JP2017516487A - ヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び配列決定反応の組み合わせを用いた、核酸配列、発現、コピー、またはｄｎａのメチル化変化の識別及び計数方法 - Google Patents

ヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び配列決定反応の組み合わせを用いた、核酸配列、発現、コピー、またはｄｎａのメチル化変化の識別及び計数方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヌクレアーゼ、ライゲーション、ポリメラーゼ、及び超並列配列決定反応の組み合わせを用いた、変異、発現、コピー数、転座、選択的スプライシング、及びメチル化変化の非常に高感度な検出を可能にするための、血液からの、即ち無細胞循環ＤＮＡ、エクソソーム、マイクロＲＮＡ、循環腫瘍細胞、または全血細胞からの、ヒトゲノム及びトランスクリプトームの領域の、非常に特異的な、標的指向させた捕捉のための方法に関する。本方法では、複数のプラットフォームでの配列決定に好適な、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を生成する。いくつかの実施形態において、集団の各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖合成核酸セグメントとを含む。これらのキメラ構築物は、変異、コピー変化、転座、及びメチル化変化の識別及び計数に好適である。別の実施形態において、投入ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを用いて、特定のｍＲＮＡやｌｎｃＲＮＡのスプライス部位変異体、転座、及びｍｉＲＮＡの存在及びコピー数を反映する環状ＤＮＡ構築物を生成する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１４年６月６日に出願の米国特許仮出願番号第６２／００９，０４７号、及び２０１５年３月２０日に出願の同６２／１３６，０９３号の利益を主張し、それぞれの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、ヌクレアーゼ、ライゲーション、ポリメラーゼ及び配列決定反応の組み合わせを用いて、変異、発現、コピー数、転座、選択的スプライシング、及びメチル化変化の非常に高感度な検出を可能にするための、血液からの、即ち、無細胞循環ＤＮＡ、エクソソーム、マイクロＲＮＡ、循環腫瘍細胞、または全血細胞からの、ヒトゲノム及びトランスクリプトームの領域の、非常に特異的な標的指向させた捕捉のための方法に関する。
ＤＮＡ塩基配列決定法の進歩は、非侵襲性分子診断を標準化して発展させ、胎児検診、移植の有効性、癌及び他の疾病の検出及び個別化した治療を改善する可能性を秘めている。現在、罹患しやすい、または初期の疾病を患う患者は識別されず、疾病を患う患者は、最良の治療を受けられない。これらは全て、診断レベルでの失敗のためである。
癌の分野では、全て血液試料による、初期検出、ガイド治療、及び再発の監視をするためのかかる技術を開発する必要性が存在する。これには、（ｉ）既知の遺伝子における単一の塩基変異、小挿入、及び小欠失突然変異の、非常に高感度な検出（存在する場合、無細胞ＤＮＡの１％〜０．０１％）、（ｉｉ）プロモーターの高メチル化及び低メチル化の非常に高感度な検出（存在する場合、無細胞ＤＮＡの１％〜０．０１％）、（ｉｉｉ）腫瘍由来のエクソソームもしくはＲＩＳＣ複合体、または循環腫瘍細胞から単離した腫瘍特異的ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの正確な定量、（ｉｖ）循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的なコピー変化の正確な定量、（ｖ）循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の変異、プロモーターの高メチル化及び低メチル化の正確な定量を開発する必要性が含まれる。（循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的なコピー変化の定量を除いて）これらは全て、配列決定を、ゲノムの、標的となる遺伝子または領域に集中させる必要がある。更に、元の断片の両方の鎖からの配列情報またはメチル化状態を決定することで、決定的に必要とされている、希少な事象の確認が行える。
通常の血漿は、通常の生理学的プロセス（即ちエクソソーム、アポトーシス）を受けた通常の細胞から放出された核酸を含有する。ストレス、炎症、感染症、または怪我の条件下にて、核酸の更なる放出がある場合がある。一般に、アポトーシス細胞から放出されるＤＮＡは、長さが平均１６０ｂｐであり、一方、胎児細胞からのＤＮＡは、平均約１４０ｂｐである。癌患者の血漿は、異常な生理学的プロセスを受け、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）内にある癌細胞から放出された核酸を含有する。同様に、妊娠した女性の血漿は、胎児細胞から放出した核酸を含有する。
信頼できる診察及びスクリーニングテストを開発するには、多くの課題が存在する。第１の課題は、疾病（即ち、初期の癌）を示す腫瘍または胎児から出てくる標識を、通常の組織から出てくる同一の標識の存在と区別することである。検査する標識の数及び試験のコストを、アッセイの特異性及び感度とバランスを取る必要性もまた存在する。これは、癌等の疾病における生物学的変化に対処するために必要な課題である。多くの場合、アッセイはスクリーニングの手段として機能しなければならず、二次的な診断のフォローアップ（即ち結腸鏡検査法、羊水穿刺）を利用できることが必要である。生物学的問題をさらに複雑にしているのは、核酸配列変異もしくはプロモーターのメチル化の違いを確実に検出する、または、非常に少量の初期細胞（即ち、ＣＴＣ）から、もしくは癌もしくは胎児特異的なシグナルが、通常細胞から出る核酸の大部分に存在する場合、のいずれかから、ＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数を確実に定量する必要性である。最後に、所望の疾病特異的核酸の違いを検出することで得られる真のシグナルと、試料中に存在する通常の核酸から生成される偽のシグナルと、疾病特異的核酸の違いが存在しない場合に生成される偽のシグナルを区別する技術的課題が存在する。
例えば、血漿中で、ｐ５３遺伝子またはメチル化プロモーター領域での変異を有する循環腫瘍ＤＮＡの存在を検出することの困難さについて考えてみる。かかる試料は、通常の細胞から生じる無細胞ＤＮＡの大部分を含有し、ここで、腫瘍ＤＮＡは無細胞ＤＮＡ全ての０．０１％しか占めない場合がある。したがって、全てを配列決定することにより、かかる変異ＤＮＡの存在を発見しようとする場合、変異を有する１０個のゲノムを識別するために、１００，０００個のゲノムを配列決定する必要がある。これには３００，０００ＧＢのＤＮＡを配列決定する必要があり、これは、膨大なデータ管理の問題は言うまでもなく、現在の配列決定技術で届く作業を超えている。この問題を回避するために、多くのグループが、特異的標的領域を捕捉するか、または問題の領域をＰＣＲ増幅することに挑戦している。配列の捕捉は、所望の配列の９０〜９５％が捕捉されたのに、所望の断片が失われる場合があるというような、脱落の問題が伴っている。あるいは、ＰＣＲ増幅は、真の変異とは区別できない希少なエラーを導くリスクをもたらす。更に、ＰＣＲではメチル化の形成が失われる。亜硫酸水素塩処理を従来は使用し、プロモーターのメチル化が決定されているが、これもまた、ＤＮＡ試料を破壊し、無細胞ＤＮＡにおける複数のメチル化変化の識別能を欠いている。
エラー率を減らし、配列決定の実施の正確性を向上させるための、多数の異なるアプローチが存在する。高いエラー率が存在する中で、ＤＮＡの同一領域を何度も配列決定することにより、コンセンサス精度に到達し得る。しかし、高いエラー率だと、例えば、通常のＤＮＡの存在下において、癌変異を識別しようとする場合など、少量の配列変異の識別が極度に困難となる。したがって、比較的少ない量で変異を検出するために、低エラー率が必要とされる。
タグ増幅ディープシークエンシング（ＴＡｍ−Ｓｅｑ）法（Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，”Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４（１３６）：１３６（２０１２）（非特許文献1））と呼ばれる第１のアプローチは、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＫＲＡＳを含む、癌に関連した遺伝子の選択領域を範囲とする、５９９５個の塩基を増幅するプライマーの設計に基づく。このアプローチでは、ｐ５３遺伝子中、２％〜６５％の頻度の変異を識別することができる。このアプローチでは、プライマーは、多くのＰＣＲプライマーと共に、多重反応においてＤＮＡを予め増幅（１５サイクル）するように設計されている。これは所望の生成物、及び所望でない生成物を両方生み出すため、この後に単回ＰＣＲにより、所望の生成物のそれぞれを更に増幅する。断片は、標準的な次世代配列決定の前に、最終のバーコーディングＰＣＲに供する。このアプローチの利点は、実績のある多重ＰＣＲ−ＰＣＲを用いることであり、このＰＣＲは、少量の開始核酸の増幅に関しては他に例を見ない。欠点は、このアプローチは、増幅の初期ラウンドにおいてＰＣＲエラーを、真の変異と区別することができないことである。したがって、２％の感度（即ち、５０の野生対立遺伝子の中で１つの変異対立遺伝子を検出すること）は、処理決定を行う前に後期癌を評価するには十分であるが、初期検出については、十分感度が高いわけではない。
第１のアプローチの変形は、安全配列決定システム「Ｓａｆｅ−ＳｅｑＳ」（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８（２３）：９５３０−５（２０１１）（非特許文献2））と呼ばれ、ここでは、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡが、ゲノムＤＮＡにライゲーションしたリンカーの末端に付加される。このアプローチは、遺伝子配列決定で記載された変異の圧倒的多数は、実際はエラーであることを示し、推定される配列決定のエラーを少なくとも７０分の１まで減少させた。同様に、超感度ディープシークエンシング（ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｎａｒａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｅｒｒｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（１４）：３４９２−８（２０１２）（非特許文献3））と呼ばれるアプローチは、ネストＰＣＲ増幅用のプライマーにバーコードを付加する。おそらく、生命情報工学ツールに依存する希少な変異、及びコピー数を検出するために、バーコードを付加する類似のシステムが開発された（Ｔａｌａｓａｚ，Ａ．；Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、米国特許出願 ＵＳ ２０１４／００６６３１７（特許文献1） Ａ１，Ｍａｒｃｈ ６，２０１４）。対になった末端の読取りを使用して、推定上の変異を含有する領域を網羅する。この方法は、後期癌を患う患者の血漿における既知の変異を追跡するために使用された。これらのアプローチは、コンセンサス配列を確立するために多くの読取りを必要とする。これらの方法は共に、標的ＤＮＡ全体を伸長させることが必要であるため、アミノ基を取り去ったシトシン等、損傷した塩基全体をコピーする場合は特に、ポリメラーゼにより生成したエラーと真の変異を区別することが不可能である。最後に、これらの方法は断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を提供しない。
デュプレックスシークエンシング（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａ−Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９（３６）：１４５０８−１３（２０１２）（非特許文献4））と呼ばれる第２のアプローチは、１２塩基の無作為化タグを含有する二本鎖リンカーを使用することに基づいている。投入標的ＤＮＡのトップ及びボトム鎖の両方を増幅することにより、所与の断片は、配列決定により追跡され得るように、固有の識別子（各端に１２塩基からなる）を得る。固有の一連のタグを共有する配列読取りを、トップ鎖またはボトム鎖方向のいずれかに鎖識別子を有する要素と共に、対になるファミリーに分類する。各ファミリーの対は、１つの二本鎖ＤＮＡ断片の増幅を反映する。１つのみ、またはいくつかのみのファミリーメンバーに存在する変異は、配列決定のミス、または増幅の後期に発生するＰＣＲがもたらすエラーを表す。対となる１ファミリーのメンバーの多く、または全てで発生する変異は、突然変異誘発によるＤＮＡ損傷部位全体をコピーする場合に起こり得るといった、増幅の第１ラウンド中のＰＣＲエラーから生じる。他方、真の変異は、ファミリー対の全てのメンバーで現れる、ＤＮＡ断片の両方の鎖に存在する。人工的な変異は真の変異とともにファミリー対で同時に発生し得るものの、ＰＣＲ増幅の第１ラウンドの間に生じるものを除いて、全ては独立して識別され、エラーを修正した一本鎖コンセンサス配列を生成する際には無視することができる。個々のＤＮＡデュプレックスの二本鎖のそれぞれから得た配列を次に、デュプレックスコンセンサス配列を得るために比較し、この比較により、ＰＣＲの第１ラウンド中に発生した残りのエラーを取り除く。このアプローチの利点は、ＰＣＲエラー、または突然変異誘発によるＤＮＡ損傷から真の変異をはっきりと区別し、３．８×１０−１０という、極めて低いエラー率を達成することである。このアプローチの欠点は、ファミリー対において、各鎖の少なくとも５つのメンバーを得るために、多くの断片を配列決定する必要があることである（即ち、元の断片１つあたりで最低１０個の配列読取りであるが、多くの場合、変動のためにはるかに多くが必要である）。更に、この方法は、インタクトなゲノムＤＮＡから生成した断片よりも小さい傾向にある、ｃｆＤＮＡでは試験されていないため、可能性のある全ての変異をカバーするために、より多くの断片の配列決定が必要となる。最後に、この方法は、断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を提供しない。
ｓｍＭＩＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ：単一分子反転プローブ）（Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｈｉｇｈ−Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（５）：８４３−５４（２０１３）（非特許文献5）と呼ばれる第３のアプローチは、単一分子のタグ付けを多重捕捉と組み合わせて、低頻度のサブクローン変形の非常に感度の高い検出を可能にする。この方法は、臨床検体においてエラー率が２．６×１０−５であると明言する。このアプローチの欠点は、ファミリー対において、各鎖の少なくとも５つのメンバーを得るために、多くの断片を配列決定する必要がある（即ち、元の断片１つあたりで最低１０個の配列読取りであるが、多くの場合、変動のためにはるかに多くが必要である）ことである。また、この方法は、標的ＤＮＡ全体を伸長させることが必要であるため、アミノ基を取り去ったシトシン等、損傷した塩基全体をコピーする場合は特に、ポリメラーゼにより発生したエラーを、真の変異と区別することができない。更に、この方法は、インタクトなゲノムＤＮＡから生成した断片よりも小さい傾向にある、ｃｆＤＮＡでは試験されていないため、可能性のある全ての変異を網羅するために、より多くの断片の配列決定が必要となる。最後に、この方法は、断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を提供しない。
環状配列決定と呼ばれる第４のアプローチ（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｅｒｒｏｒｓ ａｒｅ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０（４９）：１９８７２−７（２０１３）（非特許文献6）、Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｆｉｔｎｅｓｓ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ａｃｅｖｅｄｏ Ａ，Ｂｒｏｄｓｋｙ Ｌ，Ａｎｄｉｎｏ Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｊａｎ ３０；５０５（７４８５）：６８６−９０（非特許文献7）；及びＬｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｃｅｖｅｄｏ Ａ，Ａｎｄｉｎｏ Ｒ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１４ Ｊｕｌ；９（７）：１７６０−９（非特許文献8）もまた参照のこと）は、ＤＮＡまたはＲＮＡを約１５０塩基に剪断し、変性させて一本鎖を形成し、これらの一本鎖を環化し、ローリングサークル増幅のために（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ及びホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼの存在下で）ランダムな六量体プライマー及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、生成物を約５００塩基まで再剪断し、次いで、標準的な次世代配列決定に進めることに基づく。このアプローチの利点は、ポリメラーゼエラーは１つのコピーのみで現れ得るが、真の変異は全てのコピーで現れるように、ローリングサークル増幅が元の標的ＤＮＡの複数のタンデムコピーを作製することである。読取りファミリーの平均サイズは、コピーが物理的に互いに結合されているため、３コピーである。この方法はまた、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ及びホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼを使用して、損傷した塩基を含有する標的を取り除き、かかるエラーを除去する。この技術の利点は、配列決定エラー率を、現在のレベルの約０．１〜１×１０−２から、７．６×１０−６という低いものとすることである。後者のエラー率はここで、１００〜１０，０００倍超過の野生型ＤＮＡの存在下において、血漿中の癌変異を区別するには十分である。更なる利点は、同一配列の２〜３コピーが物理的に結合されており、デュプレックス配列決定アプローチを用いる最低１０個の断片とは対照的に、単一の断片から生成した配列データより真の変異の確認を可能にすることである。しかし、この方法はコピー数の変化を測定する能力は提供せず、また、断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報も提供しない。
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより開発された第５のアプローチ（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｂａｓｅ Ｒｅａｄｓ ｏｎ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ＤＮＡ Ｎａｎｏａｒｒａｙｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９６１）：７８−８１（２０１０）（非特許文献9））は、ナノボールアレイ上でのライゲーション読取りを用いることに基づく。約４００ヌクレオチドのゲノムＤＮＡをリンカーで環化して切断し、更なるリンカーで再度環化し、最後に再度環化して約４個のリンカーを含有させる。ＤＮＡは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いてローリングサークル増幅を経て、ナノボールを生成する。次に、これらをアレイ上に配置し、ライゲーション系アプローチを用いて配列決定する。本明細書と関連するこのアプローチの目立った特徴は、同一配列の複数のタンデムコピーが生成され得、その後、単一のローリングサークル増幅生成物から配列決定され得ることである。リガーゼまたはポリメラーゼのいずれかにより（合成アプローチによる他の配列決定と、ローリングサークルを組み合わせることにより）、同一配列が複数回照会されるため、１塩基あたりのエラー率は著しく低下する。そのために、ローリングサークル生成物から直接配列決定することは、上述の環状配列決定アプローチと同一の利点を多くもたらす。
ＳＭＲＴ（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ：単分子リアルタイム）配列決定（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（６）：４６１−５（２０１０）（非特許文献10））と称される第６のアプローチは、ＤＮＡ断片の末端上にヘアピンループを付加することに基づき、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、共有結合で閉じたループ周辺に伸長することを可能にし、２つの相補鎖に配列情報を提供する。具体的には、ポリメラーゼの単分子が、蛍光標識ヌクレオチドの、相補核酸鎖への組み込みを触媒する。ポリメラーゼは、ヌクレオチドをメチル化塩基の反対側に組み込む時に低速となるか、または「ぎくしゃく」し、得られる蛍光パルスは、Ｎ６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、及び５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡテンプレート内における、修飾ヌクレオチドの直接検出を可能にする。このアプローチの精度は、特に、ポリメラーゼが閉じたループの周りを数回移動し得るため、向上しており、コンセンサス配列の決定を可能にする。この技術は、（ほとんどの場合は、ＤＮＡの線状断片の２つの相補配列を含む）「ダンベル」様基質に配列情報を提供するように設計されているが、一本鎖環状基質にも適用可能である。
本発明は、当該技術分野におけるこれら、及び他の欠点を克服することに関する。
ＵＳ ２０１４／００６６３１７
Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，"Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，"Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４（１３６）：１３６（２０１２） Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８（２３）：９５３０−５（２０１１） Ｎａｒａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｅｒｒｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，"Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（１４）：３４９２−８（２０１２） Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａ−Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９（３６）：１４５０８−１３（２０１２） Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｈｉｇｈ−Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，"Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（５）：８４３−５４（２０１３） Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｅｒｒｏｒｓ ａｒｅ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０（４９）：１９８７２−７（２０１３） Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｆｉｔｎｅｓｓ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ａｃｅｖｅｄｏ Ａ，Ｂｒｏｄｓｋｙ Ｌ，Ａｎｄｉｎｏ Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｊａｎ ３０；５０５（７４８５）：６８６−９０ Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｃｅｖｅｄｏ Ａ，Ａｎｄｉｎｏ Ｒ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１４ Ｊｕｌ；９（７）：１７６０−９ Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｂａｓｅ Ｒｅａｄｓ ｏｎ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ＤＮＡ Ｎａｎｏａｒｒａｙｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９６１）：７８−８１（２０１０） Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，"Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（６）：４６１−５（２０１０）
本発明の第１の態様は、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団に関する。集団の各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖合成核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖合成核酸セグメントは固有の識別子部分を含み、固有の識別子部分、及び元のゲノムＤＮＡのセグメントの両方のヌクレオチド配列は、集団中の１つのキメラ一本鎖核酸構築物を、集団中の他の全てのキメラ一本鎖核酸構築物と区別する。集団のキメラ一本鎖核酸構築物は環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。
本発明の別の態様は、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を含むシステムに関する。集団の各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖核酸セグメントのヌクレオチド配列は、第１の固体支持体プライマー特異的部分、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び患者識別子配列を含む。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物は環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。本システムは、伸長生成物の集団を更に含み、各伸長生成物は、集団中のキメラ一本鎖核酸構築物に相補的な、２つ以上のタンデム線状配列を含む。集団中の各伸長生成物を、集団中の相補環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズする。
本発明の別の態様は、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を含むシステムに関する。各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖核酸セグメントのヌクレオチド配列は、第１の固体支持体プライマー特異的部分、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び患者識別子配列を含む。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物は、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。本システムは、１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを更に含み、各プライマーは、集団中のキメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分または第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な、少なくとも第１のヌクレオチド配列、及びローリングサークル増幅に好適なポリメラーゼを含む。
本発明の別の態様は、本発明の集団及びシステムを用いて、試料中の複数の核酸分子の配列決定をする方法に関する。
本発明の別の態様は、試料中で、試料中の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を識別する方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性のある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、及び、前記試料内に存在する場合、１つ以上の標的リボ核酸分子のｃＤＮＡを前記試料内で生成する工程を伴う。本方法は、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）３’ｃＤＮＡ標的特異的配列部分、（ｂ）５’ｃＤＮＡ標的特異的部分、及び更なる部分を含み、前記更なる部分は（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、工程、並びに、第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’標的部分が塩基特異的な様式でｃＤＮＡの相補領域にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる工程、を更に伴う。相補ｃＤＮＡにハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端の結合に好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成し、１つ以上のライゲーション接合部の１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションし、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に結合した標的リボ核酸配列のデオキシリボ核酸コピーを含む環状ライゲーション生成物を形成する。本方法は、試料中の他のリボ核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別するために、試料中の環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程を更に伴う。
本発明の別の態様は、試料中で、互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む可能性のある、１つ以上の核酸分子を識別する方法に関する。本方法は、互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む１つ以上の核酸分子を含む可能性がある試料を提供する工程、並びに１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する工程を伴い、各プローブセットは、（ｉ）５’第１標的特異的部分と、３’第２標的特異的部分と、更なる部分とを含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び、（ｉｉ）５’第２標的特異的部分と、３’第１標的特異的部分と、更なる部分とを含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。本方法は、試料中に存在する場合、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的な様式で核酸分子の対応する第１及び第２標的領域にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料と１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程、並びに、前記プローブセットが核酸分子の相補第１標的領域及び第２標的領域にハイブリダイズされた場合に、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に結合させる、及び、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端に結合させるのに好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程を更に伴う。プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドは１つ以上のライゲーション能のある接合部にてライゲーションされ、更なる部分に結合した核酸分子の、第１及び第２の異なる標的領域に対応するヌクレオチド配列を含む環状ライゲーション生成物を形成し、環状ライゲーション生成物を試料中で検出及び区別することにより、存在する場合、試料中に互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
本発明の別の態様は、試料中で、試料中の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を識別する方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、及び、試料中の標的リボ核酸分子の３’及び５’末端にヌクレオチドリンカーを付加する工程を伴う。本方法は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程を更に伴い、各オリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）標的リボ核酸分子の３’ヌクレオチドリンカーに相補的な３’部分、（ｂ）標的リボ核酸分子の５’ヌクレオチドリンカーに相補的な５’部分、及び（ｃ）更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。試料中に存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’部分が塩基特異的な様式で標的リボ核酸分子の相補ヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料を１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長して、１つ以上の標的リボ核酸分子の相補体を生成し、オリゴヌクレオチドプローブの３’伸長末端をオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にライゲーションし、標的リボ核酸分子の３’ヌクレオチドリンカーに相補的な配列、標的リボ核酸分子の５’ヌクレオチドリンカーに相補的な配列、１つ以上の標的リボ核酸分子の相補体、及びオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分を含む環状ライゲーション生成物を形成する。本方法は、試料中の環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程であって、それにより、試料中における他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する工程を、更に伴う。
本発明の別の態様は、試料中で、試料中の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を識別する方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、及び、試料中の標的リボ核酸分子の３’及び５’末端にヌクレオチドリンカーをライゲーションする工程を伴い、前記ヌクレオチドリンカーは更なる部分により互いに結合され、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含み、前記ライゲーションは、標的リボ核酸分子、３’及び５’ヌクレオチドリンカー配列、及び前記更なる部分を含む環状ライゲーション生成物を形成する。本方法は、環状ライゲーション生成物の３’または５’ヌクレオチドリンカー配列に相補的なヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程、及び、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを塩基特異的な様式で環状ライゲーション生成物にハイブリダイズさせる工程を更に伴う。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長し、環状ライゲーション生成物の相補体を生成し、試料中の環状ライゲーション生成物相補体を検出して区別することにより、試料中における他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する。
本発明の別の態様は、試料中で、試料中の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を識別する方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する工程を伴い、各セットは、（ａ）５’ステムループ部分と標的リボ核酸分子の３’部分に相補的な３’部分とを有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｂ）標的リボ核酸分子の５’末端のコピーに相補的な３’部分と、第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’ステムループ部分に相補的な５’部分と、（ｉ）固有の標的識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）プライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む更なる部分とを有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む。本方法は、試料、プローブセットからの１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び逆転写酵素をブレンドして逆転写酵素反応物を形成する工程、並びに、試料中に存在する場合、相補標的リボ核酸分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長し、標的リボヌクレオチド分子の相補体を生成する工程を更に伴う。プローブセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプローブを、標的リボヌクレオチド配列の相補体を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし、１つ以上のライゲーション能のある接合部が、伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした各第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端間で生成される。本方法は、各第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端をライゲーションして、第２のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に結合した標的リボ核酸配列のデオキシリボ核酸コピーを含む環状ライゲーション生成物を形成する工程を更に伴う。試料中の環状ライゲーション生成物を検出して区別することにより、試料中における他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する。
本発明が重要であるのは、本発明が、ハイスループットの診断モードでの使用に好適な、変異、発現、コピー数、転座、選択的スプライシング、及びメチル化変化の非常に高感度な検出を可能にするための、血液からの、即ち無細胞循環ＤＮＡ、エクソソーム、マイクロＲＮＡ、循環腫瘍細胞、または全血細胞からの、ヒトゲノム及びトランスクリプトームの領域の、非常に特異的な標的指向させた捕捉のための方法を教示するからである。本発明の一本鎖構築物は、次世代配列決定を含む、多数の異なる技術による読出しに好適であり、読出し技術を不可知的なものにするように設計されている。捕捉の感度を最大化するために、本発明はハイブリダイゼーションだけでなく、ポリメラーゼ伸長及びライゲーションも使用して、偽陽性を減少させる。特異性を最大化するために、ライゲーションされていないプローブは、エキソヌクレアーゼによって分解され、環化標的配列を保護する。更なる特異性は、ローリングサークル増幅により作製された、元のゲノム配列のタンデムリピートを配列決定することにより得ることができる。最後に、本発明は、ローリングサークル増幅により表面に作製された、元のゲノム配列から生成されたタンデムリピートを捕捉し、次に、これらをＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に供することで、非常に正確な変異検出、メチル化状態、及びトランスクリプトーム計数を可能にする方法を教示する。本方法は特に、癌特異的なマーカーの血液から直接識別、癌のスクリーニング、並びに治療の有効性及び再発の監視に好適である。本方法はまた、母体血液から、コピーの異常及びメンデル遺伝病を直接、出生前に診断するのにも好適である。
次世代配列決定の準備における、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の増幅のための１アプローチを示す。本アプローチは、ランダム六量体と共に、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）またはローリングサークル複製（ＲＣＲ）を用いる。 ＲＣＡ生成物から、配列決定に好適な二本鎖核酸のタンデム線状コピーの生成方法を示す。 配列決定に好適な、核酸分子のタンデム線状コピーの生成方法を示す。本プロセスは特定的に、最初の標的ＤＮＡにおける、全てのＢｓｔＵ１部位がメチル化された断片を選択する。 次世代配列決定の準備における、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の増幅のための代替アプローチを示す。本アプローチは、溶液中、または表面上のいずれかにおける、単一の特異的プライマーによるＲＣＡを用いる。 ＲＣＡまたはＲＣＲで生成した線状ＤＮＡの単位複製配列を、配列決定フローセル表面上で捕捉する前に、縮合して密な構造にするための１つのアプローチを示す。 図５−１の続きを示す。 本発明のシステム及び方法を用いて、試料中の複数の核酸分子の配列決定を行う方法を示す。 図６−１の続きを示す。 図６−２の続きを示す。 図６−３の続きを示す。 核酸分子を増幅し、得られる単位複製配列を、次世代配列決定に好適な固体支持体上で捕捉する方法を示す。 図７−１の続きを示す。 固体支持体表面上で、本発明の方法に従い調製した単位複製配列の配列決定プロセスを示す。 図８−１の続きを示す。 図８−２の続きを示す。 核酸分子を増幅し、得られる単位複製配列を、次世代配列決定に好適な固体支持体上で捕捉する方法を示す。固定化された単位複製配列の配列決定は、図８に示す方法に従い実施される。 図９−１の続きを示す。 核酸分子を増幅し、得られる単位複製配列を、次世代配列決定に好適な固体支持体上で捕捉する別の方法を示す。固定化された単位複製配列の配列決定は、図８に示す方法に従い実施される。 図１０−１の続きを示す。 核酸分子を増幅し、得られる単位複製配列を、次世代配列決定に好適な固体支持体上で捕捉する別の方法を示す。固定化された単位複製配列の配列決定は、図８に示す方法に従い実施される。 図１１−１の続きを示す。 図１１−２の続きを示す。 環状標的のローリングサークル増幅により、二重プライマーを含む固体支持体上で捕捉するための、一本鎖タンデムリピート鋳型ＤＮＡの生成を示す。 図１２−１の続きを示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 既知の遺伝子配列の隣接ＨｉｎＰ１部位における、メチル化の検出方法を示す。 ゲノム全体での、隣接ＨｉｎＰ１部位におけるメチル化の検出方法を示す。 隣接ＡｃｉＩメチル化部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 隣接ＡｃｉＩメチル化部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 隣接ＡｃｉＩメチル化部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 隣接ＡｃｉＩメチル化部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 ゲノム全体での、隣接ＡｃｉＩ部位におけるメチル化の検出方法を示す。 隣接非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 隣接非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位間に位置する、隣接メチル化ＡｃｉＩ部位を含有する本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位間に位置する、隣接メチル化ＡｃｉＩ部位を含有する本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域のＨａｅＩＩＩ部位間に、メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位を含有する、本発明のキメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。 ５’ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位付近に１つ以上のメチル化ＡｃｉＩ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 ５’ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位付近に１つ以上のメチル化ＡｃｉＩ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 ゲノムＤＮＡの既知領域における、５’ＨａｅＩＩＩ部位付近のメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。 ３’ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位付近に１つ以上のメチル化ＡｃｉＩ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 ３’ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位付近に１つ以上のメチル化ＡｃｉＩ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域において、３’ＨａｅＩＩＩ部位付近のメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。 ゲノムＤＮＡの既知領域における隣接メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。 ゲノムＤＮＡの既知領域における、Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位付近の全てのメチル化ＣｐＧ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。 隣接非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 隣接非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位間に位置する、隣接メチル化ＡｃｉＩ部位を含有する本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 ＨａｅＩＩＩ制限酵素切断部位間に位置する、隣接メチル化ＡｃｉＩ部位を含有する本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 既知のゲノム領域における、メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出プロセスを示す。 既知のゲノム領域における、非メチル化隣接ＡｃｉＩ部位の検出プロセスを示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 既知のゲノム領域中の非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出プロセスを示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接Ｈｐｈ１部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接Ｈｐｈ１部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接Ｈｐｈ１部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。 既知のゲノム領域中に非メチル化隣接Ｈｐｈ１部位を含有する、本発明の環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成及び増幅方法を示す。 既知のゲノム領域中の非メチル化隣接Ｈｐｈ１部位の検出プロセスを示す。 配列決定に好適なｃｆＤＮＡまたは剪断ゲノムＤＮＡからの、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 配列決定に好適なｃｆＤＮＡまたは剪断ゲノムＤＮＡからの、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 配列決定に好適なｃｆＤＮＡまたは剪断ゲノムＤＮＡからの、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 配列決定にすぐ使用できる鋳型をｃｆＤＮＡから生成するためのライゲーション設計及びライゲーションを示す。 ｃｆＤＮＡの標的鎖の両方において変異の配列決定、識別、及び確認を行うための、「ギャップのある」リンカー設計を示す。 Ｃ３テーリング、ライゲーション、リンカー含有ｒＧのＲＮａｓｅＨ２による活性化、ギャップ埋め、及びライゲーションを用いた、ｃｆＤＮＡの標的鎖の両方における変異の配列決定、識別、及び確認を行うためのリンカー設計を示す。 制限ｒＡ挿入によるｄＡテーリング、Ｃ３テーリング、ライゲーション、リンカー含有ｒＧのＲＮａｓｅＨ２による活性化、ギャップ埋め、及びライゲーションを用いた、ｃｆＤＮＡの標的鎖のいずれかにおける変異の配列決定及び識別を行うためのリンカー設計を示す。 配列決定に好適なｃｆＤＮＡまたは剪断ゲノムＤＮＡからの、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 ＲＮａｓｅ Ｈ２による活性化を伴う、ｃｆＤＮＡからのキメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 ＲＮａｓｅ Ｈ２による活性化を伴う、ｃｆＤＮＡからのキメラ環状一本鎖核酸標的構築物の別の例示的な作成プロセスを示す。 ハイブリダイズしたプライマーによる、元の標的ｃｆＤＮＡを含む一本鎖環状ＤＮＡの生成を示す。 捕捉基を含有するハイブリダイズしたプライマーによる、元の標的ｃｆＤＮＡを含む一本鎖環状ＤＮＡの生成を示す。 ＲＮａｓｅＨ２が標的特異的プライマーをアンブロックすることを用いた、ハイブリダイズしたプライマーによる元の標的ｃｆＤＮＡを含む一本鎖環状ＤＮＡの生成を示す。 ＲＮａｓｅＨ２が標的特異的プライマーをアンブロックすることを用いた、捕捉基を含有するハイブリダイズしたプライマーによる、元の標的ｃｆＤＮＡを含む一本鎖環状ＤＮＡの生成を示す。 配列決定に好適なｃｆＤＮＡまたは剪断ゲノムＤＮＡからの、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 配列決定に好適なｃｆＤＮＡまたは剪断ゲノムＤＮＡからの、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製プロセスを示す。 後でローリングサークル増幅に使用可能な標的特異的プライマーによる捕捉を用いた、標的特異的一本鎖環状ＤＮＡの濃縮プロセスを示す。 後でローリングサークル増幅に使用可能なギャップのあるタンデム標的特異的プライマーによる捕捉を用いた、標的特異的一本鎖環状ＤＮＡの濃縮プロセスを示す。 後でローリングサークル増幅に使用可能な標的特異的プライマーを用いた、標的特異的一本鎖環状ＤＮＡの濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の作製及び濃縮プロセスを示す。 配列決定に好適な、ゲノム標的特異的一本鎖タンデムリピート伸長生成物の生成及び濃縮プロセスを示す。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、２０塩基の３’標的特異的部分、６０塩基の５’標的特異的部分、１０塩基のリンカー（黒い棒線）、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、２０塩基の３’標的特異的部分、８０塩基の５’標的特異的部分、１０塩基のリンカー（黒い棒線）、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、５０塩基の３’標的特異的部分、６０塩基の５’標的特異的部分、１０塩基のリンカー（黒い棒線）、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、５０塩基の３’標的特異的部分、８０塩基の５’標的特異的部分、１０塩基のリンカー（黒い棒線）、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、５０塩基の３’標的特異的部分、５０塩基の５’標的特異的部分、３’及び５’の１０塩基のリンカー（黒い棒線）、並びに２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、６０塩基の３’標的特異的部分、６０塩基の５’標的特異的部分、３’及び５’の１０塩基のリンカー（黒い棒線）、並びに２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、５０塩基の３’標的特異的部分、５０塩基の５’標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、６０塩基の３’標的特異的部分、６０塩基の５’標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、７０塩基の３’標的特異的部分、７０塩基の５’標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 １０ヌクレオチド塩基刻みで、ｃｆＤＮＡ標的断片（１６０ヌクレオチド長）の集団に沿って、オリゴヌクレオチドプローブ（「オリゴ」）のファミリーのマッピングを示す。各オリゴヌクレオチドプローブは、８０塩基の５’標的特異的部分、８０塩基の５’標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の複合識別子配列（細い線）を含有する。 重複タイリング法によりオリゴヌクレオチドプローブを設計し、より大型の連続した標的領域を配列決定する方法を示す（一例として約５００塩基が示される）。 重複タイリング法によりオリゴヌクレオチドプローブを設計し、より大型の連続した標的領域を配列決定する方法を示す（一例として約５００塩基が示される）。 重複タイリング法によりオリゴヌクレオチドプローブを設計し、より大型の連続した標的領域を配列決定する方法を示す（一例として約５００塩基が示される）。 重複タイリング法によりオリゴヌクレオチドプローブを設計し、より大型の連続した標的領域を配列決定する方法を示す（一例として約５００塩基が示される）。 一続きのゲノムＤＮＡ内の、隣接する１６０ｂｐ遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズで（ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈａｓｅｄ）標識されたオリゴヌクレオチドを示す。 一続きのゲノムＤＮＡ内の、隣接する１６０ｂｐ遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズで標識されたオリゴヌクレオチドを示す。 一続きのゲノムＤＮＡ内の、隣接する１６０ｂｐ遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズで標識されたオリゴヌクレオチドを示す。 一続きのゲノムＤＮＡ内の、隣接する１６０ｂｐ遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズで標識されたオリゴヌクレオチドを示す。 標的リボ核酸分子のデオキシリボ核酸配列コピーを含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 推定遺伝子融合を含有する標的リボ核酸分子のデオキシリボ核酸配列コピーを含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 推定遺伝子融合を含有する標的リボ核酸分子のデオキシリボ核酸配列コピーを含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 特定のエクソンを含有する標的リボ核酸分子のデオキシリボ核酸配列コピーを含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 特定のエクソンを含有する標的リボ核酸分子のデオキシリボ核酸配列コピーを含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 多型を含有するＤＮＡセグメントを含む環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 標的ｍｉＲＮＡ配列に対して相補的なデオキシリボ核酸配列を含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 標的ｍｉＲＮＡ配列に対して相補的なデオキシリボ核酸配列を含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 標的ｍｉＲＮＡ配列に対して相補的なデオキシリボ核酸配列を含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。 標的ｍｉＲＮＡ配列に対して相補的なデオキシリボ核酸配列を含む、環状キメラ一本鎖核酸構築物の生成方法を示す。環状構築物は、本発明の方法に従ったＲＣＡ及び配列決定に好適である。
本発明の第１の態様は、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団に関する。集団の各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖合成核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖合成核酸セグメントは固有の識別子部分を含み、固有の識別子部分、及び元のゲノムＤＮＡのセグメントの両方のヌクレオチド配列は、集団中の１つのキメラ一本鎖核酸構築物を、集団中の他の全てのキメラ一本鎖核酸構築物と区別する。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物は環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。
本発明の本態様に関して、集団は通常、１，０００個〜４，０００，０００，０００個の環状キメラ一本鎖核酸構築物を含有する。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物の作製方法は、以下で詳述している。
キメラ核酸構築物の第１の一本鎖セグメントは、宿主からの元のゲノムＤＮＡのセグメントを含む。元のゲノムＤＮＡの本セグメントは、ゲノムＤＮＡの分裂による直接生成物である、核酸フラグメント（即ち、フラグメントの末端に１つ以上のリンカーの付加を有しない）、または、リンカーが付加されたゲノムＤＮＡの核酸フラグメントであってよい。元のゲノムＤＮＡは、例えば動物、植物、原生動物、菌類、細菌、またはヒト、リンゴの木、ジアルジア、酵母菌、黄色ブドウ球菌、もしくはパピローマウイルスの遺伝子等のウイルスゲノムといった、任意のゲノムに由来してよい。ＤＮＡのセグメントは、組織、細胞、血清、血漿、血液、またはエクソソームを含むが、これらに限定されない、任意の新鮮な、凍結された、または固定された（例えば、ホルマリンで固定され、パラフィンで包埋された）生物源から単離することができる。
集団中の核酸構築物の第２の一本鎖合成核酸セグメントは、例えばホスホジエステル結合により、第１の一本鎖セグメントに共有結合される。第２の一本鎖合成核酸セグメントは識別子配列を含有する。一実施形態では、識別子配列はバーコードである。バーコードは通常、各核酸構築物を集団中で互いに区別するために、元のゲノムＤＮＡの配列と共に用いられる、８〜１２個のヌクレオチド塩基配列である。ゲノムＤＮＡの断片が類似の配列である場合、２つの核酸構築物が同一とならないように、識別子またはバーコード配列は十分に異なっていることが重要である。約１０，０００個のゲノム等価物（１ｍＬの無細胞ＤＮＡ中におけるおよそのゲノム）を含む集団に関して、８ヌクレオチドの固有の識別子配列は十分な多様性（６５，５３６）を有し、各環状構築物は確実に固有のものとなる。約１，０００，０００個のゲノム等価物（１０ｍＬの血液中の全細胞からのおよそのゲノム）を含む集団に関して、１２ヌクレオチドの固有の識別子配列は十分な多様性（１６，７７７，２１６）を有し、各環状構築物は確実に固有のものとなる。更に、ゲノムＤＮＡが無作為に断片化されているか、または生物学的に（即ち、無細胞ＤＮＡのように）断片化されているかのいずれかの場合、ゲノムＤＮＡと合成核酸の結合点は、各環状構築物の区別を補助する、更なる固有の配列を提供する。
別の実施形態において、識別子配列は、１つ以上のプライマー結合部位、及び／または以下で述べる患者識別子配列を含む。プライマー結合部位は増幅を容易にするためだけに用いられるではなく、単独で、または患者識別子配列と組み合わせて、集団中の個々の環状構築物を区別するための、識別配列セグメントとして機能することができる。したがって、集団の核酸構築物の第２の一本鎖セグメントの識別子配列は、バーコード配列、１つ以上のプライマー配列、患者識別子配列、またはこれらの任意の組み合わせを含んでよい。
集団のキメラ核酸構築物を環化、即ち、共有結合で閉じて環化した核酸分子とする。本発明の本態様に関して、環化構築物は完全に一本鎖である。本発明の別の態様では、環化構築物は部分的に二本鎖であるか、完全に二本鎖であってよい。
本発明の別の態様は、核酸分子の増幅方法に関する。本方法は、上述の本発明の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を提供する工程、並びに、集団をポリメラーゼ、及び短いプライマー（６〜１０ヌクレオチド、前記配列の一部はランダムな塩基及び／またはヌクレオチド類似体；例えばランダム六量体、七量体、八量体を含む）とブレンドし、増幅反応を形成する工程を伴う。１つ以上の短いプライマーは、集団の１つ以上の環状キメラ一本鎖核酸構築物の一部に相補的である。増幅反応混合物を１つ以上のハイブリダイゼーション及び伸長処理に供する。ここで、１つ以上の短いプライマーは環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズし、ポリメラーゼはハイブリダイズしたプライマーを伸長して、複数の伸長生成物を作製する。各伸長生成物は、集団からのキメラ一本鎖核酸構築物に相補的な２つ以上のタンデム線状配列を含む。
図１（ステップＡ〜Ｄ）は、上述の核酸分子の増幅方法の例示的図解を提供する。図１、ステップＡは、ある集団の環状キメラ一本鎖核酸構築物、及び複数のランダム六量体プライマーを示す。環状構築物中の元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントを、単一の細い黒線で示す。元のゲノムＤＮＡ内の変異を（＊）として表す。環状構築物の固有の識別子配列を二重線として示す。ハイブリダイズした六量体プライマーの続けての伸長による環状標的の増幅を、鎖置換が可能なポリメラーゼ、例えばＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ等（図１では菱形で示す）を用いて達成する。図１、ステップＢに示すように、ハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長は最後に元のプライマーを置き換え、一本鎖尾部を作製する。六量体プライマーの１つ以上は引き続き一本鎖尾部にハイブリダイズし得る。ポリメラーゼが仲立ちするこれらのハイブリダイズしたプライマーの伸長は、図１、ステップＣ及びＤに示すように継続して、種々の長さの二本鎖伸長生成物を形成し、各伸長生成物は、環状構築物に相補的な２つ以上のタンデム線状配列を含有する。
この増幅法により形成した二本鎖伸長生成物の集団は、広範囲の次世代配列決定（ＮＧＳ）プロトコール（例えば４５４ Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、合成によるＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）配列決定、ＳＯＬｉＤ（商標）、ＳＢＬ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）、または合成系によるＭｉＳｅｑ（商標）もしくはＨｉＳｅｑ（商標））のいずれか１つに適している。ＮＧＳプロトコールに従い、標的ＤＮＡの１つ以上のタンデム相補コピーが単一フラグメント内にあるように、二本鎖伸長生成物を断片化する。リンカーが、断片化されたＤＮＡの５’及び３’末端に付加され、クラスターまたはビーズ増幅を用いた標準的なライブラリー調製及び鋳型生成を可能にする。環状標的内の元のＤＮＡ分子の、物理的に結合した相補コピーのコンセンサス配列は、配列決定中に生成される。真の変異（＊）はフラグメント内に２または３回存在するため、ポリメラーゼエラーとは容易に区別することができる。
本発明の本態様、及び全ての態様に従うと、本発明のキメラ環状核酸構築物及びその伸長生成物の配列決定は、蛍光プライマーハイブリダイゼーションによる配列決定、分子ビーコンハイブリダイゼーション、プライマー伸長、リガーゼ検出反応、リガーゼ連鎖反応、パイロシーケンス法、エキソヌクレアーゼベースの配列決定、蛍光ベースのＳＢＳ、蛍光ベースのＳＢＬ、ナノポア及びナノチューブベースの配列決定、イオンベースのＳＢＳ、並びにイオンベースのＳＢＬを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の配列決定方法を用いて実施することができる。本明細書で使用する場合、「配列決定」は、ポリヌクレオチド標的または鋳型の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの識別を入手する方法を包含する。
本発明の別の態様では、集団の各環状核酸構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖合成核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖合成核酸セグメントは、固有の識別子部分、及び一次プライマー結合部位を含む。ここで、固有の識別子部分、一次プライマー結合部位、及び元のゲノムＤＮＡのセグメントのヌクレオチド配列は、集団中の１つのキメラ一本鎖核酸構築物を、集団中の他の全てのキメラ一本鎖核酸構築物と区別する。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物は環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。
本発明の別の態様は、配列決定に好適である核酸分子のタンデム線状コピーの生成方法に関する。本方法は、上述の本発明の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を提供する工程、並びに、鎖置換活性を有するポリメラーゼ、及び１つ以上の一次プライマーと集団をブレンドし、ローリングサークル伸長反応を形成する工程を伴う。１つ以上の一次プライマーは、集団の１つ以上の環状キメラ一本鎖核酸構築物の一部に相補的である。ローリングサークル伸長反応混合物を、１つ以上のハイブリダイゼーション及び伸長処理に供する。ここで、１つ以上のプライマーは環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズし、ポリメラーゼはハイブリダイズしたプライマーを伸長して、複数の伸長生成物を作製する。各伸長生成物は、集団からのキメラ一本鎖核酸構築物に相補的な２つ以上のタンデム線状配列を含む。
図２、ステップＡ〜Ｃは、上述の核酸分子の増幅方法の例示的図解を提供する。図２、ステップＡは、集団の環状キメラ一本鎖核酸構築物、及びハイブリダイズした一次プライマーを示す。環状構築物中の元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントを、単一の細い黒線で示す。元のゲノムＤＮＡ内の変異を（＊）として表す。環状構築物の固有の識別子配列及び一次プライマー結合部位を、わずかに細めの線で示す。ハイブリダイズしたプライマーの続けての伸長による環状標的の増幅は、鎖置換が可能なポリメラーゼ、例えばＰｈｉ２９またはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ等（図２では菱形で表す）を用いて達成される。図２、ステップＢに示すように、ハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長は最後に元のプライマーを置き換え、一本鎖尾部を作製する。伸長生成物をサークルから変性させる（図２、ステップＣを参照）。１つ以上の二次プライマーセットを提供する。各プライマーセットは、（ａ）一次プライマーから形成した一本鎖伸長生成物の第１の部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、第１の二次非メチル化プライマー、及び（ｂ）一本鎖伸長生成物の第２の部分に相補的なヌクレオチド配列を有する、第２の二次メチル化プライマーを含む。一本鎖伸長生成物を、二次プライマーセット、鎖置換活性を欠くポリメラーゼ、リガーゼ、及び、一本鎖伸長生成物と第１の二次プライマーが互いにハイブリダイズしている場合に両方を切断するエンドヌクレアーゼ（即ち、エンドヌクレアーゼは非メチル化二本鎖認識配列で切断する）と、ブレンドする。
第１及び第２の二次プライマーは、図２、ステップＣに示すように、一本鎖伸長生成物の相補領域にハイブリダイズする。ポリメラーゼはハイブリダイズしたプライマーを伸長し、下流のハイブリダイゼーション二次プライマーとのライゲーション接合部を形成する。リガーゼは伸長二次プライマーを共にライゲーションして、図２、ステップＣに示すように、二本鎖伸長生成物を形成する。エンドヌクレアーゼは伸長生成物と第１の二次プライマーの両方を切断する。ここでは、これらは共にハイブリダイズされて、標的ゲノムＤＮＡ配列のタンデム線状コピーを含有する二本鎖断片を形成する。二本鎖伸長生成物断片中のタンデム線状配列の数は、上述の方法で利用される第１及び第２の二次プライマーの割合を反映している。これらのタンデムコピー断片は、上述の当該技術分野において公知の任意の配列決定方法を用いての配列決定に適している。ＮＧＳ配列決定に関して、リンカーが付加されて、標準的なクラスターまたはビーズ増幅、及び対を形成した末端の読取りを可能にする。真の変異（＊）は２または３回存在するため、ポリメラーゼのエラーとは区別される。
本発明の別の態様は、標的が元のゲノムＤＮＡ中でメチル化された場合における、核酸分子のタンデム線状コピーの生成方法に関する（メチル化塩基は「ｍ」と表される。図３を参照）。本プロセスは、上述のものと本質的に同一であり、Ｂｓｔポリメラーゼが、ＢｓｔＵ１（ＣＧ＾ＣＧ）制限エンドヌクレアーゼの存在下において、ハイブリダイズした一次プライマーの連続した伸長に用いられる（図３、ステップＢ）。ＢｓｔＵ１は、非メチル化の場合二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ、及び非メチル化一本鎖ＤＮＡは切断しない（図３、ステップＢ）（Ｚｉｅｒｈｕｔ ＆ Ｄｉｆｆｌｅｙ，“Ｂｒｅａｋ Ｄｏｓａｇｅ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｓｔａｇｅ ａｎｄ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ＤＮＡ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”ＥＭＢＯ Ｊ．２７（１３）：１８７５−８５（２００８）を参照、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。ポリメラーゼは、ローリングサークル増幅中に標的のいくつかのコピーを生成し、かつ非メチル化ＣＧＣＧ部位は二本鎖形態においてＢｓｔＵ１により切断されるため、本プロセスは、初期の標的ＤＮＡ内の全てのＢｓｔＵ１部位でメチル化断片を特異的に選択する。図３は、ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼでの本法を示しているが、非メチル化の場合の二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ、及び非メチル化一本鎖ＤＮＡは切断しない他のエンドヌクレアーゼを利用して、メチル化ゲノムＤＮＡを特異的に増幅することができる。これらのエンドヌクレアーゼとしては、高温性酵素ＢｓｔＨＨＩ（ＧＣＧＣを認識；ＨｈａＩのイソ制限酵素）、ＢｓｉＳＩ（ＣＣＧＧを認識；ＨｐａＩＩのイソ制限酵素）、及びＴａｉＩ（ＡＣＧＴを認識；ＭａｅＩＩのイソ制限酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素は全て、内部ＣｐＧ配列のメチル化に対して感受性がある。本シリーズの最後の酵素であるＴａｑＩ制限酵素は、ＣｐＧ部位でのメチル化に対して非感受性であるため、上記技術には適していない。
本発明の別の態様では、集団の各環状核酸構築物は、第２の一本鎖合成核酸セグメントに結合した宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントを含み、ここで前記第２の一本鎖セグメントは、１つ以上のプライマー特異的配列（例えば、第１及び／または第２の固体支持体プライマー特異的部分）、並びに任意で、患者識別子配列を含む。本発明の本態様に関して、第２の一本鎖セグメントは固有の識別子部分を含有してもよいし、しなくてもよい。集団のキメラ一本鎖核酸構築物を環化すると、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び／または配列決定に好適となる。
第２の一本鎖セグメントの患者識別子配列は、元のゲノムＤＮＡの患者源を識別する役割を果たす。患者識別子配列は通常約５〜８ヌクレオチド長を占め、異なる患者から生じる配列を区別するように設計されている。好ましい実施形態では、配列決定で単一塩基のエラーが生じても、正しい患者識別子配列の実際的な識別を可能にするように、患者識別子配列は少なくとも３つの位置で、互いに異なっている。現在での臨床実験の実施においては、試料のバッチ作業は通常、８、１６、２４、４８、９６、または３８４個の試料が同時に処理されるように、９６及び３８４ウェルプレートフォーマットとの適合性があるように設計されている。
本発明の別の態様は、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を含むシステムに関する。集団の各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖核酸セグメントのヌクレオチド配列は、第１の固体支持体プライマー特異的部分、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び患者識別子配列を含む。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物は環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。本システムは、伸長生成物の集団を更に含み、各伸長生成物は、集団からのキメラ一本鎖核酸構築物に相補的な２つ以上のタンデム線状配列を含む。集団中の各伸長生成物を、集団中の相補環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズする。図４のステップＢでは、本発明の本システムの例示的描写を提供する。
本発明の本システムは、複数の固定化された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを有する固体支持体を更に含んでよい。固体支持体上の各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、集団のキメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分ヌクレオチド配列と同一であり、かつ、伸長生成物の第１の固体支持体プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する。したがって、固体支持体上の１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の固体支持体プライマー特異的部分を介して、伸長生成物の集団の伸長生成物にハイブリダイズすることができる。図４、ステップＣでは、本発明の本システムの例示的描写を提供する。
固体支持体は、多種多様な材料から作製することができる。基質は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、球体、ビーズ、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、ディスク、膜として存在する、生物学的基質、非生物学的基質、有機基質、無機基質、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。基質は、ディスク、正方形、円等の任意の便利な形状を有してよい。基質は好ましくは平らであるが、種々の代替の表面形状をとってよい。例えば、基質は、ハイブリダイゼーションが行われる隆起した、または陥没した領域を含有してよい。基質及びその表面は、本明細書で記載される配列決定反応を実施する堅い支持体を形成するのが好ましい。
鋳型調製に用いられる、市販の次世代配列決定用固体支持体プラットフォームを、本発明のシステム及び方法で利用することができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）フローセル、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）ＩｏｎＳｐｈｅｒｅ（商標）、並びにエマルションＰＣＲビーズ及び４５４エマルションＰＣＲビーズを、本発明のシステム及び方法で使用することができる。したがって、環状キメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分は、市販されているＮＧＳ固体支持体上で固定化されるプライマーと同じように設計される。したがって、第１の固体支持体プライマー特異的部分の相補体を含有する伸長生成物は、ＮＧＳ固体支持体表面上でプライマーにハイブリダイズすることができる。
本発明の本システムは、図５、ステップＡに示すように、架橋オリゴヌクレオチドの集団を更に含んでよい。架橋オリゴヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチド配列の反復を有するオリゴヌクレオチドであり、ここで、反復ヌクレオチド配列は、集団中のキメラ一本鎖核酸構築物の第２の一本鎖核酸セグメントの少なくとも一部と同一の配列を有する。したがって、架橋オリゴヌクレオチドの反復ヌクレオチド配列は、キメラ核酸の伸長生成物のヌクレオチド配列の少なくとも一部（即ち、第２の一本鎖セグメントに対応する伸長生成物の一部）に相補的である。反復ヌクレオチド配列は、約１０〜２５ヌクレオチド長であってよい。各架橋オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチド配列反復は、図５、ステップＢ〜Ｄに示すように、伸長生成物の集団の伸長生成物のタンデム線状配列にハイブリダイズし、縮合構造を形成する。
図５、ステップＥ〜Ｈに示すように、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドに結合した縮合伸長生成物を、複数の固定化された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを有する固体支持体上で捕捉することができる。上述のように、固体支持体上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、伸長生成物の第１の固体支持体プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列（即ち、キメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列）を有する。図５、ステップＥに示すように、縮合伸長生成物構造体の１つ以上のタンデム線状配列を、固体支持体上で１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイゼーションさせることで、縮合構造を固定化してよい。酵素により切断される、切断可能な結合（図５、ステップＥ及びＦでは三角形で示す）を含有するように架橋オリゴヌクレオチドを設計することができる。好適な切断可能な結合としては、リボヌクレオチド、デオキシウラシル、アプリン酸部位、及び８−オキソグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、架橋オリゴヌクレオチドは、ＡＰＥ１エンドヌクレアーゼ、エンドＩＩＩ、エンドＩＶ、エンドＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、またはｈＯＧＧ１により切断されるアプリン酸部位を含有してよい。架橋オリゴヌクレオチドの切断により、縮合構造が分解し、伸長生成物の個々のタンデム配列が、固体支持体表面上での隣接プライマーへのハイブリダイゼーションにより局所的に捕捉され、カーペット様構造を作り出す（図５、ステップＦ）。図５、ステップＧに示すように、本アプローチにより、元の標的ゲノムＤＮＡ配列の数百〜数千のタンデム相補コピーが互いに隣接して捕捉されることが確実となり、これは後続の配列決定に好適である。
本発明の別の態様は、異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を含むシステムに関する。各構築物は、宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む、第２の一本鎖核酸セグメントとを含む。第２の一本鎖核酸セグメントのヌクレオチド配列は、第１の固体支持体プライマー特異的部分、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び患者識別子配列を含む。集団中のキメラ一本鎖核酸構築物は、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に適している。本システムは、１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを更に含み、各プライマーは、集団中のキメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分または第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な、少なくとも第１のヌクレオチド配列部分を含む。最後に、本システムはまた、ローリングサークル増幅に適したポリメラーゼも有する。
本発明の本システムの例示的な描写を、図４、ステップＡに示す。環化キメラ核酸構築物は、元のゲノムＤＮＡセグメント（細い黒線）を含有し、元のＤＮＡセグメント内にある問題の単一塩基置換または変異は、アスタリスク（＊）で示される。構築物の第２の一本鎖セグメントは、キメラ構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分（太い黒線で示す）、及び第２の固体支持体プライマー特異的部分（黒の二重線で示す）を含有する。キメラ構築物のローリングサークル増幅のプライミングに適した増幅プライマーは、図４、ステップＡの左パネルに示す、構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分のセグメント；図４、ステップＡの中央及び右パネルに示す、キメラ構築物の第１及び第２の固体支持体プライマー特異的部分の両方のセグメント；または図９、ステップＡに示す構築物の第２の固体支持体プライマー特異的部分の一部に相補的であることができる。この後者の実施形態において、キメラ構築物の第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な増幅プライマーを固体支持体上に固定することで、ローリングサークル増幅中に形成した伸長生成物が固体支持体に直接繋がれる。代替の実施態様において、増幅プライマーは、図４、ステップＤ及び図１０、ステップＡに示すように、固体支持体に繋がれることが可能な更なる部分を含んでよい。一実施形態では、更なる部分は、固体支持体に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的な固有のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、更なる部分は、固体支持体上で固定化された第１または第２の固体オリゴヌクレオチドプライマーに相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、更なる部分は、固体支持体上で固定化された捕捉結合パートナーにより捕捉される捕捉部分である。捕捉部分及び捕捉結合パートナーは、天然の核酸である必要はない。例えば、捕捉部分は、固定化ストレプトアビジンまたはＮＴＡマトリックスによりそれぞれ捕捉される、ビオチン基またはＨｉｓタグであってよい。
別の実施形態において、１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、（ｉ）集団のキメラ一本鎖核酸構築物の元のゲノムＤＮＡセグメントに相補的な第１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と、前記オリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’ポリメラーゼ伸長をブロックするブロック基とを含む３’部分、及び（ｉｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と捕捉基とを含む５’部分を含み、捕捉基は固体支持体に固定化されることが可能である。
別の実施形態において、１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、（ａ）（ｉ）集団のキメラ一本鎖核酸構築物の元のゲノムＤＮＡセグメントの第１の部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と、前記第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’ポリメラーゼ伸長をブロックするブロック基とを含む３’部分を有する、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、並びに（ｂ）（ｉ）集団のキメラ一本鎖核酸構築物の元のゲノムＤＮＡセグメントの第２の部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と捕捉基とを含む５’部分を有する第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含み、捕捉基は固体支持体に固定化されることが可能である。
本発明の本態様に関して、本システムは、複数の固定化された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを有する固体支持体を更に含んでよい。固体支持体上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、集団のキメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有する（例えば、図６、ステップＢを参照）。本システムの固体支持体は、集団のキメラ一本鎖核酸構築物の第２の固体支持体プライマー特異的部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、複数の固定化された第２のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含んでよい（例えば、図５、ステップＢを参照）。上述のように、鋳型調製に用いられる、市販のＮＧＳ固体支持体プラットフォーム（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）フローセル、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＩｏｎＳｐｈｅｒｅ（登録商標）等）は、本発明のシステムに適している。
本発明のシステムはまた、上述の架橋オリゴヌクレオチドの集団（即ち、ヌクレオチド配列の２つ以上の反復を有するオリゴヌクレオチド：ここで、反復ヌクレオチド配列は、集団中のキメラ一本鎖核酸構築物の第２の一本鎖核酸セグメントの少なくとも一部と同一の配列を有する）を含んでもよい。
本発明の本態様に従い、本システムのポリメラーゼは、ローリングサークル増幅に好適な鎖置換ポリメラーゼである。代表的な鎖置換ポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（大型断片または５’→３’エキソ）、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ（大型断片または５’→３’エキソ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ポリメラーゼ、クレノウ断片（３’→５’エキソ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（５’→３’エキソ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏＰｈａｇｅ３１７３ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な鎖置換ポリメラーゼとしては、ＳＤ ＤＮＡポリメラーゼ（変異Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（米国特許公開公報第２０１２／０１１５１４５号（Ｆｕ）、国際公開第２０１４／１６１７１２号（Ｉｇｎａｔｏｖら）、及びＩｇｎａｔｏｖら「Ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｓｔａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍａｒｋｅｄｌｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５７：８１０８７（２０１４）」を参照：それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）；ＡｐｔａＨｏｔＴａｑポリメラーゼ（５’フラップエンドヌクレアーゼ活性と共に、熱安定性５’→３’ポリメラーゼ活性）；好熱性ウイルス及び微生物由来のポリメラーゼ（米国特許公開公報第２０１２／００８３０１８（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄら）、及び米国特許第８，０９３，０３０号（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄら）を参照：それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）；国際公開第２００６／０３０４５５（Ｈｊｏｒｌｅｉｆｓｄｏｔｔｉｒら）、及び米国特許公開公報第２００８／０３１１６２６号（Ｈｊｏｒｌｅｉｆｓｄｏｔｔｉｒら）（それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）に開示されている、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ及びＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ由来のポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ由来の熱安定性ポリメラーゼ（国際公開第ＷＯ２００７／０７６４６１（Ｒｅｃｈら）を参照：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）；並びにＢａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ由来のＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７３６，３７３号（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を参照：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）等の、熱安定性及び鎖置換活性を有するものが挙げられる。当該技術分野において公知の他の鎖置換ポリメラーゼもまた、本システム及び関連する本発明の方法に好適である。
本発明の別の態様は、本システムを用いた、複数の核酸分子配列決定方法に関する。本方法に従い、相補集団中のキメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド増幅プライマーをポリメラーゼとブレンドし、ローリングサークル増幅反応混合物を形成する。ローリングサークル増幅反応混合物を伸長処理に供する。この処理で、ポリメラーゼは、１つ以上のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド増幅プライマーを伸長し、複数の一次伸長生成物を作製する。各一次伸長生成物は１つ以上のタンデム線状配列を含み、各タンデム線状配列は、集団中の環状キメラ一本鎖核酸構築物に相補的である。環状キメラ一本鎖核酸構築物は、直接配列決定することができる。例えば、環状キメラ構築物は、ＳＢＳ用の鋳型である。あるいは、ローリングサークル増幅反応から形成した一次伸長生成物は、配列決定用に用いられる鋳型である。上記の通り、当該技術分野において公知の任意の配列決定方法を利用し、環状核酸構築物またはその一次伸長生成物の配列決定をすることができる。
一実施形態では、一次伸長生成物は配列決定の前に固体支持体上に固定化される。好適な固体支持体は、それぞれが、集団のキメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有する（即ち、一次伸長生成物の第１の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な配列を有する）、少なくとも複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好適な固体支持体としては、市販されており、次世代配列決定プラットフォームでの鋳型調製に利用されるもの、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）フローセル、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）Ｉｏｎ Ｓｐｈｅｒｅ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。一次伸長生成物は固体支持体上で第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズし、以下でより詳細に記載するように、支持体上で配列決定される。
固体支持体は、複数の第２のオリゴヌクレオチドプライマーを更に含んでよい。第２のプライマーは、キメラ一本鎖核酸構築物の第２の固体支持体プライマー特異的プライマー部分に相補的なヌクレオチド配列を有する。図９、ステップＢに示すように、かつ本明細書でより詳細に記載するように、核酸構築物のローリングサークル増幅は固体支持体上で第２のオリゴヌクレオチドプライマーによりプライミングされ得る。本アプローチを使用し、一次伸長生成物を固体支持体上で直接繋げることができる。
図５、ステップＡ〜Ｇに示すように、架橋オリゴヌクレオチドを利用して、ローリングサークル増幅反応から形成される伸びた一次伸長生成物を縮合することができる。図５、ステップＡに示すように、ＤＮＡポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が、元のゲノムセグメントを含有する環状構築物の周りで増幅プライマーを伸長する。ポリメラーゼが伸長を続けると、図５、ステップＢに示すように、伸びた一次伸長生成物は、架橋オリゴヌクレオチドの相補的な反復領域にハイブリダイズすることにより縮合する。図５、ステップＣ及びＤに示すように本プロセスは継続し、縮合構造中で、数百〜数千の標的ＤＮＡのタンデム相補コピーを生成する。異なる相補配列を有するオリゴヌクレオチドの数、及び所与のオリゴヌクレオチド内のタンデムリピートの数を変化させることにより、ループ、即ち「架橋ノード」の数を変更させることができ、構造体の「緻密性」を調節する可能性をもたらす。図５、ステップＥに示すように、縮合一次伸長生成物は、一次伸長生成物の相補的な第１のオリゴヌクレオチドプライマーへのハイブリダイゼーションにより固体支持体上に固定化することができる。図５、ステップＥに示すように、縮合構造はいくつかの位置にて相補プライマーにハイブリダイズする。架橋オリゴヌクレオチドは切断可能な結合を含有し、切断の際、縮合構造が壊れ始める（図５、ステップＦ）。一次伸長生成物の個々のループは、固体支持体の表面上の隣接第１プライマーにハイブリダイズすることで局所的に捕捉され、カーペット様構造を作り出す（図５、ステップＧ）。本アプローチにより、数百〜数千の標的のタンデムコピーが互いに隣接して捕捉されることが確実となり、これは後の配列決定に好適である。
図６は、本発明に従った、例示的な配列決定方法を示す。図６、ステップＡに示すように、本プロセスは、環状キメラ核酸鋳型にハイブリダイズした増幅プライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｈｉ２９ポリメラーゼ；塗りつぶした菱形）により開始し、一次伸長生成物を生成する。伸長生成物は固体支持体上で第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする（図６、ステップＢ）。図６、ステップＣに示すように、ローリングサークル増幅反応から形成した伸びた伸長生成物は、表面上で隣接第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることで、固体支持体上で局所的に捕捉され、カーペット様構造を作り出す。図６、ステップＤに示すように、本アプローチにより、数百〜数千の元のゲノムＤＮＡのタンデム相補コピーが、後続の配列決定のために互いに隣接して捕捉されることが確実となる。
一次伸長生成物が固体支持体上で固定化されると（図６、ステップＤ）、図６、ステップＥに示すように、配列決定プライマーが固体支持体上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に隣接してハイブリダイズする。任意に、図６、ステップＥでまた示すように、ＰＮＡまたはブロッキングオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に隣接してハイブリダイズすることができる。図６、ステップＦに示すように、一次伸長生成物は、配列決定プライマーによりプライミングされる、ＳＢＳ反応用の鋳型である。形成されるSBS二次伸長生成物が、ＰＮＡまたはブロッキングオリゴヌクレオチドにより更に伸長できなくなるまで、配列決定は続く（図６、ステップＧ）。
反対の鎖を配列決定するために（即ち、一次伸長生成物の配列を得るために）、固体支持体上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーをアンブロックする。５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が、図６、ステップＨに示すように、合成反応による配列決定からの生成物を分解しながら、固体支持体上で繋がれた配列決定プライマーを伸長する。図６、ステップＩに示すように、ＰＮＡまたはブロッキングオリゴヌクレオチド（太い縞模様の線）のために更に進むことができなくなるまで、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が鎖を伸長する。これが鋳型の単一長コピーを生成し、各鋳型は、元のゲノムＤＮＡのコピーを含む。図６、ステップＪに示すように、元の一次伸長生成物及び環状鋳型が変性され、洗い流される。図６、ステップＫに示すように、第２の配列決定プライマーを各単一長鋳型鎖にハイブリダイズし、図６、ステップＬ及びＭに示すように、合成による配列決定を用いて、固定化鋳型の配列を得る。
図７は、本発明に従った配列決定の別の代表的な方法を示す。本方法は、環状キメラ核酸構築物のローリングサークル増幅、並びに、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを共に有する固体支持体上での、一次伸長生成物の捕捉を伴う。図７、ステップＡに示すように、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が環化鋳型上で増幅プライマーを伸長し、一本鎖一次伸長生成物を生成する。固体支持体表面上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、ローリングサークル増幅プロセス中に伸長をできなくさせる、３’末端の取り外し可能なブロック基を含有する（図７、ステップＢ）。ブロック基は、ポリメラーゼまたは他の酵素の、生産的な方法でのオリゴヌクレオチドとの増幅、伸長または反応を防止する化学的部分である。本実施例では、ブロック基は３’末端のポリメラーゼ伸長を防止する。好適なブロック基としては、Ｃ３スペーサー、Ｃ１８スペーサー、重合停止ヌクレオチド、２’−Ｏメチルリボヌクレオチド誘導体、３’ホスフェート、または３’もしくは２’ＯＨ部分の他の修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ブロック基そのものは、例えば、可逆的重合停止ヌクレオチド、もしくは３’ホスフェート、またはブロック基の使用により切断することができるか、及び任意でいくつかの追加のヌクレオチドは、切断可能な結合における切断により除去された後、遊離３’ＯＨ末端を遊離させることができる。好適な切断可能な結合としてはリボヌクレオチド、デオキシウラシル、アプリン酸部位、及び８−オキソグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。図７、ステップＣに示すように、ローリングサークル増幅が伸びた一次伸長生成物を生成し続けると、生成物は固体支持体表面上で隣接する第１のオリゴヌクレオチドプライマーに局所的にハイブリダイズされて捕捉され、カーペット様構造を作製する。本アプローチにより、数百〜数千のタンデムコピーが固体支持体表面上で互いに隣接して捕捉されることが確実となる（図７、ステップＤ）。
図７、ステップＥに示すように、ブロック基は固体支持体上で一次伸長生成物にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプライマーから除去される。ブロック基は切断可能な結合を切断することで除去されてよい。リボヌクレオチドの切断可能な結合は、ＲＮａｓｅＨを用いて切断可能であり、デオキシウラシルの切断可能な結合は、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いて、またはＵＤＧ、エンドＶＩＩＩ及びＴ４キナーゼを用いて切断可能であり、アプリン酸部位の切断可能な結合はＴｔｈエンドＩＶ、エンドＩＶ、またはＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断可能であり、かつ、８−オキソグアニン切断可能な結合はＦｇｐで切断可能である。プライマーがアンブロックされると、プライマーが伸長され、これにより、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を用いて、固体支持体上の数百〜数千の位置にて一次伸長生成物がコピーされる（図７、ステップＦ）。これにより、環化鋳型の単一長二次伸長生成物を生成する。図７、ステップＧに示すように、一次伸長生成物及び環状鋳型を変性させて洗い流し、得られる鋳型の二次伸長生成物を、図８、ステップＡ〜Ｉに示す後続の配列決定に好適なものにする。
図８は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを共に有する固体支持体上で捕捉される、ローリングサークル増幅標的（例えば二次伸長生成物）の配列決定を示す。図８、ステップＡは、図７に示すハイブリダイズした一次伸長生成物の、ポリメラーゼが仲立ちする伸長から生成した単一長二次伸長生成物を示す。配列決定プロセスは、図８、ステップＡに示すように、配列決定プライマーが二次伸長生成物にハイブリダイズすることで開始する。ＳＢＳを用いて、固定化二次伸長生成物の配列を得る（図８、ステップＢ）。伸長生成物が繋がれた第１のオリゴヌクレオチドプライマーの末端に到達するまで、配列決定を続ける（図８、ステップＣ）。ＳＢＳ生成物を、繋がれた二次伸長生成物から変性させ、一本鎖二次伸長生成物を、図８、ステップＤに示すように固体支持体上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする。二次伸長生成物を、ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長することによりコピーし、二次伸長生成物の完全長コピー、即ち三次伸長生成物を生成する（図８、ステップＥ）。後続の配列決定に好適な、繋がれた三次伸長生成物を残しながら、二次伸長生成物を切断し、変性させ、洗い流す（図８、ステップＥ〜Ｆ）。配列決定プライマーを三次伸長生成物にハイブリダイズし（図８、ステップＧ）、ＳＢＳを実施して、図８、ステップＨ及びＩに示すように三次生成物の配列を得る。
二次及び三次伸長生成物の配列決定は、本明細書で記載及び図示したＳＢＳを使用して達成することができる。ＳＢＳとしては、蛍光ベースのＳＢＳ、及びイオンベースのＳＢＳが挙げられる。例えば、蛍光プライマーハイブリダイゼーション、分子ビーコンハイブリダイゼーション、プライマー伸長、エキソヌクレアーゼベースの配列決定、リガーゼ検出反応、リガーゼ連鎖反応、パイロシーケンス法、蛍光ベースのＳＢＬ、ナノポア及びナノチューブベースの配列決定、並びにイオンベースのＳＢＬを含むがこれらに限定されない、他の好適な配列決定方法もまた用いることができる。
図９は、本発明に従った配列決定の別の代表的な方法を示す。図９、ステップＡに示すように、本実施形態は、固体支持体上での、キメラ環状核酸構築物の第２の非ブロックオリゴヌクレオチドプライマーへの直接ハイブリダイゼーションを伴う。第２のプライマーは増幅プライマーとして機能し、環状構築物のローリングサークル増幅をプライミングする。生成される一次伸長生成物を、固体支持体に直接繋げる（図９、ステップＡ）。ローリングサークル増幅により生成される一次伸長生成物は、図９、ステップＢ及びＣに示すように、除去可能な３’ブロック基を含有する固体支持体上で第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることにより、複数の「カーペットループ」構造体を生成する。第１プライマーの３’ブロック基が除去され（図９、ステップＤ）、第１プライマーが好適なポリメラーゼ（例えば、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼ）により伸長可能となり、固体支持体表面に共有結合した、数百〜数千の単一長二次伸長生成物で構成される表面を生成する（図９、ステップＥ）。図９、ステップＥ〜Ｆに示すように、第１プライマーを切断する部位特異的切断試薬または酵素による表面処理、続いて変性ステップにより、図８、ステップＡ〜Ｉで図示及び説明する後続の配列決定に好適な共有結合した二次伸長生成物を残しながら、一次伸長生成物を放出する。
図１０は、本発明に従った配列決定の別の例示的な方法を示す。本実施形態において、増幅プライマーは、短い一本鎖尾部、即ち、固体支持体上に捕捉される更なる部分を含む。図１０、ステップＡに示すように、更なる部分は、固体支持体表面上の捕捉プローブまたはプライマーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでよい。更なる部分の、相補捕捉プローブまたはプライマーへのハイブリダイゼーションは、ローリングサークル増幅により形成された一次伸長生成物を、固体支持体に直接繋げる。ローリングサークル増幅が、キメラ環状構築物のタンデム相補コピーを含む伸びた一次伸長生成物を生成し続けると、一次伸長生成物が、表面上での３’ブロックされた第１のオリゴヌクレオチドプライマーへのハイブリダイゼーションにより局所的に捕捉され、表面上で複数のカーペットループ構造体を生成する（図１０、ステップＢ及びＣ）。第１プライマーが脱ブロックされ（図１０、ステップＤ）、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼにより伸長し、単一長の複数の二次伸長生成物を形成する（図１０、ステップＥ）。変性により一次伸長生成物が放出され、元の環化鋳型と同一のセンスであり、全ての末端に、３’末端で規定されたプライマー結合配列を有する、共有結合した二次伸長生成物が残る。共有結合した二次伸長生成物は、図８で示す配列決定に好適な鋳型である。
図１１は、本発明に従った配列決定の別の例示的な方法を示す。図１１、ステップＡにおいて、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はキメラサークル鋳型上で増幅プライマーを伸長し、短い一本鎖一次伸長生成物を生成する。ポリメラーゼ及び一次伸長生成物は環状鋳型から変性される。図１１、ステップＢに示すように、一次伸長生成物は固体支持体上で第１プライマーにハイブリダイズする。一次伸長生成物は、複数の位置（塗りつぶした菱形）にて、固定化された第１のオリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ伸長によりコピーされる。好適なポリメラーゼとしては、上述のような、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼが挙げられる。これにより、単一長の二次伸長生成物が生成される（図１１、ステップＣ）。図１１、ステップＤに示すように、一次伸長生成物を変性させて洗い流す。クラスター増幅プロセスを用いて、残りの一本鎖二次伸長生成物を増幅する。ここで、図１１、ステップＥに示すように、二次伸長生成物は固体支持体上で第２のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする。第２のプライマーは、伸長したポリメラーゼであり（図１１、ステップＦ）、三次伸長生成物を形成する。変性後（図１１、ステップＧ）、二次及び三次伸長生成物は、固体支持体上で相補的な第１及び第２のプライマーにハイブリダイズする（図１１、ステップＨ）。ハイブリダイズしたプライマーは伸長したポリメラーゼであり、図１１Ｉに示すように、二次及び三次伸長生成物のコピーを形成する。伸長生成物は変性され、図８に示す方法を用いて、本プロセスを繰り返して各鎖を配列決定するために十分な鋳型を生成する（図１１、ステップＪ）。限定的な（短い）ＲＣＡ単位複製配列の、共有結合した個々のコピーを用いる表面形成の代替手段としては、セコイア増幅（Ｓｅｑｕｏｉａ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（国際公開第２０１３／０１２４４０号（Ｂａｒａｎｙら）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）、及び野火増幅（ｗｉｌｄｆｉｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｍａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０（３５）：１４３２０−３（２０１３）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）が挙げられる。
図１２は、図１１で示したものに類似の、本発明に従った配列決定の別の代表的な方法を示す。図１２、ステップＡにおいて、Ｐｈｉ２９またはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はキメラサークル鋳型上で増幅プライマーを伸長し、一本鎖一次伸長生成物を生成する。ポリメラーゼ及び一次伸長生成物は環状鋳型から変性される。図１２、ステップＢに示すように、一次伸長生成物は、固体支持体上の２つ以上のウェルまたは領域内で複数の第１プライマーにハイブリダイズする。一次伸長生成物は長いため、プライマーを有する固体表面上の複数のウェルまたは別個の領域内に伸長されてよい。長い伸長生成物の本性質の利点は、同一標的が複数の隣接ウェルまたは領域内で配列決定されるため、低量の変異を更に確認できることである。図１２、ステップＣに示すように、一次伸長生成物は複数の位置（塗りつぶした菱形）にて、固定化された第１のオリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ伸長によりコピーされる。好適なポリメラーゼとしては、上述のような、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼが挙げられる。これにより、タンデムリピート伸長生成物が生成されるウェル間で架橋が行われる場合を除いて、単一長の二次伸長生成物が生成される（図１２、ステップＣ及びＤ）。図１２、ステップＥに示すように、一次伸長生成物を変性させて洗い流す。クラスター増幅プロセスを用いて、残りの一本鎖二次伸長生成物を増幅する。ここで、図１１、ステップＥ〜Ｉに示すように、二次伸長生成物は固体支持体上で第２のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする。伸長生成物は変性され、図８に示す方法を用いて、本プロセスを繰り返して各鎖を配列決定するために十分な鋳型を生成する（図１１、ステップＪ）。
本発明の別の態様は、本明細書で記載されるシステム及び方法の構成成分である環状キメラ一本鎖核酸構築物の作製方法に関する。いくつかの例示的方法を以下に述べ、添付の図面に示している。
環状キメラ一本鎖核酸構築物の１つの好適な作製方法は、１つ以上の標的ゲノムＤＮＡセグメントを含有する試料を提供する工程を伴う。標的ゲノムＤＮＡセグメントは、１つ以上の塩基の違い、または、検出のための関心対象の１つ以上のメチル化残基を含有する可能性があり得る。本方法は、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程を更に伴い、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）５’標的特異的部分、（ｂ）３’標的特異的部分、及び（ｃ）更なる部分を含む。更なる部分は、（ｉ）患者識別子配列、（ｉｉ）第１の固体支持体プライマー特異的部分、及び（ｉｉｉ）第２の固体支持体プライマー特異的部分を含むヌクレオチド配列である。試料中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’標的特異的部分が塩基特異的な様式で標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補３’末端にハイブリダイズするのに効果的な、かつ第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’標的特異的部分が塩基特異的な様式で標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補５’末端にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料と１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる。ハイブリダイゼーションの後、第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端のカップリングに好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部が生成され、標的ゲノムＤＮＡセグメントを１つ以上のライゲーション接合部にて互いにライゲーションし、集団の環状キメラ一本鎖核酸構築物を形成する。
図１３、ステップＡ〜Ｅは、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸「標的」構築物の、１つの例示的な作製方法を示す。本実施形態において、元のゲノムセグメントは、１６０ｂｐの平均長を有する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のセグメント、または、約１６０ｂｐの断片に剪断されたゲノムＤＮＡのセグメント（「標的オリゴヌクレオチド」もしくは「ＤＮＡセグメント」）を含む。本プロセスは、短いリンカーのＤＮＡセグメントへのライゲーションから開始する（黒い太い棒線、図１３、ステップＡ）。図１３、ステップＢに示すように、標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’に相補的、並びに３’リンカーに相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図１３、ステップＢの標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端付近のループ領域は、オリゴヌクレオチドプローブに相補的でない標的オリゴヌクレオチドの領域である。本図に示すように、標的オリゴヌクレオチドセグメントとオリゴヌクレオチドプローブとの間の非相補的小領域は、キメラ環状構築物の形成プロセスに影響を及ぼさない。
オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分（太い黒い棒線で示す）はまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、プライマー結合配列、及び／または切断可能な結合を含有してもよい（図１３、ステップＢ、左パネル、切断可能な結合は太い棒線間に「Ｕ」として標識した）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端にブロック基を含有してよい（図１３、ステップＢ、右パネル、プローブは５’ブロック基を有する）。図１３、ステップＣに示すように、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした短いリンカー３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。本実施形態で用いるポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、例えば５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含んでよい。伸長の後、５’ヌクレアーゼはマッチする標的ＤＮＡの５’重複塩基を切断し、５’リンカー領域を除去することで、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残す。ポリメラーゼはまた、鋳型として標的ＤＮＡセグメントを用いてオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長する（図１３、ステップＣ）が、ブロック基は切断しない（図１３、ステップＣ、左側）。図１３、ステップＤ（左パネル）において、リガーゼ（塗りつぶした円）は、伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端間、並びに伸長オリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端でライゲーション接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ニックを、環化オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入し（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）、オリゴヌクレオチドプローブを、エキソヌクレアーゼ分解を受けやすくさせる（図１３、ステップＥ、左パネル）。図１３、ステップＤ、右パネルに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は、伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端間のライゲーション接合部を共有結合で閉じるが、オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図１３、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼは、例えば固有の識別子配列、プライマー結合配列、または患者識別子配列を含有する更なる部分に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状核酸構築物を残して、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチド生成物またはニックオリゴヌクレオチド生成物（即ちオリゴヌクレオチドプローブ）を全て分解する。上述のように、得られる環化生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
図１４、ステップＡ〜Ｅに示すプロセスは、図１３、ステップＡ〜Ｅに示すプロセスと実質的に同一であるが、オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（「ｒ」）、プライマー結合配列、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を含む（図１４、ステップＢを参照）。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした短いリンカー３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。重複してマッチする塩基における、ＤＮＡセグメントの５’末端のヌクレアーゼ切断により、ライゲーション能のある５’ホスフェートが生成される（図１４、ステップＣ）。図１４、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長した末端を共有結合で閉じ、環状標的ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブの３’ブロック基は、オリゴヌクレオチドプローブの伸長を防止する。続いて、ブロック基が切断可能な結合における切断、例えばリボヌクレオチド「ｒ」のＲＮａｓｅ（塗りつぶした三角形）切断により除去される（図１４、ステップＤ）。図１４、ステップＥに示すように、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はオリゴヌクレオチドプローブの遊離３’末端を伸長し、ローリングサークル増幅を開始する。ローリングサークル増幅により形成された一次伸長生成物は配列決定に好適である。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図１５及び図１７は、配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸「標的」構築物の作製のための、図１３に示すものと類似のプロセスを示す。標的ゲノムＤＮＡは、１６０ｂｐの平均長のｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐの断片に剪断されたゲノムＤＮＡに由来する。本プロセスは、短いリンカーのＤＮＡセグメントへのライゲーションから開始する（太い黒い棒線、図１５、ステップＡ、及び図１７、ステップＡ）。図１５、ステップＢ、及び図１７、ステップＢに示すように、ＤＮＡセグメントの５’及び３’末端に相補的な、並びにＤＮＡセグメントの３’リンカーに相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図１５、ステップＢに示した実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、標的オリゴヌクレオチドの３’末端に非相補的な領域、即ち、ヌクレオチド配列部分（図１５、ステップＢにおける、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端付近のループがほどけた部分）を含有する。更に、リンカーを含む標的オリゴヌクレオチドの５’末端はオリゴヌクレオチドプローブに相補的でないため、フラップを形成する。図１７、ステップＢの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及び標的オリゴヌクレオチドは共に、それぞれ、標的またはプローブオリゴヌクレオチドに非相補的なヌクレオチド配列部分を含有する。これらの非相補領域は、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端付近のループ領域、及び標的オリゴヌクレオチドの５’末端付近のループ領域として示される（図１７、ステップＢ）。これらの領域は、環化核酸構築物を形成する全体的なプロセスに影響を及ぼさない。
オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分（太い黒い棒線で示す）は、固有の識別子配列、患者識別子配列、プライマー結合配列、及び／または切断可能な結合（「Ｕ」として太い棒線内に示す（図１５、ステップＢ及び１７、ステップＢ、左パネル））を含有してよい。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端にブロック基を含有してもよい（図１５、ステップＢ及び図１７、ステップＢ、右パネル；オリゴヌクレオチドプローブの５’末端上のブロック基）。図１５、ステップＣ及び１７、ステップＣで示すように、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした短いリンカー３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。本実施形態で用いるポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、例えば５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含んでよい。伸長の後、５’ヌクレアーゼはマッチする標的ＤＮＡの５’重複塩基を切断し、５’リンカー領域を除去することで、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残す（図１５、ステップＣ及び図１７、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長する（図１５、ステップＣ及び図１７、ステップＣ）。プローブの５’上のブロック基（図１５、ステップＣ及び１７、ステップＣ、左側）は切断されない。図１５、ステップＤ及び図１７、ステップＤ（左パネル）において、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端と、伸長オリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端との間でライゲーション接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ニックを、環化オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入し（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）、オリゴヌクレオチドプローブを、エキソヌクレアーゼ分解を受けやすくさせる（図１５、ステップＥ及び図１７、ステップＥ、左パネル）。図１５、ステップＤ及び１７、ステップＤ（右パネル）で示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は、伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端間のライゲーション接合部を共有結合で閉じるが、オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図１５、ステップＥ及び図１７、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼは、例えば固有の識別子配列、プライマー結合配列、または患者識別子配列を含有する更なる部分に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状核酸構築物を残して、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチド生成物またはニックオリゴヌクレオチド生成物（即ちオリゴヌクレオチドプローブ）を全て分解する。上述のように、得られる環化生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
図１６及び１８に示すプロセスは、図１５及び１７にそれぞれ示すプロセスと実質的に同一であるが、オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合、プライマー結合配列、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を含む（図１６、ステップＢ及び図１８、ステップＢ）。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした短いリンカー３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。重複してマッチする塩基における、ＤＮＡセグメントの５’末端のヌクレアーゼ切断により、ライゲーション能のある５’ホスフェートが生成される（図１６、ステップＣ及び図１８、ステップＣ）。図１６、ステップＤ及び図１８、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブの３’ブロック基は、オリゴヌクレオチドプローブの伸長を防止する。続いて、ブロック基を切断可能な結合にて、切断（例えばリボヌクレオチド「ｒ」のＲＮａｓｅ（塗りつぶした三角形）切断）により取り除く。図１６、ステップＥ及び１８、ステップＥに示すように、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はオリゴヌクレオチドプローブの遊離３’末端を伸長し、ローリングサークル増幅を開始する。ローリングサークル増幅により形成された一次伸長生成物は配列決定に好適である。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図１９及び２１は、図１３、１５及び１７に関して上述の、配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物の類似の作製プロセスを示す。標的ゲノムＤＮＡは、１６０ｂｐの平均長のｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐの断片に剪断されたゲノムＤＮＡに由来する。本実施形態において、本プロセスは、短いヌクレオチド配列尾部を、末端トランスフェラーゼを介して、標的オリゴヌクレオチド鎖の３’末端に付加することにより開始する（標的オリゴヌクレオチドの３’末端上の太い黒い棒線、図１９、ステップＡ及び２１、ステップＡ）。図１９、ステップＢ、及び図２１、ステップＢに示すように、ＤＮＡセグメントの５’及び３’末端に相補的な、並びにＤＮＡセグメントの３’リンカーに相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図１９、ステップＢに示した実施形態において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドに非相補的な領域、即ち、３’末端上のヌクレオチド配列部分（図１９、ステップＢにおける、標的オリゴヌクレオチドの３’末端付近のループがほどけた部分）を含有する。更に、標的オリゴヌクレオチドの５’末端はオリゴヌクレオチドプローブに相補的でないため、フラップを形成する。図２１、ステップＢの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、標的オリゴヌクレオチドに非相補的なヌクレオチド配列部分を含有する。この非相補領域は、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端付近のループ領域として示される。図２１、ステップＢにおける標的オリゴヌクレオチドの５’末端はオリゴヌクレオチドプローブに相補的でなく、ヌクレアーゼ切断に好適なフラップを形成する。標的オリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの間のこれらの領域の非相補性は、環化核酸構築物を形成する全体的なプロセスに影響を及ぼさない。
オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分（太い黒い棒線で示す）は、固有の識別子配列、患者識別子配列、プライマー結合配列、及び／または切断可能な結合（太い棒線内に「Ｕ」として示す）を含有してよい（図１９、ステップＢ及び２１、ステップＢ、左パネル）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端にブロック基を含有してもよい（例えば、図１９、ステップＢ及び２１、ステップＢ、右パネルは、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端上のブロック基を示す）。図１９、ステップＣ及び図２１、ステップＣに示すように、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした短いリンカー３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。本実施形態で用いるポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、例えば５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含んでよい。伸長の後、５’ヌクレアーゼはマッチする標的ＤＮＡの５’重複塩基を切断し、５’リンカー領域を除去することで、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残す。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いて、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長する（図１９、ステップＣ及び２１、ステップＣ）。プローブの５’上のブロック基（図１９、ステップＣ及び２１、ステップＣ、右側）は切断しない。図１９、ステップＤ及び図２１、ステップＤ（左パネル）において、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端と、伸長オリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端との間でライゲーション接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。環化オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合にニックが導入され（例えばｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）、オリゴヌクレオチドプローブを、エキソヌクレアーゼ分解を受けやすくさせる（図１９、ステップＥ及び２１、ステップＥ、左パネル）。図１９、ステップＤ及び２１、ステップＤ（右パネル）で示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は、伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端間のライゲーション接合部を共有結合で閉じるが、オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図１９、ステップＥ及び２１、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼは、例えば固有の識別子配列、プライマー結合配列、または患者識別子配列を含有する更なる部分に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状核酸構築物を残して、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチド生成物またはニックオリゴヌクレオチド生成物（即ちオリゴヌクレオチドプローブ）を全て分解する。上述のように、得られる環化生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
図２０及び２２に示すプロセスは、図１９及び２１にそれぞれ示すプロセスと実質的に同一であるが、オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（「ｒ」）、プライマー結合配列、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を含む（図２０、ステップＢ及び図２２、ステップＢ）。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした短いリンカー３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。重複してマッチする塩基における、ＤＮＡセグメントの５’末端のヌクレアーゼ切断により、ライゲーション能のある５’ホスフェートが生成される（図２０、ステップＣ及び図２２、ステップＣ）。図２０、ステップＤ及び図２２、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は標的の伸長３’末端を５’末端と共有結合して閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブの３’ブロック基は、オリゴヌクレオチドプローブの伸長を防止する。続いて、ブロック基を切断可能な結合にて、切断（例えばリボヌクレオチド「ｒ」のＲＮａｓｅ（塗りつぶした三角形）切断）により取り除く。図２０、ステップＥ及び２２、ステップＥに示すように、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はオリゴヌクレオチドプローブの遊離３’末端を伸長し、ローリングサークル増幅を開始する。ローリングサークル増幅により形成された一次伸長生成物は配列決定に好適である。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図２３及び図２５は、図１３、１５、１７、１９、及び２１に関して上述の、配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸「標的」構築物の類似の作製プロセスを示す。標的ゲノムＤＮＡは、１６０ｂｐの平均長のｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐの断片に剪断されたゲノムＤＮＡに由来する。図２３及び２５の実施形態において、３’または５’リンカーまたは尾部は、ゲノムＤＮＡに付加されない。図２３、ステップＢ、及び図２５、ステップＢに示すように、ＤＮＡセグメントの５’及び３’末端に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図２３、ステップＢに示した実施形態において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’及び５’末端はオリゴヌクレオチドプローブに相補的でなく、２つのハイブリダイズされていないフラップを形成する。図２５、ステップＢの実施形態において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’及び５’末端はオリゴヌクレオチドプローブに相補的である。
オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分（太い黒い棒線で示す）は、固有の識別子配列、患者識別子配列、プライマー結合配列、及び／または切断可能な結合（黒い棒線内に「Ｕ」で示す）を含有してよい（図２３、ステップＢ及び２５、ステップＢ、左パネル）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端にブロック基を含有してもよい（例えば、図２３、ステップＢ及び２５、ステップＢ、右パネル；オリゴヌクレオチドプローブの５’末端上のブロック基）。図２３、ステップＣに示すように、３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的オリゴヌクレオチドの一本鎖３’末端を取り除き、続いて、ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長してオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。標的オリゴヌクレオチドの３’末端の、ポリメラーゼが仲立ちする伸長はまた、図２５、ステップＢのプロセスでも生じる。図２３、ステップＣ及び図２５、ステップＣのプロセスにおける伸長に続いて、５’ヌクレアーゼは、マッチする標的ＤＮＡの５’重複塩基にて切断を行い、５’リンカー領域を取り除くことで、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残す。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いて、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長する（図２３、ステップＣ及び２５、ステップＣ）。プローブの５’上のブロック基（図２３、ステップＣ及び２５、ステップＣ、右側）は切断しない。図２３、ステップＤ及び２５、ステップＤ（左パネル）において、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端と、伸長オリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端との間でライゲーション接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ニックを、環化オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入し（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）、オリゴヌクレオチドプローブを、エキソヌクレアーゼ分解を受けやすくさせる（図２３、ステップＥ及び２５、ステップＥ、左パネル）。図２３、ステップＤ及び２５、ステップＤ（右パネル）で示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は、伸長標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端間のライゲーション接合部を共有結合で閉じるが、オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図２３、ステップＥ及び２５、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼは、例えば固有の識別子配列、プライマー結合配列、または患者識別子配列を含有する更なる部分に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状核酸構築物を残して、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチド生成物またはニックオリゴヌクレオチド生成物（即ちオリゴヌクレオチドプローブ）を全て分解する。上述のように、得られる環化生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
オリゴヌクレオチドプローブ、例えば図２５に示すプロセスで用いられるオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’標的特異的部分を、標的ゲノムＤＮＡセグメントと１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含むように設計することができる。この設計の特徴により、ライゲーションされた環化核酸構築物の標的ゲノムＤＮＡセグメントが、ライゲーションされた環化核酸構築物のポリメラーゼ伸長部分から区別可能となることが確実となる（即ち、図２５Ｅにおいて、実線の環化構築物が、破線の構築物と区別することができる）。
図２４及び２６に示すプロセスは、図２３及び２５にそれぞれ示すプロセスと実質的に同一であるが、オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合、プライマー結合配列、及び任意の５’捕捉基「Ｚ」を含む（図２４、ステップＢ及び２６、ステップＢ）。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの更なる部分をコピーする。図２４、ステップＣの実施形態において、ポリメラーゼは、伸長の前に標的オリゴヌクレオチドの３’非相補フラップを切断する。重複してマッチする塩基における、ＤＮＡセグメントの５’末端のヌクレアーゼ切断により、ライゲーション能のある５’ホスフェートが生成される（図２４、ステップＣ及び２６、ステップＣ）。図２４、ステップＤ及び２６、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの伸長３’末端を５’末端と共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブの３’ブロック基は、オリゴヌクレオチドプローブの伸長を防止する。続いて、ブロック基を切断可能な結合にて、切断（例えばリボヌクレオチド「ｒ」のＲＮａｓｅ（塗りつぶした三角形）切断）により取り除く。図２４、ステップＥ及び２６、ステップＥに示すように、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はオリゴヌクレオチドプローブの遊離３’末端を伸長し、ローリングサークル増幅を開始する。ローリングサークル増幅により形成された一次伸長生成物は配列決定に好適である。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図２７は、隣接メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）を含有する、一本鎖環化核酸構築物の形成方法を示す。環化核酸構築物は、メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出及び／または配列決定に適している。図２７、ステップＡに示すように、本プロセスは、ｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをＨｉｎＰ１Ｉにより、非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ認識部位にて切断することで開始し、約１６０ｂｐのＤＮＡセグメントを形成する。標的オリゴヌクレオチド断片内のメチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位は、「ｍ」により示される。図２７、ステップＢに示すように、固有の識別子配列（太い黒線）、並びにオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端の両方に非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ配列を有する（即ち、ｃｆＤＮＡのＨｉｎＰ１Ｉ部位に相補的な）オリゴヌクレオチドプローブを、メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位（左パネル）または非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位（右パネル）を有する標的ｃｆＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブの５’末端はブロック基を含有し、３’末端は標的オリゴヌクレオチドにミスマッチしており、ポリメラーゼ伸長を防止する。図２７、ステップＣにおいて、ゲノム標的セグメントにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを、ＨｉｎＰ１Ｉ（塗りつぶした三角形）切断に供する。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドがメチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有しない場合、ＨｉｎＰ１Ｉは標的及びプローブオリゴヌクレオチドの両方を切断するため、非メチル化標的配列を更なる分析から除外する。図２７、ステップＣ（左パネル）に示すように、標的オリゴヌクレオチドがメチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有するが、プローブオリゴヌクレオチドがメチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を含有しない場合、ＨｉｎＰ１Ｉはプローブオリゴヌクレオチドのみを切断するため、伸長能のある３’ＯＨ及びライゲーション能のある５’ホスフェートが生成される。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はオリゴヌクレオチドプローブの遊離３’末端を伸長し、リガーゼ（塗りつぶした円）はオリゴヌクレオチドプローブの３’伸長末端及び５’末端を共有結合で閉じ、共有結合で閉じたライゲーション生成物を作製する（図２７、ステップＤ）。ＨｉｎＰ１Ｉの熱による失活、または修飾ヌクレオチドのポリメラーゼ組み込みにより、ＨｉｎＰ１Ｉによる再切断が防止させる。図２７、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解は、全てのライゲーションされていない生成物または切断された生成物を取り除くことにより、固有の識別子配列を有する標的ＤＮＡの相補体を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残す。この環化ライゲーション生成物は、ローリングサークル増幅及び後続の配列決定に適している。
図２８は、ゲノム全体を通しての、隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）におけるメチル化の発見プロセスを示す。本プロセスは、ＨｉｎＰ１ＩによりゲノムＤＮＡを切断し、図２８、ステップＡに示すように、切断したゲノム断片に、ブロック５’末端を有する短いリンカー（太い黒線）をライゲーションすることを伴う。「ｍ」は、メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を示す。図２８、ステップＢにおいて、５’ブロックプライマーによる制限ＰＣＲ増幅により、非メチル化生成物が生成される。ＨｉｎＰ１Ｉ（塗りつぶした三角形）で切断した場合、元の標的でメチル化された隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＧ）のみが、非ブロック断片を生成する。図２８、ステップＣに示すように、ブロック３’末端またはチオホスフェート含有骨格（＊＊＊＊）のいずれかを有する、任意の固有の識別子配列（灰色に塗りつぶした二重線）、任意の患者識別子配列（灰色に塗りつぶした二重線）を含有するリンカー（二重線）上でライゲーションし（塗りつぶした円）、３’エキソヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）による後続の分解を阻害する。両側にライゲーションしたリンカーを有する断片のみが、二本鎖として残る。図２８、ステップＤにおいて、リンカーの自由端に、（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながらの、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせにより、ライゲーション能を付与する。図２８、ステップＥにおいて、オリゴマー化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。ライゲーション生成物は、任意の固有の識別子及び／または患者識別子配列を有する、標的ＤＮＡ中で元々メチル化されていた隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を含む。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図２９は、平均長１６０ｂｐのｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐ断片に剪断されたゲノムＤＮＡ（「標的オリゴヌクレオチド」または「ＤＮＡセグメント」）から始まる、既知のゲノム領域での隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）におけるメチル化の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図２９、ステップＡに示すように、本プロセスは、ゲノムＤＮＡの３’及び５’末端上に、亜硫酸水素塩耐性リンカー（太い黒線）を（例えばライゲーションにより）付加することで開始する。ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理することで、非メチル化シトシンをウラシルに転換することで、一本鎖生成物が得られる（図２９、ステップＡの「ｍ」はメチル化ＡｃｉＩ部位を表す）。制限ＰＣＲを行い、二本鎖生成物を生成し、得られたＰＣＲ産物をＡｃｉＩ（塗りつぶした三角形）で切断する。元の標的セグメント内のメチル化部位のみがＧＣＧＧとして残り、ＡｃｉＩ切断を受けてライゲーション能のある末端が生成される。図２９、ステップＢに示すように、切断標的オリゴヌクレオチドの５’及び３’側に相補的な配列、並びに任意で、５’ブロック基を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれの相補標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。標的特異的部分に加えて、オリゴヌクレオチドプローブは更なる部分もまた含有する。この更なる部分は、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び１つ以上のプライマー結合部位を含有し得るヌクレオチド配列部分である。図２９、ステップＣに示すように、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が標的オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーして、標的オリゴヌクレオチドの５’末端を有するライゲーション能のある接合部を生成する。ポリメラーゼはまた、標的オリゴヌクレオチドを鋳型として用いオリゴヌクレオチドプローブを伸長するが、存在する場合、プローブの５’ブロック基は切断しない。図２９、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は標的オリゴヌクレオチドの３’及び５’末端を共有結合で閉じ、（亜硫酸水素塩で処理し、コピーした）標的ＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基は、オリゴヌクレオチドプローブ鎖の環化を防止する。図２９、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼは、固有の識別子配列を有する、亜硫酸水素塩で転換された標的ＤＮＡの相補体を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。最終生成物は、上述の方法のいずれかを用いた環状配列決定に好適である。
図３０は、１６０ｂｐの平均長のｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐ断片に剪断されたゲノムＤＮＡから始まる、既知のゲノム領域での隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）におけるメチル化の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図３０Ａに示すように、本プロセスは、ＤＮＡセグメントの３’及び５’末端に、亜硫酸水素塩耐性リンカー（太い黒線）を（例えばライゲーションにより）付加することから開始する。ＤＮＡセグメントの「ｍ」は、メチル化ＡｃｉＩ部位を表す。ｃｆＤＮＡ及び／またはＤＮＡセグメントを亜硫酸水素塩処理することで、非メチル化ＣがＵに転換され、一本鎖生成物が生成される。制限ＰＣＲを行い、二本鎖生成物を生成し、得られたＰＣＲ産物をＡｃｉＩ（塗りつぶした三角形）で切断する（元の標的内のメチル化部位のみがＧＣＧＧとして残る）ことで、ライゲーション能のある末端が生成される。図３０、ステップＢに示すように、切断した標的ＰＣＲ産物の５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれの相補標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合、及び／または任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を有してよい。標的特異的部分に加えて、オリゴヌクレオチドプローブは更なる部分もまた含有する。この更なる部分は、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び１つ以上のプライマー結合部位を含有し得るヌクレオチド配列部分である。図３０、ステップＣに示すように、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が標的オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーして、標的オリゴヌクレオチドの５’末端を有するライゲーション能のある接合部を生成する。図３０、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は標的オリゴヌクレオチドの３’及び５’末端を共有結合で閉じ、（亜硫酸水素塩処理し、コピーした）標的ＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基は、オリゴヌクレオチドプローブ鎖の伸長及び環化を防止する。切断可能な結合のニッキング（例えば、リボヌクレオチドｒによるＲＮａｓｅ切断）により、続いて３’ブロック基を取り除くことにより、ポリメラーゼが仲立ちするオリゴヌクレオチドプローブの伸長が可能となる（図３０、ステップＤ）。図３０に示す、ステップＥに示すように、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ローリングサークル増幅のために遊離３’末端を伸長する。この伸長生成物は、本明細書記載の方法のいずれかを用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図３１は、１６０ｂｐの平均長のｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐ断片に剪断されたゲノムＤＮＡから始まる、既知のゲノム領域での隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）でのメチル化の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す（ｍはメチル化ＡｃｉＩ部位を表す）。図３１、ステップＡに示すように、本プロセスは、ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上に（例えばライゲーションにより）亜硫酸水素塩耐性リンカー（太い黒線）を付加することにより開始する。ｃｆＤＮＡ及び／またはＤＮＡセグメントを亜硫酸水素塩処理することで、非メチル化ＣがＵに転換され、一本鎖生成物が生成される。制限ＰＣＲを行い、二本鎖生成物を生成し、得られたＰＣＲ産物をＡｃｉＩで切断する（塗りつぶした三角形）。元の標的内のメチル化部位のみがＧＣＧＧとして残り、ＡｃｉＩによる切断を受けてライゲーション能のある末端が生成される。図３１、ステップＢに示すように、二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、切断した標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。二本鎖プローブは、更なる部分により互いに分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的なヌクレオチド配列を含有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖を含む。更なる部分は、固有の識別子部分、及び／または患者識別子部分、及び／または１つ以上のプライマー結合配列を含む。二本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ループを有する太い黒線）の第２のオリゴヌクレオチドプローブは、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に相補的な配列を含有する。第２のオリゴヌクレオチドプローブのループ領域は、非相補領域を示す。図３１、ステップＣに示すように、切断したゲノムＤＮＡセグメントへの二本鎖プローブのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡセグメントの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端との間、及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端と切断したゲノムセグメントの５’との間に、２つのライゲーション能のある接合部を作製する。リガーゼ（塗りつぶした円）は、ライゲーション接合部を共有結合で閉じ、（亜硫酸水素塩で処理し、コピーした）ＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する（図３１、ステップＣ）。図３１、ステップＤに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、本明細書記載の方法のいずれかを用いた環状配列決定に好適な、所望の一本鎖環状ライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。
図３２は、図３１に図示及び記載した、隣接ＡｃｉＩ部位におけるメチル化の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物と実質的に同一の作製プロセスを示す。図３２に示す実施形態において、二本鎖プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブは、任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を有する（図３２、ステップＢ）。第２のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（亜硫酸水素塩で処理し、コピーした）標的ＤＮＡセグメントをライゲーションして環化ライゲーション生成物を形成した後（図３２、ステップＣ）、第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を、鎖置換ポリメラーゼを用いて伸長する。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物（図３２、ステップＤ）に相補的であり、かつ本明細書記載の方法を用いた配列決定に好適なタンデム線状配列を含有する第１の一次伸長生成物が生成される。
図３３は、１５０ｂｐの平均サイズに剪断されたゲノムＤＮＡ、または１６０ｂｐの平均サイズを有するｃｆＤＮＡのいずれかから開始する、ゲノム全体を通しての、隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）におけるメチル化発見のためのプロセスを示す。図３３、ステップＡに示すように、本プロセスは、例えばライゲーションにより、ＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上に短いリンカー（太い黒線）を付加することにより開始する。５’リンカーはブロック基を含有する。ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することにより、非メチル化CをＵに転換し、一本鎖生成物が得られる。図３３、ステップＢに示すように、５’ブロックプライマーによる制限ＰＣＲ増幅により、非メチル化生成物が生成される。ＡｃｉＩ（塗りつぶした三角形）で切断した場合、元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）のみが、非ブロック断片を生成する。図３３、ステップＣに示すように、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列を含有するリンカー（灰色の二重線）が（例えば、ＡｃｉＩ切断生成物へのライゲーションにより）付加される。リンカーは３’ブロック基、またはチオホスフェート含有骨格（＊＊＊＊）のいずれかを含み、３’エキソヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）による後続の分解を阻害する。両側にリンカーが付加された断片のみが二本鎖のまま残る（図３３、ステップＣ、下面）。図３３、ステップＤに示すように、（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断による、ライゲーション能のある５’ホスフェートの生成、または（ｉｖ）これらの技術の任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー末端にライゲーション能を付与する（塗りつぶした円）。オリゴマー化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。図３３、ステップＥは、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列と共に、亜硫酸水素塩で転換した（多くの場合、ＣｐＧアイランドから生じる）標的ＤＮＡの相補体を含むライゲーション生成物を示す。最終生成物は追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図３４は、１６０ｂｐの平均長のｃｆＤＮＡ、または約１６０ｂｐ断片に剪断されたゲノムＤＮＡから開始する、ゲノムの規定領域における非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図３４、ステップＡに示すように、本プロセスはＧＣＧＣ認識部位におけるゲノムＤＮＡのＨｉｎＰ１Ｉ切断により開始し（塗りつぶした三角形）、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。図３４、ステップＢに示すように、切断した標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれの切断標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、及び任意で、患者識別子配列を含有する、更なるヌクレオチド部分も含有する。図３４の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端、例えば５’末端上にブロック基を有する。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーして、標的の５’末端上にライゲーション能のあるホスフェートを有するライゲーション接合部を作製する（図３４、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図３４、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図３４、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に好適である。
図３５は、図３４に図示及び記載したゲノムの規定領域における非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物と実質的に同一の作製プロセスを示す。図３５に示す実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（切断可能な結合は「ｒ」として示される）、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を有する（図３５、ステップＢ）。ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端は、伸長ポリメラーゼで伸長され、標的ＤＮＡセグメントの５’末端上でライゲーション能のあるホスフェートとのライゲーション接合部を作製する。標的ＤＮＡセグメントの３’伸長末端及び５’末端のライゲーションにより、環化ライゲーション生成物を形成した後（図３５、ステップＣ）、オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基が取り除かれ（例えば、リボヌクレオチド結合のＲＮａｓｅＨ切断）（図３５、ステップＤ）、環化ＤＮＡライゲーション生成物を鋳型として用いて、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図３５、ステップＥ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図３５、ステップＥ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。ローリングサークル増幅の前または後に、任意の５’Ｚ基を、固体支持体上に捕捉させてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図３６及び３７は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域のＨａｅＩＩＩ部位間でのメチル化ＡｃｉＩ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＡｃｉＩ（塗りつぶした三角形、ＧＣＧＧ）とＨａｅＩＩＩ（塗りつぶした三角形、ＧＧＣＣ）で切断され、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。ｍは切断セグメント内でのメチル化部位を表す（図３６、ステップＡ及び３７、ステップＡ）。図３６の実施形態において、標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図３６、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含有する更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図３６、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーし、標的の５’末端上で、ライゲーション能のあるホスフェートとのライゲーション接合部を作製する（図３６、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図３６、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図３６、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に好適である。
図３７に示す実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（切断可能な結合は「ｒ」として示される）、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）を有する（図３７、ステップＢ）。標的ＤＮＡセグメントの３’伸長末端及び５’末端のライゲーションにより、環化ライゲーション生成物を形成した後（図３７、ステップＣ）、オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基が取り除かれ（例えば、リボヌクレオチド結合のＲＮａｓｅＨ切断）（図３７、ステップＤ）、環化ＤＮＡライゲーション生成物を鋳型として用いて、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図３７、ステップＥ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図３７、ステップＥ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図３８は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内のＨａｅＩＩＩ部位間でのメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）とＨａｅＩＩＩ（塗りつぶした三角形、ＧＧＣＣ）で切断され、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。ｍは切断セグメント内のメチル化部位を表す（図３８、ステップＡ）。図３８の実施形態において、標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図３８、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含有する更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図３８、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーして、標的の５’末端上にライゲーション能のあるホスフェートを有するライゲーション接合部を作製する（図３８、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図３８、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図３８、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）の存在下におけるＢｓｔポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅に適しており、元の標的内のメチル化された部位が切断されず、続いて配列決定により識別されることが確実となる。本実施例は、ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼの利用を示している。しかし、非メチル化の場合、二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ及び非メチル化一本鎖ＤＮＡを切断しない他のエンドヌクレアーゼもまた、本方法で利用することができる。これらとしては、高温性酵素ＢｓｔＨＨＩ（ＧＣＧＣを認識；ＨｈａＩのイソ制限酵素）、ＢｓｉＳＩ（ＣＣＧＧを認識；ＨｐａＩＩのイソ制限酵素）、及びＴａｉＩ（ＡＣＧＴを認識；ＭａｅＩＩのイソ制限酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。
図３９及び図３６は、ゲノムＤＮＡの既知領域内の５’ＨａｅＩＩＩ部位付近でのメチル化ＡｃｉＩ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。本方法は、１６０ｂｐの平均サイズに剪断されたゲノムＤＮＡ、または１６０ｂｐの平均サイズを有するｃｆＤＮＡ内でのメチル化ＡｃｉＩ部位の検出に適している。ゲノムＤＮＡはＡｃｉＩ（ＧＣＧＧ）及びＨａｅＩＩＩ（ＧＧＣＣ）で切断され、ライゲーション能のある５’末端を生成する（図３９、ステップＡ及び４０、ステップＡ）。図３９に示す実施形態において、標的ゲノムＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’末端配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図３９、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含む更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図３９、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。３’−５’ヌクレアーゼ活性を有するが、５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が一本鎖３’末端を取り除き、その後、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーして、標的の５’末端上にライゲーション能のあるホスフェートを有するライゲーション接合部を作製する（図３９、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図３９、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図３９、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に好適である。
図４０に示す実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される、切断標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’末端配列を含有する。更に、オリゴヌクレオチドプローブはまた、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（切断可能な結合は「ｒ」として示される）、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図４０、ステップＡ）。標的ＤＮＡセグメントの３’伸長末端及び５’末端のライゲーションにより、環化ライゲーション生成物を形成した後（図４０、ステップＣ）、オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基が取り除かれ（例えば、リボヌクレオチド結合のＲＮａｓｅＨ切断）（図４０、ステップＤ）、環化ＤＮＡライゲーション生成物を鋳型として用いて、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図４０、ステップＥ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図４０、ステップＥ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図４１は、ゲノムＤＮＡの既知領域における、５’ＨａｅＩＩＩ部位付近のメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。本方法は、１５０ｂｐの平均サイズに剪断されたゲノムＤＮＡ、または１６０ｂｐの平均サイズを有するｃｆＤＮＡ内でのメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に適している。ゲノムＤＮＡはＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）とＨａｅＩＩＩ（ＧＧＣＣ）で切断され、ライゲーション能のある５’末端を生成する（図４１、ステップＡ）。図４１に示す実施形態において、標的ゲノムＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’末端配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図４１、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含む更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図４１、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。３’−５ヌクレアーゼ活性を有するが、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的ＤＮＡセグメントの一本鎖３’末端を取り除き、その後、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの切断３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーして、標的の５’末端上にライゲーション能のあるホスフェートを有するライゲーション接合部を作製する（図４１、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図４１、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図４１、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）の存在下におけるＢｓｔポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅に適しており、元の標的内のメチル化された部位は続いて、配列決定により確実に識別される。本実施例は、ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼの利用を示している。しかし、非メチル化の場合、二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ及び非メチル化一本鎖ＤＮＡを切断しない他のエンドヌクレアーゼを代わりに利用することができる。これらとしては、高温性酵素ＢｓｔＨＨＩ（ＧＣＧＣを認識；ＨｈａＩのイソ制限酵素）、ＢｓｉＳＩ（ＣＣＧＧを認識；ＨｐａＩＩのイソ制限酵素）、及びＴａｉＩ（ＡＣＧＴを認識；ＭａｅＩＩのイソ制限酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。
図４２及び図４３は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内の３’ＨａｅＩＩＩ部位付近でのメチル化ＡｃｉＩ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＡｃｉＩ（ＧＣＧＧ）及びＨａｅＩＩＩ（ＧＧＣＣ）で切断され、伸長能のある３’末端を生成する（図４２、ステップＡ及び４３、ステップＡ）。図４２の実施形態において、標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図４２、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含有する更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図４２Ｂに示す５’ブロック基）を有してもよい。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーする。ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡセグメントのマッチする５’重複塩基を切断することにより、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図４２、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図４２、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、元のゲノムＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図４２、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に好適である。
図４３の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、オリゴヌクレオチドプローブはまた、３’末端上にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（切断可能な結合は「ｒ」として示される）、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図４３、ステップＢ）。標的ＤＮＡセグメントの３’伸長末端及び５’末端のライゲーションにより、環化ライゲーション生成物を形成した後（図４３、ステップＣ）、オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基が取り除かれ（例えば、リボヌクレオチド結合のＲＮａｓｅＨ切断）（図４３、ステップＤ）、環化ＤＮＡライゲーション生成物を鋳型として用いて、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図４３、ステップＥ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図４３、ステップＥ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図４４は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域において、３’ＨａｅＩＩＩ部位付近のメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）とＨａｅＩＩＩ（ＧＧＣＣ）で切断され、伸長能のある３’末端を生成する（図４４、ステップＡ）。図４４の実施形態において、標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図４４、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含有する更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図４４、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーする。ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡセグメントのマッチする５’重複塩基を切断することにより、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図４４、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図４４、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、元のゲノムＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図４４、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）の存在下におけるＢｓｔポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅に適しており、元の標的内のメチル化された部位は続いて、配列決定により確実に識別される。本実施例は、ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼの使用を示す。しかし、非メチル化の場合、二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ及び非メチル化一本鎖ＤＮＡを切断しない他のエンドヌクレアーゼを使用することができる。これらとしては、高温性酵素ＢｓｔＨＨＩ（ＧＣＧＣを認識；ＨｈａＩのイソ制限酵素）、ＢｓｉＳＩ（ＣＣＧＧを認識；ＨｐａＩＩのイソ制限酵素）、及びＴａｉＩ（ＡＣＧＴを認識；ＭａｅＩＩのイソ制限酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。
図４５は、ゲノムＤＮＡの既知領域における隣接メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。本方法は、１５０ｂｐの平均サイズに剪断されたゲノムＤＮＡ、または１６０ｂｐの平均サイズを有するｃｆＤＮＡ内でのメチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位の検出に適している。ゲノムＤＮＡは、標的ＤＮＡ内の非メチル化認識部位にてＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）により切断される（図４５、ステップＡ）。図４５に示す実施形態において、標的ゲノムＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’末端配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図４５、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含む更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図４４、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。３’−５’活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が標的の一本鎖３’末端を取り除き、続いて、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーする。ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡセグメントのマッチする５’重複塩基を切断することにより、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図４５、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図４５、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図４５、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）の存在下でのＢｓｔポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅に適している。したがって、元の標的内のメチル化された部位が増幅され、続いて配列決定により識別される。本実施例は、ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼの利用を示している。しかし、非メチル化の場合、二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ及び非メチル化一本鎖ＤＮＡを切断しない他のエンドヌクレアーゼを使用することができる。これらとしては、高温性酵素ＢｓｔＨＨＩ（ＧＣＧＣを認識；ＨｈａＩのイソ制限酵素）、ＢｓｉＳＩ（ＣＣＧＧを認識；ＨｐａＩＩのイソ制限酵素）、及びＴａｉＩ（ＡＣＧＴを認識；ＭａｅＩＩのイソ制限酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。
図４６は、ゲノムＤＮＡの既知領域における、Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位付近の全てのメチル化ＣｐＧ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。本方法は、１５０ｂｐの平均サイズに剪断されたゲノムＤＮＡ、または１６０ｂｐの平均サイズを有するｃｆＤＮＡ内の、メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位付近での全てのメチル化ＣｐＧ部位の検出に適している。ゲノムＤＮＡは、非メチル化認識部位にてＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）により切断される（図４６、ステップＡ）。亜硫酸水素塩処理により非メチル化ＣがＵに転換され、鎖を非相補的にする。図４６に示す実施形態において、亜硫酸水素塩処理したメチル化標的ゲノムＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’末端配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図４６、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含む更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図４６、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。３’−５’活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が亜硫酸水素塩処理した標的の一本鎖３’末端を取り除き、続いてハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長してプローブの更なる部分をコピーする。ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は亜硫酸水素塩処理した標的ＤＮＡセグメントのマッチする５’重複塩基を切断することにより、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図４６、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、亜硫酸水素塩処理した標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブを伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図４６、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、ＤＮＡセグメントの３’伸長末端と５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図４６、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した元の亜硫酸水素塩処理済標的ＤＮＡセグメントを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残す。最終生成物は、ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）の存在下におけるＢｓｔポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅に適しており、亜硫酸水素塩により転換されない部位が元の標的内で確実にメチル化され、他の全てのメチル化ＣｐＧ部位が配列決定により識別される。本実施例は、ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼの使用を示す。しかし、非メチル化の場合、二本鎖ＤＮＡを切断するが、ハイブリッドメチル化／非メチル化ＤＮＡ及び非メチル化一本鎖ＤＮＡを切断せず、亜硫酸水素塩処理の後にメチル化部位の制限認識を保持する、他のエンドヌクレアーゼを利用することができる。これには高温性酵素のＴａｉＩ（ＡＣＧＴを認識；ＭａｅＩＩのイソ制限酵素）が挙げられるが、これに限定されない。
図４７及び図４８は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＨｉｎＰ１Ｉ（ＧＣＧＣ）（塗りつぶした三角形）で切断され、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する（図４７、ステップＡ及び４８、ステップＡ）。図４７、ステップＢに示すように、二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、切断した標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。二本鎖プローブは、更なる部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的なヌクレオチド配列を含有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖を含む。更なる部分は、固有の識別子部分、及び／または患者識別子部分、及び／または１つ以上のプライマー結合配列を含む。二本鎖オリゴヌクレオチドプローブの第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ループを有する太い黒線）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に相補的な配列を含有する。第２のオリゴヌクレオチドプローブのループ領域は、非相補領域を示す。図４７、ステップＣに示すように、２つのライゲーション能のある接合部、即ち、二本鎖プローブの切断ゲノムＤＮＡセグメントへのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡセグメントの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端との間、及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端と切断ゲノムセグメントの５’との間、が作製される。リガーゼ（塗りつぶした円）は、ライゲーション接合部を共有結合で閉じ、ゲノムＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する（図４７、ステップＣ）。図４７、ステップＤに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、本明細書記載の方法のいずれかを用いた環状配列決定に好適な所望の一本鎖環状ライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。
図４８に示す実施形態において、二本鎖プローブの第１のオリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、第１のオリゴヌクレオチドプローブはまた、任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図４８、ステップＢ）。標的ＤＮＡセグメントと第２のオリゴヌクレオチドプローブとの間の２つのライゲーション接合部にてライゲーションをし、図４８、ステップＣの環化ライゲーション生成物を形成した後、ライゲーション生成物を鋳型として含有する環化ＤＮＡを用いて、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が第１のオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図４８、ステップＤ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図４８、ステップＤ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図４９及び図５０は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内のＨａｅＩＩＩ部位間に位置するメチル化（「ｍ」）ＡｃｉＩ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＡｃｉＩ（塗りつぶした三角形、ＧＣＧＧ）とＨａｅＩＩＩ（塗りつぶした三角形、ＧＧＣＣ）で切断され、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する（図４９、ステップＡ及び５０、ステップＡ）。図４９、ステップＢ及び５０、ステップＢで示すように、二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、切断した標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図４９に示す実施形態において、二本鎖プローブは、更なる部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的なヌクレオチド配列を含有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖を含む。更なる部分は、固有の識別子部分、及び／または患者識別子部分、及び／または１つ以上のプライマー結合配列を含む（図４９、ステップＢ）。二本鎖オリゴヌクレオチドプローブの第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ループを有する太い黒線）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に相補的な配列を含有する（図４９、ステップＢ）。第２のオリゴヌクレオチドプローブのループ領域は、非相補領域を示す。図４９、ステップＣに示すように、２つのライゲーション能のある接合部、即ち、二本鎖プローブの切断ゲノムＤＮＡセグメントへのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡセグメントの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端との間、及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端と切断ゲノムセグメントの５’との間、が作製される。リガーゼ（塗りつぶした円）は、ライゲーション接合部を共有結合で閉じ、メチル化ゲノムＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する（図４９、ステップＣ）。図４９、ステップＤに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、本明細書記載の方法のいずれかを用いた環状配列決定に好適な所望の一本鎖環状ライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。
図５０に示す実施形態において、二本鎖プローブの第１のオリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、第１のオリゴヌクレオチドプローブはまた、任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図５０、ステップＢ）。標的ＤＮＡセグメントと第２のオリゴヌクレオチドプローブとの間で２つのライゲーション接合部をライゲーションし、環状メチル化ライゲーション生成物を形成した後（図５０、ステップＣ）、ライゲーション生成物を鋳型として含有する環化ＤＮＡを用いて、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が第１のオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図５０、ステップＤ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図５０、ステップＤ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図５１は、ゲノムＤＮＡの既知領域内での、非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）の発見プロセスを示す。全細胞から単離されたか、または血漿内にｃｆＤＮＡとして存在するゲノムＤＮＡは、天然酵素プロセスまたは剪断により、末端を含有する。これらは、短いリンカーをＤＮＡ末端の３’及び５’末端に付加する（例えば、ライゲーションによりリンカーを付加する）ことにより後続のステップからブロックする必要がある。図５１、ステップＡに示すように、５’末端リンカーはブロック基（太い黒線）を含有する。リンカーが付加されたＤＮＡをＨｉｎＰ１Ｉ（ＧＣＧＣ）（塗りつぶした三角形）で切断する（図５１、ステップＡ）。元のゲノムＤＮＡ内の非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＧ）のみが、ＨｉｎＰ１Ｉにより切断される時に非ブロック断片を生成する。図５１、ステップＢに示すように、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列を含有する長いリンカー（部分的な灰色の二重線）が、ＨｉｎＰ１Ｉにより切断されたＤＮＡ断片に付加される。長いリンカーは、３’末端ブロック基またはチオホスフェート含有骨格（＊＊＊＊）のいずれかを含有し、３’エキソヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）による後続の分解を阻害する。両側にリンカーが付加された断片のみが二本鎖として残る。図５１、ステップＣに示すように、リンカーの自由端に、（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）３’ブロック基の除去、（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断による、ライゲーション能のある５’ホスフェートの生成、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の任意の組み合わせのいずれかにより、ライゲーション能を付与する。オリゴマー化に有利となるように、ライゲーション（塗りつぶした円）条件を設計する。図５１、ステップＤに示すように、ライゲーション生成物は、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列に結合したゲノムＤＮＡ内に、元々非メチル化されている隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を含む。最終生成物は、後続の配列決定に適している。
図５２は、ゲノム全体を通しての、既知の領域内でのメチル化隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）の発見プロセスを示す。ゲノムＤＮＡはＡｃｉＩ（塗りつぶした三角形）で切断され、ｍはメチル化部位を表す。図５２、ステップＡに示すように ５’末端ブロック基（太い黒線）を有する短いリンカーが、例えばライゲーションにより、ＡｃｉＩで分解されたＤＮＡに付加される。リンカーが付加されたＤＮＡはＨａｅＩＩＩ（ＧＧＣＣ）で切断される。元のゲノムＤＮＡ中の、メチル化ＡｃｉＩ部位を有する隣接ＨａｅＩＩＩ部位（ＧＧＣＣ）のみが、ＨａｅＩＩＩにより切断される時に非ブロック断片を生成する。図５２、ステップＢにおいて、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列を含有する長いリンカー（部分的な灰色の二重線）が、ＨａｅＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片に付加される。長いリンカーは、３’末端ブロック基またはチオホスフェート含有骨格（＊＊＊＊）のいずれかを含有し、３’エキソヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）による後続の分解を阻害する。両側にリンカーが付加された断片のみが二本鎖として残る。図５２、ステップＣに示すように、リンカーの自由端に、（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）３’ブロック基の除去、（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断による、ライゲーション能のある５’ホスフェートの生成、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の任意の組み合わせのいずれかにより、ライゲーション能を付与する。オリゴマー化に有利となるように、ライゲーション（塗りつぶした円）条件を設計する。図５２、ステップＤに示すように、ライゲーション生成物は、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列に結合したゲノムＤＮＡ内のＡｃｉＩ部位にて、元々メチル化されている隣接ＨａｅＩＩＩ配列を含む。最終生成物は、後続の配列決定に適している。
図５３及び図５４は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図５３、ステップＡ及び５４、ステップＡに示すように、ゲノムＤＮＡをＨｉｎＰ１Ｉ（ＧＣＧＣ）で切断し、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。ＨｉｎＰ１Ｉで分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することで、非メチル化ＣをＵに転換する。図５３の実施形態において、標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な５’及び３’配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図５３、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドは、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び片端での任意のブロック基を含有する。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、標的の５’末端上のライゲーション能のあるホスフェートとなる（図５３、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的上でオリゴヌクレオチドプローブを伸長するが、５’ブロック基は切断しない。図５３、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長標的ＤＮＡセグメント末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図５３、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列と共に、亜硫酸水素塩で転換された元の標的ＤＮＡを含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。最終生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に好適である。
図５４の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、オリゴヌクレオチドプローブはまた、３’末端上にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（切断可能な結合は「ｒ」として示される）、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図５４、ステップＢ）。標的ＤＮＡセグメントの３’伸長末端及び５’末端のライゲーションにより、環化ライゲーション生成物を形成した後（図５４、ステップＣ）、オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基が取り除かれ（例えば、リボヌクレオチド結合のＲＮａｓｅＨ切断）（図５４、ステップＤ）、環化ＤＮＡライゲーション生成物を鋳型として用いて、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図５４、ステップＥ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図５４、ステップＥ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図５５及び５６は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図５５、ステップＡ及び５６、ステップＡに示すように、ゲノムＤＮＡはＨｉｎＰ１Ｉ（ＧＣＧＣ）（塗りつぶした三角形）で切断され、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。ＨｉｎＰ１Ｉで分解されたＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することにより、非メチル化ＣがＵに転換される（図５５、ステップＡ及び５６、ステップＡ）。図５５、ステップＢ及び５６、ステップＢで示すように、二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、切断した標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図５５に示す実施形態において、二本鎖プローブは、更なる部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的なヌクレオチド配列を含有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖を含む。更なる部分は、固有の識別子部分、及び／または患者識別子部分、及び／または１つ以上のプライマー結合配列を含む（図５５、ステップＢ）。二本鎖オリゴヌクレオチドプローブの第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ループを有する太い黒線）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に相補的な配列を含有する（図５５、ステップＢ）。第２のオリゴヌクレオチドプローブのループ領域は、非相補領域を示す。図５５、ステップＣに示すように、二本鎖プローブの、ＨｉｎＰ１Ｉで分解し亜硫酸水素塩で処理したゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションにより、２つのライゲーション能のある接合部、即ち、ＤＮＡセグメントの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端との間、及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端とＤＮＡセグメントの５’との間が作製される。リガーゼ（塗りつぶした円）は、ライゲーション接合部を共有結合で閉じ、亜硫酸水素塩処理したゲノムＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する（図５５、ステップＣ）。図５５、ステップＤに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、本明細書記載の方法のいずれかを用いた環状配列決定に好適な所望の一本鎖環状ライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。
図５６に示す実施形態において、二本鎖プローブの第１のオリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、第１のオリゴヌクレオチドプローブはまた、任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図５６、ステップＢ）。標的ＤＮＡセグメントと第２のオリゴヌクレオチドプローブとの間の２つのライゲーション接合部におけるライゲーションにより環化ライゲーション生成物を形成した後（図５６、ステップＣ）、ライゲーション生成物を鋳型として含有する環化ＤＮＡを用いて、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が第１のオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図５６、ステップＤ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図５６、ステップＤ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図５７は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）の発見プロセスを示す。全細胞から単離されたか、または血漿内にｃｆＤＮＡとして存在するゲノムＤＮＡは、天然酵素プロセスまたは剪断により、末端を含有する。これらは、短いリンカーをＤＮＡ末端の３’及び５’末端に付加する（例えば、ライゲーションによりリンカーを付加する）ことにより後続のステップをブロックする必要がある。図５７、ステップＡに示すように、５’末端リンカーはブロック基（太い黒線）を含有する。リンカーが付加されたＤＮＡをＨｉｎＰ１Ｉ（ＧＣＧＣ）（塗りつぶした三角形）で切断する（図５７、ステップＡ）。元のゲノムＤＮＡ内の非メチル化隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＧ）のみが、ＨｉｎＰ１Ｉにより切断される時に非ブロック断片を生成する。図５７、ステップＢに示すように、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列を含有する長いリンカー（部分的な灰色の二重線）が、ＨｉｎＰ１Ｉにより切断されたＤＮＡ断片に付加される。長いリンカーは、３’末端ブロック基またはチオホスフェート含有骨格（＊＊＊＊）のいずれかを含有し、３’エキソヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）による後続の分解を阻害する。両側にリンカーが付加された断片のみが二本鎖として残る。図５７、ステップＣに示すように、リンカーの自由端に、（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）３’ブロック基の除去、（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断による、ライゲーション能のある５’ホスフェートの生成、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の任意の組み合わせのいずれかにより、ライゲーション能を付与する。オリゴマー化に有利となるように、ライゲーション（塗りつぶした円）条件を設計する。図５７、ステップＤに示すように、ライゲーション生成物を亜硫酸水素塩処理することで、非メチル化ＣがＵに転換する。ライゲーション生成物は、固有の識別子及び／または患者識別子配列に結合した標的ＤＮＡ内の、元々非メチル化されている隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列内に、亜硫酸水素塩により転換されたＤＮＡを含む。最終生成物は追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図５８及び図５９は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での非メチル化隣接「ＨｐｈＩ」の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図５８、ステップＡ及び５９、ステップＡに示すように、短いリンカーがｃｆＤＮＡ断片または剪断したゲノムＤＮＡに（例えばライゲーションにより）付加される。リンカーが付加されたＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、非メチル化ＣをＵに転換する。制限ＰＣＲを行い、得られるＰＣＲ産物をＨｐｈＩ（非メチル化ＧＧＣＧＡのみがＧＧＴＧＡとなる）により切断し、ライゲーション能のある末端を生成する（図５８、ステップＡ及び５９、ステップＡ）。図５８の実施形態において、分解した標的ＰＣＲセグメントに５’及び３’側に相補的な５’及び３’末端配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、切断ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図５８、ステップＢ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または１つ以上のプライマー結合部位の１つ以上を含有する更なるヌクレオチド部分も含有する。オリゴヌクレオチドプローブはまた、片端上にブロック基（例えば、図５８、ステップＢに示す５’ブロック基）を有してもよい。５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’末端を伸長し、プローブの更なる部分をコピーし、ハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの５’末端とライゲーション接合部を形成する（図５８、ステップＣ）。ポリメラーゼはまた、標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いてオリゴヌクレオチドプローブも伸長するが、５’末端上のブロック基は切断しない。図５８、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は、３’伸長末端とＤＮＡセグメントの５’末端との間の接合部を共有結合で閉じ、ＰＣＲで作製した、ＨｐｈＩで分解したＤＮＡセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を生成する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。あるいは、更なる部分、例えばＵＤＧを用いて切断されるウラシルヌクレオチドを含有する更なる部分に含まれる切断可能な結合に、ニックを導入する。図５８、ステップＥに示すように、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物をエキソヌクレアーゼで分解することで、更なる識別ヌクレオチド配列、例えば固有の識別子配列に結合した、ＰＣＲで生成したＨｐｈＩで分解したＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみが残る。最終生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定に好適である。
図５９の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブはまた、更なるヌクレオチド部分により分離された、分解された標的ＰＣＲセグメントの５’及び３’側に相補的な配列も含有する。更に、オリゴヌクレオチドプローブはまた、３’末端にブロック基（３’−Ｂｌｋ）、１つ以上の切断可能な結合（切断可能な結合は「ｒ」として示される）、及び任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する。（図５９、ステップＢ）３’伸長末端と標的ＰＣＲセグメントの５’末端とのライゲーションにより環化ライゲーション生成物を形成した後（図５９、ステップＣ）、オリゴヌクレオチドプローブ上の３’ブロック基が取り除かれ（例えば、リボヌクレオチド結合のＲＮａｓｅＨ切断）（図５９、ステップＤ）、環化ＤＮＡライゲーション生成物を鋳型として用いて、５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図５９、ステップＥ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図５８、ステップＥ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。任意の５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されてよい。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図６０及び６１は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での非メチル化隣接「ＨｐｈＩ」の検出に好適な、キメラ環状一本鎖核酸構築物の作製プロセスを示す。図６０、ステップＡ及び６１、ステップＡに示すように、短いリンカーがｃｆＤＮＡ断片または剪断したゲノムＤＮＡに（例えばライゲーションにより）付加される。リンカーが付加されたＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、非メチル化ＣをＵに転換する。制限ＰＣＲを行い、得られるＰＣＲ産物をＨｐｈＩ（非メチル化ＧＧＣＧＡのみがＧＧＴＧＡとなる）により切断し、ライゲーション能のある末端を生成する（図６０、ステップＡ及び６１、ステップＡ）。図６０、ステップＢ及び６１、ステップＢで示すように、二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、切断した標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。図６０に示す実施形態において、二本鎖プローブは、標的ＰＣＲセグメントの５’及び３’側に相補的なヌクレオチド配列を含有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖を含む。第１のオリゴヌクレオチドプローブのこれらの標的特異的部分は、固有の識別子部分、及び／または患者識別子部分、及び／または１つ以上のプライマー結合配列を含む更なる部分により分離される（図６０、ステップＢ）。二本鎖オリゴヌクレオチドプローブの第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ループを有する太い黒線）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に相補的な配列を含有する（図６０、ステップＢ）。第２のオリゴヌクレオチドプローブのループ領域は、非相補領域を示す。図６０、ステップＣに示すように、二本鎖プローブの、ＨｐｈＩで分解したＰＣＲ産物へのハイブリダイゼーションにより、２つのライゲーション能のある接合部、即ち、ＤＮＡセグメントの３’末端と第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端との間、及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端とＤＮＡセグメントの５’との間が作製される。リガーゼ（塗りつぶした円）は、ライゲーション接合部を共有結合で閉じ、ＨｐｈＩで分解したセグメントを含有する環状ライゲーション生成物を作製する（図６０、ステップＣ）。図６０、ステップＤに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、本明細書記載の方法のいずれかを用いた環状配列決定に好適な所望の一本鎖環状ライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。
図６１に示す実施形態において、二本鎖プローブの第１のオリゴヌクレオチドプローブは、更なるヌクレオチド部分により分離される標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’側に相補的な配列を含有する。更に、第１のオリゴヌクレオチドプローブはまた、任意の５’捕捉基（「Ｚ」）も有する（図６１、ステップＢ）。ＨｐｈＩで分解したＰＣＲセグメントと第２のオリゴヌクレオチドプローブとの間の２つのライゲーション接合部にてライゲーションをし、環化ライゲーション生成物を形成した後（図６１、ステップＣ）、環化ライゲーション生成物を鋳型として用いて、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が第１のオリゴヌクレオチドプローブを伸長する（図６１、ステップＤ）。ローリングサークル増幅により、環化ライゲーション生成物に相補的なタンデム線状配列を含有する一次伸長生成物が生成される（図６１、ステップＤ）。この一次伸長生成物は、本明細書記載の方法を用いた配列決定に適している。５’Ｚ基は、ローリングサークル増幅の前または後に、固体支持体上で捕捉されることができる。捕捉されると、プライマーが結合した環状ライゲーション生成物またはその伸長物は、ローリングサークル増幅の前または後のいずれかで、切断可能な結合での切断により、固体支持体から遊離されることができる。
図６２は、ｃｆＤＮＡまたは剪断された全ゲノムＤＮＡの既知のゲノム領域内での、非メチル化隣接ＨｐｈＩ部位の発見プロセスを示す。全細胞から単離されたか、または血漿内にｃｆＤＮＡとして存在するゲノムＤＮＡは、天然酵素プロセスまたは剪断により、末端を含有する。これらは、短いリンカーをＤＮＡ末端の３’及び５’末端に付加する（例えば、ライゲーションによりリンカーを付加する）ことにより後続のステップをブロックする必要がある。図６２、ステップＡに示すように、５’末端リンカーはブロック基（太い黒線）を含有する。リンカーが付加されたＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、非メチル化ＣをＵに転換する。図６２、ステップＢに示すように、５’ブロックプライマーによる制限ＰＣＲ増幅により、非メチル化二本鎖生成物を生成する。元の標的内で非メチル化されていた隣接ＨｐｈＩ部位（非メチル化ＧＧＣＧＡ→ＧＧＴＧＡ）のみが、ＨｐｈＩ（塗りつぶした三角形）により切断される場合に非ブロック断片を生成する。図６２、ステップＣに示すように、固有の識別子配列及び／または患者識別子配列を含有するリンカー（灰色で塗りつぶした二重線）が、ＨｐｈＩで切断したＤＮＡ断片に付加される。リンカーは、３’末端ブロック基またはチオホスフェート含有骨格（＊＊＊＊）のいずれかを含有し、３’エキソヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）による後続の分解を阻害する。両側にリンカーが付加された断片のみが二本鎖として残る。図６２、ステップＤに示すように、リンカーの自由端に、（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）３’ブロック基の除去、（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断による、ライゲーション能のある５’ホスフェートの生成、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の任意の組み合わせのいずれかにより、ライゲーション能を付与する。オリゴマー化に有利となるように、ライゲーション（塗りつぶした円）条件を設計する。図６２、ステップＥに示すように、ライゲーション生成物は、任意の固有の識別子及び／または患者識別子配列を有する、ゲノムＤＮＡ内で元々非メチル化されていた隣接ＨｐｈＩ配列内に、亜硫酸水素塩により転換されたＤＮＡの相補体を含む。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
集団の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物を生成するための別の好適なアプローチは、１つ以上の塩基の違いまたは１つ以上のメチル化残基を含む可能性のある１つ以上の標的ゲノムＤＮＡセグメントを含有する試料を提供する工程、並びに、ヌクレオチドリンカー配列を標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端に付加することを伴う。付加されたヌクレオチドリンカーは任意で、（ｉ）患者識別子配列、（ｉｉ）第１の固体支持体プライマー特異的部分、（ｉｉｉ）第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び／または（ｉｖ）固有の識別子配列を含む。各第１のオリゴヌクレオチドプローブが（ａ）リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’リンカー部分に相補的な部分、（ｂ）リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの５’リンカー部分に相補的な部分、及び（ｃ）任意で更なる部分を含む、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブが提供される。更なる部分は、任意で、（ｉ）患者識別子配列、（ｉｉ）第１の固体支持体プライマー特異的部分、（ｉｉｉ）第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び／または（ｉｖ）固有の識別子配列を含む。試料中に存在する場合、リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補リンカーに第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’部分が塩基特異的な様式でハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料と１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる。第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端の結合に好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部が生成される。１つ以上のライゲーション接合部における、リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントのライゲーションにより、集団の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物が形成される。
図６３は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製に関連する例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、短いリンカーをＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上にライゲーションすることから開始する（太い黒い棒線、図６３、ステップＡ）。図６３の右パネルに示すプロセスの付加されたリンカーは、ライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有するが、図６３の左パネルに示すプロセスの付加されたリンカーは、ライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有しない。標的ＤＮＡセグメントの５’及び３’リンカーに相補的なヌクレオチド配列、並びに５’ブロック基を含有するオリゴヌクレオチドプローブ（太い黒線）を、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図６３、ステップＡ）。オリゴヌクレオチドプローブのリンカー特異的部分は、更なる部分により分離される。この更なる部分は、任意の固有の識別子部分、及び／または患者識別子部分、及び／または１つ以上のプライマー結合配列を含む。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’リンカー末端を伸長して、標的ＤＮＡセグメントの５’リンカー末端とのライゲーション接合部を形成する（図６３、ステップＢ）。図６３、ステップＣに示す実施形態において、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、伸長によりライゲーション能のある５’ホスフェートを生成した後、５’リンカー上で、マッチする５’重複塩基を切断する。図６３、ステップＣ（右パネル）に示す実施形態において、標的ＤＮＡセグメントの５’リンカーはライゲーション能のある５’末端を含有するため、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを利用することができる。ポリメラーゼはまた、ハイブリダイズした環化標的ＤＮＡセグメントを鋳型として用いて、セグメントがプローブの５’ブロック基に到達するまで、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端も伸長する。図６３、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）はＤＮＡセグメントの伸長３’末端及び５’末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブ上の５’ブロック基は、ポリメラーゼにより伸長したオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。図６３、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、所望の一本鎖環化ＤＮＡライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。これらの環化ライゲーション生成物は、固有もしくは反復配列（例えばテトラヌクレオチド反復）による任意の捕捉、または固有の標的指向プライマーによるローリングサークル伸長と後続の配列決定に適している。
図６４は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、別の例示的プロセスを示す。本実施形態において、標的ゲノムＤＮＡセグメントは、ライゲーションまたは伸長に好適な５’及び３’末端を有する二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントである（図６４、ステップＢ）。標的ゲノムＤＮＡセグメントにヌクレオチドリンカー配列を付加する。本実施形態に従うと、ヌクレオチドリンカーは第１及び第２のリンカーオリゴヌクレオチドを含み、（ｉ）第１のリンカーオリゴヌクレオチドは、５’一本鎖部分、１つ以上の切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、固有の識別子配列、第２のリンカーオリゴヌクレオチドに相補的な３’末端、及び３’ＯＨを含み、並びに、（ｉｉ）第２のリンカーオリゴヌクレオチドは、５’ＯＨ末端、第１のリンカーオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分、及び任意の３’ブロック末端を含む。第２のリンカーオリゴヌクレオチドは、第１のリンカーオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズし、標的ゲノムＤＮＡセグメントの付加に好適な複合リンカーを形成する。
図６４、ステップＣ〜Ｄに示すように、（ｉ）複合リンカーの第１のリンカーオリゴヌクレオチドの３’ＯＨの、二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの５’末端へのライゲーションに好適な、（ｉｉ）複合リンカーの第１のリンカーオリゴヌクレオチドの相補コピーを作製するための二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’末端のポリメラーゼ伸長に好適な、及び（ｉｉｉ）リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントを形成するための１つ以上の切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の切断に好適な条件下にて、二本鎖標的ゲノムＤＮＡを、複合リンカー、リガーゼ、及びポリメラーゼとブレンドする。標的ＤＮＡセグメントのリンカーの５’及び３’一本鎖部分に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ（太い黒二重線）を、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする（図６４、ステップＦ）。オリゴヌクレオチドプローブは、患者識別子配列、プライマー結合部位、及び３’末端上のミスマッチ尾部を含有する。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’リンカー末端を伸長して、標的ＤＮＡセグメントの５’リンカー末端とライゲーション接合部を形成する（図６４、ステップＧ）。図６４、ステップＨに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）はリンカーが付加されたＤＮＡセグメントの３’及び５’末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。これらの環化ライゲーション生成物は、固有もしくは反復配列（例えばテトラヌクレオチド反復）による任意の捕捉、または固有の標的指向プライマーによるローリングサークル伸長と後続の配列決定に適している。
図６５は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製に関連する例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、一本鎖（細い黒二重線）と二本鎖部分（太い黒線）の両方を含む複合リンカーの、ＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上へのライゲーションにより開始する（図６５、ステップＡ）。図６５、ステップＢ（右パネル）に示すプロセスの付加されたリンカーは、ライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有するが、図６５、ステップＢ（左パネル）に示すプロセスの付加されたリンカーは、ライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有しない。標的ＤＮＡセグメントのリンカーの５’及び３’一本鎖部分に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ（太い黒二重線）を、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はハイブリダイズした標的ＤＮＡセグメントの３’リンカー末端を伸長して、標的ＤＮＡセグメントの５’リンカー末端とライゲーション接合部を形成する（図６５、ステップＣ）。図６５、ステップＣに示す実施形態において、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、伸長によりライゲーション能のある５’ホスフェートを生成した後、５’リンカー上で、マッチする５’重複塩基を切断する。図６５、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）はリンカーが付加されたＤＮＡセグメントの３’及び５’末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。図６５、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、所望の一本鎖環化ＤＮＡライゲーション生成物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。これらの環化ライゲーション生成物は、固有もしくは反復配列（例えばテトラヌクレオチド反復）による任意の捕捉、または固有の標的指向プライマーによるローリングサークル伸長と後続の配列決定に適している。
リンカーを付加するための標準的アプローチは図６６に図示されており、当業者に周知である。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。断片化ＤＮＡの末端は、Ｔ４ポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩ（大型）（クレノウ）断片等の、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて修復され、このポリメラーゼは、５’末端と重なるまで、陥凹３’末端を伸長するか、または３’オーバーハング末端を分解する（図６６、ステップＡ）。５’末端が、Ｔ４キナーゼによりリン酸化され、３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼＩ（大型）（クレノウ）断片を用いて、追加のＡ塩基が３’末端に付加される（図６６、ステップＢ及びＣ）。Ｔ４リガーゼを用いて、リンカー上で３’Ｔオーバーハングをライゲーションする（図６６、ステップＤ）。この図において、リンカーのプライマー部分１及び３を用いて、それぞれ任意の患者及び固有の識別子配列１及び２を決定する。プライマー部分２及び３’を用いて、それぞれフォワード及びリバース標的ＤＮＡを配列決定する。本生成物は、上の図６３及び６５に示す、元の標的トップ鎖及びボトム鎖の環化に適している。
標準的なアプローチは、リンカーの一本鎖部分に固有配列を導入する可能性を提供するが、これらの配列では、トップ鎖配列のボトム鎖配列との明確なマッチングが可能とならない。この種類の構築物を得るために、図６７に示すように、標準的なアプローチを修正する。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。断片化ＤＮＡの末端は、Ｔ４ポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩ（大型）（クレノウ）断片等の、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて修復され、このポリメラーゼは、５’末端と重なるまで、陥凹３’末端を伸長するか、または３’オーバーハング末端を分解する（図６７、ステップＡ）。５’末端がＴ４キナーゼによって任意でリン酸化され（図６７、ステップＢ）、３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩ（大型）（クレノウ）断片を用いて、Ａ塩基オーバーハングが３’末端に付加される。
本実施形態において、リンカー配列は第１、第２、及び第３のオリゴヌクレオチドを含む。第１のオリゴヌクレオチドは、第１の固体支持体プライマー特異的部分、１つ以上の第１の患者識別子配列、第１の配列決定プライマー結合部位、及び、第３のオリゴヌクレオチドに相補的な３’末端を含む。第２のオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドの５’末端に相補的な領域を含み、第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドに相補的な５’末端、第２の配列決定プライマー結合部位、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的な部分、第２の患者識別子配列、及び第２の固体支持体プライマー特異的部分を含む。第３のオリゴヌクレオチドは第１及び第２のオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズし、複合リンカーを形成する。図６７、ステップＤに示すように、複合リンカーの第２及び第３のオリゴヌクレオチドの、二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントのそれぞれ５’及び３’末端へのライゲーションに好適な条件下にて、二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントを複合リンカー、リガーゼ、及びポリメラーゼとブレンドする。ポリメラーゼは複合リンカーの第１のオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長し、５’末端にて、複合リンカーの第２のオリゴヌクレオチドとのライゲーション接合部を作製する（図６７、ステップＥ）。複合リンカーの第２のオリゴヌクレオチド５’末端がリン酸化されていない場合、ポリメラーゼは、ライゲーションに好適な５’ホスフェートを遊離させるために５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する。第２のオリゴヌクレオチドが５’末端上でリン酸化されている場合、ポリメラーゼは５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠き、これによりポリメラーゼがリンカーまで伸長することができ、続いてリガーゼがニックを閉じることができる。図６７、ステップＥに示すように、リガーゼは、前記ライゲーション接合部にて複合リンカーの第１及び第２のオリゴヌクレオチドを共有結合で閉じ、リンカーが付加された二本鎖標的ゲノムＤＮＡを形成する。本実施形態において、リンカーのプライマー部分１及び３はそれぞれ、任意の患者識別子配列１及び２を決定するために用いられる（図６７、ステップＦを参照）。リンカーのプライマー部分２及び３’はそれぞれ、フォワードとリバース標的ＤＮＡ、並びに固有の識別子配列１及び２を配列決定するために用いられる。本生成物は、上の図６３及び６５に示す、元の標的鎖のそれぞれの環化に適している。これらの鎖の配列の決定時に、固有の識別子配列１及び２は、トップ鎖配列の、ボトム鎖配列との明確なマッチングが可能となり、これにより、元の標的分子の両方の鎖における、低量の変異の独立した検証を行うことができる。
図６８は、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製の好適であり、トップ鎖配列のボトム鎖配列との明確なマッチングが可能となるような、プライマー配列を標的ＤＮＡの末端に付加する別のアプローチを例示する。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。断片化したＤＮＡは、５’末端と重なるまで陥凹３’末端を伸長するか、または３’オーバーハング末端を分解する、Ｔ４ポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩ（大型）（クレノウ）断片等の、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて修復される（図６８、ステップＡ）。５’末端は任意で、Ｔ４キナーゼでリン酸化される（図６８、ステップＢ）。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩもしくはＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の逆転写酵素は、３つのＣ塩基を各標的の３’末端に付加する（図６８、ステップＣ）。
本実施形態において、リンカー配列は、（ｉ）第１の固体支持体プライマー特異的部分、１つ以上の第１の患者識別子配列、第１のプライマー結合部位、及び３’末端上のリボグアノシン塩基を含む第１のリンカーオリゴヌクレオチド、並びに（ｉｉ）第２の配列決定プライマー結合部位、第２の患者識別子配列、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び第１のオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分を含む第２のリンカーオリゴヌクレオチドを含む。二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントをリンカー配列、逆転写酵素、及びリガーゼとブレンドし、逆転写−ライゲーション反応混合物を形成する。第１のリンカーオリゴヌクレオチドのリボグアノシン塩基は、二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’シトシンオーバーハングにハイブリダイズする（図６８、ステップＤ）。逆転写酵素は鎖のスイッチングを受け、二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントのハイブリダイズされた３’末端が伸長され、第１のリンカーオリゴヌクレオチドの第１の患者識別子配列に相補的な配列、及び第２のリンカーオリゴヌクレオチドの５’末端とのライゲーション接合部を生成する（図６８、ステップＤ）。二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの伸長３’末端は、ライゲーション接合部にて第２のオリゴヌクレオチドの５’末端にライゲーションされる。ＲＮａｓｅＨ２は第１のリンカーオリゴヌクレオチドのリボグアノシン塩基を切断し、ポリメラーゼが仲立ちする伸長に好適な３’ＯＨを遊離させる（図６８、ステップＥ）。第１のリンカーオリゴヌクレオチドの３’末端が伸長され、二本鎖標的ゲノムＤＮＡの５’末端にライゲーションされる（図６８、ステップＦ）。第２のリンカーまたは標的ＤＮＡが５’末端上でリン酸化されていない場合、ポリメラーゼはライゲーションに好適な５’ホスフェートを遊離させるために５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する。第２のリンカー及び標的がリン酸化されている場合、図６８に示すように、ポリメラーゼは５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠き、これにより第２のプライマーまたは標的の５’末端まで伸長可能であり、その後ニックがリガーゼにより閉じられる。図６８、ステップＧに示すように、リンカーのプライマー部分１及び３は、それぞれ任意の患者識別子配列１及び２を測定するために用いられる。リンカーのプライマー部分２及び３’はそれぞれ、フォワードとリバース標的ＤＮＡ、並びに固有の識別子配列１及び２を配列決定するために用いられる。上の図６３及び６５で示すように、本生成物は元の標的鎖のそれぞれの環化に適している。これらの鎖の配列の決定時に、固有の識別子配列１及び２は、トップ鎖配列の、ボトム鎖配列との明確なマッチングが可能となり、これにより、元の標的分子の両方の鎖における、低量の変異の独立した検証を行うことができる。
図６９は、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物の作製に好適であるような、プライマー配列を標的ＤＮＡの末端に付加する別のアプローチを例示する。本実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。断片は変性され、標的は一本鎖となる（図６９、ステップＡ）。平均５０〜１００塩基が付加され、最初の３０塩基に少なくとも１つのｒＡＴＰの組み込みが存在するように、ｄＡＴＰとＡＴＰの混合物を用いて、３’末端に末端トランスフェラーゼが付加される（図６９、ステップＢ）。本実施形態に従うと、１つ以上のオリゴヌクレオチドセットが提供され、各セットは、ｉ）第２の固体支持体プライマー特異的部分と、１つ以上の患者識別子配列と、配列決定プライマー結合部位と、標的ゲノムＤＮＡセグメントの伸長領域に相補的であり１つ以上の切断可能なヌクレオチドを含むモノヌクレオチド反復領域とを含む、プライマーオリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）第１の固体支持体プライマー特異的部分と、１つ以上の患者識別子配列と、配列決定プライマー結合部位とを含む、第１のリンカーオリゴヌクレオチドを含む。第１のリンカーオリゴヌクレオチドは、３’上に２つのリボグアノシン塩基及びロックド核酸であるグアノシン塩基（ｒＧｒＧ＋Ｇ）を有する。図６９、ステップＢに示すように、本プロセスは、任意の患者及び固有識別子（２）を有する５’プライマー結合部位（３及び４）、３’末端での（Ｔ，ｄＵ）３０ＶＮ配列、及び切断可能な結合（ｄＵ）を含有するプライマーオリゴヌクレオチドの、標的ゲノムＤＮＡの末端トランスフェラーゼ伸長領域へのハイブリダイゼーションを伴う（図６９、ステップＢ）。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩもしくはＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の逆転写酵素はプライマーを伸長して標的の完全長コピーを作製し、３つのＣ塩基を伸長標的配列の３’末端に付加させる（図６８、ステップＣ）。図６８、ステップＣに示すように、３’ｒＧｒＧ＋Ｇを有する第１のリンカーオリゴヌクレオチドは、伸長標的配列の３つのＣ塩基にハイブリダイズする。逆転写酵素は鎖のスイッチングを受け、第１のリンカーオリゴヌクレオチドをコピーする（図６９、ステップＤ）。ＲＮａｓｅＨ２はＲＮＡ塩基を切断し、Ａ尾部内、及び第１のリンカーオリゴヌクレオチドのｒＧｒＧ＋Ｇに隣接するＤＮＡの３’ＯＨを遊離させる（図６９、ステップＤ）。５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼはプライマーオリゴヌクレオチド領域を複製し、第１のリンカーオリゴヌクレオチドを伸長して標的ＤＮＡ上の５’ホスフェートを遊離させる（図６９、ステップＦ）。リガーゼが第１のリンカーオリゴヌクレオチドのニックを閉じ、第１のリンカーを元の標的鎖にライゲーションする（図６９、ステップＧ）。続いて、標的のコピーが第１のプライマー結合領域を欠くために更なる増幅を受けないように、プライマーオリゴヌクレオチドの切断可能な結合にニックを導入する（例えばｄＵのＵＤＧ切断）。この図において、プライマー部分１及び３は、それぞれ任意の患者及び固有の識別子配列１及び２を決定するために用いられる（図６９、ステップＨ）。プライマー部分２及び３’を用いて、それぞれフォワード及びリバース標的ＤＮＡを配列決定する。初期サイクルにプライマー３’を用いる場合、Ｔ３０領域の配列決定に機器が時間を浪費しないように、ターミネーターを含まないＴＴＰを用いる。本生成物は、上の図６３及び６５に示す、元の標的トップ及びボトム鎖の環化に適している。
図７０は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、別の例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、短いリンカーをＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上にライゲーションすることから開始する（太い黒い棒線、図７０、ステップＡ）。付加されたリンカーの５’末端は、任意でライゲーション能のあるホスフェートを含有する。標的ＤＮＡセグメントの固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）、並びにリンカーの５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、図７０、ステップＢに示すように、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、１つ以上の固有の識別子配列、患者識別子配列、ライゲーション能のある５’ホスフェート、及び切断可能な結合（ｄＵ）を含有する更なる部分も含有する。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的ＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端及びオリゴヌクレオチドプローブを伸長し（図７０、ステップＣ）、それぞれ、標的ＤＮＡセグメントの対応する５’末端及びプローブとライゲーション接合部を作製する。標的セグメントまたはプローブ上にライゲーション能のある５’ホスフェートが存在しない場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する。図７０、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）はオリゴヌクレオチドプローブと標的セグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、結合した環状ライゲーション生成物を作製する。続いて、ニックをオリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入する（例えばｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）。図７０、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図７１は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、別の例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば腫瘍特異的な変異、ＳＮＰ、または固有配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、短いリンカーをＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上にライゲーションすることから開始する（太い黒／白い棒線、図７１、ステップＡ）。付加されたリンカーの５’末端は、任意でライゲーション能のあるホスフェートを含有する。標的ＤＮＡセグメントの固有配列、並びにリンカーの５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、図７１、ステップＢに示すように、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、１つ以上の固有の識別子配列、患者識別子配列、任意のライゲーション能のある５’ホスフェート、及び任意の切断可能な結合（ｄＵ）を含有する更なる部分も含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は更に、標的、例えばリボヌクレオチド塩基にブロック基として、及びＲＮａｓｅ Ｈ２（星印）に切断ヌクレアーゼとしてハイブリダイズした時にのみ、ヌクレアーゼによる切断により遊離され、遊離３’ＯＨを形成するいくつかの過剰の塩基及びブロック基を含む（図７１、ステップＣ）。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的ＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端及びオリゴヌクレオチドプローブを伸長し（図７１、ステップＣ）、それぞれ、標的ＤＮＡセグメントの対応する５’末端及びプローブとライゲーション接合部を作製する。標的セグメントまたはプローブ上にライゲーション能のある５’ホスフェートが存在しない場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する。図７１、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）オリゴヌクレオチドプローブと標的セグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、結合した環状ライゲーション生成物を作製する。続いて、ニックをオリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入する（例えばｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）。図７１、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、任意の患者または固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図７２は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、別の例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば腫瘍特異的な変異、ＳＮＰ、または固有配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、短いリンカーをＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上にライゲーションすることから開始する（太い黒／白い棒線、図７２、ステップＡ）。付加されたリンカーの５’末端は、任意でライゲーション能のあるホスフェートを含有する。標的ＤＮＡセグメントの固有配列、並びにリンカーの５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、図７１、ステップＢに示すように、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、１つ以上の固有の識別子配列、患者識別子配列、ライゲーション能のある５’ホスフェート、及び任意の切断可能な結合（ｄＵ）を含有する更なる部分も含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は更に、標的、例えばリボヌクレオチド塩基にブロック基として、及びＲＮａｓｅ Ｈ２（星印）に切断ヌクレアーゼとしてハイブリダイズした時にのみ、ヌクレアーゼによる切断により遊離され、遊離３’ＯＨを形成するいくつかの過剰の塩基及びブロック基を含む。ここで、オリゴヌクレオチドプローブが標的にハイブリダイズした場合、遊離３’ＯＨは５’リン酸化末端への直接ライゲーションに適している（図７２、ステップＣ）。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的ＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端を伸長し（図７２、ステップＣ）、標的ＤＮＡセグメントの対応する５’末端とライゲーション接合部を作製する。標的セグメントのリンカー上にライゲーション能のある５’ホスフェートが存在しない場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する。図７２、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は標的セグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、結合した環状ライゲーション生成物を作製する。続いて、ニックをオリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入する（例えばｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）。図７２、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、任意の患者または固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図７３は、上述したローリングサークル増幅のプライミング及び配列決定に好適な、ハイブリダイズした標的特異的オリゴヌクレオチドを有するキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製する例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば腫瘍特異的な変異、ＳＮＰ、または固有配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、一本鎖（細い黒二重線）と二本鎖部分（太い黒い棒線）の両方を含む複合リンカーの、ＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上へのライゲーションにより開始する（図７３、ステップＡ）。図７３（左パネル）に示すプロセスの付加されたリンカーは、ライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有するが、図７３（右パネル）に示すプロセスの付加されたリンカーは、ライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有しない。標的ＤＮＡセグメントの固有配列（太い黒線）、並びに標的ＤＮＡセグメントに付加されたリンカーの５’及び３’一本鎖部分（細い黒の二重線）に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、図７３、ステップＢに示すように、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、任意の固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、５’末端での任意のホスフェート、及び１つ以上の切断可能な結合（ｄＵ）も含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は更に、標的、例えばリボヌクレオチド塩基にブロック基として、及びＲＮａｓｅ Ｈ２（星印）に切断ヌクレアーゼとしてハイブリダイズした時にのみ、ヌクレアーゼによる切断により遊離され、遊離３’ＯＨを形成するいくつかの過剰の塩基及びブロック基を含む。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的ＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端及びオリゴヌクレオチドプローブを伸長し（図７３、ステップＣ）、それぞれ、標的ＤＮＡセグメントの対応する５’末端及びプローブとライゲーション接合部を作製する。標的セグメントまたはプローブ上にライゲーション能のある５’ホスフェートが存在しない場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する。図７３、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）はオリゴヌクレオチドプローブと標的セグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、結合した環状ライゲーション生成物を作製する。続いて、オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に１つ以上のニックを導入する（例えばｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）。図７３、ステップＥに示すように、標的特異的なハイブリダイズしたプライマーと共に元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、切断されたオリゴヌクレオチド断片は標的ＤＮＡからなくなる。最終生成物はローリングサークル増幅、任意の追加のステップ、及び後続の配列決定に適している。
図７４は、上述したローリングサークル増幅のプライミング及び配列決定に好適な、ハイブリダイズした標的特異的オリゴヌクレオチドを有するキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための別の例示的プロセスを示す。本実施形態のステップは、図７３、ステップＡ〜Ｅに示す実施形態と類似している。しかし、本実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはまた、固体支持体上（即ち、ストレプトアビジンでコーティングした固体支持体）での生成物の捕捉に好適な捕捉基（Ｚ）（即ち、ビオチン）も含む。図７４、ステップＥに示すように、後続の捕捉ステップのための捕捉基（Ｚ）もまた含有する、標的特異的ハイブリダイズしたプライマーと共に元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、切断されたオリゴヌクレオチド断片は標的ＤＮＡからなくなる。最終生成物はローリングサークル増幅、任意の追加のステップ、及び後続の配列決定に適している。
図７５は、上述したローリングサークル増幅のプライミング及び配列決定に好適な、ハイブリダイズした標的特異的オリゴヌクレオチドを有するキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための別の例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば腫瘍特異的な変異、ＳＮＰ、または固有配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、一本鎖（細い黒二重線）と二本鎖部分（太い黒い棒線）の両方を含む複合リンカーの、ＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上へのライゲーションにより開始する（図７５、ステップＡ）。図７５（左）に示すプロセスの付加されたリンカーはライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有するが、図７５（右）に示すプロセスの付加されたリンカーはライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有しない。標的ＤＮＡセグメントの固有配列（太い黒線）、並びに標的ＤＮＡセグメントの付加されたリンカーの５’及び３’一本鎖部分（細い黒の二重線）に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、図７５、ステップＢに示すように、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、任意で固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、５’末端のホスフェート、及び１つ以上の切断可能な結合（ｄＵ）も含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は更に、標的、例えばリボヌクレオチド塩基にブロック基として、及びＲＮａｓｅ Ｈ２（星印）に切断ヌクレアーゼとしてハイブリダイズした時にのみ、ヌクレアーゼによる切断により遊離され、遊離３’ＯＨを形成するいくつかの過剰の塩基及びブロック基を含む。オリゴヌクレオチドプローブの末端は、ＲＮａｓｅＨ２による切断の後で互いに隣接するため、これらはリガーゼによる閉鎖（図７５、ステップＣ）に適している。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は標的ＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端を伸長し（図７５、ステップＣ、右）、標的ＤＮＡセグメントの対応する５’末端とライゲーション接合部を作製する。標的セグメント上にライゲーション能のある５’ホスフェートが存在しない場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する。図７５、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は標的セグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、結合した環状ライゲーション生成物を作製する。続いて、オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に１つ以上のニックを導入する（例えばｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）。図７５、ステップＥに示すように、標的特異的ハイブリダイズしたプライマーと共に元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、切断されたオリゴヌクレオチド断片は標的ＤＮＡからなくなる。最終生成物はローリングサークル増幅、任意の追加のステップ、及び後続の配列決定に適している。
図７６は、上述のローリングサークル増幅及び配列決定に好適な、ハイブリダイズした標的特異的オリゴヌクレオチドを有するキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための別の例示的プロセスである。本実施形態のステップは、図７５、ステップＡ〜Ｅに示すステップに類似している。しかし、本実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはまた、固体支持体上（即ち、ストレプトアビジンでコーティングした固体支持体）での生成物の捕捉に好適な捕捉基（Ｚ）（即ち、ビオチン）も含む。図７６、ステップＥに示すように、後続の捕捉ステップのための捕捉基（Ｚ）もまた含有する標的特異的なハイブリダイズしたプライマーと共に、元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、切断されたオリゴヌクレオチド断片は標的ＤＮＡからなくなる。最終生成物はローリングサークル増幅、任意の追加のステップ、及び後続の配列決定に適している。
図７７は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための別の例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、短いリンカーをＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上にライゲーションすることから開始する（太い黒い棒線、図７７、ステップＡ）。付加されたリンカーの５’末端は任意で、ライゲーション能のあるホスフェートを含有する（図７７、ステップＢ、左パネル）。標的ＤＮＡセグメントの固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）、並びに付加されたリンカーの５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、図７７、ステップＢに示すように、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、１つ以上の固有の識別子配列、患者識別子配列、ライゲーション能のある５’ホスフェート、及び切断可能な結合（ｄＵ）を含有する更なる部分も含有する。図７７、ステップＣは、標的ＤＮＡセグメントのハイブリダイズした３’末端とオリゴヌクレオチドプローブの、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）が仲立ちする伸長のための、３つのｄＮＴＰ（即ちｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ）の使用を示す。標的ＤＮＡセグメントの３’末端の伸長により、標的ＤＮＡセグメントの対応する５’末端とのライゲーション接合部が作製される。標的ＤＮＡセグメントにライゲーション能のある５’ホスフェートが存在しない場合（図７７、ステップＣ）、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する。図７７、ステップＤにおいて、リガーゼ（塗りつぶした円）は標的ＤＮＡセグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列に結合した元の標的ＤＮＡセグメントを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
図７８は、上述の配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、別の例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、元のゲノムセグメントは、例えば、腫瘍特異的変異、ＳＮＰ、または多型反復配列を含有する、ｃｆＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメント、または剪断されたゲノムＤＮＡ（約１６０ｂｐ）のセグメントを含む。本プロセスは、短いリンカーをＤＮＡセグメントの３’及び５’末端上にライゲーションすることから開始する（太い黒い棒線、図７８、ステップＡ）。本プロセスの付加されたリンカーは、固有の識別子配列、並びに任意で、患者識別子配列及びライゲーション能のある５’ホスフェート基を含有する。図７８、ステップＢに示すように、標的ＤＮＡセグメントの固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）、並びに付加されたリンカーの５’及び３’側に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれの標的ＤＮＡセグメントにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブはまた、任意の切断可能な結合（ｄＵ）、及びライゲーション能のある５’ホスフェート基も含有する。リンカーが付加された標的ＤＮＡセグメントの５’末端、及び／またはオリゴヌクレオチドプローブの５’末端が、ライゲーション能のある５’末端を含有しない（図７８、左パネル）が、フラップもしくは重複塩基を含有する場合（図７８、ステップＢ、右パネル）、５’ヌクレアーゼ活性（塗りつぶした菱形）は、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、マッチする５’重複塩基またはフラップを切断する（図７８、ステップＣ）。図７８、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）がオリゴヌクレオチドプローブと標的ＤＮＡセグメントの隣接末端を共有結合で閉じ、結合した環状ライゲーション生成物を作製する。続いて、オリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合にニックが導入され（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、塗りつぶした三角形）、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列に結合した元のゲノム標的ＤＮＡを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。最終生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、図６３、６５、及び７０〜７８に例示する手順、並びに、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するためのプロセスにおける、標的ＤＮＡにリンカーを付加させるための、図６６、６７、６８、及び６９に例示する手順は全て共通して、元の標的ＤＮＡを一本鎖環内に捕捉している。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブはいくつかの標的選択性（図７０〜７８）を提供し、かつ場合によっては、生成物は、ローリングサークル増幅または直接の捕捉、及び後続の配列決定に好適な、標的特異的なハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖環内に元の標的ＤＮＡを、共に含む（図７３〜７６）。最終生成物が、ハイブリダイズしたプライマーを有しないキメラ環状一本鎖核酸標的であるこれらのアプローチに関して、図７９〜８１は、非常に高い特異性にて、標的特異的プライマーをハイブリダイズし、続いて捕捉を行い、非標的核酸を洗い流し、後続のローリングサークル増幅を行うための３つの異なるアプローチを例示する。
図７９は、上述の配列決定に好適な、所望の標的特異的キメラ環状一本鎖核酸標的構築物を濃縮するための例示的プロセスを示す。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、標的にハイブリダイズした場合、かつその場合に限り、切断可能なリボヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ２による切断により遊離したブロック３’基（Ｄｏｂｏｓｙ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮａｓｅ Ｈ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｅｄ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ，”ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：８０（２０１１）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）及び、任意の５’捕捉基（例えばビオチン部分）を含有するように設計される（図７９、ステップＢを参照のこと）。所望の標的を含む環状ＤＮＡは、プライマーの捕捉基による、固体支持体上でのハイブリダイズしたプライマー／環状構築物の捕捉、例えばビオチン部分のストレプトアビジン捕捉により濃縮される。標的を含有しないサークルを洗浄により取り除く。ニックを切断可能な結合に導入し（例えば、リボヌクレオチドｒのＲＮａｓｅ切断）、固体支持体から標的含有環を遊離させ、プライマー上に３’ＯＨ基を生成する。鎖置換活性を有するポリメラーゼにより、ローリングサークル増幅のために、プライマーの遊離３’末端を伸長する（図８０、ステップＢを参照）。この伸長生成物は、後続の配列決定に好適である。
図８０は、上述の配列決定に好適な所望の標的特異的キメラ環状一本鎖核酸標的構築物を濃縮するための、別の例示的なプロセスを示す。本実施形態において、標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、１５〜２０塩基の５’アンカー配列、ミスマッチした３〜５塩基、標的に相補的なマッチした６〜１０塩基を含有するように設計されている（Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｕａｌ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ Ｇｅｎｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（６）：ｅ４０（２００７）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。図７９のように、オリゴヌクレオチドプライマーはまた、標的にハイブリダイズした場合、かつその場合に限り、切断可能なリボヌクレオチド結合にてＲＮａｓｅＨ２による切断により遊離されるブロック３’基、及び任意の５’捕捉基（即ち、ビオチン部分）も含有する（図８０、ステップＢを参照）。所望の標的を含む環状ＤＮＡは、固体支持体上で捕捉基を介しての、ハイブリダイズしたプライマー／環状作成物の捕捉、例えば、ビオチン部分のストレプトアビジン捕捉により濃縮される。標的を含有しないサークルを洗浄により取り除く。ニックを切断可能な結合に導入し（例えば、リボヌクレオチドｒのＲＮａｓｅ切断）、固体支持体から標的含有環を遊離させ、プライマー上に３’ＯＨ基を生成する（図８０、ステップＣ）。鎖置換活性を有するポリメラーゼは、ローリングサークル増幅のためにプライマーの遊離３’末端を伸長する（図８０、ステップＤ）。この伸長生成物は、後続の配列決定に好適である。
図８１は、上述の配列決定に好適な所望の標的特異的キメラ環状一本鎖核酸標的構築物を濃縮するための、別の例示的なプロセスを示す。本実施形態において、２つの隣接オリゴヌクレオチドを、環状構築物の標的特異的部分にハイブリダイズする。上流オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の５’捕捉基（例えばビオチン部分）を含む。下流オリゴヌクレオチドプライマーは、標的にハイブリダイズした場合、かつその場合に限り、切断可能なリボヌクレオチド結合にてＲＮａｓｅＨ２により遊離される、５’ホスフェート及びブロック３’基を含有するように設計される（図８１、ステップＢ）。標的の存在下において、リガーゼは２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合させる（図８１、ステップＢ）。捕捉基による、固体支持体上でのハイブリダイズしたプライマー／環状構築物の捕捉、例えばビオチン部分のストレプトアビジン捕捉により、所望の標的を含む環状ＤＮＡを濃縮することができる。標的を含有しないサークルを洗浄により取り除く。ニックを切断可能な結合に導入し（例えば、リボヌクレオチドｒのＲＮａｓｅ切断）、固体支持体から標的含有環を遊離させ、下流オリゴヌクレオチド上に３’ＯＨ基を生成する（図８１、ステップＣ）。鎖置換活性を有するポリメラーゼは、ローリングサークル増幅のために遊離３’末端を伸長する（図８１、ステップＤ）。この伸長生成物は、後続の配列決定に好適である。
したがって、配列決定に好適なキメラ環状一本鎖核酸標的構築物を作製するための、図５５、５６、６５、７０、及び７１〜７８に例示する手順、並びに図７９〜８１に例示する手順は、ローリングサークル増幅と後続の配列決定に好適な、標的特異的結合部位、またはプライマーがハイブリダイズしたプライマー結合部位を有する、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物を生成するための実施例を提供する。図８２〜８９は、所望の標的を捕捉、または更に濃縮するための異なる方法を例示する。
図８２は、標的濃縮のための例示プロセスを示す。本実施形態において、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物にハイブリダイズした標的特異的プライマーは、鎖置換ポリメラーゼを用いて伸長され、タンデムコピーのキメラ環状一本鎖構築物の２つ以上のタンデムコピーを含む、一本鎖伸長生成物を生成する（図８２、ステップＢ）。伸長生成物に相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする。これらのオリゴヌクレオチドは任意で、ブロックまたはミスマッチ３’末端を含有し、５’末端上に捕捉基Ｚ（例えばビオチン部分）を含有する（図８２、ステップＣ）。標的特異的なタンデムリピート伸長生成物は固体支持体で捕捉され、他の核酸は洗い流される。タンデムリピート伸長生成物は固体支持体上で捕捉オリゴヌクレオチドから変性される（図８２、ステップＣ）。本伸長生成物は配列決定に適している。
図８３は、標的特異的濃縮のための別の例示的プロセスを示す。本実施形態において、標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、キメラ環状一本鎖核酸標的にハイブリダイズされ、５’末端に捕捉基Ｚ（即ち、ビオチン部分）を含有させる。キメラ環状一本鎖核酸標的構築物は固体支持体上で捕捉され、他の核酸は洗い流される（図８３、ステップＡ）。５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて、元のハイブリダイズしたプライマーを伸長し、捕捉基を含有するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの５’部分をポリメラーゼが切断すると、固体支持体から遊離されるニック環を生成する（図８３、ステップＢ）。元のポリメラーゼは、熱またはプロテアーゼのいずれかにより失活される。ニック環の３’末端は鎖置換ポリメラーゼにより伸長され、標的ＤＮＡのタンデムコピーの一本鎖を生成する（図８３、ステップＣ）。本伸長生成物は配列決定に適している。
図８４は、標的特異的濃縮のための別の例示的プロセスを示す。本実施形態において、図８４、ステップＢに示すように、２つの標的特異的オリゴヌクレオチドはキメラ環状一本鎖核酸標的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドを任意で、３’末端にてブロックまたはミスマッチさせ、５’末端に捕捉基Ｚ（即ち、ビオチン部分）を含有させる。キメラ環状一本鎖核酸標的構築物は固体支持体上で捕捉され、他の核酸は洗い流される。図８４、ステップＣに示すように、鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いてハイブリダイズしたプライマーの１つが伸長され、標的ＤＮＡのタンデムコピーの一本鎖が生成され、固体支持体から伸長生成物が遊離される。本伸長生成物は配列決定に適している。
図８５は、標的特異的濃縮のための別の例示的プロセスを示す。本実施形態において、第１の標的特異的オリゴヌクレオチドは、キメラ環状一本鎖核酸標的にハイブリダイズする。このオリゴヌクレオチドは任意で、３’末端でブロックまたはミスマッチされており、５’末端に捕捉基Ｚ（即ち、ビオチン部分）を含有する。キメラ環状一本鎖核酸標的構築物は固体支持体上で捕捉され、他の核酸は洗い流される。第２の標的特異的プライマーを、捕捉した環状構築物にハイブリダイズする（図８５、ステップＢ）。鎖置換活性を有するポリメラーゼを伸長した第２のプライマーに導入し、標的ＤＮＡのタンデムコピーを含有する一本鎖伸長生成物を生成して、固体支持体から伸長生成物が遊離される（図８５、ステップＣ）。本伸長生成物は配列決定に適している。
図８６及び８７は、標的特異的濃縮のための例示的プロセスを示す。これらの実施形態において、プライマー結合部位プライマーはキメラ環状一本鎖核酸標的にハイブリダイズし、鎖置換ポリメラーゼを用いて伸長し、標的ＤＮＡのタンデムコピーを含有する一本鎖伸長生成物を生成する（図８６、ステップＡ〜Ｂ、及び図８７、ステップＡ〜Ｂ）。伸長生成物に相補的な標的特異的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズする。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは任意で３’末端にてブロックされているか、またはミスマッチしており、５’末端に捕捉基Ｚ（即ち、ビオチン部分）を含有する。標的特異的なタンデムリピート伸長生成物は固体支持体で捕捉され、他の核酸は洗い流される（図８６、ステップＣ及び図８７、ステップＣ）。図８６において、タンデムリピート伸長生成物は固体支持体上で捕捉オリゴヌクレオチドから変性される（図８６、ステップＤ）。本伸長生成物は配列決定に適している。図８７において、伸長生成物に相補的な追加の標的特異的プライマーがハイブリダイズされる。鎖置換ポリメラーゼによる伸長は、更なるコピーを作製しながら、固体支持体から元の伸長生成物を遊離させる（図８７、ステップＤ）。元の伸長生成物、及び更なるコピーは配列決定に適している。
図８８は、標的特異的濃縮のための別の例示的プロセスを示す。本実施形態において、第１の標的特異的プライマー及び第２のプライマー結合部位特異的オリゴヌクレオチドは、キメラ環状一本鎖核酸構築物にハイブリダイズする（図８８、ステップＡ〜Ｂを参照）。第２のオリゴヌクレオチドは任意で、３’末端にてブロックされるか、またはミスマッチしており、５’末端に捕捉基Ｚ（即ち、ビオチン部分）を含有する。キメラ環状一本鎖核酸標的構築物は固体支持体上で捕捉され、他の核酸は洗い流される。第１の標的特異的なハイブリダイズしたプライマーが、鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて伸長され、標的ＤＮＡのタンデムコピーを含有する一本鎖伸長生成物を生成し、固体支持体から伸長生成物を遊離させる。本伸長生成物は配列決定に適している。
図８９は、標的特異的濃縮のための別の例示的プロセスを示す。本実施形態において、プライマー結合部位特異的オリゴヌクレオチドが最初に、キメラ環状一本鎖核酸標的構築物にハイブリダイズする。このオリゴヌクレオチドは任意で、３’末端でブロックまたはミスマッチされており、５’末端に捕捉基Ｚ（即ち、ビオチン部分）を含有する。キメラ環状一本鎖核酸標的構築物は固体支持体上で捕捉され、他の核酸は洗い流される（図８９、ステップＡ）。第２の標的特異的プライマーが捕捉された環状構築物にハイブリダイズする。鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、標的ＤＮＡのタンデムコピーを含有する一本鎖伸長生成物を生成し、固体支持体から前記伸長生成物を遊離させる。本伸長生成物は配列決定に適している。
図９０〜９９は、異なるオリゴヌクレオチドプローブ構築物のカバレッジ効果を示す。各図のオリゴヌクレオチドプローブは、５’（上流）標的特異的部分、３’（下流）標的特異的部分、ギャップ長、並びに３’のみ、または５’及び３’アンカー末端が異なっており、１６０ヌクレオチドのｃｆＤＮＡ標的セグメントのカバレッジを達成する。標的ゲノムＤＮＡセグメントは１０塩基刻みで移動し、ヌクレオソーム保護により作製される、全ての可能な１６０ヌクレオチド標的の「ファミリー」を刺激する。
図９０は、ｃｆＤＮＡに由来する、リンカーが付加された（黒い棒線）全ての可能な１６０ヌクレオチド断片の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブ設計を示す。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは図示したｃｆＤＮＡ断片のファミリーの、リンカーが付加された３’末端にアンカリングされ、かつ、６０塩基の５’または上流標的特異的部分（灰色の棒線）、２０塩基の３’または下流標的特異的部分（灰色の棒線）、１０塩基のリンカー特異的部分（黒い棒線）、及び２０塩基の識別子配列（上流及び下流特異的部分の下に示される、５’標的特異的部分とリンカー部分の間の細い線）を含有する。２０塩基を識別子配列として用いるのは、例証の目的のためである。これは、図１に示すように、キメラ環状ＤＮＡを増幅し配列決定する場合、１２塩基の固有の識別子配列と８塩基の患者識別子配列を含有してよい。あるいは、図４〜１２に示すように、患者識別子、固相捕捉に好適な第１及び第２のプライマー特異的部分、並びに配列決定プライマー結合領域を用いる場合、識別子部分は４０〜８０塩基の範囲であることができる。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を図１３に提供する。図９０に示すオリゴヌクレオチドプローブ上の３’標的特異的部分とリンカー部分の間の、種々の長さの非常に細い線は、図１３〜１６に示す標的セグメントの３’末端付近のループ領域の長さに対応する。これは、プローブ領域と、リンカー領域に相補的な領域とが互いに物理的に結合していることを示す。
図９１に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計は、図９０に示すものに類似している。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、図示したｃｆＤＮＡ断片のファミリーの、リンカーが付加された３’末端にアンカリングされ、かつ、８０塩基の５’または上流標的特異的部分、２０塩基の３’または下流標的特異的部分、１０塩基のリンカー特異的部分（太い黒い棒線）、及び２０〜１６０塩基の識別子配列を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解は、図１３〜１６でもまた提供される。
図９２は、ｃｆＤＮＡに由来する、リンカーが付加された（黒い棒線）全ての可能な１６０ヌクレオチド断片の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブの変形を示す。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは図示したｃｆＤＮＡ断片のファミリーの、リンカーが付加された３’末端にアンカリングされ、かつ、６０塩基の５’または上流標的特異的部分（灰色の棒線）、５０塩基の３’または下流標的特異的部分（灰色の棒線）、１０塩基のリンカー特異的部分（黒い棒線）、及び２０〜１６０塩基の識別子配列（５’標的特異的部分とリンカー部分との間の細い線）を含有する。２０塩基を識別子配列として用いるのは、例証の目的のためのみである。図９０を参照した上述の代わりの長さもまた好適である。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を図１３及び１５に提供する。図９２に示すｃｆＤＮＡセグメントの３’リンカーとｃｆＤＮＡの３’末端との間の、種々の長さの非常に細い線は、図１３〜１６に示すオリゴヌクレオチドプローブのループ領域の長さに対応する。これは、プローブ領域と、リンカー領域に相補的な領域とが互いに物理的に結合していることを示す。
図９３に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計は、図９２に示すものに類似している。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは図示したｃｆＤＮＡ断片のファミリーの、リンカーが付加された３’末端にアンカリングされ、かつ、８０塩基の５’または上流標的特異的部分、５０塩基の３’または下流標的特異的部分、１０塩基のリンカー特異的部分（太い黒い棒線）、４０塩基のギャップセグメント、及び２０〜１６０塩基の識別子配列を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を図１３〜１６に提供する。
図９４は、ｃｆＤＮＡに由来する、リンカーが付加された（黒い棒線）全ての可能な１６０ヌクレオチド断片の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブのわずかな変形を示す。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは図示したｃｆＤＮＡ断片のファミリーの、リンカーが付加された３’末端にアンカリングされ、かつ、５０塩基の５’または上流標的特異的部分（灰色の棒線）、５０塩基の３’または下流標的特異的部分（灰色の棒線）、１０塩基の３’リンカー特異的部分（黒い棒線）、１０塩基の５’リンカー特異的部分（黒い棒線）、及び２０〜８０塩基の識別子配列（５’及び３’の標的特異的部分の間の、即ち図示される下の灰色の棒線とリンカー部分の下に示される細い線）を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を図１４に提供する。図９４に示す標的ｃｆＤＮＡセグメントの、種々の長さの非常に細い線は、図１４のオリゴヌクレオチドプローブ内のループ領域に対応し、図９４のオリゴヌクレオチドプローブ内の種々の長さの非常に細い線は、図１７及び１８の標的ＤＮＡセグメントのループ領域に対応する。これは、プローブ領域と、リンカー領域に相補的な領域とが互いに物理的に結合していることを示す。
図９５に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計は、図９４に示すものに類似している。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、図示するｃｆＤＮＡ断片のファミリーの、３’のリンカー付加末端、及び５’のリンカー付加末端にアンカリングされる。プローブは、６０塩基の５’または上流標的特異的部分、６０塩基の３’または下流標的特異的部分、１０塩基の３’リンカー特異的部分、１０塩基の５’リンカー特異的部分、及び２０〜８０塩基の識別子配列を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を図１７及び１８でも提供する。
図９６は、ｃｆＤＮＡに由来する、リンカーが付加されていない全ての可能な１６０ヌクレオチド断片（濃い灰色の棒線）の検出に好適な、オリゴヌクレオチドプローブ設計の別の変形を示す。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、５０塩基の５’または上流標的特異的部分（黒線を有する灰色の棒線）、５０塩基の３’または下流標的特異的部分（黒線を有する灰色の棒線）、及び２０〜８０塩基の識別子配列（５’及び３’標的特異的部分の間の細い線、下に灰色の棒線で示す）を含有する。灰色のプローブ領域内の短い垂直の黒線は、本物の標的ＤＮＡ領域とプローブのコピーが速やかに識別されるように、元の標的に対する単一塩基のミスマッチを表す。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を図２３〜２６に提供する。
図９７に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計は、図９６に示すものに類似している。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、６０塩基の５’または上流標的特異的部分、６０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の識別子配列を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を、図２３、２４、２５及び２６でも提供する。
図９８に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計は、図９６に示すものに類似している。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、７０塩基の５’または上流標的特異的部分、７０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の識別子配列を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解を、図２３、２４、２５及び２６でも提供する。
図９９に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計は、図９６に示すものに類似している。本実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、８０塩基の５’または上流標的特異的部分、８０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の識別子配列を含有する。標的ｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズした、この図のオリゴヌクレオチドプローブの図解は、図２３〜２６でもまた提供される。
図１００〜１０３は、隣接する１６０ｂｐの標的領域にまたがりタイリングされているとおり、３’及び／または５’リンカー領域を有する標的特異的オリゴヌクレオチドプローブによる標的領域のカバレッジを示す。具体的には、図１００は、より大きな連続領域（一例として約５００塩基を示す）を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法を示す。検出される標的領域の配列は、濃い灰色部分で表される。検出されない標的領域の配列はライトグレー部分として示され、リンカーは黒色部分として示される。この図での、それぞれの連続した縦のグルーピングは、無作為に生成したｃｆＤＮＡ断片（または無作為に剪断した断片）に見出される１６０ｂｐの標的領域をスライドすることにより得られるプローブのカバレッジを示す。標的領域は連続して１０塩基刻みでスライドし、一つのプローブによる標的領域のカバレッジを示す。それぞれの連続した縦の、左から右へのグルーピングは、第２、第３、及び第４の異なるプローブによる標的領域のカバレッジ及びプローブの重複を示す。ここ（縦のそれぞれのグルーピングの下）に示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、６０塩基の５’または上流標的特異的プローブ部分、５０塩基の３’または下流プローブ、１０塩基のリンカー部分、及び２０〜１６０ｂｐの識別子領域（細い線）を含有する。
図１０１は、図１００に示すより大きな連続領域を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法の類似の図解を示す。ここで示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、８０塩基の５’または上流標的特異的プローブ部分、５０塩基の３’または下流プローブ、１０塩基のリンカー部分、及び２０〜１６０ｂｐの識別子領域（細い線）を含有する。
図１０２は、図１００に示すより大きな連続領域を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法の類似の図解を示す。ここで示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、５０塩基の５’または上流標的特異的プローブ部分、５０塩基の３’または下流プローブ、１０塩基の５’及び３’リンカー部分、並びに２０〜１６０ｂｐの識別子領域（細い線）を含有する。
図１０３は、図１００に示すより大きな連続領域を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法の類似の図解を示す。ここで示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、６０塩基の５’または上流標的特異的プローブ部分、６０塩基の３’または下流プローブ、１０塩基の５’及び３’リンカー部分、並びに２０〜１６０ｂｐの識別子領域（細い線）を含有する。
図１０４〜１０７は、隣接する１６０ｂｐの標的遺伝子領域にまたがりタイリングされているとおり、３’または５’リンカーを含まない、標的特異的なフェーズで標識されたオリゴヌクレオチドによる標的領域のカバレッジを示す（図２０及び２２に示すプロセスを表す）。５０塩基の５’及び３’標的特異的領域を有するオリゴヌクレオチドプローブは、１０塩基毎に１つの塩基ミスマッチ（縦のハッシュマーク）を含有する。検出された標的領域の配列（濃い灰色）；検出されていない標的領域の配列（ライトグレー）。具体的には、図１０４は、ゲノムＤＮＡの伸長における、隣接する１６０ｂｐの遺伝子標的（標的セグメントにリンカーは付加されていない）にまたがりタイリングされた、標的特異的なフェーズで標識されたオリゴヌクレオチドを示す。５’及び３’標的特異的プローブは、１０塩基毎に１本の塩基ミスマッチ（縦のハッシュマーク）を有する。この図での、それぞれの連続したグルーピングは、ｃｆＤＮＡで発見された、スライドした１６０ｂｐの標的領域のプローブカバレッジのシミュレーションを示す。標的領域は連続して１０塩基刻みでスライドし、一つのプローブによる標的領域のカバレッジを示す。それぞれの連続した左から右へのグルーピングは、第２、第３、及び第４の異なるプローブによる標的領域のカバレッジ及びプローブの重複を示す。この図で示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、５０塩基の５’または上流標的特異的部分、５０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の配列識別子領域を含有する。
図１０５は、図１０４に示す、隣接する１６０ｂｐの遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズにより標識されたオリゴヌクレオチドに対する類似アプローチを示す。この図で示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、６０塩基の５’または上流標的特異的部分、６０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の配列識別子領域を含有する。
図１０６は、図１０４に示す、隣接する１６０ｂｐの遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズにより標識されたオリゴヌクレオチドに対する類似アプローチを示す。この図で示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、７０塩基の５’または上流標的特異的部分、７０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の配列識別子領域を含有する。
図１０７は、図１０４に示す、隣接する１６０ｂｐの遺伝子標的にまたがってタイリングされた、標的特異的なフェーズにより標識されたオリゴヌクレオチドに対する類似アプローチを示す。この図で示すオリゴヌクレオチドプローブ構築物は、８０塩基の５’または上流標的特異的部分、８０塩基の３’または下流標的特異的部分、及び２０〜１６０塩基の配列識別子領域を含有する。
本発明の別の態様は、試料中で、試料中の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を識別する方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、及び、前記試料内に存在する場合、１つ以上の標的リボ核酸分子のｃＤＮＡを前記試料内で生成する工程を伴う。本方法は、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程を更に伴い、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）３’ｃＤＮＡ標的特異的配列部分、（ｂ）５’ｃＤＮＡ標的特異的部分、及び更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’標的特異的部分が塩基特異的な様式でｃＤＮＡの相補領域にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料を１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる。相補ｃＤＮＡにハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端の結合に好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成し、１つ以上のライゲーション接合部にて第１のオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションし、第１のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に結合した標的リボ核酸配列のデオキシリボ核酸コピーを含む、ライゲーション環状生成物を形成する。本方法は、試料中の環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程であって、それにより、試料中の他のリボ核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する、工程を更に伴う。
本発明の本態様に従い、図１０８は、配列決定のための、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ転写物の標的特異的捕捉プロセスを示す。図１０８、ステップＡに示すように、所望の標的領域を含有するｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡを逆転写し（逆転写−塗りつぶした菱形）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成する。図１０８、ステップＢに示すように、ｃＤＮＡ標的領域に相補的な５’及び３’配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブをｃＤＮＡ分子にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、更なる部分により分離される。更なる部分は、固有の識別子部分、任意で患者識別子部分、及び任意で５’ホスフェートを含む。必要であれば、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）がオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズした３’末端を伸長し、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端と重なる３’末端を生成する（図１０８、ステップＣ）。５’末端上にライゲーション能のあるホスフェートが存在しない場合、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが５’末端のマッチする５’重複塩基を切断し、５’ホスフェートを生成する（図１０８の左側、ステップＣ）。図１０８、ステップＤに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長またはライゲーション能のある末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。最後に、図１０８、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列または患者識別子配列に結合した標的リボ核酸配列のｃＤＮＡコピーを含む所望の一本鎖環状構築物のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。本生成物は、本明細書記載の方法のいずれかを用いたローリングサークル増幅及び配列決定に適している。
本発明の別の態様は、試料内での、互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域（例えば、推定上の遺伝子融合体）を含む可能性がある１つ以上の核酸分子の識別方法に関する。本方法は、互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む１つ以上の核酸分子を含む可能性がある試料を提供する工程、並びに１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する工程を伴い、各プローブセットは、（ｉ）５’第１標的特異的部分と、３’第２標的特異的部分と、更なる部分とを含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び、（ｉｉ）５’第２標的特異的部分と、３’第１標的特異的部分と、更なる部分とを含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。本方法は、試料中に存在する場合、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的な様式で核酸分子の対応する第１及び第２の標的領域にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料と１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程、並びに、前記プローブセットが核酸分子の相補第１標的領域及び第２標的領域にハイブリダイズされた場合に、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に結合させるのに好適な、及び、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端に結合させるのに好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程を更に伴う。プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドを１つ以上のライゲーション能のある接合部にてライゲーションし、更なる部分に結合した核酸分子の第１及び第２の異なる標的領域に対応するヌクレオチド配列を含む環状ライゲーション生成物を形成する。環状ライゲーション生成物を試料内で検出及び区別することにより、存在する場合、試料中に互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
本発明の本態様に関して、図１０９、ステップＡ〜Ｅは、ｍＲＮＡ内での推定上の特定の遺伝子融合を検出する例示的プロセスを示す。推定上遺伝子融合が含まれるｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ分子を生成する（図１０９、ステップＡ）。それぞれの可能性のある標的に関して、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを含むプローブセットを提供する。第１のプローブは５’第１標的特異的部分及び３’第２標的特異的部分を有する一方、第２のプローブは５’第２標的特異的部分及び３’第１標的特異的部分を有する。各プローブの標的特異的部分は、固有の識別子配列、患者識別子配列、１つ以上のプライマー結合配列、またはこれらの任意の組み合わせを含有するヌクレオチド配列により分離される。図１０９、ステップＢに示すように、オリゴヌクレオチドプローブを標的ｃＤＮＡ分子のそれぞれの相補部分にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブがライゲーション能のある５’末端を含有する場合、図１０９、ステップＤ（左パネル）に示すように、リガーゼはハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの隣接末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブが５’フラップまたは重複ヌクレオチド塩基を含有する場合、５’ヌクレアーゼは５’末端を切断し、ライゲーション（図１０９、ステップＤ（右パネル））の前にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図１０９、ステップＣ）。エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別配列、患者識別配列、及び／または捕捉配列（例えばプライマー結合配列）に結合した遺伝子融合生成物からの、上流及び下流配列を含む所望の一本鎖環化ＤＮＡ構築物のみを残し、ライゲーションされていない生成物または線状生成物が全て取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び後続の配列決定に適している。
図１１０は、ｍＲＮＡ内での、推定上の特定の遺伝子融合を検出するための、図１０９に示すプロセスの変形を示す。本実施形態において、図１１０、ステップＢに示すように、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブをｃＤＮＡ分子のそれぞれの相補領域にハイブリダイズする。図１１０、ステップＣに示すように、ポリメラーゼは各第１及び第２プローブのハイブリダイズした３’末端を伸長し、各第２のプローブ、及び第１のプローブのハイブリダイズした５’末端とライゲーション接合部を形成する。オリゴヌクレオチドプローブが５’ＯＨを有する場合（図１１０、ステップＣの右側）、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、マッチする５’重複塩基を切断する。リガーゼ（塗りつぶした円）はハイブリダイズした第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの隣接末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する（図１１０、ステップＤ）。エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または捕捉配列（即ちプライマー結合配列）に結合した遺伝子融合生成物からの上流及び下流配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡ構築物のみを残し、ライゲーションされていない生成物または線状生成物が取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び後続の配列決定に適している。
図１１１は、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ内の特定のエクソンの検出及び定量に好適な、本発明の本態様に従った別のプロセスを示す。本実施形態において、所望のエクソンを含有するｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする（図１１１、ステップＡ）。図１１１、ステップＢに示すように、それぞれの可能性のある標的に関して、２つのオリゴヌクレオチドプローブを提供し、各プローブは、ｃＤＮＡ分子の各エクソンの固有部分に相補的な３’及び５’標的特異的配列を含有する。各プローブの標的特異的部分は、固有の識別子配列、患者識別子配列、１つ以上のプライマー結合配列、またはこれらの任意の組み合わせを含有するヌクレオチド配列により分離される。図１１１、ステップＢに示すように、プローブを標的のｃＤＮＡ上で互いに隣接させてハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブがライゲーション能のある５’末端を含有する場合、図１１１、ステップＤ（左パネル）に示すように、リガーゼはハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの隣接末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブが５’フラップまたは重複ヌクレオチド塩基を含有する場合、５’ヌクレアーゼは５’末端を切断し、ライゲーション（図１１１、ステップＤ（右パネル））の前にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図１１１、ステップＣ）。エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または捕捉配列（例えばプライマー結合配列）に結合した所望のエクソンのｃＤＮＡ配列を含む所望の一本鎖環化ＤＮＡ構築物のみを残し、ライゲーションされていない生成物または線状生成物が全て取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び後続の配列決定に適している。
図１１２は、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ内での特定のエクソンの検出及び定量のための、図１１１に示すプロセスの変形を示す。本実施形態において、図１１２、ステップＢに示すように、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブはｃＤＮＡ分子のそれぞれの相補領域にハイブリダイズする。図１１２、ステップＣに示すように、ポリメラーゼは各第１及び第２プローブのハイブリダイズした３’末端を伸長し、各第２のプローブ、及び第１のプローブのハイブリダイズした５’末端とライゲーション接合部を形成する。オリゴヌクレオチドプローブが５’ＯＨを有する場合（図１１０、ステップＣの右側）、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、マッチする５’重複塩基を切断する。リガーゼ（塗りつぶした円）は、ハイブリダイズした第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの隣接する伸長末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する（図１１２、ステップＤ）。エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または捕捉配列（即ちプライマー結合配列）に結合した所望のエクソンのｃＤＮＡ配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡ構築物のみを残し、ライゲーションされていない生成物または線状生成物が取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び後続の配列決定に適している。
図１１３は、ゲノムＤＮＡの同じ鎖での、既知の多型の検出に好適な、本発明の本態様に従った別のプロセスを示す。図１１３、ステップＡに示すように、標的ゲノムＤＮＡセグメントの上流及び下流領域は、多型を含有する。図１１３、ステップＢに示すように、それぞれの可能性のある標的に関して、２つのオリゴヌクレオチドプローブが提供され、各プローブは、多型を含有するＤＮＡの上流及び下流部分に相補的な３’及び５’標的特異的配列を含有する。各プローブの標的特異的部分は、固有の識別子配列、患者識別子配列、１つ以上のプライマー結合配列、またはこれらの任意の組み合わせを含有するヌクレオチド配列により分離される。図１１３、ステップＢに示すように、プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列上で互いに隣接してハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブがライゲーション能のある５’末端を含有する場合、図１１３、ステップＤ（左パネル）に示すように、リガーゼはハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの隣接末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。オリゴヌクレオチドプローブが５’フラップまたは重複ヌクレオチド塩基を含有する場合、５’ヌクレアーゼは５’末端を切断し、ライゲーション（図１１３、ステップＤ（右パネル））の前にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図１１３、ステップＣ）。エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別子配列、患者識別子配列、及び／または捕捉配列（例えばプライマー結合配列）に結合した多型を含有するゲノムＤＮＡの上流及び下流配列を含む所望の一本鎖環化ＤＮＡ構築物のみを残し、ライゲーションされていない生成物または線状生成物が全て取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び後続の配列決定に適している。
本発明の別の態様は、試料中における、試料の別の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の識別方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する工程、並びに、ヌクレオチドリンカーを試料内の標的ｍｉＲＮＡ分子の３’及び５’末端に付加する工程を伴う。本方法は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程を更に伴い、各オリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）標的ｍｉＲＮＡ分子の３’ヌクレオチドリンカーに相補的な３’部分、（ｂ）標的ｍｉＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドリンカーに相補的な５’部分、及び（ｃ）更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。試料中に存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’部分が塩基特異的な様式で標的ｍｉＲＮＡ分子上の相補ヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、試料を１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長して１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の相補体を生成し、オリゴヌクレオチドプローブの伸長した３’末端をオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にライゲーションし、標的ｍｉＲＮＡ分子の３’ヌクレオチドリンカーに相補的な配列、標的ｍｉＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドリンカーに相補的な配列、１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の相補体、及びオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分を含む環状ライゲーション生成物を形成する。本方法は、試料中の環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程であって、それにより、試料内で他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する工程を更に伴う。
本発明の本態様に従い、図１１４はｍｉＲＮＡの遺伝集団（ｇｅｎｅｒｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）の検出プロセスを示す。本プロセスの出発物質は、血清、または血漿、またはエクソソームから単離したｍｉＲＮＡである（図１１４、ステップＡ）。図１１４、ステップＢに示すように、ヌクレオチドリンカーは、試料内の標的リボ核酸分子の３’及び５’末端に付加される。図１１４、ステップＢに示すように、３’リンカーは３’末端にブロック基を、及び５’末端にホスフェート基を含有し、標的ｍｉＲＮＡ分子の３’末端にＴ４ ＲＮＡリガーゼ（塗りつぶした円）を使用してライゲーションを促進する。５’末端にブロック基もまた含有する５’リンカーを、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いて同様に、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端にライゲーションする。標的ｍｉＲＮＡの３’ヌクレオチドリンカーに相補的な３’部分、及び標的ｍｉＲＮＡの５’ヌクレオチドリンカーに相補的な５’部分を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、リンカーが付加された標的ｍｉＲＮＡ分子にハイブリダイズする（図１１４、ステップＣ）。オリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、１つ以上のプライマー結合配列、またはこれらの任意の組み合わせを含むヌクレオチド配列も含有する。５’−３’活性を欠く逆転写酵素（塗りつぶした菱形）はハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長し、ライゲーション能のあるオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に隣接するまで、ｍｉＲＮＡ配列をコピーする（図１１４、ステップＤ）。図１１４、ステップＥに示すように、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（塗りつぶした円）はオリゴヌクレオチドプローブの伸長３’末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）はｍｉＲＮＡにニックを入れ（図１１４、ステップＥ）、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全てエキソヌクレアーゼ分解すると、固有の識別配列に結合したｍｉＲＮＡ標的のコピーを含む所望の一本鎖環状核酸構築物のみが残る。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
本発明の別の態様は、試料中における、試料中の別の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の識別方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する工程、並びに、ヌクレオチドリンカーを試料内の標的ｍｉＲＮＡ分子の３’及び５’末端にライゲーションする工程を伴う。ヌクレオチドリンカーは更なる部分により互いに結合され、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含み、前記ライゲーションは、標的ｍｉＲＮＡ分子、３’及び５’ヌクレオチドリンカー配列、並びに更なる部分を含む環状ライゲーション生成物を形成する。本方法は、環状ライゲーション生成物の３’または５’ヌクレオチドリンカー配列に相補的なヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程、及び、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを塩基特異的な様式で環状ライゲーション生成物にハイブリダイズさせる工程を更に伴う。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長し、環状ライゲーション生成物の相補体を生成し、試料中の環状ライゲーション生成物相補体を検出して区別することにより、試料内で他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する。
本発明の本態様に関して、図１１５は、特定のｍｉＲＮＡ配列の検出プロセスを示す。血清またはエクソソームから単離したｍｉＲＮＡ（図１１５、ステップＡ）は、５’末端にてリン酸化される。図１１５、ステップＢに示すように、結合したヌクレオチドリンカーは、試料内の標的リボ核酸分子の３’及び５’末端上にライゲーションされる。ヌクレオチドリンカーは、固有の識別子配列、３’リボヌクレオチド、患者識別子配列、１つ以上のプライマー結合配列、またはこれらの任意の組み合わせを含有するヌクレオチド配列により結合される。図１１５、ステップＢに示すように、結合したヌクレオチドリンカーのライゲーションは、結合リンカーの３’末端に相補的な３’配列、結合リンカーの５’末端に相補的な５’配列、及び標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにより促進される。ヌクレオチドリンカーのｍｉＲＮＡ分子へのライゲーションは、標的ｍｉＲＮＡ分子を含有する環化ライゲーション生成物を作製する。図１１５、ステップＣに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、標的ｍｉＲＮＡを含有する所望の一本鎖環状構築物のみを残して、ライゲーションされていない生成物、例えばオリゴヌクレオチドプローブが全て取り除かれる。図１１５、ステップＤに示すように、リン酸化５’プライマーが環状構築物にハイブリダイズされ、逆転写酵素活性を有するが５’−３’活性を欠くポリメラーゼ（菱形）が環化した構築物の周りでハイブリダイズしたプライマーを伸長し、ｍｉＲＮＡ分子の相補コピーを生成する。図１１５、ステップＥに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は、プライマーの伸長３’末端とリン酸化５’末端を共有結合で閉じ、第２の環化ライゲーション生成物を作製する。ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）は元のｍｉＲＮＡ分子にニックを入れ、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別配列に結合したｍｉＲＮＡ標的のコピーを含む所望の一本鎖環状核酸構築物のみを残して、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物が全て取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
図１１６は、特定のｍｉＲＮＡ配列を検出するための、図１１５に示すプロセスの変形を示す。この変形において、結合したヌクレオチドリンカーの標的ｍｉＲＮＡへのライゲーションは、３’ブロック基、及び標的ｍｉＲＮＡ配列に相補的な配列内に内部スペーサー（「Ｘ」）を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて促進される（図１１６、ステップＢ（左パネル））。結合リンカーの標的ｍｉＲＮＡへのライゲーションにより、図１１６、ステップＢ（左パネル）に示すように、環化ライゲーション生成物を形成する。図１１６、ステップＣに示すように、チオホスフェートを含有する５’ＯＨプライマーを環化ライゲーション生成物にハイブリダイズする。逆転写酵素活性、及び５’−３’を有するポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）はハイブリダイズしたプライマーの３’末端を伸長し、環化ライゲーション生成物の相補コピー、及びその中に含まれる標的ｍｉＲＮＡ分子を形成する（図１１６、ステップＣ及び１１６、ステップＤ（左パネル））。ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、プライマーのマッチする５’重複塩基を切断する（図１１６、ステップＤ（左パネル））。図１１６、ステップＥに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は伸長末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼ（塗りつぶした三角形）は元のｍｉＲＮＡ分子を切断し（図１１６、ステップＥ（左パネル））、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別配列に結合したｍｉＲＮＡ標的のコピーを含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残して、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物が全て取り除かれる（図１１６、ステップＦ（左パネル））。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。標的ｍｉＲＮＡの不存在下において、図１１６、ステップＢ〜Ｅ（右パネル）に示すように、５’−３’ヌクレアーゼによるプライマー伸長により、二本鎖切断を有するギャップが作製される。ギャップ生成物はライゲーションせず、線状のままとなる（図１１６、ステップＥ（右パネル））。これらの線状生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により分析から取り除かれる（図１１６、ステップＦ）。
本発明の別の態様は、試料中における、試料の別の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の識別方法に関する。本方法は、１つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する工程、及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する工程を伴い、各セットは、（ａ）５’ステムループ部分、及び標的ｍｉＲＮＡ分子の３’部分に相補的な３’部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｂ）標的ｍｉＲＮＡ分子の５’末端のコピーに相補的な３’部分、第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’ステムループ部分に相補的な５’部分、並びに、（ｉ）固有の標的識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）プライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む更なる部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む。本方法は、試料中に存在する場合、試料、プローブセットからの１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び逆転写酵素をブレンドして逆転写酵素反応物を形成する工程、並びに、相補標的ｍｉＲＮＡ分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長して、標的ｍｉＲＮＡ分子の相補体を生成する工程を更に伴う。プローブセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ｍｉＲＮＡ配列の相補体を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされ、１つ以上のライゲーション能のある接合部が、伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされた各第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端間で生成される。本方法は、各第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端をライゲーションして環状ライゲーション生成物を形成する工程を更に伴い、各生成物は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの更なる部分に結合した標的ｍｉＲＮＡ配列のデオキシリボ核酸コピーを含む。試料中の環状ライゲーション生成物を検出して区別することにより、試料内で他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する。
本発明の本態様に関して、図１１７は特定のｍｉＲＮＡ配列の検出方法を示す。血清、血漿、またはエクソソームから単離したｍｉＲＮＡを、標的ｍｉＲＮＡの３’末端に相補的な配列、及び５’末端にステムループを有する第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする（図１１７、ステップＢ）。第１のオリゴヌクレオチドプローブのステップループ領域（ｓｔｅｐ ｌｏｏｐ ｒｅｇｉｏｎ）はまた、切断可能な結合（ｄＵ）も含有する。逆転写酵素（塗りつぶした菱形）を用いて第１のオリゴヌクレオチドプローブを伸長することで、ｍｉＲＮＡ分子の相補コピーを形成する。図１１７、ステップＣに示すように、伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端に相補的な３’配列、及び第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’ステムループに相補的な５’配列を含有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを、第１のオリゴヌクレオチドプローブの相補領域にハイブリダイズする。第２のオリゴヌクレオチドプローブはまた、固有の識別子配列、患者識別子配列、１つ以上のプライマー結合配列、５’ホスフェート、またはこれらの任意の組み合わせも含有してよい。ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）は第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長し、ｍｉＲＮＡ配列の相補コピーを作成し、プローブの３’末端を５’末端に隣接させてライゲーション接合部を形成する。（図１１７、ステップＤ）。ポリメラーゼはまた、（ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドプローブを鋳型として用いて）第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長し、５’末端とのライゲーション接合部を作製する（図１１７、ステップＤ）。図１１７、ステップＥに示すように、リガーゼ（塗りつぶした円）は対応するそれぞれのライゲーション接合部にて、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端を共有結合で閉じ、環化ライゲーション生成物を作製する。ニックが第１のオリゴヌクレオチドプローブの切断可能な結合に導入される（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、及びＡＰエンドヌクレアーゼ−塗りつぶした三角形）。図１１７、ステップＥに示すように、エキソヌクレアーゼ分解により、固有の識別配列に結合したｍｉＲＮＡ標的配列のコピーを含む、所望の一本鎖環状核酸構築物（即ち、第２のオリゴヌクレオチドプローブ）のみを残して、全てのライゲーションされていない生成物またはニック生成物が取り除かれる。本生成物は、本明細書に記載したローリングサークル増幅及び環状配列決定に適している。
予測実施例１−既知の遺伝子（例えばＢｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、高感度変異マーカー（１％〜０．０１％で存在する場合）、単一の塩基変異、小挿入、及び小欠失変異。
癌遺伝子における変異変化は通常、ばらばらの領域または位置に存在し、多くの場合、腫瘍の進行をもたらす。これらの遺伝子、及びその変異の一覧は、Ｓａｎｇｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒの「ＣＯＳＭＩＣ」データベース等の公開データベースに見出され得る。血清中にかかる変異が存在することは、体内におけるいくつかの腫瘍組織の強力な指標となる。従来、かかる変異は対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅を用いて識別されている。本アプローチは、初期の誤った増幅、続いて誤った生成物の増幅を受けやすい。他では、デジタルＰＣＲを用いて血清中の変異ＤＮＡの定量が試みられている。しかし、ｐ５３及びＡＰＣ等の癌抑制遺伝子における変異変化はあまりにも多く、対立遺伝子特異的ＰＣＲアプローチを用いてカバーできない。したがって、このアプローチは、タンパク質の全てのエクソンに渡るディープシークエンシングに移った。投入ＤＮＡが限定的である場合、異なる領域を等しく増幅し、カバレッジを確実に同一の一般深度とすることを達成するのが重要である。分子反転プローブ（ＭＩＰ）を用いた等しい増幅を達成する試みが存在する（例えば、Ａｋｈｒａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ｏｎｅ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｎｕｍｅｒｏｕｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２（９）：ｅ９１５（２００７）；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｈｉｇｈ−Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（５）：８４３−５４（２０１３）を参照：それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。しかし、これらの技術はゲノムＤＮＡのコピーの作製に依存しているため、更なるエラーを導入するリスクがある。
アプローチの概要：ここでの考えは、対象の領域またはエクソンをカバーする標的ＤＮＡの各断片を正確に捕捉し、固有の識別子配列及び任意の患者識別子を付加し、環状配列決定等の後続の配列決定のためにこれらを環化することである。元の標的ＤＮＡ鎖が環化され、配列決定される。これにより、偽陽性をもたらす、伸長（及び環化）ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドから生じるポリメラーゼ導入エラーが回避される。本アプローチは、必要な場合にコピー数情報（即ちウイルス量、腫瘍内のクロロソーム不均衡、非侵襲性出生前診断における異数性の検出）、及び必要最小限の配列決定による変異データの両方を得る利点を提供する。
変形１．１：（図１３〜１６）。この変形において、短いリンカーがＤＮＡ標的（約１６０塩基の平均長のｃｆＤＮＡ）にライゲーションされる。所望の領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、片端に任意のブロック基（図示した５’末端）、または任意の切断可能なリンカーを含有してよい。プローブ設計、並びに標的断片の開始及び末端塩基に応じて、標的の一部が、３’リンカーと、３’プローブに相補的な標的の一部との間で一本鎖領域としてループアウトし得る（図１３及び１４）か、または標的配列の５’末端の一部がハイブリダイズしない場合があるか、またはオリゴヌクレオチドから３’プローブ配列の一部がループアウトし得る（図１５及び１６）。ポリメラーゼを加えることにより、標的上でのオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長、並びに、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を介しての３’末端リンカーの伸長が可能となる。
ハイブリダイゼーション条件は、標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域のハイブリダイゼーションが、標的上のリンカーの３’末端の、その相補体に対する局所濃縮をもたらし、それが正しくハイブリダイズし、速やかにポリメラーゼにより伸長されるように選択される。しかし、オリゴヌクレオチドプローブと標的ＤＮＡとの間に十分な相補性が存在しない場合、標的上のリンカーの３’末端は相補体にハイブリダイズせず、ポリメラーゼにより伸長されることはほとんどない。標的上のオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長することにより、プローブの標的への会合が向上するため、リンカーの３’末端が相補体にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長される能力が増加する。ポリメラーゼ（またはＦｅｎヌクレアーゼ）の５’→３’ヌクレアーゼ切断能が、本物の標的からライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、標的の５’側がプローブの５’部分に相補的な位置にて、またはその付近にて、マッチする標的の５’重複塩基を切断する。ポリメラーゼは標的上でもまたオリゴヌクレオチドを伸長し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図１３及び１５、ステップＤの左側）か、またはオリゴヌクレオチドの５’末端上でブロック基を切断しない（図１３及び１５、ステップＤの右側）かのいずれかである。
リガーゼは伸長３’末端をライゲーション能のある５’ホスフェートと共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する（図１３及び１５、ステップＤ、右側）か、あるいは切断可能な結合にニックが導入される（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、続いてＡＰエンドヌクレアーゼによるアプリン骨格の切断、図１３及び１５、ステップＤ、左側）。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られ、Ｎ−グリコシラーゼ及びＡＰリアーゼの両方として作用する）の任意付加を用いて、損傷した塩基を含有する標的にニック付加してよい。次にエキソヌクレアーゼを加え、固有の識別子配列と共に元の標的ＤＮＡを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物はローリングサークル増幅及び環状配列決定、または直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
本アプローチには、５’プローブ領域と５’標的領域との間に適切なハイブリダイゼーション及び相補性が存在する場合にのみライゲーション能のある５’ホスフェートが生成されるように、標的依存性５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する酵素が必要である。５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有するポリメラーゼを用いる場合、課題は、ライゲーションステップなしで５’標的領域を破壊する（即ち、ニック翻訳）ような方法で、ポリメラーゼが５’プローブ領域に沿って短いリンカーを伸長するのを回避することである。元の標的ＤＮＡを破壊し、伸長ＤＮＡで置き換えるニック翻訳は、増殖し変異として誤って呼ばれてしまうポリメラーゼエラーを意図せず導入する場合がある。このことは、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによりライゲーション能のある接合部を作製することが必要であり、続いてポリメラーゼ解離、及びライゲーション現象により所望の環状ライゲーション生成物を生成するまで、大部分の伸長はヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによるものとなる、リガーゼの存在下にて分布伸長（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を行う条件下において、５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有するもの及び有しないものの両方のポリメラーゼの混合物（例えば１：２０の比率）を用いることで、最小限に抑えられ得る。
１４０〜１７０ヌクレオチド範囲のサイズを有するｃｆＤＮＡは、ヌクレオソーム単位周辺の染色体ＤＮＡの切断を反映する。かかる切断現象はある程度段階を踏むか、またはより無作為的な場合があり、均一に、まてたは不均一に分布され得るいくつかの断片を生成する。したがって、どこで断片が切断されるかに依存せずにカバレッジを与えるオリゴヌクレオチドプローブを設計することが必要となる。
図９０〜９３は、２５０塩基領域にまたがる断片をカバーするための、異なるオリゴヌクレオチドプローブ設計のいくつかの例を提供する。これらの図においては、可能性のある標的断片（領域にわたって１０塩基ごとにシフトする）はダークグレーの棒線で表され、リンカーは短い黒棒線で表され、プローブ領域はライトグレーの棒線で表され、固有配列識別子及び所望の患者識別子は太い黒線で表され、２つの配列間の接続は細い線で概略的に表される。図１００及び１０１は、約５００塩基の連続領域をカバーするための複数のプローブの設計方法を表す。
図９０において、上流５’プローブ領域（６０塩基）は標的塩基５０〜１１０に相補的である一方、下流３’プローブ領域（２０塩基）は標的塩基１４０〜１６０に相補的である。本実施例の目的に関して、リンカーは１０塩基であり、複合識別子配列は２０塩基である（１２塩基が配列識別子、及び８塩基が患者識別子）。標的が位置１〜１６０に存在する場合、このプローブ設計により１４０塩基生成物の環化が可能となり、そのうち１１０塩基、即ち位置５０〜１６０が標的配列情報を提供する。標的が位置１１〜１７０に存在する場合、このプローブ設計により、１５０塩基生成物の環化が可能となり、そのうち１２０塩基、即ち位置５０〜１７０が標的配列情報を提供する。この設計により、それぞれ位置５１〜８１から開始し、かつ位置２１０〜２４０で終了する標的を有する、最大１６０塩基の配列情報がもたらされる。この図において、標的が位置６１〜２５０に存在する場合、環化生成物は形成されない。しかし、５’プローブ領域と標的の５’側との間の相補性がより短い領域であることにより、いくつかの生成物が形成される場合があり、これらは必ずしもハイブリダイズするとは限らないという懸念がある。更に、この設計を用いると、標的の、３’側の９０塩基の「ループアウト」領域が長すぎるため、リンカーの３’末端（図の右側にある短い黒棒線）がオリゴヌクレオチド上の相補体に効率的にハイブリダイズすることが不可能となる場合がある、という懸念がある。
図９１において、上流５’プローブ領域（８０塩基）は標的塩基３０〜１１０に相補的である一方、下流３’プローブ領域（２０塩基）は標的塩基１４０〜１６０に相補的である。この図は、５’プローブ領域がより長いことを除いて図９０に類似している。標的の最初の４例に関して、オリゴヌクレオチドがより長ければより多くの標的ＤＮＡの捕捉が可能となり、得られるサークルは、元の標的ＤＮＡに追加の２０塩基を含有する。
図１００及び１０１は、より大きな連続領域（本明細書では約５００塩基を示す）を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法を表す。図１００は、図９０の設計を用いた４つの「連続」プローブを示し、図１０１は、図９１の設計を用いた４つの「連続」プローブを示す。領域にまたがって生成され得る、可能性のある１６０ｂｐ断片（１０塩基ごとにシフト）を示す。下は、上で示したこれら全ての断片をカバーするオリゴヌクレオチドである。標的内の領域がライトグレーである場合、信頼できる配列情報は提供されない。標的内の領域がダークグレーである場合、良好な配列情報を提供するはずである。本図面において、一覧で示したプローブは順に＃１、＃２、＃３、＃４等として示される。多重化伸長−ライゲーションステップについては、奇数プローブ＃１、＃３、＃５が第１のオリゴヌクレオチドプールセットにプールされ、続いて偶数プローブ＃２、＃４、＃６が第２のプールセットにプールされる。本アプローチにより、隣接オリゴヌクレオチド（即ち＃１及び＃２）が同一標的鎖への結合に対して競合することが避けられる。伸長−環化が発生すると、２つのプールは組み合わされ、エキソヌクレアーゼ、並びにローリングサークル増幅及び環状配列決定、または直接ＳＭＲＴ配列決定等の後続ステップが進行し得る。
既知の遺伝子（例えばＢｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、単一の塩基変異、小挿入、及び小欠失変異（１％〜０．０１％で存在する場合）の非常に高感度な検出に関する詳細プロトコール（Ｖ１．１）：
１．１．ａ．ｃｆＤＮＡ（または例えば、約１５０ｂｐに剪断した、ＣＴＣから単離したゲノムＤＮＡ）から開始して、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。任意で、ライゲーションしていないリンカーから標的ＤＮＡを精製する。
１．１．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイゼーションするようにさせる。Ｔａｑポリメラーゼ、及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰ、及びＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）を、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時のいずれかに加える。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションをさせ、任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
１．１．ｃ．任意で、切断可能な結合にてオリゴヌクレオチドプローブ鎖を切断する（例えば、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断したＵ）。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいはリンカー配列をプライマー結合部位として用いた、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げるための任意のブロック基を５’側に含有してよい。あるいは、切断可能な結合が元のオリゴヌクレオチドプローブに含まれてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注４：ライゲーション伸長プロセスは２つ以上の反応管内で実施してよい。第１のセットは「奇数」番号のプローブを含有し、第２のセットは「偶数」番号のプローブを含有することで、プローブが同一の標的ＤＮＡ鎖に関して競合することを回避する。それらの別々の反応物をその後にプールしてよい。
変形１．２：（図１７〜１８）。この変形において、目的は、どこでプローブが標的に結合することに関係なく、標的ＤＮＡ配列を全て捕捉することである。前述のとおり、短いリンカーがＤＮＡ標的（約１６０塩基の平均長のｃｆＤＮＡ）にライゲーションされる。所望の領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、リンカーの５’末端に相補的な配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブは、片端での任意のブロック基（図示した５’末端）、または任意の切断可能なリンカーを含有してよい。プローブ設計、並びに標的断片の開始及び末端塩基に応じて、３’リンカーと、３’プローブに相補的な標的の一部との間、及び、５’リンカーと、５’プローブに相補的な標的の一部との間で、標的またはプローブ配列の一部が、一本鎖領域としてループアウトしてよい（図１７）。ポリメラーゼを加えることにより、標的の５’リンカーに隣接するまでの、標的上でのオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長、並びに、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を介しての、３’末端リンカーの伸長が可能となる。
ハイブリダイゼーション条件は、標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域のハイブリダイゼーションが、標的上のリンカーの３’末端の局所濃縮をもたらし、それが正しくハイブリダイズし、ポリメラーゼにより速やかに伸長されるように選択される。リンカーの５’末端は、ポリメラーゼが３’リンカーを伸長すると、５’プローブ領域にハイブリダイズした５’標的部分に当たるまで、５’リンカー相補配列の始めから終わりまでを伸長しないように、わずかに長く設計されてよい。しかし、３’リンカーと５’リンカー領域の両方の、オリゴヌクレオチドプローブ上の相補体への「合わさった」ハイブリダイゼーション効果では、オリゴヌクレオチドプローブへの間違った標的のランダムハイブリダイゼーションが、発生したとしても、ごく稀にしか伸長及びライゲーションにより環状生成物を与えることがないように、ハイブリダイゼーション温度より低いＴｍを依然として有しなければならない。
この変形は、オリゴヌクレオチドプローブは、配列がわずか約２０塩基により分離されている、３’及び５’リンカー鎖の両方に相補的な配列を含有することを必要とする。配列がリンカー鎖に相補的であり、配列は結果として互いに相補的であるので、オリゴヌクレオチドプローブの自己対形成が回避される必要がある。１つの解決策は、２つのリンカーが、リンカーライゲーションに用いられる低温（Ｔ４リガーゼにより１６℃、あるいは４℃）にて二本鎖特徴を保持するように、内部バブルを含有するリンカーをライゲーションすることである。更に、５’リンカーは３’リンカーよりも長くなるように設計されてよい。最終的に、リンカー内の相補領域は、オリゴヌクレオチドプローブはより、全体のハイブリダイゼーション温度（即ち５０℃）にてループを有する内部自己対形成を形成しにくくなるように、相補オリゴヌクレオチドプローブ（即ち、Ｃ：Ａ及びＡ：Ｃ；またはＣ：Ｔ）内でより安定性を損なう、わずかなミスマッチまたはヌクレオチド類似体（即ち、Ｇ：Ｔ及びＴ：Ｇ；もしくはＩ：Ａ）を有するように設計されてよい。
例えば、リンカー内のＡトラクトの中央のＩ：Ａミスマッチは、Ｔ：Ａマッチと比較してＴｍを２．４℃下げるが、オリゴヌクレオチド内の相補性ミスマッチであるＣ：Ｔは、Ｔｍを１０．１℃下げる（７．７℃の差）。同様に、リンカー内のＡトラクトの中央のＧ：Ｔミスマッチは、Ｇ：Ｃマッチと比較してＴｍを１０．２℃下げるが、オリゴヌクレオチド内の相補性ミスマッチであるＡ：Ｃは、Ｔｍを１８．０℃下げる（７．８℃の差）。Ｋａｗａｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｉ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｉｎｉ−ｄｕｐｌｅｘｅｓ（ｄＧ２Ａ４ＸＡ４Ｇ２−ｄＣ２Ｔ４ＹＴ４Ｃ２）ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄ（ＧＧＧＡＡＸＹＴＴＣＣＣ）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｂａｓｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９）：７７２７−３６（１９８６）を参照のこと（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。したがって、リンカー内にかかるミスマッチを共に配置することは、リンカーの自己対形成と比較して、約１５．５℃、オリゴヌクレオチド自己対形成のＴｍを下げると予想される。正確な量は配列関係に基づいて変化し得るものの、４℃または１６℃のいずれかのライゲーション温度にて二本鎖のままであるリンカーＤＮＡ二本鎖内にてＩ：Ａ及びＧ：Ｔミスマッチを用いることは、確実にオリゴヌクレオチド内で約２０塩基により分離された相補配列が、より高い５０Ｃのハイブリダイゼーション温度にて自己対形成（即ち、２０塩基ループを有するヘアピン）を行わないのに十分過ぎるということが、当業者には明らかとなるであろう。
標的上のオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長することにより、プローブの標的への会合が向上するため、リンカーの３’末端が相補体にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長される能力が増加する。ポリメラーゼ（またはＦｅｎヌクレアーゼ）の５’→３’ヌクレアーゼ切断活性は、リンカー上にライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、５’リンカーのマッチする５’重複塩基を切断する。ポリメラーゼは標的上でもまたオリゴヌクレオチドを伸長し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成するか、またはオリゴヌクレオチドの５’末端上のブロック基を切断しないかのいずれかとなる。
リガーゼは伸長３’末端をライゲーション能のある５’ホスフェートと共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ブロック基がオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止するか、あるいは、ニックを切断可能な結合に導入する（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、続いてＡＰエンドヌクレアーゼによるアプリン骨格の切断）。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られ、Ｎ−グリコシラーゼ及びＡＰリアーゼの両方として作用する）の任意付加を用いて、損傷した塩基を含有する標的にニック付加してよい。次にエキソヌクレアーゼを加え、固有の識別子配列と共に元の標的ＤＮＡを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物はローリングサークル増幅及び環状配列決定、または直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
ここでの課題は、ライゲーションステップ（即ちニック翻訳）なしに５’リンカーを破壊するような方法で、ポリメラーゼに３’リンカーの伸長をさせることを回避することである。このことは、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を組み込むことで達成され得る。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流リンカーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
代替アプローチの１つは、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有する５’リンカーを用いることである。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、リンカーが標的に結合した時に、５’ホスフェートを残してＡｐ部位を切断する。エンドヌクレアーゼはまた、一本鎖リンカーも切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたリンカーが好ましい基質となる。熱安定性エンドＩＩＩを用いる場合、用いるＰＣＲポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
上述の通り、ニック翻訳の問題は、大部分の伸長は、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼがライゲーション能のある接合部を作製し、続いてポリメラーゼ解離、及びライゲーション現象により所望の環状ライゲーション生成物を生成するまで、ヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼにより行われるような、リガーゼの存在下における分布伸長の条件下にて、５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有するもの及び有しないものの両方のポリメラーゼの混合物（例えば１：２０の比率）を用いることによっても、最小限に抑えることができる。
図９４及び９５は、２５０塩基領域にまたがる断片をカバーするための、異なるオリゴヌクレオチドプローブ設計のいくつかの例を提供する。これらの図においては、可能性のある標的断片（領域にわたって１０塩基ごとにシフトする）はダークグレーの棒線で表され、リンカーは短い黒い棒線で表され、プローブ領域はライトグレーの棒線で表され、固有配列識別子及び所望の患者識別子は太い黒線で表され、かつ２つの配列間の接続は細い線で概略的に表される。図１０２及び１０３は、約５００塩基の連続領域をカバーするための複数のプローブの設計方法を表す。
図９４において、上流５’プローブ領域（５０塩基）は標的塩基５０〜１００に相補的である一方、下流３’プローブ領域（５０塩基）は標的塩基１５０〜２００に相補的である。本実施例の目的に関して、３’リンカーは１０塩基であり、複合識別子配列は２０塩基であり（１２塩基が配列識別子、及び８塩基が患者識別子）、５’リンカーは１０塩基として示されるが、別の実施形態において、５’リンカーはいくらか長い、約１２〜１８塩基である。標的が位置１〜１６０に存在する場合、このプローブを設計することで、１６０塩基全てが標的配列情報を提供する２００塩基生成物の環化が可能となる。これらのプローブは、標的が１〜１６０にあるか、９１〜２５０にまたがっているかに関わらず、依然として、環化して約２００塩基の生成物を形成する伸長生成物を形成するように設計される。
図９５において、上流５’プローブ領域（６０塩基）は標的塩基４０〜１００に相補的である一方、下流３’プローブ領域（６０塩基）は標的塩基１４０〜２００に相補的である。この図は、３’及び５’プローブ領域の両方がより長いことを除いて図９４に類似している。このプローブ設計は、末端での標的（即ち、標的１〜１６０；１１〜１７０；８１〜２４０；及び９１〜２５０）の捕捉により効果的であり得る。
図１０２及び１０３は、より大きな連続領域（本明細書では約５００塩基を示す）を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法を表す。図１０２は、図９４の設計を用いた４つの「連続」プローブを示す一方、図１０３は、図９５の設計を用いた４つの「連続」プローブを示す。領域にまたがって生成されることが可能な、可能性のある１６０ｂｐ断片（１０塩基ごとにシフト）を示す。下は、上の全ての断片をカバーするであろうオリゴヌクレオチドを示す。本図面において、列挙したプローブは＃１、＃２、＃３、＃４等で順次示される。多重化伸長−ライゲーションステップに関して、奇数プローブ＃１、＃３、＃５は第１のオリゴヌクレオチドプールセットにプールし、続いて偶数プローブ＃２、＃４、＃６を第２のプールセットにプールする。本アプローチにより、隣接オリゴヌクレオチド（即ち＃１及び＃２）が同一標的鎖への結合について競合することが避けられる。伸長−環化が発生すると、２つのプールは組み合わされ、エキソヌクレアーゼ、並びにローリングサークル増幅及び環状配列決定、または直接ＳＭＲＴ配列決定等の後続ステップが進行し得る。
既知の遺伝子（例えばＢｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、単一の塩基変異、小挿入、及び小欠失変異（１％〜０．０１％で存在する場合）の非常に高感度な検出の詳細プロトコール（Ｖ１．２）：
１．２．ａ．ｃｆＤＮＡ（または、例えば約１５０ｂｐに剪断した循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から単離したゲノムＤＮＡ）から開始し、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いる４℃でのライゲーションは、断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。任意で、ライゲーションしていないリンカーから標的ＤＮＡを精製する。
１．２．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、リンカーの５’末端に相補的な配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、並びに（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
１．２．ｃ．任意で、切断可能な結合にてオリゴヌクレオチドプローブを切断する（例えば、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断したＵ）。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいはリンカー配列をプライマー結合部位として用いた、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドは任意のブロック基を５’側に含有し、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げてよい。あるいは、切断可能な結合は元のオリゴヌクレオチドに含まれてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：５’末端リンカーは、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成されてよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流リンカーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、標的に結合する時に５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼはまた、一本鎖オリゴヌクレオチドも切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたリンカーが好ましい基質となる。
注５：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注６：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注７：ライゲーション伸長プロセスは２つ以上の反応管内で実施してよい。第１のセットは「奇数」番号のプローブを含有し、第２のセットは「偶数」番号のプローブを含有することで、プローブが同一の標的ＤＮＡ鎖に関して競合することを回避する。別々の反応物をその後にプールしてよい。
注８：単一の塩基３’「Ｔ」オーバーハングを含有するリンカーの例を、オリゴヌクレオチドｉＳｘ−００３−ＳｈＡｄＴ（トップ鎖）、及びｉＳｘ−００４−ｐＳｈＡｄＢ（ボトム鎖）として提供する（表１を参照）。リンカー領域への結合を向上させる、わずかに長いリンカーの例を、オリゴヌクレオチドｉＳｘ−００６−ＭｄＡｄＴ（トップ鎖）、及びｉＳｘ−００７−ｐＭｄＡｄＢ（ボトム鎖）として提供する（表１を参照）。リンカーｉＳｘ−００３−ＳｈＡｄＴ及びｉＳｘ−００６−ＭｄＡｄＴ（表１を参照）は、ニック翻訳を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、５’末端の末端に任意のチオホスフェート基を含有してよい。リンカーｉＳｘ−００４−ｐＳｈＡｄＢ及びｉＳｘ−００７−ｐＭｄＡｄＢ（表１を参照）は、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼを用いる場合に分解を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、３’末端付近、または３’末端に任意のチオホスフェート基を含有してよい。
注９：過剰の塩基が標的ＤＮＡに付加されない（即ち、クレノウステップを省略する）場合、平滑末端ライゲーションを用いる。リンカー同士のライゲーションを避けるために、リンカーの平滑末端はリン酸化されていない。平滑末端を含有するリンカーの例を、オリゴヌクレオチドｉＳｘ−００３−ＳｈＡｄＴ（トップ鎖）、及びｉＳｘ−００５−ＳｈＡｄＢ（ボトム鎖）として提供する（表１を参照）。
注１０：市販の機器で用いるための「バーコード」または「インデックス」配列を含む、より長いリンカー配列と用いるためのオリゴヌクレオチドを設計する場合、ＰＣＲ、鎖置換増幅、またはこれらの組み合わせを用いて、オリゴヌクレオチドをアセンブルする必要があり得る。ＰＣＲの間に、ＵＤＧによる後続の切断に好適な、ＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いてウラシルに組み込む。リバース鎖プライマーをリン酸化して、λエキソヌクレアーゼまたは類似の５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて分解を可能にすることができる。ｄＡ３０配列をフォワードプライマーの５’末端に付加し、鎖置換増幅を可能にすることができる。ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポット変異を含有するＴＰ５３エクソンの５〜８領域の配列決定のためのアセンブリ増幅に好適なオリゴヌクレオチドの例は表１（下）に示され、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳのフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０１６−ｂｋＡ３０−ＫＲＳＦ１１、ｉＳｘ−０１７−ｐＫＲＳＦ１２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０１８−ｐＫＲＳＦ１３、及びｉＳｘ−０１８−ｐＫＲＳＲ１４）及び（ｉＳｘ−０１５−ｐＫＲＳＦ１０、ｉＳｘ−０１７−ｐＫＲＳＦ１２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０１８−ｐＫＲＳＦ１３、ｉＳｘ−０１９−ｂｋＡ３０−ＫＲＳＲ１５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｉｉ）ＢＲＡＦのフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０２３−ｂｋＡ３０−ＢＲＦ−Ｆ１１、ｉＳｘ−０２４−ｐＢＲＦ−Ｆ１２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０２５−ｐＢＲＦ−Ｆ１３、及びｉＳｘ−０２６−ｐＢＲＦ−Ｒ１４）並びに（ｉＳｘ−０２２−ｐＢＲＦ−Ｆ１０、ｉＳｘ−０２４−ｐＢＲＦ−Ｆ１２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０２５−ｐＢＲＦ−Ｆ１３、ｉＳｘ−０２７−ｂｋＡ３０−ｐＢＲＦ−Ｒ１５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５の上流フォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０３５−ｂｋＡ３０−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ１１、ｉＳｘ−０３６−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ１２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０３７−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ１３、ｉＳｘ−０３８−ｐＴＰ５３ｅ５Ｒ１４）並びに（ｉＳｘ−０３４−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ１０、ｉＳｘ−０３６−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ１２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０３７−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ１３、ｉＳｘ−０３９−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ５Ｒ１５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン５の下流フォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０４３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ５Ｆ２１、ｉＳｘ−０４４−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ２２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０４５−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ２３、及びｉＳｘ−０４６−ｐＴＰ５３ｅ５Ｒ２４）並びに（ｉＳｘ−０４２−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ２０、ｉＳｘ−０４４−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ２２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０４５−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ２３、ｉＳｘ−０４７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ５Ｒ２５及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０５３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ６Ｆ３１、ｉＳｘ−０５４−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ３２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０５５−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ３３、及びｉＳｘ−０５６−ｐＴＰ５３ｅ６Ｒ３４）並びに（ｉＳｘ−０５２−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ３０、ｉＳｘ−０５４−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ３２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０５５−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ３３、ｉＳｘ−０５７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ６Ｒ３５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０６３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ７Ｆ４１、ｉＳｘ−０６４−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ４２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０６５−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ４３、及びｉＳｘ−０６６−ｐＴＰ５３ｅ７Ｒ４４）並びに（ｉＳｘ−０６２−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ４０、ｉＳｘ−０６４−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ４２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０６５−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ４３、ｉＳｘ−０６７−ｐＴＰ５３ｅ７Ｒ４５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；並びに（ｖｉｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−０７３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ８Ｆ５１、ｉＳｘ−０７４−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ５２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０７５−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ５３、及びｉＳｘ−０７６−ｐＴＰ５３ｅ８Ｒ５４）並びに（ｉＳｘ−０７２−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ５０、ｉＳｘ−０７４−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ５２、ｉＳｘ−００８−７０１Ｆ、ｉＳｘ−００９−５０１Ｒ、ｉＳｘ−０７５−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ５３、ｉＳｘ−０７７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ８Ｒ５５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）。
注１１：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成した後、これらの領域を、標的特異的プライマーを用いたローリングサークル増幅に供し、タンデムリピート生成物を生成してよい。これらの生成物は、固体支持体上での標的特異的オリゴヌクレオチドによる所望標的の捕捉前、または後のいずれかに、生成してよい（以下の注１２を参照）。プライマーは１’−２’ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）等の内部で切断可能なヌクレオチド塩基、または脱塩基部位を含有することができ、ローリングサークル増幅の間に、コンタミネーションのキャリーオーバーに対する保護のために、ｄＵＴＰの組み込みが可能となる。かかるプライマーの例は下表１に示され、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳのフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１０８−ＫＲＳ−ｒｃＦ２６、ｉＳｘ−１０９−ＫＲＳ−ｒｃＲ２７）；（ｉｉ）ＢＲＡＦのフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１１８−ＢＲＦ−ｒｃＦ２６、ｉＳｘ−１１９−ＢＲＦ−ｒｃＲ２７）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１２８−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＦ６６、ｉＳｘ−１２９−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＲ６７；ｉＳｘ−１３０−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＦ６８、ｉＳｘ−１３１−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＲ６９）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１３８−ＴＰ５３ｅ６−ｒｃＦ７６、ｉＳｘ−１３９−ＴＰ５３ｅ６−ｒｃＲ７７）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１４８−ＴＰ５３ｅ７−ｒｃＦ８６、ｉＳｘ−１４９−ＴＰ５３ｅ７−ｒｃＲ８７）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１５８−ＴＰ５３ｅ８−ｒｃＦ９６、ｉＳｘ−１５９−ＴＰ５３ｅ８−ｒｃＲ９７）。
注１２：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成し、かつ／またはタンデムリピート生成物を生成した後、これらの生成物は、固体支持体上での後続の捕捉に好適な捕捉基を含有するより長いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより捕捉され得る。ストレプトアビジンコートした固体表面を介しての捕捉に好適なビオチン基を含有する、かかるプライマーの例は下表１に示されており、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０１３−ＫＲＳ−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０１４−ＫＲＳ−ｂｃＲ２）；（ｉｉ）ＢＲＡＦフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０２０−ＢＲＦ−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０２１−ＢＲＦ−ｂｃＲ２）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０３０−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０３１−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＲ２；ｉＳｘ−０３２−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＦ３、ｉＳｘ−０３３−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＲ４）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０５０−ＴＰ５３ｅ６−ｂｃＦ５、ｉＳｘ−０５１−ＴＰ５３ｅ６−ｂｃＲ６）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０６０−ＴＰ５３ｅ７−ｂｃＦ７、ｉＳｘ−０６１−ＴＰ５３ｅ７−ｂｃＲ８）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０７０−ＴＰ５３ｅ８−ｂｃＦ９、ｉＳｘ−０７１−ＴＰ５３ｅ８−ｂｃＲ１０）。
注１３：上記プライマー及びリンカー設計を用いて生成した上述の生成物を用いて、クラスターもしくはビーズ増幅、または市販機器のウェル、アドレス（ａｄｄｒｅｓｓ）、フローセル表面内での捕捉の後、以下のプライマー：（ｉ）ｉＬｘ−００３−ＰＥｓｑＰ１、対形成したエンド配列決定プライマー１；（ｉｉ）ｉＬｘ−００４−ＢｒＣｄＲ１、インデックスプライマー、バーコード読取り１；（ｉｉｉ）ｉＬｘ−００１−Ｐ５−ＢｒＣｄＲ２、バーコード読取り２；及び（ｉｖ）ｉＬｘ−００５−ＰＥｓｑＰ２、対形成したエンド配列決定プライマー２を用いて配列決定反応を開始してよい（プライマー配列については表１を参照）。
変形１．３：（例えば図１９〜２２を参照）。この変形において、短いリンカーをＤＮＡ標的にライゲーションする代わりに、短いモノヌクレオチド尾部を、末端トランスフェラーゼを用いて付加する（約１６０塩基の平均長のｃｆＤＮＡ）。残りのステップは図１３及び１５と同一である。末端トランスフェラーゼによりどれだけ多くの塩基が付加するかを調節することは困難である。したがって、オリゴヌクレオチド内のホモヌクレオチドトラクト（即ちポリＡ）の長さがハイブリダイゼーションＴｍを決定する。３’→５’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼを用いて、相補体と重なるまで、過剰のホモヌクレオチドトラクトのいくつかを取り除くこともまた必要となり得る。これはポリメラーゼによる伸長に好適である。
変形１．４：（例えば図２３〜２６を参照）。この変形において、ＤＮＡ標的（約１６０塩基の平均長のｃｆＤＮＡ）には何も付加されない。所望の領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズする。５’及び３’プローブ領域は、規則的な間隔（即ち１０、１２、または１５塩基）で任意のミスマッチを含有する。オリゴヌクレオチドプローブは、片端での任意のブロック基（図示した５’末端）、または任意の切断可能なリンカーを含有してよい。プローブ設計、並びに標的断片の開始及び末端塩基に応じて、標的配列の５’または３’末端の一部はハイブリダイズしない場合がある（図２３）。３’→５’及び５’→３’双方のヌクレアーゼ活性を含有する、ポリメラーゼまたはポリメラーゼセットを加えることにより、標的上でのオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長、及びオリゴヌクレオチドの３’プローブ領域に重なるまでの、標的の一本鎖３’末端の任意の分解（図２３）、続いて、固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を介しての、標的の３’末端の伸長が可能となる。
ハイブリダイゼーション条件は、標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域のハイブリダイゼーション、及び標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域のハイブリダイゼーションが、片側のみにハイブリダイズする標的よりも強化される（かつ環化しない非生産的な伸長生成物を形成する）となるように選択される。標的上でのオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長は、プローブの標的への会合を向上させる。ポリメラーゼ（またはＦｅｎヌクレアーゼ）の５’→３’ヌクレアーゼ切断活性が、本物の標的からライゲーション能のある５’ホスフェートを残して、標的の５’側がプローブの５’部分に相補的な位置にて、またはその付近にて、マッチする標的の５’重複塩基を切断する。ポリメラーゼはまた、鋳型で標的を用いてオリゴヌクレオチドプローブを伸長し、かつ、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図２３及び２２の左側）か、またはオリゴヌクレオチドの５’末端上のブロック基を切断しない（図２３及び２５の右側）かのいずれかである。
リガーゼは伸長３’末端をライゲーション能のある５’ホスフェートと共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する（右側）か、あるいは切断可能な結合にニックが導入される（例えば、ｄＵのＵＤＧ切断、続いてＡＰエンドヌクレアーゼによるアプリン骨格の切断、左側）。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られ、Ｎ−グリコシラーゼ及びＡＰリアーゼの両方として作用する）の任意付加を用いて、損傷した塩基を含有する標的にニック付加してよい。次にエキソヌクレアーゼを加え、固有の識別子配列と共に元の標的ＤＮＡを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物はローリングサークル増幅及び環状配列決定、または直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
本アプローチでは、５’プローブ領域と５’標的領域との間に適切なハイブリダイゼーション及び相補性が存在する場合にのみライゲーション能のある５’ホスフェートが生成されるように、標的依存性５’→３’及び３’→５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素または酵素セットが必要となる。５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有するポリメラーゼを用いる場合、課題は、ライゲーションステップなしで５’標的領域を破壊する（即ち、ニック翻訳）ような方法で、ポリメラーゼが５’プローブ領域に沿って短いリンカーを伸長するのを回避することである。元の標的ＤＮＡを破壊し、伸長ＤＮＡで置き換えるニック翻訳は、増殖し変異として誤って呼ばれてしまうポリメラーゼエラーを意図せず導入する場合がある。このことは、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼがライゲーション能のある接合部を作製するために必要となり、続いてポリメラーゼ解離、及びライゲーション現象により所望の環状ライゲーション生成物を生成するまで、大部分の伸長はヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによるものとなる、リガーゼの存在下にて分布伸長を行う条件下において、５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有するもの及び有しないものの両方のポリメラーゼの混合物（例えば１：２０の比率）を用いることで、最小限に抑えられ得る。図２５及び２６に示すオリゴヌクレオチドプローブ設計を用いることにより、３’→５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの必要性がなくなる場合がある。Ｔ４キナーゼを用いて、初期反応において標的の５’末端にホスフェートを付加することを用いて、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製し、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの必要性をなくすこともまたできる場合がある。
図９６〜９９は、２５０塩基領域にまたがる断片をカバーするための、異なるオリゴヌクレオチドプローブ設計のいくつかの例を提供する。これらの図においては、可能性のある標的断片（領域にまたがり１０塩基ごとにシフトする）はダークグレーの棒線で表され、灰色の棒線の中に薄い黒線を有するライトグレーの棒線のプローブ領域はミスマッチ塩基を示し、固有の識別子及び所望の患者識別子は太い黒線で表される。図１０４〜１０７は、約５００塩基の連続領域をカバーするための複数のプローブの設計方法を示す。
図９６において、上流５’プローブ領域（５０塩基）は標的塩基４０〜９０に相補的である一方、下流３’プローブ領域（５０塩基）は標的塩基１５０〜２００に相補的である。本実施例の目的のために、ミスマッチは１０塩基ごとに存在し、複合識別子配列は２０塩基である（１２塩基が配列識別子、及び８塩基が患者識別子）。標的が位置１〜１６０に存在する場合、このプローブを設計することで、１８０塩基生成物の環化が可能となり、そのうちの１１０塩基、即ち位置５０〜１６０が標的配列情報を提供する。標的が位置１１〜１７０に存在する場合、このプローブを設計することで、１８０塩基生成物の環化が可能となり、そのうちの１２０塩基、即ち位置５０〜１７０が標的配列情報を提供する。この設計により、それぞれ位置３１〜５１から開始し、かつ位置１９０〜２１０で終了する標的に関する、最大１４０塩基の配列情報がもたらされる。この図において、標的が位置８１〜２５０に存在する場合、環化生成物は形成されない。しかし、５’プローブ領域と標的の５’側との間のより短い領域が相補性を有することにより、いくつかの生成物が形成される場合があり、これらは常にハイブリダイズするとは限らないという懸念がある。
図９７において、上流５’プローブ領域（６０塩基）は標的塩基３０〜９０に相補的である一方、下流３’プローブ領域（６０塩基）は標的塩基１５０〜２１０に相補的である。この図は、５’及び３’プローブ領域が共により長いことを除いて、図９６に類似している。標的の最初の５例に関して、オリゴヌクレオチドがより長ければより多くの標的ＤＮＡの捕捉が可能となり、得られるサークルは、元の標的ＤＮＡに追加の２０塩基を含有する。
図９８及び９９は、図９６及び９７の傾向を拡張し、それぞれ７０及び８０塩基のプローブ領域を有する。上述のとおり、より長いプローブ領域では、より多くの標的が確実にカバーされる。ミスマッチは、プローブのポリメラーゼコピーから本物の標的を区別するのに役立つ。問題のＤＮＡが野生型塩基を含有する場合、その野生型塩基は標的及び標的に隣接するＤＮＡ配列から開始する。ＤＮＡがプローブ上にミスマッチ塩基の相補体を含有する場合、塩基はプローブから生成されたことが分かる。
図１０４〜１０７は、より大きな連続領域（本明細書では約５００塩基を示す）を配列決定するための、重複タイリング法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法を示す。図１０４は、図９６の設計を用いた４つの「連続」プローブを示し、図１０５〜１０７は、それぞれ図９７〜９９の設計を用いた４つの「連続」プローブを示す。領域にまたがって生成されることが可能な、可能性のある１６０ｂｐ断片（１０塩基ごとにシフト）を示す。下は、上のそれらの全ての断片をカバーするオリゴヌクレオチドを示す。標的内の領域がライトグレーである場合、信頼できる配列情報は提供されない。標的内の領域がダークグレーである場合、良好な配列情報を提供するはずである。本図面において、一覧で示したプローブは＃１、＃２、＃３、＃４等として順次示される。多重化伸長−ライゲーションステップについて、奇数プローブ＃１、＃３、＃５は第１のオリゴヌクレオチドプールセットにプールし、続いて偶数プローブ＃２、＃４、＃６を第２のプールセットにプールする。本アプローチにより、隣接オリゴヌクレオチド（即ち＃１及び＃２）が同一標的鎖への結合について競合することが避けられる。伸長−環化が発生すると、２つのプールが組み合わされて、エキソヌクレアーゼ、並びにローリングサークル増幅及び環状配列決定等の後続ステップ、あるいは、任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いての、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に進むことができる。
既知の遺伝子（例えばＢｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、単一の塩基変異、小挿入、または小欠失変異（１％〜０．０１％で存在する場合）の非常に高感度な検出の詳細プロトコール：
１．４．ａ．ｃｆＤＮＡ（または例えば、約１５０ｂｐに剪断した、ＣＴＣから単離したゲノムＤＮＡ）から開始して、（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却することにより（例えば４０℃または４５℃で２時間）、オリゴヌクレオチドの、所望の断片の相補領域へのハイブリダイゼーションを可能にする。この反応の温度を下げ、ＤＮＡポリメラーゼ（即ち、強力な３’→５’プルーフリーディング活性を有するＴ４ポリメラーゼ）及びＤＮＡポリメラーゼ１（弱い３’→５’プルーフリーディング活性、しかし良好な５’→３’活性を有する）、並びに任意でクレノウ断片（５’→３’活性なし）、ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４リガーゼまたは大腸菌リガーゼ）、及びｄＮＴＰを、アニーリングステップの後に加える。２３℃または３０℃での伸長及びライゲーションをさせ、任意で温度を上げ（例えば３７℃）、伸長及びライゲーションを確実に完了させて環状生成物を生成する。
１．４．ｂ．任意で、切断可能な結合にてオリゴヌクレオチドプローブを切断する（例えば、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断したＵ）。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいはリンカー配列をプライマー結合部位として用いた、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドは任意のブロック基を５’側に含有し、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げてよい。あるいは、切断可能な結合は元のオリゴヌクレオチドに含まれてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：Ｔ４ポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）とＤＮＡポリメラーゼＩ（弱い３’→５’プルーフリーディング活性、しかし良好な５’→３’活性）の１：２０混合物、及びクレノウ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＤＮＡポリメラーゼＩ）を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注４：ライゲーション伸長プロセスは２つ以上の反応管内で実施してよい。第１のセットは「奇数」番号のプローブを含有し、第２のセットは「偶数」番号のプローブを含有することで、プローブが同一の標的ＤＮＡ鎖に関して競合することを回避する。別々の反応物をその後にプールしてよい。
注５：プローブ配列内で規則的な間隔（即ち１０、１２、または１５塩基）のミスマッチ塩基を用いることにより、プローブ鎖をコピーすることにより生成した配列から本物の標的ＤＮＡ配列を区別することが可能になる。以下の注６で一覧にするオリゴヌクレオチドは、標的配列領域内で、およそ１５塩基ごとにミスマッチ塩基を含有する。
注６：市販の機器で用いるための「バーコード」または「インデックス」配列を含む、より長いリンカー配列と用いるためのオリゴヌクレオチドを設計する場合、ＰＣＲ、鎖置換増幅、またはこれらの組み合わせを用いて、オリゴヌクレオチドをアセンブルする必要があり得る。ＰＣＲの間に、ＵＤＧによる後続の切断に好適な、ＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いてウラシルに組み込む。リバース鎖プライマーをリン酸化して、λエキソヌクレアーゼまたは類似の５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて分解を可能にすることができる。ｄＡ３０配列をフォワードプライマーの５’末端に付加し、鎖置換増幅を可能にすることができる。ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の配列決定領域のアセンブリ増幅に好適なオリゴヌクレオチドの例は下表１に示されており、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−１０３−ｂｋＡ３０−ＫＲＳＦ２１、ｉＳｘ−１０４−ｐＫＲＳＦ２２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１０５−ｐＫＲＳＦ２３、及びｉＳｘ−１０６−ｐＫＲＳＲ２４）並びに（ｉＳｘ−１０２−ｐＫＲＳＦ２０、ｉＳｘ−１０４−ｐＫＲＳＦ２２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１０５−ｐＫＲＳＦ２３、ｉＳｘ−１０７−ｂｋＡ３０−ＫＲＳＲ２５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｉｉ）ＢＲＡＦフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−１１３−ｂｋＡ３０−ＢＲＦ−Ｆ２１、ｉＳｘ−１１４−ｐＢＲＦ−Ｆ２２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１１５−ｐＢＲＦ−Ｆ２３、及びｉＳｘ−１１６−ｐＢＲＦ−Ｒ２４）並びに（ｉＳｘ−１１２−ｐＢＲＦ−Ｆ２０、ｉＳｘ−１１４−ｐＢＲＦ−Ｆ２２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１１５−ｐＢＲＦ−Ｆ２３、ｉＳｘ−１１７−ｂｋＡ３０−ＢＲＦ−Ｒ２５及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−１２３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ５Ｆ６１、ｉＳｘ−１２４−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ６２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１２５−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ６３、及びｉＳｘ−１２６−ｐＴＰ５３ｅ５Ｒ６４）並びに（ｉＳｘ−１２２−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ６０、ｉＳｘ−１２４−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ６２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１２５−ｐＴＰ５３ｅ５Ｆ６３、ｉＳｘ−１２７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ５Ｆ６５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−１３３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ６Ｆ７１、ｉＳｘ−１３４−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ７２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１３５−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ７３、及びｉＳｘ−１３６−ｐＴＰ５３ｅ６Ｒ７４）並びに（ｉＳｘ−１３２−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ７０、ｉＳｘ−１３４−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ７２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１３５−ｐＴＰ５３ｅ６Ｆ７３、ｉＳｘ−１３７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ６Ｆ７５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−１４３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ７Ｆ８１、ｉＳｘ−１４４−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ８２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１４５−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ８３、及びｉＳｘ−１４６−ｐＴＰ５３ｅ７Ｒ８４）並びに（ｉＳｘ−１４２−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ８０、ｉＳｘ−１４４−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ８２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１４５−ｐＴＰ５３ｅ７Ｆ８３、ｉＳｘ−１４７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ７Ｒ８５、及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバース標的領域（ｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０、ｉＳｘ−１５３−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ８Ｆ９１、ｉＳｘ−１５４−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ９２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１５５−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ９３、及びｉＳｘ−１５６−ｐＴＰ５３ｅ８Ｒ９４）並びに（ｉＳｘ−１５２−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ９０、ｉＳｘ−１５４−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ９２、ｉＳｘ−１００−７０５Ｆ、ｉＳｘ−１０１−５０２Ｒ、ｉＳｘ−１５５−ｐＴＰ５３ｅ８Ｆ９３、ｉＳｘ−１５７−ｂｋＡ３０−ＴＰ５３ｅ８Ｒ９５及びｉＳｘ−００１−ｂｋＡ３０）。
注７：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成した後、これらの領域を、標的特異的プライマーを用いたローリングサークル増幅に供し、タンデムリピート生成物を生成してよい。これらの生成物は、固体支持体上での標的特異的オリゴヌクレオチドによる所望標的の捕捉前、または後のいずれかに生成してよい（以下の注８を参照）。プライマーは１’，−２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）等の内部で切断可能なヌクレオチド塩基、または脱塩基部位を含有することができ、ローリングサークル増幅の間に、コンタミネーションのキャリーオーバーに対する保護のために、ｄＵＴＰの組み込みが可能となる。かかるプライマーの例は表１（下）に示されており、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳのフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１０８−ＫＲＳ−ｒｃＦ２６、ｉＳｘ−１０９−ＫＲＳ−ｒｃＲ２７）；（ｉｉ）ＢＲＡＦのフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１１８−ＢＲＦ−ｒｃＦ２６、ｉＳｘ−１１９−ＢＲＦ−ｒｃＲ２７）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１２８−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＦ６６、ｉＳｘ−１２９−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＲ６７；ｉＳｘ−１３０−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＦ６８、ｉＳｘ−１３１−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＲ６９）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１３８−ＴＰ５３ｅ６−ｒｃＦ７６、ｉＳｘ−１３９−ＴＰ５３ｅ６−ｒｃＲ７７）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１４８−ＴＰ５３ｅ７−ｒｃＦ８６、ｉＳｘ−１４９−ＴＰ５３ｅ７−ｒｃＲ８７）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１５８−ＴＰ５３ｅ８−ｒｃＦ９６、ｉＳｘ−１５９−ＴＰ５３ｅ８−ｒｃＲ９７）。
注８：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成し、かつ／またはタンデムリピート生成物を生成した後、これらの生成物は、固体支持体上での後続の捕捉に好適な捕捉基を含有するより長いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより捕捉され得る。ストレプトアビジンコートした固体表面を介しての捕捉に好適な、ビオチン基を含有するかかる捕捉オリゴヌクレオチドの例は表１（下）に示されており、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０１３−ＫＲＳ−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０１４−ＫＲＳ−ｂｃＲ２）；（ｉｉ）ＢＲＡＦフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０２０−ＢＲＦ−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０２１−ＢＲＦ−ｂｃＲ２）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０３０−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０３１−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＲ２；ｉＳｘ−０３２−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＦ３、ｉＳｘ−０３３−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＲ４）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０５０−ＴＰ５３ｅ６−ｂｃＦ５、ｉＳｘ−０５１−ＴＰ５３ｅ６−ｂｃＲ６）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０６０−ＴＰ５３ｅ７−ｂｃＦ７、ｉＳｘ−０６１−ＴＰ５３ｅ７−ｂｃＲ８）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０７０−ＴＰ５３ｅ８−ｂｃＦ９、ｉＳｘ−０７１−ＴＰ５３ｅ８−ｂｃＲ１０）。
注９：上記プライマー及びリンカー設計を用いて生成した上述の生成物を用いて、クラスターもしくはビーズ増幅、または市販機器のウェル、アドレス、フローセル表面内での捕捉の後、以下のプライマー：（ｉ）ｉＬｘ−００３−ＰＥｓｑＰ１、対形成したエンド配列決定プライマー１；（ｉｉ）ｉＬｘ−００４−ＢｒＣｄＲ１、インデックスプライマー、バーコード読取り１；（ｉｉｉ）ｉＬｘ−００１−Ｐ５−ＢｒＣｄＲ２、バーコード読取り２；及び（ｉｖ）ｉＬｘ−００５−ＰＥｓｑＰ２、対形成したエンド配列決定プライマー２を用いて配列決定反応を開始してよい（プライマー配列は以下の表１に提供する）。
予測実施例２−血漿ＤＮＡ内でのプロモーター高メチル化（存在する場合、１％〜０．０１％）に対する、高感度メチル化マーカー検出
プロモーターのメチル化は、遺伝子発現を制御するのに重要な役割を果たす。遺伝子用プロモーターは多くの場合、「ＣｐＧアイランド」として知られている、ＣｐＧ含量が高い領域を有する。プロモーターＣｐＧアイランドを有する癌抑制因子遺伝子等の遺伝子がオフになった場合、プロモーター及び１番目のエクソン領域内の多くのＣｐＧ配列のメチル化が、通常伴う。メチル化変化を検出する従来のアプローチは２つ存在する。
第１は、メチル感受性制限酵素を利用することであり、ここでは、非メチル化である場合にゲノムＤＮＡが切断され、その後、該部位に隣接するプライマーを用いたＰＣＲ増幅が続く。ＤＮＡがメチル化された場合には増幅され、非メチル化である場合は増幅しない。この技術は、分解が必ずしも完了しないという欠点を有し、更に、同一配列の大部分が非メチル化である場合、血漿検出の場合と同様に、低量のメチル化ＤＮＡは正確には発見されない。
第２のアプローチは「メチル特異的ＰＣＲ」として知られており、これは、非メチル化ＣをＵに転換する、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理に基づいている。塩基がメチル化される場合、その塩基は転換されない。メチル特異的ＰＣＲは、非メチル化である場合ではなく、メチル化された場合に得られる転換配列に対して特異的であるプライマー及びＴａｑＭａｎプローブを用いることに基づく。メチル特異的ＰＣＲは、非常に少ない量のメチル化ＤＮＡを検出可能であるという利点を有する。本技術を更に改良する場合は、亜硫酸水素塩で転換した非メチル化ＤＮＡの配列にハイブリダイズするブロッキングオリゴヌクレオチドを用いるため、亜硫酸水素塩で転換したメチル化ＤＮＡの増幅を強化する。欠点は、亜硫酸水素塩処理により、元のＤＮＡがニック付加され、完全性が５０％〜９０％破壊されるということである。血漿からのＤＮＡ（約１６０塩基の平均長を有する）から開始する場合、これは深刻な問題となり得る。更に、ＣをＵに転換することで、配列の複雑性が４塩基から３塩基に低下する。ここで、転換した配列はよりＡ：Ｔリッチであるので、より長いＰＣＲプライマーもまた必要となる。したがって、プライマーは密接に関係している正しくない配列にてよりミスプライミングする可能性が高いため、非特異的増幅が起こり得る。これには通常、ネステッドＰＣＲアプローチが必要となり、このアプローチはキャリーオーバーコンタミネーションのリスクがあり、通常多重増幅には理想的でない。
アプローチの概要：ここでの考えは、対象領域の隣接制限酵素切断部位にメチル化を含有する標的ＤＮＡの各断片を正確にコピーし、固有の識別子配列及び所望の患者識別子を付加し、後続の配列決定のためにこれらを環化することである。オリゴヌクレオチドＤＮＡ鎖は環化され配列決定される。本アプローチは、必要な場合にコピー数情報、及び必要な最少の配列決定によるメチル化データの両方を得るという利点をもたらす。
隣接部位におけるメチル化の検出
変形２．１：（例えば図２７を参照）。この変形において、ＤＮＡはまずＨｉｎＰ１Ｉにより切断され、非メチル化標的の量を著しく低下させる。所望のメチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、上流プローブの３’末端、及び下流プローブのブロック５’またはライゲーション能のない末端の両方に非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉを含有する。３’末端は、ポリメラーゼによる伸長を防止するために標的に対するミスマッチを含有するか、ブロックされている。ＨｉｎＰ１Ｉは、標的ＤＮＡがメチル化されている場合、伸長能のある３’ＯＨ末端、及びライゲーション能のある５’ホスフェートを遊離させ、プローブ標的ハイブリッドの非メチル化鎖にニック付加する（図２７の左側）。標的が非メチル化である場合、鎖の両方が切断され、標的鋳型が破壊される（図２７の右側）。鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方を欠くリガーゼ及びポリメラーゼを加えることにより、メチル化標的上のプローブの遊離３’末端の伸長、続いて、プローブの遊離５’末端へのライゲーションによる、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列の両方を含有する環状生成物の形成が可能となる。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーターのメチル化の高感度検出のための詳細プロトコール：
２．１．ａ．単離ｃｆＤＮＡ、またはメチル強化ＤＮＡを、１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例では、ＨｉｎＰ１Ｉを用いる。エンドヌクレアーゼを熱失活させ（６５℃で１５分間）、ＤＮＡを変性させる（９４℃で１分間）。
２．１．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合部位、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば４０〜５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドはプローブの３’及び５’末端の両方付近に非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ配列を含有し、これらの配列は、ポリメラーゼまたはリガーゼのいずれかに対する基質とならないように、ミスマッチを含有するか、ブロック基を含有するか、またはリン酸化を欠いているかのいずれかに設計されている。３７℃まで冷却してＨｉｎＰ１Ｉを加えることで、標的ＤＮＡがメチル化されている場合には、伸長能のある３’ＯＨ末端、及びライゲーション能のある５’ホスフェートを遊離させて、プローブ標的ハイブリッドの非メチル化鎖にニック付加する。エンドヌクレアーゼを熱失活させる（６５℃で１５分間）。ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、及び熱安定性リガーゼ（好ましくは株ＡＫ１６Ｄから）、ｄＮＴＰを、アニーリングステップの後で、または制限エンドヌクレアーゼによるニッキングステップの後で加える。５０℃にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
２．１．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドの５’末端がライゲーションに適さないように、オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを欠いているか、または５’側上に任意のブロック基を含有してよい。オリゴヌクレオチドの３’末端が標的上での伸長に適さないように、オリゴヌクレオチドは３’ミスマッチ、３’ヘアピン、または３’側上に任意のブロック基を含有してよい。両方の場合において、ブロックは、メチル化標的にハイブリダイズした場合にプローブの制限酵素ニック付加により遊離されるだけである。
注２：上記実施例では、ＫｌｅｎＴａｑ、鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方欠くポリメラーゼを用いる。オリゴヌクレオチドが３’側上にブロック基を有する場合、３’→５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることができる一方、ブロック基が５’側にある場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることができる。
注３：本実施例において、制限エンドヌクレアーゼ（ＨｉｎＰ１Ｉ）は、６５℃にて１５分間インキュベーションすることにより熱失活される。代替アプローチ（または、ＢｓｔＵＩ等の熱失活酵素を用いる場合）は、制限酵素に、認識エンドヌクレアーゼによる再切断に対する耐性を付与するヌクレオチド類似体（即ち５−メチル−ｄＣＴＰ、またはα−チオホスフェートｄＣＴＰ）により伸長することである。ヌクレオチド類似体（即ちＨｉｎＰ１Ｉ）を用いて、オリゴヌクレオチドの５’側の制限酵素切断部位が耐性形態に転換されない場合、このケースは、５’側にブロック基を有するオリゴヌクレオチド、及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を含有するポリメラーゼを用いることにより解決され得る。まず、制限エンドヌクレアーゼのニック付加活性によりブロック基が取り除かれる。続いて、ヌクレオチド類似体を用いた伸長ステップの間に、５’→３’ヌクレアーゼ活性を含有するポリメラーゼが認識部位を通してニック翻訳を行い、ニックを、部位に更なる切断への耐性を付与するヌクレオチドと置き換える。
注４：上記実施例において、更に、認識配列を過ぎたニック翻訳を最小限に抑えるために、５’プローブ部位の制限酵素切断部位に直接隣接するオリゴヌクレオチドの部分を、チオホスフェート結合を含有させて合成してよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注５：オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、作製不可能な３’及び５’末端のライゲーションの後でも、標的にハイブリダイズしたままとなるように設計される。標的がプローブ部分と重複する更なる制限酵素切断部位を含有する場合、プローブはこれらの位置で５−メチル−ｄＣにより合成され得る。標的がこれらの位置でメチル化される場合、その部位は標的及びオリゴヌクレオチドプローブの両方がメチル化されるため、ニック耐性を有することとなる。しかし、標的がこれらの位置で非メチル化である場合、部位は標的鎖上でニック付加されるため、（短くなった）鎖へのプローブハイブリダイゼーションが妨げられる。
注６：環状生成物は、（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列に相補的なタンデムリピートの作製、及び、次世代配列決定を用いた後続の標的識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注７：オリゴヌクレオチドプローブが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベース。
現在のＴＣＧＡデータベースは、通常、及び多くの異なる組織部位の腫瘍の両方に関する、ヒトゲノムの約４５０，０００ＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を含有する。しかし、このデータベースは隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位のメチル化状態を全てカバーしておらず、また、ゲノムＤＮＡの同一断片上でメチル化された両方の部位を区別しない。
したがって、上記アッセイ方法を最大限に有用にするため、隣接メチル感受性制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベースを作成するのが役に立つ。かかるアプローチの１つを、図２８に示す。
アプローチの概要：ここでの考えは、断片の両末端が、元のゲノムＤＮＡ内でメチル化されている制限酵素切断部位を含有する場合のみに形成可能である小断片のライブラリーを生成することである。断片は、ここではライゲーションを受けて追加のステップ及び後続の配列決定用の基質となる断片多量体を作製することができる、任意の固有識別子及び任意の患者識別子配列が付加されたリンカーを有する。
変形２．１．１：（例えば図２８を参照）。本アプローチは、ゲノム全体での、隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣ＊ＧＣ）におけるメチル化の発見方法を示す。出発材料は、約１６０ｂｐの平均長さのインタクトなゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡのいずれかとすることができる。ＨｉｎＰ１ＩでゲノムＤＮＡを切断し、非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位にてＤＮＡを断片化する。ライゲーションされていない末端にブロック５’末端を含有する短いリンカーを、標的断片の、ＨｉｎＰ１Ｉで切断した末端及び修復末端が埋められた両端上にライゲーションする。（これらのリンカーはライゲーション接合部にてＨｉｎＰ１Ｉ部位を再び作製しない。）非メチル化ｄＮＴＰ及び５’ブロックプライマーを用いた数ラウンドのＰＣＲ増幅により、残存するＨｉｎＰ１Ｉ部位がここでは非メチル化である生成物が生成される。次に、これらの生成物をＨｉｎＰ１Ｉで切断する。ＨｉｎＰ１Ｉで切断した場合に、元の標的内でメチル化されていた隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有するリンカーを、ＨｉｎＰ１Ｉが切断した末端が埋められた、新しく生成した断片にライゲーションする。これらの新しいリンカーは、（図２８に＊＊＊＊として示すように）、ライゲーションされていない側にブロック３’末端またはチオホスフェート含有骨格のいずれかを含有する。二本鎖３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加える際に、片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片が分解され、一本鎖となる。３’ブロック基またチオホスフェートが３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するので、両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながらの、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。例えば、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計し、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。ライゲーション生成物は、任意の固有の識別子及び／または患者識別子配列を有する、標的ＤＮＡ中で元々メチル化されていた隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列で成る。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベースを生成するための詳細プロトコール：
２．１．１．ａ．単離ゲノムＤＮＡ、またはメチル強化ＤＮＡを、１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例では、ＨｉｎＰ１Ｉを用いる。任意で、エンドヌクレアーゼを熱失活させる（６５℃で１５分間）。ライゲーションされていない末端の５’末端上でブロックされているリンカーにライゲーションする。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。（以下の注１を参照。）
２．１．１．ｂ．５’ブロックプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＨｉｎＰ１Ｉ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
２．１．１．ｃ．ＨｉｎＰ１Ｉを加えてかかる部位を含有する生成物を切断する。ＨｉｎＰ１Ｉで切断した場合に、元の標的内でメチル化されていた隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。Ｔａｑポリメラーゼからの残存ポリメラーゼは２塩基オーバーハングを埋める（任意で温度を６０℃に上げる）。ｄＮＴＰを（スピンカラムにより）取り除き、ｄＡＴＰのみを戻して単一の３’Ａオーバーハングを生成する。
２．１．１．ｄ．Ｔ４リガーゼを用いて、ライゲーション末端上に単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する（任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有する）リンカーを、切断して埋めた標的配列の単一の塩基Ａオーバーハングに付加する。リンカーのライゲーションされていない５’側は５’オーバーハングを含有し、任意でリン酸化されていない。リンカーのライゲーションされていない３’側は３’ブロック基及び／またはチオホスフェートを含有し、３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する。
２．１．１．ｅ．３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加え３７℃で分解する。片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片を分解し、一本鎖とする。両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。エキソヌクレアーゼはまた、リンカーを一本鎖にもする。任意で、スピンカラムにより所望の断片から分解生成物を取り除く。
２．１．１．ｆ．（ｉ）Ｔ４キナーゼを用いた５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しての、マッチする５’重なり合った塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する、標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を有する、標的断片の多量体を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：リンカーのライゲーションに関して：単一の塩基Ｔオーバーハングを含有するリンカーによるリンカーライゲーションの前に、末端を埋めて修復し、Ａテーリングすることに代えて、ＨｉｎＰ１Ｉにより生成した５’ＣｐＧオーバーハングを利用することができる。クレノウ（エキソ）及びｄＣＴＰを用いて、単一の塩基３’Ｃオーバーハングを生成することができる。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｃオーバーハングを有する。あるいは、ＣＧオーバーハングを有するリンカーを、部位の埋め込みなしに直接用いてもよいが、これらがセルフライゲーションする場合、ＡｃｉＩ部位（ＡＡ＾ＣＧＴＴ）を作製するようにリンカーを設計する。したがって、ゲノムＤＮＡは、リンカー及びＴ４リガーゼの両方の存在下において、３７℃でＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、ＡｃｉＩ部位（ＡＡ＾ＣＧＴＴ）で切断される。互いの断片へのライゲーションはＨｉｎＰ１Ｉにより切断され、互いのリンカーへのライゲーションはＡｃｉＩにより切断されるが、リンカーの断片末端へのライゲーションはいずれかの酵素によっても切断されないため、この３−酵素ライゲーション混合は「生化学的選択」として機能し、所望の生成物を強化する。
注２：ブロックリンカーの３’末端は、ブロックに対して内部の位置にてウラシルまたはアプリン（ＡＰ）部位を含有するように合成され、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼでの処理の後、ライゲーション能のある３’末端を遊離させる。
注３：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注４：ライゲーションは、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）を用いることにより、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体の形成に有利となり、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。
亜硫酸水素塩処理を用いた、隣接部位におけるメチル化の検出
上記アプローチは、隣接したメチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を、ＤＮＡ断片内でのメチル化の代わりとして含有する断片の識別及び計数に理想的である。しかし、いくつかの用途に関して、所与の領域内での個々のＣｐＧ部位のメチル化状態を識別することが重要である。したがって、投入ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することが必要となり得、これはメチルＣではなく通常のＣをＵに転換する。
亜硫酸水素塩を用いるアプローチの概要：ここでの考えは、対象の領域に関する配列（Ｇ＊ＣＧＧ）の隣接ＡｃｉＩ制限酵素切断部位がメチル化されている標的ＤＮＡの各断片を確実にコピーし、亜硫酸水素塩で処理し、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び所望の患者識別子を付加し、後続の配列決定のためにこれらを環化することである。オリゴヌクレオチドＤＮＡ鎖は環化され配列決定される。本アプローチは、必要な場合にコピー数情報、及び必要な最少の配列決定によるメチル化データの両方を得るという利点をもたらす。
ここでの考えは、ＡｃｉＩに対する認識配列の固有の性質を利用する。酵素は１方向において、３．５塩基の認識配列Ｇ＾ＣＧＧを切断し、第２方向においてＣ＾ＣＧＣを切断する。メチル化ＡｃｉＩ部位が第１の方向において亜硫酸水素塩で処理される場合（Ｇ＊ＣＧＧ）、この部位は変化しないままである（Ｇ＊ＣＧＧ）が、第２の方向において（Ｃ＊ＣＧＣ）は、変化が起こる（Ｕ＊ＣＧＵ、ここで＊Ｃは５−ｍｅＣを表す）。数ラウンドのＰＣＲ増幅の後、５−メチルＣはＣに転換されるが、ＵはＴに転換される。第１方向のメチル化ＡｃｉＩ部位はＧＣＧＧとして残り、第１方向の非メチル化ＡｃｉＩ部位はＧＴＧＧに転換され、第２方向のメチル化ＡｃｉＩ部位はＴＣＧＴに転換され、第２方向の非メチル化ＡｃｉＩ部位はＴＴＧＴに転換される。ＡｃｉＩで切断した場合、元の標的内でメチル化されている隣接ＡｃｉＩ部位のみが、３’及び５’末端の両方でライゲーション能のある断片を作製する。
本アプローチの１つの固有の特長は、亜硫酸水素塩による転換が２つの非相補鎖を作製するということである。したがって、トップ鎖は隣接Ｇ＊ＣＧＧ配列を有し、介在Ｃ＊ＣＧＣ配列が存在する場合でさえも、この配列はＵ＊ＣＧＵに転換され、ＰＣＲの後ＴＣＧＴに転換されてＡｃｉＩ部位としては認識されないため、問題はない。更に、介在Ｇ＊ＣＧＧまたはＧＣＧＧ（即ち非メチル化）部位が存在する場合でさえも、この部位は一本鎖領域に存在するため、ＡｃｉＩによりニック付加されない。更に良いことには、形式Ｃ＊ＣＧＣのトップ鎖上の配列はボトム鎖上でＧ＊ＣＧＧとなる。ボトム鎖はメチル化状態を確認するためにもまた用いられ得、かつ２つの配列はここでは非常に異なっているため、トップ及びボトム鎖へのオリゴヌクレオチドプローブは互いにハイブリダイズせず、転換標的にのみハイブリダイズする。したがって、本アプローチでは、トップ及びボトム鎖の両方からの情報を用いて、プロモーター上の詳細のメチル化状態を得ることが可能になる。
ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化ＤＮＡを、制限酵素により切断されないが、メチル化されている場合に同じ制限酵素により依然として切断可能である配列に転換する原理は、いくつかの更なる制限酵素切断部位まで拡大することができる。例えば、ＢｓｔＵＩ部位（ＣＧ＾ＣＧ）は、亜硫酸水素塩転換により両方のＣＧ部位がメチル化された（即ち、＊ＣＧ＊ＣＧ）後に、同一配列を保持する。同様に、Ｈｐｙ９９Ｉ部位（ＣＧＷＣＧ＾）もまた、亜硫酸水素塩転換により両方のＣＧ部位がメチル化された（＊ＣＧＷ＊ＣＧ）後に、同一配列を保持する。異なる種類の例では、ＨｐｙＣＨ２ＩＶ（Ａ＾ＣＧＴ）は、亜硫酸水素塩転換の後、形式Ａ＊ＣＧＴ及びＡ＊ＣＧＣの両方の配列を切断し、共にＡ＊ＣＧＴになる。したがって、ＡｃｉＩに関して以下で考慮する変形は、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＵＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ２ＩＶ及びこれらのイソ制限酵素限定されないが、これらに対して同様に有効である。
変形２．２：（例えば図２９〜３０を参照）。この変形において、５−メチルＣを含有する短いリンカーが、ＤＮＡの末端にライゲーションされる。次にＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、これにより鎖が非相補性となるため、一本鎖となる。数ラウンドのＰＣＲ増幅により、残存するＡｃｉＩ部位がここでは非メチル化である生成物が生成される。これらの生成物を次に、ＡｃｉＩで切断する。元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、ここでは両方の末端でライゲーション能のある断片を生成する。所望の領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方を欠くリガーゼ及びポリメラーゼを加えることにより、非メチル化標的の３’末端の伸長、続いて、標的の５’末端へのライゲーションを行い、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成することが可能となる。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーターのメチル化の高感度検出のための詳細プロトコール：
２．２．ａ．５−メチルＣを含有するリンカーへのライゲーションを行い、亜硫酸水素塩による転換後に配列を保持する。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
２．２．ｂ．プライマー類、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＡｃｉＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
２．２．ｃ．ＡｃｉＩを加えて、かかる部位を含有する生成物を切断する。ＡｃｉＩで切断された場合、元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。Ｔａｑポリメラーゼからの残存ポリメラーゼは２塩基オーバーハングを埋める（任意で温度を６０℃に上げる）。
２．２．ｄ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合部位、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを加えて、５０℃にて伸長及びライゲーションを可能にし、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
２．２．ｅ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドの５’末端がライゲーションに適さないように、オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを欠いているか、または５’側上に任意のブロック基を含有してよい。
注２：上記実施例では、ＫｌｅｎＴａｑ、鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方欠くポリメラーゼを用いる。オリゴヌクレオチドが５’側にブロック基を有する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることができる。
注３：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注４：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
変形２．２において、ポリメラーゼ及びリガーゼの両方を用いて、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する共有結合で閉じた環を形成する。これは、リガーゼのみを用いても達成可能である。
変形２．３：（例えば図３１〜３２を参照）。この変形において、５−メチルＣを含有する短いリンカーを、ＤＮＡの末端にライゲーションする。次にＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、これにより鎖が非相補性となるため、一本鎖となる。数ラウンドのＰＣＲ増幅により、残存するＡｃｉＩ部位がここでは非メチル化である生成物が生成される。これらの生成物を次に、ＡｃｉＩで切断する。元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、ここでは両方の末端でライゲーション能のある断片を生成する。所望の非メチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖に相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１のオリゴヌクレオチドプローブ鎖に相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対を標的にハイブリダイズする。リガーゼを加えることにより、標的の３’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端へのライゲーション、及び標的の５’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端へのライゲーションが可能となり、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成する。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
２．３．ａ．５−メチルＣを含有するリンカーへのライゲーションを行い、亜硫酸水素塩による転換後に配列を保持する。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
２．３．ｂ．プライマー類、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＡｃｉＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
２．３．ｃ．ＡｃｉＩを加えて、かかる部位を含有する生成物を切断する。ＡｃｉＩで切断された場合、元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。Ｔａｑポリメラーゼからの残存ポリメラーゼは２塩基オーバーハングを埋める（任意で温度を６０℃に上げる）。
２．３．ｄ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む）部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対の存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。熱安定性リガーゼ（好ましくは株ＡＫ１６Ｄから）を加え、６０℃でライゲーションさせて環状生成物を生成する。
２．３．ｅ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注２：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位（ＡｃｉＩ部位）におけるメチル化状態のデータベース。
現在のＴＣＧＡデータベースは、通常、及び多くの異なる組織部位の腫瘍の両方に関する、ヒトゲノムの約４５０，０００ＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を含有する。しかし、このデータベースは隣接ＡｃｉＩ部位のメチル化状態を全てカバーしておらず、また、ゲノムＤＮＡの同一断片上でメチル化された両方の部位を区別しない。
したがって、上記アッセイ方法を最大限に有用にするため、同一方向（ＧＣＧＧ）の隣接ＡｃｉＩ制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベースを作成することが役に立つ。本アプローチはまた、他方の方向（ＣＣＧＣ）の隣接ＡｃｉＩ制限酵素切断部位も含む。これは、この部位が亜硫酸水素塩転換の後、反対鎖ではＧＣＧＧとなるためである。かかるアプローチの１つを、図３３に示す。
アプローチの概要：ここでの考えは、断片の両末端が、元のゲノムＤＮＡ内でメチル化されている制限酵素切断部位を含有する場合のみに形成可能である小断片のライブラリーを生成することである。ここでの考えは、ＡｃｉＩに対する認識配列の固有の性質を利用する。酵素は１方向において３．５塩基認識配列Ｇ＾ＣＧＧ、かつ他方の方向でＣ＾ＣＧＣを切断する。メチル化ＡｃｉＩ部位から開始し、亜硫酸水素塩で処理する。第１の方向（Ｇ＊ＣＧＧ）において、部位は変化しないままであるが、第２の方向において、部位は変化する（Ｕ＊ＣＧＵ、＊Ｃは５−ｍｅＣ）。数ラウンドのＰＣＲ増幅の後、第１の部位はＡｃｉＩにより認識されるＧＣＧＧに転換されるが、第２の部位は切断されないＴＣＧＴに転換される。したがって、亜硫酸水素塩処理の後、ＡｃｉＩを用いて、固有のメチル化配列を識別することができる。断片は、ここではライゲーションを受けて追加のステップ及び後続の配列決定用の基質となる断片多量体を作製することができる、任意の固有識別子及び任意の患者識別子配列が付加されたリンカーを有する。
変形２．３．１：（例えば図３３を参照）。本アプローチは、ゲノム全体での、隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣ＊ＧＧ）におけるメチル化の発見方法を示す。出発材料は、約１６０ｂｐの平均長さのインタクトなゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡのいずれかとすることができる。ライゲーションされていない末端にブロック５’末端を含有する短いリンカーを、ＤＮＡの末端にライゲーションする。亜硫酸水素塩によりＤＮＡを処理し、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。非メチル化ｄＮＴＰ及び５’ブロックプライマーを用いた数ラウンドのＰＣＲ増幅により、残存するＡｃｉＩ部位がここでは非メチル化である生成物が生成される。これらの生成物を次に、ＡｃｉＩで切断する。ＡｃｉＩで切断された場合、元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有するリンカーを、新しく生成した、ＡｃｉＩが切断した部位が埋められた断片にライゲーションする。これらの新しいリンカーは、ライゲーションされていない末端に、ブロック３’末端、またはチオホスフェート含有骨格（図３３に＊＊＊＊として示す）を含有する。二本鎖３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加える際に、片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片が分解され、一本鎖となる。３ ’ブロック基またチオホスフェートが３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するので、両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながらの、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。例えば、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計し、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている同一方向（即ちＧＣＧＧ）に、隣接ＡｃｉＩ配列を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
隣接ＡｃｉＩ制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベースを生成するための詳細プロトコール：
２．３．１．ａ．ライゲーションされていない末端の５’末端上でブロックされているリンカーにライゲーションする。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加するように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
２．３．１．ｂ．５’ブロックプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＡｃｉＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
２．３．１．ｃ．ＡｃｉＩを加えて、かかる部位を含有する生成物を切断する。ＡｃｉＩで切断された場合、元の標的内でメチル化された隣接ＡｃｉＩ部位（ＧＣＧＧ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。Ｔａｑポリメラーゼからの残存ポリメラーゼは２塩基オーバーハングを埋める（任意で温度を６０℃に上げる）。ｄＮＴＰを（スピンカラムにより）取り除き、ｄＡＴＰのみを戻して単一の３’Ａオーバーハングを生成する。
２．３．１．ｄ．Ｔ４リガーゼを用いて、ライゲーション末端上に単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する（任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有する）リンカーを、切断して埋めた標的配列の単一の塩基Ａオーバーハングに付加する。リンカーのライゲーションされていない５’側は５’オーバーハングを含有し、任意でリン酸化されていない。リンカーのライゲーションされていない３’側は３’ブロック基及び／またはチオホスフェートを含有し、３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する。
２．３．１．ｅ．３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加え３７℃で分解する。片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片を分解し、一本鎖とする。両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。エキソヌクレアーゼはまた、リンカーを一本鎖にもする。任意で、スピンカラムにより所望の断片から分解生成物を取り除く。
２．３．１．ｆ．（ｉ）Ｔ４キナーゼを用いた５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しての、マッチする５’重なり合った塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている隣接ＡｃｉＩ配列を有する、標的断片の多量体を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：ブロックリンカーの３’末端は、ブロックに対して内部の位置にてウラシルまたはアプリン（ＡＰ）部位を含有するように合成され、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼでの処理の後、ライゲーション能のある３’末端を遊離させる。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：ライゲーションは、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）を用いることにより、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体の形成に有利となり、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。
予測実施例３−全ての血漿ＤＮＡ中での、プロモーター低メチル化（存在する場合１％〜０．１％）に対する高感度非メチル化マーカー。
腫瘍内でのメチル化変化の大部分は、低メチル化によるものである。予めメチル化されているプロモーター領域内でかかる低メチル化が発生する場合、癌遺伝子等の遺伝子の発現の増加の原因となり得る。更に、反復成分領域及び可動成分は通常、全体のメチル化によりサイレンシングされるが、かかるサイレンシングは、腫瘍が低メチル化した場合に失われる。
メチル感受性制限酵素を用いて、選択的増幅を補助して低量のメチル化配列を識別することができるが、そのアプローチは、低量の非メチル化配列の識別には機能しない。亜硫酸水素塩による処理、及び亜硫酸水素塩により変性した非メチル化ＤＮＡに対するＰＣＲプライマーの使用を行うことができるが、かかるプライマーは非常にＡＴリッチであり、特に多重ＰＣＲを試みる場合に、所望の断片全てを増幅するのが困難な場合がある。
アプローチの概要：ここでの考えは、対象の領域に対する隣接制限酵素切断部位が非メチル化である標的ＤＮＡのそれぞれの断片を確実にコピーし、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び所望の患者識別子を付加させ、後続の配列決定のためにこれらを環化することである。オリゴヌクレオチドＤＮＡ鎖は環化され配列決定される。本アプローチは、必要な場合にコピー数情報、及び必要最小限の配列決定による非メチル化データの両方を得るという利点を提供する。
変形３．１：（例えば、図３４及び３５を参照）。この変形において、ＨｉｎＰ１Ｉ（または他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ）でＤＮＡを切断し、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。所望の非メチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方を欠くリガーゼ及びポリメラーゼを加えることにより、非メチル化標的の３’末端の伸長、続いて標的の５’末端へのライゲーションを行い、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列及び任意のプライマー結合部位を共に含有する環状生成物を形成することができる。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となった、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
３．１．ａ．単離ｃｆＤＮＡを１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例は、ＨｉｎＰ１Ｉの使用を示す。エンドヌクレアーゼを熱失活させ（６５℃で１５分間）、ＤＮＡを変性させる（９４℃で１分間）。
３．１．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合部位、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを加えて、５０℃にて伸長及びライゲーションを可能にし、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
３．１．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドの５’末端がライゲーションに適さないように、オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを欠いているか、または５’側上に任意のブロック基を含有してよい。
注２：上記実施例では、ＫｌｅｎＴａｑ、鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方欠くポリメラーゼを用いる。オリゴヌクレオチドが５’側上にブロック基を有する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることができる。
注３：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。直接ＳＭＲＴ配列決定を用いる場合、元の鋳型ＤＮＡのメチル化状態の喪失は、直接決定されることができる。
注４：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注５：同一のアプローチを用いて、プロモーター領域がメチル化されている領域を識別することができる（図３６及び３７を参照）。単離ｃｆＤＮＡを、メチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）とメチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩ及びＭｓｐＩ）のカクテルで切断する。図は、２つのＨａｅＩＩＩ部位の内部にあり、２つのＨａｅＩＩＩ部位に隣接する、メチル化ＡｃｉＩ部位を有する断片を示す。１つのメチル非感受性制限酵素切断部位のみが存在する場合でさえも、本アプローチは作用する（例えば、図３９、４０、４２、４３を参照）。メチル非感受性制限エンドヌクレアーゼがライゲーション能のある３’末端を遊離させる場合、この末端は（５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する）Ｔａｑポリメラーゼによりオリゴヌクレオチド上で伸長され、ポリメラーゼは標的内の過剰の５’配列を伸長して切断し、標的上に、ライゲーションにより環状生成物を作製するのに好適なライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図３９）。メチル非感受性制限エンドヌクレアーゼがライゲーション能のある５’ホスフェートを遊離させる場合、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることで、（必要な場合）標的内の過剰な３’配列が分解され、次いで、オリゴヌクレオチドプローブ上の相補配列に重なると、ポリメラーゼは、標的鎖を標的上のライゲーション能のある５’ホスフェートまで伸長し、リガーゼによりニックが閉じられ環状生成物が作製される（図４０）。エキソヌクレアーゼ分解の後、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ切断から残った鎖は、その領域のメチルの用マーカーとなる。更に、共有結合で閉じた鋳型上で直接ＳＭＲＴ配列決定を用いる場合、元の鋳型ＤＮＡのメチル化状態を決定してよい。
注６：同一アプローチを用いて、プロモーター領域内のＢｓｈ１２３６Ｉ部位にてメチル化されている領域を識別することができる（図３８、４１、４４、４５、４６を参照）。単離ｃｆＤＮＡをＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）、及びメチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩ）で切断する。図３８は、２つのＨａｅＩＩＩ部位の内部にあり、２つのＨａｅＩＩＩ部位に隣接する、メチル化Ｂｓｈ１２３６Ｉ部位を有する断片で示す。本アプローチは、メチル非感受性制限酵素切断部位が１つしか存在しない場合でも作用する（例えば図４１、４４、４５を参照）。メチル非感受性制限エンドヌクレアーゼがライゲーション能のある３’末端を遊離させる場合、次いで、この末端は（５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する）Ｔａｑポリメラーゼによりオリゴヌクレオチド上で伸長され、ポリメラーゼは標的内の過剰の５’配列を伸長して切断し、標的上に、ライゲーションにより環状生成物を作製するのに好適なライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図３８）。メチル非感受性制限エンドヌクレアーゼがライゲーション能のある５’ホスフェートを遊離させる場合、３’−５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることで、（必要な場合）標的内の過剰な３’配列が分解され、次いで、オリゴヌクレオチドプローブ上の相補配列に重なると、ポリメラーゼは、標的鎖を標的上のライゲーション能のある５’ホスフェートまで伸長し、リガーゼによりニックが閉じられ環状生成物が作製される（図４１及び４５）。エキソヌクレアーゼ分解の後、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ切断から残った鎖は、その領域のメチル化のマーカーとなる。ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）の存在下における、Ｂｓｔポリメラーゼを用いたローリングサークル複製により、元の試料中で部位がメチル化されたことが確実となる。
変形３．１において、ポリメラーゼとリガーゼの両方を用いて、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する、共有結合で閉じた環を形成する。これは、リガーゼのみを用いても達成可能である。
変形３．２：（例えば、図４７及び４８を参照）。この変形において、ＨｉｎＰ１Ｉ（または他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ）でＤＮＡを切断し、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。所望の非メチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１のプローブに相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１のプローブに相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対を標的にハイブリダイズする。リガーゼを加えることにより、標的の３’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端へのライゲーション、及び標的の５’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端へのライゲーションが可能となり、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成する。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
３．２．ａ．単離ｃｆＤＮＡを１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例では、ＨｉｎＰ１Ｉを用いる。エンドヌクレアーゼを熱失活させ（６５℃で１５分間）、ＤＮＡを変性させる（９４℃で１分間）。
３．２．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１の鎖に相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１の鎖に相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む）部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対の存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。熱安定性リガーゼ（好ましくは株ＡＫ１６Ｄから）を加え、６０℃でライゲーションさせて環状生成物を生成する。
３．２．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。直接ＳＭＲＴ配列決定を用いる場合、元の鋳型ＤＮＡのメチル化状態の喪失は、直接決定されることができる。
注２：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注３：同一のアプローチを用いて、プロモーター領域がメチル化されている領域を識別することができる（図４９及び５１を参照）。単離ｃｆＤＮＡを、メチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）とメチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩ及びＭｓｐＩ）のカクテルで切断する。これらの図は、２つのＨａｅＩＩＩ部位の内部にあり、２つのＨａｅＩＩＩ部位に隣接するメチル化ＡｃｉＩ部位を示す。メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ切断から残った鎖は、その領域のメチルの用マーカーとなる。更に、共有結合で閉じた鋳型上で直接ＳＭＲＴ配列決定を用いる場合、元の鋳型ＤＮＡのメチル化状態を決定してよい。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位における非メチル化状態のデータベース
現在のＴＣＧＡデータベースは、通常、及び多くの異なる組織部位の腫瘍の両方に関する、ヒトゲノムの約４５０，０００ＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を含有する。しかし、このデータベースは隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位の非メチル化状態を全てカバーしておらず、ゲノムＤＮＡの同一断片上で、両方の部位が非メチル化であることを区別しない。
したがって、上記アッセイ方法を最大限に有用にするため、隣接メチル感受性制限酵素切断部位における非メチル化状態のデータベースを作成することが役に立つ。かかるアプローチの１つを、図５１に示す。
アプローチの概要：ここでの考えは、断片の両端が、元のゲノムＤＮＡ内で非メチル化である制限酵素切断部位を含有する場合にのみ形成可能であったであろう小断片のライブラリーを生成することである。断片は、ここではライゲーションを受けて追加のステップ及び後続の配列決定用の基質となる断片多量体を作製することができる、任意の固有識別子及び任意の患者識別子配列が付加されたリンカーを有する。
変形３．２．１：（例えば図５１を参照）。本アプローチは、ゲノム全体での、隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）における非メチル化の発見方法を示す。出発材料は、約１６０ｂｐの平均長さのインタクトなゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡのいずれかとすることができる。ライゲーションされていない末端にブロック５’末端を含有する短いリンカーを標的ＤＮＡにライゲーションする。ＨｉｎＰ１ＩでゲノムＤＮＡを切断し、非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位にてＤＮＡを断片化する。任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有するリンカーを、ＨｉｎＰ１Ｉが切断した末端が埋められた、新しく生成した断片にライゲーションする。これらの新しいリンカーは、ライゲーションされていない末端に、ブロック３’末端、またはチオホスフェート含有骨格（図５１に＊＊＊＊として示す）を含有する。二本鎖３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加える際に、片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片が分解され、一本鎖となる。３’ブロック基またチオホスフェートが３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するため、両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながらの、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。例えば、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計し、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。ライゲーション生成物は、任意の固有の識別子及び／または患者識別子配列を有する標的ＤＮＡ中で元々非メチル化された、隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベースを生成するための詳細プロトコール：
３．２．１．ａ．ライゲーションされていない末端の５’末端上でブロックされているリンカーにライゲーションする。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。単離ゲノムＤＮＡ、またはメチル強化ＤＮＡを、１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例では、ＨｉｎＰ１Ｉを用いた。任意で、エンドヌクレアーゼを熱失活させる（６５℃で１５分間）。
３．２．１．ｂ．ＨｉｎＰ１Ｉを加えてかかる部位を含有する生成物を切断する。ＨｉｎＰ１Ｉで切断した場合に、元の標的内で非メチル化であった隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）を含有する標的のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。Ｔａｑポリメラーゼからの残存ポリメラーゼは２塩基オーバーハングを埋める（任意で温度を６０℃に上げる）。ｄＮＴＰを（スピンカラムにより）取り除き、ｄＡＴＰのみを戻して、単一の塩基３’Ａオーバーハングを生成する。
３．２．１．ｃ．Ｔ４リガーゼを用いて、ライゲーション末端上に単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する（任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有する）リンカーを、切断して埋めた標的配列の単一の塩基Ａオーバーハングに付加させる。リンカーのライゲーションされていない５’側は５’オーバーハングを含有し、任意でリン酸化されていない。リンカーのライゲーションされていない３’側は３’ブロック基及び／またはチオホスフェートを含有し、３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する。
３．２．１．ｄ．３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加え３７℃で分解する。片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片を分解し、一本鎖とする。両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。エキソヌクレアーゼはまた、リンカーを一本鎖にもする。任意で、スピンカラムにより所望の断片から分解生成物を取り除く。
３．２．１．１．ｅ．（ｉ）Ｔ４キナーゼを用いた５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しての、マッチする５’重なり合った塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する、標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を有する、標的断片の多量体を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：ブロックリンカーの３’末端は、ブロックに対して内部の位置にてウラシルまたはアプリン（ＡＰ）部位を含有するように合成され、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼでの処理の後、ライゲーション能のある３’末端を遊離させる。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：ライゲーションは、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）を用いることにより、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体の形成に有利となり、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。
注４：同一のアプローチを用いて、プロモーター領域がメチル化されている領域を識別することができる（例えば、図５２を参照）。単離ｃｆＤＮＡを、メチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）のカクテルで切断し、短いリンカー上でブロック５’末端とライゲーションする。次いで、メチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩ及びＭｓｐＩ）で標的を切断する。ＡｃｉＩ及びＨａｅＩＩＩをこの図に示す。メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ切断から残った鎖は、その領域のメチルの用マーカーとなる。ＨａｅＩＩＩにより切断される時に、元の標的内の、メチル化ＡｃｉＩ部位を有する隣接ＨａｅＩＩＩ部位（ＧＧＣＣ）のみが非ブロック断片を作製する。より長いリンカーの後続のライゲーションは、前述のとおりである。ライゲーションした生成物で直接ＳＭＲＴ配列決定を用いる場合、元の鋳型ＤＮＡのメチル化状態を決定してよい。
プロモーター領域内の非メチル化隣接部位の検出
プロモーター領域内の２つのメチル感受性制限酵素切断部位の間の、ＣｐＧ配列の非メチル化状態を決定すること所望される場合がある。これは上記アプローチに類似しており、追加の亜硫酸水素塩ステップを含む。
アプローチの概要：ここでの考えは、対象の領域に対する隣接制限酵素切断部位が非メチル化である標的ＤＮＡのそれぞれの断片を確実にコピーし、亜硫酸水素塩で処理し、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び所望の患者識別子を付加させ、後続の配列決定のためにこれらを環化することである。オリゴヌクレオチドＤＮＡ鎖は環化され配列決定される。本アプローチは、必要な場合にコピー数情報、及び必要最小限の配列決定による非メチル化データの両方を得るという利点を提供する。
変形３．３：（例えば、図５３及び５４を参照）。この変形において、ＨｉｎＰ１Ｉ（または他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ）でＤＮＡを切断し、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成する。次にＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、これにより鎖が非相補性となるため、一本鎖となる。所望の非メチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方を欠くリガーゼ及びポリメラーゼを加えることにより、非メチル化標的の３’末端の伸長、続いて、標的の５’末端へのライゲーションを行い、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成することが可能となる。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
３．３．ａ．単離ｃｆＤＮＡを１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例ではＨｉｎＰ１Ｉについて記載する。エンドヌクレアーゼを熱失活させ（６５℃で１５分間）、ＤＮＡを変性させる（９４℃で１分間）。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもやは互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
３．３．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合部位、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分、必要であれば）、所望の温度に冷却する（例えば５０o〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを加えて、５０℃にて伸長及びライゲーションを可能にし、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
３．３．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドの５’末端がライゲーションに適さないように、オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを欠いているか、または５’側上に任意のブロック基を含有してよい。
注２：上記実施例では、ＫｌｅｎＴａｑ、鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方欠くポリメラーゼを用いる。オリゴヌクレオチドが５’側にブロック基を有する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることができる。
注３：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注４：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
変形３．３において、ポリメラーゼとリガーゼの両方を用いて、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する、共有結合で閉じた環を形成した。これは、リガーゼのみを用いても達成可能である。
変形３．４：（例えば、図５５及び５６を参照）。この変形において、ＤＮＡをＨｉｎＰ１Ｉ（または他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ）で切断し、ライゲーション能のある３’及び５’末端を生成して、亜硫酸水素塩による処理を続ける。所望の非メチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１のプローブに相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１のプローブに相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対を標的にハイブリダイズする。リガーゼを加えることにより、標的の３’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端へのライゲーション、及び標的の５’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端へのライゲーションが可能となり、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成する。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
３．４．ａ．単離ｃｆＤＮＡを１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例では、ＨｉｎＰ１Ｉを用いる。エンドヌクレアーゼを熱失活させ（６５℃で１５分間）、ＤＮＡを変性させる（９４℃で１分間）。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
３．４．ｂ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１の鎖に相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１の鎖に相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む）部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対の存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。熱安定性リガーゼ（好ましくは株ＡＫ１６Ｄから）を加え、６０℃でライゲーションさせて環状生成物を生成する。
３．４．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。直接ＳＭＲＴ配列決定を用いる場合、元の鋳型ＤＮＡのメチル化状態の喪失は、直接決定されることができる。
注２：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位における非メチル化状態のデータベース
現在のＴＣＧＡデータベースは、通常、及び多くの異なる組織部位の腫瘍の両方に関する、ヒトゲノムの約４５０，０００ＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を含有する。しかし、このデータベースは隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位、及びこれらの部位間のＣｐＧ部位の非メチル化状態を全てカバーしておらず、ゲノムＤＮＡの同一断片上で、両方の部位が非メチル化であることを区別しない。
したがって、上記アッセイ方法を最大限に有用にするため、隣接メチル感受性制限酵素切断部位における非メチル化状態のデータベースを作成することが役に立つ。かかるアプローチの１つを、図５７に示す。
アプローチの概要：ここでの考えは、断片の両端が、元のゲノムＤＮＡ内で非メチル化である制限酵素切断部位を含有する場合にのみ形成可能であったであろう小断片のライブラリーを生成することである。断片は、ここではライゲーションを受けて断片多量体を作製可能な任意の固有識別子及び任意の患者識別子配列が付加されたリンカーを有し、次いで断片を亜硫酸水素塩で処理してメチル化または非メチル化の位置を明らかにした後、この断片は追加のステップ及び後続の配列決定のための基質となる。
変形３．４．１：（例えば図５７を参照）。本アプローチは、ゲノム全体を通しての、隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）における非メチル化の発見方法を示す。出発材料は、約１６０ｂｐの平均長さのインタクトなゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡのいずれかとすることができる。ライゲーションされていない末端にブロック５’末端を含有する短いリンカーを標的ＤＮＡにライゲーションする。ＨｉｎＰ１ＩでゲノムＤＮＡを切断し、非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位にてＤＮＡを断片化する。任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有するリンカーを、ＨｉｎＰ１Ｉが切断した末端が埋められた、新しく生成した断片にライゲーションする。これらの新しいリンカーは、ライゲーションされていない末端に、ブロック３’末端、またはチオホスフェート含有骨格（図５７に＊＊＊＊として示す）を含有する。二本鎖３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加える際に、片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片が分解され、一本鎖となる。３’ブロック基またチオホスフェートが３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するため、両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながらの、マッチする５’重複塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。例えば、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計し、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。ライゲーション生成物は、任意の固有の識別子及び／または患者識別子配列を有する標的ＤＮＡ中で元々非メチル化であった、隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を含む。生成物を次に亜硫酸水素塩でインキュベーションし、これによりメチルＣではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。これらの一本鎖生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
隣接メチル感受性制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベースを生成するための詳細プロトコール：
３．４．１．ａ．ライゲーションされていない末端の５’末端上でブロックされているリンカーにライゲーションする。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。単離ゲノムＤＮＡ、またはメチル強化ＤＮＡを、１つ以上のメチル感受性酵素（ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）で切断する。本実施例では、ＨｉｎＰ１Ｉを用いる。任意で、エンドヌクレアーゼを熱失活させる（６５℃で１５分間）。
３．４．１．ｂ．ＨｉｎＰ１Ｉを加えてかかる部位を含有する生成物を切断する。ＨｉｎＰ１Ｉで切断した場合に、元の標的内で非メチル化であった隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位（ＧＣＧＣ）を含有する標的のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。Ｔａｑポリメラーゼからの残存ポリメラーゼは２塩基オーバーハングを埋める（任意で温度を６０℃に上げる）。ｄＮＴＰを（スピンカラムにより）取り除き、ｄＡＴＰのみを戻して単一の３’Ａオーバーハングを生成する。
３．４．１．ｃ．Ｔ４リガーゼを用いて、ライゲーション末端上に単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する（任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有する）リンカーを、切断して埋めた標的配列の単一の塩基Ａオーバーハングに付加させる。リンカーのライゲーションされていない５’側は５’オーバーハングを含有し、任意でリン酸化されていない。リンカーのライゲーションされていない３’側は３’ブロック基及び／またはチオホスフェートを含有し、３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する。
３．４．１．ｄ．３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加え３７℃で分解する。片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片を分解し、一本鎖とする。両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。エキソヌクレアーゼはまた、リンカーを一本鎖にもする。任意で、スピンカラムにより所望の断片から分解生成物を取り除く。
３．４．１．１．ｅ．（ｉ）Ｔ４キナーゼを用いた５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しての、マッチする５’重なり合った塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する、標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている隣接ＨｉｎＰ１Ｉ配列を有する、標的断片の多量体を含む。ライゲーション生成物を亜硫酸水素塩でインキュベーションし、これによりメチルＣではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。これらの一本鎖生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：より長いブロックリンカーの３’末端を、ブロック内の位置にウラシルまたはアプリン（ＡＰ）部位を含有するように合成し、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼでの処理の後、ライゲーション能のある３’末端を遊離させることができる。更に、これらのリンカーは、亜硫酸水素塩による処理の後、元の状態を保持するように５−メチルＣと共に合成することができる。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：ライゲーションは、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）を用いることにより、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体の形成に有利となり、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。
所与の領域内での個々のＣｐＧ部位の非メチル化状態の検出
上記アプローチは、隣接した非メチル化ＨｉｎＰ１Ｉ部位を、ＤＮＡ断片内での非メチル化の代わりとして含有する断片の識別及び計数に理想的である。しかし、いくつかの用途のためには、所与の領域内での個々のＣｐＧ部位の非メチル化状態を識別することが重要である。したがって、投入ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することが必要となり得、これはメチルＣではなく通常のＣをＵに転換する。
亜硫酸水素塩を用いるアプローチの概要：ここでの考えは、対象の領域に関する配列（ＧＧＴＧＡ）の隣接ＨｐｈＩ制限酵素切断部位が非メチル化である標的ＤＮＡの全ての断片を正確にコピーし、亜硫酸水素塩で処理し（ＧＧＣＧＡをＧＧＴＧＡに転換し）、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び所望の患者識別子を付加させ、後続の配列決定のためにこれらを環化することである。オリゴヌクレオチドＤＮＡ鎖は環化され配列決定される。本アプローチは、必要な場合にコピー数情報、及び必要な最少の配列決定によるメチル化データの両方を得るという利点をもたらす。
ここでの考えは、ＨｐｈＩに対する認識配列の固有の性質を利用する。酵素は１方向において４．５塩基の認識配列ＧＧＴＧＡを、他方の方向においてＴＣＡＣＣを切断する。非メチル化ＧＧＣＧＡ部位が亜硫酸水素塩で処理される場合、第１の方向において、部位はＨｐｈＩ認識配列ＧＧＴＧＡとなる。数ラウンドのＰＣＲ増幅の後、５−メチルＣはＣに転換されるが、ＵはＴに転換される。ＨｐｈＩで切断した場合、元の標的内で非メチル化である隣接部位のみが、３’及び５’末端の両方でライゲーション能のある断片を作製する。
本アプローチの１つの固有の特長は、亜硫酸水素塩による転換が２つの非相補鎖を作製するということである。したがって、トップ鎖は隣接するＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ配列を有し、介在ＴＣＡＣＣ配列が存在する場合でも、この配列は、ＨｐｈＩ部位として認識されないＴＵＡＵＵに転換されるため、問題ではない。更に良いことには、形式ＴＣＧＣＣのトップ鎖上の配列が、ボトム鎖上でＧＧＣＧＡとなる。ボトム鎖はメチル化状態を確認するためにもまた用いられ得、かつ２つの配列はここでは非常に異なっているため、トップ及びボトム鎖へのオリゴヌクレオチドプローブは互いにハイブリダイズせず、転換標的にのみハイブリダイズする。したがって、本アプローチでは、トップ及びボトム鎖の両方からの情報を用いて、プロモーター上の詳細のメチル化状態を得ることが可能になる。
ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、非メチル化ＤＮＡを制限酵素により切断可能であるが、メチル化されている場合、同じ制限酵素で切断できない配列にする原理は、いくつかの更なる制限酵素切断部位まで拡大することができる。例えば、内部ＣＧがメチル化されていないことを条件として、配列ＣＣＧＴＣはＢｃｃＩ部位（ＣＣＡＴＣ）に転換される。（これは、反対鎖、即ちＧＡＣＧＧの、ＢｃｃＩの反対鎖の認識配列、即ちＧＡＴＧＧへの転換によりもたらされる。）同様に、ＣＧがメチル化されていないことを条件として、配列ＧＧＡＣＧはＦｏｋＩ部位（ＧＧＡＴＧ）に転換される。したがって、ＨｐｈＩに関して以下で考慮する変形は、限定されないが制限エンドヌクレアーゼＢｃｃＩ、ＦｏｋＩ、及びこれらのイソ制限酵素に対して有効である。
変形３．５：（例えば、図５８及び５９を参照）。この変形において、５−メチルＣを含有する短いリンカーを、ＤＮＡの末端にライゲーションする。次にＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、これにより鎖が非相補性となるため、一本鎖となる。数ラウンドのＰＣＲ増幅により、ＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。これらの生成物を次にＨｐｈＩで切断する。元の標的で非メチル化であった隣接「ＨｐｈＩ」部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端がここではライゲーション能のある断片を生成する。所望の領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方を欠くリガーゼ及びポリメラーゼを加えることにより、非メチル化標的の３’末端の伸長、続いて、標的の５’末端へのライゲーションを行い、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成することが可能となる。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
３．５．ａ．５−メチルＣを含有するリンカーへのライゲーションを行い、亜硫酸水素塩による転換後に配列を保持する。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
３．５．ｂ．プライマー類、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
３．５．ｃ．ＨｐｈＩを加えてかかる部位を含有する生成物を切断する。ＨｐｈＩで切断した場合、元の標的で非メチル化であった隣接ＨｐｈＩ部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。
３．５．ｄ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合部位、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０o〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを加えて、５０℃にて伸長及びライゲーションを可能にし、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
３．５．ｅ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドの５’末端がライゲーションに適さないように、オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを欠いているか、または５’側上に任意のブロック基を含有してよい。
注２：上記実施例では、ＫｌｅｎＴａｑ、鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方欠くポリメラーゼを用いる。オリゴヌクレオチドが５’側にブロック基を有する場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることができる。
注３：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注４：オリゴヌクレオチドプローブが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
変形３．５において、ポリメラーゼとリガーゼを用いて、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する、共有結合で閉じた環を形成する。これは、リガーゼのみを用いても達成可能である。
変形３．６：（例えば、図６０及び６１を参照）。この変形において、５−メチルＣを含有する短いリンカーを、ＤＮＡの末端にライゲーションする。次にＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、これにより鎖が非相補性となるため、一本鎖となる。数ラウンドのＰＣＲ増幅により、ＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。これらの生成物を次にＨｐｈＩで切断する。元の標的で非メチル化であった隣接「ＨｐｈＩ」部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端がここではライゲーション能のある断片を生成する。所望の非メチル化領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１の鎖に相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１の鎖に相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対を標的にハイブリダイズする。リガーゼを加えることにより、標的の３’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端へのライゲーション、及び標的の５’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端へのライゲーションが可能となり、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成する。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
制限エンドヌクレアーゼにより３’ＯＨ及び５’ホスフェートの両方を生成させることを要求することで、間違ったシグナルが回避され、同様にいかなる非特異的ライゲーションシグナルも取り除かれるはずである。したがって、精製後に一本鎖となる、または切断されていないゲノムＤＮＡの任意の希少断片は生産的な基質を形成せず、エキソヌクレアーゼ処理ステップにより破壊される。
プロモーター非メチル化の高感度な検出のための詳細プロトコール：
３．６．ａ．５−メチルＣを含有するリンカーへのライゲーションを行い、亜硫酸水素塩による転換後に配列を保持する。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
３．６．ｂ．プライマー類、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
３．６．ｃ．ＨｐｈＩを加えてかかる部位を含有する生成物を切断する。ＨｐｈＩで切断した場合、元の標的で非メチル化であった隣接ＨｐｈＩ部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。
３．６．ｄ．（標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、第１の鎖に相補的な５’領域、固有の識別子配列、及び第１の鎖に相補的な３’領域を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む）部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド対の存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃〜６０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドを所望の断片上で相補領域にハイブリダイズさせる。熱安定性リガーゼ（好ましくは株ＡＫ１６Ｄから）を加え、６０℃でライゲーションさせて環状生成物を生成する。
３．６．ｅ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、メチル化ＤＮＡのコピー、固有の識別子配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：環状生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注２：オリゴヌクレオチドプローブが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
隣接ＨｐｈＩ制限酵素切断部位におけるメチル化状態のデータベース
現在のＴＣＧＡデータベースは、通常、及び多くの異なる組織部位の腫瘍の両方に関する、ヒトゲノムの約４５０，０００ＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報を含有する。しかし、このデータベースは隣接ＡｃｉＩ部位の非メチル化状態を全てカバーせず、また、ゲノムＤＮＡの同一断片上でメチル化された両方の部位を区別しない。
したがって、上記アッセイ方法を最大限に有用にするため、同一方向の隣接ＨｐｈＩ制限酵素切断部位（ＧＧＣＧＡをＧＧＴＧＡに転換）におけるメチル化状態のデータベースを作製することが役に立つ。本アプローチはまた、他方の方向の隣接ＨｐｈＩ制限酵素切断部位（ＴＣＡＣＣ及びＴＣＧＣＣ）も含む。これは、これら部位が亜硫酸水素塩による転換の後反対鎖上でＧＧＴＧＡになるためである。かかるアプローチの１つを、図６２に示す。
アプローチの概要：ここでの考えは、断片の両端が、元のゲノムＤＮＡ内で非メチル化であった、（ＧＧＴＧＡに）転換したＧＧＣＧＡを含有する場合にのみ形成可能であったであろう小断片のライブラリーを生成することである。ここでの考えは、ＨｐｈＩに対する認識配列の固有の性質を利用する。酵素は１方向において４．５塩基の認識配列ＧＧＴＧＡを、他方の方向においてＴＣＡＣＣを切断する。非メチル化ＧＧＣＧＡ部位を亜硫酸水素塩で処理する場合、第１の方向において、部位はＨｐｈＩ認識配列ＧＧＴＧＡとなる。数ラウンドのＰＣＲ増幅の後、５−メチルＣはＣに転換されるが、ＵはＴに転換される。ＨｐｈＩで切断した場合、元の標的内で非メチル化である隣接部位のみが、３’及び５’末端の両方でライゲーション能のある断片を作製する。断片は、ここではライゲーションを受けて追加のステップ及び後続の配列決定用の基質となる断片多量体を作製することができる、任意の固有識別子及び任意の患者識別子配列が付加されたリンカーを有する。
変形３．６．１：（例えば図６２を参照）。この変形において、５−メチルＣを含有する短いリンカーを、ＤＮＡの末端にライゲーションする。次にＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、これにより鎖が非相補性となるため、一本鎖となる。数ラウンドのＰＣＲ増幅により、ＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。これらの生成物を次にＨｐｈＩで切断する。元の標的で非メチル化であった隣接「ＨｐｈＩ」部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端がここではライゲーション能のある断片を生成する。所望の領域を捕捉するために、標的の５’側の配列に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意の患者識別子配列、及び標的の３’側の配列に相補的な３’プローブ領域を含むオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズする。鎖置換活性、並びに３’→５’及び５’→３’ヌクレアーゼ活性の両方を欠くリガーゼ及びポリメラーゼを加えることにより、非メチル化標的の３’末端の伸長、続いて、標的の５’末端へのライゲーションを行い、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合部位を含有する環状生成物を形成することが可能となる。ライゲーションしていない生成物は、エキソヌクレアーゼ分解により取り除かれる。本環状生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
変形３．６．１：（例えば図６２を参照）。本アプローチは、ゲノム全体での、隣接「ＨｐｈＩ」部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）における非メチル化の発見方法を示す。出発材料は、約１６０ｂｐの平均長さのインタクトなゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡのいずれかとすることができる。ライゲーションされていない末端にブロック５’末端を含有する短いリンカーを、ＤＮＡの末端にライゲーションする。亜硫酸水素塩によりＤＮＡを処理し、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。非メチル化ｄＮＴＰ及び５’ブロックプライマーを用いた数ラウンドのＰＣＲ増幅により、残存するＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。これらの生成物を次にＨｐｈＩで切断する。ＨｐｈＩで切断した場合、元の標的で非メチル化であった隣接ＨｐｈＩ部位（ＧＧＣＧＡ及びＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有するリンカーを、これらの、新しく生成したＨｐｈＩで切断した末端にライゲーションする。これらの新しいリンカーは、ライゲーションされていない末端に、ブロック３’末端、またはチオホスフェート含有骨格（図６２に＊＊＊＊として示す）を含有する。二本鎖３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加える際に、片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片が分解され、一本鎖となる。３’ブロック基またチオホスフェートが３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するため、両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。（ｉ）５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼの使用、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。例えば、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計し、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている同一方向（即ちＧＣＧＧ）に、隣接ＡｃｉＩ配列を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
隣接「ＨｐｈＩ」制限酵素切断部位における非メチル化状態のデータベースを生成するための詳細プロトコール：
３．６．１．ａ．ライゲーションされていない末端の５’末端上でブロックされているリンカーにライゲーションする。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復し、続いて単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰで生成する。Ｔ４リガーゼを用いたライゲーションが断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。亜硫酸水素塩でｃｆＤＮＡをインキュベーションすることにより、メチル−Ｃではなく通常のＣをＵに転換する。亜硫酸水素塩による処理は、処理後、鎖がもはや互いに相補的ではなくなり、融解して別々になるように、トップ及びボトム鎖を異なるように転換する。
３．６．１．ｂ．５’ブロックプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを加えてＰＣＲを数サイクル実施し、残存するＨｐｈＩ部位がここでは非メチル化である生成物を生成する。
３．６．１．ｃ．ＨｐｈＩを加えてかかる部位を含有する生成物を切断する。ＨｐｈＩで切断した場合、元の標的で非メチル化であった隣接ＨｐｈＩ部位（ＧＧＣＧＡまたはＧＧＴＧＡ）を含有するＰＣＲ単位複製配列のみが、両端が脱ブロックされている（即ち、リンカーによるライゲーション能のある）断片を生成する。標的末端をＴ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼで修復する。ｄＮＴＰを（スピンカラムにより）取り除き、ｄＡＴＰのみを戻して単一の３’Ａオーバーハングを生成する。
３．６．１．ｄ．Ｔ４リガーゼを用いて、ライゲーション末端上に単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する（任意の固有の識別子配列及び任意の患者識別子配列を含有する）リンカーを、切断して埋めた標的配列の単一の塩基Ａオーバーハングに付加させる。リンカーのライゲーションされていない５’側は５’オーバーハングを含有し、任意でリン酸化されていない。リンカーのライゲーションされていない３’側は３’ブロック基及び／またはチオホスフェートを含有し、３’エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する。
３．６．１．ｅ．３’エキソヌクレアーゼ（即ちエキソヌクレアーゼＩＩＩ）を加え３７℃で分解する。片側または両側に元の短いリンカーを含有する断片を分解し、一本鎖とする。両側にライゲーションした新しいリンカーを有する断片のみが二本鎖のままとなる。エキソヌクレアーゼはまた、リンカーを一本鎖にもする。任意で、スピンカラムにより所望の断片から分解生成物を取り除く。
３．６．１．ｆ．（ｉ）Ｔ４キナーゼを用いた５’末端のリン酸化、（ｉｉ）ブロック３’基の除去、もしくは（ｉｉｉ）Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を用いた、ライゲーション能のある５’ホスフェートを残しての、マッチする５’重なり合った塩基もしくはフラップの切断、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかにより、リンカー含有断片のままである自由端にライゲーション能が付与される。多量体化に有利となるようにライゲーション条件を設計する。ライゲーション生成物は、任意の固有識別子及び／または患者識別子配列を有する標的ＤＮＡ内で元々メチル化されている隣接ＡｃｉＩ配列を有する、標的断片の多量体を含む。本生成物は、任意の追加のステップ及び後続の配列決定に適している。
注１：ブロックリンカーの３’末端は、ブロックに対して内部の位置にてウラシルまたはアプリン（ＡＰ）部位を含有するように合成され、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼでの処理の後、ライゲーション能のある３’末端を遊離させる。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：ライゲーションは、クラウディング剤（即ち２０％ＰＥＧ）を用いることにより、及び／または２セットのライゲーション生成物を混合することにより、多量体の形成に有利となり、これらの２セットにおいては、第１セットの非回文状５’リンカーオーバーハングは、第２セットの非回文状５’リンカーオーバーハングに相補的である。
予測実施例４− 循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的なコピー変化の正確な定量。
腫瘍ＤＮＡのコピー変化は、転帰の強力な予測因子である。過去数十年間にわたり、大部分のコピー数作業はＳＮＰチップ上で実施されてきており、ここでは、生物情報科学アプローチにより、領域にまたがるシグナルを平均して相対的なコピー数を決定する。少数の細胞に関して、デジタルＰＣＲアプローチを用いて、出発分子の正確な数を得る。
アプローチの概要：一般に、コピー変化は染色体腕等のＤＮＡの大型領域で生じる。非常に少数の腫瘍細胞が存在するため、所与の染色体腕の複数の領域を同時に照会し、得られるシグナルを加えるかまたは平均することにより、正確性を向上させることができる。同様に、特定の遺伝子をいくつかの腫瘍（即ち、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ＩＧＦ２）において増幅し、これにより、結果を予想するか、または治療の指針とすることができる。
コピー変化に加えて、対象の領域内の多型ＳＮＰまたはマーカー内で、染色体を数えることによるだけでなく、ヘテロ接合性の従来の喪失を調査することによってもまた、ヘテロ接合性の喪失が続く場合がある。最も異種のマーカーは反復配列内に存在する。本明細書では、テトラヌクレオチド反復配列を用いる構想を示すが、トリ及びジヌクレオチド反復配列もまた考慮することができる。
全体的なアプローチは大変類似しているため、循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的なコピー変化の定量についての詳細プロトコールを、循環腫瘍細胞からの変異をスコアリングする次のセクションで取り扱う。
予測実施例５−循環腫瘍細胞またはｃｆＤＮＡから単離したＤＮＡにおける変異の検出
循環腫瘍細胞は、変異含有ＤＮＡを濃縮するという利点をもたらすため、過剰の野生型配列内で低量の変異を探す必要がもはやない。しかし、少数の出発ＤＮＡ分子が存在するので、全ての領域を正確に増幅し、変異が実際に存在することを確認することが重要である。
アプローチの概要：ここでのアプローチは、前述で概略を述べたような、既知の共通の点変異を発見するためのアプローチ、または複数のエクソンを配列決定するためのアプローチに類似している。しかし、少量の投入ＤＮＡを取り扱う場合、ポリメラーゼエラーの可能性が存在する。本問題は、環状配列決定またはＳＭＲＴ配列決定を用いることにより解決される。
いくつかの捕捉腫瘍細胞からＤＮＡが得られているので、変異が存在する場合、変異は捕捉細胞の大部分ではなくても、いくつかに存在するはずである。
アプローチは大変類似しているので、コピー数の定量を含む、循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡにおける変異の検出のための詳細プロトコールを以下に記載する。
変形５．１：（例えば図６３を参照）。ここでの全体的考えは、ｃｆＤＮＡまたはＣＴＣ ＤＮＡを全て一本鎖環に転換することであり、各断片は、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び任意のプライマー結合配列を含有する。転換が生じると、環は、ビオチン化プローブを用いる、所望の標的の生の配列決定（ｒａｗ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、配列特異的捕捉、またはビオチン化プローブを用いる所望の標的のローリングサークル増幅及び向上した捕捉にここでは好適となる。
この変形において、目的は、標的に結合するプローブを用いることなく、全ての標的及び非標的ＤＮＡ配列を捕捉することである。リンカーをＤＮＡ標的（約１６０塩基の平均長のｃｆＤＮＡ）にライゲーションする。配列を全て捕捉するために、リンカーの５’末端に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及びリンカーの３’末端に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、任意の、片端での任意のブロック基（図示する５’末端）を含有してよい。ポリメラーゼを加えることにより、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を介しての、標的の５’リンカーに隣接するまで標的上でのオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長、及び３’末端リンカーの伸長が可能となる。
リンカーの５’末端は、ポリメラーゼが３’リンカーを伸長すると、５’プローブ領域にハイブリダイズした５’標的部分に当たるまで、５’リンカー相補配列の始めから終わりまでを伸長しないように、わずかに長く設計されてよい。
この変形は、オリゴヌクレオチドプローブが、配列が約２０〜４０塩基のみにより分離されている、３’及び５’リンカー鎖の両方に相補的な配列を含有することを必要とする。配列はリンカー鎖に相補的であり、配列は結果として互いに相補的であるので、オリゴヌクレオチドプローブ内の２つの配列が、ただ２０〜４０塩基ループを有する内部ヘアピンを形成することを防ぐことが重要である。１つの解決法は、２つのリンカーが、リンカーライゲーションに用いられる低温（Ｔ４リガーゼにより１６℃、あるいは４℃）にて二本鎖特徴を保持するように、内部バブルを含有するリンカーをライゲーションすることである。更に、５’リンカーは３’リンカーよりも長くなるように設計されてよい。最終的に、リンカー内の相補領域は、オリゴヌクレオチドプローブが全体のハイブリダイゼーション温度（即ち、４０〜５０℃）で内部ヘアピンをより形成しにくくなるとなるように、相補オリゴヌクレオチドプローブ（即ち、Ｃ：Ａ及びＡ：Ｃ）内でより安定を損なう僅かなミスマッチ（即ち、Ｇ：Ｔ及びＴ：Ｇ）を有するように設計してよい。
標的上のオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長することにより、プローブの標的への会合が向上するため、リンカーの３’末端が相補体にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長される能力が増加する。ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ切断活性（またはＦｅｎヌクレアーゼ）は、リンカー上にライゲーション能のある５’ホスフェートを残しながら、５’リンカーのマッチする５’重複塩基を切断する。ポリメラーゼは標的上でもまたオリゴヌクレオチドを伸長し、オリゴヌクレオチドの５’末端上のブロック基は切断しない。
リガーゼは伸長３’末端をライゲーション能のある５’ホスフェートと共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製する。ブロック基はオリゴヌクレオチドプローブの環化を防止する。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしても知られ、Ｎ−グリコシラーゼ及びＡＰリアーゼの両方として作用する）の任意付加を用いて、損傷した塩基を含有する標的にニック付加してよい。次にエキソヌクレアーゼを加え、固有の識別子配列と共に元の標的ＤＮＡを含む、所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、ローリングサークル増幅及び環状配列決定、または直接ＳＭＲＴ配列決定と組み合わせた、ビオチン化プローブを用いる所望の標的の配列特異的捕捉に適している。
ここでの課題は、ライゲーションステップ（即ちニック翻訳）なしに５’リンカーを破壊するような方法で、ポリメラーゼが３’リンカーを伸長することを回避することである。このことは、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を組み込むことで達成され得る。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
代替アプローチの１つは、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有する５’リンカーを用いることである。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。熱安定性エンドＩＩＩを用いる場合、用いるＰＣＲポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
上述の通り、ニック翻訳の問題は、大部分の伸長は、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼがライゲーション能のある接合部を作製し、続いてポリメラーゼ解離、及びライゲーション現象により所望の環状ライゲーション生成物を生成するまで、ヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼにより行われるような、リガーゼの存在下における分布伸長の条件下にて、５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有するもの及び有しないものの両方のポリメラーゼの混合物（例えば１：２０の比率）を用いることによっても、最小限に抑えることができる。
循環腫瘍細胞またはｃｆＤＮＡから単離したＤＮＡ中の既知の遺伝子（例えば、Ｂｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、腫瘍特異的コピー変化または変異の検出の正確な定量に関する詳細プロトコール：
５．１．ａ．ＣＴＣから単離したｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから開始し（約１５０ｂｐに剪断）、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いる４℃でのライゲーションは、断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。任意で、ライゲーションしていないリンカーから標的ＤＮＡを精製する。
５．１．ｂ．（リンカーの５’末端に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及びリンカーの３’末端に相補的な配列を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば４０〜５０℃で３０分）ことにより、オリゴヌクレオチドプローブが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドプローブは５’末端に任意のブロック基を含有する。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、並びに（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
５．１．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、ビオチン化プローブを用いた所望の標的の配列特異的捕捉、または（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有する、プライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製、続いて、ビオチン化プローブを用いた、所望の標的の向上した捕捉に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、リンカー配列または任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続いてよい。
注１：オリゴヌクレオチドは任意のブロック基を５’側に含有し、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：５’末端リンカーは、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成されてよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。
注５：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注６：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注７：（ローリングサークル増幅により生成した）標的のタンデムリピートコピーの捕捉は、多価結合による、正しい標的の捕捉の向上という固有の利点をもたらす。これにより、より効率の高い捕捉、及び不必要な配列のより低い捕捉をもたらす、更にストリンジェントなハイブリダイゼーション／捕捉条件が可能となる。本アプローチを用いて、反復配列（即ち、ＡＧＡＴテトラヌクレオチド反復）を含有する標的を全て捕捉することもまた可能であり、ヘテロ接合性の喪失、コピー数の変形、ハロタイピング、父系の確立、及び他の用途に関するスコアリングが可能となる。
注８：固有配列識別子は、ローリングサークルまたは他の選択／増幅ステップの後であっても、それぞれの元の標的配列が固有にスコアリングされ、各標的の元のコピー数の正確な定量が確実に可能になる。
注９：固有の識別子配列はリンカーの両端に付加させることができる。過剰の塩基が標的ＤＮＡに付加されない（即ち、クレノウステップを飛ばす）場合、平滑末端ライゲーションを用いる。リンカー同士のライゲーションを避けるために、リンカーの平滑末端はリン酸化されていない。 固有識別子及び平滑末端を含有するリンカーの例を、オリゴヌクレオチドｉＳｘ−２０１−ＭｄＡｄＴ（トップ鎖）、及びｉＳｘ−２０２−ＭｄＬｇＡｄＢ−ｂｋ（ボトム鎖）として提供する（表１を参照）。トップ鎖のほうが長く、ライゲーションされてない側に５’一本鎖オーバーハングを作製する。ボトム鎖は５’ＯＨを有し、任意で、伸長を防ぐための３’ブロック基、及び、トップ鎖の固有の識別子配列と対形成する場合にユニバーサル塩基として機能する内部５−ニトロインドール基を含有する。平滑末端リンカーのライゲーションの後、固有配列を二本鎖ＤＮＡの５’末端に付加させ、これらの配列は、ポリメラーゼを有する３’末端を伸長することによりコピーされる。任意で、トップ鎖は、ＵＤＧ及びＦＰＧによる後続の切断により、後続ステップでのライゲーション及び環化に好適な５’ホスフェートを遊離させるための、ｄＵ塩基を含有する。リンカーｉＳｘ−２０１−ＭｄＡｄＴ（表１を参照）は、ニック翻訳を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、新しく遊離した５’ホスフェートに隣接する任意のチオホスフェート基を含有してよい。
注１０：市販の機器で用いるための「バーコード」または「インデックス」配列を含む、より長いリンカー配列と用いるためのオリゴヌクレオチドを設計する場合、ＰＣＲ、鎖置換増幅、またはこれらの組み合わせを用いて、オリゴヌクレオチドをアセンブルする必要があり得る。ＰＣＲの間に、ＵＤＧによる後続の切断に好適な、ＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いてウラシルに組み込む。リバース鎖プライマーをリン酸化して、λエキソヌクレアーゼまたは類似の５’→３’エキソヌクレアーゼを用いて分解を可能にすることができる。ｄＡ３０配列をフォワードプライマーの５’末端に付加させ、鎖置換増幅を可能にすることができる。上記リンカーと共に用いるのに好適な、リバース相補配列のアセンブリのためのオリゴヌクレオチドの例は、ｉＳｘ−２０４−ｂｋＡ３０−Ｌｋ−Ｆ２、ｉＳｘ−２０５−ｒ５０３−Ｆ３、ｉＳｘ−２０６−ｄ７０１−Ｒ４、及びｉＳｘ−２０７−Ｌｋ−Ｒ５である（表１を参照）。
注１１：付加に関する別の変形において、固有の識別子配列をリンカーの両側に付加させることができ、一方の鎖はまた、市販の機器と共に用いるための「バーコード」または「インデックス」配列を含む（例えば、図６４を参照）。リンカーとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドとの間の長い領域を分割することにより、異なる配列を直接合成し、長さを約１００塩基に保ってよい。インデックスまたはバーコード配列、固有識別子及び平滑末端を含有するリンカーの例は、オリゴヌクレオチドｉＳｘ−２１１−ｒ７０２−ＬｇＡｄＴ（トップ鎖）、及びｉＳｘ−２０２−ＭｄＬｇＡｄＢ−ｂｋ（ボトム鎖、上に同じ）として提供される（表１を参照）。トップ鎖は相当により長く、ライゲーションしてない側に５’一本鎖オーバーハングを作製する。ボトム鎖は５’ＯＨを有し、任意で、伸長を防ぐための３’ブロック基、及び、トップ鎖の固有の識別子配列と対形成する場合にユニバーサル塩基として機能する内部５−ニトロインドール基を含有する。平滑末端リンカーのライゲーションの後、固有配列を二本鎖ＤＮＡの５’末端に付加させ、これらの配列は、ポリメラーゼを有する３’末端を伸長することによりコピーされる。任意で、トップ鎖は、ＵＤＧ及びＦＰＧによる後続の切断により、後続ステップでのライゲーション及び環化に好適な５’ホスフェートを遊離させるための、ｄＵ塩基を含有する。ブリッジオリゴヌクレオチドのｉＳｘ−２１２−ｒ５０３−Ｒ４（表１を参照）は、リンカー、及び長い伸長３’末端を含有する切断５’ホスフェートにハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長、及びリガーゼによる環化を可能にする。
注１２：上記プライマー及びリンカー設計を用いて生成した上述の生成物を用いて、クラスターもしくはビーズ増幅、または市販機器のウェル、アドレス、フローセル表面内での捕捉の後、以下のプライマー：（ｉ）ｉＬｘ−００３−ＰＥｓｑＰ１、対形成したエンド配列決定プライマー１；（ｉｉ）ｉＬｘ−００４−ＢｒＣｄＲ１、インデックスプライマー、バーコード読取り１；（ｉｉｉ）ｉＬｘ−００１−Ｐ５−ＢｒＣｄＲ２、バーコード読取り２；及び（ｉｖ）ｉＬｘ−００５−ＰＥｓｑＰ２、対形成したエンド配列決定プライマー２（下表１に提供するプライマー配列）を用いて配列決定反応を開始してよい。
上記手順は、５’ＯＨを有するリンカーを用いる。変形５．２は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることと関係するいくつかの可能性のある問題を避けるために、５’ホスフェートを有するリンカーを用いる（例えば、図６３を参照）。
循環腫瘍細胞またはｃｆＤＮＡから単離したＤＮＡ中の既知の遺伝子（例えば、Ｂｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、腫瘍特異的コピー変化または変異の検出の正確な定量に関する詳細プロトコール：
５．２．ａ．ＣＴＣから単離したｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから開始し（約１５０ｂｐに剪断）、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いる４℃でのライゲーションは、断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。５’リンカーはホスフェート基を含有する（Ｔ４キナーゼを用いることで任意で付加される）。
５．２．ｂ．（リンカーの５’末端に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及びリンカーの３’末端に相補的な配列を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば４０〜５０℃で３０分）ことにより、オリゴヌクレオチドプローブが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドプローブは５’末端に任意のブロック基を含有してよい。ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、及び熱安定性リガーゼ（好ましくは株ＡＫ１６Ｄから）、ｄＮＴＰを、アニーリングステップの後、または手順の開始時点で加える。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
５．２．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、ビオチン化プローブを用いた所望の標的の配列特異的捕捉、または（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有する、プライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製、続いて、ビオチン化プローブを用いた、所望の標的の向上した捕捉に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、リンカー配列または任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続いてよい。
注１：オリゴヌクレオチドプローブが環化しないとなるように、オリゴヌクレオチドは５’側に任意のブロック基、または５’ＯＨを含有してよい。
注２：リンカーを５’ホスフェートと合成してよいか、またはＴ４キナーゼを用いてホスフェートを付加させてよい。
注３：（ローリングサークル増幅により生成した）標的のタンデムリピートコピーの捕捉は、多価結合による、正しい標的の捕捉の向上という固有の利点をもたらす。これにより、より効率の高い捕捉、及び不必要な配列のより低い捕捉をもたらす、更にストリンジェントなハイブリダイゼーション／捕捉条件が可能となる。本アプローチを用いて、反復配列（即ち、ＡＧＡＴテトラヌクレオチド反復）を含有する標的を全て捕捉することもまた可能であり、ヘテロ接合性の喪失、コピー数の変形、ハロタイピング、父系の確立、及び他の用途に関するスコアリングが可能となる。
注４：固有配列識別子は、ローリングサークルまたは他の選択／増幅ステップの後であっても、それぞれの元の標的配列が固有にスコアリングされ、各標的の元のコピー数の正確な定量が確実に可能になる。
注５：環化を促進するためのリンカー及び相補オリゴヌクレオチドの例は、それぞれｉＳｘ−２２０−ｄ５０３−ＡｄＴ１、ｉＳｘ−２２１−ｐｄ７０７−ＡｄＢ２、及びｉＳｘ−２２２−Ｌｋ−ｕＲＣ１である（表１を参照）である。ニック翻訳を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、リンカーｉＳｘ−２２０−ｄ５０３−ＡｄＴ１（表１を参照）は、５’末端から２番目及び３番目の位置に、任意のチオホスフェート基を含有してよい。
図６４及び６５に示すアプローチでは、ゲノムＤＮＡを全て捕捉して環化するためにユニバーサルリンカー及び、配列分析のための、標的を選択するためのビオチン化プローブを用いた、所望の標的の捕捉等の後のステップを用いる。ビオチン化プローブはハイブリダイゼーションの前、またはハイブリダイゼーションの後のいずれかでビーズ上に捕捉されるため、第２の場合においてハイブリダイゼーションステップが液体であるが、最終的に、液体を固体にするステップがあり、これらのステップは、より低い収率、または断片の脱落をもたらし得る。
変形５．３は、標的上で、互いの付近または互いに隣接してハイブリダイズするように設計されたプローブを用いることにより、捕捉ステップが液体で生じ、標的末端上でリンカーに対する「着地パッド（ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ）」を作製し、ハイブリダイゼーション、伸長を行い共有結合で閉じた環状標的を作製する、代替アプローチについて記載している。本アプローチは、反復ＤＮＡを含有する標的を選択する場合に部分的に有用となり得る。
循環腫瘍細胞またはｃｆＤＮＡから単離したＤＮＡ中の既知の遺伝子（例えば、Ｂｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、腫瘍特異的コピー変化または変異の検出の正確な定量に関する詳細プロトコール：
５．３．ａ．ＣＴＣから単離したｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから開始し（約１５０ｂｐに剪断）、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いる４℃でのライゲーションは、断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。リンカーを５’ホスフェートと合成してよいか、またはＴ４キナーゼを用いてホスフェートを付加させてよい。任意で、ライゲーションしていないリンカーから標的ＤＮＡを精製する。
５．３．ｂ．（標的の固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）に相補的な５’配列、任意のスペーサー領域、リンカーの５’末端に相補的な配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意のスペーサー領域、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）に相補的であり、かつ標的に相補的な５’配列に隣接する３’配列を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドは５’側に任意のブロック基を含有してよい。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、並びに（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。リンカー配列が５’ホスフェートを有する場合において、ＫｌｅｎＴａｑは、ライゲーション能のある５’末端に隣接するまで３’末端を伸長する（図７０の左側）。リンカー配列が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図７０の右側）。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
５．３．ｃ．任意で、切断可能な結合にてオリゴヌクレオチドプローブを切断する（例えば、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断したＵ）。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、ビオチン化プローブを用いた所望の標的の配列特異的捕捉、または（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有する、プライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製、続いて、ビオチン化プローブを用いた、所望の標的の向上した捕捉に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、リンカー配列または任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続いてよい。
注１：オリゴヌクレオチドは任意のブロック基を５’側に含有し、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げてよい。あるいは、切断可能な結合は元のオリゴヌクレオチドに含まれてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：５’末端リンカーは、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成されてよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。
注５：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注６：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注７：（ローリングサークル増幅により生成した）標的のタンデムリピートコピーの捕捉は、多価結合による、正しい標的の捕捉の向上という固有の利点をもたらす。これにより、より効率の高い捕捉、及び不必要な配列のより低い捕捉をもたらす、更にストリンジェントなハイブリダイゼーション／捕捉条件が可能となる。本アプローチを用いて、反復配列（即ち、ＡＧＡＴテトラヌクレオチド反復）を含有する標的を全て捕捉することもまた可能であり、ヘテロ接合性の喪失、コピー数の変形、ハロタイピング、父系の確立、及び他の用途に関するスコアリングが可能となる。
注８：固有配列識別子は、ローリングサークルまたは他の選択／増幅ステップの後であっても、それぞれの元の標的配列が固有にスコアリングされ、各標的の元のコピー数の正確な定量が確実に可能になる。
注９：単一の塩基Ｔオーバーハングライゲーションを用いて、固有の識別子配列を、「インデックス」または「バーコード」配列を含むリンカーの両側に付加させてよい（例えば、図６７を参照）。Ｔ４ポリメラーゼにより標的末端を修復し、Ｔ４キナーゼにより５’末端をリン酸化する。３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片を用いて、Ａ塩基を標的の３’末端に加える。３０℃にてＴ４リガーゼを用いて、３’Ｔオーバーハングを３個の「ギャップ」リンカー上にライゲーションする。３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片を用いてギャップを埋め、Ｔ４リガーゼの存在下で小さなリンカー鎖にライゲーションする。任意で、３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼを用いてギャップを埋め、Ｔ４リガーゼの存在下で小さなリンカー鎖にライゲーションする。かかる３個のリンカーオリゴヌクレオチドの例は、ｉＳｘ−２２３−ｄ５０４−ＡｄＴ３、ｉＳｘ−２２４−ｐＳｍＡｄＴ４、及びｉＳｘ−２２５−ｐｄ７０８−Ｎ６ＡｄＢ５である（表１を参照）。ニック翻訳を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、リンカーｉＳｘ−２２３−ｄ５０４−ＡｄＴ３（表１を参照）は、５’末端の２番目及び３番目の位置に任意のチオホスフェート基を含有してよい。
注１０：平滑末端ライゲーションを用いて、固有の識別子配列を「インデックス」または「バーコード」配列を含むリンカーの両側に付加させてよい。Ｔ４ポリメラーゼにより標的末端を修復する。３０℃にてＴ４リガーゼを用いて、３個の「ギャップ」リンカーに３’ホスフェート及び平滑オーバーハングをライゲーションする。３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片を用いて３７℃にてギャップを埋め、５０℃まで加熱して小さいリンカーを変性させる。（３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠いているが５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてギャップを埋め、熱安定性リガーゼにより標的にライゲーションする。３個のリンカーオリゴヌクレオチドの例は、ｉＳｘ−２２６−ｄ５０５−ＡｄＴ６、ｉＳｘ−２２７−ＳｍＡｄＴ７ｐ、及びｉＳｘ−２２５−ｐｄ７０８−Ｎ６ＡｄＢ５である（上に同じ；表１を参照）。ニック翻訳を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、リンカーｉＳｘ−２２６−ｄ５０５−ＡｄＴ６（表１を参照）は、５’末端から２番目及び３番目の位置に任意のチオホスフェート基を含有してよい。
注１１：逆転写を用いて、固有の識別子配列を「インデックス」または「バーコード」配列を含むリンカーの両側に付加させてよい。Ｔ４ポリメラーゼにより標的末端を修復し、Ｔ４キナーゼにより５’末端をリン酸化する（例えば、図６８を参照）。逆転写酵素を用いて３つのＣ塩基を３’末端に加える。第１のリンカーが３’末端上にｒＧｒＧ＋Ｇを有し、（＋ＧはＬＮＡ、ｒＧ３の記号である）、患者及び固有識別子を有するプライマー結合部位、並びに５’ホスフェートを有し、一方で第２のリンカーは患者識別子を有するプライマー結合部位を有するリンカー対をハイブリダイズする。逆転写酵素は鎖のスイッチングを経て、固有の識別子をコピーしてギャップを埋める。リガーゼは伸長標的を第２のリンカーと共有結合して閉じる。ＲＮａｓｅＨ２はＲＮＡ塩基を切断し、第１のリンカー配列内のｒＧ３（ｒＧｒＧ＋Ｇ）の３’0Ｈを遊離させる。ポリメラーゼはギャップを埋め、リガーゼが伸長末端を共有結合により閉じる。かかるリンカーオリゴヌクレオチドの例は、ｉＳｘ−２２８−ｄ５０６−ＡｄＴ８３＋Ｇ、及びｉＳｘ−２２９−ｐｄ７０９−ＡｄＢ６である。ニック翻訳を防止し、標的のリンカー末端との環化を促進するために、リンカーｉＳｘ−２２８−ｄ５０６−ＡｄＴ８３＋Ｇ（表１を参照）は、５’末端の２番目及び３番目の位置に任意のチオホスフェート基を含有してよい。
注１２：１つの変形は、伸長／ライゲーション及切断剤による処理の後、ローリングサークル増幅によりタンデムリピート生成物を生成するのに好適な固有のプライマーを標的鎖に生成するように、複数の切断可能な結合を含むオリゴヌクレオチドを用いることである。ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成するのに好適なかかるオリゴヌクレオチドの例は下表１に示されており、（ｉ）ＫＲＡＳフォワード及びリバース標的伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−２３２−ＫＲＳ−Ｔ３２、ｉＳｘ−２３３−ＫＲＳ−Ｂ３３）；（ｉｉ）ＢＲＡＦフォワード及びリバース標的伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−２３４−ＢＲＦ−Ｔ３４、ｉＳｘ−２３５−ＢＲＦ−Ｂ３５）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバース標的伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−２４１−ＴＰ５３ｅ５−Ｔ４１、ｉＳｘ−２４２−ＴＰ５３ｅ５−Ｂ４２、ｉＳｘ−２４３−ＴＰ５３ｅ５−Ｔ４３、ｉＳｘ−２４４−ＴＰ５３ｅ５−Ｂ４４）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバース標的伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−２４５−ＴＰ５３ｅ６−Ｔ４５、ｉＳｘ−２４６−ＴＰ５３ｅ６−Ｂ４６）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバース標的伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−２４７−ＴＰ５３ｅ７−Ｔ４７、ｉＳｘ−２４８−ＴＰ５３ｅ７−Ｂ４８）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバース標的伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−２４９−ＴＰ５３ｅ８−Ｔ４９、ｉＳｘ−２５０−ＴＰ５３ｅ８−Ｂ５０）を含む。ニック翻訳を防止し、相補標的での環化を促進するために、上述の伸長／ライゲーションオリゴヌクレオチドは、５’末端の２番目及び３番目の位置に任意のチオホスフェート基を含有してよい。
注１３：あるいは、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成した後、これらの領域を、新しく加えた標的特異的プライマーを用いたローリングサークル増幅に供し、タンデムリピート生成物を生成してよい。これらの生成物は、固体支持体上での標的特異的オリゴヌクレオチドによる所望標的の捕捉前、または後のいずれかに生成してよい（以下の注８を参照）。プライマーは１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）等の内部で切断可能なヌクレオチド塩基、または脱塩基部位を含有することができ、ローリングサークル増幅の間に、コンタミネーションのキャリーオーバーに対する保護のために、ｄＵＴＰの組み込みが可能となる。かかるプライマーの例は下表１に示され、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳのフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１０８−ＫＲＳ−ｒｃＦ２６、ｉＳｘ−１０９−ＫＲＳ−ｒｃＲ２７）；（ｉｉ）ＢＲＡＦのフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１１８−ＢＲＦ−ｒｃＦ２６、ｉＳｘ−１１９−ＢＲＦ−ｒｃＲ２７）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１２８−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＦ６６、ｉＳｘ−１２９−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＲ６７；ｉＳｘ−１３０−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＦ６８、ｉＳｘ−１３１−ＴＰ５３ｅ５−ｒｃＲ６９）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１３８−ＴＰ５３ｅ６−ｒｃＦ７６、ｉＳｘ−１３９−ＴＰ５３ｅ６−ｒｃＲ７７）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１４８−ＴＰ５３ｅ７−ｒｃＦ８６、ｉＳｘ−１４９−ＴＰ５３ｅ７−ｒｃＲ８７）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバースプライマー（ｉＳｘ−１５８−ＴＰ５３ｅ８−ｒｃＦ９６、ｉＳｘ−１５９−ＴＰ５３ｅ８−ｒｃＲ９７）。
注１４：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びホットスポットを含有するＴＰ５３エクソン５〜８の標的領域を含む環状生成物を生成し、かつ／またはタンデムリピート生成物を生成した後、これらの生成物は、固体支持体上での後続の捕捉に好適な捕捉基を含有するより長いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより捕捉され得る。ストレプトアビジンコートした固体表面を介しての捕捉に好適な、ビオチン基を含有するかかる捕捉オリゴヌクレオチドの例は下表１に示されており、以下を含む：（ｉ）ＫＲＡＳフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０１３−ＫＲＳ−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０１４−ＫＲＳ−ｂｃＲ２）；（ｉｉ）ＢＲＡＦフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０２０−ＢＲＦ−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０２１−ＢＲＦ−ｂｃＲ２）；（ｉｉｉ）ＴＰ５３エクソン５のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０３０−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＦ１、ｉＳｘ−０３１−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＲ２；ｉＳｘ−０３２−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＦ３、ｉＳｘ−０３３−ＴＰ５３ｅ５−ｂｃＲ４）；（ｉｖ）ＴＰ５３エクソン６のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０５０−ＴＰ５３ｅ６−ｂｃＦ５、ｉＳｘ−０５１−ＴＰ５３ｅ６−ｂｃＲ６）；（ｖ）ＴＰ５３エクソン７のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０６０−ＴＰ５３ｅ７−ｂｃＦ７、ｉＳｘ−０６１−ＴＰ５３ｅ７−ｂｃＲ８）；並びに（ｖｉ）ＴＰ５３エクソン８のフォワード及びリバース捕捉オリゴヌクレオチド（ｉＳｘ−０７０−ＴＰ５３ｅ８−ｂｃＦ９、ｉＳｘ−０７１−ＴＰ５３ｅ８−ｂｃＲ１０）。
注１５：上記プライマー及びリンカー設計を用いて生成した上述の生成物を用いて、クラスターもしくはビーズ増幅、または市販機器のウェル、アドレス、フローセル表面内での捕捉の後、以下のプライマー：（ｉ）ｉＬｘ−００３−ＰＥｓｑＰ１、対形成したエンド配列決定プライマー１；（ｉｉ）ｉＬｘ−００４−ＢｒＣｄＲ１、インデックスプライマー、バーコード読取り１；（ｉｉｉ）ｉＬｘ−００１−Ｐ５−ＢｒＣｄＲ２、バーコード読取り２；及び（ｉｖ）ｉＬｘ−００５−ＰＥｓｑＰ２、対形成したエンド配列決定プライマー２を用いて配列決定反応を開始してよい（プライマー配列は以下の表１に提供する）。
図７０に記載するアプローチを、オリゴヌクレオチドプローブ及びリンカー含有標的の両方のライゲーションに用い、結合した環状ライゲーション生成物を得た。続いて、切断可能な結合にニックを導入する。反復配列に関して、以下の変形５．４に示すように、３つのｄＮＴＰのみを用いて３’末端を伸長することだけができる。例えば図７７を参照。
循環腫瘍細胞またはｃｆＤＮＡから単離したＤＮＡ中の既知の遺伝子（例えば、Ｂｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、腫瘍特異的コピー変化または変異の検出の正確な定量に関する詳細プロトコール：
５．４．ａ．ＣＴＣから単離したｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから開始し（約１５０ｂｐに剪断）、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いる４℃でのライゲーションは、断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。リンカーを５’ホスフェートと合成してよいか、またはＴ４キナーゼを用いてホスフェートを付加させてよい。任意で、ライゲーションしていないリンカーから標的ＤＮＡを精製する。
５．４．ｂ．（リンカーの５’末端に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意のスペーサー領域、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び標的の固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）に相補的な３’配列を含む）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドプローブを所望の断片上の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドプローブは５’側に任意のブロック基を含有してよい。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、並びに（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、並びにＡＧＡＴ反復の例として、３つの相補ヌクレオチド（即ちｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ）のみを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。リンカー配列が５’ホスフェートを有する場合において、ＫｌｅｎＴａｑは、ライゲーション能のある５’末端に隣接するまで３’末端を伸長する（図７７の左側）。リンカー配列が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図７７の右側）。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
５．４．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、ビオチン化プローブを用いた所望の標的の配列特異的捕捉、または（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有する、プライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製、続いて、ビオチン化プローブを用いた、所望の標的の向上した捕捉に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、リンカー配列または任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続いてよい。
注１：オリゴヌクレオチドは任意のブロック基を５’側に含有し、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：５’末端リンカーは、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成されてよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。
注５：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注６：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注７：（ローリングサークル増幅により生成した）標的のタンデムリピートコピーの捕捉は、多価結合による、正しい標的の捕捉の向上という固有の利点をもたらす。これにより、より効率の高い捕捉、及び不必要な配列のより低い捕捉をもたらす、更にストリンジェントなハイブリダイゼーション／捕捉条件が可能となる。本アプローチを用いて、反復配列（即ち、ＡＧＡＴテトラヌクレオチド反復）を含有する標的を全て捕捉することもまた可能であり、ヘテロ接合性の喪失、コピー数の変形、ハロタイピング、父系の確立、及び他の用途に関するスコアリングが可能となる。
注８：固有配列識別子は、ローリングサークルまたは他の選択／増幅ステップの後であっても、それぞれの元の標的配列が固有にスコアリングされ、各標的の元のコピー数の正確な定量が確実に可能になる。
ポリメラーゼ伸長及びニック翻訳に関する問題を回避するために、この手順は、図７８（変形５．５）に示すように、リガーゼのみ、または、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性と組み合わせたリガーゼを用いて、ポリメラーゼ伸長ステップなしで実施してもよい。秘訣は固有の識別子配列をリンカーに付加させることである。
循環腫瘍細胞またはｃｆＤＮＡから単離したＤＮＡ中の既知の遺伝子（例えば、Ｂｒａｆ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３）における、腫瘍特異的コピー変化または変異の検出の正確な定量に関する詳細プロトコール：
５．５．ａ．ＣＴＣから単離したｃｆＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから開始し（約１５０ｂｐに剪断）、Ｔ４ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼにより末端を修復し、続いて、単一の塩基３’Ａオーバーハングをクレノウ（エキソ）及びｄＡＴＰと共に加える。Ｔ４リガーゼを用いる４℃でのライゲーションは、断片の両端にリンカーを付加させるように、リンカーは単一の塩基３’Ｔオーバーハングを有する。リンカーは、リンカーの５’一本鎖側に固有の識別子配列を含有し、かつ５’ホスフェートと合成されてもよいし、または、Ｔ４キナーゼを用いてホスフェートが付加されてもよい。任意で、ライゲーションしていないリンカー及び／またはｄＮＴＰから標的ＤＮＡを精製する。
５．５．ｂ．（標的の固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）に相補的な５’配列、任意のスペーサー領域、リンカーの５’末端に相補的な配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、任意のスペーサー領域、リンカーの３’末端に相補的な配列、及び、標的の固有または反復部分（即ちＡＧＡＴ反復）に相補的であり、かつ、単一の塩基またはフラップにより、標的の５’配列に直接隣接しているかまたは重複している３’配列を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で、両端にリンカーを含有する標的ＤＮＡを変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドは５’側に任意のブロック基を含有してよい。任意で、Ｔａｑポリメラーゼ及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼのいずれかを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。リンカー配列が５’ホスフェートを有する場合において、３’リンカーはライゲーション能のある５’末端に直接隣接する（図７８の左側）。リンカー配列が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基またはフラップを切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図７８の右側）。任意をフラップ切断し、ハイブリダイゼーション温度のライゲーションさせ、及び任意で温度を上げる（例えば６０℃）、確実にライゲーションを完了させ、環状生成物を生成する。
５．５．ｃ．任意で、切断可能な結合にてオリゴヌクレオチドプローブを切断する（例えば、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いて切断したＵ）。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、ビオチン化プローブを用いた所望の標的の配列特異的捕捉、または（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有する、プライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製、続いて、ビオチン化プローブを用いた、所望の標的の向上した捕捉に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、リンカー配列または任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続いてよい。
注１：オリゴヌクレオチドは任意のブロック基を５’側に含有し、オリゴヌクレオチドプローブが環化しないように、後続のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を妨げてよい。あるいは、切断可能な結合は元のオリゴヌクレオチドに含まれてよい。
注２：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注３：（ローリングサークル増幅により生成した）標的のタンデムリピートコピーの捕捉は、多価結合による、正しい標的の捕捉の向上という固有の利点をもたらす。これにより、より効率の高い捕捉、及び不必要な配列のより低い捕捉をもたらす、更にストリンジェントなハイブリダイゼーション／捕捉条件が可能となる。本アプローチを用いて、反復配列（即ち、ＡＧＡＴテトラヌクレオチド反復）を含有する標的を全て捕捉することもまた可能であり、ヘテロ接合性の喪失、コピー数の変形、ハロタイピング、父系の確立、及び他の用途に関するスコアリングが可能となる。
注４：固有配列識別子は、ローリングサークルまたは他の選択／増幅ステップの後であっても、それぞれの元の標的配列が固有にスコアリングされ、各標的の元のコピー数の正確な定量が確実に可能になる。
予測実施例６−エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離した腫瘍特異的ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡの正確な定量（例えば、転帰を予想する、または治療をガイドする多数の発現マーカー）。
腫瘍特異的ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ発現の変化は、組織特異的な方法で病気の状態を分類するための強力な手段である。これには、ｍＲＮＡもしくはｌｎｃＲＮＡの特定のエクソンの正確な検出及び定量（例えば図１０８、１１１、１１２を参照）、または、ｍＲＮＡ中に存在する遺伝子融合の再発の検出及び定量（例えば図１０９及び１１０を参照）が含まれる。ｐｏｌｙ−Ａ ｍＲＮＡもしくはｐｏｌｙ−Ａ ｌｎｃＲＮＡ、またはこれら全ては、エクソソームまたは循環腫瘍細胞のいずれかから単離され、本プロセスで使用するための逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに転換される。ｃＤＮＡは、通常、特定の転写物のエクソン−イントロン境界にまたがる領域の最大の特異性を得るための標準的な設計規則を用いて、エクソン特異的プライマーを用いて生成される。あるいは、ランダム六量体のプライミングを用いてトランスクリプトーム全体をコピーしてもよく、またはｐｏｌｙ ｄＴプライマーを用いて、全ての転写物の３’末端を濃縮してよい。
隣接するが分離した領域に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ標的にハイブリダイズする。図１０８及び１１２は、５’及び３’オリゴヌクレオチド間のギャップ（即ち、１０〜２０ヌクレオチド）（ポリメラーゼを用いて、標的結合配列の３’末端を伸長して標的配列のいくつかをコピーし、ギャップを閉じて後続のライゲーションに好適なライゲーション能のある接合部を生成して環状生成物を形成する）を用いるエクソン検出及び定量方法を示す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの５’及び３’末端間のギャップは１０〜２０ヌクレオチドである。しかし、コピーされるギャップは、後続の配列決定ステップで用いられる読取りの長さに調節することができる。図１１１は、２つの標的結合配列が互いに直接隣接し、ギャップが存在しないエクソン検出及び定量方法を示す。
これらのレポーター環の計数は、次世代配列決定を含むがこれらに限定されない種々の定量方法により実施することができる。環形成による、多くの標的配列の同時多重検出を可能にすることに加えて、読出しとしての次世代配列決定は、ライゲーションによるアーチファクトから正当なライゲーション生成物を速やかに区別し、アッセイの感度を増加させるレポーター環についての追加情報（２つの固有識別子）を提供する。
図１０９及び１１０は、ｍＲＮＡで見出される遺伝子融合の再発の検出及び定量のための２つの変形を示す。２つの遺伝子の融合接合部は、ある遺伝子の２つの５’末端と別の遺伝子の３’末端との間から、数百〜数千の塩基長の配列欠失と共に不正確に生じるため、不確定の融合接合部の上流及び下流に多数のプローブを含有するアッセイを設計するのは難しく、そのため、本明細書で記載される方法では、一端に上流エクソンを、そして他端に下流エクソンをそれぞれ有する、２つの半環状オリゴヌクレオチドプローブを利用する。両方のプローブ（４つの末端）の間のギャップに隣接する、またはｃＤＮＡ標的上で互いに直接隣接する、これらの両方のプローブのハイブリダイゼーション時にのみ、ライゲーションが生じ単一の環状生成物を形成することが可能である。ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブの（エキソヌクレアーゼを用いる）後続分解は、ある変形（例えば図１０９を参照）において、元の標的ｃＤＮＡからの更なる配列情報を含有しない（ギャップがない）環状生成物を残す。別の変形において（例えば図１１０）、ポリメラーゼはプローブのそれぞれの３’末端を、近くのプローブのそれぞれの５’末端と出会うまで伸長し、ギャップを閉じる。これらのレポーター環は共に、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及びこれらの１つ、任意のプライマー結合部位を含有する。これらのレポーター環の計数は、次世代配列決定を含むがこれらに限定されない種々の定量方法により実施することができる。多くの融合転写物の同時多重検出を可能にすることに加えて、次世代配列決定は、ライゲーションによるアーチファクトから正当なライゲーション生成物を速やかに区別するレポーター環についての更なる情報（固有識別子の２つのコピー）を提供する。２つの変形（図１０９及び１１０）はまた、それぞれ、ライゲーション能のある５’末端の生成に対する２つのアプローチを示す。ハイブリダイゼーションの前にプローブが５’ホスフェートを有する（図の左側）か、またはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を用いるかのいずれかにより、マッチする５’重複塩基またはフラップを切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを生成する（図の右側）。
エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離したｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ内のエクソンの検出及び定量に関する詳細プロトコール。
変形６．１：例えば図１０８参照。６．１．ａ．エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離したｐｏｌｙ−Ａ ｍＲＮＡもしくはｐｏｌｙ−Ａ ｌｎｃＲＮＡ、またはこれら全てから開始し、逆転写酵素及びエクソン特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを生成する。
６．１．ｂ．（５’側のｃＤＮＡの一部に相補的な５’プローブ領域、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び３’側のｃＤＮＡの別の部分に相補的な３’プローブ領域を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で標的ｃＤＮＡを変性させ（９４℃で１分間）、所望の温度に冷却する（例えば４０〜５０℃で３０分）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。オリゴヌクレオチドは、５’末端に任意のホスフェート基を、またはマッチする５’重複塩基もしくはフラップを含有してよい。任意で、Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、並びに（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、並びに任意でｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。オリゴヌクレオチドが接合部において３’ＯＨに直接隣接する５’ホスフェートを有する場合において、リガーゼを用いて２つの末端を直接結合してよい（図１０８の右側）。オリゴヌクレオチドが５’及び３’末端の間にギャップを有する５’ホスフェートを有する場合において、３’ＯＨはＫｌｅｎＴａｑにより伸長される。オリゴヌクレオチドが５’ＯＨを有する場合において、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性がマッチする５’重複塩基またはフラップを切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図１０８の左側）。 ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
６．１．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ｃＤＮＡの短い伸長コピー、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残して、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注２：オリゴヌクレオチドの５’末端を、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成してよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注３：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注５：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注６：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注７：ＭＭＬＶ逆転写酵素を改変して、全ての投入ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）から、５０〜６０℃にてｃＤＮＡを合成してよい。あるいは、ＴｔｈまたはＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、逆転写活性を向上させた（Ｍｎ補助因子の追加が必要となる場合がある）。最終的に好熱性ＰｙｒｏＰｈａｇｅ ３１７３ ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有し、これもまた用いてよい。
エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離したｍＲＮＡ内の遺伝子融合の検出及び定量に関する詳細プロトコール
変形６．２：（例えば図１０９を参照）。６．２．ａ．エクソソームまたはＣＴＣから単離したｍＲＮＡをまず、任意の可能な融合転写物に接合部にまたがるような方法で、逆転写酵素によりｃＤＮＡに転換する。好ましい方法において、エクソン特異的プライマーを用いる。
６．２．ｂ．２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃１の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的エクソン＃２の固有部分に相補的な３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃２の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び標的エクソン＃１の固有部分に相補的な３’配列を含む）の存在下で標的ｃＤＮＡを変性させ（９４℃で１分間）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、並びに任意でＴａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ホスフェートを有する場合において、ポリメラーゼは必要ではない（図１０９の左側）。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図１０９の右側）。フラップを切断し、ハイブリダイゼーション温度にてライゲーションさせ、任意で温度を上げ（例えば６０℃）、フラップ切断及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
６．２．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注２：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注３：それぞれ固有の識別子配列、任意の患者識別子配列及び任意のプライマー結合部位を含有する２つの架橋オリゴヌクレオチドプローブを用いるシステムにおいて、オリゴヌクレオチドの両方ではなく一方のみがプライマー結合部位（上流または下流オリゴヌクレオチドのいずれか）を含有することが推奨される。偽陽性検出の追加レベルに関して、固有の識別子配列は上流及び下流プローブで異なることが推奨される。
注４：ＭＭＬＶ逆転写酵素を改変して、全ての投入ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）から、５０〜６０℃にてｃＤＮＡを合成してよい。あるいは、ＴｔｈまたはＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、逆転写活性を向上させる（Ｍｎ補助因子の追加が必要となる場合がある）。最終的に好熱性ＰｙｒｏＰｈａｇｅ ３１７３ ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有し、これもまた用いてよい。
エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離したｍＲＮＡ内の遺伝子融合の検出及び定量のための別の変形に関する詳細プロトコール；
変形６．３：（例えば図１１０を参照）。６．３．ａ．エクソソームまたはＣＴＣから単離したｍＲＮＡをまず、任意の可能な融合転写物に接合部にまたがるような方法で、逆転写酵素によりｃＤＮＡに転換する。好ましい方法において、エクソン特異的プライマーを用いる。
６．３．ｂ．２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃１の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的エクソン＃２の固有部分に相補的な３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃２の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び標的エクソン＃１の固有部分に相補的な３’配列を含む）の存在下で標的ｃＤＮＡを変性させ（９４℃で１分間）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、並びにｄＮＴＰのいずれかを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ホスフェートを有する場合において、ＫｌｅｎＴａｑは、ライゲーション能のある５’末端に直接隣接するまで３’末端を伸長する（図１１０の左側）。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図１１０の右側）。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
６．３．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注２：オリゴヌクレオチドの５’末端を、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成してよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注３：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注５：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注６：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注７：それぞれが固有の識別子配列、任意の患者識別子配列及び任意のプライマー結合部位を含有する２つの架橋オリゴヌクレオチドプローブを用いるシステムにおいて、オリゴヌクレオチドの両方ではなく一方のみがプライマー結合部位（上流または下流オリゴヌクレオチドのいずれか）を含有することが推奨される。偽陽性検出の追加レベルに関して、固有の識別子配列は上流及び下流プローブで異なることが推奨される。
注８：ＭＭＬＶ逆転写酵素を改変して、全ての投入ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）から、５０〜６０℃にてｃＤＮＡを合成してよい。あるいは、ＴｔｈまたはＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、逆転写活性を向上させる（Ｍｎ補助因子の追加が必要となる場合がある）。最終的に好熱性ＰｙｒｏＰｈａｇｅ ３１７３ ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有し、これもまた用いてよい。
エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離したｍＲＮＡに（互いに隣接し得ない）特定のエクソンを含有するｍＲＮＡの検出及び定量に関する詳細プロトコール；
変形６．４：（例えば図１１１参照）。６．４．ａ．エクソソームまたはＣＴＣから単離したｍＲＮＡをまず、両方のエクソン領域を含むような方法で、逆転写酵素によりｃＤＮＡに転換する。好ましい方法において、エクソン特異的プライマーを用いる。
６．４．ｂ．２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃１の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的エクソン＃２の固有部分に相補的な３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃２の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び標的エクソン＃１の固有部分に相補的な３’配列を含む）の存在下で標的ｃＤＮＡを変性させ（９４℃で１分間）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、並びに任意でＴａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ホスフェートを有する場合において、ポリメラーゼは必要ではない（図１１１の左側）。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図１１１の右側）。フラップを切断し、ハイブリダイゼーション温度にてライゲーションさせ、任意で温度を上げ（例えば６０℃）、フラップ切断及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
６．４．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注２：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注３：それぞれが固有の識別子配列、任意の患者識別子配列及び任意のプライマー結合部位を含有する２つの架橋オリゴヌクレオチドプローブを用いるシステムにおいて、オリゴヌクレオチドの両方ではなく一方のみがプライマー結合部位（上流または下流オリゴヌクレオチドのいずれか）を含有することが推奨される。偽陽性検出の追加レベルに関して、固有の識別子配列は上流及び下流プローブで異なることが推奨される。
注４：ＭＭＬＶ逆転写酵素を改変して、全ての投入ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）から、５０〜６０℃にてｃＤＮＡを合成してよい。あるいは、ＴｔｈまたはＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、逆転写活性を向上させる（Ｍｎ補助因子の追加が必要となる場合がある）。最終的に好熱性ＰｙｒｏＰｈａｇｅ ３１７３ ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有し、これもまた用いてよい。
エクソソーム、循環腫瘍細胞、または循環腫瘍細胞を含む全血細胞から単離したｍＲＮＡに（互いに隣接し得ない）特定のエクソンを含有するｍＲＮＡの検出及び定量に関する詳細プロトコール；
変形６．５：（例えば図１１２を参照）。６．５．ａ．エクソソームまたはＣＴＣから単離したｍＲＮＡをまず、両方のエクソン領域を含むような方法で、逆転写酵素によりｃＤＮＡに転換する。好ましい方法において、エクソン特異的プライマーを用いる。
６．５．ｂ．２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃１の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的エクソン＃２の固有部分に相補的な３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、標的エクソン＃２の固有部分に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び標的エクソン＃１の固有部分に相補的な３’配列を含む）の存在下で標的ｃＤＮＡを変性させ（９４℃で１分間）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、及びｄＮＴＰのいずれかを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ホスフェートを有する場合において、ＫｌｅｎＴａｑは、ライゲーション能のある５’末端に直接隣接するまで３’末端を伸長する（図１１２の左側）。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図１１２の右側）。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
６．５．ｃ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの代わりにＦｅｎヌクレアーゼを用いて、標的の５’側にライゲーション能のある５’ホスフェートを生成してよい。
注２：オリゴヌクレオチドの５’末端を、５’ホスフェート末端から２番目及び３番目の位置に（ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により遊離される）チオホスフェート結合を含有するように合成してよい。１つの塩基をあまりに多く伸長する（下流プライマーへのライゲーションが不可能となる）ことによるこれらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限に抑えるために、ライゲーション接合部での標的塩基は、３’側でＡＴリッチであり、５’側でＧＣリッチであることが好ましい。
注３：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、所望の５’ホスフェートに隣接する位置にアプリン（ＡＰ）部位を含有するように５’末端リンカーを合成してよい。この５’ホスフェートは、熱安定性エンドＩＩＩ（ＴｍａエンドＩＩＩ等）を用いて遊離される。この酵素は、プライマーが標的に結合した際に、５’ホスフェートを残してＡＰ部位を切断する。エンドヌクレアーゼは一本鎖プライマーもまた切断するが、効率が低いため、鋳型にハイブリダイズしたプライマーが好ましい基質となる。
注４：ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）を用いる場合、５’末端リンカーは、５’ホスフェートを含有するように合成されてよい。あるいは、標的ＤＮＡのライゲーションする前、またはライゲーションステップの後のいずれかに、Ｔ４キナーゼを用いて５’ホスフェートを加えてよい。
注５：（５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する）ＴａｑポリメラーゼとＫｌｅｎＴａｑ（５’→３’ヌクレアーゼ切断活性を有しないＴａｑポリメラーゼ）の１：２０混合物を、分布伸長の条件下（即ち、より高い塩濃度）にて用いて、ニック翻訳による標的ＤＮＡの分解を最小限に抑えることができる。
注６：オリゴヌクレオチドが任意のプライマー結合部位（即ち、ユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、または他の検出方法を用いた標的識別に好適である。
注７：それぞれが固有の識別子配列、任意の患者識別子配列及び任意のプライマー結合部位を含有する２つの架橋オリゴヌクレオチドプローブを用いるシステムにおいて、オリゴヌクレオチドの両方ではなく一方のみがプライマー結合部位（上流または下流オリゴヌクレオチドのいずれか）を含有することが推奨される。偽陽性検出の追加レベルに関して、固有の識別子配列は上流及び下流プローブで異なることが推奨される。
注８：ＭＭＬＶ逆転写酵素を改変して、全ての投入ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）から、５０〜６０℃にてｃＤＮＡを合成してよい。あるいは、ＴｔｈまたはＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、逆転写活性を向上させる（Ｍｎ補助因子の追加が必要となる場合がある）。最終的に好熱性ＰｙｒｏＰｈａｇｅ ３１７３ ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有し、これもまた用いてよい。
予測実施例７−エクソソームまたはアルゴノートタンパク質から単離した腫瘍特異的ｍｉＲＮＡ（例えば、転帰を予測または治療をガイドする多数のマイクロＲＮＡマーカー）の正確な定量。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、腫瘍の存在、分類及び予後の可能性のある組織特異的マーカーとして認識されている。ｍｉＲＮＡは、Ａｇｏ２タンパク質との複合体、またはエクソソームによりカプセル化のいずれかとして、血清及び血漿中に存在する。
図１１４〜１１７は、高正確性配列決定による、後続の計数のためのｍｉＲＮＡ配列の捕捉方法について記載する。図示する全ての方法において、プロセスは、好適な環状ＤＮＡに転換される、標的ｍｉＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーの作製を伴う。
血清、血漿またはエクソソーム内に存在している全てのｍｉＲＮＡ種の、選択なしでの捕捉、識別、及び定量に関する詳細プロトコール：
変形７．１：（例えば図１１４参照）。７．１．ａ．エクソソームまたはＣＴＣからｍｉＲＮＡを単離する。ユニバーサルリンカーを、ＲＮＡリガーゼ１を用いて、５’ホスフェート末端及びブロック３’末端を有するＤＮＡリンカーを用いてｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションする。
７．１．ｂ．変性ｍｉＲＮＡの５’末端をＴ４キナーゼによりリン酸化する。ユニバーサルリンカーを、５’ホスフェート及びブロック３’末端を有するＤＮＡを用いて、変性リンカーの５’末端にライゲーションする。
７．１．ｃ．過剰のリンカーを取り除いた後、（リンカーの５’及び３’末端に相補的な配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で核酸を変性させ（９４℃で１分）、所望の温度に冷却する（例えば４０〜５０℃で３０分）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。５’−３’活性を欠く逆転写酵素（即ち、Ｍn２＋補助因子を用いるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）、（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ及びｄＮＴＰを加える。成分は、アニーリングステップの後、または手順の開始時のいずれかに加える。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、かつ任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
７．１．ｄ．ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを加えて、元の標的内のｍｉＲＮＡにニック付加し、エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ｍｉＲＮＡのコピー、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残して、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するプライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いての、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続き得る。
注１：オリゴヌクレオチドがまた、任意のプライマー結合部位（即ちユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、環状ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーションまたは他の検出法を用いた標的の識別に適している。
本方法の次の変形（例えば、図１１５〜１１７を参照）は、血清、血漿またはエクソソームから単離した全てのｍｉＲＮＡからの特定のｍｉＲＮＡ配列を捕捉するように設計されている。これらの方法は、標的ｍｉＲＮＡ配列の全てまたはいくつかの部分に相補的な捕捉プローブを用いるが、続いて、元のｍｉＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーを作製するため、ｍｉＲＮＡ内の単一の塩基変異の検出、またはミスハイブリダイゼーションによる捕捉が可能となる。
血清、血漿、またはエクソソームに存在する特定のｍｉＲＮＡ種の、選択なしでの捕捉、識別及び定量に関する詳細プロトコール：
変形７．２：（例えば図１１５参照）。７．２．ａ．エクソソームまたはＣＴＣからｍｉＲＮＡを単離する。Ｔ４キナーゼを用いて、単離したｍｉＲＮＡをリン酸化する。オリゴヌクレオチド対をハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチドは、固有５’及び３’リンカー配列に隣接する、ｍｉＲＮＡ標的に相補的な配列を含むが、第２のオリゴヌクレオチドは、固有３’リンカーの相補体が続く５’リン酸化末端、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び最後の塩基がリボヌクレオチド塩基である固有５’リンカーの相補体を含む。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、ｍｉＲＮＡの末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製するために存在する。
７．２．ｂ．エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、所望の一本鎖環状ｍｉＲＮＡ−ＤＮＡキメラのみを残しながら、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチドを全て分解する。８０℃で２０分間加熱し、エキソヌクレアーゼを熱失活させる。
７．２．ｃ．ユニバーサル５’リン酸化プライマーを環状生成物に加え、３７℃にてハイブリダイズする。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く逆転写酵素（Ｍｎ２＋補助因子を用いるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）、（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、及びｄＮＴＰを加える。成分は、アニーリングステップの後、または手順の開始時のいずれかに加える。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、任意で温度を上げ（例えば６０℃）、伸長及びライゲーションを確実に完了させて、ここでは元の標的ｍｉＲＮＡのコピーを含有する環状生成物を生成する。
７．２．ｄ．ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを加えて、元の標的内のｍｉＲＮＡにニック付加し、エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ｍｉＲＮＡのコピー、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残して、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するプライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いての、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続き得る。
注１：オリゴヌクレオチドがまた、任意のプライマー結合部位（即ちユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、環状ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーションまたは他の検出法を用いた標的の識別に適している。
本方法の次の変形は、標的ｍｉＲＮＡのコピーを可能にするＣ６またはＣ１８スペーサーを用いるが、環状生成物の完成を防止し、それによって低量の所望のｍｉＲＮＡの偽陽性検出を排除する。５’末端に対して２番目及び３番目の位置におけるチオホスフェートを含有するユニバーサルプライマーのニック翻訳により、ライゲーションしていない任意のｍｉＲＮＡプローブの検出を可能にする標的ｍｉＲＮＡ結合相補配列の中央における、Ｃ６またはＣ１８スペーサーの交差は不可能となる。
血清、血漿、またはエクソソームに存在する特定のｍｉＲＮＡ種の、任意の選択なしでの捕捉、識別及び定量に関する詳細プロトコール：
変形７．３：（例えば図１１６を参照）。７．３．ａ．エクソソームまたはＣＴＣからｍｉＲＮＡを単離する。Ｔ４キナーゼを用いて、単離したｍｉＲＮＡをリン酸化する。オリゴヌクレオチド対をハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチドは、固有の５’及び３’リンカー配列に隣接する、単一のＣ６またはＣ１８スペーサーを含有するｍｉＲＮＡ標的に相補的な配列を含むが、第２のオリゴヌクレオチドは、固有の３’リンカーの相補体が続く５’リン酸化末端、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び最後の塩基がリボヌクレオチド塩基である固有の５’リンカーの相補体を含む。ハイブリダイゼーション混合物中にはまた、５’末端から２番目及び３番目の位置にチオホスフェート結合を含有するユニバーサルプライマーも存在する。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、ｍｉＲＮＡの末端を共有結合で閉じ、環状ライゲーション生成物を作製するために存在する。
７．３．ｂ．５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する逆転写酵素（Ｍｎ２＋補助因子を用いるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）を加え、及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。ハイブリダイゼーション温度伸長及びライゲーションさせ、任意で温度を上げ（例えば６０℃）、伸長及びライゲーションを確実に完了させて、ここでは元の標的ｍｉＲＮＡのコピーを含有する環状生成物を生成する。
７．３．ｃ．ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを加えて、元の標的内のｍｉＲＮＡにニック付加し、次いで、エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加え、元の標的ｍｉＲＮＡのコピー、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するプライマー結合配列に相補的なプライマーを用いた）ローリングサークル増幅による、所望の配列のタンデムリピートの作製に適している。これに、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、任意のプライマー結合配列をプライマー結合部位として用いての、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定が続き得る。
注１：オリゴヌクレオチドがまた、任意のプライマー結合部位（即ちユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、環状ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーションまたは他の検出法を用いた標的の識別に適している。
別の変異体（図１１７）は、標的ｍｉＲＮＡのいくつかの部分に相補的なステムループ捕捉プローブを利用する。詳細プロトコールは後述するとおりである。
血清、血漿、またはエクソソームに存在する特定のｍｉＲＮＡ種の、任意の選択なしでの捕捉、識別及び定量に関する詳細プロトコール：
変形７．４：（例えば図１１７を参照）。７．４．ａ．エクソソームまたはＣＴＣからｍｉＲＮＡを単離する。ステムループを形成する５’末端、標的ｍｉＲＮＡのいくつかの部分に相補的な突起状３’領域を含むステムループプローブをハイブリダイズする。ループ部分は、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の切断可能な結合を含有する。逆転写酵素及びｄＮＴＰにより、ステムループプローブの３’末端を伸長する。
７．４．ｂ．（伸長ｃＤＮＡの５’ステムループ配列及び３’末端に相補的な配列を含む）オリゴヌクレオチドの存在下で核酸を変性させる（９４℃で１分）。更に、５’末端をブロックしてニック翻訳を防止する。所望の温度に冷却する（例えば４０〜５０℃で３０分）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。
７．４．ｃ．ＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）及び（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。ＫｌｅｎＴａｑは、ライゲーション能のある５’末端まで直接隣接するまで３’末端を伸長する。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
７．４．ｄ．切断可能な結合にてオリゴヌクレオチドプローブを切断する（例えば、ＵＤＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼを用いてＵが切断される）。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ｃＤＮＡの短い伸長コピー、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物及び過剰のプローブを全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：オリゴヌクレオチドがまた、任意のプライマー結合部位（即ちユニバーサルプライマー結合部位）もまた含む場合、環状ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅、続いて、次世代配列決定、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＵｎｉＴａｑアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーションまたは他の検出法を用いた標的の識別に適している。
予測実施例８−母体の血漿試料からの出生前診断の臨床的必要性。
胎児検診分野において、２１、１８、または１３トリソミー等の一般的な異数性、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子での欠失から生じるもの等の小欠失、自閉症の原因となるもの等の他のコピー数の小さな異常、可能性のある臨床症状を測定するためのバランスの取れた転座、アンジェルマン症候群またはプラダー・ウィリー症候群等の刷り込みに関係する病気をもたらし得るメチル化変化、ハンチントン病等の病気の原因となる三塩基反復の変化、嚢胞性線維症の原因となるＣＦＴＲ遺伝子におけるもの等の点変異に対する非侵襲性アッセイを開発する緊急性が存在する。
概要：近年の研究は、血漿中における母体ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの割合（％）は、１番目、２番目及び３番目のトリメスターにおいてそれぞれ約６％、２０％及び２６％であることを示している。ＤＮＡが劣化する様式に起因して、母性ＤＮＡは通常約１６０塩基であり、依然としてＨ１ヒストンと関係している一方、胎児ＤＮＡは約１４０塩基であり、ヒストンとは関係がない。臨床的必要性、及び知識により最良のケアがもたらされる箇所に応じて、適切なトリメスターにおいて胎児ＤＮＡを検出するのに十分な感度を有する試験を開発することができる。
遺伝子が既知である、約３，５００種類の劣性遺伝病が存在する。最も一般的な疾患は、２１トリソミー等の過剰染色体、または、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子等の遺伝子の一部の欠失のいずれかの、ＤＮＡコピーの異常に起因する。出生前スクリーニングを考慮する際、遺伝病の確率と手技のリスクのバランスを取る必要がある。現在では、標準的なケアでは、３５歳の妊娠中の母の１７週の間に羊水穿刺が推奨されている。これは、１／２００である２１トリソミーまたは他の染色体異数性のリスクがここで、該手技の後の自然流産のリスクと一致するからである。
出生前スクリーニングに関する、本明細書で記載される核酸配列決定方法の使用を考慮する際、２つのレベルの試験が推奨される。２１、１３、及び１８トリソミーに対する、全ての妊娠期間の低コストスクリーニングのために、本発明の配列決定方法を用いて、染色体２１、１３、及び１８において異なって発現する遺伝子を速やかに識別することができる、例えば、メチル化サイレンシングの結果として、胎児内でスイッチがオフされるが、大人ではオンされるこれらの遺伝子を識別することができる。３つの対照染色体、即ち２、５、７において、類似の領域を識別する。最初のトリメスターで母の血清からＤＮＡを単離する時でも、対照の染色体領域間でメチル化ＤＮＡを非メチル化ＤＮＡと比較することにより、胎児から生じるＤＮＡの割合を速やかに計算することができる。本明細書の例では、この割合は６％である。他の染色体のいずれかにトリソミー、即ち２１トリソミーが存在する場合、この染色体からのプロモーターは約９％のメチル化を示し、換言すれば、通常の二染色体の場合よりも約５０％高い。トリソミーの場合についての９０個のメチル化コピーの数が、通常試料の６０個のメチル化コピーから容易に区別されるように、１，０００個のゲノム等価物のスコアリングが推奨される。
かかる手順の第１ステップとして、成長の初期段階の間に胎児ＤＮＡ内でメチル化されているが、母性ＤＮＡ（即ちＷＢＣ）で決してメチル化されないこれらのプロモーター領域を識別するために。これは、二倍体胎児を妊娠している女性、トリソミーを含有する胎児を妊娠している女性、及び妊娠していない女性から単離したｃｆＤＮＡにおけるメチル化パターンを比較することにより、実験的に実施される必要がある。ＮＩＰＤに対するエピジェネティックなマーカーを用いることに関する一般的な概要については、Ｐａｔｓａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ，”Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１５５−６１（２０１２）を参照のこと（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。単一のマーカーＰＤＥ９Ａにおいてメチル化状態を検出する例としては、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｉｎ Ｆｉｒｓｔ Ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｐｌａｓｍａ，”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１１）：ｅ２７７０９（２０１１）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）を参照のこと。本明細書で記載されるアプローチにより、かかるマーカーを更にはるかに速やかに識別可能となる。ゲノム全体での隣接ＨｉｎＰ１Ｉ部位におけるメチル化を識別するために、図２８に概説したアプローチを用いる。あるいは、選択した染色体上の既知の遺伝子に焦点を合わせる時、図２７にスコアリングされた特定の標的領域及びメチル化のためにプローブを設計することができる。本アプローチはまた、最終の出生前スクリーニングテストにも用いられる。ゲノム全体での、より多くのメチル化部位、即ちＨａｅＩＩＩ部位間の隣接ＡｃｉＩ部位に関して、図３６に概説したアプローチを用いる。既知の遺伝子に焦点を合わせる場合、図３６、３７、３９、及び４０でスコアリングした特定の標的領域及びメチル化に対してプローブを設計することができる。上記アプローチが十分なマーカーを産生しない場合、図３３に概説するアプローチを用いて、ゲノム全体での隣接ＡｃｉＩ部位におけるメチル化部位を識別してよい。これらの部位に関して、図２９、及び３１に概説する、より標的指向されたアプローチを用いてよい。
あるいは、胎児成長の間にはスイッチがオンされ、大人の組織または血液中ではスイッチがオフされるある種の遺伝子が存在する。これらの条件下において、二倍体胎児を妊娠している女性、トリソミーを含有する胎児を妊娠している女性、及び妊娠していない女性から単離したｃｆＤＮＡにおける非メチル化パターンを比較することにより、非メチル化プロモーター領域を識別することが重要となる。メチル化パターンのゲノム全般での喪失を識別するために、図５１、５７、または６２に記載する方法を用いてよい。選択した染色体上で既知の非メチル化遺伝子を識別するために、図５３、５５、５８、６０にスコアリングした特定の標的領域及び非メチル化に対してプローブを設計することができる。本アプローチはまた、最終の出生前スクリーニングテストにも用いられる。
更に、上記アプローチはゲノム内の他の位置にて、アンジェルマン症候群またはプラダー・ウィリー症候群等の、刷り込みに関係する病気をもたらし得るメチル化変化を正確に定量することが可能である。メチル化状態を決定し、同時に、ＳＮＰまたは反復配列多型検出により、欠失が父系染色体にあるのか、または母系染色体にあるのか（即ち、上流または下流のシス位置にある、母系または父系識別ＳＮＰまたは反復配列多型の欠失）を判定する本発明の能力は、刷り込み病の診察識別能を向上させる。
ＤＡＮＳＲと称される非侵襲性出生前診断のために染色体断片をカウントするリガーゼベースのアプローチが近年報告されている（（Ｓｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｔｒｉｓｏｍｙ，”Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ．３２（１）：３−９（２０１２）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。本アプローチは、染色体腕上でのライゲーション反応において３つの断片を使用することに基づく。左の断片は上流ユニバーサル配列を含有し、中央の断片及び右の断片は下流ユニバーサル配列を含有する。ライゲーション反応の後、生成物を投入プライマーから単離し、ＰＣＲ増幅して配列決定する。擬似ライゲーション（即ち、中央の断片がない、上流の偽の下流プライマーへの直接結合）は配列決定により容易に区別でき、５％未満であった。本発明はまた、図６３〜６９に記載するような、ゲノム全体のライゲーション生成物から特定の標的を捕捉するか、または図１３〜２６、もしくは図７０〜７８に記載するような、初期ライゲーション事象の間に標的特異的プローブを用いるかのいずれかにより、本アプローチを用いることができる。
上記アプローチは染色体領域の計数に依存するため、本技術の正確性は、かかる領域において多型を利用することにより向上し得る。図７０、７７、及び７８は、反復配列多型を含有する断片を捕捉するための一連の技術について記載している。これらの多型は、ゲノムにまたがるかまたは規定の箇所のいずれかにおいて、コピー数増加またはコピー数減少のいずれかについてのコピー数差の識別を可能にし、この差は、癌ゲノム分析にも適切である。トリソミーは、初期の減数分裂中、または２番目の減数分裂中の非分裂からも生じ得る。精子形成の場合を取り上げる。１番目の減数分裂において非分裂が生じる場合、相同染色体は後期の間に同じ極に移動する。続いて、これらが分裂して配偶子を形成する時、２つは二染色体性（それぞれの親の染色体の１つを含有する）となり、２つは零染色体性となる。これらの配偶子が正倍数体卵を受精する場合、得られる接合子は２つが三染色体性（１＋１＋１）、及び２つが一染色体性である。一方、２番目の減数分裂にて非分裂が生じた後、姉妹染色分体が後期の間に同じ極に移動する。続いて、これらが分裂して配偶子を形成する時、１つは二染色体性（同じ親の染色体の２つを含有する）となり、１つは零染色体性となり、２つが正倍数体となる（それぞれの染色体を１つ）。これらの配偶子が正倍数体卵を受精する場合、得られる接合子は１つが三染色体性（２＋１）、及び１つが一染色体性、及び２つが正倍数体（二染色体性）である。母系染色体についても同じことが当てはまる。したがって、トリソミー胎児は、父系及び母系染色体の多数の異なる組み合わせを有し得る。
母系ＤＮＡについての１，０００個のゲノム等価物、及び胎児ＤＮＡについての１００個のゲノム等価物の例を用いて、コピーの存在と多型の存在をスコアリングすることによる区別の差を示すことができる。テトラヌクレオチド反復を有するもの等の、非常に多型のマーカーを用いる場合、３つ、または４つ全ての多型が異なることは珍しいことではない。結果をこれらの場合と比較し、ここでは、母系または父系染色体に対するマーカーのいずれかは同一であるか、または異なっている。染色体２を対照として用い、染色体２１をトリソミーの例として用いる。
ケース１（コピー数のみ）
Figure 2017516487

ケース２（母系マーカーはホモ接合、母系非分離、最初の減数分裂）
Figure 2017516487
＊注：対立遺伝子２Ｍ１及び２Ｍ２は同一であるので、合計は２，１００である。同様に、対立遺伝子２１Ｍ１及び２１Ｍ２は同一であるので、合計は２，２００である。父系対立遺伝子はヘテロ接合またはホモ接合のいずれかである。

ケース３（母系マーカーはホモ接合、母系非分離、２番目の減数分裂）
Figure 2017516487
＊注：対立遺伝子２Ｍ１及び２Ｍ２は同一であるので、合計は２，１００である。同様に、対立遺伝子２１Ｍ１及び２１Ｍ２は同一であるので、合計は２，２００である。父系対立遺伝子はヘテロ接合またはホモ接合のいずれかである。

ケース４（母系マーカーはヘテロ接合、母系非分裂、最初の減数分裂）
Figure 2017516487

ケース５（母系マーカーはヘテロ接合、母系非分裂、２番目の減数分裂）
Figure 2017516487
＊注：追加のトリソミーの組み合わせが存在し、これらにおいて、対立遺伝子２１Ｍ１の２つのコピーは受精卵内にある。

ケース６（母系マーカーはホモ接合、母系非分裂、最初の減数分裂）
Figure 2017516487
＊注：対立遺伝子２Ｍ１及び２Ｍ２は同一であるので、合計は２，１００である。同様に、対立遺伝子２１Ｍ１及び２１Ｍ２は同一であるので、合計は２，１００である。父系対立遺伝子はヘテロ接合またはホモ接合のいずれかである。

ケース７（母系マーカーはホモ接合、母系非分裂、２番目の減数分裂）
Figure 2017516487
＊注：対立遺伝子２Ｍ１及び２Ｍ２は同一であるので、合計は２，１００である。同様に、対立遺伝子２１Ｍ１及び２１Ｍ２は同一であるので、合計は２，１００である。父系対立遺伝子はヘテロ接合またはホモ接合のいずれかである。

ケース８（母系マーカーはヘテロ接合、母系非分裂、最初の減数分裂）
Figure 2017516487

ケース９（母系マーカーはヘテロ接合、母系非分裂、２番目の減数分裂）
Figure 2017516487
＊注：追加のトリソミーの組み合わせが存在し、これらにおいて、対立遺伝子２１Ｐ２の２つのコピーは受精卵内にある。
この分析から、トリソミーを区別するためには、最も有用なマーカーは、母系遺伝子座が多型であり、父系遺伝子座が母系対立遺伝子の両方とは異なるものであることが明らかである。父系遺伝子座は多型である必要はない。例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーに見出される、Ｘ連鎖欠失に関して、病気はほとんどの場合において男子で現れるため、アプローチは更に簡便である。再び、欠失が起こる領域において、染色体２をＸ染色体と比較する。
ケース１０（母系マーカーはヘテロ接合であり、遺伝Ｘ連鎖欠失）
Figure 2017516487
＊注：遺伝領域の欠失

ケース１１（母系マーカーはヘテロ接合、胎児はＸ連鎖欠失を含有しない）
Figure 2017516487
＊注：遺伝領域の欠失

ケース１１（母系マーカーはヘテロ接合、散発性Ｘ連鎖欠失）
Figure 2017516487
＊注：遺伝領域の欠失
ケース１０は、母がキャリアである遺伝デュシェンヌ型筋ジストロフィーを示している。これらの条件下において、２つのＸ染色体対立遺伝子の合計量は、他の位置の半分のようである。ケース１１において、胎児は病気を有さず、ケース１２において、病気は胎児で現れる散発性変異である。Ｙ染色体マーカーは雄の胎児を確認する。上では、ジェノタイピングがＤＭＤ遺伝子座においてどのように実施されるかが示されている。母がキャリアであるという知識が予め存在する場合、隣接多型による欠失のフェージングを測定することができ（以下を参照）、続いて、これらの隣接多型をまた用いて、胎児も欠失を保有するのか、かつ、胎児が雄である場合、病気に感染しやすいのかどうかを確認することができる。本アプローチを用いて、Ｘ連鎖及び常染色体優性変化の両方を発見することができる。
胎児が、欠失、点突然変異、または異常メチル化を含む、およそ３，５００種類の他の疾患の１つにおいて、遺伝または散発性変異を含有するか否かを判定するために、より洗練された分析が推奨される。配列分析は、両方の親における劣性対立遺伝子の存在を速やかに決定する。変異が両方の親で異なる場合、母の血清からの無細胞ＤＮＡを評価することにより、子供が病気に関して複合ヘテロ接合体であるか否かを判定することが可能である。母系血清内の胎児ＤＮＡの分析から全ての回答を得るためには、本アッセイに２つのパートが必要となり得る。第１のパートは、病気の遺伝子を取り囲む反復領域内の母系ＳＮＰまたは多型用のフェーズを確立することである。このことは、母の白血球から、または父の唾液から高分子量のＤＮＡを単離することにより達成され得る。
正確なハプロタイプまたは位相を決定することは、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより開発されたアプローチの変形を用いることにより達成され得る（例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ １０ ｔｏ ２０ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ，” Ｎａｔｕｒｅ ４８７（７４０６）：１９０−５（２０１２）を参照、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。本出願に関して、ＨＭＷ ＤＮＡは、ウェルあたり１つ未満の染色体が存在するように、９６または３８４ウェルプレートに分配される。続いて、ゲノム増幅を用いて、どのウェルが染色体を含有するのかを決定し、その後、母系疾患対立遺伝子に対する９６個の隣接ＳＮＰまたは反復配列多型の相を、問題の遺伝子に関して決定する。これが達成されると、父からの疾患対立遺伝子の存在を（上記アプローチ４に記載するように）スコアリングし、かつ、配列決定を用いて、母から遺伝した染色体もまた疾患対立遺伝子を含有することを確認する。ゲノム全体での、ＤＮＡの反復配列の捕捉のための複数のアプローチを本明細書で記載し、これらを用いて、元の、または全ゲノムが増幅されたＤＮＡからの多型を識別することができる。
二倍体ゲノムからハプロタイプを決定する能力は、配列決定またはいくつかの他の技術によるジェノタイピングの前に、染色体またはサブ染色体断片の物理的単離に実質的に依存する、依然として大変技術的に困難であり高価な課題のままである。以下では、ゲノムＤＮＡの同一鎖上の２つの領域を捕捉し、２つの領域により規定されるハプロタイプ構造の決定を可能にする、迅速かつ容易な手順について記載している。
それぞれの可能性のある標的に関して、それぞれが、標的の２つの多型のそれぞれに隣接する上流及び下流部分に相補的な配列を含有する、２つのオリゴヌクレオチドを同時にハイブリダイズする。これらの多型はテトラヌクレオチド、トリヌクレオチド、もしくはジヌクレオチド反復、またはＳＮＰであることができる。最も有益な多型は、胎児に転写される、母系染色体、及び父系染色体の両方が多型であるものである。ポリメラーゼを用いて、２つの３’末端のそれぞれから伸長してギャップを閉じ、隣接結合配列の２つの対の間に位置する多型の遺伝子型を決定する。標的となる２つの多型は必ずしも互いに隣接する必要はなく、他の多型により分離されることができる。対象の２つの多型の間の距離は、２つのオリゴヌクレオチドに含有される４つの結合配列により架橋される確率のみにより制限される。オリゴヌクレオチドのそれぞれは、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び５’末端上の任意のホスフェートを含有する。
２つの既知の多型間のハプロタイプの決定に関する詳細プロトコール：
変形８．１：（例えば図１１３を参照）。８．１．ａ。高分子量（１５ｋｂ超）材料を得る方法によりゲノムＤＮＡを単離する。
８．１．ｂ。２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドは、標的多型＃１の固有領域上流に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び標的多型＃２の固有配列下流に相補的な３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、標的多型＃２の固有領域上流に相補的な５’配列、固有の識別子配列、任意の患者識別子配列、及び標的多型＃１の固有領域下流に相補的な３’配列を含む）の存在下で標的ＤＮＡを変性させ（９４℃、１分）、所望の温度に冷却する（例えば５０℃で２時間）ことにより、オリゴヌクレオチドが所望の断片の相補領域にハイブリダイズするようにさせる。Ｔａｑポリメラーゼ及び／またはＫｌｅｎＴａｑ（ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ）、並びに（好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ｄＮＴＰを、アニーリングステップに続いて、または手順の開始時に加える。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ホスフェートを有する場合において、ＫｌｅｎＴａｑは、ライゲーション能のある５’末端に直接隣接するまで３’末端を伸長する（図１１３の左側）。オリゴヌクレオチド配列の両方が５’ＯＨを有する場合において、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はマッチする５’重複塩基を切断し、ライゲーション能のある５’ホスフェートを作製する（図１１３の右側）。ハイブリダイゼーション温度にて伸長及びライゲーションさせ、任意で温度を上げて（例えば６０℃）伸長及びライゲーションを確実に完了させ、環状生成物を生成する。
８．１．ｃ。エキソヌクレアーゼＩ（３’→５’方向に一本鎖ＤＮＡを分解する）、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’方向に二本鎖ＤＮＡを分解する）を加えて、元の標的ＤＮＡ、リンカー配列、固有の識別子配列、任意のプライマー結合配列、及び任意の患者識別子配列を含む所望の一本鎖環状ＤＮＡのみを残しながら、ライゲーションされていない生成物またはニック生成物を全て分解する。本生成物は、所望の配列のタンデムリピートを作製するための（ｐｈｉ２９ポリメラーゼを有するランダム六量体プライマーを用いた）ローリングサークル増幅、及び後続の、次世代配列決定を用いた標的の識別、あるいは、プライマー結合配列をプライマー結合部位として用いる、共有結合で閉じた鋳型上での直接ＳＭＲＴ配列決定に適している。
注１：本アプローチはまた、容易に、変異を引き起こす実際の病気を有するハプロタイプ（即ち位相）の確立を可能にする。多型部位の１つが実際の病気遺伝子となるように、プライマーが設計される。
注２：それぞれが固有の識別子配列、任意の患者識別子配列及び任意のプライマー結合部位を含有する２つの架橋オリゴヌクレオチドプローブを用いるシステムにおいて、オリゴヌクレオチドの両方ではなく一方のみがプライマー結合部位（上流または下流オリゴヌクレオチドのいずれか）を含有することが推奨される。偽陽性検出の追加レベルに関して、固有の識別子配列は上流及び下流プローブで異なることが推奨される。
注３：２つのオリゴ結合配列が、ＤＮＡの連続伸長により実際に結合されるライゲーション生成物の形成を最大化し、架橋断片が連続しないライゲーション生成物の形成を最小限にすることが重要である。
例証の目的のために以下の例を考える。上流領域は「X」と示され、ＡＧＡＴテトラヌクレオチド反復を有するが、下流領域は「Y」と示され、ＣＡジヌクレオチド反復を有する。上流領域Ｘは以下で上流プライマー結合部位「X-up」と示され、AGAT(n)はテトラヌクレオチド反復領域であり、「X-dn」が下流プライマー結合部位である。下流領域Ｙは以下で上流プライマー結合部位「Y-up」と示され、CA(n)はジヌクレオチド反復領域であり、「Y-dn」は下流プライマー結合部位である。本実施例では、２つの領域は１０ｋｂ離れており、２つの母系染色体は、
X-up AGAT(12) X-dn.........(10kb).......Y-up CA(23) Y-dn
X-up AGAT(16) X-dn.........(10kb).......Y-up CA(18) Y-dn
の形態である。
次いで、下の鎖に結合するライゲーション−伸長プライマーを加える（図１１３の通り）。これらは、
（左） 5' X-dn-プライマー部位-識別子＃１-Y-up 3'
（右） 5' Y-dn-識別子＃２-X-up 3'
の形態を取る。
（本実施例では、プライマー結合部位は左のプライマーにのみ存在する。）
次いで、ハプロタイプにより規定される２つの可能なライゲーション生成物（プライマー結合部位にて線状化されるため、続くのが一層容易である）は、
プライマー部位-識別子＃１-Y-up CA(23) Y-dn-識別子＃２-X-up AGAT(12)X-dn
プライマー部位-識別子＃１-Y-up CA(18) Y-dn-識別子＃２-X-up AGAT(16)X-dn
の形態を取る。
非連続部位から生じる生成物の確率が微小となるように反応を希釈することにより、同一染色体断片上の連続部位から生じる正しい生成物の形成を最大化することができる。更に、プライマーが染色体ＤＮＡに対して大変過剰であるので、２つの断片が連続していない場合、各断片が既に、断片に結合する「左」及び「右」複合プライマー（即ち、２つの別の断片に結合する４つのプライマー）を有する確率が非常により高い。２つの断片が連続している場合のみ、その２つの領域が各「左」及び「右」複合プライマーの１つにより互いに結合される可能性が高い。これは、異なる標的濃度対ライゲーション−伸長プライマーの異なる希釈の条件のマトリクスを生成することにより正しいライゲーション生成物を最適に得る直接的で簡単な実験である。
合わさる２つの異なる染色体領域から生じる間違ったライゲーション生成物が存在する場合、ＣＡ（２３）がＡＧＡＴ（１６）と結合し、ＣＡ（１８）がＡＧＡＴ（１２）と結合する生成物が間違って作製される。
例として、ライゲーション生成物の８０％が、連続していない架橋断片から生じる最悪の場合のシナリオを考える。簡便さのため、１，０００ゲノムの等価物を推定する。生成物が架橋断片から生じる場合、同一の母系染色体、そして父系染色体（即ち、それぞれ４００個）から生じる可能性は等しいことに留意されたい。しかし、連続するＤＮＡから生じるこれらの生成物は、同一の母系染色体（即ち、それぞれ２００個）からのみ生じる。したがって、以下の組み合わせが存在するはずである。
ＣＡ（２３）及びＡＧＡＴ（１２） ６００（＝４００＋２００）
ＣＡ（２３）及びＡＧＡＴ（１６） ４００
ＣＡ（１８）及びＡＧＡＴ（１２） ４００
ＣＡ（１８）及びＡＧＡＴ（１６） ６００（＝４００＋２００）
これらの数字が、最も好ましくない方向に５０変動しても（架橋断片から生じるライゲーション生成物の９０％に等しい）、各染色体において、ＣＡ（２３）及びＡＧＡＴ（１２）、並びにＣＡ（１８）及びＡＧＡＴ（１６）としてハプロタイプ区別するのは依然として直接的で簡単であろう。
ＣＡ（２３）及びＡＧＡＴ（１２） ５５０（＝４００−５０＋２００）
ＣＡ（２３）及びＡＧＡＴ（１６） ４５０（＝４００＋５０）
ＣＡ（１８）及びＡＧＡＴ（１２） ４５０（＝４００＋５０）
ＣＡ（１８）及びＡＧＡＴ（１６） ５５０（＝４００−５０＋２００）
あるいは、第２のアプローチにおいて、病気遺伝子を、２０個の最も一般的な遺伝病、及び常染色体優性病に分け、次いで、それぞれ平均２００個の遺伝子をカバーする、さほど一般的でない変異配列の１７個のグループに分けてよい。遺伝子の各グループを捕捉プローブセットによりカバーし、次いで、父系配列決定分析の結果に応じて、母体血液に適切な患者識別子を与え、１７個の特別プローブ捕捉セットの１つ以上で評価する。
上記アプローチの１番目では、遺伝及び散発性変異の両方を識別すると共に、胎児が母から変異を有する領域を遺伝しているか否かを決定する。本アプローチではまた、Ｘ連鎖遺伝病に関する欠失、他の染色体欠失、胎児における異常メチル化、三塩基反復から生じる病気、及び染色体点在または他の転位から生じる病気の存在を決定することもまた可能なはずである。
２番目のアプローチでは、照会遺伝子に関する病状を識別する。鍵となる問題は、家族にとって正しい回答を得ることがどれほど重要であるか、ということである。両方の親が保持者であるか否かを決定するのは直接的で簡単であり、変異が異なる場合、父の疾患対立遺伝子が胎児に存在するか否かを決定するのは比較的直接的で簡単である。存在しない場合、胎児は病気を有しないか、または保持者であるかのいずれかとなる。存在する場合、母系対立遺伝子が遺伝子、病気を受け取る可能性は５０％である。母系対立遺伝子に関するハプロタイプが決定された場合、ハプロタイプマーカーを用いて、遺伝母系対立遺伝子の存在または不存在を確認してよい。羊水穿刺を行い、母系対立遺伝子の存在を直接試験することもまた、賢明であり得る。現在では、前述で概略を述べた通りに遺伝子を配列決定し、父系疾患対立遺伝子についてスコアリングをすることが推奨される。存在する場合、または、父系及び母系病気特異的変異が同一である場合、医師は羊水穿刺を推奨する。
本発明の方法はまた、バランスの取れていない染色体転座の非侵襲性出生前診断及び着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）のために用いることも可能である。染色体転座を有する個体は、不妊症、不着、死産、及び／または先天性異常を有する子供を持つリスクが増加する。着床前遺伝子診断により、正しい量マテリアルバランス（バランスが取れた／通常）を有する胚と、転座の結果遺伝物質を欠いている（バランスの取れていない）胚とを区別することが可能である。一方が転座キャリアである多くの夫婦は、不着を経験しているか、または、不均衡な染色体セットを有する妊娠について学ぶ際、異なる選択を行うことに直面している。本発明の方法に基づくＰＧＤ により、移った胚はバランスの取れた染色体転座を有するという概念を予め知ることで、これらの特定の状況に対処しなければならない可能性が低下する。
染色体特異的ＳＮＰまたは相対的配列多型をスコアリングするアプローチはまた、着床前スクリーニングで用いることもできる。生体外受精による、２１、１８、及び１３トリソミーのみが受け入れられる（同様に、Ｘ及びＹ染色体異常である）妊娠とは対照的に、他の染色体異常は依然として、１６、３２、またはより大きい細胞数段階での増殖が可能となり得る。したがって、ゲノム全体での多型は、適切なコピー数、及び染色体領域のロスまたはゲインの両方を考慮に入れるのに必要である。照会される多型の数が多ければ多いほど、より細密にコピー数変化を決定することができる。
予測実施例９−胎児の父系試験（例えば胎児検診支援）
概要：基本的なアプローチは、父には存在するが、母には存在しない対立遺伝子の存在を調査することである。これには２つの一般的なアプローチがある。共通の対立遺伝子を約７０〜７５％の頻度で有するＳＮＰから開始することができ、それにより母が主要対立遺伝子に関してホモ接合である可能性は、約５０％である。約半分（２４個）に関して、母が共通の対立遺伝子に関してホモ接合となる約４８個のＳＮＰから開始することができ、父が少数の対立遺伝子に関してヘテロ接合またはホモ接合のいずれかとなる可能性は５０％である。変異の調査の同じように、母体血液中における少数の対立遺伝子を簡便にスコアリングするが、父からの少数の対立遺伝子を確認するためだけに、存在する量も定量する。第２のアプローチは、約５０％の頻度を有する対立遺伝子から開始し、母が対立遺伝子の１つに関してホモ接合である可能性は５０％であり、父がその位置において別の対立遺伝子を有する可能性は７５％である。父を区別するには、わずかにさほど情報量が多くはないが、より多くの位置の情報が有益である。第３のアプローチは、所与の位置において、父の対立遺伝子が母の対立遺伝子のいずれかと異なる可能性が高くなるように、高い多型度を有する反復配列多型を用いることである。これには、最少量の対立遺伝子が必要となる。これらの全ての条件下において、夫が胎児の父でない（非父系）である場合、母のプライバシーを尊重して、医師によりケアがなされなければならない。
（表１）本開示のオリゴヌクレオチド配列
Figure 2017516487
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／３Ｐｈｏｓ／＝３’ホスフェート
／３ＳｐＣ３／＝３’Ｃ３スペーサー（３’末端をブロック）
／５Ｐｈｏｓ／＝５’ホスフェート
／５ＳｐＣ３／＝５’Ｃ３スペーサー（５’末端をブロック）
／５２−Ｂｉｏ／＝５’デュアルビオチン
／ｉｄＳｐ／＝内部１’，２’−ジデオキシリボース（ｄスペーサー）
／ｉ５ＮｉｔＩｎｄ／＝内部５−ニトロインドール
＋Ｇ＝ＬＮＡ（ロックド核酸）グアニジン
Ｎ＝任意の塩基
ｒＧ＝リボ−グアニジン
Ｕ＝デオキシウリジン
＊＝チオホスフェート骨格
好ましい実施形態を本明細書において詳細に記述及び記載したが、関連分野の当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変更、追加、置換等を行うことができ、したがってこれらは、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内であると考えられることが明らかとなるであろう。

Claims (82)

  1. 異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団であって、各構築物は、
    宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、
    前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性のヌクレオチド配列を含む第２の一本鎖合成核酸セグメントであって、前記ヌクレオチド配列は固有の識別子部分を含み、前記固有の識別子部分及び元のゲノムＤＮＡの前記セグメントの両方の前記ヌクレオチド配列は、前記集団中の他の全てのキメラ一本鎖核酸構築物から、前記集団の１つのキメラ一本鎖核酸構築物を区別し、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物は環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に好適である、前記第２の一本鎖合成核酸セグメントと
    を含む、前記集団。
  2. 核酸分子の増幅方法であって、
    請求項１に記載の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を提供する工程、
    前記異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を、ポリメラーゼ、並びに６〜１０ヌクレオチド長でありかつランダム塩基及び／またはヌクレオチド類似体を含む複数の短いプライマーとブレンドする工程であって、前記短いプライマーの１つ以上は、前記集団の１つ以上の環状キメラ一本鎖核酸構築物の一部に相補的であり、前記ブレンドする工程が増幅反応混合物を形成する、工程、並びに
    前記増幅反応混合物を１つ以上のハイブリダイゼーション及び伸長処理に供する工程であって、前記１つ以上の短いプライマーは前記環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズし、前記ポリメラーゼは前記ハイブリダイズした短いプライマーを伸長して複数の伸長生成物を生成し、各伸長生成物は２つ以上のタンデム線状配列を含み、各タンデム線状配列は前記集団からのキメラ一本鎖核酸構築物に相補的である、工程
    を含む、前記方法。
  3. 核酸分子のタンデム線状コピーの生成方法であって、
    請求項１に記載の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を提供する工程、
    前記異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団を、鎖置換活性を有するポリメラーゼ及び１つ以上の一次プライマーとブレンドする工程であって、前記１つ以上の一次プライマーは、前記集団の１つ以上の環状キメラ一本鎖核酸構築物の一部に相補的であり、前記ブレンドする工程がローリングサークル伸長混合物を形成する、工程、
    前記ローリングサークル伸長混合物を１つ以上のハイブリダイゼーション及び伸長処理に供する工程であって、前記１つ以上の一次プライマーは、前記環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズし、前記ポリメラーゼは、前記ハイブリダイズした一次プライマーを伸長して一本鎖伸長生成物を作製し、各一本鎖伸長生成物は２つ以上のタンデム線状配列を含み、各タンデム線状配列は前記集団からのキメラ一本鎖核酸構築物に相補的である、工程、
    １つ以上の二次プライマーセットを提供する工程であって、各二次プライマーセットは、（ａ）前記１つ以上の一次プライマーから形成される一本鎖伸長生成物の第１の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の二次プライマーと、（ｂ）一本鎖伸長生成物の第２の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次プライマーとを含み、前記第２の部分は、前記１つ以上の一次プライマーから形成される前記一本鎖伸長生成物の前記第１の部分とは異なりかつそれから置き換えられている、工程、
    前記一本鎖伸長生成物と第１の二次プライマーが互いにハイブリダイズしている場合に両方を切断するエンドヌクレアーゼを提供する工程、
    前記一本鎖伸長生成物を、鎖置換活性を欠くポリメラーゼ、リガーゼ、前記エンドヌクレアーゼ、及び前記１つ以上の二次プライマーセットとブレンドして、伸長−ライゲーション−切断反応混合物を形成する工程、
    前記伸長−ライゲーション−切断反応混合物をハイブリダイゼーション及び伸長処理に供する工程であって、前記第１及び第２の二次プライマーは前記一本鎖伸長生成物にハイブリダイズし、前記ポリメラーゼは前記ハイブリダイズした二次プライマーを伸長し、前記リガーゼは前記伸長したハイブリダイゼーション二次プライマーをライゲーションして二本鎖伸長生成物を形成し、前記エンドヌクレアーゼは前記二本鎖伸長生成物を、前記第１の二次プライマーが前記一本鎖伸長生成物にハイブリダイズした位置で切断して、二本鎖伸長生成物断片を作製し、前記二本鎖伸長生成物断片は、前記集団からの前記キメラ一本鎖核酸構築物に相補的な２つ以上のタンデム線状配列を含む、工程
    を含む、前記方法。
  4. 前記二本鎖伸長生成物断片内のタンデム線状配列の数は、前記伸長−ライゲーション−切断反応混合物内の第１及び第２の二次プライマーの比により決定される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ローリングサークル伸長混合物は、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼを更に含み、
    前記ローリングサークル伸長混合物を前記１つ以上のハイブリダイゼーション及び伸長処理に供する工程の間に、前記エンドヌクレアーゼは、認識配列が非メチル化である場合に前記認識配列にて二本鎖ＤＮＡを切断し、それにより、元のメチル化ゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントを含むキメラ一本鎖核酸構築物からのみ一本鎖伸長生成物を選択的に形成する、
    請求項３に記載の方法。
  6. 前記複数の伸長生成物または二本鎖伸長生成物断片を配列決定する工程
    を更に含む、請求項２、３、４、または５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 汎用リンカー配列が、前記配列決定の前に、前記伸長生成物もしくはその断片の５’及び３’末端、または前記二本鎖伸長生成物断片の５’及び３’末端に付加されている、請求項６に記載の方法。
  8. 前記配列決定は、蛍光プライマーハイブリダイゼーション、分子ビーコンハイブリダイゼーション、プライマー伸長、エキソヌクレアーゼベースの配列決定、リガーゼ検出反応、リガーゼ連鎖反応、パイロシーケンス法、蛍光ベースのＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、蛍光ベースのＳＢＬ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ナノポアベースの配列決定、イオンベースのＳＢＳ、及びイオンベースのＳＢＬからなる群から選択される方法を用いて実施される、請求項６に記載の方法。
  9. 以下を含む、システム：
    異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団であって、各構築物は、
    宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、
    前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性であるヌクレオチド配列を含む第２の一本鎖核酸セグメントであって、前記ヌクレオチド配列は第１の固体支持体プライマー特異的部分、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び患者識別子配列を含み、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物は、環化され、ローリングサークル増幅及び／または配列決定に好適である、前記第２の一本鎖核酸セグメントと
    を含む、前記集団、並びに
    伸長生成物の集団であって、各伸長生成物は２つ以上のタンデム線状配列を含み、各タンデム線状配列は前記集団からの前記キメラ一本鎖核酸構築物に相補的であり、前記集団中の各伸長生成物は、前記集団の相補環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズする、前記伸長生成物の集団。
  10. 複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーが固定化された固体支持体であって、各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第１の固体支持体プライマー特異的部分の前記ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含み、前記固体支持体上の前記複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーの１つ以上は、前記伸長生成物の集団の伸長生成物にハイブリダイズする、前記固体支持体
    を更に含む、請求項９に記載のシステム。
  11. 架橋オリゴヌクレオチドの集団であって、各架橋オリゴヌクレオチドはヌクレオチド配列の２つ以上の反復を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記集団中の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の一本鎖核酸セグメントの前記ヌクレオチド配列の一部と同一であり、各架橋オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列反復の１つ以上は、前記伸長生成物の集団の伸長生成物の前記タンデム線状配列の相補部分にハイブリダイズする、前記集団
    を更に含む、請求項９に記載のシステム。
  12. 複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーが固定化された固体支持体であって、各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第１の固体支持体プライマー特異的部分の前記ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含み、架橋オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記伸長生成物の前記タンデム線状配列は、前記固体支持体上で１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする、前記固体支持体
    を更に含む、請求項１１に記載のシステム。
  13. 以下を含む、システム：
    異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物の集団であって、各構築物は、
    宿主生物からの元のゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントと、
    前記第１の一本鎖セグメントに結合し、前記宿主生物に対して外来性であるヌクレオチド配列を含む第２の一本鎖核酸セグメントであって、前記ヌクレオチド配列は第１の固体支持体プライマー特異的部分、第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び患者識別子配列を含み、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物はローリングサークル増幅及び／または配列決定に好適である、前記第２の一本鎖核酸セグメントと
    を含む、前記集団、
    １つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーであって、各増幅プライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の一部に相補的な第１のヌクレオチド配列を少なくとも含む、前記１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、並びに
    ローリングサークル増幅に好適なポリメラーゼ。
  14. 前記１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な第１のヌクレオチド配列を含み、前記１つ以上の増幅プライマーは固体支持体上に固定化されている、請求項１３に記載のシステム。
  15. 前記１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、（ｉ）前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第１の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のシステム。
  16. 前記１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、
    （ｉ）前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記元のゲノムＤＮＡセグメントに相補的な第１のヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と、前記オリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’ポリメラーゼ伸長をブロックするブロック基とを含む３’部分、及び
    （ｉｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と捕捉基とを含み、前記捕捉基は固体支持体上に固定化されることが可能である、５’部分
    を含む、請求項１３に記載のシステム。
  17. 前記１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、
    （ａ）（ｉ）前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記元のゲノムＤＮＡセグメントの第１の部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と、第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマーの３’ポリメラーゼ伸長をブロックするブロック基とを含む３’部分を有する、前記第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、並びに
    （ｂ）（ｉ）前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記元のゲノムＤＮＡセグメントの第２の部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と捕捉基とを含み、前記捕捉基は固体支持体上で固定化されることが可能である、５’部分を有する、第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマー
    を含む、請求項１３に記載のシステム。
  18. 前記１つ以上の増幅プライマーは、固体支持体に繋がれることが可能な部分を含む、請求項１３に記載のシステム。
  19. 複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーが固定化された固体支持体であって、各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第１の固体支持体プライマー特異的部分の前記ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む、前記固体支持体
    を更に含む、請求項１３に記載のシステム。
  20. 前記固体支持体は、
    複数の固定化された第２のオリゴヌクレオチドプライマーであって、各第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の固体支持体プライマー特異的部分の前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー
    を更に含む、請求項１９に記載のシステム。
  21. 架橋オリゴヌクレオチドの集団であって、各架橋オリゴヌクレオチドはヌクレオチド配列の２つ以上の反復を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の一本鎖核酸セグメントの前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一である、前記集団
    を更に含む、請求項１３に記載のシステム。
  22. 前記ポリメラーゼは鎖置換ポリメラーゼである、請求項１３に記載のシステム。
  23. 複数の核酸分子の配列決定方法であって、
    請求項１３に記載のシステムを提供する工程、
    前記集団中の前記環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズした１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを前記ポリメラーゼとブレンドして、ローリングサークル増幅反応混合物を形成する工程、
    前記ローリングサークル増幅反応混合物を、前記ポリメラーゼが前記１つ以上のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド増幅プライマーを伸長して複数の一次伸長生成物を作製する伸長処理に供する工程であって、各一次伸長生成物は１つ以上のタンデム線状配列を含み、各タンデム線状配列は前記集団中の環状キメラ一本鎖核酸構築物に相補的である、工程、並びに
    前記環状キメラ一本鎖核酸構築物を直接に配列決定するか、またはその前記複数の一次伸長生成物を配列決定する工程
    を含む、前記方法。
  24. 前記ローリングサークル増幅反応混合物は、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼを更に含み、
    前記ローリングサークル増幅反応混合物を前記伸長処理に供する工程の間に、前記エンドヌクレアーゼは、認識配列が非メチル化である場合に前記認識配列にて二本鎖ＤＮＡを切断し、それにより、元のメチル化ゲノムＤＮＡの第１の一本鎖セグメントを含むキメラ一本鎖核酸構築物からのみ一次伸長生成物を選択的に形成する、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーが固定化された固体支持体を提供する工程であって、各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記集団の前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第１の固体支持体プライマー特異的部分の前記ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む、工程、及び
    前記複数の一次伸長生成物を、前記配列決定の前に前記固体支持体上で前記複数の第１のオリゴヌクレオチドプライマーの１つ以上にハイブリダイズさせる工程
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記固体支持体上の２つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長生成物の２つ以上のタンデム線状配列にハイブリダイズし、前記方法は、
    ポリメラーゼを用いて、前記２つ以上のハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、複数の固定化された二次伸長生成物を形成する工程であって、各二次伸長生成物は、前記ハイブリダイズした一次伸長生成物の１つのタンデム線状配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程、及び
    前記一次伸長生成物を前記固体支持体上の前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーから変性させる工程であって、前記配列決定は、前記固定化された二次伸長生成物の配列決定を伴う、工程
    を更に含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記固体支持体上の２つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは一次伸長生成物の２つ以上のタンデム線状配列にハイブリダイズし、前記方法は、
    配列決定プライマーを前記固体支持体上の前記一次伸長生成物の各タンデム線状配列にハイブリダイズさせる工程であって、前記配列決定プライマーは、前記固体支持体上で前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズした前記タンデム線状配列の前記領域に対して５’である前記タンデム線状配列の領域にハイブリダイズする、工程、
    前記配列決定プライマーを伸長する工程、及び
    前記伸長に基づき、前記固体支持体上の前記一次伸長生成物の各タンデム線状配列を配列決定する工程
    を更に含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記１つ以上の増幅プライマーは、（ｉ）前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第１の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な第１のヌクレオチド配列部分、及び（ｉｉ）前記キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的な第２のヌクレオチド配列部分を含む、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記１つ以上の増幅プライマーは更なる部分を含み、前記更なる部分は前記固体支持体に繋がれることが可能であり、前記方法は、
    前記供する工程の前または間に、前記固体支持体上で前記一次伸長生成物の前記更なる部分を捕捉する工程
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記１つ以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、前記集団の前記環状キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の固体支持体プライマー特異的部分に相補的でありかつ前記固体支持体上で固定化されている、第１のヌクレオチド配列部分を含み、それによって、前記供する工程の間に形成される前記複数の一次伸長生成物を前記固体支持体に繋ぐ、請求項２５に記載の方法。
  31. 前記配列決定は、蛍光プライマーハイブリダイゼーション、分子ビーコンハイブリダイゼーション、プライマー伸長、エキソヌクレアーゼベースの配列決定、リガーゼ検出反応、リガーゼ連鎖反応、パイロシーケンス法、蛍光ベースのＳＢＳ、蛍光ベースのＳＢＬナノポアベースの配列決定、イオンベースのＳＢＳ、及びイオンベースのＳＢＬからなる群から選択される方法を用いて実施される、請求項２３に記載の方法。
  32. 架橋オリゴヌクレオチドの集団を提供する工程であって、各架橋オリゴヌクレオチドはヌクレオチド配列の２つ以上の反復を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記集団の前記環状キメラ一本鎖核酸構築物の前記第２の一本鎖核酸セグメントの前記ヌクレオチド配列の少なくとも１部分と同一である、工程、及び
    前記集団の架橋オリゴヌクレオチド上で一次伸長生成物の１つ以上のタンデム線状配列を捕捉する工程であって、それにより、前記配列決定の前に前記一次伸長生成物を縮合して密な構造にする、工程
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
  33. 前記集団の前記環状キメラ一本鎖核酸構築物は、
    １つ以上の標的ゲノムＤＮＡセグメントを含有する試料を提供する工程、
    １つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）５’標的特異的部分、（ｂ）３’標的特異的部分、及び（ｃ）更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）前記患者識別子配列、（ｉｉ）前記第１の固体支持体プライマー特異的部分、及び（ｉｉｉ）前記第２の固体支持体プライマー特異的部分を含む、工程、
    前記試料中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’標的特異的部分が塩基特異的な様式で標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補３’末端にハイブリダイズするのに効果的な、かつ前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’標的特異的部分が塩基特異的な様式で前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補５’末端にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる工程、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした各標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’及び５’末端の間でライゲーション能のある接合部を生成する工程、並びに
    各標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ライゲーション接合部をライゲーションして、前記集団の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物を形成する工程
    を含む方法により調製される、請求項２３に記載の方法。
  34. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ハイブリダイズした３’末端をポリメラーゼで伸長して、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ハイブリダイズした５’末端とライゲーション接合部を形成すること
    を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記標的ゲノムＤＮＡセグメント上で、ライゲーションに好適な３’ＯＨ及び／または５’ホスフェートを遊離させること
    を含む、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分は切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記ライゲーションの後、ライゲーションしていない標的ゲノムＤＮＡセグメント、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び他の非環化核酸分子を前記試料から取り除く工程
    を更に含む、請求項３３に記載の方法。
  39. 各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、取り外し可能な３’ブロック基、及び／または、固体支持体上での捕捉に好適な５’捕捉基を更に含む、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    １つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプローブを提供することであって、各第２のオリゴヌクレオチドプローブは、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、こと、及び
    前記第２のオリゴヌクレオチドプローブを、前記接触させる工程の間に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分にハイブリダイズさせることであって、前記ハイブリダイズさせることは、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントと前記第２のオリゴヌクレオチドプローブとの間でライゲーション能のある接合部を形成する、こと
    を含む、請求項３３に記載の方法。
  41. ヌクレオチドリンカーを前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの一端または両端に付加させる工程であって、前記リンカーの１つ以上は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分の領域に相補的であり、前記接触させる工程の間、前記１つ以上のヌクレオチドリンカーは塩基特異的な様式で前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分の相補領域にハイブリダイズする、工程
    を更に含む、請求項３３に記載の方法。
  42. 前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’及び５’標的特異的部分は、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントとの１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含有するように設計されており、前記伸長して１つ以上のライゲーション接合部を形成することの後、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは前記ポリメラーゼ伸長部分から区別されることができる、請求項３４に記載の方法。
  43. 前記集団の前記異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物は、
    １つ以上の標的ゲノムＤＮＡセグメントを含有する試料を提供する工程であって、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは、１つ以上の塩基の違いまたは１つ以上のメチル化残基を含有する可能性がある、工程、
    リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントを形成するために、ヌクレオチドリンカーを前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端に付加させる工程、
    １つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’ヌクレオチドリンカーに相補的な３’部分、（ｂ）前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記５’ヌクレオチドリンカーに相補的な５’部分、及び（ｃ）更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）前記患者識別子配列、（ｉｉ）前記第１の固体支持体プライマー特異的部分、及び／または（ｉｉｉ）前記第２の固体支持体プライマー特異的部分を含む、工程、
    前記試料中に存在する場合、前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補ヌクレオチドリンカー配列に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的な様式でハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる工程、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’及び５’末端の結合に好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程、並びに
    前記１つ以上のライゲーション接合部にて前記標的ゲノムＤＮＡセグメントをライゲーションし、前記集団の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物を形成する工程
    を含む方法により調製される、請求項２３に記載の方法。
  44. 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、３’標的特異的部分及び／または５’標的特異的部分を更に含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ハイブリダイズした３’末端をポリメラーゼで伸長し、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ハイブリダイズした５’末端とライゲーション接合部を形成すること
    を含む、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記標的ゲノムＤＮＡセグメント上で、ライゲーションに好適な３’ＯＨ及び／または５’ホスフェートを遊離させること
    を含む、請求項４３に記載の方法。
  48. 前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは、ライゲーションまたは伸長に好適な５’及び３’末端を有する二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントであり、前記ヌクレオチドリンカー配列は第１及び第２のリンカーオリゴヌクレオチドを含み、（ｉ）前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドは、５’一本鎖部分、１つ以上の切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、固有の識別子配列、前記第２のリンカーオリゴヌクレオチドに相補的な３’末端、及び３’ＯＨを含み、並びに（ｉｉ）前記第２のリンカーオリゴヌクレオチドは、５’ＯＨ末端、前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分、及び任意の３’ブロック末端を含み、前記第２のリンカーオリゴヌクレオチドは前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズして複合リンカーを形成し、前記付加させる工程は、
    （ｉ）前記複合リンカーの前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記３’ＯＨの、前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記５’末端へのライゲーションに好適な、及び（ｉｉ）前記複合リンカーの前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの相補コピーを作製するための前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’末端のポリメラーゼ伸長に好適な、及び（ｉｉｉ）前記接触させる工程に適した前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントを形成するための前記１つ以上の切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の切断に好適な条件下にて、前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントを前記複合リンカー、リガーゼ、及びポリメラーゼとブレンドすること
    を含む、請求項４３に記載の方法。
  49. 前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドは更なる部分を含み、前記更なる部分は（ｉ）固体支持体プライマー特異的部分、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブは、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロック基とを含む３’部分を有し、前記方法は、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を前記接触させる工程の間に切断する工程であって、それにより、前記ライゲーションの前に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’ＯＨを遊離させる、工程
    を更に含む、請求項４３に記載の方法。
  51. 前記ライゲーションの後、ライゲーションしていない標的ゲノムＤＮＡセグメント、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び他の非環化核酸分子を前記試料から取り除く工程
    を更に含む、請求項４３に記載の方法。
  52. 前記集団の前記異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物は、
    １つ以上の標的ゲノムＤＮＡセグメントを含有する試料を提供する工程であって、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは３’及び５’末端を有する、工程、
    リンカー配列を前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’及び５’末端に付加せる工程であって、前記リンカー配列は、（ｉ）１つ以上の患者識別子配列、（ｉｉ）前記第１の固体支持体プライマー特異的部分、及び（ｉｉｉ）前記第２の固体支持体プライマー特異的部分を含み、リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントを形成する、工程、
    １つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’リンカー配列に相補的な部分、及び（ｂ）前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記５’リンカー配列に相補的な部分を含む、工程、並びに
    前記試料中に存在する場合、前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補３’及び５’リンカー配列に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的な様式でハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる工程、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’及び５’末端の結合に好適な１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程、並びに
    前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントを、前記１つ以上のライゲーション接合部にてライゲーションし、前記集団の異なる環状キメラ一本鎖核酸構築物を形成する工程
    を含む方法により調製される、請求項２３に記載の方法。
  53. 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、３’標的ゲノムＤＮＡ特異的部分及び／または５’標的ゲノムＤＮＡ特異的部分を更に含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’末端をポリメラーゼにより伸長し、前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記５’末端とライゲーション接合部を形成すること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメント上の、ライゲーションに好適な３’ＯＨ及び／または５’ホスフェートを遊離させること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  57. 前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブは、第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体とブロック基とを含む３’部分を有し、前記方法は、
    前記接触させる工程の間に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断する工程であって、それにより、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブ上の３’ＯＨを遊離させる、工程、並びに
    前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端を伸長して５’末端とライゲーション接合部を形成する工程、並びに
    前記リンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ライゲーションの間に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’及び５’末端を前記ライゲーション接合部にてライゲーションする工程
    を更に含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ライゲーションの後、ライゲーションしていないリンカーが付加された標的ゲノムＤＮＡセグメント、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び他の非環化核酸分子を前記試料から取り除く工程
    を更に含む、請求項５２に記載の方法。
  59. 前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブは１つ以上の切断可能なヌクレオチドを含有し、前記方法は、
    前記ライゲーションの後、前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドを切断する工程、及び
    前記標的ゲノムＤＮＡセグメントに相補的でない、前記切断された１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブの一部を取り除く工程であって、それにより、ローリングサークル増幅に好適な、標的ゲノムＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている環状キメラ一本鎖核酸構築物を形成する、工程
    を更に含む、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記環状キメラ一本鎖核酸構築物にハイブリダイズした前記標的ゲノムＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドは捕捉部分を含み、前記方法は、
    複数の固定化された捕捉部分結合パートナーを含有する固体支持体を提供する工程、及び
    前記捕捉部分が前記固体支持体上で捕捉部分結合パートナーに結合するのに効果的な条件下にて、前記固体支持体を、前記捕捉部分を含有する前記標的ゲノムＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記環状キメラ一本鎖核酸構築物と接触させる工程であって、それにより、前記環状キメラ一本鎖核酸構築物を固定化する、工程
    を更に含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは、ライゲーションに好適な５’及び３’末端を有する二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントであり、前記リンカー配列は第１、第２、及び第３のオリゴヌクレオチドを含み、（ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドは、前記第１の固体支持体プライマー特異的部分、１つ以上の第１の患者識別子配列、第１の配列決定プライマー結合部位、及び前記第３のオリゴヌクレオチドに相補的な３’末端を含み、（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第３のオリゴヌクレオチドの前記５’末端に相補的な領域を含み、並びに、（ｉｉｉ）前記第３のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な５’末端、第２の配列決定プライマー結合部位、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記３’末端に相補的な部分、第２の患者識別子配列、固有の識別子配列、及び第２の固体支持体プライマー特異的部分を含み、前記第３のオリゴヌクレオチドは前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドの相補部分にハイブリダイズして複合リンカーを形成し、前記付加させる工程は、
    （ｉ）前記複合リンカーの前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドの、前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントのそれぞれ前記５’及び３’末端へのライゲーションに好適な、（ｉｉ）５’末端における前記複合リンカーの前記第２のオリゴヌクレオチドとのライゲーション接合部を作製するための前記複合リンカーの前記第１のオリゴヌクレオチドの前記３’末端のポリメラーゼ伸長に好適な、並びに（ｉｉｉ）両方の標的鎖に固有の識別子配列を含み前記接触させる工程に適した、リンカーが付加された二本鎖標的ゲノムＤＮＡを形成するための、前記ライゲーション接合部における前記複合リンカーの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドのライゲーションに好適な条件下にて、前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントを前記複合リンカー、リガーゼ、及びポリメラーゼとブレンドすること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  62. 前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは、３’末端シトシンオーバーハングを有する二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントであり、かつ前記リンカー配列は、（ｉ）前記第１の固体支持体プライマー特異的部分、１つ以上の第１の患者識別子配列、第１の配列決定プライマー結合部位、固有の識別子配列、前記３’末端から２番目及び３番目の位置の２つのリボグアノシン塩基、並びに３’末端のロックド核酸であるグアノシン塩基を含む第１のリンカーオリゴヌクレオチド、並びに（ｉｉ）第２の配列決定プライマー結合部位、第２の患者識別子配列、前記第２の固体支持体プライマー特異的部分、及び前記第１のオリゴヌクレオチドに相補的な５’部分を含む第２のリンカーオリゴヌクレオチドを含み、前記付加させる工程は、
    前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントを前記リンカー配列、逆転写酵素、及びリガーゼとブレンドし、逆転写−ライゲーション反応混合物を形成すること、
    前記逆転写−ライゲーション反応混合物を、（ｉ）前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記リボグアノシン及びロックド核酸であるグアノシン塩基の、前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの３’シトシンオーバーハングへのハイブリダイゼーションに好適な、（ｉｖ）前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記固有の識別子配列に相補的な配列、及び前記第２のリンカーオリゴヌクレオチドの前記５’末端とのライゲーション接合部を生成するための、前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記ハイブリダイズした３’末端の伸長に好適な、並びに（ｖ）前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの伸長３’末端の、前記ライゲーション接合部での前記第２のオリゴヌクレオチドの前記５’末端へのライゲーションに好適な条件に供すること、
    前記逆転写−ライゲーション反応混合物をＲＮａｓｅ、ポリメラーゼ、及びリガーゼとブレンドし、ヌクレアーゼ−ポリメラーゼ−ライゲーション反応混合物を形成すること、
    前記ヌクレアーゼ−ポリメラーゼ−ライゲーション伸長反応混合物を、（ｉ）前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドのリボグアノシン塩基の取り除きに好適な、（ｉｉ）前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡの前記５’末端とのライゲーション接合部を形成するための、前記取り除きの後の前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記３’末端の伸長に好適な、及び（ｉｉｉ）両方の標的鎖に固有の識別子配列を含み前記接触させる工程に適した、リンカーが付加された二本鎖標的ゲノムＤＮＡを形成するための、前記伸長した第１のリンカーオリゴヌクレオチドの、前記ライゲーション接合部での前記二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記５’末端へのライゲーションに好適な条件に供すること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  63. 前記標的ゲノムＤＮＡセグメントは一本鎖であり、末端トランスフェラーゼ伸長に好適な３’末端を含み、前記付加させる工程は、
    前記一本鎖標的ゲノムＤＮＡ、末端トランスフェラーゼ、並びにデオキシ及びリボモノヌクレオチドの混合物をブレンドし、末端トランスフェラーゼ反応混合物を形成すること、
    前記末端トランスフェラーゼ反応混合物を、デオキシ及びリボモノヌクレオチドを用いて前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記３’ＯＨを伸長するのに好適な条件に供し、前記標的ゲノムＤＮＡセグメント上にモノヌクレオチド伸長領域を形成すること、
    １つ以上のオリゴヌクレオチドセットを提供することであって、各セットは、（ｉ）前記第２の固体支持体プライマー特異的部分と、１つ以上の患者識別子配列と、配列決定プライマー結合部位と、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記伸長領域に相補的であり１つ以上の切断可能なヌクレオチドを含むモノヌクレオチド反復領域とを含むプライマーオリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）前記第１の固体支持体プライマー特異的部分と、１つ以上の患者識別子配列と、配列決定プライマー結合部位と、２つのリボグアノシン塩基と、３’末端のロックド核酸であるグアノシン塩基とを含む第１のリンカーオリゴヌクレオチドを含む、こと、
    前記末端トランスフェラーゼ反応混合物、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドセット、及び逆転写酵素をブレンドして、逆転写反応混合物を形成すること、
    前記逆転写反応混合物を、（ｉ）前記プライマーオリゴヌクレオチドの、前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記伸長領域へのハイブリダイゼーションに好適な、（ｉｉ）前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの相補体（前記相補体は３’末端にて更に３つのシトシン塩基だけ伸長している）を作製するための前記プライマーオリゴヌクレオチドの伸長に好適な、（ｉｉｉ）ｒＧ３−Ｃ３塩基対形成による、前記標的ゲノムＤＮＡの前記伸長相補体への前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに好適な、（ｉｖ）前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドに相補的な配列を生成するための前記標的ＤＮＡの前記相補体の伸長に好適な条件に供すること、
    前記逆転写反応混合物をＲＮａｓｅ、ポリメラーゼ、及びリガーゼとブレンドし、ヌクレアーゼ−ポリメラーゼ−ライゲーション反応混合物を形成すること、
    前記ヌクレアーゼ−ポリメラーゼ−ライゲーション伸長反応混合物を、（ｉ）３’ＯＨを遊離させるための前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記伸長相補体内での１つ以上のリボースモノヌクレオチドの切断に好適な、（ｉｉ）前記プライマーオリゴヌクレオチド配列のコピーを作製するための前記遊離３’ＯＨの伸長に好適な、並びに、（ｉｉｉ）前記第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記リボグアノシン塩基の切断に、及び前記標的ゲノムＤＮＡセグメントの前記５’末端とのライゲーション接合部を形成するための前記切断した第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記３’末端の伸長に好適な、並びに（ｉｖ）前記接触させる工程に適した、リンカーが付加された二本鎖標的ゲノムＤＮＡセグメントを生成するための前記伸長した第１のリンカーオリゴヌクレオチドの前記標的ゲノムＤＮＡセグメントへのライゲーションに好適な条件に供すること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  64. １つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチドは、前記一次伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ捕捉部分を含む、工程、
    前記１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドと前記供する工程の間に形成される相補一次伸長生成物との間でのハイブリダイゼーションに好適な条件下にて、前記ローリングサークル増幅反応混合物を前記１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドと接触させる工程、
    固体支持体上に固定化された好適な結合パートナーに結合する捕捉部分を介して、ハイブリダイズした捕捉オリゴヌクレオチド−一次伸長生成物複合体を前記固体支持体上で捕捉する工程、
    ハイブリダイズしていない捕捉オリゴヌクレオチド及び一次伸長生成物を、前記ローリングサークル増幅反応混合物から取り除く工程、並びに
    前記固体支持体に結合した前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記一次伸長生成物を遊離させて、濃縮した一次伸長生成物の試料を前記配列決定の前に形成する工程
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
  65. 前記遊離は、
    前記一次伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、及び、前記固体支持体に結合した捕捉オリゴヌクレオチド−一次伸長生成物複合体を、前記プライマーオリゴヌクレオチドが塩基特異的な様式で前記一次伸長生成物の前記相補部分にハイブリダイズするのに好適な、かつ前記ポリメラーゼが前記ハイブリダイズしたプライマーオリゴヌクレオチドを伸長するのに好適な条件下にて、ブレンドすることであって、前記伸長は、前記配列決定の前に前記ハイブリダイズした一次伸長生成物を遊離させる、こと
    を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. １つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチドは、前記環状キメラ一本鎖核酸構築物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ捕捉部分を含む、工程、
    前記１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドと前記集団の相補環状キメラ一本鎖核酸構築物との間のハイブリダイゼーションに好適な条件下にて、前記環状キメラ一本鎖核酸構築物の前記集団を、前記ブレンドの前または間に、前記１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドと接触させる工程、
    固体支持体上に固定化された好適な結合パートナーに結合する捕捉部分を介して、ハイブリダイズした捕捉オリゴヌクレオチド−環状キメラ一本鎖核酸構築物複合体を前記固体支持体上で捕捉する工程、
    前記集団から、ハイブリダイズしていない捕捉オリゴヌクレオチド及び環状キメラ一本鎖核酸構築物を取り除く工程、並びに
    前記固体支持体に結合した前記捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記環状キメラ一本鎖核酸構築物を遊離させて、濃縮した環状キメラ一本鎖核酸構築物の試料を前記供する工程の前に形成する工程
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
  67. 試料内における、前記試料内の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の識別方法であって、
    １つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、
    前記試料内に存在する場合、前記試料内で、前記１つ以上の標的リボ核酸分子のｃＤＮＡを生成する工程、
    １つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各第１のオリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）３’ｃＤＮＡ標的特異的配列部分、（ｂ）５’ｃＤＮＡ標的特異的部分、及び更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、工程、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’標的特異的部分が塩基特異的な様式で前記ｃＤＮＡの相補領域にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる工程、
    相補ｃＤＮＡにハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端の結合に好適な、１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程、
    前記１つ以上のライゲーション接合部にて前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションし、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分に結合した前記標的リボ核酸配列のデオキシリボ核酸コピーを含む環状ライゲーション生成物を形成する工程、並びに
    前記試料中の他のリボ核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別するために、前記試料内で前記環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程
    を含む、前記方法。
  68. 前記検出の前に、ライゲーションしていない第１のオリゴヌクレオチドプローブ及び他の非環化核酸分子を前記試料から取り除く工程
    を更に含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記検出及び区別する工程は、
    前記試料内の前記環状ライゲーション生成物を配列決定すること
    を含む、請求項６７に記載の方法。
  70. 試料内での、互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む可能性がある１つ以上の核酸分子の識別方法であって、
    互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む１つ以上の核酸分子を含む可能性がある試料を提供する工程、
    １つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する工程であって、各プローブセットは、（ｉ）５’第１標的特異的部分と、３’第２標的特異的部分と、更なる部分とを含む第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び、（ｉｉ）５’第２標的特異的部分と、３’第１標的特異的部分と、更なる部分とを含む第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、工程、
    前記試料中に存在する場合、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的な様式で前記核酸分子の対応する第１及び第２標的領域にハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程、
    前記プローブセットが核酸分子の相補第１標的領域及び第２標的領域にハイブリダイズする場合に、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端への結合に好適な、かつプローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端の、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端への結合に好適な、１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程、
    前記１つ以上のライゲーション能のある接合部にてプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、更なる部分に結合した核酸分子の前記第１及び第２の異なる標的領域に対応するヌクレオチド配列を含む環状ライゲーション生成物を形成する工程、並びに
    前記試料内で前記環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程であって、それにより、存在する場合、前記試料内で互いに結合した異なる第１標的領域及び第２標的領域を含む１つ以上の核酸分子の存在を識別する、工程
    を含む、前記方法。
  71. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    前記第１及び／または第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端をポリメラーゼで伸長し、それぞれ前記第２及び／または第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’末端とライゲーション接合部を形成すること
    を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程は、
    ライゲーションに好適な前記第１及び／または第２のオリゴヌクレオチドプローブ上の３’ＯＨ及び／または５’ホスフェートを遊離させること
    を含む、請求項７０に記載の方法。
  74. 前記検出の前に、ライゲーションしていない第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに他の非環化核酸分子を試料から取り除く工程
    を更に含む、請求項７０に記載の方法。
  75. 前記検出及び区別する工程は、
    前記試料内の前記環状ライゲーション生成物を配列決定すること
    を含む、請求項７０に記載の方法。
  76. 試料内における、前記試料内の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の識別方法であって、
    １つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、
    ヌクレオチドリンカーを、前記試料内で前記標的リボ核酸分子の３’及び５’末端に付加させる工程、
    １つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各オリゴヌクレオチドプローブは、（ａ）前記標的リボ核酸分子の前記３’ヌクレオチドリンカーに相補的な３’部分、（ｂ）前記標的リボ核酸分子の前記５’ヌクレオチドリンカーに相補的な５’部分、及び（ｃ）更なる部分を含み、前記更なる部分は、（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、工程、
    前記試料中に存在する場合、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記３’及び５’部分が塩基特異的な様式で前記標的リボ核酸分子の相補ヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするのに効果的な条件下にて、前記試料と前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを接触させる工程、
    前記ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端を伸長して前記１つ以上の標的リボ核酸分子の相補体を生成する工程、
    前記オリゴヌクレオチドプローブの前記伸長３’末端を前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端にライゲーションして、前記標的リボ核酸分子の前記３’ヌクレオチドリンカーに相補的な配列と、前記標的リボ核酸分子の前記５’ヌクレオチドリンカーに相補的な配列と、前記１つ以上の標的リボ核酸分子の前記相補体と、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分とを含む環状ライゲーション生成物を形成する工程、並びに
    前記試料中の前記環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程であって、それにより、前記試料中における他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する、工程
    を含む、前記方法。
  77. 前記ライゲーションの後に、ライゲーションしていない第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び他の非環化核酸分子を前記試料から取り除く工程
    を更に含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記検出及び区別する工程は、
    前記試料内の前記環状ライゲーション生成物を配列決定すること
    を含む、請求項７６に記載の方法。
  79. 試料内における、前記試料内の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の識別方法であって、
    １つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、
    前記試料内でヌクレオチドリンカーを前記標的リボ核酸分子の前記３’及び５’末端にライゲーションする工程であって、前記ヌクレオチドリンカーは更なる部分により互いに結合され、前記更なる部分は（ｉ）固有の識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）１つ以上のプライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含み、前記ライゲーションは、前記標的リボ核酸分子と、前記３’及び５’ヌクレオチドリンカー配列と、前記更なる部分とを含む環状ライゲーション生成物を形成する、工程、
    前記環状ライゲーション生成物の３’または５’ヌクレオチドリンカー配列に相補的なヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程、
    前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマーを塩基特異的な様式で前記環状ライゲーション生成物にハイブリダイズさせる工程、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記３’末端を伸長して前記環状ライゲーション生成物の相補体を生成する工程、並びに
    前記試料内の前記環状ライゲーション生成物相補体を検出及び区別する工程であって、それにより、前記試料中における他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する、工程
    を含む、前記方法。
  80. 前記検出及び区別する工程は、
    前記試料内の前記環状ライゲーション生成物を配列決定すること
    を含む、請求項７７に記載の方法。
  81. 試料内における、前記試料内の他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の識別方法であって、
    １つ以上の塩基の違いを含有する可能性がある１つ以上の標的リボ核酸分子を含む試料を提供する工程、
    １つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する工程であって、各セットは、（ａ）５’ステムループ部分と前記標的リボ核酸分子の３’部分に相補的な３’部分とを有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｂ）前記標的リボ核酸分子の５’末端のコピーに相補的な３’部分と、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’ステムループ部分に相補的な５’部分と、（ｉ）固有の標的識別子配列、（ｉｉ）患者識別子配列、（ｉｉｉ）プライマー結合配列、または（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む更なる部分とを有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む、工程、
    前記試料、プローブセットからの前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び逆転写酵素をブレンドして逆転写酵素反応物を形成する工程、
    前記試料中に存在する場合、相補標的リボ核酸分子にハイブリダイズした前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端を伸長させて、前記標的リボヌクレオチド分子の相補体を生成する工程、
    プローブセットの前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプローブを、前記標的リボヌクレオチド配列の相補体を含む前記伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる工程、
    伸長した第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした各第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端の間に１つ以上のライゲーション能のある接合部を生成する工程、
    各第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’及び５’末端をライゲーションして、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記更なる部分に結合した前記標的リボ核酸配列のデオキシリボ核酸コピーを含む環状ライゲーション生成物を形成する工程、並びに
    前記試料中で前記環状ライゲーション生成物を検出及び区別する工程であって、それにより、前記試料中における他の核酸分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する、工程
    を含む、前記方法。
  82. 前記検出及び区別する工程は、
    前記試料内の前記環状ライゲーション生成物配列を配列決定すること
    を含む、請求項８１に記載の方法。
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