國臨時專利申請案第62/853,373號及2020年5月15日申請之美國臨時專利申請案第63/025,417號之權益，該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明之更完整理解及其許多伴隨優勢將易於獲得，此係由於前述各者在結合附圖考慮時藉由參看以下實施方式變得更好理解，其中： 圖1展示SEQ ID NO: 4至126中所列之靶向序列的位置，其中黑色方框展示顯示人類DMPK基因表現之不低於50%降低的靶向序列之位置。 圖2展示分別使用dSaCas9-KRAB及包含由SEQ ID NO: 4至126中所列之靶向序列編碼之crRNA的sgRNA評估的對人類DMPK基因之表現抑制作用之結果。橫軸展示包含由各靶向序列編碼之crRNA的sgRNA，縱軸展示使用各sgRNA時DMPK基因之表現量與使用對照sgRNA時DMPK基因之表現量(100%)之比，且誤差杠展示標準差。 圖3展示SEQ ID NO: 4至126中所列之靶向序列之位置與當分別使用dSaCas9-KRAB及包含由靶向序列編碼之crRNA的sgRNA控制人類DMPK基因之表現時人類DMPK基因之表現量之間的關係。 圖4展示人類肌肉細胞中之DMPK下調。 圖5展示AAV9-695抑制DMSXL小鼠(A；脛前肌，B；心臟，C；肝)中之DMPK表現。 圖6展示AAV9-245抑制DMSXL小鼠(A；脛前肌，B；心臟，C；肝)中之DMPK表現。 圖7展示AAV9-257抑制DMSXL小鼠(A；脛前肌，B；心臟，C；肝)中之DMPK表現。 圖8展示AAV9-695改善DMSXL小鼠中之RNA集落形成。 圖9展示表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中DMPK基因表現之抑制。 圖10展示表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中RNA集落形成之改善(A；iDM-695細胞及iDM-Ctrl細胞之典型影像，B；各細胞中之RNA集落陽性細胞核之比率)。 圖11展示表現hDMPK sgRNA之iDM細胞中剪接缺陷之改善(A；基因之凝膠影像及外顯子型態，B；正常剪接之產物之比率)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090

Claims (26)

  1. 一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之表現調控區中以下所列區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之該表現調控區中以下所列區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119。
  3. 如請求項1或2之聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及轉錄抑制因子之融合蛋白的鹼基序列，及 (b)編碼嚮導RNA之鹼基序列，該嚮導RNA靶向人類DMPK基因之該表現調控區中以下所列區域中長度為18至24個核苷酸之連續區：SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 109或SEQ ID NO: 111。
  4. 如請求項1之聚核苷酸，其中編碼該嚮導RNA之該鹼基序列包含：SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列；或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 119中所列之鹼基序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其包含至少兩個編碼該等嚮導RNA之鹼基序列，其中該至少兩個鹼基序列不同。
  6. 如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該轉錄抑制因子係選自以下之群：KRAB、MeCP2、SIN3A、HDT1、MBD2B、NIPP1及HP1A。
  7. 如請求項6之聚核苷酸，其中該轉錄抑制因子為KRAB。
  8. 如請求項1至7中任一項之聚核苷酸，其中該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為dCas9。
  9. 如請求項8之聚核苷酸，其中該dCas9係來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )。
  10. 如請求項1至9中任一項之聚核苷酸，其進一步包含編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之啟動子序列及/或編碼該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及該轉錄抑制因子之該融合蛋白的該鹼基序列之啟動子序列。
  11. 如請求項10之聚核苷酸，其中編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之該啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。
  12. 如請求項11之聚核苷酸，其中編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之該啟動子序列為U6啟動子。
  13. 如請求項10至12中任一項之聚核苷酸，其中編碼該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及該轉錄抑制因子之該融合蛋白的該鹼基序列之該啟動子序列為廣泛啟動子或肌肉特異性啟動子。
  14. 如請求項13之聚核苷酸，其中該廣泛啟動子係選自以下之群：EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子。
  15. 如請求項13之聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子係選自以下之群：CK8啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12 (Syn)啟動子及Des啟動子。
  16. 如請求項15之聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。
  17. 如請求項10至16中任一項之聚核苷酸， 其中編碼該嚮導RNA之該鹼基序列包含SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 99中所列之該鹼基序列， 該轉錄抑制因子為KRAB， 該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 編碼該嚮導RNA的該鹼基序列之該啟動子序列為U6啟動子，且 編碼該核酸酶缺失型CRISPR效應蛋白及該轉錄抑制因子之該融合蛋白的該鹼基序列之該啟動子序列為CK8啟動子。
  18. 如請求項17之聚核苷酸， 其中編碼該嚮導RNA之該鹼基序列包含SEQ ID NO: 83中所列之該鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 83中所列之該鹼基序列。
  19. 一種載體，其包含如請求項1至18中任一項之聚核苷酸。
  20. 如請求項19之載體，其中該載體為質體載體或病毒載體。
  21. 如請求項20之載體，其中該病毒載體係選自以下之群：腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體及慢病毒載體。
  22. 如請求項21之載體，其中該AAV載體係選自以下之群：AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80、AAV587 MTP、AAV588 MTP、AAV-B1、AAVM41及AAVrh74。
  23. 如請求項22之載體，其中該AAV載體為AAV9。
  24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之聚核苷酸或如請求項19至23中任一項之載體。
  25. 如請求項24之醫藥組合物，其用於治療或預防1型強直性肌肉萎縮症(myotonic dystrophy type 1)。
  26. 一種治療或預防1型強直性肌肉萎縮症之方法，其包含向有此需要之個體投與如請求項1至18中任一項之聚核苷酸或如請求項19至23中任一項之載體。
TW109117727A 2019-05-28 2020-05-27 藉靶向dmpk基因治療肌肉萎縮症之方法 TW202111122A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962853373P 2019-05-28 2019-05-28
US62/853,373 2019-05-28
US202063025417P 2020-05-15 2020-05-15
US63/025,417 2020-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202111122A true TW202111122A (zh) 2021-03-16

Family

ID=71787010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109117727A TW202111122A (zh) 2019-05-28 2020-05-27 藉靶向dmpk基因治療肌肉萎縮症之方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220233721A1 (zh)
EP (1) EP3976785A1 (zh)
JP (1) JP2022534627A (zh)
KR (1) KR20220012926A (zh)
CN (1) CN113785066A (zh)
AU (1) AU2020283372A1 (zh)
BR (1) BR112021023899A2 (zh)
CA (1) CA3135271A1 (zh)
CO (1) CO2021014746A2 (zh)
IL (1) IL287178A (zh)
MX (1) MX2021014478A (zh)
SG (1) SG11202111427RA (zh)
TW (1) TW202111122A (zh)
WO (1) WO2020241903A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022114243A1 (en) * 2020-11-25 2022-06-02 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene
WO2022234519A1 (en) * 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
WO2023018637A1 (en) * 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002095006A2 (en) 2001-05-24 2002-11-28 Genzyme Corporation Muscle-specific expression vectors
CN103555678B (zh) 2001-11-13 2018-02-09 宾夕法尼亚大学托管会 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
ES2874298T3 (es) 2003-09-30 2021-11-04 Univ Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
AU2011282217B2 (en) * 2010-07-19 2015-12-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) expression
CN103189507A (zh) 2010-10-27 2013-07-03 学校法人自治医科大学 用于向神经系统细胞导入基因的腺相关病毒粒子
KR102240217B1 (ko) * 2012-09-25 2021-04-14 젠자임 코포레이션 근긴장성 이영양증의 치료용 펩티드-결합 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드
CN107427531A (zh) 2015-03-24 2017-12-01 协和发酵麒麟株式会社 含有核酸的脂质纳米粒子
US11427838B2 (en) 2016-06-29 2022-08-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and other related disorders
WO2018081806A2 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for impeding transcription of expanded microsatellite repeats
US20220017881A1 (en) 2018-06-08 2022-01-20 Modalis Therapeutics Corporation MODIFIED Cas9 PROTEIN AND USE THEREOF
KR20210082185A (ko) 2018-10-24 2021-07-02 가부시키가이샤 모달리스 개변된 Cas9 단백질 및 그의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN113785066A (zh) 2021-12-10
CA3135271A1 (en) 2020-12-03
CO2021014746A2 (es) 2021-11-19
EP3976785A1 (en) 2022-04-06
KR20220012926A (ko) 2022-02-04
AU2020283372A1 (en) 2021-11-18
MX2021014478A (es) 2022-01-06
BR112021023899A2 (pt) 2022-01-18
JP2022534627A (ja) 2022-08-02
WO2020241903A1 (en) 2020-12-03
IL287178A (en) 2021-12-01
SG11202111427RA (en) 2021-11-29
US20220233721A1 (en) 2022-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220195456A9 (en) Closed-ended linear duplex dna for non-viral gene transfer
US20230025279A1 (en) Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
JP7069426B2 (ja) ユートロフィン遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法
US20200216843A1 (en) Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
TW202111122A (zh) 藉靶向dmpk基因治療肌肉萎縮症之方法
US20240084334A1 (en) Serpina-modulating compositions and methods
TW202112797A (zh) 經由靶向lama1基因治療肌肉萎縮症的方法
WO2023039440A2 (en) Hbb-modulating compositions and methods
JP2023539631A (ja) Ｄｕｘ４遺伝子を標的とした顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの治療方法
WO2022176859A1 (en) Method for treating muscular dystrophy by targeting lama1 gene
WO2022145495A1 (en) Method for treating spinocerebellar ataxias (sca) by targeting atxn7 gene
US20230248810A1 (en) Method for treating alzheimer's disease by targeting mapt gene
US20240026324A1 (en) Methods and compositions for modulating a genome
RU2811724C2 (ru) РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)
WO2022114243A1 (en) Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene
WO2022232442A2 (en) Multiplex crispr/cas9-mediated target gene activation system
KR20230142776A (ko) Rna 아데노 관련 바이러스(raav) 벡터 및 그 용도
CN117980482A (zh) Rbm20突变的基因组编辑