JP2003517283A - プライマーペアの増幅及び配列決定並びにそれらの使用 - Google Patents

プライマーペアの増幅及び配列決定並びにそれらの使用

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JP2003517283A JP2000611729A JP2000611729A JP2003517283A JP 2003517283 A JP2003517283 A JP 2003517283A JP 2000611729 A JP2000611729 A JP 2000611729A JP 2000611729 A JP2000611729 A JP 2000611729A JP 2003517283 A JP2003517283 A JP 2003517283A
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ボブ ディー． ブラウン
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オアシス バイオサイエンシーズ インコーポレイティッド
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    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Abstract

(57)【要約】 オリゴヌクレオチドアンカー及びプライマーを含む増幅プライマーペアである。アンカーは、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの基質ではない核酸の化学的性質、及びDNA合成をプライムすることができない3'-末端を有する。プライマーは逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの基質である核酸の化学的性質を有する。アンカー及びプライマーはそれぞれ、ステム構造を形成するために相互に結合することができるヌクレオチドの相補性の領域を含む。ステム構造はユニバーサルプライマーに相補的な核酸配列を含む。1つのプライマーペア（リバースペア）は第1鎖の合成に使用され、第2プライマーペア（フォーワードペア）は第2鎖の合成に使用される。ユニバーサルプライマーは増幅反応を維持し、最終産物の大部分を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、2成分組み合わせPCRプライマーペア及び核酸配列を増幅及び配列決
定する際のその使用に関する。
【０００２】 関連技術の記述 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、遺伝子配列の反対端に相補的なオリゴヌク
レオチドプライマーが、高温で活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で変性、
アニーリング及び伸長の繰り返しサイクルによって、配列を増幅させるために用
いられるDNA増幅方法である。しかし、この方法は、これらの領域にハイブリダ
イズできるプライマーをデザインするために遺伝子の反対端の配列を知っている
ことに頼っている。従って、遺伝子を増幅するたびに、異なるオリゴヌクレオチ
ドプライマーを合成しなければならない。あるいは、プライマーを手元に持って
いたければ、約100,000のヒト遺伝子のそれぞれをうまく標的にし、増幅させる
ために、何百万若しくは何十億の従来のオリゴヌクレオチドの常備のライブラリ
ーが必要であろう。何百万ものPCRプライマーの整理されたライブラリーは、現
在入手できる化学的、物理的及び組織的な手段を超えている。
【０００３】 ゲノムに存在する全ての標的配列に結合することができる妥当な数のプライマ
ーを含む予め製造された（pre-made）PCRプライマーライブラリーの必要性があ
る。
【０００４】 本発明の要旨 本発明の1つの実施形態は、オリゴヌクレオチドアンカー及びプライマーを含
む増幅プライマーペアであり、該アンカーは、逆転写酵素又はDNAポリメラーゼ
の基質ではない核酸の化学的性質(nucleic acid chemistry)を有し、及び／又は
DNA合成をプライムできない3'-末端を有している；該プライマーは逆転写酵素又
はDNAポリメラーゼの基質である核酸の化学的性質を有している；該アンカー及
び該プライマーはそれぞれ、ユニバーサルプライマーに相補的な領域を含むステ
ム構造を形成するために相互に結合することができる相補的なヌクレオチドの領
域を含む。好ましくは、アンカー配列及びステム領域はフレキシブルリンカーに
よって結合される。この好適実施形態の1つの局面において、フレキシブルリン
カーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリアミド及びポリエステルからなる群から選ばれる。好まし
くは、プライマーは、アンカーのステム領域の長さを超えて伸長するテイル領域
を含む。この好適実施形態の1つの局面において、プライマーは1又はそれ以上の
修飾塩基を含む。この好適実施形態の他の局面において、アンカーは1又はそれ
以上の修飾されたバックボーン結合を含む。有利には、アンカー及び前記プライ
マーはそれぞれ6〜24塩基の長さである。好ましくは、プライマーペアはステム
構造の領域に相補的なユニバーサルプライマーに共同している。
【０００５】 本発明の他の実施形態は、オリゴヌクレオチドアンカー及びプライマーを含む
配列決定プライマーペアであり、該アンカーは逆転写酵素又はDNAポリメラーゼ
の基質ではない核酸の化学的性質を有し、及び／又は核酸合成をプライムできな
い3'-末端を有している；該プライマーは逆転写酵素又はDNAポリメラーゼの基質
である核酸の化学的性質を有している；および該アンカー及びプライマーはそれ
ぞれ、ステム構造を形成するために相互に結合することができる相補的なヌクレ
オチドの領域を含む。好ましくは、アンカー配列及びステム領域はフレキシブル
リンカーによって結合している。この好適実施形態の1つの局面において、フレ
キシブルリンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド及びポリエステルからなる群から選ば
れる。好ましくは、プライマーはアンカーのステム領域の長さを超えて伸長する
テイル領域を含む。この好適実施形態の1つの局面において、プライマーは1又は
それ以上の修飾塩基を含む。この好適実施形態の他の局面において、アンカーは
1又はそれ以上の修飾されたバックボーン結合を含む。有利には、アンカー及び
前記プライマーはそれぞれ6〜24塩基の長さである。好ましくは、プライマーペ
アはステム構造の領域に相補的なユニバーサルプライマーに共同している。
【０００６】 本発明はまた、以下のステップを含む核酸配列を増幅する方法を提供する：核
酸分子をフォーワードアンカー（FA）、フォーワードプライマー（FP）、リバー
スアンカー（RA）、リバースプライマー（RP）、フォーワードユニバーサルプラ
イマー（FUP）及びリバースユニバーサルプライマー（RUP）と結合させる。ここ
で、それらの相補的ステム領域の結合を介して、FA/FPは第1のプライマーペアを
形成し、RA/RPは第2のプライマーペアを形成し、FUPはFA/FPステム領域と相補的
であり、RUPはRA/RPステム領域と相補的であり、プライマーペアがRNA配列の側
面に位置するために選択される； 酵素媒介増幅によって前記核酸配列を増幅さ
せる。有利には、核酸配列は治療的遺伝子産物をコードする。好ましくは、核酸
配列はDNA又はRNAである。この好適実施形態の1つの局面において、酵素媒介増
幅はPCR増幅である。
【０００７】 好適実施形態の詳細な説明 本発明は、興味あるあらゆるDNA配列の増幅又は配列決定の際に用いるための
増幅及び配列決定プライマーペアを提供する。これらのプライマーペアは、プラ
イマーライブラリー中に存在する可能な数のプレ合成された成分を使用して速や
かに調製することができ、核酸の合成及び検出に使用される。成分のライブラリ
ーは、要求に応じてあらゆる所望のプライマーペアを作るのにも適している。い
かなる所望の核酸配列を増幅させるためでも、2つの増幅プライマーペアが使用
され、それぞれは個々のオリゴヌクレオチド成分から作られる。全ての可能な6-
mer、8-mer、12-mer又は他の長さのオリゴヌクレオチドは、従来の自動化された
DNAシークエンシングによって合成され、2つのそのようなプライマーがインビト
ロで組み合わせられると、それらに相補的な領域の水素結合（ワトソン−クリッ
クの塩基対形成）を介して自己集合できるように、6-mer、8-mer、12-mer（又は
他の長さのオリゴマー）の第2のセットに相補的な領域を含む。本発明の1つの実
施形態において、アンカー及びプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、6〜
約24塩基の長さである。
【０００８】 例えば、全ての可能な8-merは、48（65,536）オリゴヌクレオチドの適度な大
きさのライブラリー中に示される。他方、全ての可能な16-merは、416（4x109）
オリゴヌクレオチドの膨大なライブラリーを必要とするだろう。
【０００９】 用語“オリゴヌクレオチド”は、DNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドからなる
分子を指す。
【００１０】 用語“オリゴヌクレオチドアナログ”は、例えば、バックボーン及び一連の塩
基を有するオリゴヌクレオチド様構造物を含む分子を指し、バックボーン及び／
又は1又はそれ以上の塩基は、天然に見出されるDNA及びRNA中に見出される構造
物以外であってもよい。“非天然”オリゴヌクレオチドアナログは、天然のDNA
又はRNA中に見出されない少なくとも1つの塩基又はバックボーン構造を含む。具
体例としてのオリゴヌクレオチドアナログは、DNA、RNA、ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、メトキシエチルホスホロチオエート
、デオキシイノシン又はデオキシ5-ニトロインドールを含むオリゴヌクレオチド
などを含むが、これらに限定されない。
【００１１】 本明細書中で用いられる用語“バックボーン”とは、明確な間隔で結合する複
数の塩基を支持し得る、一般に直線の分子を指す。好ましくは、バックボーンは
、標的ポリヌクレオチドの支持される塩基間のハイブリダイゼーションに助けと
なる構造において塩基を支持するだろう。
【００１２】 用語“自然に見出されない塩基”とは、A、C、G、T及びU以外の塩基を指し、
特に天然の塩基又は天然に見出されない塩基に結合することができる部分だけで
なく同義性及びユニバーサル塩基も含む。自然に見出されない塩基は、プロピニ
ルシトシン、プロピニルウリジン、ジアミノプリン、5-メチルシトシン、7-デア
ザアデノシン及び7-デアザグアニンを含むが、これらに限定されない。
【００１３】 用語“ユニバーサル塩基”とは、任意の塩基に置換されてもよい部分をいう。
ユニバーサル塩基はハイブリッド形成に貢献する必要はないが、ハイブリッド形
成を著しく損なうべきではない。具体例としてのユニバーサル塩基はイノシン、
5-ニトロインドール及び4-ニトロベンズイミダゾールを含むが、これらに限定さ
れない。
【００１４】 用語“同義性塩基”は、任意のプリン、又は任意のピリミジンと塩基対合でき
るが、プリン及びピリミジンの両方には塩基対合できない部分を指す。具体的な
同義性塩基は、6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン（
“P”,ピリミジンミミック）及び2-アミノ-6-メトキシアミノプリン（“K”,プ
リンミミック）を含むが、これらに限定されない。
【００１５】 用語“標的ポリヌクレオチド”は、DNA又はRNAを指し、例えば生細胞で見られ
るように、プライマーペアが結合又は反応しようとするものである。
【００１６】 用語“ライブラリー”とは、様々な異なる分子を形成するために結合され得る
成分の集合体をいう。本発明のプラクティスにおいて、ライブラリーは第1セッ
トのオリゴマーが第2セットのオリゴマーに結合できるようにデザインされた少
なくとも2セットのオリゴヌクレオチドを含む。この結合は、好ましくは2つのオ
リゴマーを添加すると自発的に起こる。
【００１７】 本明細書で使用される用語“フレキシブルリンカー”は、結合ドメインが結合
部分に共有的に結合することができる反応性の化学基をいう。このリンカーは、
特に標的核酸の近接領域に結合する2つの結合ドメイン間に結合部分を挿入する
ことに起因するかもしれないストレスを解放する。フレキシブルリンカーは、好
ましくは、フレキシブルであり、親水性であり、大部分の結合部分が複合体上で
のハイブリッド形成、RNase認識及び／又はRNase活性を妨げない十分の長さであ
るように選択される。リンカーは結合ドメインの末端塩基に結合してもよいし、
又は末端から1又はそれ以上の塩基に結合することもできる。適当なフレキシブ
ルリンカーは一般的に少なくとも1又は２原子の鎖における直線分子であり、よ
り一般的には、1から12の炭素原子（及び／又は他のバックボーン原子）の長さ
の有機ポリマー鎖である。具体例としてのフレキシブルリンカーは、ポリエチレ
ングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リアミド、ポリエステルなどである。
【００１８】 用語“修飾されたバックボーン結合”は、ホスホジエステル結合以外のヌクレ
オシド間の結合を指す。これらの結合の具体例は、ホスホロチオエート、ホスホ
ロジチオエート、メチルホスホネート、モルホリノ、MMI、ペプチド核酸（PNA）
、3'-アミデートなどが挙げられる。
【００１９】 本明細書で使用される用語“ステム”は、2つのオリゴヌクレオチド又はオリ
ゴヌクレオチドアナログ結合部分によって形成される構造を指す。
【００２０】 図1A-1Bを参照すると、2つのプライマーペア：フォーワードペア及びリバース
ペアが使用される。それぞれのペアは、ステム領域中の相補的な塩基対合を介し
て結合するプライマー及びアンカーを含む。FA、FP、RA及びRPの配列は、増幅さ
れる正確な核酸配列又は遺伝子配列を基にプライマーライブラリーから選択され
る。FUP及びRUPプライマー配列は、遺伝子特異的ではない。これらのプライマー
の配列は、それぞれ共通のフォーワードステム及びリバースステム配列に基いて
いる。FUPはFPステム領域の全て又は一部にハイブリダイズし、RUPはRPステム領
域の全て又は一部にハイブリダイズする。図2に示される“テイル”領域は任意
である。FA及びFPはフォーワードステム配列の塩基ハイブリダイゼーションを介
して結合し、RA及びRPも同様にして結合する。ステム配列は長すぎて、FUP及びR
UP中の小さなオーバーラップする相補性領域が妨げることができない。どのFAも
相補的なステム配列によって任意のFPと（短い二重螺旋領域を形成するようにハ
イブリダイズする）ステムを形成し得る。ステム形成は任意のフォーワード及び
リバースライブラリーメンバー間では不可能である。従って、FAはFPとのみ対に
なり、RAはRPとのみ対になるであろう。
【００２１】 興味あるヌクレオチド配列に最大親和性結合をもたらすために、プライマーペ
アのアンカー成分は、好ましくは、1又はそれ以上の修飾塩基及び／又は同義性
塩基及び／又はユニバーサル塩基を含み、また、1又はそれ以上の修飾されたバ
ックボーン結合を含んでもよい。アンカーは、逆転写酵素又はDNAポリメラーゼ
の基質ではない任意の核酸の化学的性質（修飾塩基及び／又は結合）を有するこ
とができ、及び／又はDNA合成をプライムできる3'-OH基のような化学基を含まな
い。対照的に、プライマー成分は、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの鋳型とし
て働かなければならないから、はるかに“DNA様”であり、本質的に天然に見出
されるオリゴヌクレオチド（A、G、T、C、U）及びホスホジエステル結合を含む
。プライマー成分は、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの基質として作用する任
意の核酸の化学的性質（天然の塩基、非天然の塩基、ホスホジエステル結合、修
飾されたバックボーン結合の組み合わせ）を含んでもよい。あらゆる所望のオリ
ゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが逆転写酵素及びDNAポリメラ
ーゼの基質として作用する能力は、当業者によって容易に決定できる。
【００２２】 アンカー配列及びプライマー配列は、任意のフレキシブルリンカーによってス
テム領域に結合してもよい（図2）。リンカーは、アンカーがひずみを解放し、
結合親和性を増大させ、集合したアンカー／プライマー複合体のプライミング／
ポリメラーゼ基質活性を向上させるのにより適当であろう。プライマーもまたリ
ンカーを含むことができるが、ポリメラーゼ活性を維持できるようなものを使用
すべきである。
【００２３】 増幅される配列を知ることで、適当な相補性FA、FP、RA及びRPオリゴヌクレオ
チドがライブラリーから選択され、プライマーを形成するように組み合わせられ
る。遺伝子配列特異的増幅プライマーペアは、ユニバーサルプライマーを含む、
完全増幅（例えばPCR）反応バッファー中に混合される。FA/FP及びRA/RPの割合
は、一般的に約1から10又はそれ以下である。従って、FA/FP及びRA/RPは、一般
的に第1及び第2鎖のcDNA合成を触媒するのみである。RA/RPは第1鎖合成に使用さ
れるが、一方、FA/FPは第2鎖合成に使用される（図3）。対照的に、FUP及びRUP
は増幅反応を持続させ、最終アンプリコン産物の大部分を作る。FA及びFPは、直
ちにフォーワードステム配列の塩基ハイブリダイゼーションを介して相互にのみ
結合し、RA及びRPは同様に相互にのみ結合する。
【００２４】 増幅される鋳型RNA混合物、すなわち一般的には全細胞性RNA又はポリ(A)+RNA
は反応に添加され、標的RNAは、RA/RP複合集合体により作られる遺伝子配列に特
異的な配列のハイブリダイゼーションに基いたRA/RP複合体によって結合する。
一般的には、結合した逆転写酵素／耐熱性DNAポリメラーゼ酵素混合物（例えばT
aqポリメラーゼ）は、第1 cDNA鎖を作るためにRNAの逆転写酵素に適した温度（
概して37-55℃）でインキュベートされる反応に添加される。第1鎖cDNA合成は、
RA/RP構造によりプライムされ、RPの3'-OH基は逆転写酵素によって伸長される。
RPは該反応により消費され、第1鎖cDNA産物の5'-末端になる（図3）。RAは第2鎖
cDNA合成により置換され、増幅の次のラウンドには参加しない。
【００２５】 第2鎖cDNA合成はFA/FPによってプライムされ、FPの3'-OHはDNAポリメラーゼ（
耐熱性又はその他）によって伸長される。FPは該反応によって消費され、第2鎖
産物（“コーディング”又は“センス”鎖としても知られている）の5'-末端に
なる。FAは最終の“非センス”鎖合成の間に置換され、増幅の次のラウンドには
参加しない。
【００２６】 標準的サーモサイクルプログラムは、2本鎖DNA産物を増幅するために用いられ
る。簡単にいえば、核酸を変性させるために反応温度を90-95℃に上昇させる。
次に、プライマーが相補的なプライミング部位にハイブリダイズできるように温
度を50-65℃に低下させ、耐熱性DNAポリメラーゼが鋳型DNA分子に沿ってハイブ
リダイズされたプライマーを伸長できるように温度を68-74℃に上昇させる。各
温度の時間は約15秒から2分である。これらの工程は、2本鎖DNAを増幅させるた
めに約25から35回繰り返される。
【００２７】 最初の変性サイクルの後で、FA/FP混合物は第1鎖cDNAにハイブリダイズし、cD
NAの第2鎖を作るためにDNAポリメラーゼによって伸長され、2本鎖cDNA産物を得
る。FUP及びRUPが最初のRNA配列に適合せず、従って第1及び第2鎖のcDNA合成が
起こるまで反応に参加しないことに注意することは重要である。
【００２８】 第1及び第2鎖のプライミング及び合成、並びに最終のアンプリコンのプライミ
ング及び合成は、FP及びRPを消費する。ポリメラーゼによるプライミング基、一
般的に3'-OHの伸長は、FP及びRPが産物cDNA末端に共有結合的に取り込まれる原
因となる。cDNAの5'末端としてのFP及びRPステム配列の取り込みは、次のcDNA増
幅を結合及びプライムするためにそれぞれFUP及びRUPのプライミング部位を提供
する。FUP及びRUPは、最終的な2本鎖DNAアンプリコンを生成するための反応によ
って消費される（図3）。更に、FP、RP、FUP及び／又はRUPは、cDNA又は最終DNA
増幅産物の検出及び／又は捕捉を促進するために、“検出”部分に結合していて
もよい。適した“検出”部分は、酵素標識、蛍光標識及び放射性標識を含む。
【００２９】 第1セットのオリゴヌクレオチドプライマー及び第2セットのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含む、オリゴヌクレオチドプライマーの予備形成されたライブラ
リーが提供され、該プライマーは、増幅プライマーペアを形成するためにプライ
マーが結合できるステム領域を有する。
【００３０】 増幅プライマーを概念的に2つに分けることにより、必要な複数の増幅プライ
マーを合成するよりもむしろ、包括的な増幅プライマーライブラリーを予め準備
することができる。このプライマーペアシステムは、増大した結合親和性のため
にシングルプライマーシステムに有利である。4つの天然の塩基を用いた全ての
可能な17-merのオリゴヌクレオチドの完全ライブラリーは、417（又は約1.7x101 0 ）分子からなるであろう。必要に応じて速やかに集合した2成分におけるプライ
マー、例えば8-merのライブラリー及び9-merのライブラリーを提供することによ
って、必要なライブラリーのサイズは、48+49又は327,650分子に減少される。い
くつかの天然の塩基を1又はそれ以上のユニバーサル又は同義性塩基で置換する
ことによって、必要なライブラリーのコンプレキシティーは更に減少する。従っ
て、例えば、9-merのライブラリーが5つのユニバーサル塩基の後に4つの天然塩
基からなるとすると、成分の数は44（256）に落ち、全ライブラリーサイズは48+
44、約66,000分子に減少する。ライブラリーコンプレキシティーもまた、アンチ
センス分子を3又はそれ以上のセグメントに分割することによって減少させるこ
とができる。このサイズのライブラリーを合成及び維持すること、並びに速やか
に任意の所望のプライマーペアを長いオリゴマーの特注のデノボ合成の必要なく
集合させることができる。従って、本発明の1つの実施形態は、少なくとも2セッ
トのオリゴマーを含み、該オリゴマーは各セットから選択され、必要に応じて結
合される、ライブラリーである。
【００３１】 少なくとも1つの結合ドメインは約3から約24塩基、好ましくは約6から約8塩基
を含む。例えば、それぞれが単一の6-mer配列のみに結合する6-merの結合ドメイ
ンのセット、及び4つの塩基のみが配列特異的であり、残りの塩基が同義性又は
ユニバーサルである8-mer結合ドメインのセットを有するライブラリーが構築さ
れ得る。第1のセットは可能な46（4096）配列を含み、一方、第2のセットは44（
256）配列のみ（4個の“特異的な”塩基及び4個の“ユニバーサル”塩基と仮定
する）を含む。必要に応じて第1及び第2のセットから選択されるオリゴマーを結
合させることによって、410（106）の異なった配列がたった4,352分子を用いる
だけで生成され得る。対照的に、14-merの完全ライブラリーは414（2.7x108）分
子が必要だろう。
【００３２】 2成分のプライマーの第1オリゴヌクレオチド（プライマー成分P）は、天然に
見出されるホスホジエステル結合のみを含み、1又はそれ以上の修飾塩基（例え
ば、下記で定義されるユニバーサル及び同義性塩基）を含んでもよい。第2オリ
ゴヌクレオチド（アンカー成分A）は、RNA標的配列に対する高親和性結合を保証
するために修飾され、1又はそれ以上の修飾塩基及び修飾されたバックボーン結
合、例えば、ホスホロチオエート、デオキシホスホロチオエート、2'-O-置換ホ
スホジエステル及びデオキシアナログ、2'-O-置換ホスホジエステル及びデオキ
シアナログ、2'-O-置換ホスホロチオエート及びデオキシアナログ、モルホリノ
、ペプチド核酸（PNA；米国特許第5,539,082号を参照）、2'-O-アルキルメチル
ホスホネート、3'-アミデート、MMI、アルキルエーテル（Cookら、米国特許第5,
223,618号を参照）及びCookらの米国特許第5,378,825号、Sanghviら（米国特許
第5,489,677号）、Cookら（米国特許第5,541,307号）などに記述されている他の
ものを含む。
【００３３】 本発明における使用に適しているユニバーサル塩基は、デオキシ5-ニトロイン
ドール、デオキシ3-ニトロピロール、デオキシ4-ニトロベンズイミダゾール、デ
オキシネブラリン、デオキシイノシン、2'-OMeイノシン、2'-OMe 5-ニトロイン
ドール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-Fイノシン、2'-F ネブラリン、2'-F 5-
ニトロインドール、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、2'-F 3-ニトロピロール
、PNA-5-イントロインドール（introindole）、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン
、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルホリノ-5-ニ
トロインドール、モルホリノ-ネブラリン、モルホリノ-イノシン、モルホリノ-4
-ニトロベンズイミダゾール、モルホリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデー
ト-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート
-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデ
ート-3-ニトロピロール、2'-O-メトキシエチルイノシン、2'-O-メトキシエチル
ネブラリン、2'-O-メトキシエチル5-ニトロインドール、2'-O-メトキシエチル4-
ニトロ-ベンズイミダゾール、2'-O-メトキシエチル3-ニトロピロール、デオキシ
RpMP-5-ニトロインドールダイマー及び2'-OMeRpMP-5-ニトロインドールダイマー
を含むが、これらに限定されない。
【００３４】 本発明において使用に適した同義性塩基は、デオキシP（A&G）、デオキシK（U
&C）、2'-OMe 2-アミノプリン（U&C）、2'-OMe P（G&A）、2'-OMe K（U&C）、2'
-F-2-アミノプリン（U&C）、2'-F P（G&A）、2'-F K（U&C）、PNA-2-アミノプリ
ン（U&C）、PNA-P（G&A）、PNA-K（U&C）、モルホリノ-2-アミノプリン（U&C）
、モルホリノ-P（G&A）、モルホリノ-K（U&C）、ホスホルアミデート-2-アミノ
プリン（C&U）、ホスホルアミデート-P（G&A）、ホスホルアミデート-K（U&C）
、2'-O-メトキシエチル2-アミノプリン（U&C）、2'-O-メトキシエチルP（G&A）
、2'-O-メトキシエチルK（U&C）、デオキシRpMP-KPダイマー、デオキシRpMP-PK
ダイマー、デオキシRpMP-Kkダイマー、デオキシRpMP-PPダイマー、2'-OMe RpMP-
KPダイマー、2'-OMeRpMP-PKダイマー、2'-OMeRpMP-KKダイマー及び2'-OMeRpMP-P
Pダイマーを含むが、これらに限定されない。
【００３５】 結合部分は、共有結合的又は非共有結合的相互作用のいずれか、例えば非共有
結合ペアによって異なるセット由来の2つのオリゴマーを結合するように選択さ
れる。結合部分は、好ましくは、ライブラリー中の第1セットのオリゴヌクレオ
チドに存在する結合部分は相互に結合しないが、第2セットのオリゴヌクレオチ
ドの結合部分に容易に結合し、このようにしてオリゴヌクレオチドが意図した配
向で結合することを保証するように選択される。1つの実施形態において、結合
部分は相補的なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログである。
【００３６】 本発明のプライマーペアはまた核酸配列決定に使用することもでき、図1A及び
1Bに示されるリバース又はフォーワードユニバーサルプライマーを含まないこと
を除いて、核酸増幅に使用するものと同じである。例えば、図1A で示されるよ
うなFA/FPアンカー／プライマーペア又は図1Bで示されるようなRA/RPアンカー／
プライマーペアは、当分野で周知のこととして実施される配列決定反応をプライ
ムするために使用されてもよい。更に、これらの配列決定プライマーペアのステ
ム構造は、ユニバーサルプライマーに相補的な領域を含んでもよいし含まなくて
もよい。
【００３７】 実施例1 PKCαの増幅 以下に示す配列中、L=Glen Research由来のリンカー（spacer 18、カタログ番
号10-1918-90又はspacer 9、カタログ番号10-1909-90）、下線を引いた小文字の
ヌクレオチドは遺伝子特異的配列であり、下線を引いた大文字のヌクレオチドは
ステム配列領域である。本実施例において、全プライマーは非修飾DNAバックボ
ーンのみを含み、C-5プロピニル-C及びC-5プロピニル-Uのようないくつかの高親
和性修飾塩基を含む。アンカーは2'-OMe-修飾糖バックボーン及びC-5-プロピニ
ル-Cを含む。本実施例の遺伝子特異的領域は、合計の長さで12塩基（アンカー及
びプライマーのそれぞれから6）から24塩基（アンカー及びプライマーのそれぞ
れから12）の範囲にわたる。ステップ領域(step region)は24塩基の長さであり
、ユニバーサルプライマー（FUP及びRUP）は19又は14塩基の長さである。
【００３８】
【化１】
【００３９】 PCRは上記のパラメータを使用して行われる。最終産物のサイズは1%アガロー
スゲル電気泳動により実証する。増幅されたPCRフラグメントを、市販のPCRクリ
ーニングキット（例えば、キアゲン（Qiagen））を用いてきれいにし、精製し、
細胞又は組織のインビトロ又はインビボトランスフェクションに使用され得る。
【００４０】 本明細書中で述べられる実施例は、核酸配列のPCR増幅のための増幅プライマ
ーペアに関連するが、これらのプライマーペアは任意のDNA又はRNAポリメラーゼ
プライミング活性に使用され得る。例えば、これらのプライマーペアは、鎖置換
増幅（SDA）（Walker, PCR Methods Appl. 3:1-6, 1993; Spargoら、Mol.Cell.P
robes 10:247-256, 1996）、自己維持配列複製（3SR）及びインシテュー自己維
持配列複製（IS-3SR）（Muellerら、Histochem.Cell Biol. 108:431-437, 1997
）、ローリングサークル増幅（RCA）（Lizardiら、Nature Genet. 19:225-232,
1998）、及び核酸配列ベースの増幅（NASBA）（Heimら、Nucl.Acids Res. 26:22
50-2251, 1998; Romanoら、Immunol.Invest. 26:15-28, 1997）のような、商売
上PCRと競争して用いられる非サーモサイクリングプライマー依存増幅技術にお
いて用いられ得る。
【００４１】 本発明の特定の実施形態を詳細に述べたが、限定ではなく具体例であること、
本発明の真の範囲は以下の請求項で定義されるということは当業者に明らかであ
る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図1A及び1Bはそれぞれ、フォーワード及びリバース増幅プライマーペ
アの概略図である。各プライマーペアは図で示されるプライマーペアを形成する
ために結合した個々のオリゴヌクレオチドのライブラリーから生成される。プラ
イマーペアの1つの成分はアンカーと呼ばれ（フォーワードアンカー=FA；リバー
スアンカー=RA）、もう1つの成分はプライマーと呼ばれる（フォーワードプライ
マー= FP；リバースプライマー=RP）。2つの成分はステムと呼ばれる相補的なオ
リゴヌクレオチドの領域によって非共有結合的に結合している。アンカーはリン
カーによってステムに結合してもよい。フォーワードユニバーサルプライマー（
FUP）及びリバースユニバーサルプライマー（RUP）はそれぞれ、フォーワード及
びリバースステムに相補的である。プライマーペアは、適当な個々のオリゴヌク
レオチド配列を選択することによって、特定の遺伝子配列を増幅するために作ら
れる。リバースプライマーは、第1鎖のcDNA合成をプライムし、フォーワードプ
ライマーは第2鎖のcDNA合成をプライムする。
【図２】図2は、任意のリンカー、ステム、任意のテイル及びユニバーサルプ
ライマーを示す増幅プライマーペアの概略図である。
【図３】図3は、個々のオリゴヌクレオチドのライブラリーから生成される増
幅プライマーペアを用いた本発明の方法の概略図である。RA及びFAは、最大の結
合アフィニティのための複数の修飾塩基及び結合を含むオリゴヌクレオチドであ
り、核酸増幅反応をプライムできない（即ち、3'-OH基を含まない）。これらの
成分はフレキシブルリンカーを含んでもよい。RP及びFPは増幅プライマーとして
の機能を果たし、得られるDNA分子中に取り込まれる。第1鎖のcDNA合成はRPによ
ってプライムされ、第2鎖のcDNA合成はFPによってプライムされる。FA及びRAは
増幅反応の間に置換される。RUP及びFUPはそれぞれ、増幅されたcDNA中に取り込
まれる、RP及びFPの一部分に相補的なユニバーサルプライマーである。RUP及びF
UPプライマーはそれぞれ、産生鎖合成をリバース及びフォーワードする。最終産
物はRUP及びFUPを含む2本鎖アンプリコンである。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月１４日（２００１．１１．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA11 HA11 HA19 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR42 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 オリゴヌクレオチドアンカー及びプライマーを含む増幅プラ
    イマーペアであって、前記アンカーが逆転写酵素又はDNAポリメラーゼの基質で
    はない核酸の化学的性質(nucleic acid chemistry)を有し、及び／又は核酸合成
    をプライムすることができない3'-末端を有し、； 前記プライマーが逆転写酵素又はDNAポリメラーゼの基質である核酸の化学的
    性質を有し；かつ、 前記アンカー及び前記プライマーがそれぞれ、ステム構造を形成するために相
    互に結合することができる相補的なヌクレオチドの領域を含み、該ステム構造が
    ユニバーサルプライマーに相補的な領域を含む、増幅プライマーペア。
  2. 【請求項２】 前記アンカー配列及び前記ステム領域がフレキシブルリンカ
    ーによって結合されている請求項1のプライマーペア。
  3. 【請求項３】 フレキシブルリンカーがポリエチレングリコール、ポリプロ
    ピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド及びポリエステ
    ルからなる群から選ばれる請求項2のプライマーペア。
  4. 【請求項４】 前記プライマーが前記アンカーの前記ステム領域の長さを超
    えて伸長するテイル領域を含む請求項1のプライマーペア。
  5. 【請求項５】 前記プライマーが1又はそれ以上の修飾塩基を含む請求項1の
    プライマーペア。
  6. 【請求項６】 前記アンカーが1又はそれ以上の修飾されたバックボーン結
    合を含む請求項1のプライマーペア。
  7. 【請求項７】 前記アンカー及び前記プライマーがそれぞれ6〜24塩基の長
    さである請求項1のプライマーペア。
  8. 【請求項８】 前記ステム構造の領域に相補的であるユニバーサルプライマ
    ーとさらに共同している(in association with)請求項1のプライマーペア。
  9. 【請求項９】 オリゴヌクレオチドアンカー及びプライマーを含む配列決定
    プライマーペアであって、前記アンカーが逆転写酵素又はDNAポリメラーゼの基
    質ではない核酸の化学的性質を有し、及び／又は核酸合成をプライムすることが
    できない3'-末端を有し、； 前記プライマーが逆転写酵素又はDNAポリメラーゼの基質である核酸の化学的
    性質を有し；かつ、 前記アンカー及び前記プライマーがそれぞれ、ステム構造を形成するために相
    互に結合することができる相補的なヌクレオチドの領域を含む、配列決定プライ
    マーペア。
  10. 【請求項１０】 前記ステム構造がユニバーサルプライマーに相補的な領域
    を含む請求項9のプライマーペア。
  11. 【請求項１１】 前記アンカー配列及び前記ステム領域がフレキシブルリン
    カーによって結合されている請求項10のプライマーペア。
  12. 【請求項１２】 前記フレキシブルリンカーがポリエチレングリコール、ポ
    リプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド及びポリ
    エステルからなる群から選ばれる請求項11のプライマーペア。
  13. 【請求項１３】 前記プライマーが前記アンカーの前記ステム領域の長さを
    超えて伸長するテイル領域を含む請求項10のプライマーペア。
  14. 【請求項１４】 前記プライマーが1又はそれ以上の修飾塩基を含む請求項9
    のプライマーペア。
  15. 【請求項１５】 前記アンカーが1又はそれ以上の修飾されたバックボーン
    結合を含む請求項9のプライマーペア。
  16. 【請求項１６】 前記アンカー及び前記プライマーがそれぞれ６〜24塩基の
    長さである請求項9のプライマーペア。
  17. 【請求項１７】 前記ステム構造の領域に相補的であるユニバーサルプライ
    マーとさらに共同している(in association with)請求項9のプライマーペア。
  18. 【請求項１８】 以下の工程を含む標的核酸配列の増幅方法： 標的核酸配列をフォーワードアンカー（FA）、フォーワードプライマー（FP）、
    リバースアンカー（RA）、リバースプライマー（RP）、フォーワードユニバーサ
    ルプライマー（FUP）及びリバースユニバーサルプライマー（RUP）と結合させる
    工程、ここで、それらの相補的ステム領域の結合を介して前記FA/FPが第1プライ
    マーペアを形成し、前記RA/RPが第2プライマーペアを形成し、前記FUPがFA/FPス
    テム領域に相補的であり、前記RUPがRA/RPステム領域に相補的であり、前記プラ
    イマーペアが前記標的核酸配列の側面に位置するために標的核酸配列への相補性
    に基いて選択される：および、 酵素媒介増幅により前記核酸配列を増幅する工程。
  19. 【請求項１９】 前記核酸配列が治療的遺伝子産物をコードする請求項18の
    方法。
  20. 【請求項２０】 前記核酸配列がDNA又はRNAである請求項18の方法。
  21. 【請求項２１】 前記酵素媒介増幅がPCR増幅である請求項18の方法。
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