KR20100025792A - 지질을 포함하는 생물학적 제제 및 지질을 이용한 면역 반응 활성화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지질을 포함하는 생물학적 제제 및 지질을 이용한 면역 반응 활성화 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 지질을 포함하는 생물학적 제제, 백신의 아주반트 및 면역증강제, 그리고 지질을 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응 활성화 방법에 대한 것이다.

지질

Description

지질을 포함하는 생물학적 제제 및 지질을 이용한 면역 반응 활성화 방법{Biological Agent Comprising Lipid and Method for Activating Immune Response using Lipid}

본 발명은 지질을 포함하는 생물학적 제제 및 지질을 이용한 면역 반응 활성화 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 지질을 포함하는 생물학적 제제, 백신의 아주반트 및 면역증강제, 그리고 지질을 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응 활성화 방법에 대한 것이다.

수지상세포 (Dendritic Cells, DCs)는 매우 적은 수로 존재하는 백혈구의 일종으로 선천면역 반응과 후천 면역반응의 중심에 서 있는 세포로써 병원체 감염 등 여러 원인에 의한 조직 손상을 인식하여 주변의 항원 정보를 T 림프구에 전달함으로써 후천 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 지금까지 알려진 항원제시세포 (Antigen Presenting Cell, APC) 중 가장 우수한 항원제시세포이다. 항원제시세포들은 말초 조직에서 항원을 포식하고 활성화된 후, 2차 림프조직으로 이동, 처녀 T 림프구를 활성화시키는 역할을 한다. 따라서, 암 또는 바이러스 감염 등 질병에 대한 면역 반응을 유도하여 임상에 적용하기 위해서 수지상세포의 면역원성 및 항원 제시 능력을 결정하는 요인에 대한 많은 연구들이 진행되고 있다.

수지상세포는 골수에서 기원하여 미성숙한 상태로 혈류를 통해 체내 모든 기관으로 이동해 가면서 각 조직 주변의 항원을 인식함으로써 성숙한 수지상세포로 분화하게 된다. 시험관 내에서는, 분리한 골수세포를 IL-4, GM-CSF로 처리하여 미성숙 수지상세포로의 분화를 유도한 후 LPS와 같은 병원체 유래 분자나 TNF-α와 같은 싸이토카인등으로 활성화시켜 성숙한 수지상세포를 얻을 수 있다. 예를 들어, LPS에 의해 활성화된 수지상세포는 핵 전사인자의 하나인 NF-κB의 발현을 높여 다양한 면역반응과 염증반응에 관여하는 유전자의 발현을 조절한다. 성숙한 수지상세포는 미성숙한 수지상세포에 비해 CD40, CD80, CD86와 같은 보조 자극 인자 및 I-Ab의 발현이 증가하여 T 림프구를 활성화 시킬 수 있는 것이 특징이다. 예를 들어, 수지상세포를 이용한 항암 세포치료제 또는 백신을 개발하고자 하는 많은 연구는 수지상세포를 시험관에서 분화하여 암 항원과 배양하여 암 항원을 제시하고 LPS나 TNF-α로 성숙한 수지상세포를 얻어 종양을 가지고 있는 동물이나 암환자에게 다시 주사하여 생체 내에서 암 항원에 특이적인 T 림프구의 활성화를 유도, 암을 치료하는데 초점을 두고 있다.

그러나, 수지상세포를 활성화 시키는데 사용되는 LPS나 TNF-α는 생체내에 투여시 전신 독성 반응이 매우 강하여, LPS 같은 경우에는 체내 투여가 금지되어 왔고, 모든 생물학적 제재의 인체투여를 위하여 LPS가 존재하지 않는 경우에 한하여 사용을 허가하고 있다. 따라서 인체에 투여가 가능한 수지상세포를 제조하기 위해서는 독성이 없이 안전하게 수지상세포를 활성화시킬 수 있는 아주반트나 면역증 강제의 발굴 또는 개발이 필수적이다. 현재 가장 효과적인 면역 증강제 중 하나는 mineral oil, surfactant, mycobacteria가 섞여있는 Freund's Complete Adjuvant (FCA)로써 항원에 대한 면역반응을 증가시키기 때문에 수년간 사용되어 왔다. 하지만, FCA는 동물에 주사할 때 주사하는 위치나 주사하는 양에 따라 만성염증반응을 일으켜 동물에 심각한 통증을 초래할 수도 있다는 단점이 있다. 예를 들어, FCA를 다룰 때 실수로 눈으로 튀어 들어가면 실명의 위험을 초래하기도 하고, tuberculin 양성 반응을 가진 사람이 FCA이 접종될 경우 심각한 괴사병반을 초래하기도 한다. Mycobacteria가 들어 있지 않은 Freund's Incomplete Adjuvant (FIA)는 FCA보다 안전하기 때문에 많이 쓰이고는 있으나 이 역시 농양 (abscess)이나 육아종 (granuloma) 형성을 초래하기 때문에 Freund's Adjuvant를 대체할 수 있는 아주반트들이 많이 개발되어지고 있다. 따라서, 백신 개발에서 아주반트를 사용한 면역 증강 효과를 보기 위해서는 부작용에 대한 위험을 최소화할 수 있는 물질들의 개발에 관한 관심이 급속하게 증가하고 있다. 또한, 대부분의 백신은 면역원성(immunogenicity)이 낮기 때문에 백신 제조회사나 WHO등은 새로운 백신의 개발이나 현재 사용되고 있는 백신의 효과를 증대시키는 방법을 모색하고 있다.

본 발명의 기본적인 목적은 지질을 포함하는 면역치료용 생물학적 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지질을 포함하는 백신의 아주반트(adjuvant)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지질을 포함하는 면역증강제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지질을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응 활성화 방법을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 지질을 포함하는 면역치료용 생물학적 제제를 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 지질은 콜레스테롤(Cholesterol), 세라마이드(ceramide, (2S,3R,4E)-2-acylamino-1,3-octadec-4-enediol), L-α-리소포스파티딜콜린(L-α-lysophosphatidylcholine, lyso-PC), L-α-포스파티딜콜린(L-α-phosphatidylcholine, PC), L-α-리소포스파티딜에탄올아민(L- α-lysophosphatidylethanolamine, lyso-PE), 돼지 뇌지질 추출물(porcine brain lipid extract), L-α-포스파티딘산(L-α-phosphatidic acid, PA), 소의 심장 지질 추출물(bovine heart lipid extract), L-α-리소포스파티딜세린(L-α-lysophosphatidylserine, lyso-PS), L-α-포스파티딜에탄올아민(L-α- phosphatidylethanolamine, PE), L-α-포스파티딜-DL-글리세롤(L-α-phosphatidyl-DL-glycerol, PG), L-α-포스파티딜세린(L-α-phosphatidylserine, PS), 카디오리핀(cardiolipin) 또는 L-α-포스파티딜노시톨(L-α-phosphatidylinositol, PI) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 이러한 지질들은 세포의 NF-κB의 활성을 유도한다.

상기 지질들은 시험관 내에서 수지상 세포를 활성화하여 공자극분자 발현을 증가시키거나 일산화질소 생산을 증가시키거나, IL12p40의 생산을 증가시킨다. 또한 상기 지질들은 시험관 내에서 수지상 세포를 활성화하고, 이렇게 활성화된 수지상 세포가 항원특이 T림프구를 활성화한다.

그리고 상기 지질들은 생체 내에서 수지상 세포를 활성화하여 공자극분자 발현을 증가시킨다. 또한 상기 지질들은 생체 내에서 수지상 세포를 활성화하고, 이렇게 활성화 된 수지상 세포가 항원특이 T림프구를 활성화한다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 지질을 포함하는 백신의 아주반트(adjuvant)를 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 지질은 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 또는 L-α-포스파티딜노시톨 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 이러한 지질들은 세포의 NF-κB의 활성을 유도한다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 지질을 포함하는 면역증강제를 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 지질은 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 또는 L-α-포스파티딜노시톨 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 이러한 지질들은 세포의 NF-κB의 활성을 유도한다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 지질을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응 활성화 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 지질은 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 또는 L-α-포스파티딜노시톨 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 이러한 지질들은 세포의 NF-κB의 활성을 유도한다.

카디오리핀을 비롯한 다양한 지질이 수지상 세포를 활성화하고 이렇게 활성화된 수지상세포는 항원특이 T림프구를 활성화 하므로 이는 카디오리핀을 포함하는 지질이 백신의 아주반트나 혹은 면역 세포치료제의 아주반트로써 사용 될 수 있음 을 시사한다.

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에 사용된 지질은 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 또는 L-α-포스파티딜노시톨이다. 상기 지질 분자들은 Avanti Polar Lipids, Inc (Alabaster, AL)로부터 구입한 것이다.

그리고 본 발명의 실시예에서 유세포 분석기를 이용한 세포의 분석에 사용한 항체는 anti-mouse CD4-APC (clone GK1.5), anti-mouse CD3e-APC (clone 145-2C11), anti-mouse CD11c-APC (clone HL3),anti-mouse IL-12p40-APC (clone C15.6), anti-mouse CD44-APC (clone IM7), anti-mouse CD40-FITC (clone HM40-3), anti-mouse CD80-FITC (clone 16-10A1), anti-mouse CD86-PE (clone GL1), anti-human CD25-PE (clone M-A251), anti-mouse Vβ6-R-PE (clone RR4-7), anti-mouse I-Ab-PE (clone AF6), anti-mouse CD69-PerCP-Cy5.5 (clone H1.2F3), anti-mouse CD69-biotin (clone H1.2F3)이다. 각 항체에 맞는 isotype control 및 각각의 항체는 BD pharmingen (San Diego, CA)에서 구입하였다.

또한, 본 발명의 실시예에서 사용된 마우스는 Rag2 유전자 결손 마우스와 I-Ab에 제시되는 male 항원 (H-Y 펩타이드)에 대한 단일 CD4+ T 세포군만을 갖고 있는 T 세포 수용체 (TCR)(V1.1, Vβ6) 트랜스제닉 Rag2 유전자 결손 Marilyn 마우스를 Taconic Farms, Inc. (Hudson, NY)에서 구매하였다. Wild-type B6 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)에서 수입하여 사용하였다. 마우스의 유전형은 판매회사가 제안한 방법을 통해 확인하였다.

실시예 1. 카디오리핀 저장액 제조

100 % 에탄올에 녹인 카디오리핀 저장액은 소량으로 분배하여 진공상태로 건조시켰다. 완전히 건조된 카디오리핀은 2.5 ml의 PBS를 넣고 수조형 초음파발생 장치에서 30분씩 두 번 처리하여 녹이고, 사용 전에 수조형 초음파발생 장치에서 15분 처리한 후 사용하였다. 카디오리핀 저장액은 균체 내독소(endotoxin) 제거용액(US Biological, Swampscott, MA)으로 세척한 유리병에 보관하였다.

실시예 2. 괴사성 세포 준비

B6 마우스의 넙다리 네갈래근에서 섬유아세포를 분리하여 배양하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 세포주는 Cell Applications Inc.(San Diego, CA)사에서 구입하여 내피세포 증식 배 지(endothelial cell growth medium)로 배양하였다. 괴사성 섬유아세포와 괴사성 HUVEC 세포주는 에탄올을 넣은 드라이 아이스에서 세포를 얼리고 37℃ 수조에서 녹이는 작업을 10번 반복하여 만들었다.

실시예 3. 괴사성 세포와 CD14 의 결합능 분석

정제된 CD14와 OVA5에 Cy5를 표지하였다. 제조사 GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden가 제시한 기준을 토대로 Cy5의 표지비율을 결정하였다. 같은 수 (5×10⁵)의 괴사성 세포와 살아있는 세포를 PBS로 섞은 후 CD14-Cy5 또는 OVA-Cy5로 30분 동안 얼음에서 반응시켰다. 반응이 끝난 세포는 PBS로 두 번 수세한 후 30분 동안 7AAD로 염색하였다. 괴사성 세포가 CD14-Cy5 또는 OVA-Cy5와의 결합 여부는 유세포 분석기를 통해 확인하였다.

CD14는 살아 있는 세포 (7AAD^neg)보다 괴사성 세포 (7AAD^pos)와 더 잘 결합하였다(도 1a). OVA와 달리 CD14는 첨가해준 괴사성 세포양에 비례하여 괴사성 세포와 결합하였으나(도 1a 및 1c), 첨가해준 살아 있는 세포와는 농도 의존적인 결합 양상을 보이지 않았다(도 1b). 마우스 괴사성 섬유아세포(도 1c) 및 사람의 괴사성 HUVEC 세포주(도 1d)도 CD14를 발현하지 않는 NF-κB 리포터(reporter) CHO 세포의 NF-κB 활성화를 유도하나 CD14를 발현하는 NF-κB 리포터 CHO 세포의 NF-κB 활성화를 더욱 증가시켰다. LPS와는 달리 괴사성 세포는 MD2 유전자 이상 NF-κB 리포터 CHO 세포(CD14^posMD2^neg)의 NF-κB 활성화를 유도하였으므로 괴사성 세포에 의 한 NF-κB 활성화 유도는 LPS 오염에 의한 결과라는 가능성을 배제할 수 있었다.

실시예 4. NF -κB 리포터 CHO 세포의 준비

NF-κB 핵 전사인자에 반응하는 프로모터의 조절을 받아 세포표면에 human CD25를 발현하는 NF-κB 리포터 CHO(chinese hamster ovary) 세포(CD14^posMD2^pos), MD2 유전자 이상 NF-κB 리포터 CHO 세포(CD14^posMD2^neg), CD14^negMD2^pos NF-κB 리포터 CHO 세포가 사용되었다. NF-κB 리포터 CHO 세포는 10% FBS(Gibco), 400 U/ml 농도의 하이그로마이신(hygromyci, Calbiochem사), 항생제(100 units/ml의 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신, 50 μg/ml의 겐타마이신(gentamycin)(Gibco)), 400 μg/ml의 G418(Invitrogen)을 첨가한 Ham's F-12 medium(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다.

실시예 5. NF -κB 리포터 CHO 세포 자극 방법 및 분석

NF-κB 활성화 분석을 위해서 plate당 5×10⁶의 세포를 배양하기 시작하였다 (day 0). 배양 하루 뒤(day 1)에 flat bottom 96 well plate에 well 당 1×10⁵개의 세포를 넣고 24 시간 동안 배양하였다. 이틀째 되는 날(day 2) 자극 물질들(다양한 종류의 지질들 또는 LPS)을 첨가하고, 18 시간을 더 배양하였다. LPS(E. coli serotype O26:B6)는 Sigma사(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 그리고 사흘째 되 는 날(day 3) 세포를 회수하여 phycoerythrin (PE)-conjugated anti-human CD25 항체로 염색한 후 유세포 분석기(FACS Calibur, BD, San Jose, CA)를 이용하여 CD25의 발현(NF-κB 활성) 정도를 측정하였다. 활성화된 세포의 백분율은 실험군의 CD25^pos CHO 세포 백분율에서 배양액으로 자극한 음성 대조군의 CD25^pos CHO 세포 백분율을 제외한 값이다. 배양액으로 자극한 음성 대조군에서 50% 이상의 세포가 분포하는 위치에 gating을 적용하였다.

본 발명에 사용된 다양한 종류의 지질들 중 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 세라마이드, 리소포스파티딜콜린은 NF-κB를 활성화하지 못했지만 포스파티딜세린, 카디오리핀, 포스파티딜이노시톨은 MD2의 발현과는 무관하게 CD14가 있으면 NF-κB의 활성을 더욱 증가시켰다(도 2b, 도 3a). 소의 심장에서 분리한 지질 추출물도 농도 의존적으로 MD2의 발현과는 무관하게 NF-κB를 활성화시켰다(도 2a).

발명에 사용된 다양한 종류의 지질들 중 카디오리핀도 농도 의존적으로 MD2의 발현과는 무관하게 NF-κB를 활성화하였다 (제3도). 모든 실험군에서 MD2는 지질 분자에 의한 NF-κB 활성화에 어떠한 영향도 주지 않았다. 이것은 지질 분자에 의한 NF-κB 활성화는 LPS 오염과 무관함을 나타내는 것이다.

실시예 6. 시험관 내에서 카디오리핀에 의한 수지상 세포의 활성화

골수 유래 수지상 세포는 Rag2 유전자 결손 마우스의 골수로부터 채취하였다. 6 ~ 8주령 사이의 마우스의 대퇴골과 경골의 골수를 IMDM(Gibco)으로 씻어내 고(flushing) 수세를 거친 후 complete IMDM[10% heat-inactivated FBS, 50 nM의 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol, Invitrogen), 2 mM의 L-글루타민, 항생제(antibiotics, 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신(WelGENE Inc.)와 50 μg/ml 겐타마이신(Gibco)), 재조합 마우스 GM-CSF(0.75 ng/ml), 마우스 IL-4(1.5 ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ)를 넣은 IMDM] 배양액을 이용하여 96 웰 배양 플레이트에서 배양하였다(1×10⁶ cells/ml). 매일 배양액의 절반을 버리고 동량의 새로운 배양액을 넣어 준다. 배양 엿새째 되는 날에 미성숙 수지상 세포는 카디오리핀 또는 LPS로 18 시간 처리한 후 CD11c^pos 세포의 I-A^b, CD40, CD80 및 CD86 표면 발현을 유세포 분석기를 통해 확인하였다. 카디오리핀을 처리한 살아 있는 수지상 세포 (7AAD^neg/CD11c^pos)의 보조 자극 분자 및 I-Ab의 발현이 처리하지 않은 세포보다 증가했다(도 4a). 이는 시험관 내에서 수지상 세포는 카디오리핀 처리에 의해 활성화되었음을 나타낸다.

실시예 7. 시험관 내에서 카디오리핀에 의한 수지상 세포의 일산화질소( NO ) 생성력 분석

세포질과 배양액에 존재하는 아질산염(nitrite)은 Griess reagent(Sigma)를 이용하여 측정하였다. 수지상 세포를 카디오리핀 또는 LPS로 18 시간 처리한 후 세포와 배양 상청액(100 μl)을 동량(100 μl)의 Griess reagent(0.1% (w/v)의 N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride), 1% (w/v)의 설파닐아미드(sulfanilamide) 및 5% (w/v)의 H₃PO₄)로 혼합하여 8분간 반응시킨 후 automated plate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염 농도는 질산나트륨 표준 곡선을 토대로 계산하였다. 배양액으로 처리한 음성 대조군의 값으로 실험군의 값을 나누어서 "접힘 유도(fold induction)"를 도출하였다. 수지상 세포는 처리한 카디오리핀의 양에 비례해서 NO를 생성했다(도 4b). 이는 시험관 내에서 카디오리핀이 수지상 세포를 활성화 시켰음을 나타낸다.

실시예 8. 시험관 내에서 카디오리핀에 의해 활성화된 수지상 세포의 T 세포 활성화능 분석

Marilyn 마우스의 림프절과 비장을 배양접시에 올려 놓고 겸자와 나일론 망사로 잘 으깨서 세포 여과체(cell strainer)로 거른 후 림프구 세포와 비장 림프구를 분리하였다. 적혈구는 적혈구 용해 완충액(0.15 M NH₄Cl, 1 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA pH 7.2)을 4분간 처리하여 제거하였다. 마우스 T 세포는 Pan T Cell Isolation Kit(MACS; Miltenyi Biotech, CA)의 바이오틴(biotin)이 표지된 CD11b, CD45R, DX5 및 Ter-119에 대한 단클론(monoclonal) 항체를 이용한 부정 선택(negative selection)으로 분리하였다. 분리한 세포는(1×10⁷개) 곧바로 37℃에서 15분 동안 crushing buffer[0.5% (v/v) FBS가 포함된 PBS]에 희석한 1 μM 농도의 5-, 6-카르복시플루오레세인 다아세테이트 숙신이미딜 에스테르(5-, 6- carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSE))로 염색하였다. 결합하지 않은 CFSE는 차갑게 식힌 충분한 양의 FBS를 넣어주어 억제시킨다. 세포(1×10⁷개)를 crushing buffer로 3번 수세한 후 IL-4를 넣지 않은 complete IMDM에 재부유 시키고, H-Y 펩타이드(0.1 mM)로 pulsing하고 카디오리핀(12.5 ~ 50 μg/ml) 또는 LPS(300 ng/ml)로 활성화된 수지상 세포(1×10⁴)를 첨가하여 18 시간 동안 96 well plate에서 함께 배양하였다.

하루에서 사흘 뒤에 세포를 회수하여 anti-mouse CD3-APC, Vβ6-R-PE, 및 CD69-PerCP-Cy5.5 항체로 염색하고, CD3⁺Vβ6⁺ 세포의 CFSE 염색 양상을 유세포 분석기를 통해 분석하였다.

H-Y 펩타이드를 펄싱하고 카디오리핀으로 활성화시킨 수지상 세포와 함께 배양한 Marilyn T 세포의 CD69의 발현이 증가되었다(도 4c 및 4d). 비록 여러 농도의 H-Y 펩타이드(0.01 ~ 10 mM)를 갖고 수지상 세포를 펄싱하였으나, Marilyn T 세포의 CD69 발현 증가에는 차이를 보이지 않았다. 도 4c의 bar는 결과값의 평균치를 나타낸다. CFSE를 염색한 Marilyn T 세포는 H-Y 펩타이드로 펄싱하고 카디오리핀으로 활성화시킨 수지상 세포와 함께 배양했을 때 증식하였다(도 4e). H-Y Dbyp 펩타이드(NAGFNSNRANSSRSS)는 Research Genetics (Huntsville, AL)에 의뢰하여 90% 이상의 순도로 합성하였다.

실시예 9. 생체 내에서 카디오리핀의 수지상 세포 활성화능 분석

B6 마우스의 복강으로 카디오리핀을 주입하고 18 시간 후 복강 세포를 회수하여 살아 있는 수지상 세포 (7AAD^neg/CD11c^pos)의 표현형을 유세포 분석기를 통해 분석하였다. 카디오리핀은 수지상 세포의 보조 자극 인자 및 I-A^b의 발현을 증가 시켰다(도 5a 및 5b). 다양한 양의 카디오리핀을 처리(마우스 당 3 ~ 50 μg의 카디오리핀을 주입)했을 때, 그룹 간 보조 자극 인자 및 I-A^b의 발현에는 큰 차이를 보이지 않았다(도 5b). PBS 대조군과 비교했을 때 카디오리핀이 비록 전체 복강 세포의 수를 증가시키지는 않았으나 CD11c^pos 세포수를 거의 2배 증가시켰다(도 5c). 데이터의 bar는 평균값을 나타낸다.

실시예 10. 생체 내에서 카디오리핀의 T 세포 활성화능 분석

생체 내에서 카디오리핀에 의한 T 세포의 활성 정도를 평가하기 위해서 PBS+H-Y 펩타이드, 카디오리핀+H-Y 펩타이드, FCA+H-Y 펩타이드를 base of tail로 암컷 Marilyn 마우스에 주사하였다. 사용한 H-Y 펩타이드는 마우스당 0.1g씩 주사하였다. 대조군으로 PBS(200 μl), 카디오리핀(200 μg), FCA(200 μl)를 단독으로 주사하였다. 주사 후 각각 이틀과 나흘 뒤에 마우스 서혜부의 림프절이나 비장으로부터 림프구를 분리하여 anti-mouse CD4-APC, anti-mouse Vβ6-R-PE, anti-mouse CD69-PerCP-Cy5.5 및 anti-mouse CD44-FITC 항체로 염색하고 CD4⁺Vβ6⁺ T 세포의 활성화 정도를 유세포 분석기를 통해 분석하였다. 카디오리핀+H-Y 펩타이드를 면역한 후 이틀 뒤에 분리한 서혜부 림프절의 CD4⁺Vβ6⁺ T 세포가 초기(CD69) 및 후기(CD44) T 세포의 활성화 지표의 발현이 증가(도 6b 및 6c)하였으며 카디오리핀 또는 FCA 단독 실험군은 T 세포의 활성에 어떠한 영향도 주지 않았다(도 6a). PBS 대조군과 비교했을 때 카디오리핀+H-Y 펩타이드 처리군에서 얻은 비장림프구의 CD44 발현이 증가한 것을 볼 수 있었다. 나흘 뒤에 얻은 FCA+HY 의 비장림프구도 후기 T 세포 활성 marker인 CD44의 발현이 증가된 것을 관찰하였다(도 6d). 각 그룹당 두마리의 마우스를 면역한 후 얻은 세포는 두 개를 한 쌍으로 염색하거나(도 6c) 세 개 시료를 한 쌍으로 염색하였다(도 6d). 데이터의 평균치는 bar로 나타내었다.

실시예 11. 세포 생존력( Viability ) 분석

시험관에서 카디오리핀을 처리한 수지상 세포의 생존능은 7AAD를 염색한 후 유세포 분석기를 이용하여 관찰하였다. 카디오리핀(50 μg)을 18 시간 동안 처리한 경우에도 수지상 세포에 독성을 나타내지 않았다(도 7a 및 7b). B6 마우스에 PBS, LPS(2 ug/마우스), 카디오리핀(200 ug/마우스)을 복강 내에 주입하고 18 시간 후에 복강 세포를 회수하여 두 개 시료를 한 쌍으로(duplicate) 7AAD로 염색하여 분석하였다(도 7c). PBS, LPS, 카디오리핀 처리군 간의 차이를 보이지 않았다. 시험관 분석을 위해 한 쌍으로 배양으로 얻은 세포는 triplicate 로 염색하였다(도 7a 및 7b). 생체 내 반응을 확인하기 위한 실험에서는 다섯 마리의 마우스로부터 얻은 세 포를 한 쌍으로 염색하였다(도 7c).

본 발명의 실시예에서는 Student's t-test를 사용하여 그룹간 결과를 통계적으로 비교하였다. 3회 반복 실험을 통해 도출한 결과를 평균±SEM으로 나타내었다. 다중 원점으로 표시된 그래프에서는 선으로 평균값을 표시하였다.

도 1은 CD14가 괴사성 세포에 의한 NF-κB의 활성을 유도하는데 관여함을 나타낸다. 도 1a는 CD14가 살아있는 섬유아세포 (7AAD^neg)보다 괴사성 섬유아세포 (7AAD^pos)와 더 잘 결합함을 보여준다. 도 1b는 괴사성 섬유아세포의 양에 비례해서 CD14와 괴사성 세포의 결합이 증가하고 (왼쪽) 괴사성 세포는 OVA가 아니라 CD14와 특이적으로 결합함을 보여준다 (오른쪽). 도 1c는 CD14를 발현하지 않는 NF-κB 리포터 CHO 세포는 첨가해준 괴사성 섬유아세포의 양에 비례해서 NF-κB를 활성화하나 CD14를 발현하는 NF-κB 리포터 CHO세포는 CD14를 발현하지 않는 NF-κB 리포터 CHO 세포보다 첨가해준 괴사성 섬유아세포의 양에 비례해서 NF-κB의 활성화를 더욱 증대시킨다는 것을 보여준다. 도 1d는 인간 괴사성 세포주(HUVEC)도 마우스 괴사성 세포주 (섬유아세포, 제1도 c)와 마찬가지로 CD14를 발현하지 않는 NF-κB 리포터 CHO 세포보다 CD14를 발현하는 NF-κB 리포터 CHO 세포의 NF-κB의 활성화를 더욱 증대시킨다는 것을 보여준다.

도 2는 CD14가 다양한 종류의 지질에 의한 NF-κB의 활성을 유도하는데 관여함을 나타낸다. 도 2a는 CD14가 있으면 소의 심장에서 분리한 지질 추출물의 농도에 의존적으로 NF-κB가 활성화됨을 나타낸다. 도 2b는 다양한 지질 분자들 중 포스파티딜세린, 카디오리핀, 포스파티딜이노시톨은 CD14가 없을때 보다 CD14가 있을 때 NF-κB의 활성을 더욱 증가시킨다는 것을 보여준다.

도 3은 카디오리핀에 의한 NF-κB 활성화에 CD14가 관여함을 나타낸다. 카디 오리핀이 CD14가 발현하지 않는 NF-κB 리포터 CHO 세포에서(도 3a) NF-κB의 활성을 유도할 수 있지만 CD14가 발현하면(도 3b) NF-κB의 활성화를 더욱 증시킨다는 것을 보여준다. 도 3c는 카디오리핀에 의한 NF-κB 활성화는 LPS의 오염 때문이 아님을 보여준다. 도 3d는 MD2의 발현과는 무관하게 CD14가 발현하는 NF-κB 리포터 CHO세포에서 넣어준 카디오리핀의 양에 비례해서 NF-κB의 활성화가 증가됨을 보여준다.

도 4는 시험관 내에서 카디오리핀이 수지상 세포와 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 보여준다. 도 4a는 카디오리핀이 수지상 세포의 보조 자극 분자 및 I-Ab의 발현을 증가 시킨다는 것을 보여준다. 도 4b는 넣어준 카디오리핀의 양에 비례해서 수지상 세포가 NO를 생성함을 보여준다. 도 4c는 카디오리핀에 의해 활성화된 수지상 세포가 T 세포를 활성화 (CD69가 증가)시킴을 보여준다. 도 4d는 도 4c의 대표적인 히스토그램을 보여준다. 도 4e는 카디오리핀에 의해 활성화된 수지상 세포가 T 세포의 증식을 증가시킴을 나타낸다.

도 5는 생체 내에서 카디오리핀이 수지상 세포를 활성화한다는 것을 나타낸다. 도 5a는 도 5b의 결과를 대표하는 히스토그램이다. 도 5b는 카디오리핀을 B6 마우스의 복강에 주입하고 18 시간 후에 회수한 복강 세포들 중 살아있는 (7AAD^neg) 수지상 세포 (CD11c^pos)의 보조 자극 인자 및 I-Ab의 발현이 증가(활성화 )되었음을 나타내다. 도 5c는 카디오리핀이 생체 내에서 전체 복강 세포의 수를 증가시키지는 않았으나 CD11c^pos 세포수를 거의 2배 증가시킨다는 것을 보여준다.

도 6은 생체 내에서 카디오리핀이 T 세포를 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 도 6a는 PBS, 카디오리핀, FCA 단독 처리군 사이에서는 서혜부의 림프절 T 세포의 활성화는 별 차이가 없음을 보여준다. 도 6b는 도 6c의 결과를 대표하는 히스토그램이다. 도 6c는 카디오리핀과 H-Y 펩타이드를 함께 주사 후 2일째 얻은 서혜부 림프절의 T 세포가 활성화 (전기, 후기 T 세포 활성 마커(marker)인 CD69와 CD44가 증가) 되었음을 나타낸다. 도 6d는 카디오리핀과 H-Y 펩타이드를 함께 주사 후 4일째 얻은 비장 T 세포가 활성화 (후기 T 세포 활성 마커인 CD44가 증가) 되었음을 나타낸다.

도 7은 카디오리핀이 시험관 내에서나 생체 내에서 세포에 독성이 없음을 나타낸다. 도 7a는 도 7b의 결과를 대표하는 히스토그램이다. 도 7b는 카디오리핀은 시험관 내에서 수지상 세포의 생존력에 영향을 주지 않음을 나타낸다. 도 7c는 카디오리핀을 복강 내 주입한 B6 마우스의 복강 세포의 생존력도 카디오리핀에 의해 영향을 받지 않음을 나타낸다.

Claims (8)

1. 지질을 포함하는 면역치료용 생물학적 제제.
2. 제2항에 있어서, 상기 지질이 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 및 L-α-포스파티딜노시톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것임을 특징으로 하는, 면역치료용 생물학적 제제.
3. 지질을 포함하는 백신의 아주반트(adjuvant).
4. 제3항에 있어서, 상기 지질이 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 및 L-α-포스파티딜노시톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것임을 특징으로 하는, 백신의 아주반트.
5. 지질을 포함하는 면역증강제.
6. 제5항에 있어서, 상기 지질이 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 및 L-α-포스파티딜노시톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것임을 특징으로 하는, 면역보강제.
7. 지질을 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응 활성화 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 지질이 콜레스테롤, 세라마이드, L-α-리소포스파티딜콜린, L-α-포스파티딜콜린, L-α-리소포스파티딜에탄올아민, 돼지 뇌지질 추출물, L-α-포스파티딘산, 소의 심장 지질 추출물, L-α-리소포스파티딜세린, L-α-포스파티딜에탄올아민, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, L-α-포스파티딜세린, 카디오리핀 및 L-α-포스파티딜노시톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것임을 특징으로 하는, 면역 반응 활성화 방법.

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