CN109517888B

CN109517888B - 使用等位基因特异的反应性引物的核酸扩增方法

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Publication number: CN109517888B
Application number: CN201811303065.8A
Authority: CN
Inventors: 安城皖; 吴泰祯
Original assignee: Genomictree Inc
Current assignee: Genomictree Inc
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2033-04-16
Also published as: DK2982762T3; WO2014163225A1; CN105247071A; ES2693133T3; US10023908B2; KR20150088772A; EP2982762A1; CN105247071B; KR101557975B1; EP2982762B1; KR20150089987A; KR101600039B1; KR20140119602A; TR201815755T4; EP2982762A4; US20160194695A1; CN109517888A

Abstract

本发明涉及一种使用被设计成解决传统等位基因特异性PCR的问题的等位基因特异的反应性引物(ASRP)来扩增核酸的方法，更具体地，本发明涉及靶核酸的检测方法，包括具有校对活性的DNA聚合酶和与靶核酸互补的碱基序列，其中在ASRP存在下扩增靶核酸，所述ASRP被修饰为使得位于来自与引物5’方向上不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中的一个或多个修饰核苷酸，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物。根据本发明的使用ASRP的检测方法由于ASRP和校对DNA聚合酶的特性而成为具有非常高特异性的技术，并且能够有效地检测包括单核苷酸多态性(SNP)在内的突变(点突变、插入、缺失)。此外，该方法也可以用于检测亚硫酸氢盐处理后的CpG甲基化的存在，或者扩增并检测DNA文库中从所需核苷酸序列开始的靶DNA。

Description

使用等位基因特异的反应性引物的核酸扩增方法

本发明申请是基于申请日为2013年04月16日，申请号为201380077114.X(国际申请号为PCT/KR2013/003185)，发明名称为“使用等位基因特异的反应性引物的核酸扩增方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种使用被设计成解决传统等位基因特异性PCR的问题的等位基因特异的反应性引物(ASRP)来扩增核酸的方法，更具体地，涉及用于检测靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下扩增靶核酸，所述ASRP包括：i)与靶核酸互补的核苷酸序列，和ii)一个或多个修饰核苷酸，位于来自与引物5’方向上不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是当一个单核苷酸被其它三种核苷酸之一替换时发生的DNA序列的遗传变异。它导致个体间的差异，如致病原因或对治疗药物的反应。单核苷酸多态性的检测和鉴定不仅与个性化的药物相关联，也与新药开发相关联，因此已经受到了大量的关注。

对于单核苷酸多态性的快速检测，已使用基于实时PCR技术的各种检测方法。这些检测方法的典型实例包括使用DNA嵌入荧光染料的测定法，使用DNA探针的测定法和使用PNA探针的测定法。然而，这些方法的缺点在于使用DNA嵌入荧光染料是受限的并且需要使用用于分析熔解曲线的程序(Kirk M.Ririe et al.,Analytical Biochemistry 245:154,1997；U.Hladnik et al.,Clin Exp Med,2:105,2002)。

具有3'→5'校对活性的DNA聚合酶确保了DNA复制的高保真性(Drake,J.W.et.al.,Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,33:339,1968；Drake,J.W.et.al.,Nature,221:1128,1968；Goodman,M.F.et.al..Genetics,148:1475,1998)，并且已经发现了很多具有3'核酸外切酶活性的校对聚合酶。

具有校对活性的DNA聚合酶确保了体内DNA复制的高保真性，但是，当将具有校对活性的DNA聚合酶应用到利用常规等位基因特异性的引物所进行的聚合酶链式反应时，存在这样的问题，即，因为在3'端不匹配的碱基被除去，所以无论引物与用作模板的DNA是完全杂交或是不完全杂交，引物的末端都会延伸(Zhang,J.et al.,Mol.Biotechnol.,24:105,2003)。

由于这个问题，在研究突变检测中几乎不使用具有校对活性的DNA聚合酶。然而近几年，已经出现了针对于使用修饰引物的3’端的方法来检测靶核酸中的突变的方法的研究，例如标记引物的3’端或将3'核酸外切酶抗性因子缀合至3'端的方法，或除去核苷酸的3'端的-OH基团或用其他残基置换该-OH基团的方法(Zhang,J.et al.,Current DrugDisc.,9:21,2001；Bi,W.L.and Sambrook,P.J.,Nucleic Acids Res.,26:3073,1998)。

例如，在引物的3'端被标记的情况下，当引物互补结合到模板DNA时，产生扩增终产物，同时在3'端的标签被保持，但是当引物不匹配模板DNA时，在3'端的标签被具有校对活性的DNA聚合酶在校对时去除，因此产生不含标签的扩增终产物，这表明可以基于标记的存在或不存在来检测突变。基于这个原理，可以将具有以各种方式进行3'端修饰的等位基因特异性引物，以及具有校对活性的DNA聚合酶，应用于包括实时PCR、多孔板和微阵列技术的各种平台。

因此，本发明人进行了广泛的努力，以使用3'端修饰的引物和具有校对活性的DNA聚合酶来检测靶核酸，并且结果发现，在具有校对活性的DNA聚合酶存在下，使用其中核苷酸的3'端被修饰的等位基因特异的反应性引物(ASRP)，特异地扩增出靶核酸，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种使用等位基因特异的反应性引物(ASRP)来检测靶核酸的方法，以及用于从DNA文库选择性地扩增靶核酸的方法，所述等位基因特异反应性引物(ASRP)包括与靶核酸互补的核苷酸序列，以及一个或多个修饰核苷酸，位于来自与引物5’方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能充当聚合酶反应的引物。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下，扩增靶核酸，所述等位基因特异反应性引物(ASRP)包括：i)与靶核酸互补的核苷酸序列，和ii)一个或多个修饰核苷酸，位于来自与引物5’方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能充当聚合酶反应的引物。

本发明还提供从DNA文库扩增以特定核苷酸序列开始的靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下，从DNA文库中扩增靶核酸，所述靶核酸包括在其5'端与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列，和在3'端与靶核酸互补的核苷酸序列和修饰核苷酸，以便在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物。

本发明还提供了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括在下述物质存在下扩增靶核酸：(i)等位基因特异的反应性引物(ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含与靶核酸不互补的核苷酸序列的标签序列，修饰单核苷酸和与靶核酸互补的核苷酸序列，所述等位基因特异的反应性引物(ASRP)在其3’端具有一个或多个使得在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸；(ii)标签序列和报告子模板，所述报告子模板含有与靶核酸互补的核苷酸序列的一部分；和(iii)具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

附图说明

图1是示出利用等位基因特异的反应性引物(ASRP)的检测系统的示意图。

图2示出使用通用引物和ASRP检测单核苷酸突变来进行PCR扩增实验的结果。

图3示出使用通用引物和ASRP检测甲基化来进行PCR扩增实验的结果。

图4是示出使用等位基因特异的反应性引物(ASRP)从DNA文库扩增从所需核苷酸序列开始的靶DNA的过程的示意图。

图5是示出使用等位基因特异的反应性引物(ASRP)和具有3'→5'核酸外切酶活性且没有校对活性的DNA聚合酶的检测系统的示意图，该ASRP包括标签序列，修饰单核苷酸和与靶核酸互补的靶特异性序列。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员的通常理解相同的含义。通常，本文中使用的命名法是众所周知且在本领域中常用的。

在一个方面，本发明涉及一种检测靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下，扩增靶核酸，所述ASRP包括i)与靶核酸互补的核苷酸序列，和ii)一个或多个修饰核苷酸，位于来自与引物5’方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能充当聚合酶反应的引物。

用于本发明中的等位基因特异的反应性引物(以下，称为“ASRP”)，是被设计用来解决传统等位基因特异性PCR的问题的引物。根据本发明，可以使用具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物，特异地扩增靶核酸，所述等位基因特异的反应性引物包括与靶核酸互补以便能够特异性地扩增所需等位基因的核苷酸序列，和位于来自与引物5’方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中的一个或多个修饰核苷酸，在3'端存在不互补的核苷酸时，该不互补的核苷酸将被DNA聚合酶的校对活性除去，以使在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能充当聚合酶反应的引物。

如本文所用，术语“靶核酸”是指待检测的核酸序列(DNA或RNA)，并且该靶核酸在杂交、退火或扩增的条件下与引物或探针杂交。术语“靶核酸”与本文所用的术语“靶核酸序列”或“靶序列”互换使用。

如本文所用，术语“杂交”是指互补的单链核酸形成双链核酸。当两条核酸链之间的互补性是完全的(完全匹配)或当存在一些不匹配的残基时，可以发生杂交。用于杂交的互补性水平可以因杂交条件，特别是温度变化而变化。

在本发明中，等位基因特异的反应性引物的特征在于，如果毗邻等位基因特异的反应性引物的修饰核苷酸3'侧的核苷酸是与靶核酸互补的，它不被DNA聚合酶的校对活性除去，而如果该核苷酸与靶核酸不是互补的，它被DNA聚合酶的校对活性除去，由此使修饰核苷酸保留在3'端。

在本发明中，具有校对活性的DNA聚合酶可以具有3'→5'核酸外切酶活性。

在本发明中，不能用作DNA聚合酶反应的引物的修饰‘核苷酸’，是可被选自脱氧核苷酸及反转(逆转)脱氧核苷酸中至少一种置换的核苷酸，在本发明的一个例子中，使用其中在3'端的核苷酸被脱氧核苷酸置换的ASRP，但不限于此，并且可以使用本领域中已知的任何常规的核苷酸修饰方法。

根据本发明用于检测靶核酸的方法具体包括以下步骤：(a)混合靶核酸与等位基因特异的反应性引物(ASRP)并杂交，得到杂交产物；(b)在具有校对活性的DNA聚合酶的存在下，扩增杂交产物中的靶核酸；和(c)基于所述靶核酸的扩增产物存在与否，检测靶核酸。

在本发明中，对于在ASRP存在下的靶特异性扩增，应该使用具有3'→5'校对核酸外切酶的DNA聚合酶。在DNA聚合酶存在下，当通用引物结合模板DNA(靶核酸)，如果引物3'端与模板DNA是互补的，DNA聚合酶反应在5'→3'方向进行而不进行校对(图1A)，而当在3’端的一个或多个核苷酸与模板是不互补的，不管不互补的核苷酸的数目是多少，都进行切割所有核苷酸的校对反应，然后合成与模板互补的新核苷酸序列(图1B)。在使用根据本发明的ASRP的情况下，当引物3'端与模板是互补的，DNA聚合酶反应在5'→3'方向进行而不进行校对(图1C)，就像使用通用引物一样，而当在3'端的核苷酸与模板是不互补的，不管不互补的核苷酸的数目是多少，所有不互补的核苷酸都被校对反应除去(图1D)。校对反应完成后，在3'端保持脱氧核苷酸，并且DNA聚合酶反应停止，因为具有该结构的ASRP不能作为聚合酶反应的引物。因此，当使用具有校对活性的DNA聚合酶和ASRP的组合来诱导DNA聚合酶反应时，只有具有特异序列的模板DNA才可以被选择性扩增，因为ASRP使得只有当它遇到与其互补的模板时才发生聚合酶反应。

在本发明中，等位基因特异的反应性引物(ASRP)的浓度可以为0.1-20M，并且在步骤(b)中的扩增可以通过聚合酶链反应(PCR)进行。

在本发明中，如果等位基因特异的反应性引物与靶核酸是互补的，产生靶核酸的扩增产物(匹配/开)，并且如果等位基因特异的反应性引物与靶核酸是不互补的，通过DNA聚合酶的校对活性除去不匹配的核苷酸，并且由于保留在引物3'端的修饰核苷酸，不产生靶核酸的扩增产物(不匹配/关)。

在本发明中，靶核酸可以是DNA或RNA，并且可以使用本发明的靶核酸检测方法来检测突变或病原体。

当本发明的方法用于检测突变时，不仅可以检测单核苷酸多态性，还可以检测由靶核酸的核苷酸的置换、缺失或插入引起的突变。此外，如果在靶核酸中不存在突变，那么产生靶核酸的扩增产物，如果在靶核酸中存在突变，那么不产生靶核酸的扩增产物。

在本发明的一个例子中，为了使用本发明的等位基因特异的反应性引物(ASRP)检测突变，进行对BRAFV600E体细胞点突变这一典型的癌症细胞突变的检测实验。结果可以看出，当使用通用引物时，不仅扩增了BRAFV600E突变(图2中的泳道2)，而且也发生了野生型BRAF的非特异性扩增(图2中的泳道1)。然而，当使用ASRP进行PCR时，未扩增用作模板的野生型BRAF(图2中的泳道4)，并且仅扩增了作为模板的BRAFV600E突变(图2中的泳道5)。

使用本发明的方法检测病原体的方法的特征在于，靶核酸的扩增产物是在病原体存在时产生的，而在不存在病原体时不产生。用于本发明的病原体是引起疾病的微生物，并且可选自包括病毒、真细菌、真菌和原生动物的组，但不限于此，并且包括可以感染人类或动物而直接引起疾病的任何生物体。

另外，本发明的靶核酸检测方法可以用于检测胞嘧啶甲基化的基因。在这种情况下，产生甲基化的靶核酸的扩增产物，并且不产生未甲基化的靶核酸的扩增产物。

如本文所用，术语“甲基化”是指甲基连接于胞嘧啶环的5-碳而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。5-甲基胞嘧啶始终只连接于CG二核苷酸(5'-mCG-3')的C，并且这一CG经常表示为CpG。这一CpG的甲基化抑制基因组中重复序列(如alu或转座子)的表达。此外，CpG是哺乳动物细胞中最常发生表观遗传变化的位点。这一CpG的5-mC自然脱氨基为T，并且因此所述CpG在哺乳动物基因组中显示的频率仅为1％，这比正常频率(1/4x 1/4＝6.25％)低得多。

CpG异常整合的区域被称为CpG岛。CpG岛是指长度0.2-3kb，并具有超过50％的C+G含量和大于3.75％的CpG比的位点。在人类基因组中有大约45,000个CpG岛，并且发现它们大多在启动子区调控基因表达。实际上，CpG岛发生在持家基因的启动子中，约占人类基因的50％(Cross,S.&Bird,A.P.,Curr.Opin.Gene Develop.,5:309,1995)。

根据本发明的用于检测甲基化的靶核酸的方法具体包括步骤：(a)化学或酶处理靶核酸以将未甲基化的胞嘧啶核苷酸转换为尿嘧啶或除了胞嘧啶以外的其他核苷酸而不转换甲基化的胞嘧啶核苷酸；(b)将化学或酶处理过的靶核酸与等位基因特异的反应性引物(ASRP)混合并杂交，得到杂交产物，并在具有校对活性的DNA聚合酶存在下，扩增在杂交产物中的靶产物；和(c)基于靶核酸的扩增产物存在与否，检测靶核酸的甲基化。

根据本发明使用ASRP检测靶核酸的甲基化的方法包括化学或酶处理靶核酸以将未甲基化的胞嘧啶核苷酸转换为尿嘧啶或除了胞嘧啶以外的其他核苷酸而不转换甲基化的胞嘧啶核苷酸的步骤。对于甲基化的核酸的检测，应该使用具有3'→5'校对核酸外切酶的DNA聚合酶。当通用引物结合模板并且引物3'端与甲基化的靶核酸互补时，DNA聚合酶反应在5'→3'方向进行而不进行校对。当未甲基化的胞嘧啶核苷酸转换为尿嘧啶或除了胞嘧啶以外的其他核苷酸时，即使在3’端的核苷酸与模板是不互补的，也通过DNA聚合酶的校对活性进行切割不互补的核苷酸的校对反应，然后合成与模板互补的新核苷酸序列。在使用本发明的ASRP的情况下，当引物3'端与甲基化的靶核酸互补时，DNA聚合酶反应在5'→3'方向进行而不进行校对，而当未甲基化的胞嘧啶核苷酸被转换为尿嘧啶或除了胞嘧啶以外的其他核苷酸，并且引物3'端与模板不互补时，不互补的核苷酸被DNA聚合酶的校对反应除去。校对反应完成后，脱氧核苷酸保持在3'端，并且DNA聚合酶反应停止，因为具有该结构的ASRP不能作为DNA聚合酶反应的引物。

在本发明的另一实例中，为了使用本发明的等位基因特异的反应性引物(ASRP)来检测甲基化基因，进行对人SDC2基因的甲基化检测的实验。结果表明，当使用通用引物时，即使是使用甲基化特异性引物，对甲基化的SDC2(图3中的泳道1)和未甲基化的SDC2(图3中的泳道2)都出现扩增产物，而当使用SDC2甲基化特异性ASRP时，对甲基化的SDC2观察到特定的扩增产物(图3中的泳道4)，但对未甲基化的SDC2没有发生扩增(图3中的泳道5)。

在本发明中，用于将未甲基化的胞嘧啶核苷酸转换为尿嘧啶的化合物可以是亚硫酸氢盐。在本发明的一个实施例中使用的SDC2是使用其中胞嘧啶核苷酸改变为尿嘧啶的核苷酸序列所合成的基因，并且在该例子中省略亚硫酸氢盐处理过程。

在另一个方面，本发明涉及从DNA文库扩增以特定核苷酸序列开始的靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下，扩增来自DNA文库的特定核酸，所述ASRP在其5'端包括与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列，以及在其3'端包括与靶核酸互补的核苷酸序列和使得在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸。

如本文所用，术语“DNA文库”是指足够包括存在于特定生物体中的所有单个基因的克隆数量的集合。基因组DNA文库是通过分离总细胞DNA，部分消化分离的DNA，并将产生的片段克隆到载体中来构建的。作为载体，使用可以克隆大的基因或基因簇的BAC、YAC、福斯质粒、粘粒等，但是也使用常用的质粒。

在本发明中，可以从DNA文库选择地扩增包含靶核酸的核苷酸序列的DNA片段。根据本发明的方法，可以使用等位基因特异的反应性引物从下一代测序(NGS)文库中扩增具有特异的核苷酸序列的靶核酸。

根据本发明的从DNA文库扩增具有特定核苷酸序列的靶核酸的方法特别包括以下步骤：(a)随机消化基因组DNA，并将测序接头序列连接到经消化的DNA片段的5'和3’两末端，以制备DNA文库；(b)将DNA文库与等位基因特异的反应性引物(ASRP)混合并杂交，其中所述等位基因特异的反应性引物(ASRP)包括与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列和一个或多个修饰核苷酸，所述修饰核苷酸位于来自与引物5’方向的不互补的核苷酸紧邻的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的区域中，其将在3'端存在不互补的核苷酸时，被DNA聚合酶的校对活性除去，以使在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应的引物；和(c)在具有校对活性的DNA聚合酶存在下，进行杂交产物中从特定核苷酸序列开始的扩增。在该方法中，如果靶核酸存在于DNA文库中，它互补地结合等位基因特异的反应性引物，以产生扩增产物，并且如果靶核酸与等位基因特异的反应性引物是不互补的，不互补的核苷酸被DNA聚合酶的校对活性除去，由于在3'端残留的修饰核苷酸，因此不产生扩增产物。

根据本发明的方法，通过随机地消化基因组DNA来制备DNA片段，将测序接头序列连接到DNA片段的5'和3'两末端以构建DNA文库，并从DNA库中选择性地扩增具有特定核苷酸序列的DNA片段，可以进行新一代测序(NGS)。如图4A所示，构建一文库，然后，例如，如果N(A、T、C、G)(与核苷酸接头序列的端部核苷酸紧邻的第一个核苷酸)与ASRP是互补的，文库被扩增而不进行校对，如果位于修饰核苷酸的3’端的一个或多个核苷酸是不互补的，那么所述核苷酸通过校对被除去并且不会发生聚合，所述修饰核苷酸选自包括来自3’端的第二个核苷酸至用于测序的接头的5’端的核苷酸的核苷酸。因此，根据该方法，只有含从特定核苷酸开始的基因组DNA片段的DNA片段，才可以被选择性地从DNA文库中扩增。

根据本发明，可以从DNA文库扩增甲基化的靶核酸。具体地说，扩增甲基化的靶核酸的方法包括以下步骤：(a)化学或酶处理基因组DNA以将未甲基化的胞嘧啶核苷酸转换为尿嘧啶或其他核苷酸而不转换甲基化的胞嘧啶核苷酸；(b)随机消化基因组DNA，并将测序接头连接到经消化的DNA片段的5'和3'两端，以构建DNA文库；(c)将DNA文库与等位基因特异的反应性引物(ASRP)混合并杂交，其中所述ASRP包括与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列和在3'端的胞嘧啶和一个或多个使得在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸；和(d)在具有校对活性的DNA聚合酶存在下，扩增杂交产物中包含甲基化的靶核酸的核苷酸序列的DNA片段，其中甲基化的靶核酸被扩增而未甲基化的靶核酸不被扩增。

当用亚硫酸氢盐处理基因组DNA后执行新一代测序(NGS)时，新一代测序(NGS)可以通过使用本发明的方法从通过将测序序列连接到5'和3'两端而构建的文库，选择性地扩增具有甲基化的核苷酸序列的DNA片段来实现。如图4B所示，当使用亚硫酸氢盐处理的基因组DNA来构建的文库是使用具有校对活性的DNA聚合酶以及ASRP来扩增时，所述ASRP制备成在5'端具有接头序列并且在3'端具有脱氧修饰的核苷酸序列和甲基化的胞嘧啶(C)序列，如果DNA文库中的DNA片段的第一核苷酸为甲基化的胞嘧啶，DNA片段被扩增而不校对，并且如果核苷酸是不互补的，它被校对反应除去，并且DNA片段由于在3'端剩余的修饰核苷酸而不被扩增。因此，根据该方法，可以从DNA文库中选择性地扩增含有甲基化的DNA片段的DNA片段。

在又一个方面，本发明涉及一种检测靶核酸方法，该方法包括在下述物质存在下，扩增靶核酸：(i)等位基因特异的反应性引物(ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含与靶核酸不互补的核苷酸序列的标签序列，修饰单核苷酸和与靶核酸互补的核苷酸序列，所述等位基因特异的反应性引物(ASRP)具有使得引物不能作为DNA聚合酶引物的3'端修饰；(ii)报告子模板，包括标签序列和与靶核酸互补的核苷酸序列的一部分；和(iii)具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

在本发明中，等位基因特异的反应性引物的标签序列可以包括15-30个核苷酸，并且修饰单核苷酸不能作为DNA聚合酶的引物。

根据本发明的报告子模板在3'端包括，能够结合到标签序列的核苷酸序列和能够互补结合到与靶核酸(目标特异性序列)互补的核苷酸序列的单核苷酸(N：A、T、C或G)，并且在5'端包括，具有20bp或更大的大小的人工序列。

根据本发明用于检测靶核酸的方法具体包括以下步骤：(a)将靶核酸与下述物质混合并杂交：(i)等位基因特异的反应性引物(ASRP)，它包括，在5'端包含与靶核酸不互补的核苷酸序列的标签序列，修饰单核苷酸，与靶核酸互补的核苷酸序列以及在3’端具有一个或多个使得在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸；(ii)标签序列和含有与靶核酸互补的核苷酸序列的一部分的报告子模板；和(iii)与靶核酸互补的引物；(b)通过具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶除去等位基因特异的反应性引物的一部分，其中包括不与靶核酸杂交的5'端标签序列，接着与报告子模板杂交；和(c)扩增杂交的报告子模板，并基于是否存在报告子模板的扩增产物来检测靶核酸。在此方法中，如果不存在靶核酸或靶核酸含有突变，那么产生报告子模板的扩增产物，如果存在靶核酸，那么不产生扩增产物。

如图5所示，在本发明中，为使用具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶进行PCR，将能够互补地结合于模板的中间部分(靶核酸)的等位基因特异的反应性引物构建到引物两端。本发明的等位基因特异的反应性引物具有使得它不能作为DNA聚合酶引物和PCR反应引物的3'端修饰。对于等位基因特异的反应性引物的5'端连接的标签序列，其结合于报告子模板以用作第二次PCR的模板，并且可以作为PCR引物。向标签序列连接修饰成脱氧核苷酸(dN：dA、dT、dG或dC)的单核苷酸，和与靶核酸(靶特异性序列)互补的核苷酸序列。

在本发明中，如果位于等位基因特异的反应性引物的修饰单核苷酸(dN)3'端的核苷酸(N)与靶核酸相匹配，那么通过具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶制成包含连接到标签序列3’端的修饰单核苷酸(dN)的片段。该片段可互补地结合报告子模板，但该片段不会发生扩增并且不会产生该片段的扩增产物，因为在3'端的核苷酸被修饰成脱氧核苷酸。但是，位于等位基因特异的反应性引物的修饰单核苷酸(dN)3'端的核苷酸(N)与靶核酸的核苷酸序列由于靶核酸的突变而不匹配时，在标签序列3'端的修饰单核苷酸(dN)和位于修饰单核苷酸(dN)3’端的核苷酸(N：A，T，G或C)被具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶以连接状态去除，并因此制成能够互补地结合报告子模板的片段。该片段互补结合到报告子模板，并且一般的核苷酸(N)而不是修饰核苷酸被连接到该片段3'端。因此，该片段发生扩增，并且产生该片段的扩增产物。

在本发明中，靶核酸可以是DNA或RNA，并且本发明的靶核酸检测方法可以用于检测突变。

当使用本发明的方法检测突变时，不仅可以检测单核苷酸多态性，还可以检测由核苷酸的置换、缺失或插入引起的突变。此外，如果在靶核酸中不存在突变，那么产生报告子模板的扩增产物，如果在靶核酸中存在突变，那么不产生报告子模板的扩增产物。

可以制备含有本发明的等位基因特异的反应性引物(ASRP)的试剂盒。根据预期用途，可以各种方式来配置该试剂盒。优选地，试剂盒可用于检测靶核酸中的突变，检测靶核酸的甲基化，以及从DNA文库中选择性扩增靶核酸。

根据预期的用途，本发明的试剂盒可包括具有校对活性的DNA聚合酶或具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶，并且可以任选地包括靶扩增PCR反应(例如，PCR反应)所需的试剂如缓冲液和脱氧核糖-5-磷酸。任选地，本发明的试剂盒还可以包括各种多核苷酸分子，各种缓冲液，试剂，和抑制DNA聚合酶活性的抗体。

在试剂盒中，在特定反应中使用的最佳试剂量可以由本领域的技术人员从本说明书的公开内容来确定。通常，本发明的试剂盒是制备成含有上述组分的单独的包或隔室。

实施例

以下，参照实施例对本发明进行更详细说明。对本领域的普通技术人员显而易见的是，这些实施例是说明性的目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。

实施例1：使用ASRP检测BRAFV600E突变

为了使用本发明的等位基因特异的反应性引物(ASRP)检测突变，进行对(BRAFV600ET1799A)体细胞点突变这一典型的癌症细胞突变的检测实验。

为制备野生型BRAF(B型Raf激酶；SEQ ID NO：1)的突变(BRAFV600E(SEQ ID NO：2)，合成具有T到A的突变的BRAFV600E基因(Bioneer，韩国)，并用TOPcloner TA核心试剂盒(Enzynomics，韩国)(Bioneer，韩国)克隆到pTOP TA V2质粒载体(Enzynomics，韩国)。对于BRAFV600E点突变的扩增，合成(Bioneer，韩国)具有BRAFV600E互补序列的正向通用引物(SEQ ID NO：3)，具有BRAFV600E互补序列和具有在3'端的第二核苷酸的脱氧鸟嘌呤(dG)置换的正向ASRP引物(SEQ ID NO：4)，和具有BRAFV600E互补序列的反向引物(SEQ ID NO：5)：

[SEQ ID NO：3]5'-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3'

[SEQ ID NO：4]5'-GTGATTTTGGTCTAGCTACA[dG]A-3'

[SEQ ID NO：5]5'-TTCTAGTAACTCAGCAGCATCTC-3'

将10⁵拷贝的野生型BRAF和BRAFV600E突变质粒用作PCR扩增的模板，并且作为具有3'→5'校对活性的DNA聚合酶，使用Pfu聚合酶(HelixAmp^TM Power-Pfu Polymerase，Nanohelix，韩国)。使用

热循环仪(Applied Biosystems，新加坡)进行PCR，并且PCR条件如下。将10⁵拷贝的模板，2.5μl的10X Power-pfu缓冲液，1μl的dNTP混合物(10mM)，1μl每种引物(4pmole/μl)，以及Pfu聚合酶(HelixAmp^TM Power-Pfu Polymerase，1.25单位)加入到25μl的总体积中，然后在下表1所示的条件下进行PCR反应。

表1：PCR反应条件

将10μl的PCR反应产物与5X DNA上样染料混合并上样到3％琼脂糖凝胶(SeaKemLE Agarose，美国)中，并且对扩增产物的大小进行分析。

结果可以看出，当使用通用引物时，不仅扩增了BRAFV600E突变(图2中的泳道2)，而且也发生了野生型BRAF的非特异性扩增(图2中的泳道1)。然而，当使用ASRP进行PCR时，未扩增用作模板的野生型BRAF(图2中的泳道4)，并且仅扩增了作为模板的BRAFV600E突变(图2中的泳道5)。

实施例2：使用ASRP检测甲基化

为了使用本发明的等位基因特异的反应性引物(ASRP)检测甲基化基因，进行对人SDC2基因的甲基化的检测实验。

用基因合成方法(Bioneer，韩国)构建甲基化的SDC2(多配体蛋白聚糖-2)核苷酸序列(SEQ ID NO：6)和未甲基化的SDC2核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，并用TOPcloner TA核心试剂盒(Enzynomics，韩国)(Bioneer，韩国)克隆到pTOP TA V2质粒载体(Enzynomics，韩国)中。对于甲基化的SDC2的扩增，合成具有甲基化的SDC2互补序列的正向通用引物(SEQID NO：8)，具有甲基化的SDC2互补序列和具有在3'端的第二核苷酸的脱氧鸟嘌呤(dG)置换的正向ASRP引物(SEQ ID NO：9)，和具有甲基化的SDC2互补序列的反向引物(SEQ ID NO：10)：

[SEQ ID NO：8]5'-TAGAAATTAATAAGTGAGAGGGC-3'

[SEQ ID NO：9]5'-TAGAAATTAATAAGTGAGAGG[dG的]C-3'

[SEQ ID NO：10]5'-GACTCAAACTCGAAAACTC-3'

将10⁵拷贝的甲基化的SDC2和未甲基化的SDC2质粒用作PCR扩增的模板，并且作为具有3'→5'校对活性的DNA聚合酶，使用Pfu聚合酶(HelixAmp^TM Power-Pfu Polymerase，Nanohelix，韩国)。使用

热循环仪(Applied Biosystems，新加坡)进行PCR，并且PCR条件如下。将10⁵拷贝的模板，2.5μl的10X Power-pfu缓冲液，1μl的dNTP混合物(10mM)，1μl每种引物(4pmole/μl)，以及Pfu聚合酶(HelixAmp^TM Power-Pfu Polymerase，1.25单位)加入到25μl的总体积中，然后在下表2所示的条件下进行PCR反应。

表2：PCR反应条件

结果表明，当使用通用引物时，即使是使用甲基化的特异性引物，对甲基化的SDC2(图3中的泳道1)和未甲基化的SDC2(图3中的泳道2)也都出现扩增产物，而当使用SDC2甲基化特异的ASRP时，对甲基化的SDC2观察到特定的扩增产物(图3中的泳道4)，但未甲基化的SDC2没有发生扩增(图3中的泳道5)。

工业实用性

如上所述，根据本发明的使用等位基因特异的反应性引物(ASRP)的检测方法由于ASRP和校对DNA聚合酶的特性而成为具有非常高特异性的技术。该检测方法可以有效地检测包括单核苷酸多态性(SNP)在内的突变(点突变、插入、缺失等)，并且也可以用于检测亚硫酸氢盐处理后的CpG甲基化，或者扩增并检测DNA文库中从所需核苷酸序列开始的靶DNA。

尽管本发明已参照具体特征作了详细描述，但对本领域技术人员显而易见的是该描述仅仅用于优选实施方式，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。

序列表

<110> 基因特力株式会社

<120> 使用等位基因特异的反应性引物的核酸扩增方法

<130> PDK03251D1

<150> 10-2013-0035343

<151> 2013-04-01

<160> 10

<170> PatentIn版本3.2

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> BRAF(B-型Raf激酶)

<400> 1

tatagaaatt agatctctta cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag 60

atctactgtt ttcctttact tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag 120

taaaaatagg tgattttggt ctagctacag tgaaatctcg atggagtggg tcccatcagt 180

ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga 240

ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta 300

tagtattttc atagttccca gtattcacaa aaatcagtgt tcttattttt ta 352

<210> 2

<211> 352

<212> DNA

<213> BRAF(B-型Raf激酶)V600E

<400> 2

tatagaaatt agatctctta cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag 60

atctactgtt ttcctttact tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag 120

taaaaatagg tgattttggt ctagctacag agaaatctcg atggagtggg tcccatcagt 180

ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga 240

ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta 300

tagtattttc atagttccca gtattcacaa aaatcagtgt tcttattttt ta 352

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> BRAFV600E正向引物

<400> 3

gtgattttgg tctagctaca ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> BRAFV600E正向ASRP

<400> 4

gtgattttgg tctagctaca ga 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> BRAFV600E反向引物

<400> 5

ttctagtaac tcagcagcat ctc 23

<210> 6

<211> 350

<212> DNA

<213> 甲基化SDC2

<400> 6

aaattagaaa ttgaatttcg gtacgggaaa ggagttcgcg gaggagtaaa attatagtag 60

agtaagaaga gttttagaga gtagtttttt cggagtatta atttcgtgtc gggagtgtag 120

aaattaataa gtgagagggc gtcgcgtttt cggggcgtag ttgcgggcgg cgggagtagg 180

cgtaggagga ggaagcgagc gttttcgagt ttcgagttcg agttttcgag tttgagtcgt 240

aatcgttgcg gtattttgtt tcggattcgt gtgcgcgggt tgcgtcgagc gttgggtagg 300

aggtttcgtt ttgttttggt tgtaagtagc ggttgggagt agtcggtttt 350

<210> 7

<211> 350

<212> DNA

<213> 未甲基化SDC2

<400> 7

aaattagaaa ttgaattttg gtatgggaaa ggagtttgtg gaggagtaaa attatagtag 60

agtaagaaga gttttagaga gtagtttttt tggagtatta attttgtgtt gggagtgtag 120

aaattaataa gtgagagggt gttgtgtttt tggggtgtag ttgtgggtgg tgggagtagg 180

tgtaggagga ggaagtgagt gtttttgagt tttgagtttg agtttttgag tttgagttgt 240

aattgttgtg gtattttgtt ttggatttgt gtgtgtgggt tgtgttgagt gttgggtagg 300

aggttttgtt ttgttttggt tgtaagtagt ggttgggagt agttggtttt 350

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 甲基化SDC2正向引物

<400> 8

tagaaattaa taagtgagag ggc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 甲基化SDC2正向ASRP

<400> 9

tagaaattaa taagtgagag ggc 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 甲基化SDC2反向引物

<400> 10

gactcaaact cgaaaactc 19

Claims

1.一种从DNA文库中扩增从特定核苷酸序列开始的靶核酸的方法，该方法包括在具有校对活性的DNA聚合酶和等位基因特异的反应性引物(ASRP)存在下，从DNA文库中扩增靶核酸，所述等位基因特异的反应性引物包括在其5'端与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列，和

在3'端，与靶核酸互补的核苷酸序列以及使得在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸，

其中所述等位基因特异的反应性引物中的3'端的核苷酸被脱氧核苷酸取代，

其中当毗邻等位基因特异的反应性引物的修饰核苷酸3'侧的核苷酸与靶核酸互补时，毗邻等位基因特异的反应性引物的修饰核苷酸3'侧的核苷酸不被DNA聚合酶的校对活性除去，和

当毗邻等位基因特异的反应性引物的修饰核苷酸3'侧的核苷酸与靶核酸不互补时，毗邻等位基因特异的反应性引物的修饰核苷酸3'侧的核苷酸被除去，因此修饰核苷酸保持在3'端。

2.根据权利要求1的方法，其中所述具有校对活性的DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性。

3.根据权利要求1的方法，其中等位基因特异的反应性引物的浓度为0.1-20M。

4.根据权利要求1的方法，其中来自DNA文库的从特定核苷酸序列开始的靶核酸互补地结合等位基因特异的反应性引物，以产生扩增产物，并且当等位基因特异的反应性引物与靶核酸不互补时，不互补的核苷酸被DNA聚合酶的校对活性除去，并且由于残留在引物3'端的修饰核苷酸，不产生靶核酸的扩增产物。

5.根据权利要求1的方法，其中只有甲基化的靶核酸被扩增。

6.根据权利要求5的方法，其中所述甲基化的靶核酸的扩增方法包括步骤：

(a)化学或酶处理基因组DNA以将未甲基化的胞嘧啶核苷酸转换为尿嘧啶或其他核苷酸而不转换甲基化的胞嘧啶核苷酸；

(b)随机消化基因组DNA，并将测序接头连接到经消化的DNA片段的5'和3'两端，以构建DNA文库；

(c)将DNA文库与等位基因特异的反应性引物(ASRP)混合并杂交，其中所述ASRP包括与DNA文库的接头序列互补的核苷酸序列，在3'端的胞嘧啶和一个或多个使得在等位基因特异的反应性引物中的核苷酸不能作为聚合酶反应引物的修饰核苷酸；和

(d)在具有校对活性的DNA聚合酶存在下，扩增在(c)的杂交产物中包含甲基化的靶核酸的核苷酸序列的DNA片段。

7.根据权利要求6的方法，其中甲基化靶核酸被扩增而未甲基化的靶核酸没有被扩增。