JP2022544320A - Ｌａｍａ１遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト筋ジストロフィー（特にＭＤＣ１Ａ）の新規治療手段を提供することを目的とする。本発明は以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する：（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び（ｂ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、をコードする塩基配列。【選択図】なし
Description
本発明は、ラミニン－α１鎖（ＬＡＭＡ１）遺伝子を標的とした筋ジストロフィー、特にメロシン欠損先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ１Ａ）の治療方法等に関する。より詳細には、本発明は、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ、及び転写アクチベーターとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いて本来は筋肉組織にあまり発現していないヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートすることにより、変異によって欠失しているＬＡＭＡ２あるいはその機能を補完し、筋ジストロフィーを治療又は予防する方法、並びに筋ジストロフィーの治療又は予防剤等に関する。
筋ジストロフィーは進行性の筋萎縮と筋力低下を伴う遺伝性疾患の総称である。現在のところ、筋ジストロフィーに対して有効な根本治療薬は存在せず、対症療法のみがおこなわれている。筋ジストロフィーの１つに、常染色体劣性疾患であるメロシン欠損先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ１Ａ）が知られている。
ＭＤＣ１Ａは、精神発達遅滞を欠く西洋型先天性筋ジストロフィーで、骨格筋基底膜成分のメロシン欠損に起因する。メロシンはラミニン鎖から構成されるヘテロ三量体で、糖鎖構造を介してα－ジストログリカンと結合しており、欠損するとジストロフィン糖蛋白複合体を介する細胞骨格と細胞外マトリックスとの連結が断たれる。欧米では最も頻度が高い先天性筋ジストロフィー（約５０％）である。６ｑ２２．３３にあるラミニンα２鎖の遺伝子（ＬＡＭＡ２遺伝子）の変異により発症する。
Ｃｏｈｎらは、ＭＤＣ１Ａのｄｙ２Ｊ／ｄｙ２Ｊマウスモデルにおける、ＬＡＭＡ２遺伝子の変異をもたらすスプライス部位突然変異を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集成分を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の全身送達を通して修正する方法を報告している。処置後のｄｙ２Ｊ／ｄｙ２Ｊマウスは、筋組織病理学および機能において実質的な改善を示し、麻痺の徴候は認められなかった（非特許文献１）。
また、Ｂａｓｓｉは、ＬＡＭＡ１遺伝子がＭＤＣ１Ａの疾患修飾遺伝子であり得ることを示した。ＬＡＭＡ１遺伝子は、ラミニンα２鎖と構造的に類似しているラミニンα１鎖タンパク質をコードする。具体的にはマウスを用いた実験により、S. aureusのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＬＡＭＡ１の発現をアプレギュレートし、ラミニンα２鎖の欠損を補う可能性が示されている（非特許文献２、非特許文献３）。
また、Ｂａｓｓｉは、ＬＡＭＡ１遺伝子がＭＤＣ１Ａの疾患修飾遺伝子であり得ることを示した。ＬＡＭＡ１遺伝子は、ラミニンα２鎖と構造的に類似しているラミニンα１鎖タンパク質をコードする。具体的にはマウスを用いた実験により、S. aureusのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＬＡＭＡ１の発現をアプレギュレートし、ラミニンα２鎖の欠損を補う可能性が示されている（非特許文献２、非特許文献３）。
Kemaladewi, D. U., Maino, E., Hyatt, E., Hou, H., Ding, M., Place, K. M., Zhu, X., Bassi, P., Baghestani, Z., Deshwar, A. G., Merico, D., Xiong, H. Y., Frey, B. J., Wilson, M. D., Ivakine, E. A., Cohn, R. D. Nat Medicine. 23:8. 2017.
Prabhpreet Singh Bassi, A thesis submitted in conformity with the requirements for the degree of Master of Science, Department of Molecular Genetics, University of Toronto. 2017: Assessing the Therapeutic Potential of CRISPR/Cas9-Mediated Gene Modulation in Merosin-Deficient Congenital Muscular Dystrophy Type 1A
Dwi U. Kemaladewi, Prabhpreet S. Bassi, Steven erwood, Dhekra Al-Basha, Kinga I. Gawlik, Kyle Lindsay, elzbieta Hyatt, rebekah Kember, Kara M. Place, ryan M. Marks, Madeleine Durbeej, Steven A. Prescott, evgueni A. Ivakine & ronald D. Cohn, Nature 572, p125, 2019: A mutation-independent approach for muscular dystrophy via upregulation of a modifier gene
本発明の目的は、ヒト筋ジストロフィー（特にＭＤＣ１Ａ）の新規治療手段を提供することにある。
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８４２１７）の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ、及び転写アクチベーターとヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いることにより、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を筋肉細胞でアプレギュレートできることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含んでもよい。
［１］以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、をコードする塩基配列。
［２］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される塩基配列、又は
当該塩基配列において１～３塩基欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］転写アクチベーターが、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲ）、ｍｉｃｒｏＶＲ、及び転写活性化能を有するそれらの変異体からなる群より選択される、上記［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチド。
［４］転写アクチベーターが、ｍｉｎｉＶＲである、上記［３］に記載のポリヌクレオチド。
［５］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記［１］～［４］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［６］ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Streptococcus aureus）に由来するｄＣａｓ９である、上記［５］に記載のポリヌクレオチド。
［７］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［８］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、上記［７］に記載のポリヌクレオチド。
［９］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、上記［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、上記［７］～［９］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［１１］ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、上記［１０］に記載のポリヌクレオチド。
［１２］筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びｕｎｃ４５ｂプロモーターからなる群より選択される、上記［１０］に記載のポリヌクレオチド。
［１３］上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、上記［１３］に記載のベクター。
［１５］ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、上記［１４］に記載のベクター。
［１６］ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９およびこれらのバリアントからなる群から選択される、上記［１５］に記載のベクター。
［１７］上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクターを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤。
［１８］上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法。
［１９］ＭＤＣ１Ａの治療又は予防に使用するための、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクター。
［２０］ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクターの使用。
［２１］細胞におけるヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートする方法であって、前記細胞内で
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ
を発現させることを含む、方法。
［２２］以下を含む、リボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ。
［２３］以下を含む、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートするためのキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
［２４］以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与する工程を含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
［２５］ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下の（ｅ）及び（ｆ）の使用：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
［１］以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、をコードする塩基配列。
［２］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される塩基配列、又は
当該塩基配列において１～３塩基欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］転写アクチベーターが、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲ）、ｍｉｃｒｏＶＲ、及び転写活性化能を有するそれらの変異体からなる群より選択される、上記［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチド。
［４］転写アクチベーターが、ｍｉｎｉＶＲである、上記［３］に記載のポリヌクレオチド。
［５］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、上記［１］～［４］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［６］ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Streptococcus aureus）に由来するｄＣａｓ９である、上記［５］に記載のポリヌクレオチド。
［７］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、上記［１］～［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［８］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、上記［７］に記載のポリヌクレオチド。
［９］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、上記［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、上記［７］～［９］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［１１］ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、上記［１０］に記載のポリヌクレオチド。
［１２］筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びｕｎｃ４５ｂプロモーターからなる群より選択される、上記［１０］に記載のポリヌクレオチド。
［１３］上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、上記［１３］に記載のベクター。
［１５］ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、上記［１４］に記載のベクター。
［１６］ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９およびこれらのバリアントからなる群から選択される、上記［１５］に記載のベクター。
［１７］上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクターを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤。
［１８］上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法。
［１９］ＭＤＣ１Ａの治療又は予防に使用するための、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクター。
［２０］ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は上記［１３］～［１６］のいずれかに記載のベクターの使用。
［２１］細胞におけるヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートする方法であって、前記細胞内で
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ
を発現させることを含む、方法。
［２２］以下を含む、リボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ。
［２３］以下を含む、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートするためのキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
［２４］以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与する工程を含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
［２５］ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下の（ｅ）及び（ｆ）の使用：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明によると、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートすることができ、結果として本発明はＭＤＣ１Ａを治療することができると期待される。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
１．ポリヌクレオチド
本発明は、以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称することがある）を提供する：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ
をコードする塩基配列。
本発明のポリヌクレオチドは、所望の細胞内に導入され、転写されることにより、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質及びヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中の特定の領域を標的とするガイドＲＮＡを生じる。これら融合タンパク質及びガイドＲＮＡが複合体（以下、該複合体を「リボヌクレオプロテイン（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）」と称することがある）となって協同的に前記特定の領域に作用することにより、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の転写を活性化する。
本発明は、以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称することがある）を提供する：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ
をコードする塩基配列。
本発明のポリヌクレオチドは、所望の細胞内に導入され、転写されることにより、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質及びヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中の特定の領域を標的とするガイドＲＮＡを生じる。これら融合タンパク質及びガイドＲＮＡが複合体（以下、該複合体を「リボヌクレオプロテイン（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）」と称することがある）となって協同的に前記特定の領域に作用することにより、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の転写を活性化する。
（１）定義
本明細書において「ヒトラミニン－α１鎖（ＬＡＭＡ１）遺伝子の発現制御領域」とは、ＲＮＰがその領域へ結合することによりヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現が活性化され得る、あらゆる領域を意味する。即ち、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域とは、ＲＮＰの結合によりヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現が活性化される限り、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、エクソン等のいずれの領域に存在してもよい。本明細書中、ある特定の配列により発現制御領域を表す場合、発現制御領域とは、そのセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列の両方を含む概念である。
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによりヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中の特定の領域へリクルートされる。本明細書において、「～を標的とするガイドＲＮＡ」とは、「～へ融合タンパク質をリクルートするガイドＲＮＡ」を意味する。
本明細書において、「ガイドＲＮＡ（『ｇＲＮＡ』とも称することがある）」とは、ゲノム特異的ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」と称する）を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列（後述）の相補配列に結合するＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその５’末端に付した特定の配列（例えばＦｎＣｐｆ１の場合、配列番号６５で表されるＲＮＡ配列）からなるＲＮＡを含むＲＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその３’末端に連結されたｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称する）を含むキメラＲＮＡ（「ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と称する）を指す。（例えば、Zhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本明細書において、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中で、ｃｒＲＮＡが結合する配列に対する相補配列を「ターゲティング配列（targeting sequence）」と称する。すなわち、本明細書において、「ターゲティング配列」とは、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中に存在し、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif））が隣接するＤＮＡ配列である。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合にはターゲティング配列の５’側に隣接する。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合にはターゲティング配列の３’側に隣接する。ターゲティング配列は、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域のセンス鎖配列側及びアンチセンス鎖配列側のいずれに存在してもよい（例えば、上述のZhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本明細書において「ヒトラミニン－α１鎖（ＬＡＭＡ１）遺伝子の発現制御領域」とは、ＲＮＰがその領域へ結合することによりヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現が活性化され得る、あらゆる領域を意味する。即ち、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域とは、ＲＮＰの結合によりヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現が活性化される限り、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、エクソン等のいずれの領域に存在してもよい。本明細書中、ある特定の配列により発現制御領域を表す場合、発現制御領域とは、そのセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列の両方を含む概念である。
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによりヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中の特定の領域へリクルートされる。本明細書において、「～を標的とするガイドＲＮＡ」とは、「～へ融合タンパク質をリクルートするガイドＲＮＡ」を意味する。
本明細書において、「ガイドＲＮＡ（『ｇＲＮＡ』とも称することがある）」とは、ゲノム特異的ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」と称する）を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列（後述）の相補配列に結合するＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその５’末端に付した特定の配列（例えばＦｎＣｐｆ１の場合、配列番号６５で表されるＲＮＡ配列）からなるＲＮＡを含むＲＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその３’末端に連結されたｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称する）を含むキメラＲＮＡ（「ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と称する）を指す。（例えば、Zhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本明細書において、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中で、ｃｒＲＮＡが結合する配列に対する相補配列を「ターゲティング配列（targeting sequence）」と称する。すなわち、本明細書において、「ターゲティング配列」とは、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中に存在し、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif））が隣接するＤＮＡ配列である。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合にはターゲティング配列の５’側に隣接する。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合にはターゲティング配列の３’側に隣接する。ターゲティング配列は、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域のセンス鎖配列側及びアンチセンス鎖配列側のいずれに存在してもよい（例えば、上述のZhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
（２）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質
本発明では、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いて、それに融合させた転写アクチベーターをヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートさせる。本発明に用いられるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」と称する）としては、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートされる限り特に制限はないが、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（以下「ｄＣａｓ９」とも称することがある）又はヌクレアーゼ欠損Ｃｐｆ１（以下「ｄＣｐｆ１」とも称することがある）が挙げられる。
上記ｄＣａｓ９としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＡＧＡＡＷ（ＷはＡ又はＴ。以下同じ））、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、又は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））由来のＣａｓ９(ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡ又はＧ。以下同じ））のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、これらに限定されない（例えばNishimasu et al., Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49、Esvelt KM et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21、Zhang Y. Mol Cell. 2015 Oct 15;60(2):242-55、及びFriedland AE et al., Genome Biol. 2015 Nov 24;16:257を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、８４０番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（「ｄＳｐＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる（例えば上述のNishimasu et al., Cell. 2014を参照）。或いは、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号６６）、又は、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５５７番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号６７）（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９」と称することがある）を使用することができる（例えば上述のFriedland AE et al., Genome Biol. 2015を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
また、本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、前記ｄＣａｓ９のアミノ酸配列の一部をさらに改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。かかる改変体としては、例えば、アミノ酸配列の一部を欠失させた短縮型の改変体が挙げられる。本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、米国仮特許出願６２／６８２，２４４及び６２／７４９，８５５（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）において開示された改変体を用いることができる。具体的には、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の７２１番目～７４５番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号６８）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（例えば、該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカー（配列番号６９）で置換したものを配列番号７０で示す）、又は前記二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の４８２番目～６４８番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号７１）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカーで置換したものを配列番号７２で示す）を用いてもよい。
また、上記ｄＣｐｆ１としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴ）、アシダミノコッカス ｓｐ．（Acidaminococcus sp.）由来のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）、又はラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71、Yamano T et al., Cell. 2016 May 5;165(4):949-62、及びYamano T et al., Mol Cell. 2017 Aug 17;67(4):633-45を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、１００６番目のＧｌｕ残基をＡｌａ残基に変換した二重変異体を用いることができる（例えば、上述のZetsche B et al., Cell. 2015を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明の一態様において、ｄＣｐｆ１として、前記ｄＣｐｆ１のアミノ酸配列の一部を改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。
本発明の一態様において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としては、ｄＣａｓ９が使用され、特定の態様において、ｄＳａＣａ９が使用される。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分をコードする領域をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＰＣＲ法によって該ポリヌクレオチドを増幅することにより、クローニングすることができる。また、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、クローン化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に、公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基、及び５８０番目のＡｓｎ残基；ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基や１００６番目のＧｌｕ残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法との組み合わせにより取得することができ、さらに、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行った塩基配列として構築することもできる。
本発明では、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いて、それに融合させた転写アクチベーターをヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートさせる。本発明に用いられるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」と称する）としては、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートされる限り特に制限はないが、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（以下「ｄＣａｓ９」とも称することがある）又はヌクレアーゼ欠損Ｃｐｆ１（以下「ｄＣｐｆ１」とも称することがある）が挙げられる。
上記ｄＣａｓ９としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＡＧＡＡＷ（ＷはＡ又はＴ。以下同じ））、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、又は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））由来のＣａｓ９(ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡ又はＧ。以下同じ））のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、これらに限定されない（例えばNishimasu et al., Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49、Esvelt KM et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21、Zhang Y. Mol Cell. 2015 Oct 15;60(2):242-55、及びFriedland AE et al., Genome Biol. 2015 Nov 24;16:257を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、８４０番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（「ｄＳｐＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる（例えば上述のNishimasu et al., Cell. 2014を参照）。或いは、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号６６）、又は、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５５７番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体（配列番号６７）（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９」と称することがある）を使用することができる（例えば上述のFriedland AE et al., Genome Biol. 2015を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
また、本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、前記ｄＣａｓ９のアミノ酸配列の一部をさらに改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。かかる改変体としては、例えば、アミノ酸配列の一部を欠失させた短縮型の改変体が挙げられる。本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、米国仮特許出願６２／６８２，２４４及び６２／７４９，８５５（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）において開示された改変体を用いることができる。具体的には、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基で変換した二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の７２１番目～７４５番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号６８）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（例えば、該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカー（配列番号６９）で置換したものを配列番号７０で示す）、又は前記二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の４８２番目～６４８番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号７１）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカーで置換したものを配列番号７２で示す）を用いてもよい。
また、上記ｄＣｐｆ１としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴ）、アシダミノコッカス ｓｐ．（Acidaminococcus sp.）由来のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）、又はラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71、Yamano T et al., Cell. 2016 May 5;165(4):949-62、及びYamano T et al., Mol Cell. 2017 Aug 17;67(4):633-45を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、１００６番目のＧｌｕ残基をＡｌａ残基に変換した二重変異体を用いることができる（例えば、上述のZetsche B et al., Cell. 2015を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明の一態様において、ｄＣｐｆ１として、前記ｄＣｐｆ１のアミノ酸配列の一部を改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。
本発明の一態様において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としては、ｄＣａｓ９が使用され、特定の態様において、ｄＳａＣａ９が使用される。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分をコードする領域をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＰＣＲ法によって該ポリヌクレオチドを増幅することにより、クローニングすることができる。また、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、クローン化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に、公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基、及び５８０番目のＡｓｎ残基；ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基や１００６番目のＧｌｕ残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法との組み合わせにより取得することができ、さらに、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行った塩基配列として構築することもできる。
（３）転写アクチベーター
本発明において、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子発現の活性化は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に融合された転写アクチベーターの作用により達成される。本明細書において、「転写アクチベーター」とは、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の転写活性化能を有するタンパク質又はその機能を保持するペプチド断片を意味する。本発明に用いられる転写アクチベーターとしては、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を活性化し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ｍｉｎｉＶＲ、及びｍｉｃｒｏＶＲ、並びに転写活性化能を有するそれらの改変体等が含まれる。ＶＰ６４は、配列番号７３で表される５０アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰ１６０は、配列番号８４で表される１３１アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰＨは、ＶＰ６４と、ｐ６５と、ＨＳＦ１との融合タンパク質であり、具体的には、配列番号７４で表される３７６アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰＲは、ＶＰ６４と、ｐ６５と、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスの複製転写活性化因子（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＲＴＡ））との融合タンパク質であり、具体的には、配列番号７５で表される５２３アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰ６４、ＶＰＨ、及びＶＰＲは公知であり、例えば、Chavez A. et al., Nat Methods. 2016 Jul;13(7):563-7やChavez A. et al., Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）に詳細に開示されている。ｍｉｎｉＶＲ及びｍｉｃｒｏＶＲはＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである。ＲＴＡの転写活性化ドメインは公知であり、例えばJ Virol. 1992 Sep;66(9):5500-8等に開示され、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。具体的には、ｍｉｎｉＶＲは配列番号７６で表される１６７アミノ酸からなるペプチドによって例示され、ｍｉｃｒｏＶＲは配列番号７７で表される１４０アミノ酸からなるペプチドによって例示される。配列番号７６で表されるアミノ酸配列は、ＲＴＡの４９３～６０５位のアミノ酸残基とＶＰ６４とをＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（配列番号７８）で連結したアミノ酸配列からなる。配列番号７７で表されるアミノ酸配列は、ＲＴＡの５２０～６０５位のアミノ酸残基とＶＰ６４とをＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカーで連結したアミノ酸配列からなる。ｍｉｎｉＶＲおよびｍｉｃｒｏＶＲの詳細は、米国仮特許出願６２／７１５，４３２に記載され、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。上述のいずれの転写アクチベーターも、その転写活性化能を維持する限り、あらゆる修飾及び／又は改変が加えられていてもよい。
転写アクチベーターをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー法との組み合わせにより構築することができる。さらに、転写アクチベーターをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行ったＤＮＡ配列として構築することもできる。
転写アクチベーターをコードする塩基配列に、直接又はリンカー、ＮＬＳ（核移行シグナル）、及び／又はタグをコードする塩基配列を付加した後に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列をライゲーションすることで、転写アクチベーターとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを調製することができる。本発明において、転写アクチベーターはＮ末端又はＣ末端のいずれに融合させてもよい。また、リンカーとしては、アミノ酸数が２から５０個程度のリンカーを用いることができ、具体的には、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）が交互に連結したＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子発現の活性化は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に融合された転写アクチベーターの作用により達成される。本明細書において、「転写アクチベーター」とは、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の転写活性化能を有するタンパク質又はその機能を保持するペプチド断片を意味する。本発明に用いられる転写アクチベーターとしては、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を活性化し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ｍｉｎｉＶＲ、及びｍｉｃｒｏＶＲ、並びに転写活性化能を有するそれらの改変体等が含まれる。ＶＰ６４は、配列番号７３で表される５０アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰ１６０は、配列番号８４で表される１３１アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰＨは、ＶＰ６４と、ｐ６５と、ＨＳＦ１との融合タンパク質であり、具体的には、配列番号７４で表される３７６アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰＲは、ＶＰ６４と、ｐ６５と、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスの複製転写活性化因子（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＲＴＡ））との融合タンパク質であり、具体的には、配列番号７５で表される５２３アミノ酸からなるペプチドによって例示される。ＶＰ６４、ＶＰＨ、及びＶＰＲは公知であり、例えば、Chavez A. et al., Nat Methods. 2016 Jul;13(7):563-7やChavez A. et al., Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）に詳細に開示されている。ｍｉｎｉＶＲ及びｍｉｃｒｏＶＲはＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化ドメインを含むペプチドである。ＲＴＡの転写活性化ドメインは公知であり、例えばJ Virol. 1992 Sep;66(9):5500-8等に開示され、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。具体的には、ｍｉｎｉＶＲは配列番号７６で表される１６７アミノ酸からなるペプチドによって例示され、ｍｉｃｒｏＶＲは配列番号７７で表される１４０アミノ酸からなるペプチドによって例示される。配列番号７６で表されるアミノ酸配列は、ＲＴＡの４９３～６０５位のアミノ酸残基とＶＰ６４とをＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（配列番号７８）で連結したアミノ酸配列からなる。配列番号７７で表されるアミノ酸配列は、ＲＴＡの５２０～６０５位のアミノ酸残基とＶＰ６４とをＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカーで連結したアミノ酸配列からなる。ｍｉｎｉＶＲおよびｍｉｃｒｏＶＲの詳細は、米国仮特許出願６２／７１５，４３２に記載され、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。上述のいずれの転写アクチベーターも、その転写活性化能を維持する限り、あらゆる修飾及び／又は改変が加えられていてもよい。
転写アクチベーターをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー法との組み合わせにより構築することができる。さらに、転写アクチベーターをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行ったＤＮＡ配列として構築することもできる。
転写アクチベーターをコードする塩基配列に、直接又はリンカー、ＮＬＳ（核移行シグナル）、及び／又はタグをコードする塩基配列を付加した後に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列をライゲーションすることで、転写アクチベーターとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを調製することができる。本発明において、転写アクチベーターはＮ末端又はＣ末端のいずれに融合させてもよい。また、リンカーとしては、アミノ酸数が２から５０個程度のリンカーを用いることができ、具体的には、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）が交互に連結したＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
（４）ガイドＲＮＡ
本発明において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質のヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域へのリクルートは、ガイドＲＮＡにより達成される。前記「（１）定義」の項に記載の通り、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、該ｃｒＲＮＡはターゲティング配列の相補配列に結合する。ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列の相補配列と完全に相補的でなくてもよく、少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
ターゲティング配列は、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、公開されているｇＲＮＡ設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPR direct等）を用いて設定することが出来る。具体的には、目的遺伝子（即ち、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子）の配列の中から、ＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、ＮＮＧＲＲＴ）が３’側に隣接している約２０ヌクレオチド長の候補ターゲティング配列をリストアップし、これらの候補ターゲティング配列の中から、ヒトのゲノム中のオフターゲットサイト数が少ないものをターゲティング配列として使用することができる。ターゲティング配列の塩基長は、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長である。オフターゲットサイト数の予測をする一次スクリーニングとして、多数のバイオインフォマティクスツールが公知且つ公衆に利用可能であり、最もオフターゲット効果が小さいターゲティング配列を予測するために使用することができる。Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（https://benchling.com）やＣＯＳＭＩＤ（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions）（インターネット上のhttps://crispr.bme.gatech.eduで利用可能）等のバイオインフォマティクスツールが例示され、これらによりｇＲＮＡが標的とする塩基配列に対する類似性をまとめることができる。使用するｇＲＮＡ設計ソフトウェアに対象ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補ターゲティング配列の３’側の８～１２ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いシード（ｓｅｅｄ）配列）について、対象のゲノムに対してＢｌａｓｔ検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
本発明の一態様において、ヒト染色体１８番（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する領域中、以下の領域が、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域となり得る。ここの領域はヒストンの修飾パターンにより発現制御領域であることが強く示唆される領域である。よって、本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体１８（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する以下の領域中、少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる：
（１）７，１１５，０００－７，１１８，０００．
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される塩基配列とすることができる。
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体１８（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する以下の領域の少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長とすることができる：
（２）７，０３６，０００－７，０４２，０００．
（３）７，０８３，０００－７，０８７，０００
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、配列番号１２４で表される塩基配列とすることができる。
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体１８（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する以下の領域の少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長とすることができる：
（４）７，１１８，０００－７，１３３，０００
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される塩基配列とすることができる。本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ターゲティング配列と同じ塩基配列であり得る。例えば、配列番号１５で表されるターゲティング配列（ＴＣＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＧ）をｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として細胞に導入した場合、係る配列から転写されるｃｒＲＮＡはＵＣＵＣＧＣＣＵＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＵＣＧ（配列番号７９）となり、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中に存在する、配列番号１５で表される塩基配列の相補配列であるＣＧＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＧＡ（配列番号８０）に結合する。別の態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ターゲティング配列に対して少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を使用することができる。よって、本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号１５、２０、２５、５０、５６、若しくは６１で表される塩基配列、又は１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたそのような塩基配列を使用し得る。本発明の別の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号１２４で表される塩基配列、又は１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたそのような塩基配列を使用し得る。本発明のさらなる別の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号１７８、１９３、若しくは１９５で表される塩基配列、又は１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたそのような塩基配列を使用し得る。
ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣｐｆ１を用いる場合、５’末端に特定のＲＮＡを付したｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として設計することができる。このようなｃｒＲＮＡの５’末端に付するＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣｐｆ１に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＦｎＣｐｆ１を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列としては、ターゲティング配列の５’側に配列番８１；ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴを付した塩基配列を用いることができる（ＲＮＡに転写されると、下線部の配列同士が塩基対を形成しステム－ループ構造をとる）。このような５’末端に付する配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣｐｆ１タンパク質に対して一般的に使用される配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
また、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端に既知のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列として設計することが出来る。このようなｔｒａｃｒＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣａｓ９に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＳａＣａｓ９を用いる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として、配列番号８２で表される塩基配列が使用される。ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣａｓ９タンパク質に対して一般的に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡをコードする塩基配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
このように設計されたｇＲＮＡをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成方法を用いて、化学的に合成することができる。
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、異なるｃｒＲＮＡを有する２種以上のｇＲＮＡを含んでもよい。
本発明において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質のヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域へのリクルートは、ガイドＲＮＡにより達成される。前記「（１）定義」の項に記載の通り、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、該ｃｒＲＮＡはターゲティング配列の相補配列に結合する。ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列の相補配列と完全に相補的でなくてもよく、少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
ターゲティング配列は、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、公開されているｇＲＮＡ設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPR direct等）を用いて設定することが出来る。具体的には、目的遺伝子（即ち、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子）の配列の中から、ＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、ＮＮＧＲＲＴ）が３’側に隣接している約２０ヌクレオチド長の候補ターゲティング配列をリストアップし、これらの候補ターゲティング配列の中から、ヒトのゲノム中のオフターゲットサイト数が少ないものをターゲティング配列として使用することができる。ターゲティング配列の塩基長は、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長である。オフターゲットサイト数の予測をする一次スクリーニングとして、多数のバイオインフォマティクスツールが公知且つ公衆に利用可能であり、最もオフターゲット効果が小さいターゲティング配列を予測するために使用することができる。Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（https://benchling.com）やＣＯＳＭＩＤ（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions）（インターネット上のhttps://crispr.bme.gatech.eduで利用可能）等のバイオインフォマティクスツールが例示され、これらによりｇＲＮＡが標的とする塩基配列に対する類似性をまとめることができる。使用するｇＲＮＡ設計ソフトウェアに対象ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補ターゲティング配列の３’側の８～１２ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いシード（ｓｅｅｄ）配列）について、対象のゲノムに対してＢｌａｓｔ検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
本発明の一態様において、ヒト染色体１８番（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する領域中、以下の領域が、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域となり得る。ここの領域はヒストンの修飾パターンにより発現制御領域であることが強く示唆される領域である。よって、本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体１８（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する以下の領域中、少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長の塩基配列とすることができる：
（１）７，１１５，０００－７，１１８，０００．
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される塩基配列とすることができる。
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体１８（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する以下の領域の少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長とすることができる：
（２）７，０３６，０００－７，０４２，０００．
（３）７，０８３，０００－７，０８７，０００
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、配列番号１２４で表される塩基配列とすることができる。
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト染色体１８（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する以下の領域の少なくとも１つの領域にある１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長とすることができる：
（４）７，１１８，０００－７，１３３，０００
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される塩基配列とすることができる。本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ターゲティング配列と同じ塩基配列であり得る。例えば、配列番号１５で表されるターゲティング配列（ＴＣＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＧ）をｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として細胞に導入した場合、係る配列から転写されるｃｒＲＮＡはＵＣＵＣＧＣＣＵＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＵＣＧ（配列番号７９）となり、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域中に存在する、配列番号１５で表される塩基配列の相補配列であるＣＧＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＧＡ（配列番号８０）に結合する。別の態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ターゲティング配列に対して少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を使用することができる。よって、本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号１５、２０、２５、５０、５６、若しくは６１で表される塩基配列、又は１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたそのような塩基配列を使用し得る。本発明の別の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号１２４で表される塩基配列、又は１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたそのような塩基配列を使用し得る。本発明のさらなる別の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号１７８、１９３、若しくは１９５で表される塩基配列、又は１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたそのような塩基配列を使用し得る。
ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣｐｆ１を用いる場合、５’末端に特定のＲＮＡを付したｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として設計することができる。このようなｃｒＲＮＡの５’末端に付するＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣｐｆ１に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＦｎＣｐｆ１を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列としては、ターゲティング配列の５’側に配列番８１；ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴを付した塩基配列を用いることができる（ＲＮＡに転写されると、下線部の配列同士が塩基対を形成しステム－ループ構造をとる）。このような５’末端に付する配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣｐｆ１タンパク質に対して一般的に使用される配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
また、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端に既知のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列として設計することが出来る。このようなｔｒａｃｒＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣａｓ９に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＳａＣａｓ９を用いる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として、配列番号８２で表される塩基配列が使用される。ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣａｓ９タンパク質に対して一般的に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡをコードする塩基配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
このように設計されたｇＲＮＡをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成方法を用いて、化学的に合成することができる。
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、異なるｃｒＲＮＡを有する２種以上のｇＲＮＡを含んでもよい。
（５）プロモーター配列
本発明の一態様において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列及び／又はｇＲＮＡをコードする塩基配列のそれぞれの上流部分に、プロモーター配列が作動可能に連結されていてもよい。連結され得るプロモーターとしては、対象の細胞内においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、該融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。ｇＲＮＡをコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーターである、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びｔＲＮＡプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、前記融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、筋特異的なプロモーターを使用することができる。かかる筋特異的なプロモーターとしては、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、心筋トロポニンＣプロモーター、αアクチンプロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ(ＭＨＣＫ)プロモーター、ミオシン軽鎖２Ａプロモーター、ジストロフィンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３４８ＭＣＫプロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、Ｍｙｆ５プロモーター、ＭＬＣ１／３ｆプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、Ｍｙｏｇプロモーター、Ｐａｘ７プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない（筋特異的プロモーターの詳細は、例えばＵＳ２０１１／０２１２５２９Ａ、McCarthy JJ et al., Skeletal Muscle.2012 May;2(1):8、およびWang B.et al., Gene Ther.2008 Nov;15(22):1489-99等を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本発明の一態様において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列及び／又はｇＲＮＡをコードする塩基配列のそれぞれの上流部分に、プロモーター配列が作動可能に連結されていてもよい。連結され得るプロモーターとしては、対象の細胞内においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、該融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。ｇＲＮＡをコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーターである、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びｔＲＮＡプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、前記融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、筋特異的なプロモーターを使用することができる。かかる筋特異的なプロモーターとしては、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ９プロモーター、心筋トロポニンＣプロモーター、αアクチンプロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ(ＭＨＣＫ)プロモーター、ミオシン軽鎖２Ａプロモーター、ジストロフィンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３４８ＭＣＫプロモーター、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、Ｍｙｆ５プロモーター、ＭＬＣ１／３ｆプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、Ｍｙｏｇプロモーター、Ｐａｘ７プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない（筋特異的プロモーターの詳細は、例えばＵＳ２０１１／０２１２５２９Ａ、McCarthy JJ et al., Skeletal Muscle.2012 May;2(1):8、およびWang B.et al., Gene Ther.2008 Nov;15(22):1489-99等を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
（６）その他の塩基配列
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列が転写されて生じるｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる目的で、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列等の公知の配列をさらに含んでもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードする塩基配列、ＮＬＳをコードする塩基配列、及び／又はタグをコードする塩基配列を含んでもよい。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列が転写されて生じるｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる目的で、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列等の公知の配列をさらに含んでもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードする塩基配列、ＮＬＳをコードする塩基配列、及び／又はタグをコードする塩基配列を含んでもよい。
２．ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）を提供する。本発明のベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。
本発明のベクターがプラスミドベクターである場合、使用されるプラスミドベクターとしては、特に限定されず、クローニングプラスミドベクターや発現プラスミドベクター等のあらゆるプラスミドベクターであってよい。当該プラスミドベクターは、公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドをプラスミドベクターに挿入することにより調製される。
本発明のベクターがウイルスベクターである場合、使用されるウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない。尚、本明細書において「ウイルスベクター（virus vector）」又は「ウイルスベクター（viral vector）」には、その派生物も含まれる。遺伝子治療における利用を考慮すれば、導入遺伝子を長期にわたり発現させられる点や非病原性ウイルス由来で安全性が高い等の理由から、ＡＡＶベクターが好適に用いられる。
本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、公知の方法により調製することができる。簡潔には、本発明のポリヌクレオチドを挿入したウイルス発現用プラスミドベクターを調製し、これを適切な宿主細胞にトランスフェクトし、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを一過性に産生させ、該ウイルスベクターを回収する。
本発明の一態様において、ＡＡＶベクターを用いる場合、ＡＡＶベクターの血清型としては、対象においてヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を活性化できる限り特に限定されず、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ１０及び派生物等のいずれを用いてもよい（ＡＡＶの多様な血清型に関してはＷＯ２００５／０３３３２１を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。尚、ＡＡＶの派生物としては、例えば、キャプシド改変した新規血清型（例えば、ＷＯ２０１２／０５７３６３、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等が挙げられるが、これに限定されない。
ＡＡＶベクターを調製する一例では、まず、野生型のＡＡＶのゲノム配列のうち両端の末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ(ＩＴＲ)）と、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡの代わりに挿入された、本発明のポリヌクレオチドとを含むベクタープラスミドを作製する。一方で、ウイルス粒子の形成に必要とされるＲｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡは、別のプラスミドに挿入する。さらに、ＡＡＶの増殖に必要なアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、及びＥ４ｏｒｆ６）を含むプラスミドを、アデノウイルスヘルパープラスミドとして作製する。これら３種のプラスミドを、宿主細胞にコトランスフェクションすることにより、該細胞内において組換えＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生されるようになる。宿主細胞としては、前記ヘルパー作用を担う遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）のうちの一部を供給し得る細胞（例えば、２９３細胞等）を用いることが好ましく、そのような細胞を用いる場合には、該宿主細胞より供給され得るタンパク質をコードする遺伝子を、前記アデノウイルスヘルパープラスミドに搭載する必要がない。産生されたＡＡＶベクターは核内に存在するため、宿主細胞を凍結融解して細胞を破壊することでウイルスを回収し、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法やカラム法等により、ウイルス画分の分離及び精製を行うことにより、所望のＡＡＶベクターが調製される。
ＡＡＶベクターは、安全性や遺伝子導入効率等の点から大きな利点があり、遺伝子治療に利用されている。しかしながら、ＡＡＶベクターに搭載可能なポリヌクレオチドのサイズに制限があることが知られている。例えば、本発明の一態様である、ｄＳａＣａｓ９とｍｉｎｉＶＲまたはｍｉｃｒｏＶＲとの融合タンパク質をコードする塩基配列、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域を標的とするｇＲＮＡをコードする塩基配列、並びにプロモーター配列としてＥＦＳプロモーター配列及びＵ６プロモーター配列を含むポリヌクレオチドの塩基長と、ＩＴＲ部とを含む全長は、約４.８５ｋｂであるので、単一のＡＡＶベクターに搭載することが出来る。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）を提供する。本発明のベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。
本発明のベクターがプラスミドベクターである場合、使用されるプラスミドベクターとしては、特に限定されず、クローニングプラスミドベクターや発現プラスミドベクター等のあらゆるプラスミドベクターであってよい。当該プラスミドベクターは、公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドをプラスミドベクターに挿入することにより調製される。
本発明のベクターがウイルスベクターである場合、使用されるウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない。尚、本明細書において「ウイルスベクター（virus vector）」又は「ウイルスベクター（viral vector）」には、その派生物も含まれる。遺伝子治療における利用を考慮すれば、導入遺伝子を長期にわたり発現させられる点や非病原性ウイルス由来で安全性が高い等の理由から、ＡＡＶベクターが好適に用いられる。
本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、公知の方法により調製することができる。簡潔には、本発明のポリヌクレオチドを挿入したウイルス発現用プラスミドベクターを調製し、これを適切な宿主細胞にトランスフェクトし、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを一過性に産生させ、該ウイルスベクターを回収する。
本発明の一態様において、ＡＡＶベクターを用いる場合、ＡＡＶベクターの血清型としては、対象においてヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を活性化できる限り特に限定されず、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ１０及び派生物等のいずれを用いてもよい（ＡＡＶの多様な血清型に関してはＷＯ２００５／０３３３２１を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。尚、ＡＡＶの派生物としては、例えば、キャプシド改変した新規血清型（例えば、ＷＯ２０１２／０５７３６３、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等が挙げられるが、これに限定されない。
ＡＡＶベクターを調製する一例では、まず、野生型のＡＡＶのゲノム配列のうち両端の末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ(ＩＴＲ)）と、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡの代わりに挿入された、本発明のポリヌクレオチドとを含むベクタープラスミドを作製する。一方で、ウイルス粒子の形成に必要とされるＲｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡは、別のプラスミドに挿入する。さらに、ＡＡＶの増殖に必要なアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、及びＥ４ｏｒｆ６）を含むプラスミドを、アデノウイルスヘルパープラスミドとして作製する。これら３種のプラスミドを、宿主細胞にコトランスフェクションすることにより、該細胞内において組換えＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生されるようになる。宿主細胞としては、前記ヘルパー作用を担う遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）のうちの一部を供給し得る細胞（例えば、２９３細胞等）を用いることが好ましく、そのような細胞を用いる場合には、該宿主細胞より供給され得るタンパク質をコードする遺伝子を、前記アデノウイルスヘルパープラスミドに搭載する必要がない。産生されたＡＡＶベクターは核内に存在するため、宿主細胞を凍結融解して細胞を破壊することでウイルスを回収し、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法やカラム法等により、ウイルス画分の分離及び精製を行うことにより、所望のＡＡＶベクターが調製される。
ＡＡＶベクターは、安全性や遺伝子導入効率等の点から大きな利点があり、遺伝子治療に利用されている。しかしながら、ＡＡＶベクターに搭載可能なポリヌクレオチドのサイズに制限があることが知られている。例えば、本発明の一態様である、ｄＳａＣａｓ９とｍｉｎｉＶＲまたはｍｉｃｒｏＶＲとの融合タンパク質をコードする塩基配列、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域を標的とするｇＲＮＡをコードする塩基配列、並びにプロモーター配列としてＥＦＳプロモーター配列及びＵ６プロモーター配列を含むポリヌクレオチドの塩基長と、ＩＴＲ部とを含む全長は、約４.８５ｋｂであるので、単一のＡＡＶベクターに搭載することが出来る。
３．ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤（以下、「本発明の剤」と称することがある）を提供する。
本発明の剤は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを有効成分として含み、かかる有効成分（即ち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクター）と、通常、医薬的に許容される担体を含む製剤として調製され得る。
本発明の剤は、非経口に投与され、また局所的又は全身的に投与され得る。本発明の剤は、限定するものではないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与することができる。
本発明の剤の対象への投与量は、治療及び／又は予防有効量である限り特に限定されない。有効成分、剤形、対象の年齢及び体重、投与スケジュール、並びに投与方法等に応じて適宜最適化すればよい。
本発明の一態様において、本発明の剤は、ＭＤＣ１Ａに罹患している対象だけでなく、遺伝的バックグラウンド解析等に基づき、将来的にＭＤＣ１Ａを発症する可能性のある対象に対して予防的に投与することもできる。また、本明細書における「治療」との用語には、疾患の治癒に加えて、疾患の寛解も含まれ得る。また、「予防」との用語には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせることも含まれ得る。また、本発明の剤は、「本発明の医薬組成物」等とも言い換えることができる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤（以下、「本発明の剤」と称することがある）を提供する。
本発明の剤は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを有効成分として含み、かかる有効成分（即ち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクター）と、通常、医薬的に許容される担体を含む製剤として調製され得る。
本発明の剤は、非経口に投与され、また局所的又は全身的に投与され得る。本発明の剤は、限定するものではないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与することができる。
本発明の剤の対象への投与量は、治療及び／又は予防有効量である限り特に限定されない。有効成分、剤形、対象の年齢及び体重、投与スケジュール、並びに投与方法等に応じて適宜最適化すればよい。
本発明の一態様において、本発明の剤は、ＭＤＣ１Ａに罹患している対象だけでなく、遺伝的バックグラウンド解析等に基づき、将来的にＭＤＣ１Ａを発症する可能性のある対象に対して予防的に投与することもできる。また、本明細書における「治療」との用語には、疾患の治癒に加えて、疾患の寛解も含まれ得る。また、「予防」との用語には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせることも含まれ得る。また、本発明の剤は、「本発明の医薬組成物」等とも言い換えることができる。
４．ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。また、本発明には、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが含まれる。さらに、本発明には、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターの使用が含まれる。
本発明の方法は、上述した本発明の剤をＭＤＣ１Ａを罹患する対象に投与することにより実施することができ、その投与量、投与経路、対象等は上記したものと同一である。
症状の測定は本発明の方法を用いた治療の開始前に行ってよく、また、治療に対する対象の応答を判定するための治療後の任意のタイミングでおこなってよい。
本発明の方法により、対象の骨格筋及び／又は心筋の機能が改善され得る。機能が改善される筋肉としては、特に限定はなく、あらゆる筋肉又は筋肉群が例示される。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。また、本発明には、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが含まれる。さらに、本発明には、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターの使用が含まれる。
本発明の方法は、上述した本発明の剤をＭＤＣ１Ａを罹患する対象に投与することにより実施することができ、その投与量、投与経路、対象等は上記したものと同一である。
症状の測定は本発明の方法を用いた治療の開始前に行ってよく、また、治療に対する対象の応答を判定するための治療後の任意のタイミングでおこなってよい。
本発明の方法により、対象の骨格筋及び／又は心筋の機能が改善され得る。機能が改善される筋肉としては、特に限定はなく、あらゆる筋肉又は筋肉群が例示される。
５．リボヌクレオプロテイン
本発明は、以下を含む、リボヌクレオプロテイン（以下、「本発明のＲＮＰ」と称することがある。）を提供する：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域
を標的とするガイドＲＮＡ。
本発明のＲＮＰに含まれるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、およびガイドＲＮＡとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」の項目において詳細に説明される、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、およびガイドＲＮＡを使用することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞や細菌、その他の生物体に導入して発現させることにより、あるいは該ポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムにより作製することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、例えば、化学的に合成するか、あるいはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムを用いて作製することができる。このようにして作製されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合することで、本発明のＲＮＰを調製することができる。必要に応じて、金粒子などの他の物質を混合してもよい。本発明のＲＮＰを標的細胞や組織等に直接送達するために、公知の方法により、該ＲＮＰは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化してもよい。本発明のＲＮＰは、公知の方法により、標的細胞や組織等に導入することができる。ＬＮＰへのカプセル化や導入方法については、例えばLee K., et al., Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901, 及びＷＯ ２０１６／１５３０１２（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を参酌することができる。
本発明の一態様において、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、ヒト染色体１８番（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する領域中、以下の領域の少なくとも１つにある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長を標的とする：
（１）７，１１５，０００－７，１１８，０００。
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される配列の全て又は一部を含む領域を標的とする。
（２）７，０３６，０００－７，０４２，０００．
（３）７，０８３，０００－７，０８７，０００
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１２４で表される配列の全て又は一部を含む領域を標的とする。
（４）７，１１８，０００－７，１３３，０００．
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１７８、１９３，又は１９５で表される配列の全て又は一部を含む領域を標的とする。
本発明は、以下を含む、リボヌクレオプロテイン（以下、「本発明のＲＮＰ」と称することがある。）を提供する：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域
を標的とするガイドＲＮＡ。
本発明のＲＮＰに含まれるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、およびガイドＲＮＡとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」の項目において詳細に説明される、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、およびガイドＲＮＡを使用することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞や細菌、その他の生物体に導入して発現させることにより、あるいは該ポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムにより作製することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、例えば、化学的に合成するか、あるいはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムを用いて作製することができる。このようにして作製されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合することで、本発明のＲＮＰを調製することができる。必要に応じて、金粒子などの他の物質を混合してもよい。本発明のＲＮＰを標的細胞や組織等に直接送達するために、公知の方法により、該ＲＮＰは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化してもよい。本発明のＲＮＰは、公知の方法により、標的細胞や組織等に導入することができる。ＬＮＰへのカプセル化や導入方法については、例えばLee K., et al., Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901, 及びＷＯ ２０１６／１５３０１２（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を参酌することができる。
本発明の一態様において、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、ヒト染色体１８番（Ｃｈｒ１８）のＧＲＣｈ３８．ｐ１３ポジションに存在する領域中、以下の領域の少なくとも１つにある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長を標的とする：
（１）７，１１５，０００－７，１１８，０００。
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される配列の全て又は一部を含む領域を標的とする。
（２）７，０３６，０００－７，０４２，０００．
（３）７，０８３，０００－７，０８７，０００
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１２４で表される配列の全て又は一部を含む領域を標的とする。
（４）７，１１８，０００－７，１３３，０００．
１つの態様において、当該ガイドＲＮＡは、配列番号１７８、１９３，又は１９５で表される配列の全て又は一部を含む領域を標的とする。
６．その他
本発明はまた、以下を含む、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を活性化するための組成物又はキットを提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、
を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、
を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
これらの発明で使用されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、ガイドＲＮＡ、並びにこれらをコードするポリヌクレオチド及びそれらが搭載されるベクターとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」、「２．ベクター」や「５．リボヌクレオプロテイン」の項目において詳細に説明されるものが使用できる。上記（ｅ）及び（ｆ）の投与量、投与経路、対象、製剤等は「３．ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤」の項目において説明したものと同様である。
本発明はまた、以下を含む、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現を活性化するための組成物又はキットを提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、
を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、
を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
これらの発明で使用されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写アクチベーター、ガイドＲＮＡ、並びにこれらをコードするポリヌクレオチド及びそれらが搭載されるベクターとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」、「２．ベクター」や「５．リボヌクレオプロテイン」の項目において詳細に説明されるものが使用できる。上記（ｅ）及び（ｆ）の投与量、投与経路、対象、製剤等は「３．ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤」の項目において説明したものと同様である。
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために与えられた以下の例示的な態様の記載によって明らかになるであろうが、それらに限定されることを意図するものではない。
実験方法
ＬＡＭＡ１ターゲティング配列の選択
ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、さらに２つのヒトＬＡＭＡ１遺伝子の推定遺伝子制御領域（Ｒ１及びＲ２）をスキャンし、本明細書でターゲティング配列として定義されているｇＲＮＡと複合化した触媒的に不活性なＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９）によって標的化される配列を探した。ＬＡＭＡ１遺伝子に対する標的ゲノム領域の位置を図１に示し、その座標を以下に示す：
１．Ｃｈｒ１８：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；７，０３６，０００－７，０４２，０００－＞～６ｋｂ（Ｒ１）
２．Ｃｈｒ１８：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；７，０８３，０００－７，０８７，０００－＞～４ｋｂ（Ｒ２）
ＬＡＭＡ１ターゲティング配列の選択
ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、さらに２つのヒトＬＡＭＡ１遺伝子の推定遺伝子制御領域（Ｒ１及びＲ２）をスキャンし、本明細書でターゲティング配列として定義されているｇＲＮＡと複合化した触媒的に不活性なＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９）によって標的化される配列を探した。ＬＡＭＡ１遺伝子に対する標的ゲノム領域の位置を図１に示し、その座標を以下に示す：
１．Ｃｈｒ１８：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；７，０３６，０００－７，０４２，０００－＞～６ｋｂ（Ｒ１）
２．Ｃｈｒ１８：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；７，０８３，０００－７，０８７，０００－＞～４ｋｂ（Ｒ２）
ターゲティング配列は，配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する２１ヌクレオチドセグメント（５’－２１ｎｔターゲティング配列－ＮＮＧＲＲＴ－３’）で特定した（表１）。
さらに、ヒトＬＡＭＡ1 ＴＳＳ部位の上流およそ１５ｋｂの領域もスキャンしてカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ゲノムの対応する領域と完全に一致するもの（ターゲティング配列とＰＡＭ配列）のみを選んだ。ＬＡＭＡ１遺伝子に対する標的ゲノム領域の位置を図１に示し、その座標を以下に示す。
Ｃｈｒ１８：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；７，１１８，０００－７，１３３，０００－＞～１５ｋｂ（ｃｙｎｏ－マッチ）
Ｃｈｒ１８：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；７，１１８，０００－７，１３３，０００－＞～１５ｋｂ（ｃｙｎｏ－マッチ）
表１ ＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域のスクリーニングに使用したターゲティング配列
表１において、「位置」は、ＳａＣａｓ９を使用した場合の、示されたすべてのｇＲＮＡに対するＳａＣａｓ9の切断候補部位を示す。
配列番号１～６１はＴＳＳ領域に位置し、配列番号８５～１１３はＲ１領域に位置し、配列番号１１４～１２９はＲ２領域に位置し、そして配列番号１３０～２２１はcyno-マッチ領域に位置する（図１）。
配列番号１～６１はＴＳＳ領域に位置し、配列番号８５～１１３はＲ１領域に位置し、配列番号１１４～１２９はＲ２領域に位置し、そして配列番号１３０～２２１はcyno-マッチ領域に位置する（図１）。
レンチウイルス導入プラスミド（ｐＥＤ１７６及び派生プラスミド）の構築
ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（https://www.genscript.com）から購入し、以下の変更を加えた：ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列をＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列に置き換え；ＳｐＣａｓ９－ＦＬＡＧをコドン最適化ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲとも称される）に融合したｄＳａＣａｓ９に置き換えた。ＶＰ６４－ＭｉｎｉＲＴＡの転写活性化ドメインは、プロモーターに局在すると、転写を活性化をすることで遺伝子発現を活性化することができる。ＶＰ６４－ＭｉｎｉＲＴＡはｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体）のＣ末端に結合され（以下、ｄＳａＣａｓ９－ＶＲと称する）、そして、ターゲティング配列によって指示されるように、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の制御領域にターゲティングされる（表１、図１）。調製したバックボーンプラスミドはｐＥＤ１７６と名付けた。ｍｉｎｉ－ＶＲを他の活性化ドメインであるＶＰ６４－ＥＢＮＡ２、ＶＰ１６０、ＶＰ６４－ｎａｎｏＲＴＡ、ＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡに置き換えた派生プラスミドも調製した。
ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（https://www.genscript.com）から購入し、以下の変更を加えた：ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列をＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列に置き換え；ＳｐＣａｓ９－ＦＬＡＧをコドン最適化ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲとも称される）に融合したｄＳａＣａｓ９に置き換えた。ＶＰ６４－ＭｉｎｉＲＴＡの転写活性化ドメインは、プロモーターに局在すると、転写を活性化をすることで遺伝子発現を活性化することができる。ＶＰ６４－ＭｉｎｉＲＴＡはｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体）のＣ末端に結合され（以下、ｄＳａＣａｓ９－ＶＲと称する）、そして、ターゲティング配列によって指示されるように、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の制御領域にターゲティングされる（表１、図１）。調製したバックボーンプラスミドはｐＥＤ１７６と名付けた。ｍｉｎｉ－ＶＲを他の活性化ドメインであるＶＰ６４－ＥＢＮＡ２、ＶＰ１６０、ＶＰ６４－ｎａｎｏＲＴＡ、ＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡに置き換えた派生プラスミドも調製した。
ｇＲＮＡクローニング
３つのコントロールノンターゲティングターゲティング配列と１６４のターゲティング配列（表１）をｐＥＤ１７６にクローニングした。フォワードおよびリバースオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により以下のフォーマットで合成された；フォワード；５’ＣＡＣＣ（Ｇ）－２０塩基対ターゲティング配列－３’、及びリバース；５’ＡＡＡＣ－１９～２１塩基対の逆相補ターゲティング配列－（Ｃ）－３’（ターゲットがＧで始まらない場合は括弧内の塩基が追加された）。オリゴはトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に１００μＭで再懸濁した。各相補オリゴ１μｌをＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（ＮＥＢカタログ番号：Ｂ７２０３Ｓ）で１０μｌの反応液（reaction）に添加した（combined）。この反応液を９５℃まで加熱し、サーモサイクラーで２５℃まで冷却することで、ｐＥＤ１７６へのクローニングに適合する粘着末端オーバーハングを持つオリゴをアニーリングした。アニーリングしたオリゴを、ＢｓｍＢＩで消化してゲル精製したレンチウイルス導入プラスミドｐＥＤ１７６とあわせ、製造元のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢカタログ番号：Ｍ０２０２Ｓ）でライゲーションした。２μｌのライゲーション反応液で、製造元のプロトコールに従って、１０μｌのＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（ＮＥＢカタログ番号：Ｃ３０４０Ｉ）を形質転換した。このようにして得られたコンストラクトは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号８３）と融合した個々のターゲティング配列によってコードされているｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの発現をＵ６プロモーターによって駆動する。
３つのコントロールノンターゲティングターゲティング配列と１６４のターゲティング配列（表１）をｐＥＤ１７６にクローニングした。フォワードおよびリバースオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により以下のフォーマットで合成された；フォワード；５’ＣＡＣＣ（Ｇ）－２０塩基対ターゲティング配列－３’、及びリバース；５’ＡＡＡＣ－１９～２１塩基対の逆相補ターゲティング配列－（Ｃ）－３’（ターゲットがＧで始まらない場合は括弧内の塩基が追加された）。オリゴはトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に１００μＭで再懸濁した。各相補オリゴ１μｌをＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（ＮＥＢカタログ番号：Ｂ７２０３Ｓ）で１０μｌの反応液（reaction）に添加した（combined）。この反応液を９５℃まで加熱し、サーモサイクラーで２５℃まで冷却することで、ｐＥＤ１７６へのクローニングに適合する粘着末端オーバーハングを持つオリゴをアニーリングした。アニーリングしたオリゴを、ＢｓｍＢＩで消化してゲル精製したレンチウイルス導入プラスミドｐＥＤ１７６とあわせ、製造元のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢカタログ番号：Ｍ０２０２Ｓ）でライゲーションした。２μｌのライゲーション反応液で、製造元のプロトコールに従って、１０μｌのＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（ＮＥＢカタログ番号：Ｃ３０４０Ｉ）を形質転換した。このようにして得られたコンストラクトは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号８３）と融合した個々のターゲティング配列によってコードされているｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの発現をＵ６プロモーターによって駆動する。
レンチウイルス調製
ＨＥＫ２９３ＴＡ細胞を６ウェル細胞培養皿（ＶＷＲカタログ番号：１００６２－８９２）に０．７５ｘ１０６細胞／ウェルで播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地）中で、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ ｄｅｌｔａ Ｒ８．２； ａｄｄｇｅｎｅ ＃ １２２６３を参照）と０．５μｇのエンベロープ発現プラスミド（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ； ａｄｄｇｅｎｅ ＃ ８４５４を参照）］、およびｄＳａＣａｓ９－ＶＲと示されたｓｇＲＮＡをコードする配列を含む導入プラスミド１μｇを用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮトランスフェクション反応を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８時間後に、０．４５μＭのＰＥＳフィルター（ＶＷＲ カタログ番号：１０２１８－４８８）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。精製して分注したレンチウイルスは、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。
ＨＥＫ２９３ＴＡ細胞を６ウェル細胞培養皿（ＶＷＲカタログ番号：１００６２－８９２）に０．７５ｘ１０６細胞／ウェルで播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地）中で、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ ｄｅｌｔａ Ｒ８．２； ａｄｄｇｅｎｅ ＃ １２２６３を参照）と０．５μｇのエンベロープ発現プラスミド（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ； ａｄｄｇｅｎｅ ＃ ８４５４を参照）］、およびｄＳａＣａｓ９－ＶＲと示されたｓｇＲＮＡをコードする配列を含む導入プラスミド１μｇを用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮトランスフェクション反応を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８時間後に、０．４５μＭのＰＥＳフィルター（ＶＷＲ カタログ番号：１０２１８－４８８）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。精製して分注したレンチウイルスは、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。
ＨＳＭＭ細胞のトランスダクション
０～２６歳と年齢を変えて５つの異なるヒトドナー（それぞれ、ドナー＃３、ドナー＃５、ドナー＃１２１、ドナー＃３６８、ドナー＃６１７と称する）から採取した初代骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）をＬｏｎｚａ Ｉｎｃ．から入手した。細胞は、初代骨格筋細胞増殖用培地［ＳｋＧＭ－２ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｏｎｚａ ＃ＣＣ－３２４４ ＆ ＣＣ－３２４６）］中で培養した。トランスダクションにあたっては、増殖培地を入れた６ウェルの細胞培養皿（ＶＷＲカタログ番号：１００６２－８９４）に０．１２５～０．３３×１０６細胞／ウェルで細胞を播種し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａカタログ番号：ＴＲ－１００３－Ｇ）を添加した１．５ｍｌの増殖培地と、個々のターゲティング配列（表１）とｔｒａｃｒＲＮＡとにコードされたｃｒＲＮＡを含む各ｓｇＲＮＡに対応する１．０ｍｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェルに添加した。細胞をレンチウイルスと６時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、新鮮な増殖培地と交換した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：Ｐ８８３３））を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから７－１０日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１８２）でＲＮＡを抽出した。
０～２６歳と年齢を変えて５つの異なるヒトドナー（それぞれ、ドナー＃３、ドナー＃５、ドナー＃１２１、ドナー＃３６８、ドナー＃６１７と称する）から採取した初代骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）をＬｏｎｚａ Ｉｎｃ．から入手した。細胞は、初代骨格筋細胞増殖用培地［ＳｋＧＭ－２ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｏｎｚａ ＃ＣＣ－３２４４ ＆ ＣＣ－３２４６）］中で培養した。トランスダクションにあたっては、増殖培地を入れた６ウェルの細胞培養皿（ＶＷＲカタログ番号：１００６２－８９４）に０．１２５～０．３３×１０６細胞／ウェルで細胞を播種し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａカタログ番号：ＴＲ－１００３－Ｇ）を添加した１．５ｍｌの増殖培地と、個々のターゲティング配列（表１）とｔｒａｃｒＲＮＡとにコードされたｃｒＲＮＡを含む各ｓｇＲＮＡに対応する１．０ｍｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェルに添加した。細胞をレンチウイルスと６時間インキュベートした後、ウイルス培地を除去し、新鮮な増殖培地と交換した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：Ｐ８８３３））を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから７－１０日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１８２）でＲＮＡを抽出した。
遺伝子発現解析
遺伝子発現解析のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号：４３６８８１３）のプロトコールに従って、約０．５～０．８μｇの全ＲＮＡから１０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（ＬＡＭＡ１：Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ０１０７４４８９＿ｍ１ ＦＡＭ； ＨＰＲＴ： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１ ＶＩＣ＿ＰＬ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘのプロトコールに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を進め解析した。
遺伝子発現解析のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号：４３６８８１３）のプロトコールに従って、約０．５～０．８μｇの全ＲＮＡから１０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（ＬＡＭＡ１：Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ０１０７４４８９＿ｍ１ ＦＡＭ； ＨＰＲＴ： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１ ＶＩＣ＿ＰＬ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘのプロトコールに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を進め解析した。
ピューロマイシン選択下で７日後、ＱＩＡＧＥＮ Ａｌｌｐｒｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮＡ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ ＃８０４０４）を用いて、製造元の指示に従い、形質導入したＨＳＭＭ細胞から全タンパク質を抽出し、続いて１μｇ／μＬ終濃度となるよう定量および標準化した。各タンパク質溶液２０μｇをＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ ３－８％ ｍｉｎｉ ｇｅｌ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ ＥＡ０３７５ＢＯＸ）で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に４℃、７０分間、３５Ｖで転写した。続いてこれをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）ブロッキングバッファー（ＬｉｆｅＴｅｃｈ ３７５１６）中、ＲＴで１時間インキュベートし、非特異的相互作用部位をブロッキングした。その後、膜を抗ＬＡＭＡ１抗体（１：１００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ ｓｃ－７４４１７）または抗ｂ－アクチン抗体（１：１００００）（ＬｉｆｅＴｅｃｈ ＭＡ１－１４０）とともに４℃にて一晩インキュベートした。膜を洗浄液（１ＸＴＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０分間撹拌しながら３回洗浄し、非特異結合後の過剰または緩く結合した抗体を除去した。ブロッキング溶液で１：１０，０００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；ＬｉｆｅＴｅｃｈ）と結合したヤギ免疫グロブリン抗マウスを、撹拌しながらＲＴで１時間、膜上でインキュベートした。さらに３回の洗浄を行った後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ ３４０９４）に１分間、膜を浸漬した。結果は、Ａｚｕｒｅ Ｃ４００で可視化した。
データ解析
各サンプルと３つのコントロールについて、３回の技術的反復実験から得られたＬＡＭＡ１プローブのＣｔ値の平均値をＨＰＲＴプローブの平均値から差し引くことにより、ｄｅｌｔａＣｔ値を算出した（平均Ｃｔ ＬＡＭＡ１ －平均Ｃｔ ＨＰＲＴ）。発現値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖａｌｕｅ）は、各サンプルについて、２－（ｄｅｌｔａＣｔ）の式を用いて求めた。次に、サンプルの発現値を、各実験について３つのコントロールの発現値の平均値で正規化し、各サンプルの相対的なＬＡＭＡ１発現量を求めた。
各サンプルと３つのコントロールについて、３回の技術的反復実験から得られたＬＡＭＡ１プローブのＣｔ値の平均値をＨＰＲＴプローブの平均値から差し引くことにより、ｄｅｌｔａＣｔ値を算出した（平均Ｃｔ ＬＡＭＡ１ －平均Ｃｔ ＨＰＲＴ）。発現値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖａｌｕｅ）は、各サンプルについて、２－（ｄｅｌｔａＣｔ）の式を用いて求めた。次に、サンプルの発現値を、各実験について３つのコントロールの発現値の平均値で正規化し、各サンプルの相対的なＬＡＭＡ１発現量を求めた。
結果
ｄＳａＣａｓ９－ＶＲ：ｓｇＲＮＡによるＬＡＭＡ１遺伝子発現の活性化
ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡの発現カセットと各ターゲティング配列のｓｇＲＮＡを、初代ＨＳＭＭ細胞に送達させるレンチウイルスを作製した。トランスダクションされた細胞は、ピューロマイシンに対する耐性で選択され、Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙを用いてＬＡＭＡ１の発現量を定量した。各サンプルの発現値を、コントロールのｓｇＲＮＡを導入した細胞のＬＡＭＡ１発現量の平均値で正規化した。
図２に示されるように、テストした１６配列のうち、３つのターゲティング配列がＨＳＭＭドナー＃３細胞においてＬＡＭＡ１ｍＲＮＡの発現を約５～７倍に増加させ（図２）、同じ３つの配列は、ドナー＃５細胞では、約１１～１６倍に増加させることがわかった（図３）。
１６個のｓｇＲＮＡ（配列番号１～１６）を用いた最初のスクリーニングで有望なアプレギュレーション結果が得られた後、同じ領域内で設計を続け、さらに４５個のｓｇＲＮＡ（配列番号１７～６１）をスクリーニングし、ｓｇＲＮＡ２５やｓｇＲＮＡ５０といった、ｓｇＲＮＡ１５に比べて約２倍の効力を持つ新しい強力なｓｇＲＮＡを同定した（図４）。
図５に示されるように、Ｒ１及びＲ２中の調べた４０個の配列のうち、ｇＲＮＡ＃１０１のみがＨＳＭＭドナー＃３細胞においてＬＡＭＡ１ｍＲＮＡの発現を３倍超増加させることが示された。
図６に示されるように、ＬＡＭＡ１ ＴＳＳの上流に位置する、調べた９２個のガイド配列のうち、ＬＡＭＡ１の発現量を２倍以上に増加させることができるガイド配列は、一握りであった。４つの異なる起源を持つ初代ＨＳＭＭ細胞を用いた以下検証実験には、最も強力な３つのガイド配列、即ち、ｇＲＮＡ＃１５５、ｇＲＮＡ＃１７０及びｇＲＮＡ＃１７２を含めた。各処理条件に対して３つの生物学的複製を含めた。１．ウイルスを導入していない；２．ｓｇＲＮＡを有さないｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；３．非ターゲッティングｓｇＲＮＡを有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；４．ｇＲＮＡ＃１５５を有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；５．ｇＲＮＡ＃１７０を有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；６．ｇＲＮＡ＃１７２を有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入。図７に示されるように、３つのｓｇＲＮＡは全て、４つの異なる起源を持つ全ての初代ＨＳＭＭ細胞において、一貫してＬＡＭＡ１の発現レベルを高いレベルまでアプレギュレートすることができた（少なくとも３．５倍）。また、異なるＨＳＭＭ起源の間では、アプレギュレーションする能力にばらつきが観察された（例：ドナー＃３６８では＞３５倍であるのに対しドナー＃１２１では～３．５倍）が、これは、ＬＡＭＡ１の基礎発現量に違いによるものと考えられた（図８）。
次に、これらのｓｇＲＮＡが、活性化部分を変えて、ＬＡＭＡ１レベルをアプレギュレートできるかどうかを検証してみた。図９に示されるように、ＶＰ１６０、ｎａｎｏＶＲ、ｍｉｃｒｏＶＲ、及びｍｉｎｉＶＲはいずれもＬＡＭＡ１の発現を３倍超アプレギュレートすることができ、ＶＰ６４－ＭｙｏＤは２倍程度ＬＡＭＡ１の発現をアプレギュレートすることができた。一方、ＬＡＭＡ１のｍＲＮＡレベルの上昇がタンパク質レベルの上昇につながるかどうかを調べるために、ｍｉｃｒｏＶＲを用いたサンプルより全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットアッセイを実施した。図１０に示されるように、２つの異なる起源のＨＳＭＭ細胞で、３つのｓｇＲＮＡは、いずれもＬＡＭＡ１タンパク質レベルを少なくとも１．７倍上昇させることができた。
上述のすべての特許およびその他の文献は、この参照により、詳細に記載されている場合と同じように、ここに完全に組み入れられる。
ｄＳａＣａｓ９－ＶＲ：ｓｇＲＮＡによるＬＡＭＡ１遺伝子発現の活性化
ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡの発現カセットと各ターゲティング配列のｓｇＲＮＡを、初代ＨＳＭＭ細胞に送達させるレンチウイルスを作製した。トランスダクションされた細胞は、ピューロマイシンに対する耐性で選択され、Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙを用いてＬＡＭＡ１の発現量を定量した。各サンプルの発現値を、コントロールのｓｇＲＮＡを導入した細胞のＬＡＭＡ１発現量の平均値で正規化した。
図２に示されるように、テストした１６配列のうち、３つのターゲティング配列がＨＳＭＭドナー＃３細胞においてＬＡＭＡ１ｍＲＮＡの発現を約５～７倍に増加させ（図２）、同じ３つの配列は、ドナー＃５細胞では、約１１～１６倍に増加させることがわかった（図３）。
１６個のｓｇＲＮＡ（配列番号１～１６）を用いた最初のスクリーニングで有望なアプレギュレーション結果が得られた後、同じ領域内で設計を続け、さらに４５個のｓｇＲＮＡ（配列番号１７～６１）をスクリーニングし、ｓｇＲＮＡ２５やｓｇＲＮＡ５０といった、ｓｇＲＮＡ１５に比べて約２倍の効力を持つ新しい強力なｓｇＲＮＡを同定した（図４）。
図５に示されるように、Ｒ１及びＲ２中の調べた４０個の配列のうち、ｇＲＮＡ＃１０１のみがＨＳＭＭドナー＃３細胞においてＬＡＭＡ１ｍＲＮＡの発現を３倍超増加させることが示された。
図６に示されるように、ＬＡＭＡ１ ＴＳＳの上流に位置する、調べた９２個のガイド配列のうち、ＬＡＭＡ１の発現量を２倍以上に増加させることができるガイド配列は、一握りであった。４つの異なる起源を持つ初代ＨＳＭＭ細胞を用いた以下検証実験には、最も強力な３つのガイド配列、即ち、ｇＲＮＡ＃１５５、ｇＲＮＡ＃１７０及びｇＲＮＡ＃１７２を含めた。各処理条件に対して３つの生物学的複製を含めた。１．ウイルスを導入していない；２．ｓｇＲＮＡを有さないｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；３．非ターゲッティングｓｇＲＮＡを有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；４．ｇＲＮＡ＃１５５を有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；５．ｇＲＮＡ＃１７０を有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入；６．ｇＲＮＡ＃１７２を有するｄＳａＣａｓ９－ＶＲを導入。図７に示されるように、３つのｓｇＲＮＡは全て、４つの異なる起源を持つ全ての初代ＨＳＭＭ細胞において、一貫してＬＡＭＡ１の発現レベルを高いレベルまでアプレギュレートすることができた（少なくとも３．５倍）。また、異なるＨＳＭＭ起源の間では、アプレギュレーションする能力にばらつきが観察された（例：ドナー＃３６８では＞３５倍であるのに対しドナー＃１２１では～３．５倍）が、これは、ＬＡＭＡ１の基礎発現量に違いによるものと考えられた（図８）。
次に、これらのｓｇＲＮＡが、活性化部分を変えて、ＬＡＭＡ１レベルをアプレギュレートできるかどうかを検証してみた。図９に示されるように、ＶＰ１６０、ｎａｎｏＶＲ、ｍｉｃｒｏＶＲ、及びｍｉｎｉＶＲはいずれもＬＡＭＡ１の発現を３倍超アプレギュレートすることができ、ＶＰ６４－ＭｙｏＤは２倍程度ＬＡＭＡ１の発現をアプレギュレートすることができた。一方、ＬＡＭＡ１のｍＲＮＡレベルの上昇がタンパク質レベルの上昇につながるかどうかを調べるために、ｍｉｃｒｏＶＲを用いたサンプルより全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットアッセイを実施した。図１０に示されるように、２つの異なる起源のＨＳＭＭ細胞で、３つのｓｇＲＮＡは、いずれもＬＡＭＡ１タンパク質レベルを少なくとも１．７倍上昇させることができた。
上述のすべての特許およびその他の文献は、この参照により、詳細に記載されている場合と同じように、ここに完全に組み入れられる。
本発明によれば、ＭＤＣ１Ａ患者由来の筋肉細胞においてＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートすることができるため、ＭＤＣ１Ａの治療及び／又は予防に極めて有用であると期待される。
本出願は、米国で出願された米国仮特許出願（Ｎｏ．６２／８８７，８６３、出願日：２０１９年８月１６日）及び米国仮特許出願（Ｎｏ．６３／００８，０５９、出願日：２０２０年４月１０日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
本出願は、米国で出願された米国仮特許出願（Ｎｏ．６２／８８７，８６３、出願日：２０１９年８月１６日）及び米国仮特許出願（Ｎｏ．６３／００８，０５９、出願日：２０２０年４月１０日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (25)
- 以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域を標的とするガイドＲＮＡ、をコードする塩基配列。 - ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、
（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１２４で表される塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される塩基配列、又は
当該塩基配列において１～３塩基欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 転写アクチベーターが、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＰＨ、ＶＰＲ、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲ）、ｍｉｃｒｏＶＲ、及び転写活性化能を有するそれらの変異体からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
- 転写アクチベーターが、ｍｉｎｉＶＲである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
- ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Streptococcus aureus）に由来するｄＣａｓ９である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
- ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
- ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
- ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は筋特異的プロモーターである、請求項７～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
- 筋特異的プロモーターが、ＣＫ８プロモーター、ミオシン重鎖キナーゼ（ＭＨＣＫ）プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、及びｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ５－１２（Ｓｙｎ）プロモーター、及びｕｎｃ４５ｂプロモーターからなる群より選択される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
- ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１４に記載のベクター。
- ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９およびこれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１５に記載のベクター。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載のベクターを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防剤。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法。
- ＭＤＣ１Ａの治療又は予防に使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載のベクター。
- ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載のベクターの使用。
- 細胞におけるヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートする方法であって、前記細胞内で
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ
を発現させることを含む、方法。 - 以下を含む、リボヌクレオプロテイン：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ。 - 以下を含む、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現をアプレギュレートするためのキット：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。 - 以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与する工程を含む、ＭＤＣ１Ａの治療又は予防方法：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。 - ＭＤＣ１Ａの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下の（ｅ）及び（ｆ）の使用：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＬＡＭＡ１遺伝子の発現制御領域における、（ｉ）配列番号１５、２０、２５、５０、５６、又は６１で表される連続領域、（ｉｉ）配列番号１２４で表される連続領域、又は（ｉｉｉ）配列番号１７８、１９３、又は１９５で表される連続領域、を標的とするガイドＲＮＡ又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (5)
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