TW202112797A - 經由靶向lama1基因治療肌肉萎縮症的方法 - Google Patents

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秦元寶
山形哲也
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日商摩大力斯醫療公司
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Abstract

本發明旨在提供一種用於人類肌肉萎縮症(特別是MDC1A)的新穎治療方法。本發明提供一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列：(a)編碼核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列，及(b)在人類LAMA1基因之表現調節區域中編碼以下之鹼基序列：(i)靶向SEQ ID NO：15、20、25、50、56或61所示的連續區域之引導RNA、(ii)靶向SEQ ID NO: 124所示的連續區域之引導RNA、或(iii)靶向SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA。

Description

經由靶向LAMA1基因治療肌肉萎縮症的方法
本發明係關於一種經由靶向層黏連蛋白-α1鏈(LAMA1)基因及類似者治療肌肉萎縮症(特別是板素(Merosin)缺乏先天性肌肉萎縮症(MDC1A))的方法。更特定言之，本發明係關於一種用於治療或預防肌肉萎縮症的方法，該方法包括藉由上調人類LAMA1基因之表現(該LAMA1基因在肌肉組織中不固有地表現)，藉由使用靶向人類LAMA1基因之特定序列之引導RNA、及轉錄活化子及CRISPR效應蛋白之融合蛋白、及用於治療或預防肌肉萎縮症及類似者之藥劑，來補充因突變而刪除的LAMA2或其功能。
肌肉萎縮症係具有進行性肌肉萎縮及肌肉強度損失的遺傳性疾病的通稱術語。目前，尚無針對於肌肉萎縮症之有效基本治療藥物，而僅給出對症治療(symptomatic treatment)。已知體染色體隱性疾病板素缺乏先天性肌肉萎縮症(MDC1A)係肌肉萎縮症之一種類型。
MDC1A係缺乏智力發育遲緩(mental retardation)之西方型先天性肌肉萎縮症，且係由骨骼肌基底膜組分中板素之缺乏引起。板素係由層黏連蛋白鏈組成之異三聚物且係經由糖鏈結構結合至α-肌肉萎縮蛋白聚糖(dystroglycan)。當其經刪除時，細胞骨架(cytoskeleton)與細胞外基質間經由肌肉萎縮蛋白糖蛋白複合物的連接被破壞。其係歐洲及美國最常見的先天性肌肉萎縮症(約50%)。其係由6q22.33處的層黏連蛋白α2鏈基因(LAMA2基因)中之突變引起的。
Cohn等人報導一種透過全身遞送具有CRISPR/Cas9基因組編輯組分之腺相關病毒(AAV)來校正導致MDC1A dy2J /dy2J 小鼠模型中LAMA2基因突變之剪接位點突變的方法。治療後的dy2J /dy2J 小鼠顯示肌肉組織病理學及功能實質改良且無麻痺徵兆(NPL 1)。 此外，Bassi顯示LAMA1基因可係MDC1A之疾病改良基因。LAMA1基因編碼層黏連蛋白α1鏈蛋白，其結構上類似於層黏連蛋白α2鏈。具體而言，使用小鼠的實驗已顯示可使用金黃色葡萄球菌(S. aureus)之CRISPR/Cas9系統來上調LAMA1之表現且補償層黏連蛋白α2鏈之缺乏(NPL 2，NPL 3)的可能性。
[技術問題]
本發明旨在提供一種用於人類肌肉萎縮症(特別是MDC1A)的新穎治療方法。 [問題的解決辦法]
本發明者已進行以上提及問題之深入研究且發現人類LAMA1基因之表現可利用肌細胞藉由使用靶向人類LAMA1基因(基因ID：284217)之特定序列之引導RNA、及轉錄活化子及缺乏核酸酶活性之CRISPR效應蛋白之融合蛋白來上調。本發明者已基於此等發現完成本發明。
本發明可包括以下發明。 [1]一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)在人類LAMA1基因之表現調節區域中編碼(i)靶向以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域之引導RNA、(ii)靶向以SEQ ID NO: 124所示的連續區域之引導RNA、或(iii)靶向以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA之鹼基序列。 [2]如上述[1]之聚核苷酸，其中該編碼引導RNA之鹼基序列包含 (i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的鹼基序列， (ii)以SEQ ID NO: 124所示的鹼基序列， (iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的鹼基序列， 或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的該鹼基序列。 [3]如上述[1]或[2]之聚核苷酸，其中該轉錄活化子係選自由VP64、VP160、VPH、VPR、VP64-miniRTA (miniVR)、及microVR、其之具有轉錄活化能力之變體組成之群。 [4]如上述[3]之聚核苷酸，其中該轉錄活化子為miniVR。 [5]如上述[1]至[4]中任一項之聚核苷酸，其中該核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白為dCas9。 [6]如上述[5]之聚核苷酸，其中該dCas9係衍生自金黃色葡萄球菌。 [7]如上述[1]至[6]中任一項之聚核苷酸，其進一步包含編碼該引導RNA之鹼基序列之啟動子序列及/或編碼該核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列之啟動子序列。 [8]如上述[7]之聚核苷酸，其中編碼該引導RNA之鹼基序列之啟動子序列係選自由U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子組成之群。 [9]如上述[8]之聚核苷酸，其中編碼該引導RNA之鹼基序列之啟動子序列為U6啟動子。 [10]如上述[7]至[9]中任一項之聚核苷酸，其中編碼該核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列之啟動子序列為泛在啟動子(ubiquitous promoter)或肌肉特異性啟動子。 [11]如上述[10]之聚核苷酸，其中該泛在啟動子係選自由EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子組成之群。 [12]如上述[10]之聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子係選自由CK8啟動子、肌球蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12(Syn)啟動子及unc45b啟動子組成之群。 [13]一種載體，其包含如上述[1]至[12]中任一項之聚核苷酸。 [14]如上述[13]之載體，其中該載體為質體載體或病毒載體。 [15]如上述[14]之載體，其中該病毒載體係選自由腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體及慢病毒載體組成之群。 [16]如上述[15]之載體，其中該AAV載體係選自由AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其變體組成之群。 [17]一種用於治療或預防MDC1A的藥劑，其包含如上述[1]至[12]中任一項之聚核苷酸或如上述[13]至[16]中任一項之載體。 [18]一種用於治療或預防MDC1A的方法，該方法包括對有此需要的個體投與如上述[1]至[12]中任一項之聚核苷酸或如上述[13]至[16]中任一項之載體。 [19]一種如上述[1]至[12]中任一項之聚核苷酸或如上述[13]至[16]中任一項之載體於治療或預防MDC1A之用途。 [20]一種如上述[1]至[12]中任一項之聚核苷酸或如上述[13]至[16]中任一項之載體於製造用於治療或預防MDC1A的醫藥組合物之用途。 [21]一種用於上調細胞中人類LAMA1基因之表現的方法，該方法包括在前述細胞中表現 (c)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白及轉錄活化子之融合蛋白，及 (d)靶向人類LAMA1之表現調節區域中(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA。 [22]一種核糖核蛋白，其包含下列： (c)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白及轉錄活化子之融合蛋白，及 (d)靶向人類LAMA1基因之表現調節區域中(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA。 [23]一種套組，其包含用於上調人類LAMA1基因之表現之下列： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類LAMA1基因之表現調節區域中(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA、或編碼該引導RNA之聚核苷酸。 [24]一種用於治療或預防MDC1A的方法，該方法包括投與以下(e)及(f)： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類LAMA1基因之表現調節區域中(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA、或編碼該引導RNA之聚核苷酸。 [25]一種以下(e)及(f)於製造用於治療或預防MDC1A的醫藥組合物之用途： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類LAMA1基因之表現調節區域中(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域或編碼該引導RNA之聚核苷酸。 [本發明之有利效應]
根據本發明，可上調人類LAMA1基因之表現，其結果係預期本發明能夠治療MDC1A。
[引文清單] [非專利文獻]
[NPL 1] Kemaladewi, D. U.、Maino, E.、Hyatt, E.、 Hou, H. 、Ding, M. 、Place, K. M. 、Zhu, X. 、Bassi, P. 、Baghestani, Z. 、Deshwar, A. G. 、Merico, D. 、Xiong, H. Y. 、Frey, B. J. 、Wilson, M. D. 、Ivakine, E. A. 、Cohn, R. D. Nat Medicine. 23:8. 2017。 [NPL 2] Prabhpreet Singh Bassi，依據理科碩士學位要求提交的論文，Department of Molecular Genetics，University of Toronto. 2017: Assessing the Therapeutic Potential of CRISPR/Cas9-Mediated Gene Modulation in Merosin-Deficient Congenital Muscular Dystrophy Type 1A [NPL 3] Dwi U. Kemaladewi、Prabhpreet S. Bassi、Steven erwood、Dhekra Al-Basha、Kinga I. Gawlik、Kyle Lindsay、elzbieta Hyatt、rebekah Kember、Kara M. Place、ryan M. Marks、Madeleine Durbeej、Steven A. Prescott、evgueni A. Ivakine & ronald D. Cohn，Nature 572，p125，2019: A mutation- independent approach for muscular dystrophy via upregulation of a modifier gene
下文詳細地解釋本發明之實施例。
1. 聚核苷酸 本發明提供一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列(後文有時亦稱為「本發明之聚核苷酸」)： (a)編碼核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)編碼人類LAMA1基因之表現調節區域中下列之鹼基序列 (i)靶向以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域之引導RNA， (ii)靶向以SEQ ID NO: 124所示的連續區域之引導RNA，或 (iii)靶向以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA。 將本發明之聚核苷酸引入所需細胞中且轉錄以產生核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白、及靶向人類LAMA1基因之表現調節區域之特定區域之引導RNA。此等融合蛋白及引導RNA形成複合物(後文中該複合物有時稱為「核糖核蛋白；RNP」)且協同作用於前述特定區域，由此活化人類LAMA1基因之轉錄。
(1)定義 在本說明書中，「人類層黏連蛋白-α1鏈(LAMA1)基因之表現調節區域」意指可藉由將RNP結合至該區域來活化人類LAMA1基因之表現之任何區域。亦即，人類LAMA1基因之表現調節區域可存在於人類LAMA1基因之任何區域，諸如啟動子區域、增強子區域、內含子及外顯子中，只要藉由結合RNP來活化人類LAMA1基因之表現即可。在本說明書中，當表現調節區域由特定序列表示時，表現調節區域在概念上包括有義股序列及反義股序列二者。 在本發明中，核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白藉由引導RNA募集至人類LAMA1基因之表現調節區域中之特定區域中。在本說明書中，「靶向...之引導RNA」意指「募集融合蛋白至...中之引導RNA」。 在本說明書中，「引導RNA(亦稱為「gRNA」)」係包含基因組特異性CRISPR-RNA(稱為「crRNA」)之RNA。crRNA係結合至靶向序列之互補序列之RNA(稍後描述)。當使用Cpf1作為CRISPR效應蛋白時，「引導RNA」係指包含由crRNA及連接到其5'端的特定序列組成之RNA(例如在FnCpf 1之情況下，以SEQ ID NO: 65所示的RNA序列)的RNA。當使用Cas9作為CRISPR效應蛋白時，「引導RNA」係指包含crRNA及連接至其3'端的反式活化crRNA(稱為「tracrRNA」)之嵌合體RNA(稱為「單引導RNA (sgRNA)」)(參見，例如，Zhang F.等人，Hum Mol Genet. 2014年9月15日；23(R1):R40-6及Zetsche B.等人，Cell. 2015年10月22日；163(3)：759-71，該文獻係以全文引用之方式併入本文中)。 在本說明書中，與人類LAMA1基因之表現調節區域中crRNA所結合的序列互補之序列稱為「靶向序列」。亦即，在本說明書中，「靶向序列」係存在於人類LAMA1基因之表現調節區域中且與PAM(原間隔子(protospacer)相鄰基序)相鄰之DNA序列。當使用Cpf1作為CRISPR效應蛋白時，PAM與靶向序列的5'側相鄰。當使用Cas9作為CRISPR效應蛋白時，PAM與靶向序列的3'側相鄰。靶向序列可存在於人類LAMA1基因之表現調節區域的有義股序列側或反義股序列側中任一側(參見例如前述的Zhang F.等人，Hum Mol Genet. 2014年9月15日；23(R1):R40-6及Zetsche B.等人，Cell. 2015年10月22日；163(3): 759-71，該文獻係以全文引用之方式併入本文中)。
(2)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白 在本發明中，使用核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白，將與其融合的轉錄活化子募集至人類LAMA1基因之表現調節區域。意欲用於本發明的核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白(後文簡稱為「CRISPR效應蛋白」)並無特定限制，只要其與gRNA形成複合物且募集至人類LAMA1基因之表現調節區域即可。例如，可包括核酸酶缺乏Cas9(後文有時亦稱為「dCas9」)或核酸酶缺乏Cpf1(後文有時亦稱為「dCpf1」)。 上述dCas9之實例包括，但不限於，釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)衍生之Cas9(SpCas9；PAM序列：NGG (N為A、G、T或C。後文相同))、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)衍生之Cas9 (StCas9；PAM序列：NNAGAAW (W為A或T。後文相同))、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)衍生之Cas9 (NmCas9；PAM序列：NNNNGATT)或金黃色葡萄球菌衍生之Cas9 (SaCas9；PAM序列：NNGRRT (R為A或G。後文相同))及類似者之核酸酶缺乏型變體(參見，例如，Nishimasu等人，Cell. 2014年2月27日；156(5)：935-49，Esvelt KM等人，Nat Methods. 2013年11月；10(11):1116-21，Zhang Y. Mol Cell. 2015年10月15日；60(2):242-55，及Friedland AE等人，Genome Biol. 2015年11月24日；16:257，該等文獻係以全文引用之方式併入本文中)。例如，在SpCas9之情況下，可使用雙重突變體，其中第10個Asp殘基轉化為Ala殘基及第840個His殘基轉化為Ala殘基(有時稱為「dSpCas9」)(參見，例如，前述的Nishimasu等人，Cell. 2014)。或者，在SaCas9之情況下，可使用其中將第10個Asp殘基轉化為Ala殘基及將第580個Asn殘基轉化為Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 66)、或其中將第10個Asp殘基轉化為Ala殘基及將第557個His殘基轉化為Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 67) (後文此等雙重突變體中之任何者有時稱為「dSaCas9」) (參見，例如，前述的Friedland AE等人，Genome Biol. 2015，該文獻係以全文引用之方式併入本文中)。 此外，在本發明之一個實施例中，亦可使用與gRNA形成複合物且經募集至人類LAMA1基因之表現調節區域的藉由修飾前述dCas9之胺基酸之一部分而獲得的變體作為dCas9。此類變體之實例包括具有經部分刪除之胺基酸序列之截短變體。在本發明之一個實施例中，可使用揭示於美國臨時專利申請案第62/682,244號及第62/749,855號中之變體作為dCas9，該等案係以全文引用之方式併入本文中。具體而言，亦可使用藉由自為其中將第10個Asp殘基轉化為Ala殘基及將第580個Asn殘基轉化為Ala殘基的雙重突變體(SEQ ID NO:68)之dSaCas9刪除第721位至第745位胺基酸而獲得之dSaCas9、或其中刪除的部分經肽連接子取代之dSaCas9(例如，其中刪除的部分係經GGSGGS連接子(SEQ ID NO: 69)取代者係以SEQ ID NO: 70所示)、或藉由刪除為上述雙重突變體(SEQ ID NO:71)的dSaCas9之第482位至第648位胺基酸而獲得之dSaCas9、或其中刪除的部分係經肽連接子取代之dSaCas9(其中刪除的部分係經GGSGGS連接子取代者係以SEQ ID NO: 72所示)。 上述dCpf1之實例包括，但不限於，新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)衍生之Cpf1 (FnCpf1；PAM序列：NTT)、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)衍生之Cpf1 (AsCpf1；PAM序列：NTTT)、或毛螺菌(Lachnospiraceae bacterium)衍生之Cpf1 (LbCpf1；PAM序列：NTTT)及類似者之核酸酶缺乏變體(參見，例如，Zetsche B.等人，Cell. 2015年10月22日；163(3):759-71，Yamano T等人，Cell. 2016年5月5日；165(4):949-62，及Yamano T等人，Mol Cell. 2017年8月17日；67(4):633-45，該等文獻係以全文引用之方式併入本文中)。例如，在FnCpf1之情況下，可使用其中將第917個Asp殘基轉化為Ala殘基及將第1006個Glu殘基轉化為Ala殘基的雙重突變體(參見，例如，前述的Zetsche B等人，Cell. 2015，該文獻係以全文引用之方式併入本文中)。在本發明之一個實施例中，亦可使用與gRNA形成複合物且經募集至人類LAMA1基因之表現調節區域的藉由修飾前述dCpf1之胺基酸之一部分而獲得的變體作為dCpf1。 在本發明之一個實施例中，將dCas9用作CRISPR效應蛋白且在一個特定實施例中，使用dSaCas9。 包含編碼CRISPR效應蛋白之鹼基序列之聚核苷酸可藉由例如基於其cDNA序列資訊合成覆蓋編碼該蛋白質之所需部分之區域之寡DNA引物，及藉由PCR方法使用自產生該蛋白質的細胞製備的總RNA或mRNA部分作為模板來擴增該聚核苷酸進行選殖。另外，包含編碼CRISPR效應蛋白之鹼基序列之聚核苷酸可藉由利用已知的定點誘變方法將突變引入編碼經選殖之CRISPR效應蛋白之核苷酸序列中以將在對於DNA切割活性而言重要的位點處的胺基酸殘基(例如，可包括在SaCas9之情況下，第10個Asp殘基、第557個His殘基及第580個Asn殘基；在FnCpf1之情況下，第917個Asp殘基及第1006個Glu殘基，及類似者，但不限於該等殘基)轉化為其他胺基酸來獲得。 或者，包含編碼CRISPR效應蛋白之鹼基序列之聚核苷酸可基於其cDNA序列資訊藉由化學合成或化學合成及PCR方法或吉普森組裝(Gibson Assembly)方法之組合來獲得，且亦可經進一步建構為經歷密碼子最佳化以提供適於在人類中表現之密碼子的鹼基序列。
(3)轉錄活化子 在本發明中，人類LAMA1基因表現係藉由與CRISPR效應蛋白融合的轉錄活化子之作用而被活化。在本說明書中，「轉錄活化子」意指具有活化人類LAMA1基因之基因轉錄之能力之蛋白質或保留其功能之肽片段。意欲用於本發明中的轉錄活化子並無特定限制，只要其可活化人類LAMA1基因之表現即可。例如，其包括VP64、VP160、VPH、VPR、miniVR及microVR、其之具有轉錄活化能力之變體及類似者。VP64之實例係由以SEQ ID NO:73所示的50個胺基酸組成之肽。VP160之實例係由以SEQ ID NO: 84所示的131個胺基酸組成之肽。VPH係VP64、p65及HSF1之融合蛋白，具體而言，其實例係由以SEQ ID NO: 74所示的376個胺基酸組成之肽。VPR係VP64、p65及埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)(RTA)之複製及轉錄活化子之融合蛋白，具體而言，其實例係由以SEQ ID NO:75所示的523個胺基酸組成之肽。VP64、VPH及VPR係已知的且詳細揭示於例如Chavez A等人，Nat Methods. 2016年7月；13(7):563-7及Chavez A等人，Nat Methods. 2015年4月；12(4):326-8中，該等文獻係以全文引用之方式併入本文中。miniVR及microVR係包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。RTA之轉錄活化域係已知的且揭示於例如J Virol. 1992年9月；66(9):5500-8(該文獻係以全文引用之方式併入本文中)及類似者中。具體而言，miniVR之實例係由以SEQ ID NO: 76所示的167個胺基酸組成之肽，及microVR之實例係由以SEQ ID NO: 77所示的140個胺基酸組成之肽。以SEQ ID NO: 76所示的胺基酸序列係由其中RTA及VP64之第493個至第605個胺基酸殘基經G-S-G-S連接子(SEQ ID NO:78)連接之胺基酸序列所組成。以SEQ ID NO: 77所示的胺基酸序列係由其中RTA及VP64之第520個至第605個胺基酸殘基經G-S-G-S連接子連接之胺基酸序列所組成。miniVR及microVR之詳細內容描述在美國臨時專利申請案第62/715,432號中，該案係以全文引用之方式併入本文中。任何前述轉錄活化子均可經歷任何修飾及/或改變，只要其維持其轉錄活化能力即可。 包含編碼轉錄活化子之鹼基序列之聚核苷酸可藉由化學合成或化學合成及PCR方法或吉普森組裝方法之組合來建構。此外，亦可將包含編碼轉錄活化子之鹼基序列之聚核苷酸建構為密碼子最佳化之DNA序列以成為適於在人類中表現的密碼子。 可藉由將編碼CRISPR效應蛋白之鹼基序列直接接合至編碼轉錄活化子之鹼基序列或在添加編碼連接子、NLS(核定位訊號)及/或標籤之鹼基序列後製備包含編碼轉錄活化子與CRISPR效應蛋白之融合蛋白之鹼基序列之聚核苷酸。在本發明中，轉錄活化子可與N端或C端中任一端融合。作為連接子，可使用具有約2至50之胺基酸數目之連接子，且其特定實例包括，但不限於，其中甘胺酸(G)及絲胺酸(S)交替連接的G-S-G-S連接子及類似者。
(4)引導RNA 在本發明中，可藉由引導RNA將CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白募集至人類LAMA1基因之表現調節區域。如前述「(1)定義」中所述，引導RNA包含crRNA，且該crRNA結合至靶向序列之互補序列。只要引導RNA可將融合蛋白募集至靶區域，則crRNA可不與靶向序列之互補序列完全互補，且可係其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至3個鹼基之序列。 當使用dCas9作為CRISPR效應蛋白時，例如，可使用經公開之gRNA設計網站(CRISPR設計工具(CRISPR Design Tool)，CRISPR direct等)來確定靶向序列。具體而言，自標的基因(亦即人類LAMA1基因)之序列中，列出長度為約20個核苷酸的候選靶向序列(其中PAM(例如NNGRRT，在SaCas9之情況下)與其3'側相鄰)，及可使用在此等候選靶向序列中之人類基因組中具有少量脫靶位點者作為靶向序列。靶向序列之鹼基長度為18至24個核苷酸長，較佳20至23個核苷酸長，更佳21至23個核苷酸長。作為用於預測脫靶位點數之主要篩選，許多生物資訊工具係已知的且可公開獲得，及可用於預測具有最低脫靶效應之靶向序列。其實例包括生物資訊工具，諸如Benchling (https://benchling.com)及COSMID (具有錯配、插入及刪除之CRISPR脫靶位點) (可在國際網路的https://crispr.bme.gatech.edu上獲得)。使用此等生物資訊工具，可概述與gRNA靶向的鹼基序列之相似性。當意欲使用的gRNA設計軟體不具有搜索靶基因組之脫靶位點之功能時，例如，可藉由使靶基因組經歷相對於候選靶向序列(靶向核苷酸序列之具有高度識別能力之種子序列)的3'側上的8至12個核苷酸的Blast搜索來搜索脫靶位點。 在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體18 (Chr 18)之GRCh38.p13位置中的區域中，以下區域可係人類LAMA1基因之表現調節區域。強烈建議該區域作為藉由組蛋白修飾模式之表現調節區域。因此，在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體18(Chr 18)之GRCh38.p13位置中的以下區域之至少一個區域中，靶向序列可為18至24個核苷酸長，較佳20至23個核苷酸長，更佳21至23個核苷酸長： (1) 7,115,000至7,118,000。 在本發明之一個實施例中，靶向序列可係以SEQ ID NO:15、20、25、50、56或61所示的鹼基序列。 在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體18(Chr 18)之GRCh38.p13位置中的以下區域之至少一個區域中，靶向序列可為18至24個核苷酸長，較佳20至23個核苷酸長，更佳21至23個核苷酸長： (2) 7,036,000至7,042,000。 (3) 7,083,000至7,087,000 在本發明之一個實施例中，靶向序列可係以SEQ ID NO: 124所示的鹼基序列。 在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體18(Chr 18)之GRCh38.p13位置中的以下區域之至少一個區域中，靶向序列可為18至24個核苷酸長，較佳20至23個核苷酸長，更佳21至23個核苷酸長： (4) 7,118,000至7,133,000。 在本發明之一個實施例中，靶向序列可係以SEQ ID NO: 178、193或195所示的鹼基序列。在本發明之一個實施例中，編碼crRNA之鹼基序列可係與靶向序列相同的鹼基序列。例如，當將以SEQ ID NO: 15 (TCTCGCCTCCGCCGCCACTCG)所示的靶向序列引入細胞中作為編碼crRNA之鹼基序列時，自該序列轉錄的crRNA為UCUCGCCUCCGCCGCCACUCG (SEQ ID NO: 79)且結合至CGAGTGGCGGCGGAGGCGAGA (SEQ ID NO: 80)，其係與以SEQ ID NO: 15所示的鹼基序列互補且存在於人類LAMA1基因之表現調節區域中之序列。在另一個實施例中，可將作為其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至3個鹼基之靶向序列的鹼基序列用作編碼crRNA之鹼基序列，只要引導RNA可募集融合蛋白至靶區域即可。因此，在本發明之一個實施例中，可使用以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基之此種序列作為編碼crRNA之鹼基序列。在本發明之另一個實施例中，可使用以SEQ ID NO: 124所示的鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基之此種序列作為編碼crRNA之鹼基序列。在本發明之又另一個實施例中，可使用以SEQ ID NO: 178、193或195所示的鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基之此種序列作為編碼crRNA之鹼基序列。 當使用dCpf1作為CRISPR效應蛋白時，編碼gRNA之鹼基序列可經設計為特定RNA連接至5'端的編碼crRNA之DNA序列。可由一般技術者根據所使用的dCpf1適宜地選擇連接至crRNA的5'端的RNA及編碼該RNA之DNA序列。例如，當使用dFnCpf1時，可使用其中SEQ ID NO: 81；AATTTCTAC TGTTGTAGA T連接至靶向序列的5'側的鹼基序列作為編碼gRNA之鹼基序列(當轉錄為RNA時，加底線的部分之序列形成鹼基對以形成莖環(stem-loop)結構)。意欲添加至5'端的序列可係一般用於各種Cpf1蛋白的其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至6個鹼基的序列，只要gRNA可將融合蛋白募集至轉錄後的表現調節區域即可。 當使用dCas9作為CRISPR效應蛋白時，編碼gRNA之鹼基序列可經設計為其中編碼已知tracrRNA之DNA序列係連接至編碼crRNA之DNA序列的3'端的DNA序列。可由一般技術者根據意欲使用的dCas9適宜地選擇此種tracrRNA及編碼tracrRNA之DNA序列。例如，當使用dSaCas9時，使用以SEQ ID NO: 82所示的鹼基序列作為編碼tracrRNA之DNA序列。編碼tracrRNA之DNA序列可係一般用於各種Cas9蛋白質的其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至6個鹼基的編碼tracrRNA之鹼基序列，只要gRNA可將融合蛋白募集至轉錄後的表現調節區域即可。 可使用已知DNA合成方法化學合成包含以此方式設計的編碼gRNA之鹼基序列之聚核苷酸。 在本發明之另一個實施例中，本發明之聚核苷酸可包含兩種或更多種具有不同crRNA之gRNA。
(5)啟動子序列 在本發明之一個實施例中，啟動子序列可以可操作地連接至編碼CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列及/或編碼gRNA之鹼基序列中之各者的上游。可能連接的啟動子並無特定限制，只要其在靶細胞中顯示啟動子活性即可。可能連接至編碼融合蛋白之鹼基序列的上游的啟動子序列之實例包括，但不限於，EFS啟動子、CMV(巨大細胞病毒)啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、MYOD啟動子、hTERT啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CAG啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))啟動子及類似者。可能連接至編碼gRNA之鹼基序列的上游的啟動子序列之實例包括，但不限於，U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子、H1啟動子及tRNA啟動子(其為pol III啟動子)及類似者。在本發明之一個實施例中，可使用肌肉特異性啟動子作為連接至編碼前述融合蛋白之鹼基序列的上游的啟動子序列。肌肉特異性啟動子之實例包括，但不限於，CK8啟動子、CK6啟動子、CK1啟動子、CK7啟動子、CK9啟動子、心肌肌鈣蛋白C啟動子、α肌動蛋白啟動子、肌球蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌球蛋白輕鏈2A啟動子、肌肉萎縮蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶啟動子、dMCK啟動子、tMCK啟動子、enh348 MCK啟動子、合成C5-12(Syn)啟動子、unc45b啟動子、Myf5啟動子、MLC1/3f啟動子、MYOD啟動子、Myog啟動子、Pax7啟動子及類似者(關於肌肉特異性啟動子之詳細內容，參見，例如，US2011/0212529A，McCarthy JJ等人，Skeletal Muscle. 2012年5月；2(1):8，Wang B.等人，Gene Ther. 2008年11月；15(22):1489-99(該等文獻係以全文引用之方式併入本文中)及類似者)。
(6)其他鹼基序列 此外，本發明之聚核苷酸除了彼等以上針對於改良藉由編碼CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列之轉錄產生的mRNA之轉譯效率之目的所述者以外可進一步包含已知序列，諸如多腺苷酸化訊號、Kozak共通序列及類似者。另外，本發明之聚核苷酸可包含編碼連接子序列之鹼基序列、編碼NLS之鹼基序列及/或編碼標籤之鹼基序列。
2. 載體 本發明提供包含本發明之聚核苷酸之載體(後文有時稱為「本發明之載體」)。本發明之載體可係質體載體或病毒載體。 當本發明之載體係質體載體時，意欲使用的質體載體並無特定限制且可為任何質體載體(諸如選殖質體載體及表現質體載體)。質體載體係藉由將本發明之聚核苷酸藉由已知方法插入質體載體中來製備。 當本發明之載體係病毒載體時，意欲使用的病毒載體並無特定限制及其實例包括，但不限於，腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒、仙台病毒載體(Sendaivirus vector)及類似者。在本說明書中，「病毒載體(virus vector/viral vector)」亦包括其衍生物。考慮到在基因療法中之用途，出於可以長時間表現轉基因的原因，較佳係使用AAV載體，及其係衍生自非致病性病毒且具有高安全性。 可藉由已知方法來製備包含本發明之聚核苷酸之病毒載體。簡言之，製備其中已插入本發明之聚核苷酸的用於病毒表現之質體載體，該載體係經轉染至適宜宿主細胞中以允許短暫產生包含本發明之聚核苷酸之病毒載體，及收集病毒載體。 在本發明之一個實施例中，當使用AAV載體時，AAV載體之血清型並無特定限制，只要可活化標靶中人類LAMA1基因之表現即可，及可使用AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10中之任何者及其變體及類似者(對於AAV之各種血清型，參見，例如，WO 2005/033321，該案係以全文引用之方式併入本文中)。AAV之變體之實例包括，但不限於，具有經修飾之衣殼之新血清型(例如WO 2012/057363，該案係以全文引用之方式併入本文中)及類似者。 在製備AAV載體之一個實例中，首先，製備載體質體，其在野生型AAV基因組序列的兩端包含反向末端重複序列(ITR)及經插入以代替編碼Rep蛋白及衣殼蛋白之DNA之本發明聚核苷酸。另一方面，將形成病毒顆粒所必需的編碼Rep蛋白及衣殼蛋白之DNA插入其他質體中。此外，製備包含負責AAV增殖所必需的腺病毒之輔助作用之基因(E1A、E1B、E2A、VA及E4orf6)之質體作為腺病毒輔助質體。該三種質體共轉染至宿主細胞中在細胞中引起重組AAV(亦即AAV載體)之產生。關於宿主細胞，較佳使用能夠提供負責前述輔助作用之基因之基因產物(蛋白質)之一部分之細胞(例如293細胞等)。當使用此種細胞時，不必在前述腺病毒輔助質體中攜帶編碼可由宿主細胞提供的蛋白質之基因。所產生的AAV載體係存在於細胞核中。因此，藉由利用冷凍熔融破壞宿主細胞，收集病毒且然後藉由使用氯化銫之密度梯度超離心法、管柱方法或類似者使病毒流份經歷分離及純化，來製備所需AAV載體。 AAV載體在就安全性、基因轉導效率及類似者方面具有很大優勢，及係用於基因療法。然而，已知可包裝的聚核苷酸的大小受到限制。例如，包括包含編碼dSaCas9與miniVR或microVR之融合蛋白之鹼基序列、編碼靶向人類LAMA1基因之表現調節區域之gRNA之鹼基序列、及作為啟動子序列之EFS啟動子序列及U6啟動子序列(其係本發明之一個實施例)之聚核苷酸之鹼基長度、及ITR部分的全長為約4.85 kb，及其可包裝在單個AAV載體中。
3. MDC1A之治療或預防藥劑 本發明亦提供一種用於MDC1A之治療或預防藥劑，其包含本發明之聚核苷酸或本發明之載體(後文有時稱為「本發明之藥劑」)。 本發明之藥劑包含本發明之聚核苷酸或本發明之載體作為活性成分，及可經製備成包含此種活性成分(亦即本發明之聚核苷酸或本發明之載體)及一般而言醫藥上可接受之載劑之調配物。 本發明之藥劑係非經腸投與，且可局部或全身性投與。本發明之藥劑可藉由，但不限於，例如，靜脈內投與、動脈內投與、皮下投與、腹膜內投與或肌內投與來投與。 本發明之藥劑針對個體之劑量並無特定限制，只要其係用於治療及/或預防之有效量即可。其可根據活性成分、劑型、個體的年齡及體重、投藥時間表、投藥方法及類似者適宜地最佳化。 在本發明之一個實施例中，本發明之藥劑不僅可投與罹患MDC1A的個體，而且可基於遺傳背景分析及類似者預防性地投與在將來可能發展MDC1A的個體。除了治癒疾病之外，在本說明書中術語「治療」亦包括緩解疾病。另外，術語「預防」除了預防疾病發作之外亦可包括延遲疾病發作。本發明之藥劑亦可稱為「本發明之醫藥組合物」或類似者。
4. 用於治療或預防MDC1A之方法 本發明亦提供一種用於治療或預防MDC1A的方法，該方法包括對有此需要的個體投與本發明之聚核苷酸或本發明之載體(後文有時稱為「本發明之方法」)。另外，本發明包括用於治療或預防MDC1A之本發明之聚核苷酸或本發明之載體。此外，本發明包括本發明之聚核苷酸或本發明之載體於製造用於治療或預防MDC1A的醫藥組合物之用途。 本發明之方法可藉由對罹患MDC1A的個體投與本發明之前述藥劑來實踐，及劑量、投藥途徑、個體及類似者係與彼等以上所述者相同。 症狀之測量可在使用本發明之方法開始治療之前及在治療後的任何時間進行以確定個體對治療之反應。 本發明之方法可改良個體之骨骼肌及/或心肌之功能。意欲改良其功能的肌肉並無特定限制，及舉例說明任何肌肉及肌肉組。
5. 核糖核蛋白 本發明提供一種核糖核蛋白，其包含下列(後文有時稱為「本發明之RNP」)： (c)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白，及 (d)人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA (i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域， (ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域；或 (iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域。 可使用詳細說明於上述「1.聚核苷酸」部分中的CRISPR效應蛋白、轉錄活化子及引導RNA作為包含在本發明之RNP中的CRISPR效應蛋白、轉錄活化子及引導RNA。意欲包含在本發明之RNP中的CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白可藉由，例如，將編碼融合蛋白之聚核苷酸引入細胞、細菌或其他生物中以允許表現，或藉由使用聚核苷酸之活體外轉譯系統來產生。另外，包含在本發明之RNP中的引導RNA可藉由，例如，化學合成或藉由使用編碼引導RNA之聚核苷酸之活體外轉錄系統來產生。將由此製備的CRISPR效應蛋白及引導RNA混合以製備本發明之RNP。必要時，可混合其他物質，諸如金顆粒。為將本發明之RNP直接遞送至靶細胞、組織及類似者，可藉由已知方法將RNP包埋在脂質奈米顆粒(LNP)中。可藉由已知方法將本發明之RNP引入靶細胞、組織及類似者中。關於LNP中之包埋及引入方法，可參考例如Lee K.等人，Nat Biomed Eng. 2017；1:889-901，WO 2016/153012(該案係以全文引用之方式併入本文中)及類似者。 在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體18(Chr 18)之GRCh38.p13位置中的以下區域之至少一個區域中，包含在本發明之RNP中的引導RNA靶向連續18至24個核苷酸長度，較佳20至23個核苷酸長度，更佳21至23個核苷酸長度： (1) 7,115,000至7,118,000。 在一個實施例中，引導RNA靶向包含以SEQ ID NO:15、20、25、50、56或61所示的全部或一部分序列中之區域。 (2) 7,036,000-7,042,000。 (3) 7,083,000-7,087,000 在一個實施例中，引導RNA靶向包含以SEQ ID NO: 124所述的全部或一部分序列之區域。 (4) 7,118,000-7,133,000。 在一個實施例中，引導RNA靶向包含以SEQ ID NO: 178、193或195所示的全部或一部分序列之區域。
6. 其他 本發明亦提供一種包含下列的用於活化人類LAMA1基因之表現的組合物或套組： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA (i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域； (ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域；或 (iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域， 或編碼該引導RNA之聚核苷酸。 本發明亦提供一種用於治療或預防MDC1A的方法，該方法包括投與以下(e)及(f)： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA (i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域， (ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域，或 (iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域， 或編碼該引導RNA之聚核苷酸。 可使用彼等詳細說明於上述「1.聚核苷酸」、「2.載體」及「5.核糖核蛋白」部分中者作為CRISPR效應蛋白、轉錄活化子、引導RNA、以及編碼其之聚核苷酸及其中此等發明中攜帶其的載體。上述(e)及(f)之劑量、投藥途徑、個體、調配物及類似者係與彼等說明於「3. MDC1A之治療或預防藥劑」部分中者相同。
在以下示例性實施例描述過程中當明瞭本發明之其他特徵，該等示例性實施例係針對於說明本發明而給出的而無意對本發明進行限制。 [實例]
實驗方法 LAMA1靶向序列之選擇 基於人類骨骼肌細胞中基因組之H3K4me3、H3K27Ac模式，掃描人類LAMA1基因之兩個另外推定基因調節區域(R1及R2)以得到可經無催化活性之SaCas9 (D10A及N580A突變體；與gRNA複合之dSaCas9)靶向的序列，本文中定義為靶向序列。靶向基因組區域相對於LAMA1基因之位置描繪於圖1中及其坐標如下所示： 1.  Chr18: GRCh38/hg38；7,036,000-7,042,000 -＞ ~6kb (R1) 2.  Chr18：GRCh38/hg38；7,083,000-7,087,000 -＞ ~4kb (R2)
靶向序列由與具有序列NNGRRT (5'-第21個靶向序列-NNGRRT-3')之原間隔子相鄰基序(PAM)相鄰的21個核苷酸片段指示(表1)。
此外，吾人亦掃描人類LAMA1 TSS位點的上游近15kb區域，及僅選擇與食蟹獼猴(crab-eating macaque)(食蟹獼猴(Macaca fascicularis))基因組之相應區域完全匹配之靶向序列及PAM序列。靶向基因組區域相對於LAMA1基因之位置描繪於圖1中及其坐標如下所示： Chr18：GRCh38/hg38；7,118,000-7,133,000 -＞ ~15kb (與食蟹獼猴匹配的)
表1 用於篩選LAMA1基因之表現調節區域之靶向序列。
[表1-1]
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[表1-2]
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[表1-3]
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[表1-4]
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[表1-5]
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[表1-6]
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[表1-7]
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[表1-8]
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在表1中，「位置」指示當使用SaCas9時所有所顯示的gRNA之潛在SaCas9切割位點。 SEQ ID NO: 1至61位於TSS區域中，SEQ ID NO: 85至113位於R1區域中，SEQ ID NO: 114至129位於R2區域中及SEQ ID NO: 130至221位於與食蟹猴匹配的區域中(圖1)。
慢病毒轉移質體(pED176及衍生質體)之建構 pLentiCRISPR v2係購自Genscript (https://www.genscript.com)且進行以下修改：將SpCas9 gRNA支架序列替換為SaCas9 gRNA支架序列；將SpCas9-FLAG替換為融合至密碼子最佳化之VP64-miniRTA (亦稱為mini-VR)的dSaCas9。當藉由活化轉錄定位至啟動子時，VP64-miniRTA轉錄活化域可活化基因表現。VP64-miniRTA係連接至dSaCas9 (D10A及N580A突變體)的C端，其在後文中稱為dSaCas9-VR，及如藉由靶向序列所指示靶向至人類LAMA1基因調節區域(表1，圖1)。所產生的骨架質體命名為pED176。吾人亦藉由將mini-VR替換為下列其他活化域來產生衍生質體：VP64-EBNA2、VP160、VP64-nanoRTA、VP64-microRTA。
gRNA選殖 將三個對照非靶向靶向序列及164個靶向序列(表1)選殖至pED176中。由Integrated DNA Technologies以以下格式合成正向及反向寡聚物(oligos)：正向；5' CACC(G)-20個鹼基對靶向序列 - 3'，及反向：5' AAAC - 19至21個鹼基對反向補體靶向序列 - (C) - 3'，其中若標靶並非以G開頭，則添加括號中之鹼基。將寡聚物以100 μM再懸浮在Tris-EDTA緩衝液(pH 8.0)中。將1 μl的各互補寡聚物在NE緩衝液3.1 (NEB目錄號：B7203S)中於10 μl反應中組合。將反應加熱至95℃且允許在熱循環儀中冷卻至25℃，由此退火具有與選殖至pED176相容之黏性末端懸伸的寡聚物。將經退火之寡聚物與已用BsmBI消化且凝膠純化的慢病毒轉移質體pED176組合，且根據製造商的方案利用T4 DNA連接酶連接(NEB目錄號：M0202S)。根據製造商的方案將2 μl連接反應轉變至10 μl NEB穩定勝任細胞(Competent cells) (NEB目錄號：C3040I)中。所得的構築體藉由U6啟動子驅動包含由與tracrRNA (SEQ ID NO:83)融合之個別靶向序列編碼之crRNA之sgRNA之表現。
慢病毒之產生 將HEK293TA細胞以0.75x106 個細胞/孔接種在6孔細胞培養皿(VWR目錄號：10062-892)內的2 ml生長培養基(補充10% FBS及2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸之DMEM培養基)中且在37℃/5% CO2 下培養24小時。第二天，根據製造商的方案利用1.5 μg包裝質體混合物[1 μg包裝質體(參見pCMV delta R8.2；addgene #12263)及0.5 μg包膜表現質體(參見pCMV-VSV-G；addgene #8454)]及1 μg之含有編碼dSaCas9-VR及所指示sgRNA之序列之轉移質體設定TransIT-VirusGEN轉染反應。轉染後48小時藉由使培養基上清液通過0.45 μM PES過濾器(VWR目錄號：10218-488)來收穫慢病毒。在準備使用之前，將經純化且等分之慢病毒儲藏在-80℃冰箱中。
HSMM細胞之轉導 自Lonza Inc.獲得來自5名年齡在0至26歲間的不同人類供體(分別稱為供體#3、供體#5、供體#121、供體#368、供體#617)之原生骨骼肌成肌細胞(HSMM)。在原生骨骼肌細胞生長培養基[SkGM-2骨骼肌生長BulletKit培養基(Lonza #CC-3244 & CC-3246)]中培養該等細胞。為進行轉導，將細胞以0.125-0.33x106 個細胞/孔接種在含有生長培養基之6孔細胞培養皿(VWR目錄號：10062-894)中且在37℃/5% CO2 下培養24小時。第二天，將補充有8 μg/ml Polybrene(Sigma目錄號：TR-1003-G)及對應於包含由個別靶向序列編碼之crRNA(表1)及tracrRNA之各sgRNA的1.0 ml慢病毒上清液(參見上文)之1.5 ml生長培養基添加至每個孔。將細胞與慢病毒一起培養6小時然後移除病毒培養基且替換為新鮮生長培養基。轉導後72小時，將選擇培養基[補充0.5 μg/ml嘌呤黴素之生長培養基(Sigma Aldrich目錄號：P8833)]饋入細胞。每2至3天為細胞提供新鮮選擇培養基。細胞在選擇培養基中7至10天後，收穫細胞且如製造商所指示利用RNeasy 96套組(Qiagen目錄號：74182)提取RNA。
基因表現分析 對於基因表現分析，自~0.5 μg至0.8 μg總RNA根據高容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems；ThermoFisher目錄號：4368813)方案以10 μl體積產生cDNA。將cDNA稀釋10倍且使用Taqman Fast Advanced Master Mix根據製造商的方案進行分析。Taqman探針(LAMA1：Assay Id Hs01074489_m1 FAM；HPRT：Assay Id Hs99999909_m1 VIC_PL)係從Life Technologies獲得。藉由QuantStudio 5即時PCR系統如由Taqman Fast Advanced Master Mix方案所指示處理及分析基於Taqman探針之即時PCR反應。
在嘌呤黴素選擇下7天後，藉由使用QIAGEN Allprep蛋白質/RNA套組(Qiagen #80404)如由製造商所指示自經轉導之HSMM細胞提取總蛋白質，及隨後進行定量且標準化至1 μg/μL最終濃度。在NuPAGE Tris-乙酸鹽3至8%微型凝膠(FisherSci EA0375BOX)上分離20 μg每種蛋白質溶液且然後在35V於4C下轉移至PVDF膜(Bio-Rad) 70分鐘。隨後於RT下在SuperBlock T20 (PBS)阻斷緩衝液(LifeTech 37516)中培養該蛋白質溶液1小時以阻斷非特異性相互作用位點。之後，將該膜與抗LAMA1抗體(1:100) (Santa Cruz Bio sc- 74417)或抗b-肌動蛋白抗體(1:10000) (LifeTech MA1-140)在4℃下培養過夜。在攪拌下在洗滌溶液(1X TBS及0.05%吐溫20(Tween 20))中歷時10 min洗滌該膜3次，以移除非特異性結合後過量或鬆散結合之抗體。在攪拌下於RT下在該膜上培養在阻斷溶液中以1:10,000稀釋之與辣根過氧化物酶(HRP；LifeTech)偶合的山羊免疫球蛋白抗小鼠1小時。在將該膜在SuperSignal West Femto最大靈敏度受質(LifeTech 34094)中浸泡1 min之前，進行另一系列之三次洗滌。結果藉由Azure C400顯現。
資料分析 對於每個樣品及三個對照，由HPRT探針減去LAMA1探針之3次技術重複之平均Ct值，計算∆Ct值(平均Ct LAMA1 - 平均Ct HPRT)。使用公式2-(∆Ct) 確定每個樣品之表現值。然後將樣品表現值針對每個實驗之3個對照表現值之平均標準化以確定每個樣品之相對LAMA1表現。
結果 藉由dSaCas9-VR:sgRNA活化LAMA1基因表現 產生慢病毒，其將針對每個靶向序列之VP64-miniRTA及sgRNA之表現盒遞送至原生HSMM細胞。選擇抗嘌呤黴素之經轉導之細胞，及使用Taqman分析法定量LAMA1表現。將每個樣品之表現值針對利用對照sgRNA轉導之細胞中LAMA1表現之平均值標準化。 如圖2中所顯示，在16個所測試序列中，3個靶向序列顯示HSMM供體#3細胞中LAMA1 mRNA表現上調~5至7倍(圖2)，及相同3個序列顯示供體#5細胞中上調~11至16倍(圖3)。 從首次篩選16種sgRNA (SEQ ID No. 1至16)看到有前景的上調結果後，吾人繼續設計及篩選相同區域中之另外45種sgRNA (SEQ ID No. 17至61)，及識別與sgRNA 15相比，效力幾乎兩倍的新的有效的sgRNA，諸如sgRNA 25及sgRNA 50(圖4)。 如圖5中所顯示，在R1及R2中之40個所測試序列中，僅gRNA#101在HSMM供體#3細胞中顯示LAMA1 mRNA表現之超過3倍的上調。 如圖6中所顯示，在位於LAMA1 TSS上游的92個所測試引導序列中，此等引導中之少數能夠上調LAMA1表現程度至2倍或更高。利用具有四個不同來源之原生HSMM細胞進行測試的以下驗證實驗中包括三種最有效的引導序列，亦即gRNA#155、gRNA#170及gRNA#172，每種治療條件均包括三個生物學重複：1.未經病毒轉導；2.未經sgRNA轉導的dSaCas9-VR；3.經非靶向sgRNA轉導的dSaCas9-VR；4.經gRNA#155轉導的dSaCas9-VR；5.經gRNA#170轉導的dSaCas9-VR；6.經gRNA#172轉導的dSaCas9-VR。如圖7中所顯示，所有三個sgRNA均能夠在具有四個不同來源的所有原生HSMM細胞中一致地上調LAMA1表現程度至更高程度(至少3.5倍)。此外吾人觀測到不同HSMM來源間的上調效力不同(例如與供體#368中為＞35倍相比，供體#121中為約3.5倍)，此可能係由於LAMA1之基礎表現程度不同所致(圖8)。 接下來，吾人繼續測試此等sgRNA是否可利用不同活化部分來上調LAMA1濃度。如圖9中所顯示，VP160、nanoVR、microVR及miniVR均能夠上調LAMA1表現超過3倍，VP64-MyoD能夠上調LAMA1表現約2倍。同時，為檢查LAMA1 mRNA濃度之上調是否轉化為蛋白質濃度之升高，吾人利用microVR自樣品提取總蛋白質且進行西方墨點分析法(western blot assay)。如圖10中所顯示，在兩個個別HSMM細胞來源中，所有三個sgRNA均能夠使LAMA1蛋白質濃度增加至少1.7倍。 上面提及的所有專利及其他參考文獻均以該引用方式全文併入本文中，如同經詳盡闡述。 [工業適用性]
根據本發明，可上調得自MDC1A患者之肌肉細胞中LAMA1基因之表現。因此，預期本發明對於MDC1A之治療及/或預防極有用。 本申請案係基於美國臨時專利申請案第62/887,863號(申請日期：2019年8月16日)及美國臨時專利申請案第63/008,059號(申請日期：2020年4月10日)，該兩案均在美國申請，該等案之內容係全文併入本文中。
[圖1] 圖1顯示人類LAMA1基因中靶向基因組區域之位置。 [圖2] 圖2顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 1至16所示的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA於得自供體＃3之原生骨骼肌成肌細胞(HSMM細胞)中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示含有由各靶向序列編碼的crRNA之sgRNA，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。 [圖3] 圖3顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 1至16所示的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA於得自供體＃5之原生HSMM細胞中對人類LAMA1基因之表現增強效應之評估結果。水平軸顯示含有由各靶向序列編碼的crRNA之sgRNA，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。 [圖4] 圖4顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 10、11、15、17至61所示的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA於得自供體＃3之原生HSMM細胞中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示含有由各靶向序列編碼的crRNA之sgRNA，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。 [圖5] 圖5顯示藉由使用含有由位於R1或R2區域中的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA於得自供體＃3之原生HSMM細胞中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示含有由各靶向序列編碼的crRNA之sgRNA，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。 [圖6] 圖6顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 130至221所示的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA於原生HSMM細胞(得自供體#3、#121、#368、#617)中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示含有由各靶向序列編碼的crRNA之sgRNA，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。 [圖7A] 圖7A顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 178、193或195所示的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA (sgLAMA1-155、sgLAMA1-170、sgLAMA-172)於原生HSMM細胞(得自供體#3、#121)中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示各病狀，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。重複實驗3次且顯示平均值及SD。 [圖7B] 圖7B顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 178、193或195所示的靶向序列編碼的crRNA及mini-VR之sgRNA (sgLAMA1-155、sgLAMA1-170、sgLAMA-172)於原生HSMM細胞(得自供體#368、#617)中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示各病狀，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。重複實驗3次且顯示平均值及SD。 [圖8] 圖8顯示於原生HSMM細胞(得自供體#3、#121、#368、#617)中對人類LAMA1基因表現程度之評估結果。水平軸顯示供體編號，及垂直軸顯示使用HPRT對照時的表現程度。 [圖9] 圖9顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 178、193或195所示的靶向序列編碼的crRNA及各種活化部分之sgRNA (sgLAMA1-155、sgLAMA1-170、sgLAMA-172)於原生HSMM細胞(得自供體#3)中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。水平軸顯示各病狀，及垂直軸顯示使用各sgRNA時的LAMA1基因表現程度與使用對照sgRNA作為1時的LAMA1基因表現程度之比。 [圖10] 圖10顯示藉由使用含有由以SEQ ID NO: 178、193或195所示的靶向序列編碼的crRNA及microVR之sgRNA於原生HSMM細胞(得自供體#3、#617)中對人類LAMA1基因之表現增強作用之評估結果。
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Figure 12_A0101_SEQ_0080

Claims (25)

  1. 一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)在人類LAMA1基因之表現調節區域中編碼下列之鹼基序列：(i)靶向以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域之引導RNA、(ii)靶向以SEQ ID NO: 124所示的連續區域之引導RNA、或(iii)靶向以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域之引導RNA。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中該編碼引導RNA之鹼基序列包含 (i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的鹼基序列， (ii)以SEQ ID NO: 124所示的鹼基序列， (iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的鹼基序列， 或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的該鹼基序列。
  3. 如請求項1或2之聚核苷酸，其中該轉錄活化子係選自由VP64、VP160、VPH、VPR、VP64-miniRTA (miniVR)、及microVR、具有轉錄活化能力之其變體組成之群。
  4. 如請求項3之聚核苷酸，其中該轉錄活化子為miniVR。
  5. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其中該核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白為dCas9。
  6. 如請求項5之聚核苷酸，其中該dCas9係衍生自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
  7. 如請求項1至6中任一項之聚核苷酸，其進一步包含編碼該引導RNA之鹼基序列之啟動子序列及/或編碼該核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列之啟動子序列。
  8. 如請求項7之聚核苷酸，其中編碼該引導RNA之鹼基序列之啟動子序列係選自由U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子組成之群。
  9. 如請求項8之聚核苷酸，其中編碼該引導RNA之鹼基序列之啟動子序列為U6啟動子。
  10. 如請求項7至9中任一項之聚核苷酸，其中編碼該核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白之鹼基序列之啟動子序列為泛在啟動子(ubiquitous promoter)或肌肉特異性啟動子。
  11. 如請求項10之聚核苷酸，其中該泛在啟動子係選自由EFS啟動子、CMV啟動子及CAG啟動子組成之群。
  12. 如請求項10之聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子係選自由CK8啟動子、肌球蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成C5-12(Syn)啟動子及unc45b啟動子組成之群。
  13. 一種載體，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸。
  14. 如請求項13之載體，其中該載體為質體載體或病毒載體。
  15. 如請求項14之載體，其中該病毒載體係選自由腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體及慢病毒載體組成之群。
  16. 如請求項15之載體，其中該AAV載體係選自由AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其變體組成之群。
  17. 一種用於治療或預防MDC1A之藥劑，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至16中任一項之載體。
  18. 一種用於治療或預防MDC1A之方法，其包括對有此需要的個體投與如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至16中任一項之載體。
  19. 一種如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至16中任一項之載體於治療或預防MDC1A之用途。
  20. 一種如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至16中任一項之載體於製造用於治療或預防MDC1A的醫藥組合物之用途。
  21. 一種用於上調細胞中人類LAMA1基因之表現的方法，其包括在前述細胞中表現 (c)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白及轉錄活化子之融合蛋白，及 (d)在人類LAMA1之表現調節區域中靶向下列之引導RNA ：(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域。
  22. 一種核糖核蛋白，其包含下列： (c)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白及轉錄活化子之融合蛋白，及 (d)在人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA ：(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域。
  23. 一種套組，其包含用於上調人類LAMA1基因之表現之下列： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)在人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA ：(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域、或編碼該引導RNA之聚核苷酸。
  24. 一種用於治療或預防MDC1A的方法，該方法包括投與以下(e)及(f)： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白、或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)在人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA：(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域、或編碼該引導RNA之聚核苷酸。
  25. 一種以下(e)及(f)於製造用於治療或預防MDC1A的醫藥組合物之用途： (e)核酸酶缺乏型CRISPR效應蛋白與轉錄活化子之融合蛋白、或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)在人類LAMA1基因之表現調節區域中靶向下列之引導RNA ：(i)以SEQ ID NO: 15、20、25、50、56或61所示的連續區域、(ii)以SEQ ID NO: 124所示的連續區域、或(iii)以SEQ ID NO: 178、193或195所示的連續區域，或編碼該引導RNA之聚核苷酸。
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