JP2019526230A - 核酸突然変異検出のための組成物及び方法 - Google Patents

核酸突然変異検出のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、特定の実施態様において循環腫瘍ＤＮＡを含む画分を含む、血液又はその画分の試料中の標的遺伝子における突然変異を検出するための方法及び組成物を提供する。これらの方法は、例えば、片側多重タイリング反応などの、タイリングＰＣＲ反応を含むことができる。事実上あらゆる型の突然変異を、本方法及び組成物により検出することができる。特定の実施態様において、遺伝子融合が検出される。特にネステッドマルチプレックスＰＣＲ反応の実行に関する改善されたＰＣＲ法が、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月１日に出願された米国特許仮出願第６２／３５７，８４７号の優先権を請求するものであり、この仮出願の全体は引用により本明細書中に組み込まれている。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、且つその全体が引用により本明細書中に組み込まれている、配列表を含む。２０１７年６月２９日に作製された該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｎ＿０１７＿ＷＯ＿０１＿ＳＬ．ＴＸＴと称し、且つサイズは８３，４６８バイトである。
発明の分野
開示された本発明は、概して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法を使用し、核酸突然変異及び融合を検出する方法に関する。
発明の背景
診断前、疾患病期に関する診断確定時、又は治療有効性をモニタリングするためのいずれかの、癌を含む疾患に関連した突然変異の検出は、伝統的に固形腫瘍生検試料に頼っている。このような試料採取は、高度に侵襲性であり、且つ転移又は手術合併症をもたらす可能性のあるリスクを排除しない。疾患又は発達異常に関する突然変異決定は、染色体転座、介在欠失、一塩基多様性（ＳＮＶ）、逆位、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、置換及びそれらの組合せとして認識され得る。染色体転座又は遺伝子融合は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１などの様々な癌に関与していることが分かっている遺伝子に関連することができる。
遺伝子融合は、肺癌などの特定の癌の主要な駆動事象の一部である。遺伝子融合は通常、腫瘍生検におけるｍＲＮＡ−Ｓｅｑにより検出されるが、そのアプローチは、血漿中の融合の検出に適用することができない。簡便な血液採取を用い突然変異を検出する能力は、高度に侵襲性の医学的手法及び傷跡を含む可能性のある合併症を避けることができる。開示された発明は、血液中の血清又は血漿などの無細胞ＤＮＡ試料中の突然変異を検出する能力の利点がある。
発明の概要
本発明は、特定の例において循環腫瘍ＤＮＡを含有する画分を含む、試料又はその画分中の標的遺伝子中の突然変異を検出する方法及び組成物を提供する。本方法は、例えば、片側多重タイリング反応などの、タイリングＰＣＲ反応を含むことができる。実質的にあらゆる型の突然変異を、本方法及び組成物により検出することができる。特定の実施態様において、遺伝子融合が検出される。特にネステッドマルチプレックスＰＣＲ反応を実行することに関与した、改善されたＰＣＲ法が提供される。
一実施態様において、循環腫瘍ＤＮＡを含有する、哺乳動物由来の血漿画分などの、試料又はその画分、例えば無細胞画分中の、標的遺伝子における突然変異を検出する方法が、本明細書に提供される。この方法は、試料由来のＤＮＡ上にタイリングされた一連のプライマーを使用する、マルチプレックスＰＣＲ反応を実行する工程、及び例証的実施態様において、最初にタイリングされた一連の外側プライマーを使用し、外側プライマー標的アンプリコンを作製し、次にタイリングされた一連の内側プライマーを使用し、外側プライマー標的アンプリコンから内側プライマー標的アンプリコンを形成する、ネステッドマルチプレックスＰＣＲ反応を実行する工程を含む。次にこの内側プライマー標的アンプリコンを、ハイスループット核酸シークエンシングなどの、核酸シークエンシングに供し、突然変異を検出する。例証的実施態様において、この突然変異は、遺伝子融合である。
別の実施態様において、哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子における突然変異を検出する方法が、本明細書に提供される。この方法は、以下を含む：ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及びプラス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを配合することにより、外側プライマー反応混合物を形成する工程であって、ここで該核酸断片は、リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のフォワード標的−特異的外側プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の標的特異的外側プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含む工程；この外側プライマー反応混合物を、外側プライマー増幅条件に供し、一連のフォワード標的−特異的外側プライマーの一つのプライマー及びリバース外側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製された外側プライマー標的アンプリコンを作製する工程；並びに、少なくとも一部の外側プライマー標的アンプリコンの核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子中の突然変異を検出する工程。
本方法は、分析工程前に、以下の工程を更に含むことができる：外側プライマー標的アンプリコン、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、リバース内側ユニバーサルプライマー、並びに１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の標的−特異的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各々少なくとも１つの外側プライマー標的アンプリコン上に認められ、一連の外側標的−特異的プライマーと同じ方向に伸長反応をプライミングするよう構成された、一連のフォワード標的−特異的内側プライマーを配合することにより、内側プライマー増幅反応混合物を形成する工程；並びに、この内側プライマー反応混合物を、内側プライマー増幅条件に供し、フォワード標的−特異的内側プライマーの一つ及びリバース内側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製された内側プライマー標的アンプリコンを作製し、ここでその核酸配列が分析されるアンプリコンは、内側プライマー標的アンプリコンを含む工程。
前記分析工程は、超並列シークエンシングを用いて、アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を決定することを含むことができる。タイリングされた一連の標的−特異的外側及び／又は内側プライマー結合部位は、例えば、１０〜７５ヌクレオチド又は１５〜５０ヌクレオチドにより、標的遺伝子上で隔てられることができる。
哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子中の突然変異を検出するための更に別の実施態様において、本方法は、以下の工程を含む：試料又はその画分、特にそれらの無細胞画分から構築されたライブラリー由来の核酸断片を含むことができるか、或いはネステッドＰＣＲ法において、外側プライマー標的アンプリコンであることができる核酸試料、並びにポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸などのヌクレオチド、リバース内側ユニバーサルプライマー、並びに１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の標的−特異的内側プライマー結合部位に結合する５〜１０００、５〜５００、又は５〜２５０のプライマーを含み、且つ各々少なくとも１つの外側プライマー標的アンプリコン上に任意に認められ、任意に一連の標的−特異的外側プライマーと同じ方向で伸長反応をプライミングするように構成された、一連のフォワード標的−特異的内側プライマーを配合することにより、内側プライマー反応混合物を形成する工程；並びに、この内側プライマー反応混合物を、内側プライマー増幅条件に供し、フォワード標的−特異的内側プライマーの一つ及びリバース内側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製される内側プライマー標的アンプリコンを作製する工程；並びに、少なくとも一部の内側プライマー標的アンプリコンの核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子中の突然変異を検出する工程。任意に本方法は、内側プライマー反応混合物を形成する前に、以下の工程に従い、一連の外側プライマーアンプリコンを作製することを含むことができる：ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸などのヌクレオチド、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のフォワード標的−特異的外側プライマー、及びプラス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを配合することにより、外側プライマー反応混合物を形成する工程であって、ここで該核酸断片は、リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のフォワード外側標的−特異的プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含む工程；並びに、この外側プライマー反応混合物を、外側プライマー増幅条件に供し、一連のフォワード標的−特異的外側プライマーの一つのプライマー及びリバース外側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製される外側プライマー標的アンプリコンを作製する工程。
ひとつの典型的実施態様において、標的−特異的内側プライマー結合部位は、５〜２０個のヌクレオチドにより、標的外側プライマー結合部位と重複している。また別の実施態様において、この重複は、その範囲の下端が０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチド、並びにその範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、又は２５ヌクレオチドであることができる。リバース外側ユニバーサルプライマーは、リバース内側ユニバーサルプライマーと同じヌクレオチド配列を含むことができる。タイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位及び標的−特異的内側プライマー結合部位は、１〜１００の標的遺伝子の各々の標的領域上に配置されることができる。
本方法のまた別の実施態様において、外側プライマー標的アンプリコンの少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％は、外側プライマー標的アンプリコンの少なくとももう一つとの重複配列を有し、ここで標的領域は、５００〜１０，０００ヌクレオチドを含み、且つここで標的領域は、疾患に関連した既知の突然変異を含む。本方法は、１〜１００の標的遺伝子、又は５〜５０の標的遺伝子の各々の上の少なくとも１つの標的領域をカバーする重複配列を有する、外側プライマー標的アンプリコンを含むことができ、ここで各標的領域は、５００〜１０，０００ヌクレオチドを含み、且つここで標的領域は、疾患に関連した既知の突然変異を含む。少なくとも５０％の外側プライマー標的アンプリコン及び少なくとも１つの内側プライマー標的アンプリコンの各々は、重複配列を有することができる。
本方法は、以下の工程を更に含むことができる：ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー及びマイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを配合することにより、マイナス鎖外側プライマー反応混合物を形成する工程であって、ここで該核酸断片は、マイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含み、ここでマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー結合部位は、標的−特異的外側プライマー結合部位により標的化された鎖のマイナス鎖上に配置される工程；このマイナス鎖反応混合物を、増幅条件に供し、一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマーの一つのプライマー及びマイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製されたマイナス鎖標的外側アンプリコンを作製する工程；並びに、マイナス鎖標的外側アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子における突然変異を検出する工程。
本方法は、該分析の前に、また更に以下の工程を含むことができる：マイナス鎖外側プライマー標的アンプリコン、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、マイナス鎖リバース内側ユニバーサルプライマー、並びに１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連のマイナス鎖標的−特異的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各々少なくとも１個のマイナス鎖外側プライマー標的アンプリコン上に認められ、一連のマイナス鎖標的−特異的外側プライマーと同じ方向に伸長反応をプライミングするよう構成された、一連のフォワードマイナス鎖標的−特異的内側プライマーを配合することにより、マイナス鎖内側プライマー増幅反応混合物を形成する工程；並びに、このマイナス鎖反応混合物を、マイナス鎖標的−特異的内側プライマー増幅条件に供し、マイナス鎖フォワード標的−特異的内側プライマーの一つ及びマイナス鎖内側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製されるマイナス鎖内側プライマー標的アンプリコンを形成する工程であって、ここでその核酸配列が分析されるアンプリコンは、マイナス鎖内側プライマー標的アンプリコンを含む工程。このマイナス鎖外側プライマー増幅条件は、外側プライマー増幅条件と同一であることができ、且つこのマイナス鎖内側プライマー増幅条件は、内側プライマー増幅条件と同一であることができる。本方法で、突然変異に関連した疾患は、癌である。
本方法の一実施態様において、標的遺伝子由来の少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０及び１００の近接核酸、並びに外側プライマー標的アンプリコン及び／又は内側プライマー標的アンプリコン上の標的遺伝子上に認められない哺乳動物のゲノム領域由来の少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０及び１００の近接ヌクレオチドの存在は、標的遺伝子を含む遺伝子融合の指標である。一連のフォワードプラス鎖標的−特異的外側プライマーは、標的遺伝子に関する既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的プライマー結合部位に結合する、少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで外側プライマー標的アンプリコンは、少なくとも１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む。
本方法は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１からなる群から選択される、少なくとも１つの、又は少なくとも２つの融合パートナー遺伝子由来の遺伝子融合を検出し、且つここで一連の標的−特異的外側プライマーは、該標的遺伝子の各々に関する既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで外側プライマー標的アンプリコンは、少なくとも１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む。この遺伝子融合は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１からなる群から選択される融合パートナー遺伝子由来の染色体転座を含む。
本方法の一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及び一連のフォワード標的−特異的内側プライマーの各々は、標的遺伝子についての既知の融合切断点からの標的距離にある標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで該外側プライマー標的アンプリコンは、標的距離と長さが同じくらいである少なくとも１つのアンプリコンを含む。この標的遺伝子は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１から選択される。この標的遺伝子は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１からなる群から選択される少なくとも２つの融合パートナー遺伝子を含むことができ、且つ一連の標的−特異的外側プライマー及び一連の標的−特異的内側プライマーの各々は、５〜２５０のプライマーを含み、並びに各々は、少なくとも２つの融合パートナー遺伝子の一方の上の少なくとも１つの標的領域に結合し、且つここで少なくとも１つのプライマーは、少なくとも２つの融合パートナー遺伝子の各々に関する既知の融合切断点からの標的距離にある標的結合配列に結合し、且つここで少なくとも２つの融合パートナー遺伝子の各々に関する外側プライマー標的アンプリコンは、標的距離と長さが同じくらいである少なくとも１つのアンプリコンを含む。
この一連の標的−特異的外側プライマー及び一連の標的−特異的内側プライマーの各々は、該標的遺伝子の各々に関する既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチドであり、且つここで、外側プライマー標的アンプリコンは、既知の遺伝子融合切断点に広がる少なくとも１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含むか；該標的遺伝子の各々についての既知の融合切断点から２５〜１００個のヌクレオチドであり、且つここで外側プライマー標的アンプリコンは、既知の遺伝子融合切断点に広がる少なくとも１００ヌクレオチド長であるアンプリコンを含むか；或いは、該標的遺伝子の各々についての既知の融合切断点から２５〜５０ヌクレオチドであり、且つここで外側プライマー標的アンプリコンは、既知の遺伝子融合切断点に広がる少なくとも５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む：標的結合配列に結合する少なくとも１つのプライマーを含む。
本方法の標的−特異的外側プライマー増幅条件は、５８℃〜７２℃で３０〜１２０分間又は６０〜９０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程を有する、少なくとも５サイクルＰＣＲを含む。
本方法は、５８℃〜６５℃で３０〜１２０分間の外側プライマーアニーリング工程による２〜１０サイクルのＰＣＲの第一セット、及び６８℃〜７２℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による５〜５０サイクルのＰＣＲの第二セットである、標的−特異的外側プライマー増幅条件の２セットを含むことができる。この標的−特異的外側プライマーのセットの最高Ｔｍは、アニーリング温度よりも２〜１０度低いことができる。このアニーリングは、アニーリング／伸長併用工程で実行することができる。
哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子における突然変異を検出する方法の更なる実施態様が提供され、ここで該標的−特異的外側プライマー増幅条件は、５８℃〜７２℃で、長さ３０〜１２０分間、又は６０〜９０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程を有する、少なくとも５サイクルのＰＣＲを含む。この標的−特異的外側プライマー増幅条件は、５８℃〜６５℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による２〜１０サイクルのＰＣＲの第一セット、並びに６８℃〜７２℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による５〜５０サイクルのＰＣＲの第二セットを含むことができる。標的−特異的外側プライマーの５０％、７５％、９０％、９５％又は全ての最高Ｔｍは、増幅（例えばＰＣＲ）反応に使用されるアニーリング温度よりも、その範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは２０℃から、その範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、もしくは２５℃低いことができる。この標的−特異的外側プライマーのセットの最高Ｔｍは、アニーリング温度よりも２〜１０℃低いことができる。一連の標的−特異的外側プライマーは、標的遺伝子に関する既知の切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的結合配列に結合する、少なくとも１つのプライマーを含み、且つこのアニーリングは、アニーリング／伸長併用工程で実行することができる。
別の実施態様において、インビトロにおいて標的核酸領域を増幅する方法が提供される。この方法は、以下を含む：ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、ライブラリー由来の核酸断片、複数の標的−特異的プライマーの第一プール及び第一のリバースユニバーサルプライマーを配合することにより、反応混合物を形成する工程であって、ここで該ライブラリーの核酸断片は、ユニバーサルリバースプライマー結合部位を含み、且つここで該複数の標的−特異的プライマーは、１０〜５０個のヌクレオチドにより標的核酸領域上で隔てられているタイリングされた一連のプライマー結合部位に結合することが可能である５〜２５０のプライマーを含む工程；並びに、該反応混合物を増幅条件に供し、長さが１００〜２００ヌクレオチドのアンプリコンを形成し、ここで該増幅条件は、５８℃〜７２℃で３０〜１２０分間のアニーリング工程を含み、これにより標的核酸領域を増幅する工程。この標的−特異的プライマー増幅の方法は、５８℃〜７２℃で６０〜９０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程を有する、少なくとも５サイクルのＰＣＲを含むことができる。
本方法は、５８℃〜６５℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による２〜１０サイクルのＰＣＲの第一セット及び６８℃〜７２℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による５〜５０サイクルのＰＣＲの第二セットである、標的−特異的プライマー増幅条件を更に含むことができる。標的−特異的外側プライマーの５０％、７５％、９０％、９５％又は全ての最高Ｔｍは、増幅（例えばＰＣＲ）反応に使用されるアニーリング温度よりも、その範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは２０℃からその範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、もしくは２５℃低いことができる。標的−特異的外側プライマーのセットの最高Ｔｍは、アニーリング温度よりも２〜１０℃低いことができる。このアニーリングは、アニーリング／伸長併用工程で実行することができる。
更なる実施態様において、哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子が関与する融合を検出する方法が提供される。この方法は、以下を含む：試料中の核酸を、標的遺伝子の標的領域にわたる片側ＰＣＲタイリング反応に供し、外側標的アンプリコンを作製し、ここで該タイリング反応は、リバース外側ユニバーサルプライマー、及び１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子の標的領域上で隔てられているタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位に結合する５〜２５０のフォワード標的−特異的外側プライマーを使用し実行される工程；並びに、標的アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子中の突然変異を検出する工程。本方法は更に、リバース内側ユニバーサルプライマー、及び１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子の標的領域上で隔てられているタイリングされた一連の標的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各々少なくとも１つの外側プライマー標的アンプリコン上に認められる、一連のフォワード標的−特異的内側プライマーを使用し、外側標的アンプリコンを増幅することにより、第二の片側ＰＣＲタイリング反応を実行し、内側フォワード標的アンプリコンを作製する工程を更に含み、ここで該フォワード標的−特異的内側プライマーは、一連の外側標的−特異的プライマーと同じ方向で伸長反応をプライミングするように構成され、且つここでその核酸配列が分析される標的アンプリコンは、内側フォワード標的アンプリコンを含む。
本方法の標的−特異的内側プライマー結合部位は、５〜２０個のヌクレオチドにより、標的−特異的外側プライマー結合部位と重複することができる。この標的領域は、遺伝子融合に関与していることがわかっている標的遺伝子の領域を含む。このタイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位は、１０〜７５又は１５〜５０個のヌクレオチドにより、標的領域上で隔てられることができる。このタイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位及び標的−特異的内側プライマー結合部位は、２〜５０の標的遺伝子の各々の標的領域上で選択される。
開示された発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項から明らかであろう。
図面の簡単な説明
図１：遺伝子融合にわたる１６０ｂｐの遺伝子融合スパイクのグラフ表示。
図２：遺伝子融合が、各遺伝子の異なる部分を伴う、「パートナー」第一遺伝子と「標的」第二遺伝子の間に置かれている、人工的に合成された１６０ｂｐ遺伝子融合スパイクのグラフ表示。
図３：片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法においてプールするための内側＋外側プライマーを選択するために群別された連続した３０ｂｐウインドウ内にタイリングされた標的特異的プライマーのグラフ表示。
図４：選択されたタイリング標的に関する、外側プラス鎖、内側プラス鎖、外側マイナス鎖及び内側マイナス鎖プライマーセットの各々に関する、プライマーデザインプールのグラフ表示。
図５：標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法を使用する場合の、内側プライマーに関する増幅されたリードを読み取ることで始めるデータ解析のグラフ表示。
図６Ａ−６Ｂ：標的特異的タイリングされたプライマーによるＰＣＲ法の略図が描かれている。図６Ａ−６Ｂは、最初に増幅された外側プライマーアンプリコン（図６Ａ、第一のＰＣＲ）が、内側プライマー（図６Ｂ、第二のＰＣＲ）によるネステッドＰＣＲの第二ラウンドのための鋳型である、標的特異的プライマーによる、片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法を図示している。 図６Ａの説明に同じ。
図７Ａ−７Ｂ：ライブラリー調製及び第一増幅ラウンド（図７Ａ、第一のＰＣＲ）、第二増幅ラウンド（第二のＰＣＲ）から、ＮＧＳシークエンシング及びシークエンシング解析（図７Ｂ）にかけての、標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法に関する実験的ワークフローを描く。 図７Ａの説明に同じ。
図８Ａ−８Ｃ：標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法から生じる、配列決定されたＴＰ５３遺伝子アンプリコンのＮＧＳシークエンシングリードデプス（ＤＯＲ）のグラフ表示。図８Ａは、プラス鎖標的特異的ＰＣＲプライマープールを用いて作製された、配列決定されたアンプリコンのＤＯＲを図示している。図８Ｂは、マイナス鎖標的特異的ＰＣＲプライマープールを用いて作製された、配列決定されたアンプリコンのＤＯＲを図示している。図８Ｃは、プラス鎖及びマイナス鎖の両方の標的特異的ＰＣＲプライマープールを用いて作製された、配列決定されたアンプリコンの組合せＤＯＲを図示している。
図９Ａ−９Ｂ：遺伝子融合を検出するための２つの可能性のある方法を、図示している。図９Ａは、ＴＰＭ４−ＡＬＫ１のための片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法（Ｓｔａｒ１及びＳｔａｒ２）、並びにＣＤ７４（パートナー遺伝子）及びＲＯＳ１（標的遺伝子）の両側一工程マルチプレックスＰＣＲ法（ＯｎｅＳｔａｒ）を図示している。図９Ｂは、融合が起こり得るＡＬＫ１遺伝子領域にわたりタイリングされた、標的特異的タイリングされたプライマーを図示している。
図１０Ａ−１０Ｃ：３種の遺伝子融合スパイクのシークエンシングデータを図示している。図１０Ａは、上側トラック上の片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲから生じるアンプリコンの野生型ＡＬＫ配列リード、及び下側トラック上の片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ誘導されたアンプリコンから配列決定されたシークエンスドＴＰＭ４−ＡＬＫ９切断点を描いている。図１０Ｂは、上側トラック上の片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲからの野生型ＡＬＫ配列決定されたアンプリコン、及び下側トラック上の片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ由来のアンプリコンから配列決定されたシークエンスドＮＰＭ１−ＡＬＫ９切断点を描いている。図１０Ｃは、下側トラックシークエンシングリード（増幅なし、そのためシークエンシング産物なし）上の標的特異的タイリングされたプライマーによる両側一工程マルチプレックスＰＣＲ法により増幅された野生型ＣＤ７４ ＰＣＲ、及び上側トラックシークエンシングリード上の両側一工程マルチプレックスＰＣＲ法により増幅されたシークエンスドＣＤ７４−ＲＯＳ１＿１３切断点を描いている。 図１０Ａの説明に同じ。 図１０Ａの説明に同じ。
図１１：融合又はＳＮＶの検出のための分析のフローチャート。
図１２：野生型ＡＬＫ増幅のためのプライマー競合の概略。黒色はＡＬＫ配列、青色はＥＭＬ４配列、赤色はプライマーである。
図１３Ａ−１３Ｈ：ＡＬＫ、染色体２、及びＲＯＳ１、染色体６、標的領域（配列番号：１−２９６）のＰＣＲ増幅に関する、ＳＴＡＲ１（１４８フォワード標的−特異的外側プライマー）及びＳＴＡＲ２（１４８フォワード標的−特異的内側プライマー）に関する典型的プライマーの表。列の項目：名称（プライマー名）；特異性（“Ｔｒｕｅ”は遺伝子に独自の配列、“Ｆａｌｓｅ”は独自ではない（全ての内側プライマーが“Ｔｒｕｅ”の場合のみ、外側プライマーについて規定される））；ｂｐ（塩基対数）；スタート（遺伝子上のヌクレオチドプライマー結合配列の開始）；Ｔｍ（結合したプライマーの融解温度）；配列番号．（プライマーの配列リストＩＤ番号）；並びに、距離（外側プライマーのスタートと内側プライマーのスタートの間の距離）。 図１３Ａの説明に同じ。 図１３Ａの説明に同じ。 図１３Ａの説明に同じ。 図１３Ａの説明に同じ。 図１３Ａの説明に同じ。 図１３Ａの説明に同じ。 図１３Ａの説明に同じ。
図１４：４種の異なる遺伝子融合対のスパイクデザインを示すグラフ表示で、全てのスパイクは、同じ切断点を伴うが、しかし標的遺伝子及びパートナー遺伝子の異なる割合を伴う。
図１５：遺伝子融合、Ｓｔａｒ１−Ｓｔａｒ２及びＯｎｅＳｔａｒを検出するための、２つの異なるアプローチを示すグラフ表示。
図１６：ＡＬＫ：ＴＰＭ４の遺伝子−融合切断点に関する、フォワードプライマーの４つの位置、並びにそれらの代表的アンプリコンのグラフ表示。
図１７：鋳型融合スパイク分子に関する、フォワード内側プライマー２、３、及び４の相対位置のグラフ表示。
図１８Ａ：一連のフォワード標的特異的プライマーによる様々な長さの複数標的のタイリングのグラフ表示。アダプターを伴わない標的インサートの長さは、括弧内に示している。
図１８Ｂ：タグ付けプライマー蛍光、対、アンプリコン長の１ステージアニーリングサイクルスペクトルを示すグラフ。
図１８Ｃ：タグ付けプライマー蛍光、対、アンプリコン長の２ステージアニーリングサイクルスペクトルを示すグラフ。
図１９Ａ：３０、６０及び９０分間のアニーリングサイクルを使用する、一連のプライマーによる、８Ｆ９＋５Ｒ４＿ＲＳＱ鋳型、１１７ｂｐ標的インサートの増幅により生成された生成物の割合（％）のグラフ表示。
図１９Ｂ：３０、６０及び９０分間のアニーリングサイクルを使用する、一連のプライマーによる、８Ｆ９＋５Ｒ４＿ＲＳＱ鋳型、標的の１２１ｂｐ標的インサートの増幅により生成された生成物の割合（％）のグラフ表示。
図１９Ｃ：９０分間のアニーリングサイクル及び２種の異なるマスターミックス組成物を使用する、一連のプライマーによる、８Ｆ９＋５Ｒ４＿ＲＳＱ鋳型、１２１ｂｐ標的インサートの増幅により生成された生成物の割合（％）のグラフ表示。
図１９Ｄ：９０、６０及び３０分間のアニーリングサイクルを使用する、一連のプライマーによる、８Ｆ９＋５Ｒ４＿ＲＳＱ鋳型；２３２ｂｐ標的インサートの増幅により生成された生成物の割合（％）のグラフ表示。
先に確定した図は、代表として提供され、限定するものではない。
発明の詳細な説明
一例証的実施態様において、マルチプレックスＰＣＲを利用する循環核酸中の突然変異検出のための戦略が、本明細書に提供される。例証的実施態様において本方法は、既知又は不明の突然変異について、既知の癌−関連遺伝子を走査するために使用することができ、及び／又はこれは遺伝子融合を検出するために使用することができる。マルチプレックスＰＣＲは、標的遺伝子の標的領域上のタイリングされた一連の結合部位に結合するプライマーにより実行される（すなわち、プライマーは、該遺伝子にわたりタイリングされる）。この標的領域は、突然変異が疑われる、考えられる又は生じることがわかっている領域であることができる。マルチプレックスＰＣＲには、典型的にはシークエンシング及びバイオインフォマティクス解析が続く。例えばＰＣＲプライマーは、先行する分析から癌−関連遺伝子融合が生じることがわかっている全領域にわたり、タイリングされることができる。このアプローチにおいて、バイオインフォマティクス解析は、２つの遺伝子（標的遺伝子及び融合パートナー）をマッピングする配列リードを同定し、これにより遺伝子融合事象を検出することができる。例証的実施態様において、本発明のこの実施態様の方法は、片側プライマータイリング、特にネステッド片側プライマータイリングを利用するＰＣＲ法である。より高い収率及びより大きい特異性を伴うより大きいアンプリコンを提供する、このような片側タイリングマルチプレックスＰＣＲ法への改良が、提供される。
従って本発明の一実施態様に従う方法は、哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子における突然変異の検出のために提供される。特定の例証的実施態様において、突然変異は、遺伝子融合である。この方法は、以下の工程を含むことができる：試料又はそれらの断片から作製された核酸ライブラリーを増幅するための、片側マルチプレックスＰＣＲタイリング反応混合物を形成する工程。例証的実施態様において、片側マルチプレックスＰＣＲ増幅は、ネステッド、片側マルチプレックスＰＣＲ増幅である。片側マルチプレックスＰＣＲ反応は、標的遺伝子の標的領域上のタイリングされた一連の結合部位に結合する一連のフォワードプライマーを使用する。例証的実施態様において、標的遺伝子は、癌−関連遺伝子、例えば癌駆動者である融合事象において遺伝子融合パートナーであることが公知の遺伝子などである。この反応混合物は、増幅条件に供され、且つ作製されたアンプリコンの少なくとも一部の核酸配列は、それらの核酸配列を決定するために分析される。
より具体的実施例において、標的遺伝子中の突然変異を検出するためのこの実施態様の方法は、以下の工程を含むことができる：ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及び第一鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを配合することにより、外側プライマー反応混合物を形成する工程であって、ここで該核酸断片は、リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のフォワード標的−特異的外側プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含む工程；この外側プライマー反応混合物を、外側プライマー増幅条件に供し、一連のフォワード標的−特異的外側プライマーの一つのプライマー及びリバース外側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製された外側プライマー標的アンプリコンを作製する工程；並びに、外側プライマー標的アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子における突然変異を検出する工程。
特定の実施態様において、本明細書に提供される方法は、遺伝子融合、特に癌に関連した遺伝子融合を検出する方法である。かかる融合は、以下の融合パートナー遺伝子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は全てを含むことができる：ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１。融合を検出するためにここで提供される方法において使用されるプライマーは、範囲の下端が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００又は２５０、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，００００、６０，０００、又は７５，０００の間の一連のプライマーを含むことができ、及び範囲の上端が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００又は２５０、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，００００、６０，０００、７５，０００、又は１００，０００の間の一連のプライマーを含むことができ、ここで範囲の下端がプライマー１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、又は１０，０００と、範囲の上端上でプライマー２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、１０，０００又は２５，０００の間は、各標的遺伝子について既知の切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的結合配列に結合し、且つここで本方法により作製されたアンプリコンは、平均２５〜２００ヌクレオチド長であり、特定の実施態様においては５０〜１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む。例証的実施態様において、この遺伝子融合は、以下から選択される融合パートナー遺伝子からの染色体転座を含む：ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１。一部の実施態様において、改善されたＰＣＲ反応混合物及びサイクリング条件、並びに本明細書に提供される例証的プライマー部位スペーシングのいずれかを含むタイリングされたプライマーを使用する片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲを含む本明細書に提供される方法は、遺伝子融合を検出するために、具体的に設計される。
融合検出のための本明細書に提供される方法において、標的領域は、例えば、標的遺伝子について０．５ｋｂ〜１０ｋｂ、及び特定の実施態様において、標的遺伝子について０．５ｋｂ〜５ｋｂであることができる。実施例１に明らかにされたように、マッピング公開データベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）融合による融合を検出するための標的領域は、ゲノム座標に転写する（すなわち転座）が、好ましくはエクソン境界及び報告された融合を使用する。このアプローチを使用し、タイリングされるべき標的領域は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１及びＲＥＴの３つの例示的標的の各々について＜３．６ｋｂの配列のタイリングを必要とするであろう。実施例１の表２は、既知の融合標的ＡＬＫ、ＲＯＳ１、及びＲＥＴに関する具体的、例示的標的領域を詳述している。
特定の例証的実施態様において、本発明の方法において分析される試料は、血液試料、又はその画分である。特定の実施態様において、本明細書に提供される方法は、インビトロ方法である。特定の実施態様において、本明細書に提供される方法は、ＤＮＡ断片の、特に循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）中に認められる腫瘍ＤＮＡ断片の増幅に、特別に適用される。かかる断片は、典型的には約１６０ヌクレオチドの長さである。
無細胞核酸（ｃｆＮＡ）、例えばｃｆＤＮＡは、アポトーシス、ネクローシス、自己貪食及びネクロプトーシスなどの、細胞死の様々な形を介して循環へと放出され得ることは、当該技術分野において公知である。ｃｆＤＮＡは断片化され、且つこれらの断片のサイズ分布は、１５０〜３５０ｂｐから＞１００００ｂｐまで変動する(Kalninaら、World J Gastroenterol. 2015 Nov 7; 21(41): 11636-11653参照)。例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血漿ＤＮＡ断片のサイズ分布は、長さ１００〜２２０ｂｐの範囲に広がり、約１６６ｂｐにカウント頻度(count frequency)のピークがあり、且つ最高腫瘍ＤＮＡ濃度は長さ１５０〜１８０ｂｐの断片にある(参照：Jiangら、Proc Natl Acad Sci USA 112:E1317-E1325)。
例証的実施態様において、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、遠心分離による細胞デブリ及び血小板の除去後に、ＥＤＴＡ−２Ｎａチューブを使用し、血液から単離される。この血漿試料は、例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、独国）を使用し、ＤＮＡが抽出されるまで、−８０℃で貯蔵することができる(例えば、Hamakawaら、Br J Cancer. 2015; 112:352-356)。Hamakavaらは、全ての試料の抽出された無細胞ＤＮＡの中央濃度４３．１ｎｇ／ｍｌ血漿（９．５〜１３３８ｎｇ／ｍｌの範囲）、及び突然変異体画分範囲０．００１〜７７．８％、中央値０．９０％を報告した。
特定の例証的実施態様において、この試料は腫瘍である。本明細書の教示を考慮し、腫瘍から核酸を単離する方法、及びかかるＤＮＡ試料から核酸ライブラリーを作製する方法は、当該技術分野において公知である。更に本明細書の教示を考慮し、当業者は、ｃｔＤＮＡ試料へ加えＤＮＡが自在浮遊である他の液体試料などの、他の試料から、本明細書の方法に適した核酸ライブラリーを作製する方法を認めるであろう。
特定の実施態様において、本発明の方法は典型的には、試料由来の核酸ライブラリー（すなわち、ライブラリー調製品）を作製し且つ増幅する工程を含む。ライブラリー調製工程時の試料由来の核酸は、付属されたライブラリータグ又はライゲーションアダプタータグ（ＬＴ）と称されることが多いライゲーションアダプターを有することができ、ここでこのライゲーションアダプターは、ユニバーサルプライミング配列を含み、その後ユニバーサル増幅される。ある実施態様において、これは、断片化後にシークエンシングライブラリーを作製するように設計された標準プロトコールを用いて実行されてよい。ある実施態様において、ＤＮＡ試料は、平滑末端であることができ、次にＡが３’末端に付加され得る。Ｔ−オーバーハングを伴うＹ−アダプターは、付加され且つライゲーションされる。一部の実施態様において、他の付着末端は、Ａ又はＴオーバーハング以外も使用することができる。一部の実施態様において、例えば、ループ化されたライゲーションアダプターなどの他のアダプターが、付加され得る。一部の実施態様において、これらのアダプターは、ＰＣＲ増幅のために設計されたタグを有してよい。
プライマーテイルは、例外なくタグ付けされたライブラリーからの断片化されたＤＮＡの検出を改善することができる。ライブラリータグとプライマーテイルが相同配列を含む場合、ハイブリダイゼーションは、改善され得（例えば、融解温度（Ｔｍ）は低下する）、且つプライマーは、プライマー標的配列の一部が試料ＤＮＡ断片中に存在する場合にのみ、伸長され得る。一部の実施態様において、１３以上の標的特異的塩基対を使用してよい。一部の実施態様において、１０〜１２の標的特異的塩基対を使用してよい。一部の実施態様において、８〜９の標的特異的塩基対を使用してよい。一部の実施態様において、６〜７の標的特異的塩基対を使用してよい。
本明細書に提供される方法の例示的実施態様は、片側マルチプレックスＰＣＲアプローチを利用するので、ライブラリー調製時に、１又は複数のユニバーサルプライマー結合部位（例えば、リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位、リバース内側ユニバーサルプライマー結合部位）は、典型的にはライブラリーの核酸断片にライゲーションされたアダプター上に含まれる。更に、部分配列の核酸配列決定に関する、シークエンシングプライマー結合部位は、当業者に認められるように、ライブラリー調製工程、又は任意の後続の工程時に追加することができる。加えて、ユニーク又は半ユニークの識別子（ＵＩＤ）は、ライブラリー調製工程時に試料から単離された核酸に追加され得る。
後続の増幅、例えばクローン増幅のため、及び部分配列シークエンシングのための、ユニバーサルプライマー結合部位を含む核酸のライブラリーを作製するための多くのキット及び方法が、当該技術分野において公知である。アダプターライゲーションの促進を補助するために、ライブラリー調製及び増幅は、末端修復及びアデニル化（すなわちＡ−テイル化）を含むことができる。小さい核酸断片、特に循環遊離ＤＮＡからのライブラリーの調製に適合されたキットは、本明細書に提供される方法を実践するのに有用であることができる。例えば、Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（オースチン、ＴＸ）から入手可能なＮＥＸＴｆｌｅｘ無細胞キット又はＮａｔｅｒａライブラリー調製キット（更に実施例９において考察、Ｎａｔｅｒａ社、サンカルロス、ＣＡ）など。しかしかかるキットは、典型的には、本明細書に提供される方法の増幅工程及びシークエンシング工程のためにカスタマイズされたアダプターを含むように、改変されるであろう。アダプターライゲーションは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＣＡ）において認められるライゲーションキットなどの、市販のキットを用いて、実行することができる。
従ってライブラリー調製の結果として、本明細書に考察されたように、ネステッド型の実施態様のための、リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位及び任意にリバース内側ユニバーサルプライマー結合部位を有する核酸断片を含む、核酸ライブラリーが作製される。かかるユニバーサルプライマー結合部位は、認識され、且つ典型的には本明細書に提供される方法の例示的実施態様の反応混合物中に含まれるユニバーサルプライマーに相補的である。本明細書に提供される実施例は、ユニバーサルプライマー結合部位及びユニバーサルプライマーの使用を例示している。
特定の実施態様において、本発明のために使用される一連のプライマー、例えばリバース又はフォワード内側又は外側標的−特異的プライマーは、標的遺伝子の標的領域にわたりタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位の１つに各々結合するプライマーを、範囲の下端が５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、又は５０，０００と、範囲の上端が１５、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、又は１００，０００の間含む。本発明において、一連のプライマーが標的遺伝子領域にわたりタイリングされる場合、この一連の各プライマーは、一連のプライマー結合部位の異なる結合部位に結合し、ここでシリーズ内のプライマー結合部位は、典型的には１〜１００個のヌクレオチドにより隔てられており、且つ同じ５’から３’方向で核酸鎖上で一連のプライマー伸長反応をプライミングすることが可能であり、ここでシリーズ内の第一のプライマー由来のプライマー伸長反応産物は、該シリーズ内の少なくとも１つの次のプライマーにより結合される標的遺伝子の領域と重複している。
シリーズ内のプライマー結合部位は、範囲の下端が１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００ヌクレオチドと、範囲の上端が１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０ヌクレオチドの間により隔てられている、少なくとも２つのプライマー結合部位を含むことができる。特定の実施態様において、シリーズ内のプライマー結合部位は、範囲の下端が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、５００、１０００、１５００、１００００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、又は５０，０００プライマー及びプライマー結合部位、並びに上端が３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、５００、１０００、１５００、１００００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、７５，０００又は１００，０００のプライマー及びプライマー結合部位を含む。特定の例証的実施態様において、一連のプライマー結合部位は、関心対象の遺伝子の全標的領域に広がり、且つ下端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０と、上端が３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は５００の間のヌクレオチドにより隔てられている。
かかるプライマー結合部位スペーシングは、特定の例証的実施例において、タイリングされた結合部位に結合する一連のプライマーにより作製された予想されるアンプリコンサイズを基に、及び／又はタイリングＰＣＲに使用される増幅条件を基に、選択され得る。例えばタイリングプライマー結合部位スペーシングは、予想される、実験的な、もしくは実際の平均アンプリコン長の、範囲の下端が１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％と、範囲の上端が２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の間であることができる。特定の例示的実施態様において、タイリングプライマー結合部位スペーシングは、本明細書に提供される本発明の方法時に作製されたアンプリコンの実際の平均のアンプリコン長の２５％〜９０％である。別の例示的実施態様において、タイリングプライマー結合部位スペーシングは、本明細書に提供される本発明の方法時に作製されたアンプリコンの実際の平均のアンプリコン長の２５％〜５０％である。更に別の例示的実施態様において、タイリングプライマー結合部位スペーシングは、本明細書に提供される本発明の方法時に作製されたアンプリコンの実際の平均のアンプリコン長の５０％〜９０％である。本明細書に提供される別の実施態様において、タイリングプライマー結合部位スペーシングは、本明細書に提供される本発明の方法時に作製されたアンプリコンの平均長未満である。
従って遺伝子融合を検出するための本明細書に提供される方法において、前記プライマー範囲は、アンプリコンが、提供された範囲の上端よりも短い又はこれと等しい距離だけ、融合切断点に広がることを確実にする助けになるであろう。例えば、融合検出のための特定の例示的実施態様において、プライマー結合部位は、融合切断点から平均アンプリコン長を超えることのない距離内にあるであろう。融合検出に関する他の例示的実施態様において、プライマー結合部位は、融合切断点から平均アンプリコン長の７５％を超えることのない距離内にあるであろう。本明細書において考察される場合、プライマー結合部位間のスペーシング又は距離は、第一プライマー結合部位の３’末端と、第一プライマー結合部位に結合するプライマーと同じ方向で下流にプライミングするプライマーにより結合される第二プライマー結合部位の５’末端の間の距離を基にしている。
特定の例証的例において、プライマー結合部位は、２５〜２００ヌクレオチドにより、標的遺伝子の標的領域上で隔てられている。特定の例証的例において、プライマー結合部位は、２５〜１５０ヌクレオチドにより、標的遺伝子の標的領域上で隔てられている。特定の例証的例において、プライマー結合部位は、１０〜１００個のヌクレオチドにより、標的遺伝子の標的領域上で隔てられている。他の例証的例において、タイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位は、１０〜７５ヌクレオチドにより、標的遺伝子上で隔てられている。別の例証的方法において、タイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位は、１５〜５０ヌクレオチドにより、標的遺伝子の標的領域上で隔てられている。このセクションで考察したプライマースペーシングに関連したプライマー結合部位は、本発明の方法の標的−特異的プライマー結合部位のいずれかであることができる。例えば、考察したスペーシングは、プラス鎖又はマイナス鎖のいずれかにおける標的−特異的外側又は内側プライマー結合部位についてであることができる。
例証的実施態様において本明細書に提供される方法は、片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法であり、これは本明細書において片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法とも称される。従って本方法は、典型的には、ネステッドプライマー（すなわち、内側プライマーセットのメンバーとしての内側プライマー及び外側プライマーセットのメンバーとしての外側プライマー）を使用する増幅反応を含む。
本明細書の実施例３は、本明細書に提供される方法における使用のためのタイリングされたプライマーを設計するアプローチに関する詳細を提供する。このプライマーは、標的遺伝子（すなわち関心対象の遺伝子）の標的領域にわたり隔てられたタイリングされた一連のプライマー結合部位に結合する。例証として、プライマーは、５５℃〜６５℃、例えば５８℃〜６１℃に最適融解温度（Ｔｍ）を持つ標的遺伝子領域のプラス鎖及び／又はマイナス鎖について設計され得る（図４−６）。弛緩型（ｄｅｌｔａＧ−６、ｄｅｌｔａＧ−５、ｄｅｌｔａＧ−４）又は緊張型（ｄｅｌｔａＧ−３）プライマーセットにより設計されたプライマーを、設計することができる。弛緩型セットは、典型的にはプライマーによりカバーされたより多くのウインドウを有するが、またプライマー−二量体を生じる可能性のある有害なプライマーも含み得る。プライマーは、任意のプライマー供給会社、例えばＩＤＴ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）などに発注することができる。プライマーは、タグ付き又はタグなしで設計することができる。例えば非限定的に、外側プライマーは、タグなしで設計され、及び内側プライマーは、ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号：２９７）のように、タグ付きで設計されることができる。
プライマーデザインは、Ｐｒｉｍｅｒ３により作製されることができる(Untergrasser A、Cutcutache I、Koressaar T、Ye J、Faircloth BC、Remm M、Rozen SG (2012)、”Primer3 - new capabilities and interfaces”、Nucleic Acids Research 40(15):e115、及びKoressaar T、Remm M (2007)、”Enhancements and modifications of primer design program Primer3”、Bioinformatics 23(10):1289-91)（ソースコードはprimer3.sourceforge.netで入手可能）。プライマー特異性は、ＢＬＡＳＴにより評価することができ、且つ現存するプライマーデザイン情報ルートに加えられる。
プラス（＋）鎖プライマーは、選択された標的領域について作製することができる。標的領域配列は、２０〜５０ｂｐ毎のウインドウにおいて標的化することができる。各プライマーデザインウインドウは、ウインドウ開始点から長さ２０〜４０ｂｐであることができる。プライマーは、対をなすネステッド外側プライマー及び内側プライマーについて２つの連続したウインドウで検索することができる。Ｐｒｉｍｅｒ３を使用し、各領域の最も右側の５’（又はマイナス鎖上最も左側）座標を標的化する外側プライマーが、設計され得る。ウインドウを使用するための論理的根拠は、内側プライマーは、第二ウインドウ毎に選択され、且つマッチする外側プライマー（下記の規則に従う）は、更に遠くではなく、同じ又は先行する（３’側）ウインドウのいずれかから選択されることである。プライマーは、ＲｕｎＰｒｉｍｅｒ３．ｊａｖａを用いｏｎｅ＿ｓｉｄｅｄ＝ｔｒｕｅオプションで、作製することができる。プログラムのこのモードは、対をなすマイナスプライマーを作製せずに、プライマーのただ一つのセットを作製する。
プライマー特異性は、ｎｃｂｉ−ｂｌａｓｔ−２．２．２９＋パッケージからのＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて、決定することができる。タスクオプション“ｂｌａｓｔｎ−ｓｈｏｒｔ”を使用し、ｈｇ１９ヒトゲノムに対しプライマーをマッピングすることができる。プライマーがこのゲノムに対し１００未満のヒットを有し、且つトップヒットがそのゲノムの標的相補的プライマー結合領域であり、及び他のヒットよりも少なくとも２スコアより高い（スコアはＢＬＡＳＴｎプログラムにより規定される）場合は、このプライマーデザインは“特異的(specific)”と決定することができる。これは、このゲノムに対するユニークヒットを有し、且つゲノムを通じて多くの他のヒットを有さないために、実行することができる。
プライマーは、以下の規則により、内側対＋外側対に対する各連続したウインドウで群別され得る（例えば図５参照）：
ａ）タイリングされたウインドウ毎に外側／内側プライマー対が存在する（図示された３０ｂｐウインドウ（例えば図３参照）；
ｂ）第二ウインドウ毎から、特異的内側プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３によりアウトプット順に試行することができる；
ｃ）プライマーは、既に選択された任意の他の内側プライマーとそれが＞５０％重複する場合、スキップすることができる；
ｄ）外側プライマーは、以下のように同定されるよう試みることができる：
ａ．現在の及び先行するウインドウからの外側プライマー（1つは内側プライマー由来）は、以下のようなプライマーを見つけるよう試行される：
１．プライマーの第一塩基は、内側プライマーの第一塩基の前（又はマイナスプライマーについては後ろ）である
２．外側プライマーと重複しない内側プライマーの部分は、５〜２０塩基である
３．外側プライマーは特異的である
４．プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３アウトプットによりもたらされた順に試験される
ｂ．（ｉ）に失敗したならば、外側プライマーを非特異的にすること以外は、（ｉ）と同様に試行
ｃ．（ｉｉ）に失敗したならば、距離を３〜４０塩基にすること以外は、（ｉ）と同様に試行
ｄ．（ｉｉｉ）に失敗したならば、距離を３〜４０塩基とし、且つ外側プライマーを非特異的にすること以外は、（ｉ）と同様に試行
ｅ．（ｉｖ）に失敗したならば、距離を４０〜１００塩基にすること以外は、（ｉ）と同様に試行
ｆ．（ｖ）に失敗したならば、距離を４０〜１００塩基にし、且つ外側プライマーを非特異的にすること以外は、（ｉ）と同様に試行
ｅ）他のプライマーとの相互作用なし又は最小（内側プライマー及び外側プライマーについて個別に試験した）
ｆ）内側プライマーは、プラス鎖タグ付き配列ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ”（配列番号：２９７）との相互作用なし
ｇ）外側プライマーは、マイナス鎖タグ配列ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号：２９８）との相互作用を有さない
ｈ）最終的に選択されたプライマーは、ＩＧＶ(Robinsonら、Integrative Genomics Viewer. Nature Biotechnology 29, 24-26 (2011))及びＵＣＳＣブラウザ(Sugnetら、The human genom browser at UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006)において、バリデーションのためのベッドファイル及びカバレッジマップを使用し、可視化することができる。
弛緩型及び緊張型ｄｅｌｔａＧ閾値（−６対−３）を伴うプライマーセットは、各々５８及び６１のＴｍ設定で設計され得る（プラス／マイナス鎖及び内側／外側プライマーを含む、例えば１デザインにつき４プール）。選択されたプライマーの最終セットは、各鎖上の、及び各鎖組合せ上の（“ｂｏｔｈ”と称される）、各標的領域のそれらのカバレッジを見るために評価され得る。次に許容し得るプライマーセットは、ネステッドマルチプレックスＰＣＲのために、本明細書で提供される方法で使用される。
本明細書の実施例４は、ＴＰ５３遺伝子などの、癌駆動突然変異である様々な突然変異を有することがわかっている遺伝子などの、癌−関連遺伝子における突然変異を検出する方法において使用するために、標的領域を同定し且つタイリングされたプライマーを設計するアプローチに関する詳細を提供する。プライマーデザインパラメータ及びそれらのパラメータの設定の例証的例は、実施例４表９−１１に提供される。
本明細書において考察されるように、本明細書に提供されるネステッド片側ＰＣＲ法に関して、内側プライマー及び外側プライマーが使用される。従って具体的実施態様において、本発明の方法は、分析前に、外側プライマー標的アンプリコン、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸などのヌクレオチド、リバース内側ユニバーサルプライマー、並びに１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の標的−特異的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含み、且つ各々少なくとも１つの外側プライマー標的アンプリコン上に認められ、一連の外側標的−特異的プライマーと同じ方向に伸長反応をプライミングするよう構成された、一連のフォワード標的−特異的内側プライマーを配合することにより、内側プライマー増幅反応混合物を形成する工程；並びに、この内側プライマー反応混合物を、内側プライマー増幅条件に供し、フォワード標的−特異的内側プライマーの一つ及びリバース内側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製される内側プライマー標的アンプリコンを作製する工程であって、ここでその核酸配列が分析されるアンプリコンは、内側プライマー標的アンプリコンを含む工程を更に含む。特定の実施態様において、この標的−特異的内側プライマー結合部位は、範囲の下端が０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドと、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、又は２５ヌクレオチドの間の、マッチした標的−特異的外側プライマー結合部位と重複している。一つの例証的実施態様において、標的−特異的内側プライマー結合部位は、５〜２０ヌクレオチドにより、少なくとも１つの標的−特異的外側プライマー結合部位と重複している。更に別の例証的実施態様において、標的−特異的内側プライマー結合部位は、外側プライマー結合部位と重複していない。片側方法に関して、ＰＣＲアンプリコンの反対側上のユニバーサルプライマーは、外側プライマーによるＰＣＲ反応に対する内側プライマーによるＰＣＲ反応について、同じ又は異なることができる。
本発明の方法は、特定の実施態様において、増幅反応混合物を形成することを含む。例証的実施態様をそれら自身で形成する本明細書に提供される反応混合物のいずれかは、本発明の個別の態様である。本発明の反応混合物は典型的には、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸などのヌクレオチド、試料、特に循環腫瘍ＤＮＡを含有する血液の無細胞画分から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、及び一連のプライマーを配合することにより形成される。一連のプライマーは、プラス及び／又はマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー並びにプラス及び／又はマイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを含むことができ、ここで核酸断片は、リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のフォワード外側標的−特異的プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられたタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各標的領域は、５００〜１０，０００ヌクレオチドを含む。また更に例示的組成物において、一連のプライマーは、プラス及び／又はマイナス鎖フォワード標的−特異的内側プライマー並びにプラス及び／又はマイナス鎖リバース内側ユニバーサルプライマーを含み、ここで核酸断片は、リバース内側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のフォワード内側標的−特異的プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられたタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各標的領域は、５００〜１０，０００ヌクレオチドを含む。この組成物は、遺伝子融合切断点にわたり(cross)、ｃｔＤＮＡ試料から直接誘導される核酸断片を含むことができる。
本発明に有用な増幅反応混合物は、核酸増幅に関する、特にＰＣＲ増幅に関する当該技術分野において公知の成分を含む。例えば、反応混合物は典型的には、デオキシヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ、及びマグネシウムを含む。本発明に有用であるポリメラーゼは、増幅反応において使用することができる任意のポリメラーゼ、特にＰＣＲ反応において有用であるものを含むことができる。特定の実施態様において、ホットスタートＴａｑポリメラーゼは、特に有用である。Ｋ２３及びＡｍｐｌｉＴａｑゴールドマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）などの、本明細書に提供される方法の実践に有用な増幅反応混合物は、本明細書に提供される実施例セクションにおける非限定的例として提供される。PCR反応混合物に関する更なる詳細は、本明細書の更なるセクションに認められる。
ＰＣＲに関する増幅（例えば温度サイクリング）条件は、当該技術分野において周知である。本明細書に提供される方法は、ライブラリー由来の標的核酸などの、標的核酸の増幅を生じる、任意のＰＣＲサイクリング条件を含むことができる。非限定的例示的サイクリング条件は、本明細書の実施例セクションに提供される。ＰＣＲサイクリング条件に関する更なる詳細は、本明細書の更なるセクションに認められる。
本明細書に提供される融合検出方法の例証的実施態様は、例示的Ｓｔａｒ１及びＳｔａｒ２プロトコールを使用する、ｃｔＤＮＡライブラリーの片側ネステッドマルチプレックス増幅を適用する。Ｓｔａｒ１ ＰＣＲプログラムは以下である：９５℃で１０分；１５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］；７２℃で７分、４℃で保持。Ｓｔａｒ２ ＰＣＲプログラムは以下である：９５℃で１０分；１５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］；７２℃で７分、４℃で保持。
本発明の方法の例証的実施態様は、最初の変性工程（例えば、９５℃で５〜１５分）の後の延長されたアニーリング及び／又は伸長及び／又は組合せアニーリング／伸長時間、並びに、変性工程（例えば、９５℃で１５〜１２０秒）、３０〜２４０分の延長されたアニーリング工程、及び任意に７０〜７５℃（例えば７２℃）で３０〜２４０秒の伸長工程を含むサイクリングパラメータを利用する。アニーリング工程は、変性工程後及び任意の伸長工程前の、ＰＣＲサイクル中の工程である。任意に、ＰＣＲは、複数の段階（すなわち、サイクリングパラメータの複数の異なるセット）を有し、例えばＰＣＲは、本明細書に提供される実施例１２に明らかにされるような二段階ＰＣＲであることができる。従って本明細書に提供される一実施態様において、本発明の方法は、標的−特異的外側プライマー増幅条件などの増幅条件が、範囲の下端が５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、又は６５℃と、範囲の上端が６０、６１、６２、６３、６４、６５、又は７０℃の温度での、範囲の下端が３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０分と、範囲の上端が３５、４０、４５、５０、５５、６０、１２０、１８０、又は２４０分の間のアニーリング工程を有する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、又は３０サイクルのＰＣＲを含むものである。例証的実施態様において、アニーリング工程は、５８℃〜７２℃で、３０〜１２０分である。関連のある実施態様において、アニーリング工程は、５８℃〜６５℃で、長さ６０〜９０分である。
関連のある実施態様において、増幅条件は、範囲の下端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５サイクルと、範囲の上端が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５又は３０サイクルの間の第一セット、並びに範囲の下端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、又は２５サイクルと、範囲の上端が３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、又は６０サイクルの間の第二セットを含む。例証的実施態様において、増幅条件は、４０〜６０℃で、例えば５８℃〜６５℃で、３０〜１２０分の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程などのアニーリング工程による、２及び１０サイクルのＰＣＲ、並びに５５〜７５℃、例えば５８℃〜７２℃で、３０〜１２０分の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による、５〜５０サイクルのＰＣＲの第二セットを含む。別の実施態様において、標的−特異的及び／又はユニバーサルプライマーのセットの５０％、７５％、９０％、９５％又は全てのプライマーの最高Ｔｍは、増幅（例えばＰＣＲ）反応に使用されるアニーリング温度よりも、範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃と、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、又は２５℃の間だけより低い。例証的実施態様において、このプライマーセットの少なくとも５０％のプライマーのＴｍは、ＰＣＲ反応に使用されるアニーリング温度よりも２〜１０℃より低い。
延長されたアニーリング又は伸長工程を伴うこれらの実施態様において、この延長された工程はまた、アニーリング／伸長併用工程であることができる。本明細書に提供される一部の実施態様において、本明細書に提供されるプライマー結合部位スペーシングのいずれかを含む実施態様は、本明細書に提供される延長されたアニーリング及び／又は伸長条件のいずれかを含む実施態様と組合せられる。
本明細書の実施例１２において提供される一つの追加される驚くべき結果は、より高いイオン強度のＰＣＲマスターミックス（Ｋ２３）は、市販のＡｍｐｌｉＴａｑゴールドマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）と比べ、有意に高い割合の収量を生じ、且つより短いプライマーによる増幅に起因するより少ない副産物を伴うより大きい選択性を有したことである。従って特定の実施態様において、イオン強度最終濃度が、７５〜１０００ｍＭ、１００〜８００ｍＭ、１５０〜６００ｍＭ、及び２００〜４００ｍＭである１×ＰＣＲ反応混合物が、本明細書に提供される。
ＰＣＲを実行する際に可能である、多くのワークフローが存在し：本明細書に開示された方法に典型的ないくつかのワークフローが、本明細書に提供される。本明細書に概説された工程は、他の可能性のある工程を排除することを意味せず、また本明細書記載の工程のいずれかが、その方法を適切に作業するために必要とされることを暗示するものでもない。多数のパラメータの変動又は他の修飾は、文献において公知であり、且つ本発明の本質に影響を及ぼすことなく行われてよい。
一部の実施態様において、本明細書に提供される方法は、癌などの、哺乳動物の疾患において突然変異されることがわかっている標的領域にわたる、タイリングされたマルチプレックスＰＣＲを実行することにより、突然変異について標的遺伝子を走査するために使用することができる。従って特定の実施態様において、哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子において、突然変異を検出する方法が、本明細書に提供され、ここで、任意に重複する配列を有する外側プライマー標的アンプリコンは、標的遺伝子の標的領域に広がり、ここで標的領域は、全遺伝子、遺伝子のエクソンの全て、又はそれらの任意の画分を含むことができる。例えば、ヌクレオチド長は、範囲の下端が０、０．１、０．２５、０．５、及び１．０ｋと、範囲の上端が１．０、２．５、５、及び１０ｋの間である。標的領域は、疾患に関連した既知の突然変異を含むことができる。ヒトｐ５３遺伝子の全てのエクソンにわたるタイリングに効果がある一連のプライマーが、本明細書に提供される。本明細書に提供される突然変異について標的遺伝子を走査する方法に関して、ＰＣＲ法は、片側（片側の標的−特異的プライマー（フォワード又はリバース）及び他の側のユニバーサルプライマー）、又は両側（すなわち、両側の標的特異的プライマー）であることができる。本明細書に提供される実施例４は、ＴＰ５３遺伝子の突然変異を検出するそのような方法の例を例証している。例えば、ＴＰ５３に関して、標的領域は、卵巣癌におけるその突然変異の大半を含む、エクソン５から８内に認めることができる（表４参照）。例証したように、完全タイリングを確実にするために、プライマー標的のカバレッジは、そのプライマー長を除く、様々なリード長さ（例えば５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、又は２００ｂｐ）により試験することができる。表４−８に例示したように、理想的に両鎖を考慮する場合、標的遺伝子の標的領域の１００％カバレッジが存在する。
この実施態様の特定の例において、外側プライマー標的アンプリコンは、範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０及び７５の標的遺伝子と、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、及び１００の標的遺伝子の間の各々の上において、範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の標的領域と、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５の標的領域の間をカバーする重複配列を有する。一つの例証的実施態様において、外側プライマー標的アンプリコンは、２〜５標的遺伝子上の２〜５標的領域をカバーする重複配列を有する。別の例証的実施態様において、外側プライマー標的アンプリコンは、２〜１０標的遺伝子の上の１又は２標的領域をカバーする重複配列を有する。
この実施態様の特定の例において、外側プライマー標的アンプリコン及び内側プライマー標的アンプリコンは、範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０及び７５の標的遺伝子と、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、及び１００の標的遺伝子の間の各々の上において、範囲の下端が１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の標的領域と、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５の標的領域の間をカバーする重複配列を有する。一つの例証的実施態様において、外側プライマー標的アンプリコン及び内側プライマー標的アンプリコンは、２〜５標的遺伝子上の２〜５標的領域をカバーする重複配列を有する。別の例証的実施態様において、外側プライマー標的アンプリコンは、２〜１０標的遺伝子の上の１又は２標的領域をカバーする重複配列を有する。
本明細書に提供される方法の特定の実施態様において、タイリングＰＣＲの方法は、反対方向で両方の鎖において実行される。従って一実施態様において、本方法は、プラス鎖外側プライマー反応混合物を形成し且つそれにプラス鎖増幅条件に供することに加え、マイナス鎖外側プライマー反応混合物を、及び一部の実施態様においてはマイナス鎖内側プライマー反応混合物を形成すること、並びにこの／これらのマイナス鎖反応混合物（複数可）を増幅条件（すなわち、標的核酸断片の増幅）に供し、且つ少なくとも一部のマイナス鎖外側プライマー標的アンプリコンの、及び特定の実施態様においてはマイナス鎖内側プライマー標的アンプリコンの、核酸配列を分析することを更に含む。理解されるように、プラス鎖反応混合物、増幅条件、及び配列分析に関する本明細書の教示は、それらがプラス鎖に正に適用されるように、マイナス鎖に適用される。
本明細書に提供される方法の特定の実施態様において、少なくとも一部及び例証的例において、ネステッドＰＣＲ反応を含む方法のための内側プライマー標的アンプリコンなどのアンプリコンの全配列が、決定される。アンプリコンの配列を決定する方法は、当該技術分野において公知である。当該技術分野において公知である任意のシークエンシング法、例えばサンガーシークエンシングは、かかる配列決定に使用することができる。例証的実施態様において、高スループット次世代シークエンシング技術（本明細書において超並列シークエンシング技術とも称される）であって、例えば非限定的に、ＭＹＳＥＱ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨＩＳＥＱ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ ＣＡ）、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）、ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＩＬＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＧＳ ＦＬＥＸ＋（ＲＯＣＨＥ４５４）において使用されるものは、本明細書に提供される方法により作製されるアンプリコンのシークエンシングに使用することができる。
高スループット遺伝子シークエンサーは、個体由来の特定の試料を同定し、それによりＤＮＡシークエンサーの単回試行において複数の試料の同時分析を可能にするために、バーコードの使用（すなわち、識別可能な核酸配列による試料タグ付け）に適している。ライブラリー調製品（又は他の関心対象の核酸(nucleic)調製品）中のゲノムの所定の領域が配列決定される回数（リードの回数）は、関心対象のゲノム中のその配列のコピーの数（又はｃＤＮＡ含有調製品の場合発現レベル）に比例するであろう。増幅効率におけるバイアスは、かかる定量的決定において考慮することができる。
分析論
本明細書に提供される方法の実行時に、核酸シークエンシングデータは、タイリングされたマルチプレックスＰＣＲにより作出されたアンプリコンについて作製される。本明細書の実施例において例証したように、遺伝子融合を含む突然変異が、標的遺伝子に存在するかどうかを特定の信頼限界内で決定するために、このデータの分析に使用及び／又は適合することができるアルゴリズム設計ツールが、利用可能である。
図１１は、標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法、又は標的特異的タイリングされたプライマーによる両側一工程マルチプレックスＰＣＲ法のいずれかから生じたシークエンシングデータの分析のための、例示的ワークフローを提供する。任意にプラス鎖及びマイナス鎖に関するシークエンシングデータは、Ｆａｓｔｑを用いて分析することができ、且つペアエンドリードを集成することができる。ユニーク識別子は、同じアンプリコンのシークエンシングリードの精度を確認するための品質管理において使用することができる。シークエンシングリードは、研究室内のツールを使用し多重分解され、集成され、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒアライメントソフトウェア、Ｂｗａ ｍｅｍファンクション(BWA、Burrows-Wheeler Alignment Software(Li H.及びDurbin R. (2010) “Fast and accureate long-lead alignment with Burrows-Wheeler Transform” Bioinformatics、電子版[PMID: 20080505]参照)を使用し、ｈｇ１９ゲノムなどの、参照ゲノムに対しマッピングされ得る。
ＱＣ測定基準(metrics)は、分析の品質を向上するために利用することができる。タイリング増幅統計ＱＣは、総リード、マッピングされたリードの数、オン標的にマッピングされたリードの数、及びカウントされたリードの数を分析することにより、実行され得る。非限定的具体例において、参照ヒトゲノムに対し特定数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）もしくはそれ以上のミスマッチを有するリードは、廃棄することができる。更に当該技術分野において公知のように、マッピング品質スコアを利用することができ、且つ特定のカットオフ（例えば、２５、２０（２００の不正確なマッピング中１）、１５、又は１０）未満のマッピング品質スコアを伴うリードは、廃棄することができる。次に、リードデプスを計算し、その統計を計算することができる。
ＱＣ分析を通過するリードは、次に融合を検出する及び／又はＳＮＶを検出するために、図１１に示されるように分析される。図１１に示されるように、異なる分析フローは、その方法が融合又はＳＮＶを検出するためにデータを分析するかどうかに応じて続けることができる。融合検出に関して、Ｂｗａ ｍｅｍモードは、プライマリーアライメントのマッピングされた部分を説明するプライマリーアライメントを有するリードのアライメントとして、補足アライメントを報告する。各プライマリーアライメントについて複数の補足アライメントが存在することができる。プライマリー−補足アライメント対のリンケージマップを構築することにより、そのデータ中の切断点を、発見することができる。切断点は、局所的突然変異により説明されるには互いに非常に遠くに連結された配列として検出することができる。これらは遺伝子融合又はアーチファクトのいずれかであってよい。
特定の例証的実施態様は、ペアエンドリードが集成される前にそれらがマッピングされるペアエンドブリッジ分析を利用する。この分析のために、シークエンシングリードは、ペアエンドモードでマッピングすることができる。シークエンシングリードが、一つの融合遺伝子上にマッピングされることが認められ、且つそのシークエンシングメートが、融合パートナー上に明確にマッピングされる場合、その配列リードは、検出された融合ブリッジの証拠としてカウントされ得る。このブリッジマップは、標的領域について作製され、且つ補足リード分析に類似した様式で報告されることができる。切断点リードに対するブリッジリードのカウントは、最初に一つのバーコードについて比較及び分析することができ、次に全ての試料についてそれらを報告するために、測定基準を構築することができる。こうして、切断点の検出を検証することができる。
融合を検出する分析の一つの具体例において、ＢＷＡが参照ヒトゲノムに対し試料に関するシークエンシングリードをマッピングした後、リードの一部を、ゲノム中の２以上の異なる位置にマッピングすることができる（以下の「補足リード分析」において考察）。これらは、融合コールを最初にシードし、これは真の融合コールであるか、又は偽陽性であってよい。例えばリードは、融合事象の２つの異なる遺伝子へではなく、ゲノムの異なる位置への遺伝子マッピングの２つのホモログにマッピングされてよい。これらの可能性の区別を補助するために、アルゴリズムは、ここで可能性のある融合事象を含む当初の参照ゲノムの改変版である新たな参照配列を作出し、各コールに関するドナー、アクセプター、融合配列鋳型を構築することができる。最初に融合アライメントを示さなかったリードであっても、可能性のある融合事象を含む参照ゲノムの改変版を使用し、再度の分析を通じて試行することができる。最初に融合パートナーに対するアライメントを示さなかった一部のリードは、推定融合配列にマッピングされる場合に、ここでアライメントを示すことができる。試料中の同じ最初の核酸断片（リードの数又は割合として）に由来するかどうかにかかわらず十分な数のリードが特定の融合事象にマッピングされる場合、この融合は報告することができる。例えば、１，０００、２，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、又は２５，０００の核酸断片を有する試料由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、５０、又は１００リードが、同じ最初の核酸断片に由来するかどうかにかかわらず、融合にマッピングされる場合、この融合は報告され得る。
従って本発明は、哺乳動物由来の試料中の遺伝子融合を検出する方法を含み、これは以下の工程を含み：遺伝子融合の部位であることがわかっている標的領域に関して、試料由来の核酸断片についてＰＣＲを実行し、アンプリコンを作製する工程；アンプリコンをシークエンシングし、該核酸断片に関する配列情報を作製する工程；参照ゲノムに対し配列情報を最初にマッピングし、任意の核酸断片が、見かけの遺伝子融合の融合ジャンクション指標と交差するように見えるかどうかを決定する工程；配列情報を、見かけの遺伝子融合を含む融合ゲノムに対し、再マッピングする工程；ここで、カットオフ値を上回る融合ゲノム中の見かけの遺伝子融合に対しマッピングする核酸断片の数は、遺伝子融合の指標である。
ＳＮＶ検出のための分析の一つの具体例において、図１１に示されたフロー略図のＳＮＶ枝に従うことができる。最初にタイリングカウントは、試料中の同じ出発核酸断片から誘導される各シークエンシングリードについての位置で、ＳＮＶが検出される回数実行される。これを促進することを補助するために、増幅反応は、試料由来の核酸断片へのユニーク識別子（ＵＩＤ）のライゲーション後に実行することができる。従って分析は、ＵＩＤ及び断片エンド（“ＵＩＤ”よりも試料中により多くの核酸断片が存在することができるから）を同定し且つカウントすることにより実行することができる。ＳＮＶは、例えば試料由来の所定の核酸についてのリードが特定の割合（５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５、又は９９％）を超える場合に、コールすることができる。これは図１１におけるタイリングカウントプログラムにより表される。非限定的例について、最初の試料由来の所定の核酸断片のリードの１０％がＳＮＶを明らかにする場合、ＳＮＶは、その出発核酸断片のそれについてコールすることができる。
次に、カットオフが同じ位置でのＳＮＶを報告するアンプリコンの絶対数又は絶対割合を超えるかどうかを決定するために、タイリングパイルアップ分析を、所定のアンプリコンについて実行することができる。特定位置に広がる少なくとも特定数又は特定割合のアンプリコンが、その位置でＳＮＶ（カットオフを超える）を報告する場合、ＳＮＶコールがその位置について成される。例えば標的位置に広がる少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アンプリコンがその位置でＳＮＶを報告する場合、ＳＮＶが、その位置についてコールされる。
標的遺伝子
例示的実施態様における本発明の標的遺伝子は、癌−関連遺伝子である。しかし当業者は、本明細書に提供される方法は、任意の他の遺伝子（複数可）上の同様の突然変異を検出するために使用することができることを理解するであろう。癌−関連遺伝子とは、変更された癌リスク又は変更された癌の予後に関連した遺伝子を指す。癌を促進する癌−関連遺伝子の例は、癌遺伝子；細胞の増殖、浸潤又は転移を増強する遺伝子；アポトーシスを阻害する遺伝子；及び血管新生促進遺伝子を含む。癌を阻害する癌−関連遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子；細胞の増殖、浸潤もしくは転移を阻害する遺伝子；アポトーシスを促進する遺伝子；及び抗−血管新生遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。
突然変異検出法の実施態様は、標的となり始める遺伝子の領域の選択から始まる。公知の突然変異点及び融合点を持ち且つ人工的に合成された遺伝子融合の領域は、融合スパイクと称され、遺伝子融合検出方法の開発、並びに診断目的の遺伝子融合のフィンガープリントとして働くように使用される。ゲノム座標に対する融合転写産物（すなわち、転座）のＣＯＳＭＩＣ(Catalog of Somatic Mutations in Cancer、Sanger Institute、www.sanger.ac.ukにおいて)データベースを使用し、エクソン境界を基に各々報告された融合に関する標的領域（すなわち、配列の範囲）を選択することができる。その遺伝子の観察された融合の総数に対し少なくとも１％寄与する融合パートナーが、同定される。
例示的実施態様において、本発明の方法は、以下から選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は全ての融合パートナー遺伝子からの遺伝子融合を検出する：ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１。
本明細書に提供される方法は、遺伝子融合検出に加え、突然変異、特に癌に関連することがわかっている突然変異の事実上あらゆる型を検出するために使用することができる。多型又は突然変異の例は、以下の遺伝子の１又は複数であることができる：ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＮＲＡＳ、ＮＦ２、ＦＢＸＷ７、ＥＲＢＢｓ、ＡＴＡＤ５、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ｐ５３、ＢＲＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＳＥＴＤ２、ＬＲＰ１Ｂ、ＰＢＲＭ、ＳＰＴＡ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＴＲＲＡＰ、ＳＴＡＧ２、ＥＰＨＡ３／５／７、ＰＯＬＥ、ＳＹＮＥ１、Ｃ２０ｏｒｆ８０、ＣＳＭＤ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＩＴ、ＭＵＣ４、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＤＤＸ１１、ＤＤＸ１２、ＤＳＰＰ、ＥＰＰＫ１、ＦＡＭ１８６Ａ、ＧＮＡＳ、ＨＲＮＲ、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＬＬ３、ＮＲＡＳ、ＲＢ１、ＳＭＡＤ４、ＴＴＮ、ＡＢＣＣ９、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＧＡＰ１０、ＡＫＴ１、ＡＭＢＮ、ＡＭＰＤ２、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＡＮＫＲＤ４０、ＡＰＯＢＲ、ＡＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＭＰ２、ＢＲＡＴ１、ＢＴＮＬ８、Ｃ１２ｏｒｆ４、Ｃ１ＱＴＮＦ７、Ｃ２０ｏｒｆ１８６、ＣＡＰＲＩＮ２、ＣＢＷＤ１、ＣＣＤＣ３０、ＣＣＤＣ９３、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２７、ＣＤＣ４２ＢＰＡ、ＣＤＨ９、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＺ１、ＣＬＳＰＮ、ＣＮＴＮ６、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＯＣＣ、ＣＴＳＦ、ＣＹＰ１Ａ２、ＤＣＬＫ１、ＤＨＤＤＳ、ＤＨＸ３２、ＤＫＫ２、ＤＬＥＣ１、ＤＮＡＨ１４、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ９、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＵＳＰ１６、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＥＣＴ２、ＥＦＨＢ、ＲＲＮ３Ｐ２、ＴＲＩＭ４９Ｂ、ＴＵＢＢ８Ｐ５、ＥＰＨＡ７、ＥＲＢＢ３、ＥＲＣＣ６、ＦＡＭ２１Ａ、ＦＡＭ２１Ｃ、ＦＣＧＢＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＧ２、ＦＬＴ１、ＦＯＬＲ２、ＦＲＹＬ、ＦＳＣＢ、ＧＡＢ１、ＧＡＢＲＡ４、ＧＡＢＲＰ、ＧＨ２、ＧＯＬＧＡ６Ｌ１、ＧＰＨＢ５、ＧＰＲ３２、ＧＰＸ５、ＧＴＦ３Ｃ３、ＨＥＣＷ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＲＡＳ、ＨＳ３ＳＴ１、ＨＳ６ＳＴ１、ＨＳＰＤ１、ＩＤＨ１、ＪＡＫ２、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＩＡＡ０５２８、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ３８、ＫＲＴＡＰ２１−１、ＫＲＴＡＰ４−５、ＫＲＴＡＰ４−７、ＫＲＴＡＰ５−４、ＫＲＴＡＰ５−５、ＬＡＭＡ４、ＬＡＴＳ１、ＬＭＦ１、ＬＰＡＲ４、ＬＰＰＲ４、ＬＲＲＦＩＰ１、ＬＵＭ、ＬＹＳＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＯ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＥＧＦ１０、ＭＭＰ１６、ＭＯＲＣ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＴＭＲ３、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ２、ＭＵＣ２０、ＮＢＰＦ１０、ＮＢＰＦ２０、ＮＥＫ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＬＲＰ４、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＫ、ＮＵＰ９３、ＯＢＳＣＮ、ＯＲ１１Ｈ１、ＯＲ２Ｂ１１、ＯＲ２Ｍ４、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ５Ｄ１３、ＯＲ８Ｉ２、ＯＸＳＭ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＦ１、ＰＲＧ４、ＰＲＰＦ１９、ＰＴＨ２、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＪ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ５０、ＲＢＭ１２、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ２２、ＲＯＲ１、ＲＰ１１−６７１Ｍ２２．１、ＲＰ１３−９９６Ｆ３．４、ＲＰ１Ｌ１、ＲＳＢＮ１Ｌ、ＲＹＲ３、ＳＡＭＤ３、ＳＣＮ３Ａ、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＬＣ２５Ａ２、ＳＬＣ４４Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＭＡＤ２、ＳＰＴＡ１、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴＫ１１、ＳＺＴ２、ＴＡＦ１Ｌ、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＴＢＰ、ＴＧＦＢＩ、ＴＩＦ１、ＴＭＥＭ１４Ｂ、ＴＭＥＭ７４、ＴＰＴＥ、ＴＲＡＰＰＣ８、ＴＲＰＳ１、ＴＸＮＤＣ６、ＵＳＰ３２、ＵＴＰ２０、ＶＡＳＮ、ＶＰＳ７２、ＷＡＳＨ３Ｐ、ＷＷＴＲ１、ＸＰＯ１、ＺＦＨＸ４、ＺＭＩＺ１、ＺＮＦ１６７、ＺＮＦ４３６、ＺＮＦ４９２、ＺＮＦ５９８、ＺＲＳＲ２、ＡＢＬ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲ、ＡＸＬ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＬＭ、ＢＲＩＰ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ１、ＣＩＣ、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ１、ＤＡＸＸ、ＤＤＲ２、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＭＳＹ（Ｃ１１ｏｒｆ３０）、ＥＰ３００、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＭ１２３Ｂ（ＷＴＸ）、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＬ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＩＤ４（Ｃ１７ｏｒｆ３９）、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＳＫ３Ｂ、ＨＧＦ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ７Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ（ＭＹＳＴ３）、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ６、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＰＬ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＸ２−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤＫ１、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＤ５１、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＮＦ４３、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＴＡＴ４、ＳＵＦＵ、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＩＳＰ３、ＷＴ１、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ７０３、及びそれらの組合せ。
増幅（例えばＰＣＲ）反応混合物：
特定の実施態様において、本発明の方法は、増幅反応混合物を形成することを含む。この反応混合物は典型的には、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及びプラス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを配合することにより、形成される。別の例証的実施態様は、フォワード標的−特異的外側プライマーの代わりにフォワード標的−特異的内側プライマー、及び核酸ライブラリー由来の核酸断片の代わりに、外側プライマーを使用する第一ＰＣＲ反応からのアンプリコンを含む反応混合物である。本明細書に提供される反応混合物はそれら自身、例証的実施態様において、本発明の個別の態様において形成される。例証的実施態様において、反応混合物は、ＰＣＲ反応混合物である。ＰＣＲ反応混合物は典型的には、マグネシウムを含む。
一部の実施態様において、この反応混合物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マグネシウム、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、又はそれらの任意の組合せを含む。一部の実施態様において、ＴＭＡＣの濃度は、両端を含んで２０〜７０ｍＭである。いずれか特定の理論に結びつけられることを意味するものではないが、ＴＭＡＣは、ＤＮＡに結合し、二重鎖を安定化し、プライマー特異性を増大し、及び／又は様々なプライマーの融解温度を平均化すると考えられる。一部の実施態様において、ＴＭＡＣは、異なる標的に関する増幅産物の量の均一性を増大する。一部の実施態様において、マグネシウム（塩化マグネシウム由来のマグネシウムなど）の濃度は、１〜８ｍＭである。
多数の標的のマルチプレックスＰＣＲに使用される多数のプライマーは、多量のマグネシウムをキレートする（プライマー中２リン酸は１マグネシウムをキレートする）ことができる。例えば、プライマー由来のリン酸の濃度が〜９ｍＭであるように、十分なプライマーが使用される場合、これらのプライマーは、有効マグネシウム濃度を〜４．５ｍＭ低下することができる。一部の実施態様において、ＥＤＴＡは、ポリメラーゼの補因子として利用可能なマグネシウムの量を減少するために使用され、その理由は高いマグネシウム濃度は、非標的遺伝子座の増幅などのＰＣＲエラーを生じ得るからである。一部の実施態様において、ＥＤＴＡの濃度は、利用可能なマグネシウムの量を、１〜５ｍＭ（３〜５ｍＭなど）に減少する。
一部の実施態様において、そのｐＨは、両端を含んで７．５〜８．５、例えば７．５〜８．８及び８．３、又は８．３〜８．５などである。一部の実施態様において、トリスが、例えば両端を含んで１０〜１００ｍＭの濃度、例えば１０〜２５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、５０〜７５ｍＭ、又は２５〜７５ｍＭで使用される。一部の実施態様において、これらのトリス濃度のいずれも、ｐＨ７．５〜８．５で使用される。一部の実施態様において、ＫＣｌと（ＮＨ4）2ＳＯ4の組合せが、両端を含んで５０〜１５０ｍＭ ＫＣｌ及び１０〜９０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4などで使用される。一部の実施態様において、ＫＣｌの濃度は、両端を含んで０〜３０ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、又は１００〜１５０ｍＭである。一部の実施態様において、（ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度は、両端を含んで１０〜５０ｍＭ、５０〜９０ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、２０〜４０ｍＭ、４０ｍＭ〜６０、又は６０ｍＭ〜８０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4である。一部の実施態様において、アンモニウム［ＮＨ4 +］濃度は、両端を含んで０〜１６０ｍＭ、例えば０〜５０、５０〜１００、又は１００〜１６０ｍＭである。一部の実施態様において、カリウム及びアンモニウム濃度の合計（［Ｋ+］＋［ＮＨ4 +］）は、両端を含んで０〜１６０ｍＭ、例えば０〜２５、２５〜５０、５０〜１５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、又は１２５〜１６０ｍＭである。［Ｋ+］＋［ＮＨ4 +］＝１２０ｍＭである例示的緩衝液は、２０ｍＭ ＫＣｌ及び５０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4である。一部の実施態様において、この緩衝液は、両端を含んで２５〜７５ｍＭトリス、ｐＨ７．２〜８．０、５０ｍＭ ＫＣＬ、１０〜８０ｍＭ硫酸アンモニウム、及び３〜６ｍＭマグネシウムを含む。一部の実施態様において、この緩衝液は、両端を含んで２５〜７５ｍＭトリス、ｐＨ７〜８．５、３〜６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０〜５０ｍＭ ＫＣｌ、及び２０〜８０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4を含む。一部の実施態様において、１００〜２００単位／ｍＬのポリメラーゼが使用される。一部の実施態様において、ｐＨ８．１の最終容積２０ｕｌ中で、１００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、７．５ｎＭのライブラリー中の各プライマー、５０ｍＭ ＴＭＡＣ、及び７ｕｌのＤＮＡ鋳型が使用される。
一部の実施態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えばＰＥＧ８，０００）又はグリセロールなどの、クラウディング剤が使用される。一部の実施態様において、ＰＥＧ（ＰＥＧ８，０００など）の量は、両端を含んで０．１〜２０％、例えば０．５〜１５％、１〜１０％、２〜８％、又は４〜８％である。一部の実施態様において、グリセロールの量は、両端を含んで０．１〜２０％、例えば０．５〜１５％、１〜１０％、２〜８％、又は４〜８％である。一部の実施態様において、クラウディング剤は、低ポリメラーゼ濃度及び／又はより短いアニーリング時間のいずれかの使用を可能にする。一部の実施態様において、クラウディング剤は、ＤＯＲの均一性を改善し、及び／又はドロップアウト（検出されないアレル）を減少する。
ポリメラーゼ
一部の実施態様において、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼ、プルーフリーディング活性を持たない（又は無視できる）ポリメラーゼ、又はプルーフリーディング活性を持つポリメラーゼとプルーフリーディング活性を持たない（又は無視できる）ポリメラーゼの混合物が、使用される。一部の実施態様において、ホットスタートポリメラーゼ、非−ホットスタートポリメラーゼ、又はホットスタートポリメラーゼと非−ホットスタートポリメラーゼの混合物が使用される。一部の実施態様において、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが使用される（例えば、ＱＩＡＧＥＮカタログ番号２０３２０３参照）。一部の実施態様において、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが使用される。一部の実施態様において、反応混合物中に過剰な鋳型が存在する場合、及び長い生成物を増幅する場合に、効率的ＰＣＲ増幅を提供する高忠実度ポリメラーゼである、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼが、使用される（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、マウンテンビュー、ＣＡ）。一部の実施態様において、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又はＫＡＰＡ ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼが使用され；これらは、好熱性細菌サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のシングルサブユニット、野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを基にしている。ＫＡＰＡ Ｔａｑ及びＫＡＰＡ ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’ポリメラーゼ活性及び５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）は有さない（例えば、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳカタログ番号ＢＫ１０００参照）。一部の実施態様において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが使用され；これは、超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の高度に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、５’→３’方向のヌクレオチドの二重鎖ＤＮＡへの鋳型−依存型重合を触媒する。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼはまた、このポリメラーゼのヌクレオチド組込みエラーを補正することができる、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）も示す。これは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は有さない（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＥＰ０５０１参照）。一部の実施態様において、Ｋｌｅｎｔａｑ１が使用され；これは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片アナログであり、エキソヌクレアーゼ活性又はエンドヌクレアーゼ活性を有さない（例えば、ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号１００）。一部の実施態様において、ポリメラーゼは、ＰＵＳＨＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼであり、例えばＰＨＵＳＩＯＮ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）又はＰＨＵＳＩＯＮホットスタートＦｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３５Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）などである。一部の実施態様において、ポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであり、例えばＱ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）又はＱ５（登録商標）ホットスタート高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）などである。一部の実施態様において、ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）である。
一部の実施態様において、ポリメラーゼ５〜６００単位／ｍＬ（反応容積１ｍＬ当たりの単位）、両端を含んで５〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、又は５００〜６００単位／ｍＬが使用される。
ＰＣＲ法
一部の実施態様において、ＰＣＲサーモサイクリングの前の重合を減少又は防ぐために、ホットスタートＰＣＲが使用される。ホットスタートＰＣＲ法の例は、ＤＮＡポリメラーゼの初期阻害、又は反応混合物が高温に達するまでの、反応成分の物理的分離を含む。一部の実施態様において、マグネシウムの緩徐な放出が使用される。ＤＮＡポリメラーゼは、活性のためにマグネシウムイオンを必要とし、そのためマグネシウムは、化学化合物への結合により、反応から化学的に分離され、且つ高温でのみ、溶液へ放出される。一部の実施態様において、インヒビターの非共有結合が使用される。この方法において、ペプチド、抗体、又はアプタマーは、低温で酵素に非共有的結合し、且つその活性を阻害する。上昇した温度でのインキュベーション後、このインヒビターは放出され、且つ反応が始まる。一部の実施態様において、低温ではほとんど活性がない修飾型ＤＮＡポリメラーゼなどの、低温−感受性Ｔａｑポリメラーゼが使用される。一部の実施態様において、化学修飾が使用される。この方法において、分子は、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位において、アミノ酸の側鎖へ共有結合される。この分子は、反応混合物の上昇した温度でのインキュベーションにより、酵素から放出される。一旦分子が放出されると、この酵素は活性化される。
一部の実施態様において、鋳型核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ試料など）に対する量は、両端を含んで、２０〜５，０００ｎｇ、例えば２０〜２００、２００〜４００、４００〜６００、６００〜１，０００；１，０００〜１，５００；又は、２，０００〜３，０００ｎｇである。
一部の実施態様において、ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスＰＣＲキットが使用される（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号２０６１４３）。１００×５０μｌマルチプレックスＰＣＲ反応に関して、このキットは、２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（最終濃度３ｍＭ ＭｇＣｌ2、３×０．８５ｍｌを提供する）、５×Ｑ−溶液（１×２．０ｍｌ）、及びＲＮａｓｅ非含有水（２×１．７ｍｌ）を含む。ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（ＭＭ）は、ＫＣｌと（ＮＨ4）2ＳＯ4の組合せ、並びにＰＣＲ添加物、鋳型でのプライマー濃度を局所的に上昇するＭＰ因子を含む。ＭＰ因子は、特異的に結合したプライマーを安定化し、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる効率的プライマー伸長を可能にする。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの修飾型であり、外界温度ではポリメラーゼ活性を有さない。一部の実施態様において、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、９５℃で１５分間のインキュベーションにより活性化され、これは任意の現存するサーマル−サイクラープログラムに組込むことができる。
一部の実施態様において、最終容積２０ｕｌ中で、１×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度（推奨濃度）、ライブラリー中の各プライマー７．５ｎＭ、ＴＭＡＣ ５０ｍＭ、及びＤＮＡ鋳型７ｕｌが使用される。一部の実施態様において、ＰＣＲサーモサイクリング条件は、９５℃で１０分（ホットスタート）；９６℃で３０秒；６５℃で１５分；及び、７２℃で３０秒の２０サイクル；それに続く、７２℃で２分（最終伸長）；並びに、次に４℃での保持である。
一部の実施態様において、総容積２０ｕｌ中で、２×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度（推奨濃度の２倍）、ライブラリー中の各プライマー２ｎＭ、ＴＭＡＣ ７０ｍＭ、及びＤＮＡ鋳型７ｕｌが使用される。一部の実施態様において、最大４ｍＭ ＥＤＴＡも含まれる。一部の実施態様において、ＰＣＲサーモサイクリング条件は、９５℃で１０分（ホットスタート）；９６℃で３０秒；６５℃で２０、２５、３０、４５、６０、１２０、又は１８０分；及び、任意に７２℃で３０秒の２５サイクル；それに続く、７２℃で２分（最終伸長）；並びに、次に４℃での保持である。
別の条件の例示的セットは、セミネステッドＰＣＲアプローチを含む。最初のＰＣＲ反応は、２×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度、ライブラリー中の各プライマー（外側フォワード及びリバースプライマー）１．８７５ｎＭ、及びＤＮＡ鋳型を含む反応容積２０ｕｌを使用する。サーモサイクリングパラメータは、９５℃で１０分；９６℃で３０秒、６５℃で１分、５８℃で６分、６０℃で８分、６５℃で４分、及び７２℃で３０秒の２５サイクル；並びに、次に７２℃で２分、並びに次に４℃での保持である。次に、得られた生成物２ｕｌを、１：２００で希釈し、第二のＰＣＲ反応に投入する。この反応は、１×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度、各内側フォワードプライマー２０ｎＭ、及びリバースプライマータグ１ｕＭを含む反応容積１０ｕｌを使用する。サーモサイクリングパラメータは、９５℃で１０分；９５℃で３０秒、６５℃で１分、６０℃で５分、６５℃で５分、及び７２℃で３０秒の１５サイクル；並びに、次に７２℃で２分、及び次に４℃での保持を含む。アニーリング温度は、本明細書に考察したように、任意に、プライマーの一部又は全ての融解温度よりも高いことができる（２０１５年１０月２０日に出願された米国特許出願第１４／９１８，５４４号を参照し、これはその全体が引用により本明細書中に組み込まれている）。
融解温度（Ｔm）とは、オリゴヌクレオチド（プライマーなど）及びその完全な相補体のＤＮＡ二重鎖の１／２（５０％）が、解離し且つ一本鎖ＤＮＡとなる温度である。アニーリング温度（ＴA）は、ＰＣＲプロトコールが試行される温度である。先行する方法に関して、これは通常使用されるプライマーの最低Ｔmを５℃下回り、従って全ての可能性のある二重鎖が形成される（その結果本質的に全てのプライマー分子が鋳型核酸に結合する）温度に近い。これは高度に効率的であるが、より低い温度では、より特異的でない反応結合が起こる。低すぎるＴAを有する結果の一つとしては、内部一塩基ミスマッチ又は部分的アニーリングが容認され得るので、プライマーは、真の標的以外の配列にアニーリングすることがあるということである。本発明の一部の実施態様において、ＴAは、（Ｔm）よりも高く、ここでは所定の時点で、標的の一部分のみがアニーリングされたプライマーを有する（わずかに〜１−５％など）。これらが伸長される場合、これらは、アニーリングの平衡から除去され、プライマーと標的が解離し（伸長は、７０℃を上回るまで迅速にＴmを上昇するので）、標的の新規の〜１−５％は、プライマーを有する。従って、アニーリングのための長い反応時間をもたらすことにより、１サイクル当たりのコピーされた標的の〜１００％を得ることができる。
様々な実施態様において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５、又は１００％の融解温度（例えば、実験的に測定した又は計算したＴm）よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３℃と、範囲の上端が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１５℃の間より高い。様々な実施態様において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５；５０；７５；１００；３００；５００；７５０；１，０００；２，０００；５，０００；７，５００；１０，０００；１５，０００；１９，０００；２０，０００；２５，０００；２７，０００；２８，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；又は全ての融解温度（例えば、実験的に測定した又は計算したＴm）よりも、１〜１５℃（両端を含んで、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２、又は１２〜１５℃）の間より高い。様々な実施態様において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％又は全ての融解温度（例えば、実験的に測定した又は計算したＴm）よりも、１〜１５℃（例えば、両端を含んで１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、３〜８、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２、又は１２〜１５℃など）より高く、且つアニーリング工程の長さ（１サイクルのＰＣＲにつき）は、両端を含んで５〜１８０分、例えば１５〜１２０分、１５〜６０分、１５〜４５分、又は２０〜６０分である。
本明細書で考察したように、例証的実施態様における本発明の方法は、タイリングされたプライマー（すなわち標的遺伝子の標的領域上の一連のタイリングされたプライマー結合部位に結合するプライマー）を使用する、片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法である。かかる方法において、その断片末端にアダプターを有する、標的ＤＮＡ（例えば、ｃｔＤＮＡから作製される核酸ライブラリー由来の核酸断片）を、使用することができる。特異的標的増幅（“ＳＴＡ”）は、ネステッドフォワードプライマーの多重セットにより、ユニバーサルリバースプライマーのための結合部位としてライゲーションアダプタータグを使用して、実行することができる。第二のＳＴＡは次に、第一のＰＣＲ反応のために使用されるユニバーサルプライマーよりも、同じ又は異なることができる、ネステッドフォワードプライマー及びユニバーサルリバースプライマーのセットを使用して実行することができる。
当業者は、一連のタイリングされたプライマーを含む例証的実施態様により、本発明の方法を実行するために、他の増幅（例えばＰＣＲ）変形を使用することができることを認めるであろう。例えば、ＰＣＲ変形は、以下を含むことができる：
セミネステッドＰＣＲ：ＳＴＡ １後、内側ネステッドフォワードプライマー及び１種（又は数種）のタグ−特異的リバースプライマーの多重セットを含む、第二のＳＴＡを実行することができる。
完全ネステッドＰＣＲ：ＳＴＡ工程１の後、タグ（Ａ、ａ、Ｂ、ｂ）を保有する２つのネステッドプライマーによる第二のマルチプレックスＰＣＲ（又は複雑度の低下した並行マルチプレックスＰＣＲ）を実行することが可能である。
ヘミ−ネステッドＰＣＲ：断片末端にアダプターを有する標的ＤＮＡを使用することが、可能である。フォワードプライマー（Ｂ）と１種（又は数種）のタグ−特異的リバースプライマー（Ａ）の多重セットを含むＳＴＡが、実行される。第二のＳＴＡは、ユニバーサルタグ−特異的フォワードプライマー及び標的特異的リバースプライマーを使用し、実行することができる。
三重ヘミ−ネステッドＰＣＲ：断片末端にアダプターを有する標的ＤＮＡを使用することが、可能である。フォワードプライマー（Ｂ）と１種（又は数種）のタグ−特異的リバースプライマー（Ａ）及び（ａ）の多重セットを含むＳＴＡを、実行することができる。第二のＳＴＡは、ユニバーサルタグ−特異的フォワードプライマー及び標的特異的リバースプライマーを使用し、実行することができる。
片側ＰＣＲ：断片末端にアダプターを有する標的ＤＮＡを使用することが、可能である。ＳＴＡは、フォワードプライマーと１種（又は数種）のタグ−特異的リバースプライマーの多重セットにより実行されてよい。
リバースセミネステッドＰＣＲ：断片末端にアダプターを有する標的ＤＮＡを使用することが、可能である。ＳＴＡは、フォワードプライマーと１種（又は数種）のタグ−特異的リバースプライマーの多重セットにより実行されてよい。
同じく、プライマーの３セットが使用される二重ネステッドＰＣＲなどの、前述の方法の単純な反復又は組合せであるより多くの変形も存在する。別の変形は、片側半(one-and-a-half)ネステッドミニＰＣＲであり、ここでは、ＳＴＡは同じくネステッドフォワードプライマーと１種（又は数種）のタグ−特異的リバースプライマーの多重セットにより実行されてよい。
これらの変形の全てにおいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーのアイデンティティは互換され得ることに注意。一部の実施態様において、ネステッド変形は、アダプタータグの付属を含む最初のライブラリー調製、及びユニバーサル増幅工程を伴わずに、同等に良好に試行することができることに注意。一部の実施態様において、追加のフォワード及び／又はリバースプライマー並びに増幅工程を持つ、ＰＣＲの追加ラウンドが含まれてよく；これらの追加工程は、循環腫瘍ＤＮＡ由来の標的遺伝子の標的領域に対応するＤＮＡ分子の割合の更なる増加が望ましい場合に、特に有用であることに注意。
マルチプレックスＰＣＲ法の例
本明細書に提供されるタイリングＰＣＲ法は、マルチプレックスＰＣＲ法である。従って一態様において、本発明は、核酸ライブラリー由来の核酸断片の試料中の標的遺伝子の標的領域のセグメントと重複する標的を増幅する方法を特徴とする。この方法は以下を含むことができる：（ｉ）核酸試料を、５０、１００、２５０、５００、１，０００；２，０００；５，０００；７，５００；１０，０００；１５，０００；１９，０００；２０，０００；２５，０００；２７，０００；２８，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；及び７５，０００のプライマー結合部位（例えば内側又は外側プライマー結合部位）と、１００、２５０、５００、１，０００；２，０００；５，０００；７，５００；１０，０００；１５，０００；１９，０００；２０，０００；２５，０００；２７，０００；２８，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；７５，０００及び１００，０００のプライマー結合部位の間で、同時にハイブリダイズするプライマーライブラリーと接触させる工程であって、ここでプライマー結合部位は、典型的にはタイリングされた一連のプライマー結合部位であること。本明細書において考察したように、プライマー結合部位の群は、典型的には、プライマーを使用する増幅反応の平均アンプリコンサイズと等しいか又はこれ未満であることができる距離だけ、標的遺伝子（複数可）の標的領域（複数可）上で隔てられている。一部の実施態様において、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、又は１００％は、少なくとも５、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００、又は４００−倍増幅される。様々な実施態様において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、又は０．０５％未満は、プライマー二量体である。一部の実施態様において、本方法は、標的遺伝子（複数可）における遺伝子融合などの突然変異を決定するための、マルチプレックスＰＣＲとそれに続く多重アンプリコンのシークエンシング（ハイスループットシークエンシングなど）に関与している。
様々な実施態様において、長いアニーリング時間（本明細書に考察し実施例１２に例示）及び／又は低プライマー濃度が使用される。様々な実施態様において、アニーリング工程の長さは、範囲の下端が１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は６０分間と、範囲の上端が２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、１２０、又は１８０分間の間である。様々な実施態様において、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲ１サイクルにつき）の長さは、３０〜１８０分間である。例えばアニーリング工程は、３０〜６０分間であることができ、且つ各プライマーの濃度は、２０、１５、１０、又は５ｎＭ未満であることができる。
高レベルの多重化で、溶液は、溶液中の大量のプライマーのために、粘性となり始める。溶液が粘性でありすぎる場合、プライマー濃度を、プライマーが鋳型ＤＮＡに結合するのに依然十分である量まで低下することができる。様々な実施態様において、１，０００〜１００，０００の異なるプライマーを使用し、且つ各プライマーの濃度は、２０ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、両端を含んで１〜１０ｎＭである。
下記実施例は、当業者に、いかに本明細書に提供される実施態様を使用するかの完全な開示及び説明を提供するために示され、開示の範囲を限定することを意図せず、また下記実施例が実行された全て又は唯一の実験であることを表すことも意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするよう努力するが、若干の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別に記載しない限りは、部は容積部であり、温度は摂氏である。実施例が例証することを意味する基本的態様を変更しない限り、記載された方法の変形が成され得ることは理解されるベきである。
実施例
実施例1：タイリング分析のための融合遺伝子切断点の同定
本発明の方法、特に片側ネステッドＰＣＲ反応を使用し遺伝子融合を検出する方法で使用するための一連のタイリングされたプライマーが、どのように設計され且つ選択され得るかの例を、ここで提供する。遺伝子融合の検出のためのタイリングされたプライマーのデザインは、ゲノム座標へのＣＯＳＭＩＣ融合転写産物（すなわち転座）のマッピングにより始まる。しかし再編成は主にイントロン性である（及び転写産物がスプライシングされる）ために、転写レベル情報の使用は、切断点位置の不確実性を誘導することがわかった。その結果として、エクソン境界を基に各々報告された融合の配列の範囲をカバーすることが必要であった。分子署名の同定は、遺伝子融合の同定のための癌検出パネルの開発を補助することができ、且つ肺癌以外にも他の癌及び疾患、例えばＡＬＫ造血及びリンパ系組織、甲状腺癌におけるＲＥＴまで適用することができる。
評価された標的遺伝子は、いくつかの融合パートナーを有することがわかっている。しかし、標的切断点の遺伝子発現は一貫しており、その理由はこの融合産物は、機能獲得型事象であり、そのため標的遺伝子における切断点の整合性は、タイリング戦略に組み込まれるために使用された。例えば標的化されたプライマーは、標的遺伝子のみのゲノムＤＮＡに対し設計された。これは、複数の融合パートナー、並びに融合切断点はパートナー遺伝子についてより大きいという知見をうまく考慮している。これは、３種の標的：ＡＬＫ、ＲＯＳ１及びＲＥＴに関して、＜３．６ｋｂの配列のタイリングを必要とするであろう。
あるいは、標的遺伝子及びパートナー遺伝子の両方は同じく、実質的に必要とされたタイリングを増加するよう標的化された（表１参照）。表１は、標的遺伝子及びそれらの共通パートナー遺伝子（頻度＞１％）に関する切断点のまとめであり、且つ報告された融合事象を捕獲するために使用されるタイリング必要要件をまとめている。表１のゲノム座標を使用し、転座アッセイのためのタイリング座標を規定した。
Figure 2019526230
ＣＯＳＭＩＣにおける遺伝子の報告された融合転写産物（例えば、ＡＬＫに関する稀パートナーの長いテイルが存在する）に対し１％より多くをもたらす３種の標的遺伝子の各々、及び全てのパートナー遺伝子に関するドメイン切断点は、表２に示したように決定した。ゲノム座標は、ヒトＧＲＣｈ３７に由来した。
Figure 2019526230
ＣＯＳＭＩＣ融合は、ＲＮＡ転写産物のレベルで注釈され；結果的に、基礎となるゲノム融合切断点は、ほとんどの場合不明である。結果的に、転写産物情報をもたらした切断点の範囲が、推定された。ＣＯＳＭＩＣｖ７０融合データベースの分析は、５４，２９０の記録された融合を同定した。融合事象はフィルタリングされ、その結果、ｉ）類推された転写レベル融合座標により、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物注釈に関して注釈された融合（１５，４４０パスした）、ｉｉ）１つ及びただ一つのパートナーに関与した融合（５４，０６３パスした）、ｉｉｉ）新規配列の挿入を含まない融合（５４，２３６パスした）、並びにｉｖ）肺−癌特異的試料に適用された制限なし。フィルタリング後、１５，１８２の融合が残った。
次に、各標的遺伝子について、その遺伝子に関して観察された融合の総数に対し少なくとも１％をもたらすパートナーを同定した。次に各融合パートナーに関して、標的とそのパートナーの間の融合からの切断点の最大ゲノム範囲を、その遺伝子のエクソン座標を用いて記録した。鎖（プラス又はマイナス）を説明することも行った考慮したことは注記される。ＣＯＳＭＩＣにおいて報告された転写産物座標がＥｎｓｅｍｂｌ座標とマッチしなかった場合は、その不整合性を注記し、且つその転写産物に関する範囲は報告しなかった。
フィルタリング基準の結果として１２２の報告されたＲＯＳ１融合の９０％は、フィルターに失敗した（主に整合性のない転写産物ラベリングから生じた）。ＣＤ７４は、最も保有されているパートナーとして同定された。フィルタリングは、ＳＣＬ３４Ａ２、ＥＺＲ、及びＧＯＰＣを除去した。更なるフィルタリングの精緻化により、追加の転写産物を回復することは、可能である。
実施例２Ａ：合成融合標準の開発
遺伝子融合スパイクのデザイン
本明細書において使用される融合スパイクは、人工的に合成された遺伝子融合、例えばＣＤ７４：Ｒｏｓ１、ＮＭＰ１：Ａｌｋ１（×２）及びＴＰＭ４：Ａｌｋ１などを指す。最初の遺伝子は、パートナー（例えば、ＣＤ７４、ＮＭＰ１及びＴＰＭ４）であり、後者は標的（Ｒｏｓ１、ＡＬＫ１（２セット）及びＡｌｋ１）である。これらの融合スパイクは、長さ１６０ｂｐを選択する、ｃｆＤＮＡの平均長に対応するように、設計された。このデザインは、図１に例示されたような、１６０融合スパイク“標的”を超えてタイリングされた９種のプライマーの使用をもたらした。
融合スパイクは、本明細書に使用されるように、‘ジャンクション’を隔てるように、設計され、２つの融合パートナー間の融合切断点を指すことができる。例証するために、以下の例を考慮し、ここには配列｛ａ＿ｉ｝及び｛ｂ＿ｉ｝を構成された２つの遺伝子Ａ及びＢが存在し、融合はこれら２つの遺伝子間で起こる。融合スパイクを作製するために、本発明者らは、最初に各遺伝子の切断点の位置を確定し、次にスパイクＳを構築した：
Ｓ＝ａ＿｛ｉ−ｍ｝，．．．，ａ＿ｉ，ｂ＿ｊ，．．．，ｂ｛ｊ＋ｎ｝
式中、Ｓの総長は１６０塩基である。次に遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂの異なる割合を、このスパイクにおいて表すように、ｍ及びｎの値を特定した。この明らかにされた方法は、ほぼ平均長約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０ｂｐ、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、及び少なくとも約１６０ｂｐで通常断片化される試料物質としてＤＮＡに頼るので、血液中の融合を検出することができる。
実施例２Ｂ：合成融合標準の開発
合成融合スパイクのデザインを、遺伝子融合プロファイルの検出を可能にするシステムを開発するために行った。遺伝子融合プロファイルの同定は、融合されたゲノムＤＮＡのシークエンシング後の、再編成のために、融合されたゲノム配列を同定することを補助することができる。ゲノム配列（遺伝子融合を有することが疑われる）を使用し、各々長さ１６０ｂｐである、タイリングされた融合スパイクとして切断点を含む各標的配列にわたりタイリングされた、タイリングされたプライマー鋳型合成オリゴヌクレオチドを構築した。図１は、融合スパイクを構築するためのこれらの合成オリゴヌクレオチドのタイリングを図示している。
公開された転座のゲノム配列に関する文献の検証を、遺伝子融合産物を同定するために、行った。これは、遺伝子融合を含む６つの領域（５つのＡＬＫ、１つのＲＯＳ）の選択を生じ、それに続けてコンピュータによるバイオインフォマティクスにより、これらの結果を一元化するために、対応するゲノム位置を同定した。
６つの融合領域の各々のゲノム位置の同定後に、長さ１６０ｂｐの二本鎖合成オリゴヌクレオチド融合スパイクを、８塩基間隔で融合切断点にわたるスパイクのタイリングにより、融合切断点の各々にわたり設計した。遺伝子Ａの１５２塩基及び遺伝子Ｂの８塩基で開始したタイリングの範囲は、図２−３に示したように、遺伝子Ａの８塩基及び遺伝子Ｂの１５２塩基で終わった。
表３Ａ及び３Ｂは、選択された領域の合成により設計された遺伝子融合スパイクを提供する。行の見出しは、以下である：表３Ａ：配列番号（配列リストの配列に対応）；ＩＤ（報告された再編成の一次ソース参照）；及び、配列（スパイクデザインについて均一な長さに水増しされた報告されたゲノム配列）。表３Ａの配列リストヌクレオチド記号は、特定の配列が遺伝子エクソン領域に認められる場合には大文字であり、遺伝子イントロン領域に認められる場合には、小文字である。表３Ｂ：遺伝子１（融合に関与した第一の遺伝子のＨＵＧＯ遺伝子名）；遺伝子２（融合に関与した第二遺伝子のＨＵＧＯ遺伝子名）；配列番号；ｇ１（報告された配列内の第一遺伝子に対応するゲノム座標）／ｇ２（報告された配列内の第二遺伝子に対応するゲノム座標）；スタート−ｃＳｔａｒｔ１／ｃＳｔａｒｔ２（“ｃＳｔａｒｔ１”−報告された配列内の第一遺伝子に対応するスタート座標、“ｃＳｔａｒｔ２”−報告された配列内の第二遺伝子に対応するスタート座標）；エンド−ｃＥｎｄ１／ｃＥｎｄ２（“ｃＥｎｄ１”−報告された配列内の第一遺伝子に対応するエンド座標、“ｃＥｎｄ２”−報告された配列内の第二遺伝子に対応するエンド座標）；鎖−Ｓｔｒａｎｄ１／Ｓｔｒａｎｄ２１（参照配列に対する鎖（マイナスは、リバース相補鎖を示す）；ギャップ（ｃＥｎｄ１とｃＳｔａｒｔ２の間の距離（値＞０は、新規配列を示し、値＜０は、マイクロホモロジーを示す）；同一性−Ｉｄｅｎｔｉｔｙ１／Ｉｄｅｎｔｉｙ２（ヒト参照に対しマッピングした場合の、同一性の割合）；生じる転写産物（生じる転座は、発癌活性のある転写産物を生じたかどうかの予測（両型は、バランスのとれた転座に認められる））；プラス（プラス鎖プライマーデザインは、転座を捕獲するかどうかの予測（片側デザインは鎖特異的であるので意味がある））。
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実施例３：本明細書に提供されるタイリング方法のためのプライマー選択に関する例証的規則及び戦略
プライマーデザイン
以下は、標的遺伝子（すなわち、関心対象の遺伝子）の標的領域に広がるタイリングされた一連のプライマー結合部位に結合するプライマーを使用する、片側ネステッドＰＣＲアプローチにおいて使用するためのプライマーを選択するための一つのアプローチの詳細な例である。プライマーは、５８℃〜６１℃の最適融解温度（Ｔｍ）を持つ、標的遺伝子領域のプラス鎖及びマイナス鎖について設計した（図４−６）。弛緩型（ｄｅｌｔａＧ−６）対緊張型（ｄｅｌｔａＧ−３）の両方のプライマーセットを設計した。弛緩型セットは、プライマーでカバーされたより広いウインドウを有したが、同じくプライマー−二量体を生じた有害な可能性のあるプライマーを含み得る。プライマーは、外側プライマー上にタグを付けずに、及び内側プライマー上にタグＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号：２９７）を付けて、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）から注文調達した。
プライマーデザインは、Ｐｒｉｍｅｒ３により作製した(Untergrasser A、Cutcutache I、Koressaar T、Ye J、Faircloth BC、Remm M、Rozen SG (2012) “Primer3 - new capabilities and interfaces.” Nucleic Acids Research 40(15):e115、及びKoressaar T、Remm M(2007) “Enhancements and modifications of primer design program Primer3.”、Bioinformatics 23(10):1289-91)（ソースコードはprimer3.sourceforge.netで入手可能）。プライマー特異性は、ＢＬＡＳＴにより評価し、且つ現存するプライマーデザイン情報ルート基準に加えた：
１．プラス（＋）鎖プライマーは、選択された標的領域について作製した。標的領域配列は、２０〜５０ｂｐ毎のウインドウにおいて標的化した。各プライマーデザインウインドウは、ウインドウ開始点から、長さ２０〜４０ｂｐであった。プライマーは、対のあるネステッド外側プライマー及び内側プライマーに関して、２つの連続したウインドウで検索した。Ｐｒｉｍｅｒ３を使用し、各領域の最も右側の５’（又はマイナス鎖上最も左側）座標を標的化する外側プライマーを設計した。ウインドウに関する論理的根拠は、内側プライマーは、第二ウインドウ毎に選択され、且つマッチする外側プライマー（下記の規則に従う）は、更に遠くではなく同じ又は先行する（３’側）ウインドウのいずれかから選択されるであろう。プライマーは、ＲｕｎＰｒｉｍｅｒ３．ｊａｖａを用いてｏｎｅ＿ｓｉｄｅｄ＝ｔｒｕｅオプションで作製した。プログラムのこのモードは、対のあるマイナスプライマーを作製せずに、プライマーのただ一つのセットを作製する。
２．プライマー特異性は、ｎｃｂｉ−ｂｌａｓｔ−２．２．２９＋パッケージからのＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて決定した。タスクオプション“ｂｌａｓｔｎ−ｓｈｏｒｔ”を、ｈｇ１９ヒトゲノムに対するプライマーのマッピングに使用した。プライマーが、このゲノムに対し１００未満のヒットを有し、且つトップヒットが、そのゲノムの標的相補性プライマー結合領域であり、及び他のヒットよりも少なくとも２スコアより高い（スコアはＢＬＡＳＴｎプログラムにより規定される）場合に、プライマーデザインは、“特異的”として決定した。これは、このゲノムに対するユニークヒットを有し、且つゲノムを通じて多くの他のヒットを有さないために、行った。
３．プライマーは、以下の規則に従い、内側対＋外側対に対する各連続したウインドウについて群別した（図５参照）：
ａ．タイリングされたウインドウ毎に、外側／内側プライマー対が存在した（図示された３０ｂｐウインドウ（図３））。
ｂ．第二ウインドウ毎から、特異的内側プライマーが、Ｐｒｉｍｅｒ３により、アウトプット順を基に試みた。
ｉ．プライマーは、既に選択された任意の他の内側プライマーとそれが＞５０％重複する場合に、スキップされるであろう。
ｃ．外側プライマーは、以下のように同定されるよう試みた：
ｉ．現在の及び先行するウインドウからの外側プライマー（１つは内側プライマー由来）は、以下のようなプライマーを見つけるために試行した：
１．プライマーの第一塩基は、内側プライマーの第一塩基の前（又はマイナスプライマーについては後ろ）であった
２．外側プライマーと重複しない内側プライマーの部分は、５〜２０塩基であった
３．外側プライマーは特異的であった
４．プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３アウトプットによりもたらされた順に試験した
ｉｉ．（ｉ）に失敗したならば、外側プライマーが非−特異的であった以外は、（ｉ）と同様に試行した
ｉｉｉ．（ｉｉ）に失敗したならば、距離が３〜４０塩基であった以外は、（ｉ）と同様に試行した
ｉｖ．（ｉｉｉ）に失敗したならば、距離が３〜４０塩基であり、且つ外側プライマーが非−特異的であった以外は、（ｉ）と同様に試行した
ｖ．（ｉｖ）に失敗したならば、距離が４０〜１００塩基であった以外は、（ｉ）と同様に試行した
ｖｉ．（ｖ）に失敗したならば、距離が４０〜１００塩基であり、且つ外側プライマーが非−特異的であった以外は、（ｉ）と同様に試行した
ｄ．他のプライマーとの相互作用なし又は最小（は、内側プライマー及び外側プライマーについて個別に試験した）
ｅ．内側プライマーは、プラス鎖タグ付き配列“ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ”（配列番号：２９７）と相互作用を有さない
ｆ．外側プライマーは、マイナス鎖タグ付き配列ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号：２９８）と相互作用を有さない
ｇ．最終的に選択されたプライマーは、ＩＧＶ(James T. Robinson、Helga Thorvaldsdottir、Wendy Winckler、Mitchell Guttman、Eric S. Lander、Gad Getz、Jill P. Mesirov、”Integrative Genomics Viewer”. Nature Biotechnology 29, 24-26 (2011))及びＵＣＳＣブラウザ(Kent WJ、Sugnet CW、Furey TS、Roskin KM、Pringle TH、Zahler AM、Haussler D、”The human genome browser at UCSC”. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006 )において、バリデーションのためのベッドファイル及びカバレッジマップを用いて、可視化した。
弛緩型及び緊張型のｄｅｌｔａＧ閾値（−６対−３）を伴うプライマーセットは、各々５８及び６１のＴｍ設定で設計した（プラス／マイナス鎖及び内側／外側プライマーを含む、１設計につき４プール）。選択されたプライマーの最終セットを、各鎖上の、及び各鎖上の組合せ上の（“ｂｏｔｈ”と称される）各標的領域のそれらのカバレッジをみるために、評価した。
実施例４：卵巣癌におけるＴＰ５３の標的領域タイリングのための標的領域及びプライマーを同定する方法の例
様々な突然変異が生じることがわかっている癌遺伝子の領域中の癌遺伝子突然変異を検出するための本発明の方法に関して、どのようにしてプライマーは、設計され得るかの例を、以下に提供する。この実施態様において、突然変異は典型的には、遺伝子融合ではない。プライマーは、先に説明した様に設計された。プライマー標的領域は、以下の基準を含んだ：ＴＰ５３遺伝子に関するＴＣＧＡ卵巣試験及びＣＯＳＭＩＣデータベースにおいて発見された、反復ＳＮＶ及び小型インデルの９５％を含むコーディングエクソンが含まれた。ＴＣＧＡ及びＣＯＳＭＩＣシークエンシングは、ＴＰ５３のエクソン性領域のみを標的化した。ＴＣＧＡにおいて患者３１６名が、及びＣＯＳＭＩＣにおいて患者２３３名が存在し、ここで突然変異（ＳＮＶ＋小型インデル）を伴う患者の数は、表４に示した。ＴＣＧＡ患者コホートに関して、患者の９５．４％は、これらの標的に突然変異を有する。
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ＴＣＧＡにおいては試験しなかったＵＴＲ領域もまた、エキソームパネルにより試験されなかったとしても、ＵＴＲ領域に追加の突然変異が存在するかどうかを試験するために含んだ。文献は、３’ＵＴＲ上に診断の可能性のあるｍｉｃｒｏＲＮＡ変更する突然変異が存在することを示している(Liら、“Single nucleotide variation in the TP53 3′ untranslated region in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab-CHOP: a report from the International DLBCL rituximab-CHOP Consortium Program”、Blood 121(22):4529-40, 2013)。
プライマー標的カバレッジは、４つの追加遺伝子、及び卵巣癌においてその突然変異の大半を含むＴＰ５３のエクソン５から８上の、標的突然変異に対して試験した（表５）。このカバレッジは、プライマー（インサートのみを有用なカバレッジに対しカウントした）を除き、７５ｂｐ及び１００ｂｐリード長により試験した。表６−８は、カバレッジデータを提供する。表９−１１は、Ｐｒｉｍｅｒ３に関する例示的プライマーデザイン基準を提供する。
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 共通の設計パラメータ：
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実施例５：標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法の例
多重タイリングされたプライマープール（８０〜９０プライマー／プール（対をなすマイナス鎖プライマーを伴わない単方向性のプラス鎖プライマー））を、プライマー適合性のインシリコ分析に基づいて作製した。以下を考慮した：重複アンプリコンを、個別のプライマープールへ分配し、プライマー−二量体形成の可能性を最小化し、且つ単独プール内のグアニン、シトシン（ＧＣ）含量の類似性を確実にする。プライマーは、等モル量でプールした。
外側プラス鎖プライマープール及びプールされた外側マイナス鎖プライマープールを、第一増幅ラウンドにおいて個別に増幅した。プールされたプラス鎖又はマイナス鎖プライマーの増幅のために、以下のＰＣＲ条件を、５０ｕＬ反応容積中で、使用した：１．２５単位のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、１−Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ反応緩衝液（両方共Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社から）、２００ｕＭ各ｄＮＴＰ、２５ｎＭ各特異的プラス鎖又はマイナス鎖プライマー、２．５ｕＭユニバーサルリバースプライマー、及び１ｕｇの鋳型としての増幅されたライブラリー。或いは、非増幅ライブラリーも使用することができる。このライブラリーは、ＤＮＡ鎖の各末端にライゲーションされたアダプターを伴う、二本鎖ＤＮＡである。ＰＣＲ増幅の第一ラウンドは、下記の条件下で行った：９８℃で１分、１５×［９８℃で１０秒、６３℃で１５分、６８℃で１分］、６８℃で２分、４℃で保持（第一のＰＣＲ）。この増幅産物は、水中に１：２００希釈し、鋳型として２ｕｌを、ＰＣＲ増幅反応の第二ラウンド（総容積１０ｕｌ）に添加した。図６Ａは、片側上の標的特異的プライマー（複数可）及びユニバーサルリバースプライマーによる、ＰＣＲ増幅反応の第一ラウンドを図示している。
第二ネステッドＰＣＲ増幅ラウンドは、増幅の第一ラウンド（第一のＰＣＲ）から作製されたアンプリコンを使用し、プールされた内側プラス鎖プライマープール及びプールされた内側マイナス鎖プライマープールを用い、引き続き個別に行った。プールされた内側プラス鎖プライマー及びプールされた内側マイナス鎖プライマープールの第二ＰＣＲ増幅ラウンドは、０．２５単位のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、１−Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ反応緩衝液、２００ｕＭ各ｄＮＴＰ、１０ｎＭ各特異的内側プラス鎖プライマー又は１０ｎＭ各特異的内側マイナス鎖プライマー、１ｕＭユニバーサルリバースプライマー、及び２ｕｌの第一増幅ラウンド由来の希釈した外側プラス鎖プライマー増幅産物又はマイナス鎖増幅産物を含んだ。ＰＣＲ増幅の第二ラウンドは、以下の条件下で行った：９８℃で１分、１５×［９８℃で１０秒、６３℃で１５分、６８℃で１分］、６８℃で２分、４℃で保持（第二のＰＣＲ、ネステッド）。図６Ｂは、ユニバーサルリバースプライマーを持つ片側上の標的特異的プライマー（複数可）による、ネステッドＰＣＲ増幅反応の第二ラウンドを図示している。片側上のタイリングされた標的特異的プライマーによるネステッドＰＣＲに関するワークフローは、図７Ａ−７Ｂに図示している。
増幅産物は、バーコード化した。シークエンシングの１回の試行は、１試料につきほぼ同数のリードで行った。
表１２は、異なるライブラリーインプット濃度を使用する、シミュレーションしたｃｆＤＮＡ試料の分析からの、シークエンシング結果を示す。リードデプス（ＤＯＲ）の均一性が、プール化され且つゲノム標的領域にわたりタイリングされたおよそ８０〜９０プライマーを有する各プールにより、プラス鎖デザイン（図８Ａ）及びマイナス鎖デザイン（図８Ｂ）について示されている。図８Ｃは、カバレッジの均一性を図示し、これは、全ＴＰ５３遺伝子のプラス及びマイナス両鎖のプライマーデザインにより得られた組合せカバレッジを示している。図１１は、本実施例において作製されたものなどの、ハイスループットシークエンシングデータを基に、ＴＰ５３遺伝子を含む、任意の遺伝子のＳＮＶを検出する（右側の「ＳＮＶ検出」参照）ために使用することができる、例示的分析フローを提供する。図１１の方法に従いどのようにこのＳＮＶ検出分析が行われるかの詳細は、本明細書において提供する。
Figure 2019526230
実施例６：標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッド一工程マルチプレックスＰＣＲ法の例
多重タイリングされたプライマープール（対をなすマイナス鎖プライマーを伴わないプラス鎖プライマー）を、プライマー適合性のインシリコ分析に基づいて作製した。以下を考慮した：プライマー−二量体形成の可能性を最小化し、且つプール内のグアニン＋シトシン（ＧＣ％）含量の類似性を確実にする。プライマーは、等モル濃度でプールした。
プールしたプライマーによる増幅に関して、以下のＰＣＲ条件を、１０ｕＬ反応容積において、使用した：０．２５単位のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、１Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ反応緩衝液（両方共Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社より）、２００ｕＭ各ｄＮＴＰ、１０ｎＭ各プライマー、１ｕＭユニバーサルリバースプライマー、及び１ｕｇの鋳型として増幅されたライブラリー。或いは、非増幅ライブラリーも使用することができる。このライブラリーは、ＤＮＡ鎖の各末端にライゲーションされたアダプターを伴う、二本鎖ＤＮＡである。ＰＣＲ増幅は、下記の条件下で行った：９８℃で１分、１５×［９８℃で１０秒、６３℃で１５分、６８℃で１分］、６８℃で２分、４℃で保持。この増幅産物は次に、後続のＰＣＲ工程においてバーコード化され、且つ配列決定された。シークエンシングの１回の試行は、１試料につきほぼ同数のリードで行った。
実施例７：両側上のタイリング標的特異的内側プライマー（複数可）によるＰＣＲの例
多重タイリングされたプライマープール（８０−９０プライマー／プール（対をなすマイナス鎖プライマーを伴わない単方向プラス鎖内側プライマー））を、プライマー適合性のインシリコ分析に基づいて作製した。以下を考慮した：重複アンプリコンを、個別のプライマープールへ分配し、プライマー−二量体形成の可能性を最小化し、且つ単独プール内のグアニン、シトシン（ＧＣ）含量の類似性を確実にする。プライマーは、等モル量でプールした。
各反応に存在するタグ及びユニバーサルリバースプライマーを有するプール中の各プライマーによる内側プラス鎖及び内側マイナス鎖プライマープールを含む２つのＰＣＲ反応を、個別に増幅した。以下のＰＣＲ条件を、５０ｕＬ反応容積中で、使用した：１．２５単位ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、１−Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ反応緩衝液（両方共Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社から）、２００ｕＭ各ｄＮＴＰ、２５ｎＭ各特異的プラス鎖又はマイナス鎖プライマー、２．５ｕＭユニバーサルマイナス鎖プライマー、及び１ｕｇの鋳型としての増幅されたライブラリー。このライブラリーは、ＤＮＡ鎖の各末端にライゲーションされたアダプターを伴う、二本鎖ＤＮＡであった。開始ＤＮＡの量が相対的に高い、例えばゲノムＤＮＡを共有する場合には、開始ＤＮＡは、ライブラリーフォーマットにはないことに注意。ＰＣＲ増幅の第一ラウンドは、下記の条件下で行った：９８℃で１分、１５×［９８℃で１０秒、６３℃で１５分、６８℃で１分］、６８℃で２分、４℃で保持。この増幅産物は、水中に１：２００希釈した。希釈した増幅産物２ｕｌを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応の第二ラウンド（総容積１０ｕｌ）に添加した。図６Ａは、片側上の標的特異的プライマー（複数可）及び他側上のユニバーサルリバースプライマーによる、ネステッドＰＣＲ増幅反応の第一ラウンドを図示している。増幅産物は、バーコード化された。ＮＧＳシークエンシングの１回の試行は、１試料につきほぼ同数のリードで行った。シークエンシングデータを解析し、決定的な癌の突然変異又は融合を同定した。
全てのプライマーデザインが功を奏したと仮定すると、１００ｂｐのカバレッジを、プライマーインサートについて計算し、これらを全ＴＰ５３領域にわたり可視化し、且つ特定のエクソンに焦点を当てることができる。
実施例８：タイリングされた遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲによる遺伝子融合の検出
図９Ａ−９Ｂは、開示された遺伝子融合を検出する３種のアプローチを図示している。片側上の標的特異的プライマーを使用する片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲタイリングアプローチにおいて、ユニバーサルリバースプライマーを伴う外側及び内側プライマーのマルチプレックスＰＣＲプールを調製し、染色体の切断点にわたる、従って遺伝子融合のシークエンシングのためのアンプリコンを提供する（図９Ａ上側−Ｓｔａｒ１−Ｓｔａｒ２）。切断点が存在せず、従って遺伝子融合がないならば、配列決定された場合に、野生型遺伝子のみがリードされる。片側マルチプレックスＰＣＲアプローチにおいて、これは、染色体の切断点にわたる、従って遺伝子融合のシークエンシングのために、片側上の標的特異的プライマー、及びユニバーサルリバースプライマーを伴うＤＮＡプライマーのマルチプレックスＰＣＲプールも使用する（図９Ｂ）。再度、切断点が存在せず、従って遺伝子融合がないならば、配列決定された場合に、野生型遺伝子のみがリードされる。標的特異的タイリングされたプライマーアプローチによる両側一工程マルチプレックスＰＣＲにおいて（図９Ａ下側−ＯｎｅＳＴＡＲ）、遺伝子融合が生じる場合、シークエンシングによるリードのための切断点に広がる増幅されたＰＣＲ産物が存在するであろう。しかし、遺伝子融合が存在しない場合には、左右のプライマーにより標的化された領域内において増幅されたリードが存在しないので、シークエンシングリードが存在しない。第一及び第三の方法は、１６０ｂｐ融合スパイクを用い、更に試験した。
遺伝子融合の検出のための標的特異的タイリングされたプライマーによる片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ法は、以下のように実行した。
プールされた外側プラス鎖プライマープール及びプールされた外側マイナス鎖プライマープールを、プールされたネステッド内側プラス鎖プライマー及びプールされた内側マイナス鎖プライマーとして、ＰＣＲ増幅反応のために個別に使用した。これら２種の外側標的特異的プライマープールの各々の増幅のために、以下のＰＣＲ条件を、２０ｕＬ反応容積において使用した：２００ｕＭの各ｄＮＴＰを含む１×マスターミックス、１−Ｘマスターミックス反応緩衝液、６０−９０＋プライマーのプール中の２５ｎＭの各特異的外側プライマー又は６０−９０＋プライマーのプール中の２５ｎＭの各特異的マイナス鎖プライマー、２．５ｕＭユニバーサルリバースプライマー、及び４ｕＬの鋳型としてのプラトーライブラリー。このライブラリーは、ＤＮＡ鎖の各末端にライゲーションされたアダプターを伴う、二本鎖ＤＮＡであった。ＰＣＲ増幅の第一ラウンドは、以下の条件下で行った：９５℃で１０分、１５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］、７２℃で７分、４℃で保持。この増幅産物は、水中に１：２０希釈し、２ｕｌを鋳型として、７２℃での；ネステッドＰＣＲ増幅反応の第二ラウンド（総容積１０ｕｌ）に添加した。
プールされた内側プラス鎖ネステッド標的特異的プライマープール及びプールされた内側マイナス鎖ネステッド標的特異的プライマープールを、ＰＣＲ増幅のために個別に使用した。プールされた内側ネステッド標的特異的プライマーの第二のＰＣＲ増幅ラウンドは、２００ｕＭの各ｄＮＴＰを含む１×マスターミックス、１×マスターミックス反応緩衝液、６０−９０＋プライマーのプール中の４０ｎＭの各特異的内側プラス鎖プライマー又は６０−９０＋プライマーのプール中の２５ｎＭの各特異的マイナス鎖プライマー、１ｕＭユニバーサルリバースプライマー、及び２ｕｌの希釈した外側プラス鎖プライマー増幅産物又は外側マイナス鎖プライマー増幅産物を含んだ。外側プラス鎖プライマープールを使用する第一のＰＣＲラウンド由来のアンプリコンを、内側プラス鎖ネステッド標的特異的プライマープールと共に使用し、且つ外側マイナス鎖プライマープールを使用する第一のＰＣＲラウンド由来のアンプリコンを、内側マイナス鎖ネステッド標的特異的プライマープールと共に使用した。ＰＣＲ増幅の第二ラウンドは、以下の条件で行った：９５℃で１０分、１５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］、７２℃で７分、４℃で保持。
第二ネステッドＰＣＲ増幅反応由来の増幅産物を、１×Ｑｉａｇｅｎマスターミックス、０．５ｕＭプラス鎖バーコード、０．５ｕＭマイナス鎖バーコード、１ｕＬの１；２０希釈したプールされた内側プライマーの第二ＰＣＲ増幅ラウンド由来の増幅産物を含有する１０ｕＬ反応容積中で、バーコード化した。バーコード化反応は、９５℃で１０分、１２×［９５℃で３０秒、６２．５℃で３分、７２℃で２分］、７２℃で７分、４℃で保持であった。バーコード化後、この反応物をプールし、精製し、且つ１回のシークエンシング試行を、１試料につきほぼ同数のリードで行った。
片側マルチプレックスＰＣＲによるＴＭＰ４−ＡＬＫ可視化の結果は、図１０Ａに図示している。野生型ＡＬＫ片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲは、上側トラックシークエンシングリードに示し、ＴＰＭ４：ＡＬＫ＿９切断点は、下側トラックシークエンシングリードに示した。融合スパイクは融合境界を越える一方で、ＡＬＫ野生型増幅産物は、切断点を超えない（切断点でのカバレッジは、３３，８５５リード、対、野生型３４である）ことは、容易に明らかである。
片側マルチプレックスＰＣＲによるＮＰＭ１−ＡＬＫ＿９可視化の結果は、図１０Ｂに図示している。野生型ＡＬＫ片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲは、上側トラックシークエンシングリードに示し、ＮＰＭ１−ＡＬＫ＿９切断点は、下側トラックシークエンシングリードに示した。融合スパイクは融合境界を越える一方で、ＡＬＫ野生型増幅産物は、切断点を超えない（切断点でのカバレッジは、１２，４３７リード、対、野生型３３である）ことは、容易に明らかである。
遺伝子融合を検出するための標的特異的タイリングされたプライマーによる両側一工程マルチプレックスＰＣＲ法を、以下のように実行した：
プールされた内側プラス鎖標的特異的プライマープール及びプールされた内側マイナス鎖標的特異的プライマープールを一緒にし、且つＣＤ７４＿ＲＯＳ１＿１３融合の検出のために増幅した。プールされた内側プラス鎖及びマイナスプライマーのＰＣＲ増幅ラウンドは、１０ｕＬ総容積中に、２００ｕＭの各ｄＮＴＰを含む１×マスターミックス、１×マスターミックス反応緩衝液、５０ｎＭの各特異的内側プラス鎖及びマイナス鎖プライマー、並びに４ｕＬのプラトーライブラリーを含んだ。ＰＣＲ増幅は、下記の条件下で行った：９５℃で１０分、３０×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で３０秒］、７２℃で２分、４℃で保持。
この増幅産物は、１０ｕＬ総容積中に、１×Ｑｉａｇｅｎマスターミックス、０．５ｕＭプラス鎖バーコード、０．５ｕＭマイナス鎖バーコード、１ｕＬの１：２０希釈したＯｎｅＳＴＡＲ増幅産物を含有する、１０ｕＬ反応容積中で、バーコード化した。バーコード化反応は、９５℃で１０分、１２×［９５℃で３０秒、６２．５℃で３分、７２℃で２分］、７２℃で７分、４℃で保持である。バーコード化後、この反応物をプールし、精製し、且つ１回のシークエンシング試行を、１試料につきほぼ同数のリードで行った。
標的特異的タイリングされたプライマーでの両側一工程マルチプレックスＰＣＲによるＣＤ７４＿ＲＯＳ１＿１３可視化の結果は、図１０Ｃに図示している。標的特異的タイリングされたプライマーでの両側ＰＣＲによる野生型ＣＤ７４は、下側トラックシークエンシングリードに示し、並びにＣＤ７４＿ＲＯＳ１＿１３切断点は、上側トラックシークエンシングリードに示した。融合スパイクは融合境界を越える一方で、ＣＤ７４野生型増幅産物は、切断点を超えない（切断点でのカバレッジは、１７，３８６リード、対、野生型４である）ことは、容易に明らかである。
データ解析
補足リード分析：
前述の分析のために、アライメントを、以下のように行った：両鎖からのシークエンシングリード（ｆａｓｔ１プラス及びｆａｓｔ１マイナス）を、ペアエンド分析を用いて集成した。集成した配列を、ＢＷＡ Ａｌｉｇｎｅｒプログラムを用い、試験中の(on-test)融合を伴わない公的に入手可能な参照ゲノムにマッピングした。ＢＷＡ Ａｌｉｇｎｅｒプログラムは、プライマリーアライメントのマッピングされない部分を説明することができるプライマリーアライメントを有するリードのアライメントとして補足アライメントを報告した。時には、各プライマリーアライメントについて複数の補足アライメントが存在する。プライマリー−補足アライメント対のリンケージマップを構築することにより、データ中の切断点を発見した。本明細書において使用される切断点とは、それらの融合が局所的突然変異により説明することができないように、それらが互いに非常に離れているので、そうでなければ連結されることのない２つの配列の融合を指す。マッピングデータにおいて同定された切断点は、遺伝子融合又はアーチファクトのいずれかであった。バックグラウンドノイズは、陰性試料から決定し、且つ除外した。切断点は、切断点リードの総数が、カットオフを上回るかどうかを決定することにより、同定した。
最初又はシード融合コールの更なる分析を、図１１に示したように、シード融合コールを基にドナー、アクセプター融合鋳型を構築することにより行うことができる。これらのリードは次に、融合を伴わない公に入手可能な参照ゲノムの代わりに、ドナー、アクセプター融合鋳型に再度マッピングすることができる。
ペアエンドブリッジ分析：
シークエンシングリードを、ペアエンドモードでマッピングすることができ、ここで各配列決定された鎖は、ペアエンド分析において一緒にされた後よりもむしろ、個別にマッピングされる。シークエンシングリードが、１つの融合遺伝子上にマッピングするために認められ、且つそのシークエンシングメートを融合パートナー上に忠実にマッピングする場合、この配列リードは、検出された融合ブリッジの証拠としてカウントすることができる。ブリッジマップは、標的領域について作製することができ、且つ補足リード分析と同様に報告される。１つのバーコードに関するブリッジリード、対、切断点リードのカウントは、分析することができ、且つ最初に比較し、その後全てのバーコードについてそれらを報告するために測定基準を構築することができる。こうして、切断点の検出を、検証することができる。
実施例９：デノボ検出限界を評価するための融合の片側ＰＣＲタイリング検出
ネステッド片側ＰＣＲタイリング法を、遺伝子融合を検出し、且つこの方法の検出限界を評価するために、実行した。この実験は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＴＰＭ４−ＡＬＫ及びＣＤ７４−ＲＯＳ１融合に焦点を当て、且つデノボ検出分析アルゴリズムを使用し、低インプット割合でのこれらの遺伝子間のいくつかの特異的再編成の検出を試験した。タイトレーションシリーズを、ＰＣＲ増幅により作製された２つの独立した遺伝子融合構築体及び融合細胞株から作製されたモノソームＤＮＡについて行い、引き続き本発明のネステッド片側タイリングＰＣＲ実施態様及びデノボ融合検出アルゴリズムを用い、検出された融合を測定した。
方法
インビボにおいて循環ＤＮＡ中に生じる核酸断片を模倣するよう、一連の合成ポリヌクレオチドを作出し、これは既知の遺伝子融合切断点にわたる既知の融合パートナー遺伝子由来の核酸配列を含む。ＴＰＭ４：ＡＬＫ及びＣＤ７４：ＲＯＳ１融合事象を模倣する合成ポリヌクレオチドを作出するために、示された融合配列を伴う合成オリゴヌクレオチド鋳型を、表１３に示されたプライマーを用いて、標準ＰＣＲ条件下で、ＰＣＲ−増幅した。得られた増幅された断片を、各インプット百分率で、以下のタイトレーション実験のために使用した。
Figure 2019526230
融合スパイクは、ＨＳ Ｑｕｂｉｔ（登録商標）核酸定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カールスバッド、ＣＡ）を用いて定量し、１ｎｇ／μｌ野生型モノソームＤＮＡ中に希釈した。ミクロコッカス・ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）により消化されたＨ２２２８融合細胞株ＤＮＡを、モノソームＤＮＡに精製した（ＡＧ１６７７８ ６８ｎｇ／ｕｌ（Ｂ−リンパ球細胞株）、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カムデン、ＮＪ、ＵＳＡ）。Ｈ２２２８融合細胞株ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＮＥＢ断片化(fragmentase)キット（ＮＥＢ、イプスウィッチ、ＭＡ）により断片化した。断片化された及びモノソームの両方のＨ２２２８融合細胞株ＤＮＡに対し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ）上で、品質管理アッセイ（ＱＣ）を行った。断片化された及びモノソームＨ２２２８融合細胞株ＤＮＡ並びに野生型細胞株モノソームＤＮＡ（ＡＧ１６７７８ ６８ｎｇ／ｕｌ）を、核酸定量のためのＱｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カールスバッド、ＣＡ）を用いて、定量した。合計２７試料を調製した。先に示したように、先の表１３のＣＤ７４：ＲＯＳ１プライマーによる鋳型ＤＮＡの増幅により、並びに他方は、表１３のＴＰＭ：ＡＬＫプライマーによる鋳型ＤＮＡの増幅により、作製されたアンプリコンを用い、２つの融合スパイクを作出した。これら２つの融合スパイクアンプリコンは、野生型ＤＮＡの５０，０００コピーへ、１０％、１％、０．５％、０．１％及び０．０５％インプットで、個別に添加した（５試料／スパイクで合計１０試料）。モノソームＨ２２２８ ＤＮＡは、野生型ＤＮＡの５０，０００コピーへ、１００％（１０，０００コピー）、１０％、１％、０．５％、０．１％及び０．０５％インプットで、２つ組で添加した（合計１２試料を形成）。３つの陰性試料は、モノソームＤＮＡ（５０，０００コピー）を含んだ。Ｈ２２８に関して、この細胞株は、遺伝子融合についてヘテロ接合性であると推測され、これは検出可能な割合を半減することは、注目に値する。
簡単にいうと、先に明らかにされた様々なＤＮＡ鋳型試料由来の核酸ライブラリーは、Ｎａｔｅｒａライブラリー調製キット（Ｎａｔｅｒａ、サンカルロス、ＣＡ）を用いて調製した。このライブラリー調製試薬は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片を、ＤＮＡ分子の増幅されたライブラリーへ形質転換するために使用し、各々、特異的合成アダプターＤＮＡに隣接された当初のｃｆＤＮＡ配列からなる。ｃｆＤＮＡ断片の３’又は５’オーバーハングは、ポリメラーゼを用い平滑末端へと変換し、引き続き平滑末端とされたｃｆＤＮＡ断片に単独の３’Ａヌクレオチドを追加し、アダプターのアニーリング及びライゲーションを増強した。合成アダプター配列は、Ａ−テイル化されたｃｆＤＮＡ断片の両端に、単独３’Ｔヌクレオチドにライゲーションした。これらのライブラリー調製試薬により作製されたアダプター−ライゲーションされたライブラリーを次に、これらのアダプターに相補的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅は、以下の条件で行った：９５℃で２分、９×［９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、６８℃で２０秒］、６８℃で２分、４℃で保持。ＰＣＲ産物を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅビーズを用いて精製した。精製したｃｆＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡ浮遊緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、−１０℃〜−３０℃で保存した。
これらのライブラリーの品質管理は、ＬａｂＣｈｉｐ ＤＮＡ分析装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）を用いて行った。マルチプレックスネステッド片側ＰＣＲ反応は、一連の１４８フォワード標的−特異的外側プライマー及びリバース外側ユニバーサルプライマーを用いる“Ｓｔａｒ１”と称される第一ＰＣＲを実行することにより実施し、外側プライマー標的アンプリコンを作製した。次に一連の１４８のフォワード標的−特異的内側プライマー及びリバース内側ユニバーサルプライマーを使用し、外側プライマー標的アンプリコンの一部を増幅することにより、“Ｓｔａｒ２”と称される第二ＰＣＲを実行した。
次に２７試料についてバーコード化ＰＣＲ反応を実行することにより、バーコードを、内側プライマー標的アンプリコンに追加した。内側プライマー標的アンプリコンのシークエンシングのためにプールされた試料は、２７試料の各々から２ｕｌを配合することにより、調製した。シークエンシング試料は、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、且つＱｕｂｉｔ ＢＲを用いて定量した。試料は、ＨｉＳｅｑ ２５００システム及びＴｒｕＳｅｑ Ｒａｐｉｄ ＳＢＳキット（２００サイクル及び５０サイクル）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて配列決定した（１００ｂｐのペアエンド及び単インデックス）。予想される平均ＤＯＲは、合計３００，０００，０００リードのオン標的リードの５０％での１４８アッセイ、オン標的リード１５０，０００，０００及び５，５００，０００リード／試料を基に、〜３７，５００リード／アッセイであると計算した。この方法は、以下により詳細に考察する。
Figure 2019526230
ＳＴＡＲ１プロトコール：以下を含有する片側外側ＰＣＲ反応混合物を形成した：２５ｎＭの各融合１外側プールプライマー（フォワード標的−特異的外側プライマー）（この実験で使用した標的−特異的タイリングされた外側ＡＬＫ及びＲＯＳプライマーのリストについては、図１３Ａ−１３Ｈ参照）、２．５ｕＭ ＲＳｔａｒ２＿Ｃ３＿Ｌｏｏｐ（外側ユニバーサルプライマー）、４ｕｌプラトー化されたライブラリー（核酸ライブラリー）を、本明細書においてＫ２３マスターミックスと称されることが多い、インハウス反応混合物へ添加した。Ｋ２３マスターミックスは、最終ＰＣＲ反応混合物内に以下の濃度を含んだ：７５ｍＭトリスｐＨ８．０（ＴｅｋＮｏｖａ Ｔ１０８０）；５ｍＭ ＭｇＣｌ2；３０ｍＭ ＫＣｌ；６０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4；１５０Ｕ／ｍＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０；０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ（Ｎ０４４７Ｓ）；及び、３％グリセロール。ＰＣＲ増幅プロトコールは、以下に従った：９５℃で１０分；１５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］；７２℃で７分、及び４℃で保持。
ＳＴＡＲ２プロトコール：以下を含む、片側内側ＰＣＲ反応混合物を形成した：４０ｎＭの各融合１内側プールプライマー（フォワード、標的−特異的内側プライマー）（この実験で使用した標的−特異的タイリングされた内側ＲＯＳ及びＡＬＫプライマーのリストについては、図１３Ａ−１３Ｈ参照）、１ｕＭ ＲＳｔａｒ２（内側ユニバーサルプライマー）、２ｕｌの１：２０希釈したＳｔａｒ１生成物（外側プライマー標的アンプリコン）。ＰＣＲ増幅プロトコールは、以下に従った：９５℃で１０分；１５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］；７２℃で７分、及び４℃で保持。
バーコード化プロトコール：下記のバーコード化反応混合物を形成した：１×Ｑｉａｇｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ、独国）、０．５ｕＭ Ｆ−ＢＣ−バーコード、及び１μｌのＳｔａｒ２生成物（１：２０希釈した内側プライマー標的アンプリコン）。バーコード化ＰＣＲ増幅プロトコールは、以下に従った：９５℃で１０分；１２×［９５℃で３０秒、６２．５℃で３分、７２℃で２分］；７２℃で７分、及び４℃で保持。
試料プーリング及びシークエンシング：シークエンシングプールを、２７試料の各々から２μｌを配合することにより調製した。このプールを、Ｑｉａｇｅｎキットを用い、ＰＣＲ精製し、且つＢＲ Ｑｕｂｉｔを用い、定量した。プールは、１回ＨｉＳｅｑ２５００ １００ｂｐのペアエンド、単インデックスランで試行した。プール濃度は、Ｑｕｂｉｔ ＢＲを用いて決定した。プール濃度は、３７７ｎＭであった。
分析は、実施例８の設定で行った。
結果
本明細書の片側ネステッド多重タイリングされたＰＣＲ法に含まれた、内側及び外側タイリングされたＡＬＫ及びＲＯＳプライマーを使用するプライマーカウントの分析は、以下のリードを生じた：ｂａｍリード総数１９８，６９５，３８３；マッピングされたリード総数１７６，４９１，８３０；マッピングされたオン標的リード総数１０１，９４７，１６８：マッピングされたリード〜８９％；マッピングされたオン標的リード〜５１％；並びに、９０番目／１０番目パーセンタイルの均一性６１。従って総リードの約５０％は、オン標的リードとしてマッピングし、これは他の類似の実験と一致した。同じ事が、この融合プールの約６０％である均一性についても当てはまった。
融合割合は、個々のプライマーに関して検出された総融合リードを基に計算した。１つのプライマー及び複数のｃｉｇａｒｓｔｒｉｎｇｓに関する融合リードの合計を計算し、且つ総プライマーカウントにより除算した。これは、野生型リード及び代替マッピング（切断点後の３１ｂｐ最短長）には短すぎるリードを含み、このことは融合切断点から更に離れたプライマー部位によるスパイクのための検出された融合の割合を低下し得る。
ＥＭＬ４−ＡＬＫタイリングアッセイは、モノソームＨ２２２８融合細胞株ＤＮＡを用いて、タイトレーションした。注目すべきことに、このデータは、ＥＭＬ４にマッピングするリードについて予め選択され、「偽陽性融合」は全て除去された。
Figure 2019526230
表１５に示したように、融合細胞株（１００％）由来の純粋なモノソームＤＮＡは、７０％融合検出に達した。〜５０００の非割当てリードが存在し、これはＥＭＬ４及び野生型ＡＬＫリードにマッピングするには、短すぎるリードである。注目すべきことに、１００％野生型試料は、プライマーＡＬＫ＿ｒ２０１＿ｉに対応する平均４４００リードを有し、これは野生型リードであることの非割当てリードの確度を明らかにしている。
理論により限定されるものではないが、融合リードのためのアンプリコン作製は、より高い効率を有する（１７，０００融合リード、対、４４００野生型リード）ことは疑わしく、その理由は、他のプライマーは、その融合遺伝子の下流にはないからである。他方で、野生型領域の増幅のための、プライマーは、下流プライマーと競合し、これは図１２を参照のこと。
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合は、プライマーＡＬＫ＿ｒ２０１＿ｉにより検出され、％インプットに応じて、１〜６０ｃｉｇａｒｓｔｒｉｎｇｓを伴う、生成物サイズ６２ｂｐ〜１５５ｂｐへつながった。切断点は、プライマー末端を１１ｂｐ下回った（総ＡＬＫアンプリコン長３１ｂｐ）。このブレークは、ＥＭＬ４エクソン６−イントロン６とＡＬＫイントロン１９−エクソン２０の間で検出され、これはＥＭＬ４−エクソン６にエクソン２０により融合し、バリアント３を作製する。このバリアントは先に、Rikovaらの論文、２００７により、Ｈ２２２８細胞株について報告された。
Ｈ２２２８細胞株由来の断片化されたＤＮＡは、１００％融合試料中の２０％融合の検出につながった。これは、モノソームＨ２２２８ ＤＮＡと比べ、はるかに低い割合であり、このことは７０％融合リードを生じた。試験した両方の１００％断片化されたＤＮＡ試料のプライマーＡＬＫ＿ｒ２０１＿ｉに関するリードの数は、〜４０，０００であり、これはモノソームＤＮＡ試料（〜１７，５００）の２倍以上である。それにもかかわらず、これらの試料は、類似のパフォーマンスを示すことに失敗している。
ＲＯＳタイリングされたプライマーを使用し、表１６を参照し、タイトレーションされたＲＯＳ−ＣＤ７４スパイクは、予想された量では検出されなかった。この実験では、非常に低い割合が、検出された。この理由は、この融合の巧みなマッピングのためには、長いアンプリコン長が必要であるためであると考えられる。ＲＯＳプライマーは、比較的長い距離で配置され、その結果スパイク配列内に結合したプライマーのみが、切断点から６８ｂｐ離れた。このことは、最小アンプリコン長約１２０ｂｐ、到達することが必要とされるプライマー開始部位と合成スパイク末端の間の距離は、ＲＯＳプライマーを考慮し、２４ヌクレオチド長であり、及びＣＤ７４遺伝子を同定するために配列決定される必要があるＣＤ７４遺伝子の約３０ヌクレオチドであったことを意味する。これは、試験したＴＰＭ４−ＡＬＫスパイクと比べ２倍のアンプリコン長であり、これは恐らくＲＯＳ−ＣＤ７４スパイクについてインプットと検出された割合の間の相違を説明するであろう。しかし、表１６を参照し、ＲＯＳプライマーのためのＤＯＲは、極めて高く、これは０．０１％のＲＯＳ−ＣＤ７４スパイクの検出を可能にする。
Figure 2019526230
ＴＰＭ４−ＡＬＫタイリングされたＰＣＲアッセイは、ＡＬＫの１１２ヌクレオチドに融合されたＴＰＭ４の４８ヌクレオチドを有する鋳型により、代表的ＰＣＲ増幅されたスパイクを用いてタイトレーションした。表１６を参照し、ＴＰＭ４−ＡＬＫスパイクは、誤差範囲内で予想された割合で検出された。このプライマーに関する低いＤＯＲは、０．１％未満のインプット融合ＤＮＡの検出を可能にしなかった。割合は、その短いアンプリコン長のために、このスパイクに関して正確であるように見える。
Figure 2019526230
結論
デノボ遺伝子融合検出は、本明細書に提供されるネステッド片側ＰＣＲアプローチを使用し、０．０５％インプット核酸まで低下するモノソームＤＮＡにおいて、ＥＭＬ４−ＡＬＫについて成功した。更に、この方法を使用し、０．１％ＴＰＭ４−ＡＬＫスパイク（インプット）を、この実験において検出した。次に低いタイトレーションポイントは、いずれの融合リードも獲得せず、これは恐らくこのプライマーに関してＤＯＲが〜３，０００であるためであろう。Ｒｏｓ−ＣＤ７４スパイクは、ネステッド片側ＰＣＲ法を使用し、０．０５％インプットまで低下して検出した。Ｒｏｓアッセイは、６０，０００総リード中で６融合リードを検出した（０．０１％定量）。このアッセイが実行されるＰＣＲ条件を考慮すると、ＲＯＳ−ＣＤ７４について検出された少ない数の融合リードは、マッピングに必要な比較的長いアンプリコン長のためであった。全てのＲＯＳアッセイは、ＡＬＫアッセイ（〜４１，０００）と比べ、平均してより高いＤＯＲ（〜５８，０００）及びより良い均一性を有した。この実験で使用した分析方法は、野生型リードの定量を可能にせず、その理由は、スプリットリードのみが分析されたからである。プライマースペーシング、プライマーパフォーマンス及びアンプリコン長は、融合コーリングの感度に影響を及ぼした。
実施例１０：遺伝子融合検出法分析
この実施例において提供される実験は、ネステッド片側ＰＣＲタイリング反応、引き続きＰＣＲタイリング反応において作製された内側プライマーアンプリコンの超並列ハイスループット核酸シークエンシングを使用し、標的遺伝子に関与する融合を検出する方法を巧く実行するための詳細を例示する。この実施例において提供される実験は、この方法の感度及び／又は特異性を向上するために、同業者はどのように、ネステッド片側ＰＣＲ反応のパラメータを改変するかを例示している。別に特定しない限り、試薬、装置、及び方法は、先の実施例９に提供するものである。
融合鋳型核酸を使用し、外側プライマー第一ＰＣＲ反応（すなわち、Ｓｔａｒ１）において３種のプライマー濃度及び３つのＳｔａｒ１サイクル数、引き続き本方法のネステッド片側ＰＣＲ工程の内側プライマー第二ＰＣＲ反応（すなわち、Ｓｔａｒ２）において３つのプライマー濃度、及び３つのＳｔａｒ２サイクル数、並びにＳｔａｒ１生成物インプットのＳｔａｒ２反応への３つの希釈による、ネステッド片側タイリングアプローチを、試験した。これらの試料は、プールし且つ分析した。
野生型モノソームＤＮＡ中のＴＰＭ４：Ａｌｋ１＿７鋳型の混合物を、実施例９に提供したプライマー及び鋳型を使用し、９０％ＴＰＭ４：Ａｌｋスパイク及び１０％モノソームＤＮＡから調製した。モノソームＤＮＡは、野生型細胞株（ＡＧ１６７７８）から調製した。Ｓｔａｒ１反応は、プライマー濃度５ｎＭ、１０ｎＭ及び２５ｎＭで、並びにサイクル数の３つの変動１５、２５及び３５サイクルで、ＲＯＳ１及びＡＬＫに関して、１４８アッセイ（すなわち、１４８のフォワード標的−特異的外側プライマー（この実験で使用された標的−特異的タイリングされた外側ＡＬＫ及びＲＯＳプライマーのリストに関しては図１３Ａ−１３Ｈ参照）、及びリバース外側ユニバーサルプライマー）を実行した。Ｓｔａｒ２反応は、３つのプライマー濃度１０ｎＭ、２０ｎＭ及び４０ｎＭ、並びに３つの異なるサイクル数（１５、２５、及び３５サイクル）、並びに３つのＳｔａｒ１希釈１：２０、１：２００及び１：２０００で、ＲＯＳ１及びＡＬＫに関して、１４８アッセイ（すなわち、１４８のフォワード標的−特異的内側プライマー（この実験で使用された標的−特異的タイリングされた内側ＡＬＫ及びＲＯＳプライマーのリストに関しては図１３Ａ−１３Ｈ参照）、及びリバース内側ユニバーサルプライマー）を実行した。先に指摘したことを除き、Ｓｔａｒ１及びＳｔａｒ２反応は、Ｋ２３マスターミックスにおいて、実施例９に提供されたサイクリング条件を用いて、実行した。Ｓｔａｒ２反応のアンプリコン生成物を含む２４３の得られた試料を、実施例９のプロトコールを用いて、バーコード化した。実施例９に提供されたように、全てのバーコード化した試料のプールを調製し、且つ配列決定した。データ解析及び品質管理は、実施例９に提供したように行った。
オン標的リードにマッピングされた全てのプライマーカウントのリストを、各条件及びプライマーのために供給した。均一性は、９０番目及び１０番目パーセンタイルについてこのデータを用いて計算した。第二の分離分析は、試験した各条件に関して総リード、％マッピングしたリード及び％オン標的リードに関する情報を供給した。このデータは、対をなし、且つ表１８に列挙した。合計３０条件を、均一性＜１０として同定した。当初のプロトコールは、この実験において試験した融合プールに関して、オン標的リードの３６．６％で、均一性３３を生じた。改善されたサイクリング条件の選択は、均一性が、〜６２％のオン標的％で、値〜５（９０番目／１０番目パーセンタイル）まで改善されたことを示している。表１８のバーコード３０３列は、良好な均一性及びオン標的リード％に関して、試験した条件の特に注目に値するセットである。
Figure 2019526230
改善された例示的プロトコールは、以下のように確定した：
Ｓｔａｒ１：１×Ｋ２３（実施例９参照）、１０ｎＭの外側プール、２．５μＭのＲＳｔａｒ２＿Ｃ３＿Ｌｏｏｐ−Ｒｙａｎ、４μｌのプラトー化されたライブラリー、２０μｌの総容積。
ＰＣＲプログラム：９５℃で１０分；３５×［９５℃で３０秒、６３Ｃ℃で１０分、７２℃で２分］；７２℃で７分、４℃で保持、
Ｓｔａｒ２：１×Ｋ２３、１０ｎＭの内側プール、１μＭのＲＳｔａｒ２、２μｌの１：２０希釈したＳｔａｒ１生成物、１０μｌの総容積
ＰＣＲプログラム：９５℃で１０分；３５×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で２分］；７２℃で７分、４℃で保持、
ＢＣ−反応：１×Ｑｉａｇｅｎ ＭＭ、０．５μＭのＲ−ＢＣ−バーコード、０．５μＭのＦ−ＢＣ−バーコード、１μｌの１：２０希釈したＳｔａｒ２生成物、１０μｌの総容積
ＢＣ−ＰＣＲプログラム：９５℃で１０分；１２×［９５℃で３０秒、６２．５℃で３分、７２℃で２分］；７２℃で７分、４℃で保持。
本プロトコールは、均一性及びオン標的リード％に関して改善された。均一性は、当初の３３から５まで低下し（９０番目／１０番目パーセンタイル）、且つ３６％から６３％まで全てのオン標的リードの倍加が達成された。従って、ネステッド片側マルチプレックスＰＣＲ反応を用い融合を検出する方法が再度巧く明らかにされるのみではなく、改善されたＰＣＲ条件を同定する方法も例証される。
実施例１１：融合検出のためのタイリングＰＣＲプライマー位置の更なる分析
この実施例は、片側ネステッドＰＣＲタイリングアプローチ、並びに両側切断点にわたる(across-the-breakpoint)プロトコールを使用する、癌遺伝子の遺伝子融合検出の概念の別の論証を提供する。
血液又はその画分中の融合検出のために本発明の方法を実行するためのこの実験セットで試験される戦略は、そのアンプリコンがそこで癌−関連標的遺伝子融合が起こることがわかっている標的領域内にあるプライマーによる、タイリングされたプライマー結合部位を使用するマルチプレックスＰＣＲ、それに続くシークエンシング及びバイオインフォマティクス解析に頼っている。バイオインフォマティクス解析は、２つの遺伝子（標的遺伝子及び融合パートナー）にマッピングされた配列リードとして、融合を同定した。
融合検出のための片側ネステッドタイリングアプローチは、融合した遺伝子由来の循環腫瘍ＤＮＡを模倣した標的として、合成スパイクを使用し、試験した。肺癌において通常認められた４種の遺伝子融合対が、この実験のために選択された。各融合対に関して、９種の異なるスパイク断片を、標的遺伝子及びパートナー遺伝子の同じ切断点、しかし異なる割合で作製した（図１４及び表１９参照）。
Figure 2019526230
融合スパイク及びライブラリーの調製は、実施例９に従い行った。インプットＤＮＡは、０％（ＷＴ−ＤＮＡの１０，０００コピー）、９０％（ＷＴの１０，０００コピー＋スパイクの９０，０００コピー）、又はスパイクのみ（９種のスパイク全ての３０ｎｇ）であった。
片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ増幅反応は、実施例９に提供したようなＳＴＡＲ１／ＳＴＡＲ２プロトコール、及び本明細書に提供されるＯｎｅＳｔａｒプロトコールと称される両側切断点にわたるプロトコールを用いて行った。ＯｎｅＳｔａｒプロトコールに関して、融合１ Ｏｎｅ−Ｓｔａｒプライマープール、５０ｎＭの１×Ｋ２３反応混合物、４μｌの１：２０希釈したＳｔａｒ１生成物、１０ｕｌの総容積の混合物を、以下のＰＣＲプログラムを使用し、増幅した：９５℃で１０分；３０×［９５℃で３０秒、６３℃で１０分、７２℃で３０秒］；７２℃で２分、４℃での保持。
これらの試料は、Ｓｔａｒ２生成物の代わりに、希釈したＳＴＡＲ２／ＯｎｅＳｔａｒ生成物を使用することを除いて、実施例９に提供されたバーコード化プロトコールを用いて、バーコード化した。試料を１つのプールにプールし、Ｑｕｂｉｔを用いて精製し、ペアエンド、単インデックス、１００サイクルリードにより配列決定した。例えば表２０及び２１のように、１融合につき９つの鋳型を分析し、１つの鋳型につき２つのバーコード、１回の分析につき１８のバーコードリードを提供した。データは、実施例８に提供されたように分析した。
融合の検出
Ｓｔａｒ１／Ｓｔａｒ２（片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲ）及びＯｎｅＳｔａｒ（両側ネステッドタイリングＰＣＲ）と称される、２つの異なるアプローチを使用し、融合を検出した。図１５は、各方法を図示している。注目すべきは、片側ネステッドマルチプレックスＰＣＲタイリングアプローチ（Ｓｔａｒ１−Ｓｔａｒ２アプローチ）は、余り多くのプライマーを必要としないことであり、その理由はＰＣＲ反応の片側は、ユニバーサルプライマーであり、且つ両方の融合パートナーの先行する知識を必要としないからである。
シークエンシングデータは、この実験において使用したＡＬＫ及びＲＯＳプライマーに関する良好なカバレッジを示し、その大半は少なくとも１，０００リードを伴う。ＡＬＫプライマーに関して６７中２のアッセイのドロップアウトが存在し、ＲＯＳプライマーに関して２７中１のアッセイのドロップアウトが存在した。シークエンシングデータの分析は、Ｓｔａｒ１／Ｓｔａｒ２及びＯｎｅＳｔａｒの両アプローチを用いて、融合は、巧く検出されたことを指摘した（データは示さず）。
シークエンシングデータの分析は、オン標的リードの割合は、Ｓｔａｒ１／Ｓｔａｒ２プロトコールに関しておよそ３５％であり、且つＯｎｅＳｔａｒプロトコールに関しておよそ１０％であることを指摘した。しかし、Ｓｔａｒ１／Ｓｔａｒ２に関してオン標的リードのわずかに約１％が融合を有したのに対し、ＯｎｅＳｔａｒプロトコールにおいて全てのリードは、ＲＯＳ１：ＣＤ７４の融合を有した。
タイリングされた一連の内側及び外側標的プライマー結合部位を用いる、片側ネステッドＰＣＲアプローチを使用する遺伝子融合の検出における融合切断点に関連する標的結合部位の配置の役割を、分析した。ＲＯＳ１：ＣＤ７４融合鋳型で増幅されたスパイク試料に関して、片側ＰＣＲアプローチのための３つの内側ＲＯＳ１プライマーは、切断点から５０６、３９６、及び９１ヌクレオチドに結合するように設計された。切断点から９１ヌクレオチドの標的プライマー結合部位に結合したプライマーによるＰＣＲのみ、検出可能な融合リードを、並びに切断点から９１ヌクレオチドの結合部位を含んだ２つ組融合スパイク核酸ライブラリー分子についてのみを生じた（表２０の試料１１−１８参照；試料１−１０は、切断点から９１ヌクレオチドの結合部位を含まなかった）。検出された最高の融合率は、６０％をわずかに上回り、これは恐らく平均リード長さが約８０塩基対であるこれらの条件下で理想的なものよりも、より高いが、その結合部位は、切断点から更に遠いように見える。
Figure 2019526230
ＡＬＫ：ＴＰＭ４融合スパイクライブラリーに関して、図１６は、試験したフォワード内側プライマーの４つの配置、並びに切断点に関するそれらの各アンプリコンを示す。図１７は、これらの片側ＰＣＲ増幅のための、鋳型融合スパイク分子に関する内側プライマー２、３、及び４の相対位置を示す。最後の７種の鋳型は、Ｐ３に関して増幅及び検出されるべきであり、且つ最後の３種の鋳型は、Ｐ４に関して増幅されるべきである。Ｐ２は、より弱い結果を提供した。理論により限定されるものではないが、切断点から２２ヌクレオチドのプライマーＰ２は、理想的である切断点に非常に近い距離にあるように見える。片側ＰＣＲ増幅からのデータは、表２１に示されている。切断点から３６ヌクレオチドのＰｒｉｍｅｒ３は、いくつかのスパイク鋳型に関して８５％を超える融合リードを伴う、長さおよそ３２ヌクレオチドの平均アンプリコンを生じたこれらのＰＣＲ条件をもたらす特に有効な距離であるようにみえる（表２１）。切断点から１０７ヌクレオチドであるＰ４プライマーに関して、このプライマーに関する平均リード長は、５０ｂｐであった。従って融合リードは、Ｐ４プライマーを用いては検出されなかった。これらの条件下で、４９ｂｐリード長が作製され、１０７ヌクレオチドは、切断点／融合を検出するには遠すぎた。
Figure 2019526230
別の試料において、ＡＬＫ：ＮＰＭ１融合スパイク鋳型ライブラリーは、各々、平均アンプリコン長３７、４１及び３８で、切断点から２１、３６、及び５８ヌクレオチドの３種の内側プライマー（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）（片側ＰＣＲについて）により分析した。この実験及びこれらの条件下において、Ｐ１は、切断点に近すぎるように見えるので、増幅しなかった。Ｐ３は、増幅したが、わずかに１％融合検出を提供した。Ｐ２（平均アンプリコン長４１ヌクレオチドで切断点から３６ヌクレオチド）は、融合の最高検出を提供し、一部の鋳型は７０％を超える融合リード／総リードを提供した。
実施例１２：片側ＰＣＲタイトリングアンプリコン長、対、アニーリング時間
試薬、装置、及び方法は、別に特定しない限り、先の実施例９に規定している。
本発明の遺伝子融合を検出するための片側ＰＣＲタイリング法を、形成された最長アンプリコン生成物の収量及びサイズに対するアニーリング／伸長時間の作用を決定するために、試験した。
鋳型は、以下のように作製した：鋳型（Ｔ１＝２３２ｂｐ（長い対照）、Ｔ２＝１７３ｂｐ、Ｔ３＝１５４ｂｐ、Ｔ４＝１２１ｂｐ、Ｔ５＝１１７ｂｐ）を、図１８Ａに概略的に示した適切な標的特異的プライマーを使用する、２つの連続したシングルプレックス反応（すなわち、第一シングルプレックス反応由来のアンプリコンを第二反応の鋳型として使用した）における、ヒトＴＰ５３エクソン４の一部を含んだ２８４ｂｐ鋳型（配列番号：３１１）の増幅により、構築した。これらの鋳型は、Ａｍｐｕｒｅ １．５Ｘビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を、標準の製造業者のプロトコールに従い使用して精製し、且つ１：５希釈した。鋳型ＤＮＡの濃度は、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ １Ｋを用いて決定した。
これらの５種の鋳型を使用し、ＰＣＲ反応のアニーリング／伸長工程について、異なる時間長で分析し、且つ１−段階、対、２−段階ＰＣＲ反応を分析し、プライマーがタイリングされたプライマー結合部位に結合する反応において、最大アンプリコンを作製する条件を確定した。これらの反応は、おおよその循環腫瘍ＤＮＡ断片に対し、上記鋳型（およそ１５０ヌクレオチド長）を使用した（図１８Ａ）。試験時の条件のためのＰＣＲ増幅混合物は、Ｋ２３緩衝液（実施例９参照）、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）３０単位／２００ｕｌ反応混合物、５０ｎＭの各標的−特異的プライマー、及び０．５ｎｇの鋳型を含んだ。これらのプライマーは、最初の２８４ｂｐ鋳型上のタイリングされた一連のプライマー結合部位に対し相補的である一連の８種のタグ付きプライマーであった（図１８Ａ）。タイリングされた一連のプライマー結合部位に結合した８種のフォワードプライマーを設計し、以下のような好適な鋳型の３’末端に対し変動する長さのアンプリコンを作製した：８Ｆ８（２３２ｂｐ）、８Ｆ３（２００ｂｐ）、８Ｆ９（１７３ｂｐ）、８Ｆ１０（１５４ｂｐ）、５Ｆ１（１２７ｂｐ）、５Ｆ８（９４ｂｐ）、５Ｆ９（７２ｂｐ）、５Ｆ３（５１ｂｐ）。括弧内のサイズのアンプリコンを作製するために使用したリバースプライマーは、図１８Ａに示した（例えば、５Ｒ３、５Ｒ４、又は５Ｒ５）。試験したＰＣＲ増幅プロトコールは、表２３に示した１−段階及び２−段階プロトコールであった。フォワード及びリバースプライマーの配列データは、表２２に示した。最長の利用可能な生成物の試料の割合は、
［長い生成物の濃度（ｎＭ）］／合計（［全ての生成物の濃度（ｎＭ）］）
を用い、計算した。
Figure 2019526230
Figure 2019526230
８Ｆ１０＋５Ｒ３（１５４ｂｐインサート）鋳型による一段階及び二段階アニーリングサイクルを使用し得られたアンプリコンの割合及び絶対収量を、各々、表２４及び表２５に一覧としている。プライマー混合物は、８Ｆ１０（１５４ｂｐ）、５Ｆ１（１２７ｂｐ）、５Ｆ８（９４ｂｐ）、５Ｆ９（７２ｂｐ）、及び５Ｆ３（５１ｂｐ）フォワードプライマー、並びに５Ｒ３リバースプライマーを含んだ。タグ付きプライマー蛍光の一段階及び二段階アニーリングサイクルスペクトル、対、アンプリコン長は、図１８Ｂ−１８Ｃに示している。タイリングされたプライマー結合部位を伴うこのマルチプレックスＰＣＲ反応における１５４ｂｐアンプリコンである、長いアンプリコンの収率（％）は、より長いアニーリング時間で一段階プロトコールを使用し１３％から７２％まで、及び二段階プロトコールを使用し６３％から８０％まで、増加した（表２４及び２５参照）。長いアンプリコンの選択性は、９０分間の長いアニーリング時間により、及び短い５１ｂｐプライマーで増幅されたアンプリコンの収率の７０％から２０％への減少により証明されるように、二段階プロトコールにより、改善された。
Figure 2019526230
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変動する長さの他の出発鋳型（２３２ｂｐ鋳型、１２１ｂｐ鋳型、及び１１７ｂｐ鋳型）を使用する長いアンプリコンの収率により証明されるように、この二段階プロトコールは、一段階プロトコールに勝って、より長いアンプリコンについて好ましい（図１９Ａ−１９Ｄ参照）。アニーリング／伸長時間の増加は、２３２ｂｐ鋳型及び１２１ｂｐ鋳型のより長い生成物の収率を増加したのに対し、１１７ｂｐ鋳型は一貫しておよそ７０％を維持した。５１ｂｐアンプリコンに関する長い２３２ｂｐ鋳型増幅選択性は、より長い９０分のアニーリング／伸長時間により減少した。Ｋ２３マスターミックス、イオン強度３００ｎＭは、より低いイオン強度６５ｎＭ、Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ０．３Ｕ／μｌ、２×Ｇｏｌｄ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び０．４ｍＭ ｄＮＴＰを含む「ゴールドマスターミックス」よりも、より長いアンプリコンに関してより大きい選択性を示し、且つより少ない副産物を生じた（例えば、図１９Ｂ−１９Ｃ参照）。
当業者は、先に開示された発明の範囲及び精神内で、多くの改変及び他の実施態様を考案することができる。実際、説明された材料、方法、図面、実験例及び実施態様の変動は、明らかにされた発明の基本的態様を変化することなく、当業者により行われて良い。明らかにされた実施態様のいずれかを、任意の他の明らかにされた実施態様と組合せて用いることができる。
明らかにされた実施態様、実施例及び実験は、開示の範囲を限定することも、以下の実験は実行された実験の全て又は一部であることを表すことも意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするよう努力したが、若干の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。説明された方法の変更は、実験が例証を意味する基本的態様の変化を伴わず行われることは理解されるべきである。

Claims (43)

  1. 哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子中の突然変異を検出する方法であって：
    ａ）ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のプラス鎖フォワード標的−特異的プライマー及びプラス鎖リバースユニバーサルプライマーを配合することにより、最初の反応混合物を形成する工程であって、ここで該核酸断片は、リバースユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のフォワード標的−特異的プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の標的−特異的プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含む工程；
    ｂ）この最初の反応混合物を、最初の増幅条件に供し、一連のフォワード標的−特異的プライマーの一つのプライマー及びリバースユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製された標的アンプリコンを作製する工程；並びに
    ｃ）標的アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子における突然変異を検出する工程：
    を含む、方法。
  2. 前記分析が、超並列シークエンシングを用いて、標的アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を決定することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記プラス鎖フォワード標的−特異的プライマーが、プラス鎖フォワード標的−特異的外側プライマーであり、且つプラス鎖リバースユニバーサルプライマーが、プラス鎖リバースユニバーサル外側プライマーであり、ここで該方法が、分析前に：
    ａ）外側プライマー標的アンプリコン、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、リバース内側ユニバーサルプライマー、並びに１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連の標的−特異的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含み、且つ各々少なくとも１つの外側プライマー標的アンプリコン上に認められ、一連の標的−特異的外側プライマーと同じ方向に伸長反応をプライミングするよう構成された、一連のフォワード標的−特異的内側プライマーを配合することにより、内側プライマー反応混合物を形成する工程；並びに
    ｂ）この内側プライマー反応混合物を、内側プライマー増幅条件に供し、フォワード標的−特異的内側プライマーの一つ及びリバース内側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製される内側プライマー標的アンプリコンを作製する工程であって、ここでその核酸配列が分析されるアンプリコンは、内側プライマー標的アンプリコンを含み、ここで該分析される核酸配列は、外側プライマー標的アンプリコンの一部である工程：
    を更に含む、請求項１記載の方法。
  4. 前記標的−特異的内側プライマー結合部位が、０〜２５ヌクレオチドにより、標的−特異的外側プライマー結合部位と重複している、請求項３記載の方法。
  5. 前記リバース内側ユニバーサルプライマーが、リバース外側ユニバーサルプライマーと同じヌクレオチド配列を含む、請求項３記載の方法。
  6. 前記タイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位及び標的−特異的内側プライマー結合部位は、１〜１００個の標的遺伝子の各々の標的領域上に認められる、請求項３記載の方法。
  7. 前記外側プライマー標的アンプリコンの少なくとも５０％又は少なくとも７５％が、１〜１００個の標的遺伝子の各々の上の外側プライマー標的アンプリコンの少なくとももう一方との重複配列を有し、ここで各標的領域は、５００〜１０，０００ヌクレオチドを含み、且つここで該標的領域は、疾患に関連した既知の突然変異を含む、請求項６記載の方法。
  8. 前記外側プライマー標的アンプリコンの少なくとも５０％及び内側プライマー標的アンプリコンの少なくとも１つが、重複配列を有する、請求項３記載の方法。
  9. 更に：
    ａ）ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、試料から作製された核酸ライブラリー由来の核酸断片、一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー及びマイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを配合することにより、マイナス鎖外側プライマー反応混合物を形成する工程であって、ここで該核酸断片は、マイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマー結合部位を含み、ここで一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマーは、１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー結合部位に結合する５〜２５０のプライマーを含み、ここでマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマー結合部位は、標的−特異的外側プライマーにより標的化された鎖のマイナス鎖上に配置される工程；
    ｂ）このマイナス鎖外側プライマー反応混合物を、増幅条件に供し、一連のマイナス鎖フォワード標的−特異的外側プライマーの一つのプライマー及びマイナス鎖リバース外側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製されたマイナス鎖外側プライマー標的アンプリコンを作製する工程；並びに、
    ｃ）マイナス鎖外側プライマー標的アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子における突然変異を検出する工程：
    を含む、請求項７記載の方法。
  10. 前記方法が分析前に：
    ａ）マイナス鎖外側プライマー標的アンプリコン、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、マイナス鎖リバース内側ユニバーサルプライマー、並びに１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子上で隔てられているタイリングされた一連のマイナス鎖標的−特異的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各々少なくとも１個のマイナス鎖外側プライマー標的アンプリコン上に認められ、一連のマイナス鎖標的−特異的外側プライマーと同じ方向に伸長反応をプライミングするよう構成された、一連のフォワードマイナス鎖標的−特異的内側プライマーを配合することにより、マイナス鎖内側プライマー増幅反応混合物を形成する工程；並びに、
    ｂ）このマイナス鎖反応混合物を、マイナス鎖標的−特異的内側プライマー増幅条件に供し、マイナス鎖フォワード標的−特異的内側プライマーの一つ及びマイナス鎖内側ユニバーサルプライマーを含むプライマー対を用いて作製されるマイナス鎖内側プライマー標的アンプリコンを形成する工程であって、ここでその核酸配列が分析されるアンプリコンが、マイナス鎖内側プライマー標的アンプリコンを含む工程：
    を更に含む、請求項９記載の方法。
  11. 前記マイナス鎖外側プライマー増幅条件が、外側プライマー増幅条件と同じである、請求項９記載の方法。
  12. 前記マイナス鎖内側プライマー増幅条件が、内側プライマー増幅条件と同じである、請求項１０記載の方法。
  13. 前記疾患が、癌である、請求項７〜１０のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記標的遺伝子由来の少なくとも２５の近接ヌクレオチドの、並びに標的遺伝子上、外側プライマー標的アンプリコン及び／又は内側プライマー標的アンプリコン上において認められない哺乳動物のゲノム領域由来の少なくとも２５の近接ヌクレオチドの存在が、標的遺伝子を含む遺伝子融合の指標である、請求項１又は３記載の方法。
  15. 前記一連のプラス鎖標的−特異的外側プライマーが、標的遺伝子に関する既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで該外側プライマー標的アンプリコンが、少なくとも１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む、請求項１又は３記載の方法。
  16. 前記方法が、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１からなる群から選択される、少なくとも１つの融合パートナー遺伝子由来の遺伝子融合を検出する、請求項１４記載の方法。
  17. 前記遺伝子融合が、染色体転座を含む、請求項１６記載の方法。
  18. 前記方法が、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１からなる群から選択される、少なくとも２つの融合パートナー遺伝子由来の遺伝子融合を検出し、且つここで一連の標的−特異的外側プライマーが、該標的遺伝子の各々に関する既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで該外側プライマー標的アンプリコンが、少なくとも１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む、請求項１４記載の方法。
  19. 前記一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及び一連のフォワード標的−特異的内側プライマーの各々が、標的遺伝子に関する既知の融合切断点からの標的距離にある標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで、該外側プライマー標的アンプリコンが、標的距離と長さが同じくらいである少なくとも１つのアンプリコンを含む、請求項３記載の方法。
  20. 前記標的遺伝子が、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１から選択される、請求項１９記載の方法。
  21. 前記標的遺伝子が、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、及びＲＯＳ１からなる群から選択される少なくとも２つの融合パートナー遺伝子を含み、且つここで、一連の該フォワード標的−特異的外側プライマー及び一連のフォワード標的−特異的内側プライマーの各々が、５〜２５０のプライマーを含み、並びに各々が、少なくとも２つの融合パートナー遺伝子の一方の上の少なくとも１つの標的領域に結合し、且つここで、少なくとも１つのプライマーが、少なくとも２つの融合パートナー遺伝子の各々についての既知の融合切断点からの標的距離にある標的プライマー結合部位に結合し、且つここで少なくとも２つの融合パートナー遺伝子の各々に関する外側プライマー標的アンプリコンが、標的距離と長さが同じくらいである少なくとも１つのアンプリコンを含む、請求項１９記載の方法。
  22. 前記一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及び一連のフォワード標的−特異的内側プライマーの各々が、該標的遺伝子の各々に関する既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチド又は２５〜１００ヌクレオチド又は２５〜５０ヌクレオチドである標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含み、且つここで外側プライマー標的アンプリコンが、既知の遺伝子融合切断点に広がる少なくとも１５０ヌクレオチド長であるアンプリコンを含む、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記プライマー増幅条件が、５８℃〜７２℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程を有する、少なくとも５サイクルのＰＣＲを含む、請求項２２記載の方法。
  24. 前記プライマー増幅条件が、５８℃〜６５℃で３０〜１２０分間の外側プライマーアニーリング工程による２〜１０サイクルのＰＣＲの第一セット、及び６８℃〜７２℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による５〜５０サイクルのＰＣＲの第二セットを含む、請求項２２記載の方法。
  25. 前記一連のフォワード標的−特異的外側プライマー及び一連のフォワード標的−特異的内側プライマーの最高Ｔｍが、アニーリング温度よりも２〜１０℃低い、請求項２２記載の方法。
  26. 前記アニーリングが、アニーリング／伸長併用工程で実行される、請求項２４記載の方法。
  27. 前記増幅条件が、５８℃〜７２℃で３０〜１２０分間のアニーリング工程を有する、少なくとも５サイクルのＰＣＲを含む、請求項１記載の方法。
  28. 前記アニーリング工程が、６０〜９０分間の長さである、請求項２７記載の方法。
  29. 前記標的−特異的プライマーの少なくとも５０％の最高Ｔｍが、ＰＣＲ反応に使用されるアニーリング温度よりも１〜１０℃低い、請求項２７又は２８記載の方法。
  30. 前記標的−特異的プライマーのセットの最高Ｔｍが、アニーリング温度よりも２〜１０℃低く、且つここでアニーリングが、アニーリング／伸長併用工程で実行される、請求項２７又は２８記載の方法。
  31. 前記一連の標的−特異的プライマーが、標的遺伝子についての既知の融合切断点から２５〜１５０ヌクレオチドである標的プライマー結合部位に結合する少なくとも１つのプライマーを含む、請求項２７記載の方法。
  32. 標的核酸領域をインビトロにおいて増幅する方法であって：
    ａ）ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、ライブラリー由来の核酸断片、複数の標的−特異的プライマーの第一プール及び第一のリバースユニバーサルプライマーを配合することにより、反応混合物を形成する工程であって、ここで該ライブラリーの核酸断片が、ユニバーサルリバースプライマー結合部位を含み、且つここで該複数の標的−特異的プライマーが、１０〜５０ヌクレオチドにより標的遺伝子の標的領域上で隔てられているタイリングされた一連のプライマー結合部位に結合することが可能である５〜２５０のプライマーを含む工程；並びに
    ｂ）該反応混合物を増幅条件に供し、長さが１００〜２００ヌクレオチドのアンプリコンを形成し、ここで該増幅条件が、５８℃〜７２℃で３０〜１２０分間のアニーリング工程を含み、これにより標的核酸領域を増幅する工程：
    を含む方法。
  33. 前記標的−特異的プライマー増幅条件が、５８℃〜７２℃で６０〜９０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程を有する少なくとも５サイクルのＰＣＲを含む、請求項１又は３２記載の方法。
  34. 前記標的−特異的プライマー増幅条件が、５８℃〜６５℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による２〜１０サイクルのＰＣＲの第一セット、及び６８℃〜７２℃で３０〜１２０分間の標的−特異的外側プライマーアニーリング工程による５〜５０サイクルのＰＣＲの第二セットを含む、請求項１又は３２記載の方法。
  35. 前記標的−特異的外側プライマーの５０％の最高Ｔｍは、ＰＣＲ反応に使用したアニーリング温度よりも１〜１０℃低い、請求項３３又は３４記載の方法。
  36. 前記標的−特異的プライマーのセットの最高Ｔｍは、アニーリング温度よりも２〜１０℃低い、請求項３３又は３４記載の方法。
  37. 前記アニーリングが、アニーリング／伸長併用工程で実行される、請求項３６記載の方法。
  38. 哺乳動物由来の試料又はその画分中の標的遺伝子が関与する融合を検出する方法であって：
    ａ）試料中の核酸を、標的遺伝子の標的領域にわたる片側ＰＣＲタイリング反応に供し、外側プライマー標的アンプリコンを作製し、ここで該タイリング反応が、リバース外側ユニバーサルプライマー、及び１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子の標的領域上で隔てられているタイリングされた一連の外側標的プライマー結合部位に結合する５〜２５０のフォワード外側標的−特異的プライマーを使用し実行される工程；並びに
    ｂ）標的アンプリコンの少なくとも一部の核酸配列を分析し、これにより標的遺伝子中の突然変異を検出する工程；
    を含む、方法。
  39. リバース内側ユニバーサルプライマー、及び１０〜１００個のヌクレオチドにより標的遺伝子の標的領域上で隔てられている一連のタイリングされた標的内側プライマー結合部位に結合する５〜２５０プライマーを含み、且つ各々少なくとも１つの外側プライマー標的アンプリコン上に認められた、一連のフォワード標的−特異的内側プライマーを使用し、外側プライマー標的アンプリコンを増幅することにより、第二の片側ＰＣＲタイリング反応を実行し、フォワード内側プライマー標的アンプリコンを作製する工程を更に含み、ここで該フォワード標的−特異的内側プライマーが、一連の標的−特異的外側プライマーと同じ方向で伸長反応をプライミングするように構成され、且つここでその核酸配列が分析される標的アンプリコンが、フォワード内側プライマー標的アンプリコンを含む、請求項３８記載の方法。
  40. 前記標的−特異的内側プライマー結合部位が、５〜２０ヌクレオチドにより、標的−特異的外側プライマー結合部位と重複している、請求項３９記載の方法。
  41. 前記標的領域が、遺伝子融合に関与していることがわかっている標的遺伝子の領域を含む、請求項３９記載の方法。
  42. 前記タイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位が、１０〜７５ヌクレオチド又は１５〜５０ヌクレオチドにより、標的領域上で隔てられている、請求項１又は３８記載の方法。
  43. 前記タイリングされた一連の標的−特異的外側プライマー結合部位及び標的−特異的内側プライマー結合部位が、２〜５０の標的遺伝子の各々の標的領域上で選択される、請求項３９記載の方法。
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