ES2748457T3 - Procedimiento para identificación y enumeración de cambios en la secuencia de ácido nucleico, expresión, copia o metilación de ADN, usando reacciones combinadas de nucleasa, ligasa, polimerasa y secuenciación - Google Patents

Procedimiento para identificación y enumeración de cambios en la secuencia de ácido nucleico, expresión, copia o metilación de ADN, usando reacciones combinadas de nucleasa, ligasa, polimerasa y secuenciación Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico, en el que dicho procedimiento comprende: proporcionar una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario, en la que cada construcción comprende: un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped, en el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una porción de identificador único, en la que la secuencia de nucleótidos de la porción de identificador único y del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de cualquier otra construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección, en el que dichas construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección están circularizadas y son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación; mezclar la colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario con una polimerasa y una pluralidad de cebadores cortos que tienen una longitud de 6 a 10 nucleótidos y comprenden bases aleatorias y/o análogos de nucleótidos, en el que uno o más de los cebadores cortos son complementarios a una porción de una o más construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección; con lo que dicho mezclado forma una mezcla de reacción de amplificación; y someter la mezcla de reacción de amplificación a uno o más tratamientos de hibridación y extensión, en los que el uno o más cebadores cortos hibridan con las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario y la polimerasa extiende los cebadores cortos hibridados para producir una pluralidad de productos de extensión, en el que cada producto de extensión comprende dos o más secuencias lineales en tándem, en el que cada secuencia lineal en tándem es complementaria a una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para identificación y enumeración de cambios en la secuencia de ácido nucleico, expresión, copia o mutilación de ADN, usando reacciones combinadas de nucleasa, ligasa, polimerasa y secuenciación
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a un procedimiento para la captura altamente específica y dirigida de regiones de genomas y transcriptomas humanos de la sangre, es decir, de ADN libre circulante, exosomas, microARN, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales, para permitir la detección altamente sensible de cambios por mutación, expresión, número de copias, translocación, empalme alternativo y metilación usando reacciones combinadas de nucleasa, fijación, polimerasa y secuenciación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los avances en la secuenciación del ADN prometen estandarizar y desarrollar diagnósticos moleculares no invasivos para mejorar la atención prenatal, la eficacia del trasplante, la detección del cáncer y de otras enfermedades y el tratamiento individualizado. Actualmente, los pacientes con enfermedad predisponente o incipiente no están identificados, y aquellos con enfermedad no reciben el mejor tratamiento, todo debido a fallos a nivel de diagnóstico.
En el campo del cáncer existe la necesidad de desarrollar dicha tecnología para la detección temprana, el tratamiento guiado y la monitorización de la recidiva, todo a partir de una muestra de sangre. Esto incluye la necesidad de desarrollar: (i) detección de alta sensibilidad de mutaciones de una sola base, mutaciones por inserciones pequeñas y deleciones pequeñas en genes conocidos (cuando están presentes en un 1 % a un 0,01 % de ADN libre circulante); (ii) detección de alta sensibilidad de la hipermetilación e hipometilación de promotores (cuando está presente en un 1 % a un 0,01 % de ADN libre circulante); (iii) cuantificación exacta de ARNm, ARNlnc (ARN largo no codificante) y miARN específico de tumor aislado de exosomas derivados de tumor o complejo RISC, o células tumorales circulantes en sangre; (iv) cuantificación exacta de cambios de copia específicos de tumor en el ADN aislado de células tumorales circulantes; (v) cuantificación exacta de mutaciones, hipermetilación e hipometilación de promotores en ADN aislado de células tumorales circulantes. Todos estos (excepto la cuantificación de los cambios de copia específicos del tumor en ADN aislado de células tumorales circulantes) requieren centrar la secuenciación en genes o regiones específicas del genoma. Además, la determinación de la información de secuencia o el estado de metilación a partir de ambas hebras del fragmento original proporciona la confirmación críticamente necesaria de acontecimientos raros.
El plasma normal contiene ácidos nucleicos liberados de células normales que experimentan procesos fisiológicos normales (es decir, exosomas, apoptosis). Puede existir una liberación adicional de ácidos nucleicos en condiciones de estrés, inflamación, infección o lesión. En general, el ADN se libera de células apoptóticas en un promedio de 160 pb de longitud, mientras que el ADN de células fetales lo hace en un promedio de aproximadamente 140 pb. El plasma de un paciente con cáncer contiene ácidos nucleicos liberados de las células cancerosas que experimentan procesos fisiológicos anómalos, así como dentro de las células tumorales circulantes (CTC). Del mismo modo, el plasma de una mujer embarazada contiene ácidos nucleicos liberados de las células fetales.
Existen varios desafíos para desarrollar pruebas fiables de diagnóstico y cribado. El primer desafío es distinguir aquellos marcadores que emanan del tumor o del feto que son indicativos de enfermedad (es decir, cáncer incipiente) frente a la presencia de los mismos marcadores que emanan del tejido normal. También existe la necesidad de equilibrar el número de marcadores examinados y el coste de la prueba, con la especificidad y sensibilidad del ensayo. Este es un desafío que debe abordar la variación biológica en enfermedades tales como el cáncer. En muchos casos, el ensayo debe servir como una herramienta de cribado, que requiere la disponibilidad de un seguimiento diagnóstico secundario (es decir, colonoscopia, amniocentesis). El problema biológico se agrava con la necesidad de detectar de manera fiable las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico o las diferencias en la metilación de los promotores, o cuantificar de manera fiable el número de copias de ADN o ARN a partir de un número muy pequeño de células iniciales (es decir, de CTC) o cuando la señal específica del feto o cáncer está en presencia de una mayoría de ácido nucleico que emana de células normales. Finalmente, existe el desafío técnico de distinguir la señal verdadera resultante de la detección de las diferencias en ácido nucleico específicas de la enfermedad deseada frente a la señal falsa generada por ácidos nucleicos normales presentes en la muestra frente a la señal falsa generada en ausencia de las diferencias del ácido nucleico específicas de la enfermedad.
A modo de ejemplo, considerar el desafío de detectar, en plasma, la presencia de ADN tumoral circulante que alberga una mutación en el gen p53 o una región promotora metilada. Dicha muestra contendrá una mayoría de ADN libre circulante procedente de células normales, donde el ADN tumoral solo puede comprender el 0,01 % del ADN libre circulante total. Por tanto, si se intentara encontrar la presencia de dicho ADN mutante mediante secuenciación total, sería necesario secuenciar 100.000 genomas para identificar 10 genomas que albergan las mutaciones. Esto requeriría secuenciar 300.000 GB de ADN, una tarea que está fuera del alcance de la tecnología de secuenciación actual, sin mencionar los enormes problemas de gestión de datos. Para evitar este problema, muchos grupos han intentado capturar regiones diana específicas o amplificar por PCR las regiones en cuestión. La captura de secuencias ha sufrido un abandono, de modo que quizás se captura el 90-95 % de las secuencias deseadas, pero faltan los fragmentos deseados. De forma alternativa, la amplificación por PCR proporciona el riesgo de introducir un error raro que no se pueda distinguir de una mutación verdadera. Además, la PCR pierde información de metilación. Si bien el tratamiento con bisulfito se ha utilizado tradicionalmente para determinar la presencia de la metilación de promotores, también es destructivo para la muestra de ADN y carece de la capacidad de identificar múltiples cambios en la metilación del ADN libre circulante.
Existen varios enfoques diferentes para reducir la tasa de error y mejorar la exactitud de las secuenciaciones. Se puede lograr una exactitud consensuada en presencia de altas tasas de error secuenciando la misma región de ADN una y otra vez. Sin embargo, una alta tasa de error hace que sea extremadamente difícil identificar una variante de secuencia en baja abundancia, por ejemplo, cuando se intenta identificar una mutación cancerosa en presencia de ADN normal. Por lo tanto, se requiere una tasa de error baja para detectar una mutación en abundancia relativamente baja.
El primer enfoque denominado procedimiento de secuenciación profunda de amplicón etiquetado (TAm-Seq) (Forshew et al., "Noninvasive Identification and Monitoring of Cancer Mutations by Targeted Deep Sequencing of Plasma DNA", Sci Transl Med. 4(136):136 (2012)) se basa en el diseño de cebadores para amplificar 5995 bases que cubrían regiones seleccionadas de genes relacionados con el cáncer, incluidos TP53, EGFR, BRAF y KRAS. Este enfoque es capaz de identificar mutaciones en el gen p53 a frecuencias del 2 % al 65 %. En este enfoque, los cebadores se diseñan para preamplificar el ADN (durante 15 ciclos) en una reacción multiplexada con muchos cebadores de PCR. Esto crea productos tanto deseados como no deseados, por lo que se sigue por PCR monoplexada para amplificar adicionalmente cada uno de los productos deseados. Los fragmentos se someten a una PCR con código de barras final antes de la secuenciación estándar de nueva generación. La ventaja de este enfoque es que utiliza la PCR-PCR multiplexada sometida a prueba en el tiempo, que es incomparable para la amplificación de un bajo número de ácidos nucleicos iniciales. La desventaja es que este enfoque es incapaz de distinguir una mutación verdadera de un error de PCR en las primeras rondas de amplificación. Por tanto, si bien la sensibilidad del 2 % (es decir, detectar un alelo mutante entre 50 alelos en peso) es suficiente para evaluar los cánceres en estadio tardío antes de tomar una decisión de tratamiento, no es lo suficientemente sensible para la detección precoz.
Una variación del primer enfoque se denomina sistema de secuenciación segura "Safe-SeqS" (Kinde et al., "Detection and Quantification of Rare Mutations with Massively Parallel Sequencing", Proc Natl Acad Sci USA 108(23):9530-5 (2011)), donde se agrega ADN genómico cortado al azar en los extremos de los conectores fijados al ADN genómico. El enfoque demostró que la gran mayoría de las mutaciones descritas a partir de la secuenciación genómica son en realidad errores, y redujeron los errores de secuenciación presuntos en al menos 70 veces. Del mismo modo, un enfoque llamado secuenciación profunda ultrasensible (Narayan et al., "Ultrasensitive Measurement of Hotspot Mutations in Tumor DNA in Blood Using Error-suppressed Multiplexed Deep Sequencing", Cancer Res.
72(14):3492-8 (2012)) agrega códigos de barras en cebadores para una amplificación por PCR con cebadores internos. Presumiblemente, se desarrolló un sistema similar de agregación de códigos de barras para detectar mutaciones raras y variaciones en el número de copias que dependen de herramientas bioinformáticas (Talasaz, A.; Systems and Methods to Detect Rare Mutations and Copy Number Variation, solicitud de patente de EE. UU.
2014/0066317 A1, 6 de marzo de 2014). Las lecturas de ambos extremos se usan para cubrir la región que contiene la presunta mutación. Este procedimiento se usó para rastrear mutaciones conocidas en plasma de pacientes con cáncer en estadio tardío. Estos enfoques requieren muchas lecturas para establecer secuencias consenso. Ambos procedimientos requieren extenderse a través del ADN diana y, por tanto, sería imposible distinguir la mutación verdadera del error generado por la polimerasa, especialmente al copiar a través de una base dañada, tal como la citosina desaminada. Finalmente, estos procedimientos no proporcionan información sobre el estado de metilación de los sitios CpG dentro del fragmento.
El segundo enfoque denominado secuenciación dúplex (Schmitt et al., "Detection of Ultra-Rare Mutations by Next-Generation Sequencing", Proc Natl Acad Sci USA 109(36):14508-13 (2012)) se basa en el uso de conectores dúplex que contienen marcas de 12 bases aleatorizadas. Al amplificar las hebras superior e inferior del ADN diana entrante, un fragmento dado obtiene un identificador único (compuesto de 12 bases en cada extremo) de modo que se pueda rastrear por medio de secuenciación. Las lecturas de secuencia que comparten un conjunto único de marcas se agrupan en familias emparejadas con miembros que tienen identificadores de hebra en la orientación de hebra superior o inferior. Cada par familiar refleja la amplificación de un fragmento de ADN bicatenario. Las mutaciones presentes en solo uno o unos pocos miembros de la familia representan fallos de secuenciación o errores introducidos por PCR que ocurren más adelante en la amplificación. Las mutaciones que ocurren en muchos o todos los miembros de una familia en un par se derivan de errores de PCR durante la primera ronda de amplificación, tal como puede ocurrir al copiar en sitios de daño en ADN mutágeno. Por otra parte, las mutaciones verdaderas presentes en ambas hebras de un fragmento de ADN aparecen en todos los miembros de un par familiar. Mientras que las mutaciones artefactuales pueden producirse conjuntamente en un par familiar con una mutación verdadera, todas, excepto las que surgen durante la primera ronda de amplificación por PCR, se pueden identificar y descartar independientemente cuando se produce una secuencia consenso monocatenaria con corrección de errores. Las secuencias obtenidas de cada una de las dos hebras de un dúplex de ADN individual se pueden comparar a continuación para obtener la secuencia consenso dúplex, que elimina los errores restantes que se produjeron durante la primera ronda de PCR. La ventaja de este enfoque es que distingue inequívocamente las mutaciones verdaderas de los errores de PCR o del daño en el ADN mutágeno, y logra una tasa de error extraordinariamente baja de 3,8 x 10-10 La desventaja de este enfoque es que es necesario secuenciar muchos fragmentos para obtener al menos cinco miembros de cada hebra en un par familiar (es decir, un mínimo de 10 lecturas de secuencia por cada fragmento original, pero a menudo requieren mucho más debido a las fluctuaciones). Además, el procedimiento no se ha sometido a prueba en ADNlc, que tiende a ser más pequeño que los fragmentos generados a partir de ADN genómico intacto y, por tanto, requeriría secuenciar más fragmentos para cubrir todas las mutaciones potenciales. Finalmente, el procedimiento no proporciona información sobre el estado de metilación de los sitios CpG dentro del fragmento.
El tercer enfoque, denominado smMIP por sondas de inversión molecular de molécula única (Hiatt et al., "Single Molecule Molecular Inversion Probes for Targeted, High-Accuracy Detection of Low-Frequency Variation", Genome Res. 23(5):843-54 (2013) combina el marcado de una sola molécula con la captura múltiple para permitir la detección altamente sensible de la variación subclonal de baja frecuencia. El procedimiento reivindica una tasa de error de 2,6 x 10-5 en muestras clínicas. La desventaja de este enfoque es que es necesario secuenciar muchos fragmentos para obtener al menos cinco miembros de cada hebra en un par familiar (es decir, un mínimo de 10 lecturas de secuencia por cada fragmento original, pero a menudo requieren mucho más debido a las fluctuaciones). Además, el procedimiento requiere extenderse a través del ADN diana y, por tanto, sería imposible distinguir la mutación verdadera del error generado por la polimerasa, especialmente al copiar a través de una base dañada, tal como la citosina desaminada. Además, el procedimiento no se ha sometido a prueba en ADNlc, que tiende a ser más pequeño que los fragmentos generados a partir de ADN genómico intacto y, por tanto, requeriría secuenciar más fragmentos para cubrir todas las mutaciones potenciales. Finalmente, el procedimiento no proporciona información sobre el estado de metilación de los sitios CpG dentro del fragmento.
El cuarto enfoque, denominado secuenciación circular (Lou et al., "High-throughput DNA Sequencing Errors are Reduced by Orders of Magnitude Using Circle Sequencing", Proc Natl Acad Sci USA 110(49):19872-7 (2013), véanse también "Mutational and fitness landscapes of an RNA virus revealed through population sequencing", Acevedo A, Brodsky L, Andino R., Nature 2014, Ene 30;505(7485):686-90; y "Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses", Acevedo A, Andino R. Nat Protocol. 2014 Jul;9(7):1760-9) se basa en el corte de ADN o ARN a aproximadamente 150 bases, desnaturalización para formar hebras simples, circularización de dichas hebras simples usando cebadores hexámeros aleatorios y ADN polimerasa phi29 para la amplificación por círculo rodante (en la presencia de uracilo-ADN glicosilasa y formamidopirimidina-ADN glicosilasa), volviendo a cortar los productos a aproximadamente 500 bases y a continuación procediendo con la secuenciación estándar de nueva generación. La ventaja de este enfoque es que la amplificación por círculo rodante prepara múltiples copias en tándem del ADN diana original, de modo que un error de polimerasa puede aparecer en una sola copia, pero una mutación verdadera aparece en todas las copias. Las familias de lectura tienen un promedio de 3 copias porque las copias están físicamente unidas entre sí. El procedimiento también utiliza uracilo-ADN glicosilasa y formamidopirimidina-ADN glicosilasa para eliminar dianas que contienen bases dañadas, para eliminar dichos errores. La ventaja de esta tecnología es que lleva la tasa de error de secuenciación de un nivel actual de aproximadamente 0,1 a 1 x 10-2 a una tasa de tan solo 7,6 x 10-6. La última tasa de error es ahora suficiente para distinguir las mutaciones cancerosas en plasma en presencia de un exceso de 100 a 10.000 veces de ADN natural. Una ventaja adicional es que 2-3 copias de la misma secuencia están unidas físicamente, lo que permite la verificación de una mutación verdadera a partir de datos de secuencia generados a partir de un solo fragmento, a diferencia de los al menos 10 fragmentos necesarios usando el enfoque de secuenciación dúplex. Sin embargo, el procedimiento no proporciona la capacidad de determinar los cambios en el número de copias, ni proporciona información sobre el estado de metilación de los sitios CpG dentro del fragmento.
El quinto enfoque, desarrollado por Complete Genomics (Drmanac et al., "Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays", Science 327(5961):78-81 (2010)) se basa en el uso de lecturas de fijación en matrices de nanobolas. Aproximadamente 400 nucleótidos de ADN genómico se circularizan con conectores, se escinden, se recircularizan con conectores adicionales y finalmente se recircularizan para contener aproximadamente cuatro conectores. El ADN se somete a una amplificación por círculo rodante utilizando la ADN polimerasa phi29 para generar nanobolas. Estas se colocan a continuación en una matriz y se secuencian usando un enfoque basado en fijación. El punto sobresaliente de este enfoque, de relevancia en el presente documento, es que se pueden generar múltiples copias en tándem de la misma secuencia y posteriormente secuenciar a partir de un único producto de amplificación por círculo rodante. Dado que la misma secuencia es interrogada múltiples veces por ligasa o polimerasa (combinando el círculo rodante con otra secuenciación por enfoques de síntesis), la tasa de error por cada base se puede reducir significativamente. Como tal, la secuenciación directamente a partir de un producto de círculo rodante proporciona muchas de las ventajas del enfoque de secuenciación circular descrito anteriormente.
El sexto enfoque, denominado secuenciación en tiempo real de una sola molécula SMRT (Flusberg et al., "Direct Detection of DNA Methylation During Single-Molecule, Real-Time Sequencing", Nat Methods 7(6):461-5 (2010)) se basa en añadir bucles de horquilla en los extremos de un fragmento de ADN y permitir que una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra se extienda alrededor del bucle cerrado covalentemente, proporcionando información de secuencia sobre las dos hebras complementarias. Específicamente, las moléculas individuales de polimerasa catalizan la incorporación de nucleótidos marcados fluorescentemente en hebras complementarias de ácido nucleico. La polimerasa se ralentiza o "interrumpe su actividad" cuando se incorpora un nucleótido opuesto a una base metilada, y los pulsos de fluorescencia resultantes permiten la detección directa de nucleótidos modificados en el molde de ADN, incluyendo N6-metiladenina, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina. La exactitud del enfoque ha mejorado, especialmente porque la polimerasa puede atravesar el bucle cerrado varias veces, lo que permite la determinación de una secuencia consenso. Aunque la técnica está diseñada para proporcionar información de secuencia sobre sustratos con forma de "mancuerna" (que contienen principalmente las dos secuencias complementarias de un fragmento lineal de ADN), también se puede aplicar a sustratos circulares monocatenarios.
El documento WO2013036929 se refiere a procedimientos para obtener una secuencia, tal como una secuencia consenso o una secuencia de haplotipo que, en determinados modos de realización, implican determinar una cantidad de ácido nucleico amplificable presente en una muestra, dividiendo el ácido nucleico en función de los resultados de la etapa de determinación de modo que cada porción dividida incluye, en promedio, un subconjunto de secuencias únicas, secuenciando el ácido nucleico para obtener lecturas de secuencia y ensamblando una secuencia consenso a partir de las lecturas.
Hamzeh-Mivehroud et al. 2013 Drug Discov Today 18:1144-57 analiza la tecnología de presentación en fagos en el contexto del descubrimiento de fármacos peptídicos.
La presente invención está dirigida a superar estas y otras carencias en la técnica.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define por las reivindicaciones.
Una divulgación se dirige a una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Cada construcción de la colección comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. El segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario comprende una porción de identificador único, en el que la secuencia de nucleótidos tanto de la porción de identificador único como del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de todas las demás construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se circularizan y son adecuadas para la amplificación por círculo rodante y/o secuenciación.
Otra divulgación se dirige a un sistema que comprende
una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Cada construcción de la colección comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. La secuencia de nucleótidos del segundo segmento de ácido nucleico monocatenario comprende una porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido y una secuencia de identificador de paciente. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se circularizan y son adecuadas para la amplificación por círculo rodante y/o secuenciación. El sistema comprende además una colección de productos de extensión, en el que cada producto de extensión comprende dos o más secuencias lineales en tándem complementarias a la construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección. Cada producto de extensión de la colección hibrida con su construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario complementaria de la colección.
Otra divulgación se dirige a un sistema que comprende una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Cada construcción comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. La secuencia de nucleótidos del segundo segmento de ácido nucleico monocatenario comprende una porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido y una secuencia de identificador de paciente. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación. El sistema comprende además uno o más cebadores de amplificación de oligonucleótidos, en el que cada cebador comprende al menos una primera porción de secuencia de nucleótidos que es complementaria a la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido o la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección; y una polimerasa adecuada para la amplificación por círculo rodante.
Otras divulgaciones se dirigen a procedimientos de secuenciación de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico en una muestra usando la colección y los sistemas divulgados en el presente documento.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases y generar, en la muestra, ADNc de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana, si están presentes en la muestra. El procedimiento implica además proporcionar una o más primeras sondas de oligonucleótido, en el que cada primera sonda de oligonucleótido comprende (a) una porción de secuencia específica de diana de ADNc 3', (b) una porción específica de diana de ADNc 5', y una porción adicional, en el que dicha porción adicional comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii), y poner en contacto la muestra y la o más primeras sondas de oligonucleótido en condiciones eficaces para que las porciones específicas de diana 3' y 5' de las primeras sondas de oligonucleótido hibriden de una manera específica según las bases con regiones complementarias del ADNc. Se genera uno o más puntos de unión aptos para fijación adecuados para acoplar los extremos 3' y 5' de una primera sonda de oligonucleótido hibridada con su ADNc complementario y la una o más primeras sondas de oligonucleótido en el uno o más puntos de unión para fijación se fijan para formar productos fijados circulares que comprenden una copia de ácido desoxirribonucleico de la secuencia de ácido ribonucleico diana acoplada a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido. El procedimiento implica además detectar y distinguir los productos fijados circulares en la muestra para identificar la presencia de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido ribonucleico de la muestra en una o más bases.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido nucleico que potencialmente comprenden distintas regiones de primera diana y segunda diana acopladas entre sí. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene potencialmente una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden distintas regiones de primera diana y segunda diana acopladas entre sí, y proporcionar uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótido, en el que cada conjunto de sondas comprende (i) una primera sonda de oligonucleótido que comprende una porción específica de primera diana 5', una porción específica de segunda diana 3', y una porción adicional, y (ii) una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una porción específica de segunda diana 5', una porción específica de primera diana 3', y una porción adicional, en la que la porción adicional de la primera o segunda sonda de oligonucleótido de un conjunto de sondas comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). Este procedimiento implica además poner en contacto la muestra y el uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótido en condiciones eficaces para que la primera y segunda sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas hibriden de una manera específica según las bases con sus regiones de primera y segunda diana correspondientes de la molécula de ácido nucleico, si están presentes en la muestra, y generar uno o más puntos de unión aptos para fijación adecuados para acoplar los extremos 3' de las primeras sondas de oligonucleótido a los extremos 5' de las segundas sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas y para acoplar los extremos 5' de las primeras sondas de oligonucleótido a los extremos 3' de segundas sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas cuando dichos conjuntos de sondas hibridan con regiones de primera y segunda diana complementarias de una molécula de ácido nucleico. El primer y el segundo oligonucleótidos de un conjunto de sondas se unen al uno o más puntos de unión aptos para fijación para formar productos fijados circulares que comprenden una secuencia de nucleótidos correspondiente a las regiones de primera y segunda diana distintas de una molécula de ácido nucleico acoplada a una porción adicional, y los productos fijados circulares se detectan y distinguen en la muestra, identificando de este modo la presencia, si la hay, de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden distintas regiones de primera diana y segunda diana acopladas entre sí en la muestra.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases y agregar conectores de nucleótidos a los extremos 3' y 5' de las moléculas de ácido ribonucleico diana de la muestra. Este procedimiento implica además proporcionar una o más sondas de oligonucleótido, en el que cada sonda de oligonucleótido comprende (a) una porción 3' complementaria al conector de nucleótidos 3' de la molécula de ácido ribonucleico diana, (b) una porción 5' complementaria al conector de nucleótidos 5' de las moléculas de ácido ribonucleico diana, y (c) una porción adicional, en el que dicha porción adicional comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). La muestra se pone en contacto con la una o más sondas de oligonucleótido en condiciones eficaces para que las porciones 3' y 5' de las sondas de oligonucleótido hibriden de una manera específica según las base con conectores de nucleótidos complementarios en las moléculas de ácido ribonucleico diana, si están presentes en la muestra. El extremo 3' de la sonda de oligonucleótido hibridada se extiende para generar un complemento de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana, y el extremo extendido 3' de la sonda de oligonucleótido se une al extremo 5' de la sonda de oligonucleótido para formar un producto fijado circular que comprende una secuencia complementaria al conector de nucleótidos 3' de la molécula de ácido ribonucleico diana, una secuencia complementaria al conector de nucleótidos 5' de la molécula de ácido ribonucleico diana, el complemento de la una o más moléculas de ácido ribonucleico diana, y el porción adicional de la sonda de oligonucleótido. Este procedimiento implica además detectar y distinguir los productos fijados circulares en la muestra, identificando de este modo la presencia de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases, y unir los conectores de nucleótidos a los extremos 3' y 5' de las moléculas de ácido ribonucleico diana de la muestra, en el que dichos conectores de nucleótidos están acoplados entre sí por una porción adicional, en el que dicha porción adicional comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii), con lo que dicha fijación forma un producto de fijación circular que comprende la molécula de ácido ribonucleico diana, las secuencias de conectores de nucleótidos 3' y 5' y la porción adicional. Este procedimiento implica además proporcionar uno o más primeros cebadores de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de conector de nucleótidos 3' o 5' del producto de fijación circular, e hibridar el uno o más primeros cebadores de oligonucleótidos con el producto de fijación circular de una manera específica según las bases. El extremo 3' del primer cebador de oligonucleótido se extiende para generar un complemento del producto de fijación circular, y los complementos del producto de fijación circular de la muestra se detectan y distinguen, identificando de este modo la presencia de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases, y proporcionar uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótido, en el que cada conjunto comprende (a) una primera sonda de oligonucleótido que tiene una porción de tallo-bucle 5' y una porción 3' complementaria a una porción 3' de la molécula de ácido ribonucleico diana, (b) una segunda sonda de oligonucleótido que tiene una porción 3' complementaria a una copia del extremo 5' de la molécula de ácido ribonucleico diana, una porción 5' complementaria a la porción de tallo-bucle 5' de la primera sonda de oligonucleótido, y una porción adicional que comprende (i) una secuencia de identificador de diana única, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una secuencia de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). El procedimiento implica además mezclar la muestra, la una o más primeras sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas, y una retrotranscriptasa para formar una reacción de retrotranscriptasa, y extender el extremo 3' de la primera sonda de oligonucleótido hibridada con su molécula de ácido ribonucleico diana complementaria para generar un complemento de la molécula de ribonucleótidos diana, si está presente en la muestra. Las una o más segundas sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas hibridan con las primeras sondas de oligonucleótido extendidas que comprenden un complemento de las secuencias de ribonucleótido diana, y se generan uno o más puntos de unión aptos para fijación entre los extremos 3' y 5' de cada segunda sonda de oligonucleótido hibridada con una primera sonda de oligonucleótido extendida. El procedimiento implica además unir los extremos 3' y 5' de cada segunda sonda de oligonucleótido para formar productos fijados circulares que comprenden una copia de ácido desoxirribonucleico de la secuencia de ácido ribonucleico diana acoplada a la porción adicional de la segunda sonda de oligonucleótido. Los productos fijados circulares de la muestra se detectan y distinguen, identificando de este modo la presencia de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases.
La importancia de la divulgación es que enseña un procedimiento para la captura altamente específica y dirigida de regiones de genomas y transcriptomas humanos de la sangre, es decir, de ADN libre circulante, exosomas, microARN, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales, para permitir la detección altamente sensible de cambios por mutación, expresión, número de copias, translocación, empalme alternativo y metilación adecuados para su uso en un modo de diagnóstico de alto rendimiento. Las construcciones monocatenarias de la divulgación son adecuadas para la lectura mediante una serie de tecnologías diferentes, incluyendo la secuenciación de nueva generación, y están diseñadas para ser independientes de la tecnología de lectura. Para maximizar la sensibilidad de la captura, la divulgación utiliza no solo la hibridación sino también la extensión por polimerasa y fijación para disminuir los positivos falsos. Para maximizar la especificidad, las sondas no fijadas se digieren con exonucleasa, preservando las secuencias diana circularizadas. Se puede obtener especificidad adicional mediante la secuenciación de repeticiones en tándem de la secuencia genómica original producida por amplificación por círculo rodante. Finalmente, en el presente documento se divulga un procedimiento para capturar repeticiones en tándem producidas a partir de la secuencia genómica original, generadas por amplificación por círculo rodante sobre una superficie y sometiéndolas a continuación a secuenciación por síntesis, permitiendo de este modo una detección de mutaciones altamente exacta, estado de metilación y enumeración de transcriptoma. El procedimiento es especialmente adecuado para identificar marcadores específicos de cáncer directamente de la sangre, para el cribado del cáncer, así como para monitorizar la eficacia y recidiva del tratamiento. El procedimiento también es adecuado para el diagnóstico prenatal de anomalías de copia y enfermedades mendelianas directamente de la sangre materna.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra un enfoque para amplificar las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la divulgación en preparación para la secuenciación de nueva generación. Este enfoque usa la amplificación por círculo rodante (ACR) o la replicación por círculo rodante (RCR) con hexámeros aleatorios.
La Figura 2 muestra un procedimiento para generar copias lineales en tándem de moléculas de ácido nucleico bicatenario, adecuadas para secuenciación, a partir de un producto de ACR.
La Figura 3 muestra un procedimiento para generar copias lineales en tándem de moléculas de ácido nucleico, adecuadas para secuenciación. Este procedimiento selecciona específicamente los fragmentos que se metilaron en todos los sitios Bstil1 del ADN diana inicial.
La Figura 4 muestra enfoques alternativos para amplificar las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación en preparación para la secuenciación de nueva generación. Este enfoque utiliza ACR con un único cebador específico en solución o sobre una superficie. La Figura 5 ilustra un enfoque para condensar amplicones de ADN lineales generados en ACR o RCR en una estructura compacta antes de capturarlos sobre una superficie de una cubeta de lectura de secuenciación.
La Figura 6 representa un procedimiento para secuenciar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico en una muestra usando el sistema y los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 7 representa un procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico y capturar los amplicones resultantes sobre un soporte sólido adecuado para la secuenciación de nueva generación. La Figura 8 muestra el procedimiento de secuenciación de amplicones preparados de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación sobre la superficie de un soporte sólido.
La Figura 9 representa un procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico y capturar los amplicones resultantes sobre un soporte sólido adecuado para la secuenciación de nueva generación. La secuenciación de los amplicones inmovilizados se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 8.
La Figura 10 representa otro procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico y capturar los amplicones resultantes sobre un soporte sólido adecuado para la secuenciación de nueva generación. La secuenciación de los amplicones inmovilizados se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 8.
La Figura 11 representa otro procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico y capturar los amplicones resultantes sobre un soporte sólido adecuado para la secuenciación de nueva generación. La secuenciación de los amplicones inmovilizados se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos mostrados en la Figura 8.
La Figura 12 representa la amplificación por círculo rodante de un diana circular para generar ADN de molde de repetición en tándem monocatenario para capturarlo sobre un soporte sólido que comprende cebadores duales.
La Figura 13 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 14 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 15 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 16 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 17 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 18 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 19 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 20 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 21 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 22 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 23 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 24 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 25 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 26 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación.
La Figura 27 muestra un procedimiento para detectar la metilación en sitios HinP1 contiguos en secuencias genéticas conocidas.
La Figura 28 representa un procedimiento para detectar la metilación en sitios HinP1 contiguos en todo el genoma.
La Figura 29 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios de metilación AciI contiguos.
La Figura 30 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios de metilación AciI contiguos. La Figura 31 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios de metilación AciI contiguos.
La Figura 32 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios de metilación AciI contiguos. La Figura 33 muestra un procedimiento para detectar la metilación en sitios AciI contiguos en todo el genoma.
La Figura 34 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinP1I no metilados contiguos. La Figura 35 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinP1I no metilados contiguos.
La Figura 36 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios AciI metilados contiguos localizados entre sitios de restricción HaeIII.
La Figura 37 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios AciI metilados contiguos localizados entre sitios de restricción HaeIII.
La Figura 38 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios Bsh1236I metilados entre sitios HaeIII en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado.
La Figura 39 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen uno o más sitios AciI metilados cerca de un sitio de restricción HaeIII 5'.
La Figura 40 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen uno o más sitios AciI metilados cerca de un sitio de restricción HaeIII 5'.
La Figura 41 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Bsh1236I metilados cerca de un sitio HaeIII 5' en regiones conocidas de ADN genómico.
La Figura 42 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen uno o más sitios AciI metilados cerca de un sitio de restricción HaeIII 3'.
La Figura 43 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen uno o más sitios AciI metilados cerca de un sitio de restricción HaeIII 3'.
La Figura 44 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Bsh1236I metilados cerca de un sitio HaeIII 3' en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado.
La Figura 45 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Bsh1236I metilados vecinos en regiones conocidas de ADN genómico.
La Figura 46 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar todos los sitios CpG metilados cerca de sitios Bsh1236I en regiones conocidas de ADN genómico.
La Figura 47 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinPlI no metilados contiguos. La Figura 48 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinPlI no metilados contiguos.
La Figura 49 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios AciI metilados contiguos localizados entre sitios de restricción HaeIII.
La Figura 50 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios AciI metilados contiguos localizados entre sitios de restricción HaeIII.
La Figura 51 representa un procedimiento para detectar sitios HinPlI contiguos metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 52 representa un procedimiento para detectar sitios AciI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 53 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinPlI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 54 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinPlI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 55 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinPlI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 56 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios HinPlI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 57 muestra un procedimiento para detectar sitios HinPlI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 58 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios Hph1 contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 59 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios Hph1 contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 60 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios Hph1 contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 61 representa un procedimiento para generar y amplificar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente divulgación que contienen sitios Hph1 contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 62 muestra un procedimiento para detectar sitios Hph1 contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas.
La Figura 63 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc o a Dn genómico cortado adecuado para secuenciación.
La Figura 64 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc o a Dn genómico cortado adecuado para secuenciación.
La Figura 65 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc o a Dn genómico cortado adecuado para secuenciación.
La Figura 66 muestra el diseño y la fijación del conector para generar moldes listos para secuenciación a partir de ADNlc.
La Figura 67 muestra el diseño del conector "hueco" para secuenciar, identificar y verificar mutaciones en ambas hebras diana del ADNlc.
La Figura 68 muestra el diseño del conector para secuenciar, identificar y verificar mutaciones en ambas hebras diana del ADNlc usando prolongación en C3, fijación, activación de conectores que contienen rG con RNasa H2, relleno de huecos y fijación.
La Figura 69 muestra el diseño del conector para secuenciar e identificar mutaciones en cualquiera de las hebras diana del ADNlc usando prolongación dA con inserción limitada de rA, prolongación en C3, fijación, activación de conectores que contienen rG con RNasa H2, relleno de huecos y fijación.
La Figura 70 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc o a Dn genómico cortado adecuado para secuenciación.
La Figura 71 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc que implica la activación con RNasa H2.
La Figura 72 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc que implica la activación con RNasa H2.
La Figura 73 muestra la generación de ADN circular monocatenario que comprende el ADNlc diana original con un cebador hibridado.
La Figura 74 muestra la generación de ADN circular monocatenario que comprende el ADNlc diana original con un cebador hibridado que contiene un grupo de captura.
La Figura 75 muestra la generación de ADN circular monocatenario que comprende ADNlc diana original con un cebador hibridado usando el desbloqueo con RNasa H2 del cebador específico de la diana.
La Figura 76 muestra la generación de ADN circular monocatenario que comprende ADNlc diana original con un cebador hibridado que contiene un grupo de captura usando el desbloqueo con RNasa H2 del cebador específico de la diana.
La Figura 77 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc o a Dn genómico cortado adecuado para secuenciación.
La Figura 78 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario a partir de ADNlc o a Dn genómico cortado adecuado para secuenciación.
La Figura 79 muestra un procedimiento para enriquecer el ADN circular monocatenario específico de la diana usando la captura por cebadores específicos de la diana que posteriormente se pueden usar para la amplificación por círculo rodante.
La Figura 80 muestra un procedimiento para enriquecer el ADN circular monocatenario específico de la diana usando la captura por cebadores específicos de la diana en tándem con huecos que posteriormente se pueden usar para la amplificación por círculo rodante.
La Figura 81 muestra un procedimiento para enriquecer el ADN circular monocatenario específico de la diana usando cebadores específicos de la diana que posteriormente se pueden usar para la amplificación por círculo rodante.
La Figura 82 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 83 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 84 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 85 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 86 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 87 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 88 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 89 muestra un procedimiento para generar y enriquecer productos de extensión de repetición en tándem monocatenarios específicos de la diana genómica adecuados para secuenciación.
La Figura 90 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADN libre circulante (ADNlc) (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 20 bases, una porción específica de diana 5' de 60 bases, un conector de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 91 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 20 bases, una porción específica de diana 5' de 80 bases, un conector de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 92 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 50 bases, una porción específica de diana 5' de 60 bases, un conector de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 93 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 50 bases, una porción específica de diana 5' de 80 bases, un conector de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 94 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 50 bases, una porción específica de la diana 5' de 50 bases, conectores 3' y 5' de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 95 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 60 bases, una porción específica de la diana 5' de 60 bases, conectores 3' y 5' de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 96 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 50 bases, una porción específica de diana 5' de 50 bases y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 97 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 60 bases, una porción específica de diana 5' de 60 bases y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 98 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 70 bases, una porción específica de diana 5' de 70 bases y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 99 muestra el mapeo de una familia de sondas de oligonucleótido ("oligo") a lo largo de una colección de fragmentos diana de ADNlc (160 nucleótidos de longitud) en incrementos de 10 bases de nucleótidos. Cada sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de la diana 3' de 80 bases, una porción específica de diana 5' de 80 bases y una secuencia de identificador compuesto de 20 a 160 bases (línea delgada).
La Figura 100 ilustra cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico superpuesto para secuenciar regiones diana contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases como ejemplo).
La Figura 101 ilustra cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones diana contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases como ejemplo).
La Figura 102 ilustra cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones diana contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases como ejemplo).
La Figura 103 ilustra cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones diana contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases como ejemplo).
La Figura 104 muestra oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb en un tramo de ADN genómico.
La Figura 105 muestra oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb en un tramo de ADN genómico.
La Figura 106 muestra oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb en un tramo de ADN genómico.
La Figura 107 muestra oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb en un tramo de ADN genómico.
La Figura 108 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una copia de la secuencia desoxirribonucleica de una molécula de ácido ribonucleico diana. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 109 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una copia de la secuencia desoxirribonucleica de una molécula de ácido ribonucleico diana que contiene fusiones de genes posibles. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 110 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una copia de la secuencia desoxirribonucleica de una molécula de ácido ribonucleico diana que contiene fusiones de genes posibles. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 111 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una copia de la secuencia desoxirribonucleica de una molécula de ácido ribonucleico diana que contiene exones específicos. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 112 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una copia de la secuencia desoxirribonucleica de una molécula de ácido ribonucleico diana que contiene exones específicos. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 113 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden un segmento de ADN que contiene polimorfismos. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 114 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una secuencia desoxirribonucleica que es complementaria a una secuencia de miARN diana. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 115 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una secuencia desoxirribonucleica que es complementaria a una secuencia de miARN diana. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 116 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una secuencia desoxirribonucleica que es complementaria a una secuencia de miARN diana. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
La Figura 117 representa un procedimiento para generar construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden una secuencia desoxirribonucleica que es complementaria a una secuencia de miARN diana. Las construcciones circulares son adecuadas para ACR y secuenciación de acuerdo con los procedimientos de la presente divulgación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Una primera divulgación se dirige a una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Cada construcción de la colección comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. El segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario comprende una porción de identificador único, en el que la secuencia de nucleótidos tanto de la porción de identificador único como del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de todas las demás construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se circularizan y son adecuadas para la amplificación por círculo rodante y/o secuenciación.
De acuerdo con la presente divulgación, la colección contiene en general entre 1.000 y 4.000.000.000 de construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Los procedimientos para preparar las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se describen en detalle más adelante.
El primer segmento monocatenario de la construcción quimérica de ácido nucleico comprende un segmento de ADN genómico original de un huésped. Este segmento de ADN genómico original puede ser un fragmento de ácido nucleico que es un producto directo de la fragmentación del ADN genómico (es decir, sin la adición de una o más porciones de conector a los extremos del fragmento), o un fragmento de ácido nucleico de ADN genómico al que se han añadido conectores. El segmento de ADN genómico original se puede derivar de cualquier genoma, por ejemplo, un genoma animal, vegetal, de protozoos, hongos, bacterias o virus, tal como el genoma de un humano, manzano, giardia, levadura, Staphylococcus aureus o virus del papiloma. El segmento de ADN se puede aislar de cualquier fuente biológica fresca, congelada o fijada (por ejemplo, fijada con formol e incluida en parafina), que incluye, sin limitación, tejido, células, suero, plasma, sangre o exosomas.
El segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario de las construcciones de ácido nucleico de la colección está unido covalentemente al primer segmento monocatenario, por ejemplo, por medio de un enlace fosfodiéster. El segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario contiene una secuencia de identificador. En un modo de realización, la secuencia del identificador es un código de barras. El código de barras es en general una secuencia de 8-12 bases nucleotídicas que se usa junto con la secuencia del segmento de ADN genómico original para distinguir cada construcción de ácido nucleico de otra en la colección. Cuando los fragmentos de ADN genómico son de secuencia similar, es importante que la secuencia del identificador o código de barras sea suficientemente divergente, de modo que no haya dos construcciones de ácido nucleico iguales. Para colecciones que comprenden aproximadamente 10.000 equivalentes de genoma (los genomas aproximados en 1 ml de ADN libre circulante), las secuencias de identificador único de 8 nucleótidos contienen suficiente diversidad (65.536) para garantizar que cada construcción circular sea única. Para colecciones que comprenden aproximadamente 1.000.000 de equivalentes de genoma (los genomas aproximados de células totales en 10 ml de sangre), las secuencias de identificador único de 12 nucleótidos contienen suficiente diversidad (16.777.216) para garantizar que cada construcción circular sea única. Además, cuando el ADN genómico se fragmenta aleatoriamente o se fragmenta biológicamente (es decir, como en el ADN libre circulante), los puntos de unión entre el ADN genómico y el ácido nucleico sintético proporcionarán secuencias únicas adicionales para ayudar a distinguir cada construcción circular. En otro modo de realización, la secuencia del identificador comprende uno o más sitios de unión a cebador y/o secuencias del identificador de paciente como se describe más adelante. Los sitios de unión a cebador se usan no solo para facilitar la amplificación, sino que solos o en combinación con la secuencia del identificador de paciente pueden servir como un segmento de secuencia identificadora para propósitos de distinguir construcciones circulares individuales dentro de la colección. En consecuencia, la secuencia de identificador del segundo segmento monocatenario de las construcciones de ácido nucleico de la colección puede comprender una secuencia de código de barras, una o más secuencias de cebador, una secuencia de identificador de paciente o cualquier combinación de las mismas.
Las construcciones quiméricas de ácido nucleico de la colección están circularizadas, es decir, son moléculas de ácido nucleico circularizadas cerradas covalentemente. De acuerdo con la presente divulgación, las construcciones circularizadas son completamente monocatenarias. En otras divulgaciones, las construcciones circularizadas pueden ser parcialmente bicatenarias o completamente bicatenarias.
Un aspecto de la presente invención está dirigido a un procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico. Este procedimiento implica proporcionar la colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente invención como se describe anteriormente, es decir, en el que cada construcción comprende:
un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y
un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped, en el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una porción de identificador único, en la que la secuencia de nucleótidos de la porción de identificador único y del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de cualquier otra construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección, en el que dichas construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección están circularizadas y son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación,
y mezclar la colección con una polimerasa y una pluralidad de cebadores cortos (6 a 10 nucleótidos en los que una porción de dicha secuencia comprende bases aleatorias y/o análogos de nucleótidos; por ejemplo, hexámeros, heptámeros, octámeros aleatorios), para formar una reacción de amplificación. El uno o más de los cebadores cortos son complementarios a una porción de una o más construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. La mezcla de reacción de amplificación se somete a uno o más tratamientos de hibridación y extensión, en los que el uno o más cebadores cortos hibridan con las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario y la polimerasa extiende los cebadores hibridados para producir una pluralidad de productos de extensión. Cada producto de extensión comprende dos o más secuencias lineales en tándem que son complementarias a una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.
La Figura 1 (etapas A-D) proporciona una ilustración ejemplar del procedimiento descrito anteriormente para amplificar moléculas de ácido nucleico. La Figura 1, etapa A, muestra una construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario de una colección y una pluralidad de cebadores hexámeros aleatorios. El primer segmento monocatenario del ADN genómico original de la construcción circular se muestra como una única línea negra y delgada. Una mutación dentro del segmento de ADN genómico original se indica con un (*). La secuencia de identificador único de la construcción circular se muestra como una línea doble. La extensión continua de un cebador hexámero hibridado para amplificar la diana circular se logra usando una polimerasa capaz de realizar desplazamiento de hebra, por ejemplo, ADN polimerasa Phi29 o similar (representada como un diamante en la Figura 1). Como se muestra en la Figura 1, etapa B, la extensión por polimerasa de un cebador hibridado desplazará finalmente al cebador original, creando una cola monocatenaria. Uno o más de los cebadores hexámeros pueden hibridar posteriormente con la cola monocatenaria, y la extensión mediada por polimerasa de esos cebadores hibridados continúa como se muestra en la Figura 1, etapas C y 1D para formar productos de extensión bicatenarios de longitud variable, en los que cada producto de extensión contiene dos o más secuencias lineales en tándem que son complementarias a la construcción circular.
La colección de productos de extensión bicatenarios formados por medio de este procedimiento de amplificación es adecuada para cualquiera de una amplia gama de protocolos de secuenciación de nueva generación (NGS) (por ejemplo, 454 Pyrosequencing, secuenciación por síntesis Ion Torrent™, secuenciación por fijación SOLiD™ o sistemas de secuenciación por síntesis MiSeq™ o HiSeq™). De acuerdo con los protocolos de NGS, los productos de extensión bicatenarios están fragmentados de modo que una o más copias complementarias en tándem del ADN diana se encuentran dentro de un solo fragmento. Los conectores se agregan a los extremos 5' y 3' del ADN fragmentado para permitir la preparación de colecciones estándar y la generación de moldes usando la amplificación por agrupamiento o con microesferas. Durante la secuenciación se genera una secuencia consenso de todas las copias complementarias unidas físicamente de la molécula de ADN original dentro de la diana circular. Debido a que las mutaciones verdaderas (*) estarán presentes 2 o 3 veces dentro de un fragmento, son fácilmente distinguibles del error de polimerasa.
De acuerdo con este aspecto de la invención y todas las demás divulgaciones, la secuenciación de las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico y los productos de extensión de las mismas se puede llevar a cabo usando cualquier procedimiento de secuenciación conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, la secuenciación por hibridación de cebador fluorescente, hibridación de balizas moleculares, extensión de cebadores, reacción de detección de ligasa, reacción en cadena de ligasa, pirosecuenciación, secuenciación basada en exonucleasa, secuenciación por síntesis basada en fluorescencia, secuenciación por fijación basada en fluorescencia, secuenciación basada en nanoporos y nanotubos, secuenciación por síntesis basada en iones y secuenciación por fijación basada en iones. Como se usa en el presente documento, "secuenciación" engloba un procedimiento mediante el cual se obtiene la identidad de al menos 10 nucleótidos consecutivos de una diana o molde de polinucleótido.
En otra divulgación, cada construcción circular de ácido nucleico de la colección comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. El segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario comprende una porción de identificador único y un sitio de unión a cebador principal, en el que la secuencia de nucleótidos de la porción de identificador único, el sitio de unión a cebador principal y el segmento de ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de todas las demás construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se circularizan y son adecuadas para la amplificación por círculo rodante y/o secuenciación.
Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un procedimiento para generar copias lineales en tándem de moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para secuenciación. Este procedimiento implica proporcionar la colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la presente invención como se describe anteriormente, es decir, en el que cada construcción comprende:
un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y
un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped, en el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una porción de identificador único, en la que la secuencia de nucleótidos de la porción de identificador único y del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de cualquier otra construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección, en el que dichas construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección están circularizadas y son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación,
y mezclar la colección con una polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra, y uno o más cebadores principales, para formar una reacción de extensión por círculo rodante. El uno o más de los cebadores principales son complementarios a una porción de una o más construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. La mezcla de reacción de extensión por círculo rodante se somete a uno o más tratamientos de hibridación y extensión, en los que el uno o más cebadores hibridan con las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario y la polimerasa extiende los cebadores hibridados para producir una pluralidad de productos de extensión. Cada producto de extensión comprende dos o más secuencias lineales en tándem que son complementarias a una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.
El procedimiento comprende además
proporcionar uno o más conjuntos de cebadores secundarios, en el que cada conjunto de cebadores secundarios comprende (a) un primer cebador secundario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción de un producto de extensión monocatenario formado a partir del uno o más cebadores principales, y (b) un segundo cebador secundario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda porción de un producto de extensión monocatenario, en el que dicha segunda porción es diferente y está desplazada de la primera porción del producto de extensión monocatenario formado a partir del uno o más más cebadores principales;
proporcionar una endonucleasa que escinde tanto el producto de extensión monocatenario como el primer cebador secundario cuando hibridan entre sí;
mezclar los productos de extensión monocatenarios con una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, una ligasa, la endonucleasa y el uno o más conjuntos de cebadores secundarios para formar una mezcla de reacción de extensión-fijación-escisión;
someter la mezcla de reacción de extensión-fijación-escisión a un tratamiento de hibridación y extensión, en el que el primer y segundo cebadores secundarios hibridan con los productos de extensión monocatenarios, la polimerasa extiende los cebadores secundarios hibridados, la ligasa une los cebadores secundarios hibridados extendidos para formar productos de extensión bicatenarios, y la endonucleasa escinde los productos de extensión bicatenarios en posiciones donde el primer cebador secundario hibrida con el producto de extensión monocatenario para producir fragmentos de productos de extensión bicatenarios, en el que dichos fragmentos de productos de extensión bicatenarios comprenden dos o más secuencias lineales en tándem complementarias a la construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.
La Figura 2, etapas A-C, proporciona una ilustración ejemplar del procedimiento descrito anteriormente para amplificar moléculas de ácido nucleico. La Figura 2, etapa A, muestra una construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario de una colección y un cebador principal hibridado. El primer segmento monocatenario del ADN genómico original de la construcción circular se muestra como una única línea negra y delgada. Una mutación dentro del segmento de ADN genómico original se indica con un (*). La secuencia del identificador único y el sitio de unión al cebador principal de la construcción circular se muestran como una línea ligeramente más gruesa. La extensión continua de un cebador hibridado para amplificar la diana circular se logra usando una polimerasa capaz de realizar desplazamiento de hebra, por ejemplo, ADN polimerasa Phi29 o Bst o similar (representada como un diamante en la Figura 2). Como se muestra en la Figura 2, etapa B, la extensión por polimerasa de un cebador hibridado desplazará finalmente al cebador original, creando una cola monocatenaria. El producto de extensión se desnaturaliza del círculo (véase la Figura 2, etapa C). Se proporcionan uno o más conjuntos de cebadores secundarios, donde cada conjunto de cebadores comprende (a) un primer cebador secundario no metilado que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción del producto de extensión monocatenario formado a partir del cebador principal, y (b) un segundo cebador secundario metilado que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda porción del producto de extensión monocatenario. Los productos de extensión monocatenarios se mezclan con los conjuntos de cebadores secundarios, una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, una ligasa y una endonucleasa que escinde tanto el producto de extensión monocatenario como el primer cebador secundario cuando hibridan entre sí (es decir, la endonucleasa escinde en una secuencia de reconocimiento bicatenaria no metilada).
El primer y segundo cebadores secundarios hibridan con regiones complementarias de los productos de extensión monocatenarios como se muestra en la Figura 2, etapa C. La polimerasa extiende los cebadores hibridados para formar puntos de unión para fijación con cebadores secundarios hibridados en dirección 3'. La ligasa une los cebadores secundarios extendidos entre sí para formar productos de extensión bicatenarios como se muestra en la Figura 2, etapa C. La endonucleasa escinde tanto el producto de extensión como el primer cebador secundario donde hibridan para formar fragmentos bicatenarios que contienen copias lineales en tándem de secuencias de ADN genómico diana. El número de secuencias lineales en tándem en los fragmentos de productos de extensión bicatenarios refleja la proporción entre el primer y el segundo cebador secundario utilizada en el procedimiento mencionado anteriormente. Estos fragmentos de copia en tándem son adecuados para secuenciación usando cualquier procedimiento de secuenciación conocido en la técnica como se describe anteriormente. Para la secuenciación NGS se agregan conectores para permitir la amplificación estándar por agrupamiento o con microesferas y las lecturas de extremos emparejados. La mutación verdadera (*) estará presente 2 o 3 veces y, por tanto, se distinguirá del error de polimerasa.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para generar copias lineales en tándem de moléculas de ácido nucleico, si la diana se metiló en el ADN genómico original (la base metilada se representa como "m", véase la Figura 3). El procedimiento es esencialmente el mismo que el descrito anteriormente, usando la polimerasa Bst para la extensión continua del cebador principal hibridado en presencia de la endonucleasa de restricción BstilI (CGACG) (Figura 3, etapa B). BstilI escindirá el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado (Figura 3, etapa B). (Véase Zierhut y Diffley, "Break Dosage, Cell Cycle Stage and DNA Replication Influence DNA Double Strand Break Response ,EMBO J. 27(13):1875-85 (2008)). Dado que la polimerasa genera varias copias de la diana durante la amplificación por círculo rodante, y dado que los sitios CGCG no metilados son escindidos por BstilI en forma bicatenaria, este procedimiento selecciona específicamente los fragmentos que están metilados en todos los sitios BstilI en el ADN diana inicial. Aunque la Figura 3 ilustra este procedimiento con la endonucleasa de restricción BstilI, se pueden utilizar otras endonucleasas que escinden el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado para amplificar selectivamente el ADN genómico metilado. Estas endonucleasas incluyen, pero no se limitan a, las enzimas termófilas BstHHI (reconoce GCGC; un isoesquizómero de Hhal), BsiSI (reconoce CCGG; un isoesquizómero de HpaII) y Tail (reconoce ACGT; un isoesquizómero de MaeII). Todas estas enzimas son sensibles a la metilación de la secuencia interna de CpG. La última enzima de esta serie, la enzima de restricción TaqI, es insensible a la metilación en el sitio CpG, por lo que no sería adecuada para la técnica anterior.
En la divulgación, cada construcción circular de ácido nucleico de la colección comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped unido al segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario, donde el segundo segmento monocatenario comprende una o más secuencias específicas de cebador (por ejemplo, una porción específica del primer y/o segundo cebador sobre soporte sólido), y opcionalmente, una secuencia de identificador de paciente. De acuerdo con la presente divulgación, el segundo segmento monocatenario puede contener o no una porción de identificador único. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se circularizan y son adecuadas para la amplificación por círculo rodante y/o secuenciación como se describe en el presente documento.
La secuencia de identificador de paciente del segundo segmento monocatenario sirve para identificar la fuente del paciente del ADN genómico original. La secuencia del identificador de paciente comprende en general aproximadamente 5 a 8 nucleótidos de longitud y está diseñada para distinguir secuencias procedentes de diferentes pacientes. En el modo de realización preferente, las secuencias del identificador de paciente difieren entre sí en al menos 3 posiciones, de modo que un error de una sola base en la secuenciación todavía permite la identificación positiva de la secuencia del identificador de paciente correcta. En la práctica clínica actual de laboratorio, el procesamiento por lotes de muestras está normalmente diseñado para ser compatible con formatos de placa de 96 y 384 pocillos, de modo que se procesen simultáneamente 8, 16, 24, 48, 96 o 384 muestras.
Otra divulgación se dirige a un sistema que comprende una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Cada construcción de la colección comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. La secuencia de nucleótidos del segundo segmento de ácido nucleico monocatenario comprende una porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido y una secuencia de identificador de paciente. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección se circularizan y son adecuadas para la amplificación por círculo rodante y/o secuenciación. El sistema comprende además una colección de productos de extensión, en el que cada producto de extensión comprende dos o más secuencias lineales en tándem que son complementarias a la construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección. Cada producto de extensión de la colección hibrida con su construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario complementaria de la colección. La Figura 4, etapa B, proporciona una representación ejemplar de este sistema.
Este sistema puede comprender además un soporte sólido que tiene una pluralidad de primeros cebadores de oligonucleótidos inmovilizados. Cada primer cebador de oligonucleótido sobre el soporte sólido tiene una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos de la porción específica del primer cebador sobre el soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección, y que es complementaria a la porción específica del primer cebador sobre el soporte sólido de los productos de extensión. En consecuencia, uno o más de los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido pueden hibridar con un producto de extensión de la colección de productos de extensión por medio de las porciones específicas del primer cebador sobre el soporte sólido. La Figura 4, etapa C, proporciona una representación ejemplar de este sistema.
El soporte sólido se puede preparar a partir de una amplia variedad de materiales. El sustrato puede ser biológico, no biológico, orgánico, inorgánico o una combinación de cualquiera de estos, existente como partículas, hebras, precipitados, geles, láminas, tubos, esferas, perlas, recipientes, capilares, almohadillas, cortes, películas, portaobjetos, discos, membranas, etc. El sustrato puede tener cualquier forma conveniente, tal como un disco, cuadrado, círculo, etc. El sustrato es preferentemente plano pero puede adoptar una variedad de configuraciones de superficie alternativas. Por ejemplo, el sustrato puede contener regiones elevadas o deprimidas en las que tiene lugar la hibridación. El sustrato y su superficie forman preferentemente un soporte rígido sobre el cual llevar a cabo las reacciones de secuenciación descritas en el presente documento.
Las plataformas de soporte sólido para secuenciación de nueva generación disponibles comercialmente usadas para la preparación de moldes se pueden utilizar en los sistemas y procedimientos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, la cubeta de lectura Illumina®, Life Technologies® IonSphere™ y microesferas de PCR en emulsión y las microesferas 454 emulsión PCR se pueden usar en el sistema y los procedimientos divulgados en el presente documento. En consecuencia, la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario se diseña para ser la misma que los cebadores inmovilizados sobre un soporte sólido de NGS disponible comercialmente. Por lo tanto, los productos de extensión que contienen el complemento de la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido son capaces de hibridar con cebadores sobre la superficie del soporte sólido de NGS.
Este sistema puede comprender además una colección de oligonucleótidos de reticulación como se muestra en la Figura 5, etapa A. Un oligonucleótido de reticulación es un oligonucleótido que tiene dos o más repeticiones de una secuencia de nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos repetida tiene la misma secuencia que al menos una porción del segundo segmento de ácido nucleico monocatenario de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. En consecuencia, la secuencia de nucleótidos repetida del oligonucleótido de reticulación es complementaria a al menos una porción de la secuencia de nucleótidos del producto de extensión de la construcción quimérica de ácido nucleico (es decir, una porción del producto de extensión correspondiente al segundo segmento monocatenario). La secuencia de nucleótidos repetida puede tener aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud. Una o más de las repeticiones de la secuencia de nucleótidos de cada oligonucleótido de reticulación hibridan con una secuencia lineal en tándem de un producto de extensión de la colección de productos de extensión como se representa en la Figura 5, etapas B-D, para formar una estructura condensada.
Como se muestra en la Figura 5, etapas E-H, el producto de extensión condensado, unido a uno o más oligonucleótidos de reticulación, se puede capturar sobre un soporte sólido que tiene una pluralidad de primeros cebadores de oligonucleótidos inmovilizados. Como se describe anteriormente, los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de los productos de extensión (es decir, una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos de la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario). Como se muestra en la Figura 5, etapa E, una o más secuencias lineales en tándem de una estructura de producto de extensión condensado pueden hibridar con uno o más primeros cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido, inmovilizando de este modo la estructura condensada. Los oligonucleótidos de reticulación se pueden diseñar para contener enlaces escindibles que se cortan enzimáticamente (representados como triángulos en la Figura 5, etapas E y F). Los enlaces escindibles adecuados incluyen, sin limitación, ribonucleótidos, desoxi-uracilo, un sitio apurínico y 8-oxoguanina. Por ejemplo, el oligonucleótido de reticulación puede contener un sitio apurínico que es escindido por endonucleasa APE 1, Endo III, Endo IV, Endo VIII, Fpg o hOGG1. La escisión de los oligonucleótidos de reticulación permite que la estructura condensada se separe y las secuencias individuales en tándem del producto de extensión se capturan localmente mediante hibridación con cebadores contiguos sobre la superficie del soporte sólido, creando una estructura de tipo alfombra (Figura 5, etapa F). Como se muestra en la Figura 5, etapa G, este enfoque garantiza que los cientos a miles de copias complementarias en tándem de la secuencia de ADN genómico diana original se capturen una al lado de la otra, y sean adecuadas para la secuenciación posterior.
Otra divulgación se dirige a un sistema que comprende una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Cada construcción comprende un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y un segundo segmento de ácido nucleico monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped. La secuencia de nucleótidos del segundo segmento de ácido nucleico monocatenario comprende una porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido y una secuencia de identificador de paciente. Las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación. El sistema comprende además uno o más cebadores de amplificación de oligonucleótidos, en el que cada cebador comprende al menos una primera porción de secuencia de nucleótidos que es complementaria a la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido o la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección. Finalmente, este sistema también tiene una polimerasa adecuada para amplificación por círculo rodante.
En la Figura 4, etapa A, se muestran representaciones ejemplares del sistema divulgado. Las construcciones circularizadas quiméricas de ácido nucleico contienen el segmento de ADN genómico original (línea negra delgada), una sustitución o mutación de una sola base de interés dentro del segmento de ADN original se indica con el asterisco (*). El segundo segmento monocatenario de las construcciones contiene una porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de la construcción quimérica (representada como una línea negra gruesa) y una porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido (representada como una línea negra doble). Los cebadores de amplificación adecuados para cebar la amplificación por círculo rodante de las construcciones quiméricas pueden ser complementarios a un segmento de la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de la construcción como se muestra en el panel izquierdo de la Figura 4, etapa A; complementarios a un segmento de las porciones específicas del primer y segundo cebador sobre soporte sólido de la construcción quimérica como se muestra en los paneles central y derecho de la Figura 4, etapa A; o complementarios a una porción de la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido de la construcción como se muestra en la Figura 9, etapa A. En este último modo de realización, el cebador de amplificación complementario a la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido de la construcción quimérica se inmoviliza sobre un soporte sólido, que ancla el producto de extensión formado durante la amplificación por círculo rodante directamente al soporte sólido. En un modo de realización alternativo, los cebadores de amplificación pueden comprender una porción adicional que puede ser anclada a un soporte sólido como se muestra en la Figura 4, etapa D y la Figura 10, etapa A. En un modo de realización, la porción adicional comprende una secuencia de nucleótidos única que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido de captura inmovilizado sobre el soporte sólido. En otro modo de realización, la porción adicional comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un primer o segundo cebador de oligonucleótido inmovilizado sobre el soporte sólido. En otro modo de realización, la porción adicional es un resto de captura que es capturado por un fijando de captura inmovilizado sobre el soporte sólido. El resto de captura y el ligando de captura no necesitan ser ácidos nucleicos en cuanto a su naturaleza. Por ejemplo, el resto de captura puede ser un grupo biotina o un His-Tag, que sería capturado por estreptavidina o matriz NTA inmovilizadas, respectivamente.
En otro modo de realización, el uno o más cebadores de amplificación de oligonucleótidos comprenden (i) una primera secuencia de nucleótidos que es complementaria al segmento de ADN genómico original de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección, (ii) una porción 3' que comprende un nucleótido o análogo de nucleótido escindible y un grupo bloqueante que bloquea la extensión por polimerasa 3' de dicho cebador de amplificación de oligonucleótidos, y (iii) una porción 5' que comprende un nucleótido o análogo de nucleótido escindible y un grupo de captura, donde el grupo de captura puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido.
En otro modo de realización, el uno o más cebadores de amplificación de oligonucleótidos comprenden (a) un primer cebador de amplificación de oligonucleótidos que tiene (i) una primera secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción del segmento de ADN genómico original de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección, y (ii) una porción 3' que comprende un nucleótido o análogo de nucleótido escindible y un grupo bloqueante que bloquea la extensión por polimerasa 3' de dicho primer cebador de amplificación de oligonucleótidos, y (b) un segundo cebador de amplificación de oligonucleótidos que tiene (i) una primera secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda porción del segmento de ADN genómico original de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección, y (ii) una porción 5' que comprende un nucleótido o análogo de nucleótido escindible y un grupo de captura, donde el grupo de captura puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido.
De acuerdo con la presente divulgación, el sistema puede comprender además un soporte sólido que tiene una pluralidad de primeros cebadores de oligonucleótidos inmovilizados. Los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido tienen una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos de la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección (véase, por ejemplo, la Figura 6, etapa B). El soporte sólido de este sistema puede comprender además una pluralidad de segundos cebadores de oligonucleótidos inmovilizados que tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección (véase, por ejemplo, la Figura 5, etapa B). Como se describe anteriormente, las plataformas de soporte sólido para NGS disponibles comercialmente usadas para la preparación de moldes (por ejemplo, Illumina® Flow Cell, Life Technologies IonSphere®, etc.) son adecuadas para los sistemas divulgados en el presente documento.
El sistema divulgado en el presente documento también puede comprender una colección de oligonucleótidos de reticulación como se describe anteriormente (es decir, un oligonucleótido que tiene dos o más repeticiones de una secuencia de nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos repetida tiene la misma secuencia que al menos una porción del segundo segmento de ácido nucleico monocatenario de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección).
De acuerdo con la divulgación, la polimerasa de este sistema es una polimerasa de desplazamiento de hebra que es adecuada para amplificación por círculo rodante. Las polimerasas de desplazamiento de hebra ejemplares incluyen, sin limitación, ADN polimerasa phi29, ADN polimerasa Bst (fragmento grande o 5 '^3 ' exo-), ADN polimerasa Bsu (fragmento grande o 5 '^3 ' exo-), DeepVentR® (exo-)polimerasa, fragmento Klenow (3 '^5 ' exo-), ADN polimerasa I (5 '^3 ' exo-), retrotranscriptasa M-MuLV, ADN polimerasa VentR® (exo-) y ADN polimerasa PyroPhage 3173. Otras polimerasas de desplazamiento de hebra ejemplares incluyen las que tienen termoestabilidad y actividad de desplazamiento de hebra, tales como ADN polimerasa SD (una ADN polimerasa Taq mutante) (véase la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2012/0115145 a Fu, el documento WO2014/161712 a Ignatov et al. e Ignatov et al., "A Strong Stand Displacement Activity of Thermostable DNA Polymerase Markedly Improves the Results of DNA Amplification", BioTechniques 57:81087 (2014)); polimerasa AptaHotTaq (actividad de polimerasa termoestable 5 '^3 ' con una actividad de endonucleasa de aleta 5'); polimerasas derivadas de virus y microbios termófilos (véase la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2012/0083018 a Schoenfeld et al. y la patente de EE. Uu . n.° 8.093.030 a Schoenfeld et al.); polimerasas derivadas de Thermus antranikianii y Thermus brockianus como se divulga en el documento WO2006/030455 a Hjorleifsdottir et al. y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2008/0311626 a Hjorleifsdottir et al.; la polimerasa termoestable derivada de Thermus scotoductus (véase el documento WO2007/076461 a Rech et al.); y ADN polimerasa de Tipo I derivada de Bacillus pallidus (véase la patente de EE. UU. n.° 5.736.373 a Hamilton). Otras polimerasas de desplazamiento de hebra conocidas en la técnica también son adecuadas para este sistema y los procedimientos relacionados divulgados en el presente documento.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento de secuenciación de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico usando este sistema. De acuerdo con este procedimiento, los cebadores de amplificación de oligonucleótidos hibridados con construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario complementarias de la colección se mezclan con la polimerasa para formar una mezcla de reacción de amplificación por círculo rodante. La mezcla de reacción de amplificación por círculo rodante se somete a un tratamiento de extensión donde la polimerasa extiende el uno o más cebadores de amplificación de oligonucleótidos hibridados para producir una pluralidad de productos de extensión principales. Cada producto de extensión principal comprende una o más secuencias lineales en tándem, en el que cada secuencia lineal en tándem es complementaria a una construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección. Las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario se pueden secuenciar directamente, por ejemplo, la construcción quimérica circular es el molde para la secuenciación por síntesis. De forma alternativa, los productos de extensión principales formados a partir de la reacción de amplificación por círculo rodante son los moldes usados para la secuenciación. Como se indica anteriormente, se puede utilizar cualquier procedimiento de secuenciación conocido en la técnica para secuenciar las construcciones circulares de ácido nucleico o los productos de extensión principales de las mismas.
En un modo de realización, los productos de extensión principales se inmovilizan sobre un soporte sólido antes de la secuenciación. Un soporte sólido adecuado comprende al menos una pluralidad de primeros cebadores de oligonucleótidos que tienen cada uno una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos de la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección (es decir, que tienen una secuencia complementaria a la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido de los productos de extensión principales). Los soportes sólidos adecuados incluyen, sin limitación, aquellos que están disponibles comercialmente y se utilizan para la preparación de moldes en plataformas de secuenciación de nueva generación, por ejemplo, cubeta de lectura Illumina®, Life Technologies™ Ion Sphere™. Los productos de extensión principales hibridan con los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido y se secuencian sobre el soporte como se describe con más detalle a continuación.
El soporte sólido puede comprender además una pluralidad de segundos cebadores de oligonucleótidos. Los segundos cebadores tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido de las construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario. Como se representa en la Figura 9, etapa B, y se describe con más detalle en el presente documento, la amplificación por círculo rodante de la construcción quimérica de ácido nucleico se puede cebar con un segundo cebador de oligonucleótido sobre el soporte sólido. Este enfoque se puede usar para anclar el producto de extensión principal directamente al soporte sólido.
Como se representa en la Figura 5, etapas A-G, los oligonucleótidos de reticulación se pueden utilizar para condensar el producto de extensión principal en crecimiento formado a partir de una reacción de amplificación por círculo rodante. Como se muestra en la Figura 5, etapa A, la ADN polimerasa (diamantes rellenos) extiende un cebador de amplificación alrededor de la construcción circular que contiene el segmento genómico original. A medida que la polimerasa continúa la extensión, el producto de extensión principal en crecimiento se condensa al hibridar a regiones repetidas complementarias de oligonucleótidos de reticulación como se muestra en la Figura 5, etapa B. El procedimiento continúa como se muestra en la Figura 5, etapas C y D, para generar cientos a miles de copias complementarias en tándem de ADN diana en una estructura condensada. Al variar el número de oligonucleótidos con diferentes secuencias complementarias y el número de repeticiones en tándem dentro de un oligonucleótido dado, se puede variar el número de bucles o "nodos de reticulación", lo que brinda la oportunidad de controlar la "compacidad" de la estructura. Como se muestra en la Figura 5, etapa E, el producto de extensión principal condensado se puede inmovilizar sobre un soporte sólido por medio de hibridación del producto de extensión principal con primeros cebadores de oligonucleótidos complementarios. Como se muestra en la Figura 5, etapa E, la estructura condensada hibrida con cebadores complementarios en algunas posiciones. Los oligonucleótidos de reticulación contienen enlaces escindibles y, tras la escisión, la estructura condensada comienza a separarse (Figura 5, etapa F). Los bucles individuales del producto de extensión principal se capturan localmente mediante hibridación con los primeros cebadores contiguos sobre la superficie del soporte sólido, creando una estructura de tipo alfombra (Figura 5, etapa G). Este enfoque garantiza que los cientos a miles de copias en tándem de la diana se capturen una al lado de la otra y sean adecuadas para la secuenciación posterior.
La Figura 6 representa un procedimiento ejemplar de secuenciación de acuerdo con la presente divulgación. Como se muestra en la Figura 6, etapa A, el procedimiento comienza con la ADN polimerasa (por ejemplo, polimerasa Phi29; diamantes rellenos) que extiende un cebador de amplificación hibridado con un molde de construcción circular quimérica de ácido nucleico para generar un producto de extensión principal. El producto de extensión hibrida con los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre un soporte sólido (Figura 6, etapa B). Como se muestra en la Figura 6, etapa C, el producto de extensión en crecimiento formado a partir de la reacción de amplificación por círculo rodante se captura localmente sobre el soporte sólido mediante hibridación con los primeros cebadores de oligonucleótidos contiguos sobre la superficie, creando una estructura de tipo alfombra. Como se muestra en la Figura 6, etapa D, este enfoque garantiza que cientos a miles de copias complementarias en tándem del segmento de ADN genómico original se capturen una al lado de la otra para la secuenciación posterior.
Una vez que el producto de extensión principal se inmoviliza sobre el soporte sólido (Figura 6, etapa D), un cebador de secuenciación hibrida contiguo al extremo 3' del primer cebador de oligonucleótido sobre el soporte sólido como se muestra en la Figura 6, etapa E. Opcionalmente, un ARN u oligonucleótido de bloqueo pueden hibridar contiguos al extremo 5' del primer cebador de oligonucleótido como también se representa en la Figura 6, etapa E. El producto de extensión principal es el molde para la reacción de secuenciación por síntesis cebada por el cebador de secuenciación como se representa en la Figura 6, etapa F. La secuenciación continúa hasta que el producto de extensión de secuenciación por síntesis secundario que se está formando no se puede extender más debido al ARN u oligonucleótido de bloqueo (Figura 6, etapa G).
Para secuenciar la hebra opuesta (es decir, para obtener la secuencia de los productos de extensión principales), el primer cebador de oligonucleótido sobre soporte sólido se desbloquea. Una polimerasa (diamantes rellenos) con actividad nucleasa 5'->3' extiende el cebador de secuenciación anclado sobre el soporte sólido mientras digiere el producto de la reacción de secuenciación por síntesis como se muestra en la Figura 6, etapa H. Como se muestra en la Figura 6, etapa I, la polimerasa (diamantes rellenos) extiende las hebras hasta que no puede avanzar más debido al ARN u oligonucleótido de bloqueo (línea de rayas anchas). Esto genera copias de longitud única del molde, cada molde comprende una copia de la secuencia de ADN genómico original. Como se muestra en la Figura 6, etapa J, el producto de extensión principal original y el molde circular se desnaturalizan y se eliminan por lavado. Un segundo cebador de secuenciación hibrida con cada hebra de molde de longitud única como se muestra en la Figura 6, etapa K, y la secuenciación por síntesis se usa para obtener la secuencia del molde inmovilizada como se muestra en la Figura 6, etapas L y M.
La Figura 7 representa otro procedimiento ejemplar de secuenciación de acuerdo con la presente divulgación. Este procedimiento implica la amplificación por círculo rodante de una construcción circular quimérica de ácido nucleico y la captura del producto de extensión principal sobre un soporte sólido que tiene primeros y segundos cebadores de oligonucleótidos. Como se muestra en la Figura 7, etapa A, una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra (diamante relleno) extiende un cebador de amplificación en un molde circularizado para generar un producto de extensión principal monocatenario. Los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre la superficie de soporte sólido contienen un grupo bloqueante extraíble en su extremo 3' que hace que sean incapaces de extenderse durante el procedimiento de amplificación por círculo rodante (Figura 7, etapa B). Un grupo bloqueante es un resto químico que impide que una polimerasa u otra enzima se amplifiquen, extiendan o reaccionen con el oligonucleótido de manera productiva. En este ejemplo, el grupo bloqueante evita la extensión por polimerasa del extremo 3'. Los grupos bloqueantes adecuados incluyen, sin limitación, espaciadores C3, espaciadores C18, nucleótidos finalizadores, derivados de 2-O-metil-ribonucleótido, fosfato 3' u otras modificaciones de los restos 3'-OH o 2'-OH. El grupo bloqueante en sí puede ser escindible, tal como mediante el uso de nucleótidos finalizadores reversibles, o fosfatos 3', o el grupo bloqueante y, opcionalmente, algunos nucleótidos adicionales se pueden retirar escindiendo un enlace escindible que a continuación libera un extremo 3'-OH libre. Los enlaces escindibles adecuados incluyen, sin limitación, ribonucleótidos, desoxi-uracilo, un sitio apurínico y 8-oxoguanina. Como se muestra en la Figura 7, etapa C, a medida que la amplificación por círculo rodante continúa generando un producto de extensión principal en crecimiento, el producto se captura localmente mediante hibridación con los primeros cebadores de oligonucleótidos contiguos sobre la superficie de soporte sólido creando una estructura de tipo alfombra. Este enfoque garantiza que los cientos a miles de copias en tándem de la diana se capturen una al lado de la otra sobre la superficie de soporte sólido (Figura 7, etapa D).
Como se muestra en la Figura 7, etapa E, el grupo bloqueante se retira de los primeros cebadores de oligonucleótidos hibridados con el producto de extensión principal sobre el soporte sólido. El grupo bloqueante se puede retirar escindiendo un enlace escindible. Los enlaces escindibles de ribonucleótidos se pueden escindir usando RNasa H; los enlaces escindibles de desoxi-uracilo se pueden escindir usando UDG y endonucleasa AP, o usando UDG, Endo VIII y cinasa T4; los enlaces escindibles del sitio apurínico se pueden escindir usando Tth Endo IV, Endo IV o endonucleasa AP; y los enlaces escindibles de 8-oxoguanina se pueden escindir con Fgp. Una vez que el cebador se desbloquea, se extiende de este modo copiando el producto de extensión principal en cientos a miles de posiciones sobre el soporte sólido usando una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad nucleasa 5 '^3 ' (Figura 7, etapa F). Esto genera productos de extensión secundarios de longitud única del molde circularizado. Como se muestra en la Figura 7, etapa G, el producto de extensión principal y el molde circular se desnaturalizan y eliminan por lavado para hacer que los productos de extensión secundarios resultantes del molde sean adecuados para la secuenciación posterior como se muestra en la Figura 8, etapas A-I.
La Figura 8 ilustra la secuenciación de la diana amplificada por círculo rodante (por ejemplo, productos de extensión secundarios) capturada sobre un soporte sólido que tiene primeros y segundos cebadores de oligonucleótidos. La Figura 8, etapa A, muestra los productos de extensión secundarios de longitud única generados a partir de la extensión mediada por polimerasa de productos de extensión principales hibridados como se describe en la Figura 7. El procedimiento de secuenciación comienza con la hibridación de cebadores de secuenciación con los productos de extensión secundarios como se muestra en la Figura 8, etapa A. La secuenciación por síntesis se usa para obtener la secuencia de los productos de extensión secundarios inmovilizados (Figura 8, etapa B). La secuenciación continúa hasta que los productos de extensión alcanzan el final de los primeros cebadores de oligonucleótidos anclados (Figura 8, etapa C). Los productos de secuenciación por síntesis se desnaturalizan de los productos de extensión secundarios anclados y los productos de extensión secundarios monocatenarios hibridan con los segundos cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido como se muestra en la Figura 8, etapa D. Los productos de extensión secundarios se copian extendiendo los segundos cebadores de oligonucleótidos hibridados para generar copias de longitud completa de los productos de extensión secundarios, es decir, productos de extensión terciarios (Figura 8, etapa E). Los productos de extensión secundarios se escinden, desnaturalizan y eliminan por lavado (Figura 8, etapas E-F), dejando los productos de extensión terciarios anclados adecuados para la secuenciación posterior. Un cebador de secuenciación hibrida con los productos de extensión terciarios (Figura 8, etapa G) y se lleva a cabo la secuenciación por síntesis para obtener la secuencia de los productos terciarios como se muestra en la Figura 8, etapas H e I.
La secuenciación de los productos de extensión secundarios y terciarios se puede lograr usando secuenciación por síntesis como se describe y se representa en el presente documento. La secuenciación por síntesis incluye secuenciación por síntesis basada en fluorescencia y secuenciación por síntesis basada en iones. También se pueden emplear otros procedimientos de secuenciación adecuados, que incluyen, por ejemplo y sin limitación, hibridación de cebador fluorescente, hibridación de balizas moleculares, extensión de cebadores, secuenciación basada en exonucleasa, reacción de detección de ligasa, reacción en cadena de ligasa, pirosecuenciación, secuenciación por fijación basada en fluorescencia, secuenciación basada en nanoporos y nanotubos y secuenciación por fijación basada en iones.
La Figura 9 representa otro procedimiento ejemplar de secuenciación de acuerdo con la presente divulgación. Como se muestra en la Figura 9, etapa A, este modo de realización implica la hibridación directa de la construcción circular quimérica de ácido nucleico con un segundo cebador de oligonucleótido no bloqueado sobre el soporte sólido. El segundo cebador sirve como un cebador de amplificación, cebando la amplificación por círculo rodante de la construcción circular. El producto de extensión principal que se genera está directamente anclado al soporte sólido (Figura 9, etapa A). El producto de extensión principal generado por amplificación por círculo rodante hibrida con los primeros cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido que contiene un grupo bloqueante 3' extraíble como se muestra en la Figura 9, etapas B y C, generando de este modo múltiples estructuras de "bucle tipo alfombra". El grupo bloqueante 3' de los primeros cebadores se retira (Figura 9, etapa D), permitiendo que los primeros cebadores se extiendan por una polimerasa adecuada (por ejemplo, una polimerasa que carece de actividad nucleasa 5 '^3 ') para generar una superficie compuesta de cientos a miles de productos de extensión secundarios de longitud única unidos covalentemente a la superficie del soporte sólido (Figura 9, etapa E). Como se muestra en la Figura 9, etapas E-F, el tratamiento de la superficie con un reactivo o enzima de escisión específica del sitio que escinde el primer cebador, seguido de una etapa de desnaturalización, libera el producto de extensión principal, dejando los productos de extensión secundarios unidos covalentemente, que son adecuados para la secuenciación posterior como se muestra y describe en la Figura 8, etapas A-I.
La Figura 10 representa otro procedimiento ejemplar de secuenciación de acuerdo con la presente divulgación. En este modo de realización, el cebador de amplificación comprende una cola corta monocatenaria, es decir, una porción adicional que se captura sobre el soporte sólido. Como se representa en la Figura 10, etapa A, la porción adicional puede comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una sonda o cebador de captura sobre la superficie del soporte sólido. La hibridación de la porción adicional a su sonda o cebador de captura complementario ancla directamente el producto de extensión principal formado por amplificación por círculo rodante al soporte sólido. A medida que la amplificación por círculo rodante continúa generando un producto de extensión principal en crecimiento que comprende copias complementarias en tándem de la estructura circular quimérica, el producto de extensión principal se captura localmente mediante hibridación con los primeros cebadores de oligonucleótidos bloqueados en 3' sobre la superficie creando múltiples estructuras de bucle tipo alfombra sobre la superficie (Figura 10, etapas B y C). Los primeros cebadores se desbloquean (Figura 10, etapa D) y se extienden con una polimerasa que carece de una actividad nucleasa 5 '^3 ' para formar múltiples productos de extensión secundarios que tienen una longitud uniforme (Figura 10, etapa E). La desnaturalización libera el producto de extensión principal y deja atrás productos de extensión secundarios unidos covalentemente que tienen el mismo sentido que los moldes circularizados originales y todos terminan con una secuencia de unión a cebador de secuenciación definida en sus extremos 3'. Los productos de extensión secundarios unidos covalentemente son moldes adecuados para secuenciación como se muestra en la Figura 8.
La Figura 11 ilustra otro procedimiento ejemplar de secuenciación de acuerdo con la presente divulgación. En la Figura 11, etapa A, la ADN polimerasa Phi29 (diamantes rellenos) extiende el cebador de amplificación en el molde circular quimérico para generar un producto de extensión principal monocatenario corto. La polimerasa y el producto de extensión principal se desnaturalizan del molde circular. Como se muestra en la Figura 11, etapa B, el producto de extensión principal hibrida con los primeros cebadores sobre un soporte sólido. El producto de extensión principal se copia mediante extensión por polimerasa de los primeros cebadores de oligonucleótidos inmovilizados en múltiples posiciones (diamantes rellenos). Las polimerasas adecuadas incluyen una polimerasa que carece de actividad nucleasa 5 '^3 ' como se describe anteriormente. Esto genera productos de extensión secundarios de longitud única (Figura 11, etapa C). El producto de extensión principal se desnaturaliza y se elimina por lavado como se muestra en la Figura 11, etapa D. Los productos de extensión secundarios monocatenarios restantes se amplifican usando un procedimiento de amplificación por agrupamiento donde los productos de extensión secundarios hibridan con segundos cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido como se muestra en Figura 11, etapa E. Los segundos cebadores se extienden con polimerasa (Figura 11, etapa F) para formar productos de extensión terciarios. Después de la desnaturalización (Figura 11, etapa G), los productos de extensión secundarios y terciarios hibridan con primeros y segundos cebadores complementarios sobre el soporte sólido (Figura 11, etapa H). Los cebadores hibridados se extienden por polimerasa para formar copias de los productos de extensión secundarios y terciarios como se muestra en la Figura 11, etapa I. Los productos de extensión se desnaturalizan y el procedimiento se repite para generar suficientes moldes para la secuenciación (Figura 11, etapa J) de cada hebra usando el procedimiento representado en la Figura 8. Los medios alternativos para formar superficies con copias idénticas unidas covalentemente del amplicón ACR limitado (corto) incluyen la amplificación Sequoia (documento WO2013/012440 de Barany et al.) y la amplificación Wildfire (Ma et al., "Isothermal Amplification Method for Next-Generation Sequencing", Proc Natl Acad Sci USA 10(35):14320-3 (2013)).
La Figura 12 ilustra otro procedimiento ejemplar de secuenciación de acuerdo con la presente divulgación, similar al presentado en la Figura 11. En la Figura 12, etapa A, la ADN polimerasa Phi29 o Bst (diamantes rellenos) extiende el cebador de amplificación en el molde circular quimérico para generar un producto de extensión principal monocatenario largo. La polimerasa y el producto de extensión principal se desnaturalizan del molde circular. Como se muestra en la Figura 12, etapa B, el producto de extensión principal hibrida con múltiples primeros cebadores en más de un pocillo o área sobre un soporte sólido. Dado que el producto de extensión principal es largo, se puede extender a múltiples pocillos o áreas discretas sobre la superficie sólida que tiene cebadores. La ventaja de esta propiedad de los productos de extensión largos es que la misma diana se secuenciará en múltiples pocillos o áreas vecinas, proporcionando de ese modo una verificación adicional de una mutación de baja abundancia. El producto de extensión principal se copia mediante la extensión por polimerasa de los primeros cebadores de oligonucleótidos inmovilizados en múltiples posiciones (diamantes rellenos), como se muestra en la Figura 12, etapa C. Las polimerasas adecuadas incluyen polimerasa que carece de actividad nucleasa 5'^-3' como se describe anteriormente. Esto genera productos de extensión secundarios de longitud única, excepto cuando se puentean entre pocillos donde se generan productos de extensión repetidos en tándem (Figura 12, etapas C y D). El producto de extensión principal se desnaturaliza y se elimina por lavado como se muestra en la Figura 12, etapa E. Los productos de extensión secundarios monocatenarios restantes se amplifican usando un procedimiento de amplificación por agrupamiento donde los productos de extensión secundarios hibridan con segundos cebadores de oligonucleótidos sobre el soporte sólido como se muestra en Figura 11, etapas E-I. Los productos de extensión se desnaturalizan y el procedimiento se repite para generar suficientes moldes para la secuenciación (véase la Figura 11, etapa J) de cada hebra usando el procedimiento representado en la Figura 8.
Otra divulgación se dirige a procedimientos para preparar las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario que son un componente de los sistemas y procedimientos descritos en el presente documento. A continuación se describen varios procedimientos ejemplares y se representan en las figuras adjuntas.
Un procedimiento adecuado para preparar las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario implica proporcionar una muestra que contenga uno o más segmentos de ADN genómico diana. Los segmentos de ADN genómico diana pueden contener potencialmente una o más diferencias de bases o uno o más residuos metilados de interés para la detección. El procedimiento implica además
proporcionar una o más primeras sondas de oligonucleótido, cada primera sonda de oligonucleótido comprendiendo (a) una porción específica de diana 5', (b) una porción específica de diana 3', y (c) una porción adicional. La porción adicional es una secuencia de nucleótidos que comprende (i) una secuencia de identificador de paciente, (ii) una porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, y (iii) una porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido. La muestra y una o más de las primeras sondas de oligonucleótido se ponen en contacto en condiciones eficaces para que la porción específica de diana 3' de una primera sonda de oligonucleótido hibride de manera específica según las bases con un extremo 3' complementario de un segmento de ADN genómico diana, y para la porción específica de diana 5' de la primera sonda de oligonucleótido hibride de manera específica según las bases con un extremo 5' complementario del segmento de ADN genómico diana, si está presente en la muestra. Después de la hibridación se generan uno o más puntos de unión aptos para fijación adecuados para acoplar los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana hibridado con la primera sonda de oligonucleótido y el segmento de ADN genómico diana se fija en uno o más puntos de unión para fijación para formar una construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.
La Figura 13, etapas A-E, muestra un procedimiento ejemplar para producir construcciones "diana" circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En este modo de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADN libre circulante (ADNlc) que tienen una longitud promedio de 160 pb, o segmentos de ADN genómico cortados a fragmentos de aproximadamente 160 pb ("oligonucleótido diana" o "segmento de ADN"). El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos a los segmentos de ADN (barras negras gruesas, Figura 13, etapa A). Como se muestra en la Figura 13, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los extremos 5' y 3' del segmento de ADN diana y complementarias al conector 3' hibridan con los segmentos de ADN. La región en bucle cerca del extremo 3' del oligonucleótido de ADN diana en la Figura 13, etapa B, es una región del oligonucleótido diana que no es complementaria a la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en esta Figura, las regiones pequeñas de no complementariedad entre el segmento de oligonucleótidos diana y la sonda de oligonucleótido no afectan el procedimiento de formación de las construcciones circulares quiméricas.
La porción adicional de la sonda de oligonucleótido (mostrada como una barra negra gruesa) también puede contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una secuencia de unión a cebador y/o un enlace escindible (Figura 13, etapa B, panel izquierdo, el enlace escindible representado dentro de la barra gruesa marcada como "U"). La sonda de oligonucleótido también puede contener un grupo bloqueante en un extremo (Figura 13, etapa B, panel derecho, la sonda tiene un grupo bloqueante en 5'). Como se muestra en la Figura 13, etapa C, una polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' del conector corto hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La polimerasa usada en este modo de realización puede comprender actividad exonucleasa, por ejemplo, actividad exonucleasa 5' a 3' o actividad exonucleasa 3' a 5'. Después de la extensión, una nucleasa 5' escinde en una base complementaria solapante en 5' de ADN diana para eliminar la región del conector 5', dejando de este modo un fosfato 5' apto para fijación. La polimerasa también extiende el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde (Figura 13, etapa C), pero no escinde el grupo bloqueante (Figura 13, etapa C, lado izquierdo). En la Figura 13, etapa D (panel izquierdo), la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión para fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido, y los extremos 3' y 5' de la sonda de oligonucleótido extendida para crear productos de fijación circular. Se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulo relleno) de la sonda de oligonucleótido circularizada, para hacer que la sonda de oligonucleótido sea susceptible a las digestiones por exonucleasa (Figura 13, etapa E, panel izquierdo). Como se muestra en la Figura 13, etapa D, panel derecho, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión para fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido; sin embargo, el grupo bloqueante en 5' de la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 13, etapa E, la(s) exonucleasa(s) digiere(n) todos los productos oligonucleotídicos no fijados o mellados (es decir, sondas de oligonucleótido), dejando solo las construcciones circulares de ácido nucleico monocatenario deseadas que comprenden el segmento de ADN diana original acoplado a la porción adicional que contiene, por ejemplo, una secuencia de identificador único, secuencia de unión a cebador o secuencia de identificador de paciente. Como se describe anteriormente, el producto circularizado resultante es adecuado para la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular.
El procedimiento representado en la Figura 14, etapas A-E, es esencialmente el mismo que el que se muestra en la Figura 13, etapas A-E; sin embargo, la sonda de oligonucleótido comprende un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles ("r"), una secuencia de unión a cebador y un grupo de captura en 5' opcional ("Z") (véase Figura 14, etapa B). La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' del conector corto hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La escisión por nucleasa del extremo 5' del segmento de ADN en una base complementaria solapante genera un fosfato 5' apto para fijación (Figura 14, etapa C). En la Figura 14, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo extendido para crear un producto de fijación diana circular. El grupo bloqueante en 3' de la sonda de oligonucleótido evita la extensión de la sonda de oligonucleótido. Posteriormente, el grupo bloqueante se elimina por escisión en el enlace escindible, por ejemplo, escisión por RNasa (triángulo relleno) de ribonucleótido "r" (Figura 14, etapa D). Como se muestra en la Figura 14, etapa E, la polimerasa (diamante relleno) con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado de la sonda de oligonucleótido para iniciar la amplificación por círculo rodante. El producto de extensión principal formado por amplificación por círculo rodante es adecuado para secuenciación. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
Las Figuras 15 y 17 muestran un procedimiento similar al representado en la Figura 13 para producir construcciones circulares quiméricas "diana" de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación. El ADN genómico diana se deriva del ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos a los segmentos de ADN (barras negras gruesas, Figura 15, etapa A y Figura 17, etapa A). Como se muestra en la Figura 15, etapa B y la Figura 17, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los extremos 5' y 3' del segmento de ADN y complementarias al conector 3' del segmento de ADN hibridan con los segmentos de ADN diana. En el modo de realización representado en la Figura 15, etapa B, la sonda de oligonucleótido contiene una región, es decir, una porción de secuencia de nucleótidos que no es complementaria al extremo 3' del oligonucleótido diana (porción en bucle cerca del extremo 3' del oligonucleótido sonda de la Figura 15, etapa B). Además, el extremo 5' del oligonucleótido diana, incluido el conector, no es complementario a la sonda de oligonucleótido, formando de este modo un flap. En el modo de realización de la Figura 17, etapa B, tanto la sonda de oligonucleótido como el oligonucleótido diana contienen porciones de secuencia de nucleótidos que no son complementarias al oligonucleótido diana o sonda, respectivamente. Estas regiones no complementarias se representan como una región en bucle cerca del extremo 3' de la sonda de oligonucleótido y una región en bucle cerca del extremo 5' del oligonucleótido diana (Figura 17, etapa B). Estas regiones no afectan el procedimiento global de formación de las construcciones circularizadas de ácido nucleico.
La porción adicional de las sondas de oligonucleótido (que se muestra como una barra negra gruesa) puede contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una secuencia de unión a cebador y/o un enlace escindible (representado dentro de la barra gruesa como "U") (Figura 15, etapa B y Figura 17, etapa B, panel izquierdo). Las sondas de oligonucleótido también pueden contener un grupo bloqueante en un extremo (Figura 15, etapa B y Figura 17, etapa B, panel derecho; grupo bloqueante en el extremo 5' de la sonda de oligonucleótido). Como se muestra en la Figura 15, etapa C y la Figura 17, etapa C, una polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' del conector corto hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La polimerasa usada en este modo de realización puede comprender actividad exonucleasa, por ejemplo, actividad exonucleasa 5' a 3' o actividad exonucleasa 3' a 5'. Después de la extensión, una nucleasa 5' escinde en una base complementaria solapante en 5' de ADN diana para eliminar la región del conector 5', dejando de este modo un fosfato 5' apto para fijación (Figura 15, etapa C y Figura 17, etapa C). La polimerasa también extiende el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde (Figura 15, etapa C y Figura 17, etapa C). El grupo bloqueante en el extremo 5' de la sonda (Figura 15, etapa C y Figura 17, etapa C, lado izquierdo) no se escinde. En la Figura 15, etapa D y la Figura 17, etapa D (panel izquierdo), la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión para fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido, y los extremos 3' y 5' de la sonda de oligonucleótido extendida para crear productos de fijación circular. Se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulo relleno) de la sonda de oligonucleótido circularizada, para hacer que la sonda de oligonucleótido sea susceptible a las digestiones por exonucleasa (Figura 15, etapa E y Figura 17, etapa E, panel izquierdo). Como se muestra en las Figuras 15, etapa D y 17, etapa D, panel derecho, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente la unión de fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido; sin embargo, el grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 15, etapa E y la Figura 17, etapa E, la(s) exonucleasa(s) digiere(n) todos los productos oligonucleotídicos no fijados o mellados (es decir, sondas de oligonucleótido), dejando solo las construcciones circulares de ácido nucleico monocatenario deseadas que comprenden el segmento de ADN diana original acoplado a la porción adicional que contiene, por ejemplo, una secuencia de identificador único, secuencia de unión a cebador o secuencia de identificador de paciente. Como se describe anteriormente, el producto circularizado resultante es adecuado para la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular.
El procedimiento representado en las Figuras 16 y 18 es esencialmente el mismo que el mostrado en las Figuras 15 y 17, respectivamente; sin embargo, la sonda de oligonucleótido comprende un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles, una secuencia de unión a cebador y un grupo de captura en 5' opcional ("Z") (véase Figura 16, etapa B y Figura 18, etapa B). La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' del conector corto hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La escisión por nucleasa del extremo 5' del segmento de ADN en una base complementaria solapante genera un fosfato 5' apto para fijación (Figura 16, etapa C y Figura 18, etapa C). En la Figura 16, etapa D y Figura 18, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo extendido para crear un producto de fijación circular. El grupo bloqueante en 3' de la sonda de oligonucleótido evita la extensión de la sonda de oligonucleótido. Posteriormente, el grupo bloqueante se elimina por escisión en el enlace escindible, por ejemplo, escisión por RNasa (triángulo relleno) de ribonucleótido "r". Como se muestra en la Figura 16, etapa E y la Figura 18, etapa E, la polimerasa (diamante relleno) con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado de la sonda de oligonucleótido para iniciar la amplificación por círculo rodante. El producto de extensión principal formado por amplificación por círculo rodante es adecuado para secuenciación. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
Las Figuras 19 y 21 muestran un procedimiento similar para producir construcciones circulares quiméricas "diana" de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe en referencia a las Figuras 13, 15 y 17 anteriores. El ADN genómico diana se deriva del ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb. En este modo de realización, el procedimiento comienza con la adición mediada por transferasa terminal de colas de secuencia de nucleótidos cortas al extremo 3' de las hebras de oligonucleótidos diana (barras negras gruesas en los extremos 3' de los oligonucleótidos diana, Figura 19, etapa A y Figura 21, etapa A) Como se muestra en la Figura 19, etapa B y la Figura 21, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los extremos 5' y 3' del segmento de ADN y complementarias al conector 3' del segmento de ADN hibridan con los segmentos de ADN diana. En el modo de realización representado en la Figura 19, etapa B, el oligonucleótido de ADN contiene una región, es decir, una porción de secuencia de nucleótidos en su extremo 3' que no es complementaria al oligonucleótido sonda (porción en bucle cerca del extremo 3' del oligonucleótido diana en la Figura 19, etapa B). Además, el extremo 5' del oligonucleótido diana no es complementario a la sonda de oligonucleótido, formando de este modo un flap. En el modo de realización de la Figura 21, etapa B, la sonda de oligonucleótido contiene una porción de secuencia de nucleótidos que no es complementaria al oligonucleótido diana. Esta región no complementaria se representa como una región en bucle cerca del extremo 3' de la sonda de oligonucleótido. El extremo 5' del oligonucleótido diana en la Figura 21, etapa B, no es complementario a la sonda de oligonucleótido, formando un flap adecuado para la escisión por nucleasa. Estas regiones de no complementariedad entre el oligonucleótido diana y el oligonucleótido sonda no afectan el procedimiento general de formación de las construcciones circularizadas de ácido nucleico.
La porción adicional de las sondas de oligonucleótido (que se muestra como una barra negra gruesa) puede contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una secuencia de unión a cebador y/o un enlace escindible (marcado dentro de la barra gruesa como "U") (Figura 19, etapa B y Figura 21, etapa B, panel izquierdo). Las sondas de oligonucleótido también pueden contener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, Figura 19, etapa B y Figura 21, etapa B, el panel derecho muestran un grupo bloqueante en el extremo 5' de la sonda de oligonucleótido). Como se muestra en la Figura 19, etapa C y Figura 21, etapa C, una polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' del conector corto hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La polimerasa usada en este modo de realización puede comprender actividad exonucleasa, por ejemplo, actividad exonucleasa 5' a 3' o actividad exonucleasa 3' a 5'.
Después de la extensión, una nucleasa 5' escinde en una base complementaria solapante en 5' de ADN diana para eliminar la región del conector 5', dejando de este modo un fosfato 5' apto para fijación. La polimerasa también extiende el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde (Figura 19, etapa C y Figura 21, etapa C). El grupo bloqueante en el extremo 5' de la sonda (Figura 19, etapa C y Figura 21, etapa C, lado derecho) no se escinde. En la Figura 19, etapa D y la Figura 21, etapa D (panel izquierdo), la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión para fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido, y los extremos 3' y 5' de la sonda de oligonucleótido extendida para crear productos de fijación circular. Se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulo relleno) de la sonda de oligonucleótido circularizada, para hacer que la sonda de oligonucleótido sea susceptible a la digestión con exonucleasa (Figura 19, etapa E y Figura 21, etapa E, panel izquierdo). Como se muestra en las Figuras 19, etapa D y 21, etapa D, panel derecho, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente la unión de fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido; sin embargo, el grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 19, etapa E y la Figura 21, etapa E, la(s) exonucleasa(s) digiere(n) todos los productos oligonucleotídicos no fijados o mellados (es decir, sondas de oligonucleótido), dejando solo las construcciones circulares de ácido nucleico monocatenario deseadas que comprenden el segmento de ADN diana original acoplado a la porción adicional que contiene, por ejemplo, una secuencia de identificador único, secuencia de unión a cebador o secuencia de identificador de paciente. Como se describe anteriormente, el producto circularizado resultante es adecuado para la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular.
El procedimiento representado en las Figuras 20 y 22 es esencialmente el mismo que el mostrado en las Figuras 19 y 21, respectivamente; sin embargo, la sonda de oligonucleótido comprende un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles ("r"), una secuencia de unión a cebador y un grupo de captura en 5' opcional ("Z") (como se muestra en la Figura 20, etapa B y la Figura 22, etapa B). La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' del conector corto hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La escisión por nucleasa del extremo 5' del segmento de ADN en una base complementaria solapante genera un fosfato 5' apto para fijación (Figura 20, etapa C y Figura 22, etapa C). En la Figura 20, etapa D y Figura 22, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo extendido 3' de la diana a su extremo 5' para crear un producto de fijación circular. El grupo bloqueante en 3' de la sonda de oligonucleótido evita la extensión de la sonda de oligonucleótido. Posteriormente, el grupo bloqueante se elimina por escisión en el enlace escindible, por ejemplo, escisión por RNasa (triángulo relleno) de ribonucleótido "r". Como se muestra en la Figura 20, etapa E y la Figura 22, etapa E, la polimerasa (diamante relleno) con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado de la sonda de oligonucleótido para iniciar la amplificación por círculo rodante. El producto de extensión principal formado por amplificación por círculo rodante es adecuado para secuenciación. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 23 y la Figura 25 muestran un procedimiento similar para producir construcciones circulares quiméricas "diana" de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe en referencia a las Figuras 13, 15, 17, 19 y 21 anteriores. El ADN genómico diana se deriva del ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb. En los modos de realización de las Figuras 23 y 25 no se añaden conectores o colas 3' o 5' a los segmentos de ADN genómico. Como se muestra en la Figura 23, etapa B y la Figura 25, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los extremos 5' y 3' del segmento de ADN hibridan con los segmentos de ADN diana. En el modo de realización representado en la Figura 23, etapa B, los extremos 3' y 5' del oligonucleótido de ADN no son complementarios a la sonda de oligonucleótido, formando dos flaps no hibridados. En el modo de realización de la Figura 25, etapa B, los extremos 3' y 5' del oligonucleótido de ADN son complementarios a la sonda de oligonucleótido.
La porción adicional de las sondas de oligonucleótido (que se muestra como una barra negra gruesa) puede contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una secuencia de unión a cebador y/o un enlace escindible (marcado dentro de la barra gruesa como "U") (Figura 23, etapa B y Figura 25, etapa B, panel izquierdo). Las sondas de oligonucleótido también pueden contener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, Figura 23, etapa B y Figura 25, etapa B, panel derecho; grupo bloqueante en el extremo 5' de la sonda de oligonucleótido). Como se muestra en la Figura 23, etapa C, una polimerasa (diamante relleno) que tiene actividad nucleasa 3' elimina el extremo 3' monocatenario del oligonucleótido diana y, a continuación, extiende el extremo 3' del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. La extensión mediada por polimerasa del extremo 3' del oligonucleótido diana también se produce en el procedimiento de la Figura 25, etapa B. Después de la extensión en los procedimientos de la Figura 23, etapa C, y la Figura 25, etapa C, una nucleasa 5' escinde en una base complementaria solapante en 5' de ADN diana para eliminar la región del conector 5', dejando de este modo un fosfato 5' apto para fijación. La polimerasa también extiende el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde (Figura 23, etapa C y Figura 25, etapa C). El grupo bloqueante en el extremo 5' de la sonda (Figura 23, etapa C y Figura 25, etapa C, lado derecho) no se escinde. En la Figura 23, etapa D y la Figura 25, etapa D (panel izquierdo), la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión para fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido, y los extremos 3' y 5' de la sonda de oligonucleótido extendida para crear productos de fijación circular. Se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulo relleno) de la sonda de oligonucleótido circularizada, para hacer que la sonda de oligonucleótido sea susceptible a las digestiones por exonucleasa (Figura 23, etapa E y Figura 25, etapa E, panel izquierdo). Como se muestra en las Figuras 23, etapa D y 25, etapa D, panel derecho, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente la unión de fijación entre los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana extendido; sin embargo, el grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 23, etapa E y la Figura 25, etapa E, la(s) exonucleasa(s) digiere(n) todos los productos oligonucleotídicos no fijados o mellados (es decir, sondas de oligonucleótido), dejando solo las construcciones circulares de ácido nucleico monocatenario deseadas que comprenden el segmento de ADN diana original acoplado a la porción adicional que contiene, por ejemplo, una secuencia de identificador único, secuencia de unión a cebador o secuencia de identificador de paciente. Como se describe anteriormente, el producto circularizado resultante es adecuado para la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular.
Las porciones específicas de diana 3' y 5' de las sondas de oligonucleótido, por ejemplo, las sondas de oligonucleótido usadas en el procedimiento representado en la Figura 25, se pueden diseñar para contener uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con el segmento de ADN genómico diana. Este rasgo característico de diseño garantiza que el segmento de ADN genómico diana de la construcción circularizada fijada de ácido nucleico se puede distinguir de la porción extendida de polimerasa de la construcción circularizada fijada de ácido nucleico (es decir, la línea continua de la construcción circularizada se puede distinguir de la línea discontinua de la construcción en las Figuras 25E).
El procedimiento representado en las Figuras 24 y 26 es esencialmente el mismo que el mostrado en las Figuras 23 y 25, respectivamente; sin embargo, la sonda de oligonucleótido comprende un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles, una secuencia de unión a cebador y un grupo de captura en 5' opcional ("Z") (Figura 24, etapa B y Figura 26, etapa B). La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' hibridado del segmento de ADN para copiar la porción adicional de la sonda de oligonucleótido. En el modo de realización de la Figura 24, etapa C, la polimerasa escinde el flap no complementario 3' del oligonucleótido diana antes de la extensión. La escisión por nucleasa del extremo 5' del segmento de ADN en una base complementaria solapante genera un fosfato 5' apto para fijación (Figura 24, etapa C y Figura 26, etapa C). En la Figura 24, etapa D y Figura 26, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo extendido 3' del segmento de a Dn a su extremo 5' para crear un producto de fijación circular. El grupo bloqueante en 3' de la sonda de oligonucleótido evita la extensión de la sonda de oligonucleótido. Posteriormente, el grupo bloqueante se elimina por escisión en el enlace escindible, por ejemplo, escisión por RNasa (triángulo relleno) de ribonucleótido "r". Como se muestra en la Figura 24, etapa E y la Figura 26, etapa E, la polimerasa (diamante relleno) con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado de la sonda de oligonucleótido para iniciar la amplificación por círculo rodante. El producto de extensión principal formado por amplificación por círculo rodante es adecuado para secuenciación. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 27 muestra un procedimiento de formación de construcciones circularizadas de ácido nucleico monocatenario que contienen sitios HinPlI metilados contiguos (GCGC). Las construcciones circularizadas de ácido nucleico son adecuadas para la detección y/o secuenciación de los sitios HinPlI metilados. Como se muestra en la Figura 27, etapa A, el procedimiento comienza con la escisión de ADNlc o ADN genómico con HinPlI en sitios de reconocimiento HinPlI no metilados para formar segmentos de ADN genómico de aproximadamente 160 pb. Los sitios HinPlI metilados dentro de los fragmentos de oligonucleótido diana se indican con 'm'. Como se muestra en la Figura 27, etapa B, las sondas de oligonucleótido con secuencia de identificador único (línea negra gruesa) y secuencias HinPlI no metiladas cerca de los extremos 3' y 5' de la sonda de oligonucleótido (es decir, complementarios a los sitios HinPlI del ADNlc) hibridan con oligonucleótidos de ADNlc diana que tienen sitios HinP1I metilados (panel izquierdo) o sitios HinPlI no metilados (panel derecho). El extremo 5' de la sonda de oligonucleótido contiene un grupo bloqueante y el extremo 3' tiene emparejamientos erróneos con el oligonucleótido diana para evitar la extensión por polimerasa. En la Figura 27, etapa C, la sonda de oligonucleótido hibridada con el segmento diana genómico se somete a la escisión por HinPlI (triángulos rellenos). Si tanto los oligonucleótidos sonda como diana no contienen sitios HinPlI metilados, HinPlI escinde los oligonucleótidos diana y sonda, eliminando por tanto las secuencias diana no metiladas de un análisis adicional. Si el oligonucleótido diana contiene sitios HinPlI metilados, pero el oligonucleótido sonda no contiene sitios HinPlI metilados como se muestra en la Figura 27, etapa C, panel izquierdo, HinPlI escinde solo el oligonucleótido sonda, generando de este modo un 3'-OH apto para extensión y un fosfato 5' apto para fijación en la sonda. La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' liberado de la sonda de oligonucleótido, y la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo 3' extendido y el extremo 5' de la sonda de oligonucleótido para crear un producto de fijación cerrado covalentemente (Figura 27, etapa D). La inactivación térmica de HinP1I, o la incorporación por polimerasa de nucleótidos modificados evita una nueva escisión con HinP1I. Como se muestra en la Figura 27, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o escindidos, dejando de este modo solo las construcciones circulares de ADN monocatenario deseadas que comprenden el complemento del ADN diana con una secuencia de identificador único. Este producto de fijación circularizado es adecuado para la amplificación por círculo rodante y la secuenciación posterior.
La Figura 28 muestra un procedimiento para el descubrimiento de la metilación en sitios HinPlI contiguos (GCGC) en todo el genoma. Este procedimiento implica escindir el ADN genómico con HinPlI y fijar en conectores cortos (líneas negras gruesas) con extremos 5' bloqueados en los fragmentos genómicos escindidos como se muestra en la Figura 28, etapa A. "m" indica los sitios HinPlI metilados. En la Figura 28, etapa B, la amplificación por PCR limitada con cebadores bloqueados en 5' genera productos no metilados. Solo los sitios HinPlI contiguos (GCGG) metilados en la diana original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con HinPlI (triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 28, etapa C, fijar (círculos rellenos) en conectores (líneas dobles) que contienen una secuencia de identificador único opcional (líneas dobles rellenas grises), una secuencia de identificador de paciente opcional (líneas dobles rellenas grises), con el extremo 3' bloqueado o con cadena principal que contiene tiofosfato (****) para inhibir la digestión posterior con exonucleasa 3' (triángulos rellenos). Solo los fragmentos con conectores fijados a ambos lados permanecerán bicatenarios. En la Figura 28, etapa D, el extremo libre de los conectores se vuelve apto para fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. En la Figura 28, etapa E, las condiciones de fijación están diseñadas para favorecer la oligomerización. Los productos fijados comprenden secuencias HinPlI contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador de paciente opcional. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 29 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar la metilación en sitios AciI contiguos (GCGG) en regiones genómicas conocidas comenzando a partir de ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb ("oligonucleótido diana" o "segmento de ADN"). Como se muestra en la Figura 29, etapa A, el procedimiento comienza agregando conectores resistentes a bisulfito (líneas negras gruesas) en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN genómico (por ejemplo, mediante fijación). El tratamiento con bisulfito del ADN genómico convierte las citosinas no metiladas en uracilos, lo que da como resultado productos monocatenarios ("m" en la Figura 29, el etapa A representa sitios AciI metilados). Se realiza una PCR limitada para generar productos bicatenarios, y el producto de PCR resultante se escinde con AciI (triángulos rellenos). Solo los sitios metilados en el segmento diana original permanecen como GCGG y se someten a la escisión por AciI para generar extremos aptos para fijación. Como se muestra en la Figura 29, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del oligonucleótido diana escindido y, opcionalmente, un grupo bloqueante 5', hibridan con sus respectivos oligonucleótidos diana complementarios. Además de las porciones específicas de diana, las sondas de oligonucleótido también contienen una porción adicional. Esta porción adicional es una porción de secuencia de nucleótidos que puede contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y uno o más sitios de unión a cebador. Como se muestra en la Figura 29, etapa C, la polimerasa que carece de actividad 5'->3' (diamantes rellenos) extiende el extremo 3' del oligonucleótido diana, copiando la porción adicional de la sonda y generando un punto de unión apto para fijación con el extremo 5' del oligonucleótido diana. La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el oligonucleótido diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante 5' de la sonda si está presente. En la Figura 29, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente los extremos 3' y 5' del oligonucleótido diana para crear un producto de fijación circular que contiene el segmento de ADN diana (tratado con bisulfito y copiado). El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la hebra de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 29, etapa E, la(s) exonucleasa(s) digiere(n) todos los productos no fijados o mellados dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el complemento de ADN diana convertido con bisulfito con una secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para la secuenciación circular usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.
La Figura 30 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar la metilación en sitios AciI contiguos (GCGG) en regiones genómicas conocidas comenzando a partir de ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb. Como se muestra en la Figura 30A, el procedimiento comienza agregando conectores resistentes a bisulfito (líneas negras gruesas) a los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN genómico (por ejemplo, mediante fijación). "m" en los segmentos de ADN genómico representa sitios AciI metilados. El tratamiento con bisulfito de los segmentos de ADNlc y/o ADN genómico convierte las C no metiladas en U que generan productos monocatenarios. Se realiza una PCR limitada para generar productos bicatenarios, y los productos de PCR resultantes se escinden con AciI (triángulos rellenos, solo los sitios metilados en la diana original permanecen como GCGG) para generar extremos aptos para fijación. Como se muestra en la Figura 30, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los lados 5' y 3' de los productos de PCR diana escindidos hibridan con sus respectivos oligonucleótidos diana complementarios. La sonda de oligonucleótido puede tener un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles y/o un grupo de captura 5' opcional ("Z"). Además de las porciones específicas de diana, las sondas de oligonucleótido también contienen una porción adicional. Esta porción adicional es una porción de secuencia de nucleótidos que puede contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y uno o más sitios de unión a cebador.
Como se muestra en la Figura 30, etapa C, una polimerasa que carece de actividad 5'->3' (diamantes rellenos) extiende el extremo 3' del oligonucleótido diana, copiando la porción adicional de la sonda y generando un punto de unión apto para fijación con el extremo 5' del oligonucleótido diana. En la Figura 30, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente los extremos 3' y 5' del oligonucleótido diana para crear un producto de fijación circular que contiene el segmento de ADN diana (tratado con bisulfito y copiado). El grupo bloqueante 3' en la sonda de oligonucleótido evita la extensión y la circularización de la hebra de la sonda de oligonucleótido. La posterior eliminación del grupo bloqueante 3' mellando el enlace escindible (por ejemplo, la escisión por RNasa del ribonucleótido r) permite la extensión mediada por polimerasa de la sonda de oligonucleótido (Figura 30, etapa D). Como se muestra en la Figura 30, etapa E, la polimerasa (diamante relleno) con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado para la amplificación por círculo rodante. Este producto de extensión es adecuado para secuenciación usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 31 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar la metilación en sitios AciI contiguos (GCGG) en regiones genómicas conocidas comenzando a partir de ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb (m representa sitios AciI metilados). Como se muestra en la Figura 31, etapa A, el procedimiento comienza agregando conectores resistentes a bisulfito (líneas negras gruesas) en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN genómico (por ejemplo, mediante fijación). El tratamiento con bisulfito de los segmentos de ADNlc y/o ADN genómico convierte las C no metiladas en U que generan productos monocatenarios. Se realiza una PCR limitada para generar productos bicatenarios, y los productos de PCR resultantes se escinden con AciI (triángulos rellenos). Solo los sitios metilados en la diana original permanecen como GCGG y se someten a escisión por AciI para generar extremos aptos para fijación. Como se muestra en la Figura 31, etapa B, las sondas de oligonucleótido dúplex hibridan con los segmentos de ADN diana escindidos. Las sondas dúplex comprenden una primera hebra de sonda de oligonucleótido que contiene secuencias de nucleótidos complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana, que están separados entre sí por una porción adicional. La porción adicional comprende una porción de identificador único y/o una porción de identificador de paciente y/o una o más secuencias de unión a cebador. La segunda sonda de oligonucleótido de la sonda de oligonucleótido dúplex (línea negra gruesa con bucle) contiene una secuencia que es complementaria a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido. La región en bucle de la segunda sonda de oligonucleótido representa una región no complementaria. Como se muestra en la Figura 31, etapa C, la hibridación de las sondas dúplex con los segmentos de ADN genómico escindidos crea dos puntos de unión aptos para fijación, entre el extremo 3' del segmento de ADN y el extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y entre el extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' del segmento genómico escindido. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los puntos de unión para fijación para crear productos de fijación circulares que contienen el segmento de ADN diana (tratado con bisulfito y copiado) (Figura 31, etapa C). Como se muestra en la Figura 31, etapa D, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos de fijación circulares monocatenarios deseados que son adecuados para la secuenciación circular usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
La Figura 32 muestra esencialmente el mismo procedimiento para producir construcciones quiméricas circulares de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar la metilación en sitios AciI contiguos como se muestra y describe en la Figura 31. En el modo de realización representado en la Figura 32, la primera sonda de oligonucleótido del conjunto de sonda dúplex tiene un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 32, etapa B). Después de la fijación de la segunda sonda de oligonucleótido y el segmento de ADN diana (tratado con bisulfito, copiado) para formar un producto de fijación circularizado (Figura 32, etapa C), el extremo 3' de la primera sonda de oligonucleótido se extiende usando una polimerasa de desplazamiento de hebra. La amplificación por círculo rodante genera un primer producto de extensión principal, que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figura 32, etapa D) y adecuadas para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento.
La Figura 33 muestra un procedimiento para el descubrimiento de la metilación en sitios AciI contiguos (GCGG) en todo el genoma comenzando a partir de ADN genómico que ha sido cortado a un tamaño promedio de 150 pb o de ADNlc con un tamaño promedio de 160 pb. Como se muestra en la Figura 33, etapa A, el procedimiento comienza agregando, por ejemplo, mediante fijación, conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (líneas negras gruesas). El conector 5' contiene un grupo bloqueante. El tratamiento con bisulfito del ADN genómico convierte las C no metiladas en U, lo que da como resultado productos monocatenarios. Como se muestra en la Figura 33, etapa B, la amplificación por PCR limitada con cebadores bloqueados en 5' genera productos no metilados. Solo los sitios AciI contiguos (GCGG) metilados en la diana original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con AciI (triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 33, etapa C, se agregan conectores (líneas dobles grises) que contienen una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente (por ejemplo, mediante fijación a productos de escisión con AciI). Los conectores contienen un grupo bloqueante en 3' o una cadena principal que contiene tiofosfato (****) para inhibir la digestión posterior con exonucleasa 3' (triángulos rellenos). Solo los fragmentos con conectores agregados a ambos lados permanecen bicatenarios (Figura 33, etapa C, panel inferior). Como se muestra en la Figura 33, etapa D, los extremos del conector se vuelven aptos para fijación (círculos rellenos), ya sea (i) fosforilando los extremos 5', (ii) eliminando los grupos 3' bloqueados, o (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5' para generar fosfato 5' apto para fijación, o (iv) cualquier combinación de estas técnicas. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la oligomerización. La Figura 33, etapa E, muestra productos fijados compuestos del complemento de ADN diana convertido con bisulfito (que procede principalmente de islas CpG) con un identificador único opcional y/o una secuencia de identificador de paciente. El producto final es adecuado para etapas adicionales y secuenciación posterior.
La Figura 34 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios HinPlI contiguos no metilados en regiones definidas del genoma comenzando a partir de ADNlc con una longitud promedio de 160 pb o ADN genómico cortado a fragmentos de aproximadamente 160 pb. Como se muestra en la Figura 34, etapa A, el procedimiento comienza con la escisión de HinPlI del ADN genómico en los sitios de reconocimiento de GCGC (triángulos rellenos) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación. Como se muestra en la Figura 34, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana escindidos hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana escindidos. Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que contiene una secuencia de identificador único y, opcionalmente, una secuencia de identificador de paciente. En el modo de realización de la Figura 34, la sonda de oligonucleótido también tiene un grupo bloqueante en un extremo, por ejemplo, el extremo 5'. La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda y creando un punto de unión para fijación con el fosfato apto para fijación en el extremo 5' de la diana (Figura 34, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 34, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 34, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular.
La Figura 35 muestra esencialmente el mismo procedimiento para producir construcciones quiméricas circulares de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios HinP1I contiguos no metilados en regiones definidas del genoma como se muestra y describe en la Figura 34. En el modo de realización representado en la Figura 35, la sonda de oligonucleótido contiene secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, la sonda de oligonucleótido también tiene un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles, donde el enlace escindible se representa como "r", y un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 35, etapa B). El extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado se extiende por la polimerasa, creando un punto de unión para fijación con el fosfato apto para fijación en el extremo 5' del segmento de ADN diana. Después de la fijación del extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN diana para formar un producto de fijación circularizado (Figura 35, etapa C), el grupo bloqueante 3' de la sonda de oligonucleótido se elimina (por ejemplo, escisión por RNasa H del enlace de ribonucleótido) (Figura 35, etapa D), y una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende la sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación de ADN circularizado como molde (Figura 35, etapa E). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 35, etapa E). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
Las Figuras 36 y 37 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Acil metilados entre sitios HaelII en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con Acil (triángulos rellenos, GCGG) y HaelII (triángulos rellenos, GGCC) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación; m representa sitios metilados dentro de los segmentos escindidos (Figura 36, etapa A y Figura 37, etapa A). En el modo de realización de la Figura 36, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de a Dn diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 36, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 36, etapa B). La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda y creando un punto de unión para fijación con el fosfato apto para fijación en el extremo 5' de la diana (Figura 36, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 36, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 36, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular.
En el modo de realización representado en la Figura 37, la sonda de oligonucleótido contiene secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, la sonda de oligonucleótido también tiene un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles, donde el enlace escindible se representa como "r", y un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 37, etapa B). Después de la fijación del extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN diana para formar un producto de fijación circularizado (Figura 37, etapa C), el grupo bloqueante 3' de la sonda de oligonucleótido se elimina (por ejemplo, escisión por RNasa H del enlace de ribonucleótido) (Figura 37, etapa D), y una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende la sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación de ADN circularizado como molde (Figura 37, etapa E). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 37, etapa E). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 38 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios AciI metilados entre sitios Bsh1236I en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con Bsh1236I (CGCG) y HaeIII (triángulos rellenos, GGCC) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación; m representa sitios metilados dentro de los segmentos escindidos (Figura 38, etapa A). En el modo de realización de la Figura 38, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 38, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 38, etapa B). La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda y creando un punto de unión para fijación con el fosfato apto para fijación en el extremo 5' de la diana (Figura 38, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 38, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 38, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante usando la polimerasa Bst en presencia de BstilI (CGCG) para garantizar que los sitios que estaban metilados en la diana original no se escindan y, posteriormente, se identifiquen por secuenciación. Este ejemplo muestra la utilización de la endonucleasa de restricción BstilI. Sin embargo, en este procedimiento también se pueden utilizar otras endonucleasas que escinden el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado. Estas incluyen, pero no se limitan a, las enzimas termófilas BstHHI (reconoce GCGC; un isoesquizómero de HhaI), BsiSI (reconoce CCGG; un isoesquizómero de HpaII) y Tail (reconoce ACGT; un isoesquizómero de MaeII).
La Figura 39 y la Figura 36 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios AciI metilados cerca de un sitio HaeIII 5' en regiones conocidas de ADN genómico. El procedimiento es adecuado para detectar sitios AciI metilados en ADN genómico cortado a un tamaño promedio de 160 pb o ADNlc que tiene un tamaño promedio de 160 pb. El ADN genómico se escinde con AciI (GCGG) y HaeIII (GGCC) para generar los extremos 5' aptos para fijación (Figura 39, etapa A y Figura 40, etapa A). En el modo de realización representado en la Figura 39, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de a Dn genómico diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 39, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que comprende una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 39, etapa B). La polimerasa con actividad nucleasa 3'->5' (diamantes rellenos), pero que carece de actividad 5'->3', elimina el extremo 3' monocatenario y, a continuación, extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda y creando un punto de unión para fijación con el fosfato apto para fijación en el extremo 5' de la diana (Figura 39, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 39, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 39, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular.
En el modo de realización representado en la Figura 40, las sondas de oligonucleótido contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana escindido que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, las sondas de oligonucleótido también tienen un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles, donde el enlace escindible se representa como "r", y un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 40, etapa A). Después de la fijación del extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN diana para formar un producto de fijación circularizado (Figura 40, etapa C), el grupo bloqueante 3' de la sonda de oligonucleótido se elimina (por ejemplo, escisión por RNasa H del enlace de ribonucleótido) (Figura 40, etapa D), y una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende la sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación de ADN circularizado como molde (Figura 40, etapa E). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 40, etapa E). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 41 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Bsh1236I metilados cerca de un sitio HaeIII 5' en regiones conocidas de ADN genómico. El procedimiento es adecuado para detectar sitios Bsh1236I metilados en ADN genómico cortado a un tamaño promedio de 150 pb o ADNlc que tiene un tamaño promedio de 160 pb. El ADN genómico se escinde con Bsh1236I (CGCG) y HaeIII (GGCC) para generar los extremos 5' aptos para fijación (Figura 41, etapa A). En el modo de realización representado en la Figura 41, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN genómico diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 41, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que comprende una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 41, etapa B). La polimerasa con actividad nucleasa 3'->5' (diamantes rellenos), pero que carece de actividad 5'->3', elimina el extremo 3' monocatenario del segmento de ADN diana y, a continuación, extiende el extremo 3' escindido del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda y creando un punto de unión para fijación con el fosfato apto para fijación en el extremo 5' de la diana (Figura 41, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 41, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 41, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante usando la polimerasa Bst en presencia de BstilI (CGCG) para garantizar que los sitios que estaban metilados en la diana original se identifiquen posteriormente por secuenciación. Este ejemplo muestra la utilización de la endonucleasa de restricción BstilI. Sin embargo, de forma alternativa se pueden utilizar otras endonucleasas que escinden el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado. Estas incluyen, pero no se limitan a, las enzimas termófilas BstHHI (reconoce GCGC; un isoesquizómero de HhaI), BsiSI (reconoce CCGG; un isoesquizómero de HpaII) y Tail (reconoce ACGT; un isoesquizómero de MaeII).
La Figura 42 y la Figura 43 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios AciI metilados cerca de un sitio HaeIII 3' en regiones genómicas conocidas de ADNlc o a Dn genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con AciI (GCGG) y HaeIII (GGCC) para generar los extremos 3' aptos para extensión (Figura 42, etapa A y Figura 43, etapa A). En el modo de realización de la Figura 42, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 42, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 42B). La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda. La actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' del segmento de ADN diana, generando de este modo un fosfato 5' apto para fijación (Figura 42, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 42, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular que contienen un segmento de ADN genómico original. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 42, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular.
En el modo de realización de la Figura 43, las sondas de oligonucleótido contienen secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, las sondas de oligonucleótido también tienen un grupo bloqueante (3'-Blk) en el extremo 3', uno o más enlaces escindibles, donde el enlace escindible se representa como "r", y un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 43, etapa B). Después de la fijación del extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de a Dn diana para formar un producto de fijación circularizado (Figura 43, etapa C), el grupo bloqueante 3' de la sonda de oligonucleótido se elimina (por ejemplo, escisión por RNasa H del enlace de ribonucleótido) (Figura 43, etapa D), y una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende la sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación de ADN circularizado como molde (Figura 43, etapa E). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 43, etapa E). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 44 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Bsh1236I metilados cerca de un sitio HaeIII 3' en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con Bsh1236I (CGCG) y HaeIII (GGCC) para generar los extremos 3' aptos para extensión (Figura 44, etapa A). En el modo de realización de la Figura 44, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de a Dn diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 44, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 44, etapa B). La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda. La actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' del segmento de ADN diana, generando de este modo un fosfato 5' apto para fijación (Figura 44, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 44, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular que contienen un segmento de ADN genómico original. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 44, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante usando la polimerasa Bst en presencia de BstilI (CGCG) para garantizar que los sitios que estaban metilados en la diana original se identifiquen posteriormente por secuenciación. Este ejemplo muestra el uso de la endonucleasa de restricción BstilI. Sin embargo, se pueden usar otras endonucleasas que escinden el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado. Estas incluyen, pero no se limitan a, las enzimas termófilas BstHHI (reconoce GCGC; un isoesquizómero de HhaI), BsiSI (reconoce CCGG; un isoesquizómero de HpaII) y Tail (reconoce ACGT; un isoesquizómero de MaeII).
La Figura 45 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios Bsh1236I metilados vecinos en regiones conocidas de ADN genómico. El procedimiento es adecuado para detectar sitios Bsh1236I metilados en ADN genómico cortado a un tamaño promedio de 150 pb o ADNlc que tiene un tamaño promedio de 160 pb. El ADN genómico se escinde con Bsh1236I (CGCG) en sitios de reconocimiento no metilados del ADN diana (Figura 45, etapa A). En el modo de realización representado en la Figura 45, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN genómico diana hibridan con los segmentos de ADN (Figura 45, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que comprende una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 44, etapa B). La polimerasa (diamantes rellenos) con actividad 3'-5 elimina el extremo 3' monocatenario de la diana y, a continuación, extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda. La actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' del segmento de ADN diana, generando de este modo un fosfato 5' apto para fijación (Figura 45, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 45, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 45, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante usando la polimerasa Bst en presencia de BstilI (CGCG). Por tanto, los sitios que estaban metilados en la diana original se amplifican y posteriormente se identifican por secuenciación. Este ejemplo muestra la utilización de la endonucleasa de restricción BstilI. Sin embargo, se pueden usar otras endonucleasas que escinden el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado. Estas incluyen, pero no se limitan a, las enzimas termófilas BstHHI (reconoce GCGC; un isoesquizómero de HhaI), BsiSI (reconoce CCGG; un isoesquizómero de HpaII) y Tail (reconoce ACGT; un isoesquizómero de MaeII).
La Figura 46 muestra un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar todos los sitios CpG metilados cerca de sitios Bsh1236I en regiones conocidas de ADN genómico. El procedimiento es adecuado para detectar todos los sitios CpG metilados cerca de los sitios Bsh1236I metilados en ADN genómico cortado a un tamaño promedio de 150 pb o ADNlc que tiene un tamaño promedio de 160 pb. El ADN genómico se escinde con Bsh1236I (CGCG) en sitios de reconocimiento no metilados (Figura 46, etapa A). El tratamiento con bisulfito convierte las C no metiladas en U y hace que las hebras no sean complementarias. En el modo de realización representado en la Figura 46, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN genómico diana metilados tratados con bisulfito hibridan con los segmentos de ADN (Figura 46, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que comprende una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 46, etapa B). La polimerasa (diamantes rellenos) con actividad 3'-5 elimina el extremo 3' monocatenario de la diana tratada con bisulfito y, a continuación, extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado para copiar la porción adicional de la sonda. La actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' del segmento de ADN diana tratado con bisulfito, generando de este modo un fosfato 5' apto para fijación (Figura 46, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana tratado con bisulfito como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 46, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 46, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de a Dn diana original tratado con bisulfito acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante usando la polimerasa Bst en presencia de BstilI (CGCG) para garantizar que los sitios no convertidos por bisulfito estaban metilados en la diana original, y que todos los demás sitios CpG metilados se identifican por secuenciación. Este ejemplo muestra el uso de la endonucleasa de restricción BstilI. Sin embargo, se pueden utilizar otras endonucleasas que escinden el ADN bicatenario si no está metilado, pero no el ADN híbrido metilado/no metilado ni el ADN monocatenario no metilado, y que retienen el reconocimiento de restricción de los sitios metilados después del tratamiento con bisulfito. Esto incluye, pero no se limita a, la enzima termófila Tail (reconoce ACGT; un isoesquizómero de MaeII).
La Figura 47 y la Figura 48 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios HinP1I contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con HinPlI (GCGC) (triángulos rellenos) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación (Figura 47, etapa A y Figura 48, etapa A). Como se muestra en la Figura 47, etapa B, las sondas de oligonucleótido dúplex hibridan con los segmentos de ADN diana escindidos. Las sondas dúplex comprenden una primera hebra de sonda de oligonucleótido que contiene secuencias de nucleótidos complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana, que están separados por una porción adicional. La porción adicional comprende una porción de identificador único y/o una porción de identificador de paciente y/o una o más secuencias de unión a cebador. La segunda sonda de oligonucleótido de las sondas de oligonucleótido dúplex (línea negra gruesa con bucle) contiene una secuencia que es complementaria a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido. La región en bucle de la segunda sonda de oligonucleótido representa una región no complementaria. Como se muestra en la Figura 47, etapa C, la hibridación de las sondas dúplex con los segmentos de ADN genómico escindidos crea dos puntos de unión aptos para fijación, es decir, entre el extremo 3' del segmento de ADN y el extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y entre el extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' del segmento genómico escindido. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los puntos de unión para fijación para crear productos de fijación circulares que contienen los segmentos de ADN genómico (Figura 47, etapa C). Como se muestra en la Figura 47, etapa D, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos de fijación circulares monocatenarios deseados que son adecuados para la secuenciación circular usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
En el modo de realización representado en la Figura 48, la primera sonda de oligonucleótido de la sonda dúplex contiene secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, la primera sonda de oligonucleótido también tiene un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 48, etapa B). Después de la fijación en los dos puntos de unión para fijación entre el segmento de ADN diana y la segunda sonda de oligonucleótido para formar el producto de fijación circularizado de la Figura 48, etapa C, una polimerasa (diamantes rellenos) que tiene actividad de desplazamiento de hebra extiende la primera sonda de oligonucleótido usando el ADN circularizado que contiene el producto de fijación como molde (Figura 48, etapa D). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 48, etapa D). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 49 y la Figura 50 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios AciI metilados ("m") localizados entre sitios HaeIII en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con AciI (triángulos rellenos, GCGG) y HaeIII (triángulos rellenos, GGCC) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación (Figura 49, etapa A y Figura 50, etapa A). Como se muestra en la Figura 49, etapa B, y Figura 50, etapa B, las sondas de oligonucleótido dúplex hibridan con los segmentos de ADN diana escindidos. En el modo de realización representado en la Figura 49, las sondas dúplex comprenden una primera hebra de sonda de oligonucleótido que contiene secuencias de nucleótidos complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana, que están separados por una porción adicional. La porción adicional comprende una porción de identificador único y/o una porción de identificador de paciente y/o una o más secuencias de unión a cebador (Figura 49, etapa B). La segunda sonda de oligonucleótido de las sondas de oligonucleótido dúplex (línea negra gruesa con bucle) contiene una secuencia que es complementaria a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido (Figura 49, etapa B). La región en bucle de la segunda sonda de oligonucleótido representa una región no complementaria. Como se muestra en la Figura 49, etapa C, la hibridación de las sondas dúplex con los segmentos de ADN genómico escindidos crea dos puntos de unión aptos para fijación, es decir, entre el extremo 3' del segmento de ADN y el extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y entre el extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' del segmento genómico escindido. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los puntos de unión para fijación para crear productos de fijación circulares que contienen segmentos de ADN genómico metilados (Figura 49, etapa C). Como se muestra en la Figura 49, etapa D, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos de fijación circulares monocatenarios deseados que son adecuados para la secuenciación circular usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
En el modo de realización representado en la Figura 50, la primera sonda de oligonucleótido de la sonda dúplex contiene secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, la primera sonda de oligonucleótido también tiene un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 50, etapa B). Después de la fijación en los dos puntos de unión para fijación entre el segmento de ADN diana y la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto de fijación metilado circularizado (Figura 50, etapa C), una polimerasa (diamantes rellenos) que tiene actividad de desplazamiento de hebra extiende la primera sonda de oligonucleótido usando el ADN circularizado que contiene el producto de fijación como molde (Figura 50, etapa D). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 50, etapa D). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 51 muestra un procedimiento para descubrir sitios HinPlI contiguos no metilados (GCGC) en regiones conocidas de ADN genómico. El ADN genómico, ya sea aislado de células completas o como ADNlc en el plasma, contiene extremos a través de procesos enzimáticos naturales o corte. Estos deben ser bloqueados de las etapas posteriores agregando conectores cortos a los extremos 3' y 5' de los extremos del ADN (por ejemplo, agregando conectores mediante fijación). Los conectores del extremo 5' contienen un grupo bloqueante (líneas negras gruesas) como se muestra en la Figura 51, etapa A. Escinde el ADN con conector agregado con HinPlI (GCGC) (triángulos rellenos) (Figura 51, etapa A). Solo los sitios HinPlI contiguos (GCGG) no metilados en el ADN genómico original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con HinP1I. Como se muestra en la Figura 51, etapa B, los conectores largos (líneas parcialmente dobles grises) que contienen una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente se agregan a los fragmentos de ADN escindidos con HinPlI. Los conectores largos contienen un grupo bloqueante en el extremo 3' o una cadena principal que contiene tiofosfato (****) para inhibir la digestión posterior con exonucleasa 3' (triángulos rellenos). Solo los fragmentos con conector agregado a ambos lados permanecerán bicatenarios. Como se muestra en la Figura 51, etapa C, el extremo libre de los conectores se vuelve apto para fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo bloqueante 3', (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', generando fosfato 5' apto para fijación, o (iv) cualquier combinación de (i), (ii), (iii). Las condiciones de fijación (círculos rellenos) se diseñan para favorecer la oligomerización. Como se muestra en la Figura 51, etapa D, los productos fijados se componen de secuencias HinPlI contiguas originalmente no metiladas en ADN genómico acopladas a una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador de paciente. El producto final es adecuado para la secuenciación posterior.
La Figura 52 muestra un procedimiento para el descubrimiento de sitios AciI contiguos metilados (GCGG) en regiones conocidas en todo el genoma. El ADN genómico se escinde con AciI (triángulos rellenos); m representa sitios metilados. Como se muestra en la Figura 52, etapa A, los conectores cortos con un grupo bloqueante en el extremo 5' (líneas negras gruesas) se agregan, por ejemplo, mediante fijación, al ADN digerido con AciI. El ADN con conector agregado se escinde con HaeIII (GGCC). Solo los sitios HaeIII contiguos (GGCC) con sitios AciI metilados en el ADN genómico original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con HaeIII. En la Figura 52, etapa B, los conectores largos (líneas parcialmente dobles grises) que contienen una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente se agregan a los fragmentos de ADN escindidos con HaeIII. Los conectores largos contienen un grupo bloqueante en el extremo 3' o una cadena principal que contiene tiofosfato (****) para inhibir la digestión posterior con exonucleasa 3' (triángulos rellenos). Solo los fragmentos con conector agregado a ambos lados permanecerán bicatenarios. Como se muestra en la Figura 52, etapa C, el extremo libre de los conectores se vuelve apto para fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo bloqueante 3', (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', generando fosfato 5' apto para fijación, o (iv) cualquier combinación de (i), (ii), (iii). Las condiciones de fijación (círculos rellenos) se diseñan para favorecer la oligomerización. Como se muestra en la Figura 52, etapa D, los productos fijados se componen de secuencias HaeIII contiguas originalmente metiladas en sitios AciI en ADN genómico acoplado a una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador de paciente. El producto final es adecuado para la secuenciación posterior.
La Figura 53 y la Figura 54 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios HinP1I contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico se escinde con HinPlI (GCGC) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación, como se muestra en la Figura 53, etapa A y Figura 54, etapa A. El tratamiento con bisulfito del ADN digerido con HinPlI convierte las C no metiladas en U. En el modo de realización de la Figura 53, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 53, etapa B). Los oligonucleótidos contienen una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un grupo bloqueante opcional en un extremo. La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana para dejarlo al nivel del fosfato apto para fijación en el extremo 5' de la diana (Figura 53, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido en la diana, pero no escinde el grupo bloqueante 5'. En la Figura 53, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos del segmento de ADN diana extendido para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. Como se muestra en la Figura 53, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende ADN diana original convertido con bisulfito con una secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular.
En el modo de realización de la Figura 54, las sondas de oligonucleótido contienen secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, las sondas de oligonucleótido también tienen un grupo bloqueante (3'-Blk) en el extremo 3', uno o más enlaces escindibles, donde el enlace escindible se representa como "r", y un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 54, etapa B). Después de la fijación del extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de a Dn diana para formar un producto de fijación circularizado (Figura 54, etapa C), el grupo bloqueante 3' de la sonda de oligonucleótido se elimina (por ejemplo, escisión por RNasa H del enlace de ribonucleótido) (Figura 54, etapa D), y una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende la sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación de ADN circularizado como molde (Figura 54, etapa E). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 54, etapa E). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
Las Figuras 55 y 56 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios HinP1I contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. Como se muestra en la Figura 55, etapa A y Figura 56, etapa A, el ADN genómico se escinde con HinPlI (GCGC) (triángulos rellenos) para generar los extremos 3' y 5' aptos para fijación. El tratamiento con bisulfito del ADN digerido con HinPlI convierte las C no metiladas en U (Figura 55, etapa A y Figura 56, etapa A). Como se muestra en la Figura 55, etapa B, y Figura 56, etapa B, las sondas de oligonucleótido dúplex hibridan con los segmentos de ADN diana escindidos. En el modo de realización representado en la Figura 55, las sondas dúplex comprenden una primera hebra de sonda de oligonucleótido que contiene secuencias de nucleótidos complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de ADN diana, que están separados por una porción adicional. La porción adicional comprende una porción de identificador único y/o una porción de identificador de paciente y/o una o más secuencias de unión a cebador (Figura 55, etapa B). La segunda sonda de oligonucleótido de las sondas de oligonucleótido dúplex (línea negra gruesa con bucle) contiene una secuencia que es complementaria a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido (Figura 55, etapa B). La región en bucle de la segunda sonda de oligonucleótido representa una región no complementaria. Como se muestra en la Figura 55, etapa C, la hibridación de las sondas dúplex con el ADN genómico digerido con HinPlI y tratado con bisulfito crea dos puntos de unión aptos para fijación, es decir, entre el extremo 3' del segmento de ADN y el extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y entre el extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' del segmento de ADN. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los puntos de unión para fijación para crear productos de fijación circulares que contienen los segmentos de ADN genómico tratados con bisulfito (Figura 55, etapa C). Como se muestra en la Figura 55, etapa D, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos de fijación circulares monocatenarios deseados que son adecuados para la secuenciación circular usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
En el modo de realización representado en la Figura 56, la primera sonda de oligonucleótido de la sonda dúplex contiene secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, la primera sonda de oligonucleótido también tiene un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 56, etapa B). Después de la fijación en los dos puntos de unión para fijación entre el segmento de ADN diana y la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto de fijación circularizado (Figura 56, etapa C), una polimerasa (diamantes rellenos) que tiene actividad de desplazamiento de hebra extiende la primera sonda de oligonucleótido usando el ADN circularizado que contiene el producto de fijación como molde (Figura 56, etapa D). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 56, etapa D). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 57 muestra un procedimiento para el descubrimiento de sitios HinPlI contiguos no metilados (GCGC) en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico, ya sea aislado de células completas o como ADNlc en el plasma, contiene extremos a través de procesos enzimáticos naturales o corte. Estos deben ser bloqueados de las etapas posteriores agregando conectores cortos a los extremos 3' y 5' de los extremos del ADN (por ejemplo, agregando conectores mediante fijación). Los conectores del extremo 5' contienen un grupo bloqueante (líneas negras gruesas) como se muestra en la Figura 57, etapa A. Escinde el ADN con conector agregado con HinPlI (GCGC) (triángulos rellenos) (Figura 57, etapa A). Solo los sitios HinPlI contiguos (GCGG) no metilados en el ADN genómico original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con HinP1I. Como se muestra en la Figura 57, etapa B, los conectores largos (líneas parcialmente dobles grises) que contienen una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente se agregan a los fragmentos de ADN escindidos con HinPlI. Los conectores largos contienen un grupo bloqueante en el extremo 3' o una cadena principal que contiene tiofosfato (****) para inhibir la digestión posterior con exonucleasa 3' (triángulos rellenos). Solo los fragmentos con conector agregado a ambos lados permanecerán bicatenarios. Como se muestra en la Figura 57, etapa C, el extremo libre de los conectores se vuelve apto para fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo bloqueante 3', (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', generando fosfato 5' apto para fijación, o (iv) cualquier combinación de (i), (ii), (iii). Las condiciones de fijación (círculos rellenos) se diseñan para favorecer la oligomerización. Como se muestra en la Figura 57, etapa D, el tratamiento con bisulfito de los productos de fijación convierte las C no metiladas en U. Los productos fijados comprenden ADN convertido con bisulfito, dentro de secuencias HinPlI contiguas no metiladas originalmente en el a Dn diana acoplado a una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador de paciente. El producto final es adecuado para etapas adicionales y secuenciación posterior.
La Figura 58 y la Figura 59 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios "HphI" contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. Como se muestra en la Figura 58, etapa A y Figura 59, etapa A, se agregan conectores cortos (por ejemplo, mediante fijación) a fragmentos de ADNlc o a ADN genómico cortado. El ADN con conector agregado se trata con bisulfito para convertir las C no metiladas en U. Se realiza una PCR limitada y los productos de PCR resultantes se escinden con HphI (solo GGCGA no metilado -> GGTGA) para generar extremos aptos para fijación (Figura 58, etapa A y Figura 59, etapa A). En el modo de realización de la Figura 58, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias en los extremos 5' y 3' que son complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de pCr diana digeridos hibridan con los segmentos de ADN escindidos (Figura 58, etapa B). Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción de nucleótido adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o uno o más sitios de unión a cebador. Las sondas de oligonucleótido también pueden tener un grupo bloqueante en un extremo (por ejemplo, un grupo bloqueante 5' como se muestra en la Figura 58, etapa B). La polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende el extremo 3' del segmento de ADN diana hibridado, copiando la porción adicional de la sonda y formando un punto de unión para fijación con el extremo 5' del segmento de ADN diana hibridado (Figura 58, etapa C). La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando el segmento de ADN diana como molde, pero no escinde el grupo bloqueante en su extremo 5'. En la Figura 58, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el punto de unión entre el extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de ADN para crear productos de fijación circular que contienen los segmentos de ADN digeridos con HphI generados por PCR. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. De forma alternativa, se introduce una mella en un enlace escindible contenido en la porción adicional, por ejemplo, la porción adicional contiene un nucleótido uracilo que se escinde usando UDG. Como se muestra en la Figura 58, etapa E, la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el segmento de ADN digerido con HphI generado por PCR acoplado a una secuencia de nucleótidos de identificación adicional, por ejemplo, secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular.
En el modo de realización de la Figura 59, las sondas de oligonucleótido también contienen secuencias complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de PCR diana digeridos que están separados por la porción de nucleótido adicional. Además, las sondas de oligonucleótido también tienen un grupo bloqueante (3'-Blk) en su extremo 3', uno o más enlaces escindibles, donde el enlace escindible se representa como "r", y un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 59, etapa B). Después de la fijación del extremo 3' extendido y el extremo 5' del segmento de PCR diana para formar un producto de fijación circularizado (Figura 59, etapa C), el grupo bloqueante 3' de la sonda de oligonucleótido se elimina (por ejemplo, escisión por RNasa H del enlace de ribonucleótido) (Figura 59, etapa D), y una polimerasa (diamantes rellenos) que carece de actividad 5'->3' extiende la sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación de ADN circularizado como molde (Figura 59, etapa E). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 58, etapa E). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z opcional en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
Las Figuras 60 y 61 muestran un procedimiento para producir construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para detectar sitios "HphI" contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. Como se muestra en la Figura 60, etapa A y Figura 61, etapa A, se agregan conectores cortos (por ejemplo, mediante fijación) a fragmentos de ADNlc o a ADN genómico cortado. El ADN con conector agregado se trata con bisulfito para convertir las C no metiladas en U. Se realiza una PCR limitada y los productos de PCR resultantes se escinden con HphI (solo GGCGA no metilado -> GGTGA) para generar extremos aptos para fijación (Figura 60, etapa A y Figura 61, etapa A). Como se muestra en la Figura 60, etapa B, y Figura 61, etapa B, las sondas de oligonucleótido dúplex hibridan con los segmentos de ADN diana escindidos. En el modo de realización representado en la Figura 60, las sondas dúplex comprenden una primera hebra de sonda de oligonucleótido que contiene secuencias de nucleótidos complementarias a los lados 5' y 3' de los segmentos de PCR diana. Estas porciones específicas de diana de la primera sonda de oligonucleótido están separadas por una porción adicional que comprende una porción de identificador único y/o una porción de identificador de paciente y/o una o más secuencias de unión a cebador (Figura 60, etapa B). La segunda sonda de oligonucleótido de las sondas de oligonucleótido dúplex (línea negra gruesa con bucle) contiene una secuencia que es complementaria a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido (Figura 60, etapa B). La región en bucle de la segunda sonda de oligonucleótido representa una región no complementaria. Como se muestra en la Figura 60, etapa C, la hibridación de las sondas dúplex con los productos de PCR digeridos con HphI crea dos puntos de unión aptos para fijación, es decir, entre el extremo 3' del segmento de ADN y el extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y entre el extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' del segmento de ADN. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los puntos de unión para fijación para crear productos de fijación circulares que contienen los segmentos digeridos con HphI (Figura 60, etapa C). Como se muestra en la Figura 60, etapa D, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos de fijación circulares monocatenarios deseados que son adecuados para la secuenciación circular usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
En el modo de realización representado en la Figura 61, la primera sonda de oligonucleótido de la sonda dúplex contiene secuencias complementarias a los lados 5' y 3' del segmento de ADN diana que están separadas por la porción de nucleótido adicional. Además, la primera sonda de oligonucleótido también tiene un grupo de captura 5' opcional ("Z") (Figura 61, etapa B). Después de la fijación en los dos puntos de unión para fijación entre el segmento de PCR digerido con HphI y la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto de fijación circularizado (Figura 61, etapa C), una polimerasa (diamantes rellenos) que tiene actividad de desplazamiento de hebra extiende la primera sonda de oligonucleótido usando el producto de fijación circularizado como molde (Figura 61, etapa D). La amplificación por círculo rodante genera un producto de extensión principal que contiene secuencias lineales en tándem que son complementarias al producto de fijación circularizado (Figuras 61, etapa D). El producto de extensión principal es adecuado para secuenciación usando los procedimientos descritos en el presente documento. El grupo Z en 5' se puede capturar sobre un soporte sólido antes o después de la amplificación por círculo rodante. Una vez capturado, el producto de fijación circular unido a cebador o la extensión del mismo se puede liberar del soporte sólido por medio de escisión en el enlace escindible, antes o después de la amplificación por círculo rodante.
La Figura 62 muestra un procedimiento para el descubrimiento de sitios HphI contiguos no metilados en regiones genómicas conocidas de ADNlc o ADN genómico total cortado. El ADN genómico, ya sea aislado de células completas o como ADNlc en el plasma, contiene extremos a través de procesos enzimáticos naturales o corte. Estos deben ser bloqueados de las etapas posteriores agregando conectores cortos a los extremos 3' y 5' de los extremos del ADN (por ejemplo, agregando conectores mediante fijación). Los conectores del extremo 5' contienen un grupo bloqueante (líneas negras gruesas) como se muestra en la Figura 62, etapa A. El ADN con conector agregado se trata con bisulfito para convertir las C no metiladas en U. Como se muestra en la Figura 62, etapa B, la amplificación por PCR limitada con cebadores bloqueados en 5' genera productos bicatenarios no metilados. Solo los sitios HphI contiguos (GGCGA no metilado -> GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con HphI (triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 62, etapa C, los conectores (líneas dobles rellenas grises) que contienen una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente se agregan a los fragmentos de ADN escindidos con HphI. Los conectores contienen un grupo bloqueante en el extremo 3' o una cadena principal que contiene tiofosfato (****) para inhibir la digestión posterior con exonucleasa 3' (triángulos rellenos). Solo los fragmentos con conector agregado a ambos lados permanecerán bicatenarios. Como se muestra en la Figura 62, etapa D, el extremo libre de los conectores se vuelve apto para fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo bloqueante 3', (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', generando fosfato 5' apto para fijación, o (iv) cualquier combinación de (i), (ii), (iii). Las condiciones de fijación (círculos rellenos) se diseñan para favorecer la oligomerización. Como se muestra en la Figura 62, etapa E, los productos fijados comprenden un complemento de ADN convertido con bisulfito, dentro de secuencias HphI contiguas originalmente no metiladas en ADN genómico con una secuencia de identificador único opcional y/o secuencia de identificador de paciente opcional. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Otro enfoque adecuado para generar las diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección implica proporcionar una muestra que contiene uno o más segmentos de ADN genómico diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases o uno o más residuos metilados y agregar secuencias de conectores de nucleótidos a los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN genómico diana. Los conectores de nucleótidos agregados comprenden opcionalmente (i) la secuencia del identificador de paciente, (ii) la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, (iii) la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido, y/o (iv) la secuencia del identificador único. Se proporcionan una o más primeras sondas de oligonucleótido donde cada primera sonda de oligonucleótido comprende (a) una porción complementaria a una porción de conector 3' del segmento de ADN genómico diana con conector agregado, (b) una porción complementaria a la porción de conector 5' del segmento de ADN genómico diana con conector agregado, y (c) opcionalmente una porción adicional. La porción adicional comprende opcionalmente (i) la secuencia del identificador de paciente, (ii) la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, (iii) la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido, y/o (iv) la secuencia del identificador único. La muestra y la una o más primeras sondas de oligonucleótido se ponen en contacto en condiciones eficaces para que las porciones 3' y 5' de las primeras sondas de oligonucleótido hibriden de una manera específica según las bases con los conectores complementarios de los segmentos de ADN genómico diana con conector agregado, si están presentes en la muestra. Se generan uno o más puntos de unión aptos para fijación adecuados para acoplar los extremos 3' y 5' del segmento de ADN genómico diana con conector agregado hibridado con la primera sonda de oligonucleótido. La fijación del segmento de ADN genómico diana con conector agregado en el uno o más puntos de unión para fijación forma una construcción circular quimérica de ácido nucleico monocatenario diferente de la colección.
La Figura 63 muestra procedimientos relacionados ejemplares para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (barras negras gruesas, Figura 63, etapa A). Los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 63, panel derecho, contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación, mientras que los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 63, panel izquierdo, no contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido (línea negra gruesa) que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a los conectores 5' y 3' de los segmentos de ADN diana y un grupo bloqueante 5' hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana (Figura 63, etapa A). Las porciones específicas de conector de la sonda de oligonucleótido están separadas por una porción adicional. Esta porción adicional comprende una porción de identificador único opcional y/o una porción de identificador de paciente y/o una o más secuencias de unión a cebador. La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo del conector 3' del segmento de ADN diana hibridado para formar un punto de unión para fijación con el extremo del conector 5' del segmento de ADN diana (Figura 63, etapa B). En el modo de realización mostrado en la Figura 63, etapa C, una polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' escinde una base complementaria solapante en 5' en el conector 5' después de la extensión para generar un fosfato 5' apto para fijación. En el modo de realización representado en la Figura 63, etapa C, panel derecho, se puede utilizar una polimerasa que carece de actividad nucleasa 5 '^3 ' porque el conector 5' del segmento de ADN diana contiene un extremo 5' apto para fijación. La polimerasa también extiende el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido, usando el segmento de ADN diana circularizado hibridado como molde hasta que alcanza el grupo bloqueante 5' de la sonda. Como se muestra en la Figura 63, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo 3' extendido y el extremo 5' de los segmentos de ADN para crear productos de fijación circulares. El grupo bloqueante 5' en la sonda de oligonucleótido evita la circularización de la sonda de oligonucleótido extendida por polimerasa. Como se muestra en la Figura 63, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos circularizado deseados de fijación de ADN monocatenario. Estos productos de fijación circularizados son adecuados para la captura opcional con secuencias únicas o repetitivas (por ejemplo, repeticiones de cuatro nucleótidos), o para la extensión por círculo rodante con cebadores dirigidos únicos y secuenciación posterior.
La Figura 64 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En este modo de realización, el segmento de ADN genómico diana es un segmento de ADN genómico diana bicatenario que tiene un extremo 5' y 3' adecuados para fijación o extensión (Figura 64, etapa B). El segmento de ADN genómico diana se agrega con secuencias de conector de nucleótidos. De acuerdo con este modo de realización, los conectores de nucleótidos comprenden oligonucleótidos conectores primero y segundo, en los que (i) el primer oligonucleótido conector comprende una porción monocatenaria 5', uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos escindibles, una secuencia de identificador único, un extremo 3' que es complementario al segundo oligonucleótido conector, y un 3'-OH, y (ii) el segundo oligonucleótido conector comprende un extremo 5'-OH, una porción 5' que es complementaria al primer oligonucleótido conector, y un extremo 3' bloqueado opcional. El segundo oligonucleótido conector hibrida con su porción complementaria del primer oligonucleótido conector para formar conectores compuestos adecuados para agregarse al segmento de ADN genómico diana.
Como se muestra en la Figura 64, etapas C-D, el ADN genómico diana bicatenario se mezcla con los conectores compuestos, una ligasa y una polimerasa en condiciones adecuadas para (i) la fijación del 3'-OH del primer oligonucleótido conector del compuesto conector al extremo 5' de los segmentos de ADN genómico diana bicatenario, (ii) la extensión por polimerasa del extremo 3' del segmento de ADN genómico diana bicatenario para crear una copia complementaria del primer oligonucleótido conector del conector compuesto, y (iii) escindir uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos escindibles para formar los segmentos de ADN genómico diana con conector agregado. Las sondas de oligonucleótido (doble línea negra y delgada) que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a las porciones monocatenarias 5' y 3' de los conectores de los segmentos de ADN diana hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana (Figura 64, etapa F). Las sondas de oligonucleótido contienen la secuencia del identificador de paciente, los sitios de unión al cebador y una cola con emparejamientos erróneos en el extremo 3'. La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo del conector 3' del segmento de ADN diana hibridado para formar un punto de unión para fijación con el extremo del conector 5' del segmento de ADN diana (Figura 64, etapa G). Como se muestra en la Figura 64, etapa H, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente los extremos 3' y 5' del segmento de ADN con conector agregado para crear productos de fijación circular. Estos productos de fijación circularizados son adecuados para la captura opcional con secuencias únicas o repetitivas (por ejemplo, repeticiones de cuatro nucleótidos), o para la extensión por círculo rodante con cebadores dirigidos únicos y secuenciación posterior.
La Figura 65 muestra procedimientos relacionados ejemplares para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores compuestos que comprenden tanto porciones monocatenarias (líneas dobles negras y más finas) como porciones bicatenarias (barras negras gruesas) en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (Figura 65, etapa A). Los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 65, etapa B, panel derecho, contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación, mientras que los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 65, etapa B, panel izquierdo, no contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido (doble línea negra y delgada) que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a las porciones monocatenarias 5' y 3' de los conectores de los segmentos de ADN diana hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana. La polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo del conector 3' del segmento de ADN diana hibridado para formar un punto de unión para fijación con el extremo del conector 5' del segmento de ADN diana (Figura 65, etapa C). En el modo de realización mostrado en la Figura 65, etapa C, una polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' escinde una base complementaria solapante en 5' en el conector 5' después de la extensión para generar un fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 65, etapa D, la ligasa (círculo relleno) sella covalentemente los extremos 3' y 5' del segmento de ADN con conector agregado para crear productos de fijación circular. Como se muestra en la Figura 65, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo los productos circularizado deseados de fijación de ADN monocatenario. Estos productos de fijación circularizados son adecuados para la captura opcional con secuencias únicas o repetitivas (por ejemplo, repeticiones de cuatro nucleótidos), o para la extensión por círculo rodante con cebadores dirigidos únicos y secuenciación posterior.
El enfoque estándar para agregar conectores se ilustra en la Figura 66 y es bien conocido por los expertos en la técnica. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. Los extremos del ADN fragmentado se reparan utilizando una polimerasa con actividad exonucleasa 3'->5', tal como la polimerasa T4 o la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow), que extiende los extremos 3' rebajados, o degrada los extremos de protuberancia en 3' hasta que quedan al nivel con el extremo 5' (Figura 66, etapa A). Los extremos 5' se fosforilan con la cinasa T4, y se agrega una base A adicional al extremo 3' usando a Dn polimerasa I, fragmento grande (Klenow), que carece de actividad nucleasa 3'->5' (Figura 66, etapas B y C). La fijación a conectores con protuberancias T en 3' se realiza usando la ligasa T4 (Figura 66, etapa D). En esta figura, las porciones de cebador 1 y 3 de los conectores se usan para determinar las secuencias de identificador de paciente y las secuencias de identificador único opcionales 1 y 2, respectivamente. Las porciones de cebador 2 y 3' se usan para secuenciar el ADN diana directo e inverso, respectivamente. Este producto es adecuado para la circularización de la hebra diana original superior o inferior como se ilustra en las Figuras 63 y 65 anteriores.
Si bien el enfoque estándar brinda la oportunidad de introducir secuencias únicas en las porciones monocatenarias de los conectores, estas secuencias no permiten una correspondencia inequívoca de una secuencia de hebra superior con una secuencia de hebra inferior. Para lograr este tipo de construcción, el enfoque estándar se modifica como se ilustra en la Figura 67. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. Los extremos del ADN fragmentado se reparan utilizando una polimerasa con actividad exonucleasa 3'->5', tal como la polimerasa T4 o la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow), que extiende los extremos 3' rebajados, o degrada los extremos de protuberancia en 3' hasta que quedan al nivel con el extremo 5' (Figura 67, etapa A). Los extremos 5' se fosforilan opcionalmente con cinasa t 4 (Figura 67, etapa B), y se añade una protuberancia de base A a los extremos 3' usando ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow), que carece de actividad nucleasa 3'^5'.
En este modo de realización, la secuencia del conector comprende un primer, segundo y tercer oligonucleótido. El primer oligonucleótido comprende la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una o más primeras secuencias de identificador de paciente, un sitio de unión al primer cebador de secuenciación y un extremo 3' que es complementario al tercer oligonucleótido. El segundo oligonucleótido comprende una región complementaria al extremo 5' del tercer oligonucleótido, y el tercer oligonucleótido comprende un extremo 5' que es complementario al segundo oligonucleótido, un sitio de unión al segundo cebador de secuenciación, una porción complementaria al extremo 3' del primer oligonucleótido, una segunda secuencia de identificador de paciente y la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido. El tercer oligonucleótido hibrida con porciones complementarias del primer y segundo oligonucleótidos para formar conectores compuestos. Como se muestra en la Figura 67, etapa D, los segmentos de ADN genómico diana bicatenario se mezclan con los conectores compuestos, una ligasa y una polimerasa en condiciones adecuadas para la fijación del segundo y tercer oligonucleótidos de los conectores compuestos a los extremos 5' y 3', respectivamente, de los segmentos de ADN genómico diana bicatenario. La polimerasa extiende el extremo 3' del primer oligonucleótido del conector compuesto para crear un punto de unión para fijación con el segundo oligonucleótido del conector compuesto en su extremo 5' (Figura 67, etapa E). Si el extremo 5' del segundo oligonucleótido del conector compuesto no está fosforilado, la polimerasa debería tener actividad nucleasa 5'->3' para liberar un fosfato 5' adecuado para fijación. Si el segundo oligonucleótido está fosforilado en el extremo 5', la polimerasa debería carecer de actividad nucleasa 5'->3', lo que le permite extender hasta el conector, seguido del sellado de la mella por la ligasa. Como se muestra en la Figura 67, etapa E, la ligasa sella covalentemente el primer y el segundo oligonucleótidos del conector compuesto en dicho punto de unión para fijación para formar ADN genómico diana bicatenario con conector agregado. En este modo de realización, las porciones de cebador 1 y 3 de los conectores se usan para determinar las secuencias de identificador de paciente opcionales 1 y 2, respectivamente (Ver Figura 67, etapa F). Las porciones de cebador 2 y 3' de los conectores se usan para secuenciar el ADN diana directo e inverso, así como las secuencias de identificador único 1 y 2, respectivamente. Este producto es adecuado para la circularización de cada una de las hebras diana originales como se ilustra en las Figuras 63 y 65 anteriores. Al determinar las secuencias de estas hebras, las secuencias de identificador único 1 y 2 permitirán una correspondencia inequívoca de una secuencia de hebra superior con una secuencia de hebra inferior, permitiendo por tanto la verificación independiente de la mutación de baja abundancia en ambas hebras de la molécula diana original.
La Figura 68 ejemplifica otro enfoque para agregar secuencias de cebador a los extremos del ADN diana, de modo que sea adecuado para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario, y permite una correspondencia inequívoca de una secuencia de hebra superior con una secuencia de hebra inferior. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. Los extremos del ADN fragmentado se reparan utilizando una polimerasa con actividad exonucleasa 3'->5', tal como la polimerasa T4 o la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow), que extiende los extremos 3' rebajados, o degrada los extremos de protuberancia en 3' hasta que quedan al nivel con el extremo 5' (Figura 68, etapa A). Los extremos 5' se fosforilan opcionalmente con cinasa T4 (Figura 68, etapa B). Una retrotranscriptasa, tal como la retrotranscriptasa del virus de la leucemia murina Moloney (M-MLV RT, New England Biolabs) o la retrotranscriptasa Superscript II o III (Life Technologies), agrega tres bases C al extremo 3' de cada diana (Figura 68, etapa C).
En este modo de realización, las secuencias de conector comprenden (i) un primer oligonucleótido conector que comprende la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una o más primeras secuencias de identificador de paciente, un sitio de unión al primer cebador de secuenciación y bases de riboguanosina en el extremo 3', y (ii) un segundo oligonucleótido conector que comprende un sitio de unión al segundo cebador de secuenciación, una segunda secuencia de identificador de paciente, la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido y una porción 5' que es complementaria al primer oligonucleótido. Los segmentos de ADN genómico diana bicatenario se mezclan con las secuencias de conector, una retrotranscriptasa y una ligasa para formar una mezcla de reacción de transcripción inversa-fijación. Las bases de riboguanosina del primer oligonucleótido conector hibridan con la protuberancia de citosina 3' del segmento de ADN genómico diana bicatenario (Figura 68, etapa D). La retrotranscriptasa experimenta un cambio de hebra y el extremo 3' hibridado del segmento de ADN genómico diana bicatenario se extiende para generar una secuencia complementaria a la primera secuencia de identificador de paciente del primer oligonucleótido conector y un punto de unión para fijación con el extremo 5' del segundo oligonucleótido conector (Figura 68, etapa D). Los extremos 3' extendidos de los segmentos de ADN genómico diana bicatenario están fijados al extremo 5' del segundo oligonucleótido en el punto de unión para fijación. La RNasa H2 escinde las bases de riboguanosina del primer oligonucleótido conector, liberando un 3'-OH adecuado para la extensión mediada por polimerasa (Figura 68, etapa E). El extremo 3' del primer oligonucleótido conector se extiende y se fija al extremo 5' del ADN genómico diana bicatenario (Figura 68, etapa F). Si el segundo conector o el ADN diana no están fosforilados en el extremo 5', la polimerasa debe tener actividad nucleasa 5'->3' para liberar un fosfato 5' adecuado para fijación. Si el segundo conector y la diana están fosforilados, como se muestra en la Figura 68, la polimerasa debería carecer de actividad nucleasa 5'->3', lo que le permite extender hasta el extremo 5' del segundo cebador o diana respectivamente, seguido del sellado de la mella por la ligasa. Como se muestra en la Figura 68, etapa G, las porciones de cebador 1 y 3 de los conectores se usan para determinar las secuencias de identificador de paciente opcionales 1 y 2, respectivamente. Las porciones de cebador 2 y 3' de los conectores se usan para secuenciar el ADN diana directo e inverso, así como las secuencias de identificador único 1 y 2, respectivamente. Este producto es adecuado para la circularización de cada una de las hebras diana originales como se ilustra en las Figuras 63 y 65 anteriores. Al determinar las secuencias de estas hebras, las secuencias de identificador único 1 y 2 permitirán una correspondencia inequívoca de una secuencia de hebra superior con una secuencia de hebra inferior, permitiendo por tanto la verificación independiente de la mutación de baja abundancia en ambas hebras de la molécula diana original.
La Figura 69 ejemplifica otro enfoque para agregar secuencias de cebador a los extremos del ADN diana, de modo que sea adecuado para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario. En este modo de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. Los fragmentos se desnaturalizan para hacer que las dianas sean monocatenarias (Figura 69, etapa A). Los extremos 3' se terminan con la transferasa terminal usando una mezcla de dATP y ATP, de modo que se añade un promedio de 50-100 bases y existe al menos una incorporación de rATP escindible en las primeras 30 bases (Figura 69, etapa B). De acuerdo con este modo de realización, se proporcionan uno o más conjuntos de oligonucleótidos, donde cada conjunto comprende i) un oligonucleótido cebador que comprende la porción específica del segundo cebador sobre soporte sólido, una o más secuencias de identificador de paciente, un sitio de unión del cebador de secuenciación y una región de repetición de mononucleótido que comprende uno o más nucleótidos escindibles que es complementaria a la región de extensión del segmento de ADN genómico diana, y (ii) un primer oligonucleótido conector que comprende la porción específica del primer cebador sobre soporte sólido, una o más secuencias de identificador de paciente, un sitio de unión a cebador de secuenciación. El primer oligonucleótido conector tiene dos bases de riboguanosina y una base de guanosina de ácido nucleico bloqueado en su (rGrG+G) 3'. Como se muestra en la Figura 69, etapa B, el procedimiento implica la hibridación del oligonucleótido cebador que contiene sitios de unión a cebador 5' (3 y 4) con identificador de paciente e identificador único opcionales (2), una secuencia VN (T,dU)30 en el extremo 3' y enlaces escindibles (dU) a la región de extensión de la transferasa terminal del ADN genómico diana (Figura 69, etapa B). Una retrotranscriptasa, tal como la retrotranscriptasa del virus de la leucemia murina Moloney (M-MLV RT, New England Biolabs) o la retrotranscriptasa Superscript II o III (Life Technologies), extiende el cebador para hacer una copia de longitud completa de la diana, y agrega tres bases C al extremo 3' de la secuencia diana extendida (Figura 68, etapa C). El primer oligonucleótido conector que tiene el rGrG+G 3' hibrida con las tres bases C de la secuencia diana extendida como se muestra en la Figura 68, etapa C. La retrotranscriptasa sufre un cambio de hebra y copia el primer oligonucleótido conector (Figura 69, etapa D). La RNasa H2 escinde las bases de ARN, liberando el 3'-OH de ADN en la cola A, así como contiguo al rGrG+G del primer oligonucleótido conector (Figura 69, etapa D). La polimerasa con actividad nucleasa 5'^-3' replica las regiones del oligonucleótido cebador, extiende el primer oligonucleótido conector y libera fosfato 5' en el ADN diana (Figura 69, etapa F). La ligasa sella la mella del primer oligonucleótido conector para fijar el primer conector a la hebra diana original (Figura 69, etapa G). Posteriormente, se introducen mellas en los enlaces escindibles del oligonucleótido cebador (por ejemplo, escisión con UDG de dU), de modo que la copia de la diana no sufrirá más amplificación, ya que carece de la primera región de unión a cebador. En esta figura, las porciones de cebador 1 y 3 se usan para determinar las secuencias de identificador de paciente y de identificador único opcionales 1 y 2, respectivamente (Figura 69, etapa H). Las porciones de cebador 2 y 3' se usan para secuenciar el ADN diana directo e inverso, respectivamente. Cuando se usa el cebador 3', para el ciclo inicial se usa TTP sin finalizador, de modo que el instrumento no pierda tiempo secuenciando la región T30. Este producto es adecuado para la circularización de la hebra diana original superior o inferior como se ilustra en las Figuras 63 y 65 anteriores.
La Figura 70 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (barras negras gruesas, Figura 70, etapa A). El extremo 5' de los conectores agregados contiene opcionalmente un fosfato apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) del segmento de ADN diana, y los lados 5' y 3' de los conectores hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana como se muestra en la Figura 70, etapa B. Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, un fosfato 5' apto para fijación y un enlace escindible (dU). La polimerasa (diamantes rellenos) extiende los extremos 3' hibridados del segmento de ADN diana y la sonda de oligonucleótido (Figura 70, etapa C) para crear puntos de unión de fijación con el extremo 5' correspondiente del segmento de ADN diana y la sonda, respectivamente. En ausencia de un fosfato 5' apto para fijación en el segmento diana o sonda, la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 70, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos de la sonda de oligonucleótido y el segmento diana para crear productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente, se introduce una mella en el enlace escindible de la sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 70, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 71 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias únicas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (barras gruesas en blanco y negro, Figura 71, etapa A). El extremo 5' de los conectores agregados contiene opcionalmente un fosfato apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a una secuencia única del segmento de ADN diana, y los lados 5' y 3' de los conectores hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana como se muestra en la Figura 71, etapa B. Las sondas de oligonucleótido también contienen otro porción que contiene una o más de una secuencia de identificador única, una secuencia de identificador de paciente, un fosfato 5' apto para fijación opcional y un enlace escindible (dU) opcional. En un modo de realización, el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido comprende además unas pocas bases adicionales y un grupo bloqueante, que se libera para formar un 3'-OH libre mediante escisión con una nucleasa solo cuando híbrida con la diana, por ejemplo, una base de ribonucleótido como el grupo bloqueante y RNasa H2 (estrella) como la nucleasa de escisión (Figura 71, etapa C). La polimerasa (diamantes rellenos) extiende los extremos 3' hibridados del segmento de ADN diana y la sonda de oligonucleótido (Figura 71, etapa C) para crear puntos de unión de fijación con el extremo 5' correspondiente del segmento de ADN diana y la sonda, respectivamente. En ausencia de un fosfato 5' apto para fijación en el segmento diana o sonda, la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 71, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos de la sonda de oligonucleótido y el segmento diana para crear productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente, se introduce una mella en el enlace escindible de la sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 71, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia opcional de identificador de paciente o de identificador único. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 72 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias únicas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (barras gruesas en blanco y negro, Figura 72, etapa A). El extremo 5' de los conectores agregados contiene opcionalmente un fosfato apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a una secuencia única del segmento de ADN diana, y los lados 5' y 3' de los conectores hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana como se muestra en la Figura 71, etapa B. Las sondas de oligonucleótido también contienen otro porción que contiene una o más de una secuencia de identificador única, una secuencia de identificador de paciente, un fosfato 5' apto para fijación y un enlace escindible (dU) opcional. En un modo de realización, el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido comprende además unas pocas bases adicionales y un grupo bloqueante, que se libera para formar un 3'-OH libre mediante escisión con una nucleasa solo cuando hibrida con la diana, por ejemplo, una base de ribonucleótido como el grupo bloqueante y RNasa H2 (estrella) como la nucleasa de escisión. El extremo 3'-OH liberado ahora es adecuado para la fijación directa al extremo 5' fosforilado cuando la sonda de oligonucleótido hibrida en la diana (Figura 72, etapa C). La polimerasa (diamantes rellenos) extiende los extremos 3' hibridados del segmento de ADN diana (Figura 72, etapa C) para crear puntos de unión de fijación con el extremo 5' correspondiente del segmento de ADN diana. En ausencia de un fosfato 5' apto para fijación en el conector del segmento diana, la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 72, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos del segmento diana para crear productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente, se introduce una mella en el enlace escindible de la sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 72, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia opcional de identificador de paciente o de identificador único. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 73 muestra un procedimiento ejemplar para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido específico de diana hibridado que es adecuado para cebar la amplificación por círculo rodante y la secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias únicas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores compuestos que comprenden tanto porciones monocatenarias (líneas dobles negras y más finas) como porciones bicatenarias (barras negras gruesas) en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (Figura 73, etapa A). Los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 73, panel izquierdo, contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación, mientras que los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 73, panel derecho, no contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a una secuencia única del segmento de ADN diana (líneas negras más gruesas), y a las porciones monocatenarias 5' y 3' de los conectores (línea negra delgada y doble línea) agregados a los segmentos de ADN diana hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana como se muestra en la Figura 73, etapa B. Las sondas de oligonucleótido también contienen una secuencia de identificador único opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional, un fosfato opcional en el extremo 5' y uno o más enlaces escindibles (dU). En un modo de realización, el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido comprende además unas pocas bases adicionales y un grupo bloqueante, que se libera para formar un 3'-OH libre mediante escisión con una nucleasa solo cuando hibrida con la diana, por ejemplo, una base de ribonucleótido como el grupo bloqueante y RNasa H2 (estrella) como la nucleasa de escisión. La polimerasa (diamantes rellenos) extiende los extremos 3' hibridados del segmento de ADN diana y la sonda de oligonucleótido (Figura 73, etapa C) para crear puntos de unión de fijación con el extremo 5' correspondiente del segmento de ADN diana y la sonda, respectivamente. En ausencia de un fosfato 5' apto para fijación en el segmento diana o sonda, la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 73, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos de la sonda de oligonucleótido y el segmento diana para crear productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente, se introducen una o más mellas en los enlaces escindibles de la sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 73, etapa E, los fragmentos de oligonucleótido escindidos se eliminan del ADN diana, dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original que tiene un cebador hibridado específico de la diana. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante, etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 74 representa otro procedimiento ejemplar para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido específico de diana hibridado que es adecuado para cebar la amplificación por círculo rodante y la secuenciación como se describe anteriormente. Los etapas de este modo de realización son similares al modo de realización mostrado en la Figura 73, etapas A-E. Sin embargo, en este modo de realización, las sondas de oligonucleótido también comprenden un grupo de captura (Z) (es decir, biotina) adecuado para la captura de productos sobre un soporte sólido (es decir, con soporte sólido recubierto con estreptavidina). Como se muestra en la Figura 74, etapa E, los fragmentos de oligonucleótido escindidos se eliminan del ADN diana, dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original que tiene un cebador hibridado específico de la diana que también contiene un grupo de captura (Z) para un etapa de captura posterior. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante, etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 75 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido específico de diana hibridado que es adecuado para cebar la amplificación por círculo rodante y la secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias únicas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores compuestos que comprenden tanto porciones monocatenarias (líneas dobles negras y más finas) como porciones bicatenarias (barras negras gruesas) en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (Figura 75, etapa A). Los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 75, panel izquierdo, contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación, mientras que los conectores agregados del procedimiento representado en la Figura 75, panel derecho, no contienen un grupo fosfato 5' apto para fijación. Las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias de nucleótidos complementarias a una secuencia única del segmento de ADN diana (líneas negras más gruesas), y a las porciones monocatenarias 5' y 3' de los conectores agregados (línea negra delgada y doble línea) de los segmentos de ADN diana hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana como se muestra en la Figura 75, etapa B. Las sondas de oligonucleótido también contienen opcionalmente una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, un fosfato en el extremo 5' y uno o más enlaces escindibles (dU). En un modo de realización, el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido comprende además unas pocas bases adicionales y un grupo bloqueante, que se libera para formar un 3'-OH libre mediante escisión con una nucleasa solo cuando hibrida con la diana, por ejemplo, una base de ribonucleótido como el grupo bloqueante y RNasa H2 (estrella) como la nucleasa de escisión. Como los extremos de las sondas de oligonucleótido son contiguos entre sí después de la escisión con RNasa H2, son adecuados para sellado con una ligasa (Figura 75, etapa C). La polimerasa (diamantes rellenos) extiende los extremos 3' hibridados del segmento de ADN diana (Figura 75, etapa C, derecha) para crear puntos de unión de fijación con el extremo 5' correspondiente del segmento de ADN diana. En ausencia de un fosfato 5' apto para fijación en el segmento diana, la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 75, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos del segmento diana para crear productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente, se introducen una o más mellas en los enlaces escindibles de la sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulos rellenos). Como se muestra en la Figura 75, etapa E, los fragmentos de oligonucleótido escindidos se eliminan del ADN diana, dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original con un cebador hibridado específico de la diana. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante, etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 76 es otro procedimiento ejemplar para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido específico de diana hibridado adecuado para la amplificación por círculo rodante y la secuenciación como se describe anteriormente. Los etapas de este modo de realización son similares a las representadas en la Figura 75, etapas A-E. Sin embargo, en este modo de realización, la sonda de oligonucleótido también comprende un grupo de captura (Z) (es decir, biotina) adecuado para la captura de productos sobre un soporte sólido (es decir, con soporte sólido recubierto con estreptavidina). Como se muestra en la Figura 76, etapa E, los fragmentos de oligonucleótido escindidos se eliminan del ADN diana, dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende un segmento de ADN diana original con un cebador hibridado específico de la diana que también contiene un grupo de captura (Z) para un etapa de captura posterior. El producto final es adecuado para amplificación por círculo rodante, etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 77 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (barras negras gruesas, Figura 77, etapa A). El extremo 5' de los conectores agregados contiene opcionalmente un fosfato apto para fijación (Figura 77, etapa B, panel izquierdo). Las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) del segmento de ADN diana, y los lados 5' y 3' de los conectores agregados hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana como se muestra en la Figura 77, etapa B. Las sondas de oligonucleótido también contienen una porción adicional que contiene una o más de una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, un fosfato 5' apto para fijación y un enlace escindible (dU). La Figura 77, etapa C, muestra el uso de 3 dNTP (es decir, dTTP, dCTP, dATP) para la extensión mediada por polimerasa (diamantes rellenos) de los extremos 3' hibridados del segmento de ADN diana y la sonda de oligonucleótido. La extensión del extremo 3' del segmento de ADN diana crea un punto de unión de fijación con el extremo 5' correspondiente del segmento de ADN diana. En ausencia de un fosfato 5' apto para fijación en el segmento de ADN diana (Figura 77, etapa C), la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde una base complementaria solapante en 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación. En la Figura 77, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos del segmento de ADN diana para crear un producto de fijación circular. La digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende el segmento de ADN diana original acoplado a una secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
La Figura 78 muestra otro procedimiento ejemplar para producir construcciones diana circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En estos modos de realización, los segmentos genómicos originales comprenden segmentos de ADNlc (~160 pb) o segmentos de ADN genómico cortado (~160 pb) que contienen, por ejemplo, mutaciones específicas de tumor, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) o secuencias repetitivas polimórficas. El procedimiento comienza con la fijación de conectores cortos en los extremos 3' y 5' de los segmentos de ADN (barras negras gruesas, Figura 78, etapa A). Los conectores agregados del procedimiento contienen una secuencia de identificador único y, opcionalmente, una secuencia de identificador de paciente y un grupo fosfato 5' apto para fijación. Como se muestra en la Figura 78, etapa B, las sondas de oligonucleótido que contienen secuencias complementarias a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) del segmento de ADN diana y los lados 5' y 3' de los conectores agregados hibridan con sus respectivos segmentos de ADN diana. Las sondas de oligonucleótido también contienen un enlace escindible opcional (dU) y un grupo fosfato 5' apto para fijación. Cuando el extremo 5' del segmento de ADN diana con conector agregado y/o el extremo 5' de la sonda de oligonucleótido no contienen un extremo 5' apto para fijación (Figura 78, panel izquierdo), sino que contienen un flap o una base solapante (Figura 78, etapa B, panel derecho), la actividad nucleasa 5' (diamantes rellenos) escinde en el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación (Figura 78, etapa C). Como se muestra en la Figura 78, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos de las sondas de oligonucleótido y los segmentos de ADN diana para crear productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente, se introduce una mella en el enlace escindible de la sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU, triángulos rellenos), y la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende ADN genómico original. acoplado a una secuencia de identificador único. El producto final es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Los procedimientos ejemplificados en las Figuras 63, 65 y 70-78 para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación, así como los procedimientos ejemplificados en las Figuras 66, 67, 68 y 69 para agregar conectores al ADN diana en el procedimiento de producción de construcciones circularas quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario tienen en común la captura del ADN diana original en círculos monocatenarios. En algunos modos de realización, la sonda de oligonucleótido proporciona cierta selectividad por la diana (Figuras 70-78), y en algunos casos el producto comprende el ADN diana original en un círculo monocatenario con un cebador hibridado específico de la diana adecuado para la amplificación por círculo rodante o la captura directa y la secuenciación posterior (Figuras 73-76). Para aquellos enfoques en los que el producto final es una diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario sin un cebador hibridado, las Figuras 79-81 ejemplifican tres enfoques diferentes para hibridar un cebador específico de la diana con una especificidad muy alta, seguido de captura, eliminación por lavado de los ácidos nucleicos no diana y posterior amplificación por círculo rodante.
La Figura 79 muestra un procedimiento ejemplar para enriquecer las construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario específicas de la diana deseadas adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. Un cebador de oligonucleótido específico de la diana se diseña para contener un grupo 3' bloqueado que se libera mediante escisión por RNasa H2 de un enlace de ribonucleótido escindible si y solo si hibrida con la diana (Dobosy et al., "RNasa H-Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primers", BMC Biotechnol. 11:80 (2011)), así como un grupo de captura 5' opcional (por ejemplo, un resto de biotina) (véase Figura 79, etapa B). El ADN circular que comprende las dianas deseadas se enriquece capturando la construcción circular/cebador hibridado sobre un soporte sólido a través del grupo de captura del cebador, por ejemplo, la captura con estreptavidina del resto de biotina. Los círculos que no contienen la diana se eliminan mediante lavado. Se introducen mellas en los enlaces escindibles por ejemplo, escisión por RNasa de ribonucleótido r) para liberar los círculos que contienen la diana del soporte sólido y generar un grupo 3'-OH en el cebador. La polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado del cebador para la amplificación por círculo rodante (véase Figura 80, etapa B). Este producto de extensión es adecuado para la secuenciación posterior.
La Figura 80 muestra otro procedimiento ejemplar para enriquecer las construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario específicas de la diana deseadas adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En este modo de realización, un cebador de oligonucleótido específico de la diana se diseña para contener una secuencia de anclaje de 15-20 bases en 5', 3-5 bases no coincidentes, 6-10 bases coincidentes, complementarias a la diana (Chun et al., "Dual Priming Oligonucleotide System for the Multiplex Detection of Respiratory Viruses and SNP Genotyping of CYP2C19 Gene", Nucleic Acids Res. 35(6):e40 (2007)). Como en la Figura 79, el cebador de oligonucleótido también contiene un grupo 3' bloqueado que se libera por la escisión con RNasa H2 en un enlace de ribonucleótido escindible si y solo si hibrida con la diana, así como un grupo de captura 5' opcional (es decir, un resto de biotina) (véase Figura 80, etapa B). El ADN circular que comprende las dianas deseadas se enriquece capturando la construcción circular/cebador hibridado sobre un soporte sólido a través del grupo de captura, por ejemplo, la captura con estreptavidina del resto de biotina. Los círculos que no contienen la diana se eliminan mediante lavado. Se introducen mellas en los enlaces escindibles por ejemplo, escisión por RNasa de ribonucleótido r) para liberar los círculos que contienen la diana del soporte sólido y generar un grupo 3'-OH en el cebador (Figura 80, etapa C). La polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado del cebador para la amplificación por círculo rodante (Figura 80, etapa D). Este producto de extensión es adecuado para la secuenciación posterior.
La Figura 81 muestra otro procedimiento ejemplar para enriquecer las construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario específicas de la diana deseadas adecuadas para secuenciación como se describe anteriormente. En este modo de realización, dos oligonucleótidos contiguos hibridan con la porción específica de la diana de la construcción circular. El cebador de oligonucleótidos en dirección 5' comprende un grupo de captura 5' opcional (por ejemplo, un resto de biotina). El cebador de oligonucleótido en dirección 3' se diseña para contener un fosfato 5' y un grupo 3' bloqueado que es liberado por la escisión con RNasa H2 en un enlace de ribonucleótido escindible si y solo si hibrida con la diana (Figura 81, etapa B). En presencia de diana, la ligasa une covalentemente los dos oligonucleótidos entre sí (Figura 81, etapa B). El ADN circular que comprende las dianas deseadas se puede enriquecer capturando las construcciones circulares/cebadores hibridados sobre un soporte sólido a través del grupo de captura, por ejemplo, la captura con estreptavidina del resto de biotina. Los círculos que no contienen la diana se eliminan mediante lavado. Se introducen mellas en los enlaces escindibles por ejemplo, escisión por RNasa de ribonucleótido r) para liberar los círculos que contienen la diana del soporte sólido y generar un grupo 3'-OH en el oligonucleótido en dirección 3' (Figura 81, etapa C). La polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra extiende el extremo 3' liberado para la amplificación por círculo rodante (Figura 81, etapa D). Este producto de extensión es adecuado para la secuenciación posterior.
Por tanto, los procedimientos ejemplificados en las Figuras 55, 56, 65, 70 y 71-78 para producir construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario adecuadas para secuenciación, más los procedimientos ejemplificados en las Figuras 79-81 proporcionan ejemplos para generar construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario con cebadores específicos de la diana o del sitio de unión a cebador hibridadas y adecuadas para amplificación por círculo rodante, seguida de secuenciación posterior. Las Figuras 82-89 ejemplifican diferentes estrategias para capturar o enriquecer aún más las dianas deseadas.
La Figura 82 muestra un procedimiento ejemplar para el enriquecimiento de dianas. En este modo de realización, un cebador específico de diana hibridado con construcciones circulares quiméricas diana de ácido nucleico monocatenario se extiende usando polimerasa de desplazamiento de hebra para generar un producto de extensión monocatenario que comprende dos o más copias en tándem de la construcción circular quimérica monocatenaria de copias en tándem (Figura 82, etapa B). Los oligonucleótidos complementarios al producto de extensión se hibridan. Estos oligonucleótidos opcionalmente contienen un extremo 3' bloqueado o con emparejamientos erróneos y contienen un grupo de captura Z (por ejemplo, un resto de biotina) en el extremo 5' (Figura 82, etapa C). El producto de extensión de repetición en tándem específico de la diana se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado. El producto de extensión de repetición en tándem se desnaturaliza a partir de oligonucleótidos de captura sobre el soporte sólido (Figura 82, etapa C). Este producto de extensión es adecuado para secuenciación.
La Figura 83 muestra otro procedimiento ejemplar para el enriquecimiento específico de la diana. En este modo de realización, el cebador de oligonucleótido específico de diana hibrida con la diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario y contiene un grupo de captura Z (es decir, un resto de biotina) en el extremo 5'. La construcción diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado (Figura 83, etapa A). El cebador hibridado original se extiende usando polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar círculos mellados que se liberan del soporte sólido a medida que la polimerasa escinde la porción 5' del oligonucleótido hibridado que contiene el grupo de captura (Figura 83, etapa B) La polimerasa original se inactiva por calor o por proteasa. El extremo 3' del círculo mellado se extiende con polimerasa de desplazamiento de hebra para generar hebras simples de copias en tándem de ADN diana (Figura 83, etapa C). Este producto de extensión es adecuado para secuenciación.
La Figura 84 muestra otro procedimiento ejemplar para el enriquecimiento específico de la diana. En este modo de realización, dos oligonucleótidos específicos de diana hibridan con la diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario como se muestra en la Figura 84, etapa B. Los oligonucleótidos están opcionalmente bloqueados o presentan emparejamientos erróneos en el extremo 3' y contienen el grupo de captura Z (es decir, un resto de biotina) en el extremo 5'. La construcción diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado. Uno de los cebadores hibridados se extiende usando polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra para generar hebras simples de copias en tándem de ADN diana y liberar el producto de extensión del soporte sólido como se muestra en la Figura 84, etapa C. Este producto de extensión es adecuado para secuenciación.
La Figura 85 muestra otro procedimiento ejemplar para el enriquecimiento específico de la diana. En este modo de realización, un primer oligonucleótido específico de diana hibrida con un diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario. Este oligonucleótido está opcionalmente bloqueado o presenta emparejamientos erróneos en el extremo 3' y contiene un grupo de captura Z (es decir, un resto de biotina) en el extremo 5'. La construcción diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado. Un segundo cebador específico de diana hibrida con las construcciones circulares capturadas (Figura 85, etapa B). Se introduce una polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra para extender el segundo cebador para generar un producto de extensión monocatenario que contiene copias en tándem del ADN diana y liberar el producto de extensión del soporte sólido (Figura 85, etapa C). Este producto de extensión es adecuado para secuenciación.
Las Figuras 86 y 87 muestran procedimientos ejemplares para enriquecimiento específico de diana. En estos modos de realización, un cebador del sitio de unión a cebador hibrida con una diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario y se extiende usando polimerasa de desplazamiento de hebra para generar un producto de extensión monocatenario que contiene copias en tándem del ADN diana (Figura 86, etapas A-B y Figura 87, etapas A-B) Los oligonucleótidos específicos de diana complementarios al producto de extensión se hibridan. Los oligonucleótidos hibridados están opcionalmente bloqueados o presentan emparejamientos erróneos en el extremo 3' y contienen un grupo de captura Z (es decir, un resto de biotina) en el extremo 5'. El producto de extensión de repetición en tándem específico de la diana se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado (Figura 86, etapa C y Figura 87, etapa C). En la Figura 86, el producto de extensión de repetición en tándem se desnaturaliza a partir de oligonucleótidos de captura sobre el soporte sólido (Figura 86, etapa D). Este producto de extensión es adecuado para secuenciación. En la Figura 87 se hibridan cebadores adicionales específicos de la diana complementarios al producto de extensión. La extensión con polimerasa de desplazamiento de hebra libera el producto de extensión original del soporte sólido, mientras se realizan copias adicionales (Figura 87, etapa D). El producto de extensión original y las copias adicionales son adecuados para secuenciación.
La Figura 88 muestra otro procedimiento ejemplar para el enriquecimiento específico de la diana. En este modo de realización, un primer cebador específico de la diana y un oligonucleótido específico del sitio de unión del segundo cebador hibridan con las construcciones quiméricas circulares de ácido nucleico monocatenario (véase Figura 88, etapas A-B). El segundo oligonucleótido está opcionalmente bloqueado o presenta emparejamientos erróneos en el extremo 3' y contiene un grupo de captura Z (es decir, un resto de biotina) en el extremo 5'. La construcción diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado. El primer cebador hibridado específico de la diana se extiende usando polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra para generar un producto de extensión monocatenario que contiene copias en tándem de ADN diana y liberar el producto de extensión del soporte sólido. Este producto de extensión es adecuado para secuenciación.
La Figura 89 muestra otro procedimiento ejemplar para el enriquecimiento específico de la diana. En este modo de realización, un oligonucleótido específico del sitio de unión a cebador hibrida inicialmente con la construcción diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario. Este oligonucleótido está opcionalmente bloqueado o presenta emparejamientos erróneos en el extremo 3' y contiene un grupo de captura Z (es decir, un resto de biotina) en el extremo 5'. La construcción diana circular quimérica de ácido nucleico monocatenario se captura sobre un soporte sólido y otros ácidos nucleicos se eliminan por lavado (Figura 89, etapa A). Un segundo cebador específico de diana hibrida con las construcciones circulares capturadas. Se utiliza una polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra para generar productos de extensión monocatenarios que contienen copias en tándem de ADN diana y liberar dicho producto de extensión del soporte sólido. Este producto de extensión es adecuado para secuenciación.
Las Figuras 90-99 muestran el efecto de cobertura de diferentes construcciones de sonda de oligonucleótido. Las sondas de oligonucleótido de cada Figura varían en cuanto a sus porciones específica de diana 5' (en dirección 5'), porciones específicas de diana 3' (en dirección 3'), longitudes de huecos y extremos de anclaje solo en 3' o en 5' y 3' para lograr cobertura de un segmento diana de ADNlc de 160 nucleótidos. El segmento de ADN genómico diana se mueve en incrementos de 10 bases que simulan la "familia" de todas las posibles dianas de 160 nucleótidos producidas mediante protección de nucleosomas.
La Figura 90 muestra diseños de sonda de oligonucleótido adecuados para la detección de todos los posibles fragmentos con conector agregado (barras negras) de 160 nucleótidos derivados de ADNlc. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido está anclada al extremo con conector agregado en 3' de la familia de fragmentos de ADNlc que se muestra, y contiene una porción específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5' (barra gris), una porción específica de la diana de 20 bases en 3' en dirección 3' o (barra gris), una porción específica del conector de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador de 20 bases (línea delgada entre la porción específica de la diana en 5' y la porción del conector que se ilustra debajo de las porciones específicas en dirección 5' y en dirección 3'). El uso de 20 bases como secuencia de identificador tiene fines ilustrativos; puede contener una secuencia de identificador único de 12 bases y una secuencia de identificador de paciente de 8 bases al amplificar y secuenciar el ADN circular quimérico como se ilustra en la Figura 1. De forma alternativa, la porción del identificador puede estar en el rango de 40 a 80 bases cuando se usan identificadores de paciente, porciones específicas del primer y segundo cebador adecuadas para la captura sobre fase sólida y secuenciación de las regiones de unión a cebador como se ilustra en las Figs. 4-12. En la Figura 13 se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana. La línea muy delgada de longitud variable entre la porción específica de la diana 3' y la porción del conector en las sondas de oligonucleótido que se muestran en la Figura 90 corresponde a la longitud de la región en bucle cerca del extremo 3' del segmento diana que se muestra en las Figuras 13-16. Ilustra que la región de la sonda y la región complementaria a la región de conector están físicamente acopladas entre sí.
El diseño de la sonda de oligonucleótido que se muestra en la Figura 91 es similar al que se muestra en la Figura 90. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido está anclada al extremo con conector agregado en 3' de la familia de fragmentos de ADNlc que se muestra, y contiene una porción específica de diana de 80 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 20 bases en 3' o en dirección 3', una porción específica del conector de 10 bases (barra negra gruesa) y una secuencia de identificador de 20 a 160 bases. En las Figuras 13-16 también se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana.
La Figura 92 muestra una variación del diseño de sonda de oligonucleótido adecuado para la detección de todos los posibles fragmentos con conector agregado (barras negras) de 160 nucleótidos derivados de ADNlc. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido está anclada al extremo con conector agregado en 3' de la familia de fragmentos de ADNlc que se muestra, y contiene una porción específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5' (barra gris), una porción específica de la diana de 50 bases en 3' en dirección 3' o (barra gris), una porción específica del conector de 10 bases (barra negra) y una secuencia de identificador de 20 a 160 bases (línea delgada entre la porción específica de la diana en 5' y la porción del conector). El uso de 20 bases como secuencia de identificador tiene solo fines ilustrativos; también son adecuadas longitudes alternativas como se describe anteriormente en referencia a la Figura 90. En las Figuras 13 y 15 se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana. La línea muy delgada de longitud variable entre el conector 3' del segmento de ADNlc y el extremo 3' del ADNlc que se muestra en la Figura 92 corresponde a la longitud de la región en bucle de la sonda de oligonucleótido que se muestra en las Figuras 13-16. Ilustra que la región de la sonda y la región complementaria a la región de conector están físicamente acopladas entre sí.
El diseño de la sonda de oligonucleótido que se muestra en la Figura 93 es similar al que se muestra en la Figura 92. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido está anclada al extremo con conector agregado en 3' de la familia de fragmentos de ADNlc que se muestra, y contiene una porción específica de diana de 80 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 50 bases en 3' o en dirección 3', una porción específica del conector de 10 bases (barra negra gruesa), un segmento de separación de 40 bases y una secuencia de identificador de 20 a 160 bases. En las Figuras 13-16 se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana.
La Figura 94 muestra una ligera variación del diseño de sonda de oligonucleótido adecuado para la detección de todos los posibles fragmentos con conector agregado (barras negras) de 160 nucleótidos derivados de ADNlc. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido está anclada al extremo con conector agregado en 3' de la familia de fragmentos de ADNlc que se muestra, y contiene una porción específica de diana de 50 bases en 5' o en dirección 5' (barra gris), una porción específica de la diana de 50 bases en 3' o en dirección 3' (barra gris), una porción específica del conector de 10 bases en 3' (barra negra), una porción específica del conector de 10 bases en 5' (barra negra) y una secuencia de identificador de 20 a 80 bases (línea delgada entre las porciones específicas de diana en 5' y 3', que se ilustra debajo de las barras grises y la porción del conector). En la Figura 14 se proporciona una ilustración de una sonda de oligonucleótido de esta Figura hibridada con su fragmento de ADNlc diana. La línea muy delgada de longitud variable en el segmento de ADNlc diana que se muestra en la Figura 94 corresponde a la región en bucle en la sonda de oligonucleótido de la Figura 14, y la línea muy delgada de longitud variable en las sondas de oligonucleótido en la Figura 94 corresponde a la región en bucle del segmento de ADN diana de las Figuras 17 y 18. Ilustra que la región de la sonda y la región complementaria a la región de conector están físicamente acopladas entre sí.
El diseño de la sonda de oligonucleótido que se muestra en la Figura 95 es similar al que se muestra en la Figura 94. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido está anclada a los extremos con conector agregado en 3' y conector agregado en 5' de la familia de fragmentos de ADNlc mostrados. La sonda contiene una porción específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 60 bases en 3' o en dirección 3', una porción específica de conector de 10 bases en 3', una porción específica de conector de 10 bases en 5' y una secuencia de identificador de 20 a 80 bases. En las Figuras 17 y 18 también se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana.
La Figura 96 muestra otra variación del diseño de la sonda de oligonucleótido adecuada para la detección de todos los posibles fragmentos sin conector agregado de 160 nucleótidos derivados de ADNlc (barras grises más oscuras). En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de diana de 50 bases en 5' o en dirección 5' (barra gris con líneas negras), una porción específica de diana de 50 bases en 3' o en dirección 3' (barra gris con líneas negras) y una secuencia de identificador de 20 a 80 bases (línea delgada entre porciones específicas de la diana de 5' y 3' y se muestra debajo de las barras grises). Las líneas negras verticales cortas dentro de las regiones de la sonda gris simbolizan los emparejamientos erróneos de una sola base con respecto a la diana original, de modo que se puedan identificar fácilmente las regiones del ADN diana auténtico frente a la copia de la sonda. En las Figuras 23-26 se proporciona una ilustración de una sonda de oligonucleótido de esta Figura hibridada con su fragmento de ADNlc diana.
El diseño de la sonda de oligonucleótido que se muestra en la Figura 97 es similar al que se muestra en la Figura 96. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 60 bases en 3' o en dirección 3' y una secuencia de identificador de 20 a 160 bases. En las Figuras 23, 24, 25 y 26 también se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana.
El diseño de la sonda de oligonucleótido que se muestra en la Figura 98 es similar al que se muestra en la Figura 96. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de diana de 70 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 70 bases en 3' o en dirección 3' y una secuencia de identificador de 20 a 160 bases. En las Figuras 23, 24, 25 y 26 también se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana.
El diseño de la sonda de oligonucleótido que se muestra en la Figura 99 es similar al que se muestra en la Figura 96. En este modo de realización, la sonda de oligonucleótido contiene una porción específica de diana de 80 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 80 bases en 3' o en dirección 3' y una secuencia de identificador de 20 a 160 bases. En las Figuras 23-26 también se proporciona una ilustración de las sondas de oligonucleótido de esta Figura hibridadas con su fragmento de ADNlc diana.
Las Figuras 100 a 103 muestran la cobertura de una región diana mediante sondas de oligonucleótido específicas de diana que tienen regiones de conector en 3' y/o 5', ya que está dispuesta en mosaico en regiones diana contiguas de 160 pb. Específicamente, la Figura 100 ilustra cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases como ejemplo). La secuencia de la región diana que se detecta está representada por la porción en gris oscuro. La secuencia de la región diana que no se detecta se representa como la porción en gris claro, y los conectores se representan como la porción en negro. Cada agrupación vertical sucesiva en esta Figura ilustra la cobertura de la sonda obtenida desplazando las regiones diana de 160 pb encontradas en fragmentos de ADNlc generados aleatoriamente (o fragmentos cortados aleatoriamente). La región diana se desplaza sucesivamente en incrementos de 10 bases para demostrar la cobertura de la región diana mediante una sola sonda. Cada agrupación vertical sucesiva de izquierda a derecha ilustra la cobertura de la región diana y el solapamiento de la sonda por una 2a, 3a y 4a sonda diferente. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra aquí (debajo de cada grupo vertical) contiene una porción de sonda específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5', una sonda de 50 bases en 3' o en dirección 3', una porción de conector de 10 bases y una región de identificador de 20 a 160 pb (líneas finas) La Figura 101 muestra una ilustración similar de cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes como se muestra en la Figura 100. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra aquí contiene una porción de sonda específica de diana de 80 bases en 5' o en dirección 5', una sonda de 50 bases en 3' o en dirección 3', una porción de conector de 10 bases y una región de identificador de 20 a 160 pb (líneas finas).
La Figura 102 muestra una ilustración similar de cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes como se muestra en la Figura 100. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra aquí contiene una porción de sonda específica de diana de 50 bases en 5' o en dirección 5', una sonda de 50 bases en 3' o en dirección 3', porciones de conector de 10 bases en 5' y 3' y una región de identificador de 20 a 160 pb (líneas finas).
La Figura 103 muestra una ilustración similar de cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes como se muestra en la Figura 100. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra aquí contiene una porción de sonda específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5', una sonda de 60 bases en 3' o en dirección 3', porciones de conector de 10 bases en 5' y 3' y una región de identificador de 20 a 160 pb (líneas finas).
Las Figuras 104 a 107 muestran la cobertura de una región diana por oligonucleótidos marcados por fases específicos de la diana sin conectores en 3' o 5', ya que se disponen en mosaico en regiones genéticas diana contiguas de 160 pb (representa el procedimiento que se muestra en las Figuras 20 y 22). Las sondas de oligonucleótido que tienen regiones específicas de diana de 50 bases en 5' y 3' contienen un emparejamiento erróneo de una sola base cada 10 bases (marcas verticales de almohadilla). Secuencia de región diana que se detecta (gris oscuro); secuencia de región diana que no se detecta (gris claro). Específicamente, la Figura 104 muestra oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb (los segmentos diana no llevan conectores agregados) en un tramo de ADN genómico. Las sondas específicas de diana 5' y 3' tienen un emparejamiento erróneo de una sola base cada 10 bases (marcas verticales de almohadilla). Cada agrupación sucesiva en la figura ilustra la simulación de la cobertura de la sonda de regiones diana de 160 pb de desplazamiento encontradas en el ADNlc. La región diana se desplaza sucesivamente en incrementos de 10 bases para demostrar la cobertura de la región diana mediante una sola sonda. Cada agrupación sucesiva de izquierda a derecha ilustra la cobertura de la región diana y el solapamiento de la sonda por una 2a, 3a y 4a sonda diferente. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra en esta figura contiene una porción específica de diana de 50 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 50 bases en 3' o en dirección 3', y una región de identificador de secuencia de 20 a 160 bases.
La Figura 105 muestra un enfoque similar para los oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb como se muestra en la Figura 104. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra en esta figura contiene una porción específica de diana de 60 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 60 bases en 3' o en dirección 3', y una región de identificador de secuencia de 20 a 160 bases.
La Figura 106 muestra un enfoque similar para los oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb como se muestra en la Figura 104. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra en esta figura contiene una porción específica de diana de 70 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 70 bases en 3' o en dirección 3', y una región de identificador de secuencia de 20 a 160 bases.
La Figura 107 muestra un enfoque similar para los oligonucleótidos marcados en fase específicos de la diana en mosaico a través de dianas de genes contiguas de 160 pb como se muestra en la Figura 104. La estructura de la sonda de oligonucleótido que se muestra en esta figura contiene una porción específica de diana de 80 bases en 5' o en dirección 5', una porción específica de diana de 80 bases en 3' o en dirección 3', y una región de identificador de secuencia de 20 a 160 bases.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases y generar, en la muestra, ADNc de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana, si están presentes en la muestra. El procedimiento implica además proporcionar una o más primeras sondas de oligonucleótido, en el que cada primera sonda de oligonucleótido comprende (a) una porción de secuencia específica de diana de ADNc 3', (b) una porción específica de diana de ADNc 5', y una porción adicional, comprendiendo dicha porción adicional (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador, o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). La muestra se pone en contacto con una o más de las primeras sondas de oligonucleótido en condiciones eficaces para que las porciones específicas de diana 3' y 5' de las primeras sondas de oligonucleótido hibriden de una manera específica de base con regiones complementarias del ADNc. Se genera uno o más puntos de unión aptos para fijación adecuados para acoplar los extremos 3' y 5' de una primera sonda de oligonucleótido hibridada con su ADNc complementario y la primera sonda de oligonucleótido, en el uno o más puntos de unión para fijación, se fija para formar un producto circular fijado que comprende una copia de ácido desoxirribonucleico de la secuencia de ácido ribonucleico diana acoplada a la porción adicional de la primera sonda de oligonucleótido. El procedimiento implica además detectar y distinguir los productos fijados circulares en la muestra para identificar la presencia de una o más moléculas de ácido ribonucleico diana que difieren de otras moléculas de ácido ribonucleico de la muestra en una o más bases.
De acuerdo con la presente divulgación, la Figura 108 muestra un procedimiento para la captura específica de diana de transcritos de ARNm o ARNlnc (ARN largo no codificante) para la secuenciación. Como se muestra en la Figura 108, el etapa A, ARNm o ARNlnc que contiene las regiones diana deseadas se retrotranscribe (retrotranscripción, diamante relleno) para generar una molécula de ADN complementario (ADNc). Como se muestra en la Figura 108, etapa B, una sonda de oligonucleótido que contiene secuencias 5' y 3' complementarias a la región diana de ADNc hibrida con la molécula de ADNc. Las porciones específicas de la diana de la sonda de oligonucleótido están separadas por una porción adicional. La porción adicional comprende una porción de identificador único, opcionalmente una porción de identificador de paciente, y opcionalmente un fosfato 5'. Si es necesario, una polimerasa (diamante relleno) extiende el extremo 3' hibridado de la sonda de oligonucleótido para generar un extremo 3' al nivel del extremo 5' de la sonda de oligonucleótido (Figura 108, etapa C). En ausencia de un fosfato apto para fijación en el extremo 5', una polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' escinde la base complementaria solapante en 5' en el extremo 5' para generar un fosfato 5' (lado izquierdo de la Figura 108, etapa C). Como se muestra en la Figura 108, etapa D, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos aptos para fijación o extendidos para crear productos de fijación circulares. Finalmente, como se muestra en la Figura 108, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados dejando solo la construcción circular monocatenaria deseada que comprende una copia de ADNc de la secuencia de ácido ribonucleico diana acoplada a una secuencia de identificador único o secuencia de identificador de paciente. Este producto es adecuado para la amplificación por círculo rodante y secuenciación usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido nucleico que potencialmente comprenden distintas regiones de primera diana y segunda diana acopladas entre sí (por ejemplo, fusiones de genes posibles). Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene potencialmente una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden distintas regiones de primera diana y segunda diana acopladas entre sí, y proporcionar uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótido, en el que cada conjunto de sondas comprende (i) una primera sonda de oligonucleótido que comprende una porción específica de primera diana 5', una porción específica de segunda diana 3', y una porción adicional, y (ii) una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una porción específica de segunda diana 5', una porción específica de primera diana 3', y una porción adicional, en la que la porción adicional de la primera o segunda sonda de oligonucleótido de un conjunto de sondas comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). Este procedimiento implica además poner en contacto la muestra y el uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótido en condiciones eficaces para que la primera y segunda sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas hibriden de una manera específica según las bases con sus regiones de primera y segunda diana correspondientes de la molécula de ácido nucleico, si están presentes en la muestra, y generar uno o más puntos de unión aptos para fijación adecuados para acoplar los extremos 3' de las primeras sondas de oligonucleótido a los extremos 5' de las segundas sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas y para acoplar los extremos 5' de las primeras sondas de oligonucleótido a los extremos 3' de segundas sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas cuando dichos conjuntos de sondas hibridan con regiones de primera y segunda diana complementarias de una molécula de ácido nucleico. El primer y segundo oligonucleótidos de un conjunto de sondas se fijan en uno o más puntos de unión aptos de fijación para formar productos fijados circulares que comprenden una secuencia de nucleótidos correspondiente a la primera y segunda regiones diana distintas de una molécula de ácido nucleico acoplada a una porción adicional. Los productos fijados circulares se detectan y se distinguen en la muestra, identificando de este modo la presencia, si la hay, de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden regiones de primera diana y segunda diana distintas acopladas entre sí en la muestra.
De acuerdo con esta divulgación, la Figura 109, etapas A-E, muestra un procedimiento ejemplar para detectar fusiones de genes posibles específicas en ARNm. El ARNm que contiene la posible fusión de genes se retrotranscribe para generar una molécula de ADNc (Figura 109, etapa A). Para cada diana potencial se proporciona un conjunto de sondas que comprende una primera y una segunda sonda de oligonucleótido. La primera sonda tiene una porción específica de primera diana 5' y una porción específica de segunda diana 3', mientras que la segunda sonda tiene una porción específica de segunda diana 5' y una porción específica de primera diana 3'. Las porciones específicas de la diana de cada sonda están separadas por una secuencia de nucleótidos que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una o más secuencias de unión a cebador, o cualquier combinación de las mismas. Las sondas de oligonucleótido hibridan con sus respectivas porciones complementarias de la molécula de ADNc diana como se muestra en la Figura 109, etapa B. Si las sondas de oligonucleótido contienen extremos 5' aptos para fijación, una ligasa sella covalentemente los extremos contiguos de los oligonucleótidos hibridados para crear un producto de fijación circular como se muestra en la Figura 109, etapa D (panel izquierdo). Si las sondas de oligonucleótido contienen un flap o una base nucleotídica solapante en 5', una nucleasa 5' escinde el extremo 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación (Figura 109, etapa C) antes de la fijación (Figura 109, etapa D, panel derecho). La digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o lineales, dejando solo las construcciones de ADN circularizadas monocatenarias deseadas que comprenden las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' de los productos de fusión de genes acoplados a una secuencia de identificador única, una secuencia de identificador de paciente y/o una secuencia de captura (por ejemplo, secuencia de unión a cebador). Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación posterior como se describe en el presente documento.
La Figura 110 muestra una variación del procedimiento representado en la Figura 109 para detectar fusiones de genes posibles específicas en ARNm. En este modo de realización, las sondas de oligonucleótido primera y segunda hibridan con sus respectivas regiones complementarias de la molécula de ADNc como se muestra en la Figura 110, etapa B. Una polimerasa extiende los extremos 3' hibridados de cada primera y segunda sonda para formar puntos de unión de fijación con los extremos 5' hibridados de la segunda y primera sondas, respectivamente, como se muestra en la Figura 110, etapa C. Cuando las sondas de oligonucleótido tienen un 5'-OH (lado derecho de la Figura 110, etapa C), la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos contiguos de las sondas de oligonucleótido hibridadas primera y segunda para crear productos de fijación circulares (Figura 110, etapa D). La digestión con exonucleasa elimina los productos no fijados o lineales, dejando solo las construcciones de ADN circulares monocatenarias deseadas que comprenden las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' de los productos de fusión de genes acoplados a una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o una secuencia de captura (es decir, secuencia de unión a cebador). Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación posterior como se describe en el presente documento.
La Figura 111 muestra otro procedimiento de acuerdo con la presente divulgación que es adecuado para la detección y cuantificación de exones específicos en ARNm o ARNip. En este modo de realización, el ARNm o ARNlnc que contiene los exones deseados se retrotranscribe en ADNc (Figura 111, etapa A). Como se muestra en la Figura 111, etapa B, para cada diana potencial, se proporcionan dos sondas de oligonucleótido, en el que cada sonda contiene secuencias específicas de diana 3' y 5' complementarias a porciones únicas de cada exón de la molécula de ADNc. Las porciones específicas de la diana de cada sonda están separadas por una secuencia de nucleótidos que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una o más secuencias de unión a cebador, o cualquier combinación de las mismas. Las sondas hibridan contiguas entre sí en el ADNc de la diana como se muestra en la Figura 111, etapa B. Si las sondas de oligonucleótido contienen extremos 5' aptos para fijación, una ligasa sella covalentemente los extremos contiguos de los oligonucleótidos hibridados para crear un producto de fijación circular como se muestra en la Figura 111, etapa D (panel izquierdo). Si las sondas de oligonucleótido contienen un flap o una base nucleotídica solapante en 5', una nucleasa 5' escinde el extremo 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación (Figura 111, etapa C) antes de la fijación (Figura 111, etapa D, panel derecho). La digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o lineales, dejando solo las construcciones de ADN circularizadas monocatenarias deseadas que comprenden la secuencia de ADNc de los exones deseados acoplada a una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o una secuencia de captura (por ejemplo, secuencia de unión a cebador). Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación posterior como se describe en el presente documento.
La Figura 112 muestra una variación del procedimiento representado en la Figura 111 para detectar y cuantificar exones específicos en ARNm o ARNlnc. En este modo de realización, las sondas de oligonucleótido primera y segunda hibridan con su respectiva región complementaria de la molécula de ADNc como se muestra en la Figura 112, etapa B. Una polimerasa extiende los extremos 3' hibridados de cada primera y segunda sonda para formar puntos de unión de fijación con los extremos 5' hibridados de la segunda y primera sondas, respectivamente, como se muestra en la Figura 112, etapa C. Cuando las sondas de oligonucleótido tienen un 5'-OH (lado derecho de la Figura 110, etapa C), la actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación. La ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos extendidos contiguos de las sondas de oligonucleótido hibridadas primera y segunda para crear productos de fijación circulares (Figura 112, etapa D). La digestión con exonucleasa elimina los productos no fijados o lineales, dejando solo las construcciones de ADN circulares monocatenarias deseadas que comprenden la secuencia de ADNc de los exones deseados acoplada a una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o una secuencia de captura (es decir, secuencia de unión a cebador). Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación posterior como se describe en el presente documento.
La Figura 113 muestra otro procedimiento de acuerdo con la presente divulgación que es adecuado para la detección de polimorfismos conocidos en la misma hebra de ADN genómico. Como se muestra en la Figura 113, el etapa A, las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del segmento de ADN genómico diana contienen polimorfismos. Como se muestra en la Figura 113, etapa B, para cada diana potencial se proporcionan dos sondas de oligonucleótido, en el que cada sonda contiene secuencias específicas de diana 3' y 5' que son complementarias a las porciones en dirección 5' y en dirección 3' del ADN que contiene polimorfismos. Las porciones específicas de la diana de cada sonda están separadas por una secuencia de nucleótidos que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una o más secuencias de unión a cebador, o cualquier combinación de las mismas. Las sondas hibridan contiguas entre sí en las secuencias de ADN genómico diana como se muestra en la Figura 113, etapa B. Si las sondas de oligonucleótido contienen extremos 5' aptos para fijación, una ligasa sella covalentemente los extremos contiguos de los oligonucleótidos hibridados para crear un producto de fijación circular como se muestra en la Figura 113, etapa D (panel izquierdo). Si las sondas de oligonucleótido contienen un flap o una base nucleotídica solapante en 5', una nucleasa 5' escinde el extremo 5' para generar un fosfato 5' apto para fijación (Figura 113, etapa C) antes de la fijación (Figura 113, etapa D, panel derecho). La digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o lineales, dejando solo las construcciones de ADN circularizadas monocatenarias deseadas que comprenden las secuencias en dirección 5' y en dirección 3' de ADN genómico que contiene polimorfismos acopladas a una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente y/o una secuencia de captura (por ejemplo, secuencia de unión a cebador). Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación posterior como se describe en el presente documento.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de miARN diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de miARN diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases y agregar conectores de nucleótidos a los extremos 3' y 5' de las moléculas de miARN diana de la muestra. Este procedimiento implica además proporcionar una o más sondas de oligonucleótido, en el que cada sonda de oligonucleótido comprende (a) una porción 3' complementaria al conector de nucleótidos 3' de la molécula de miARN diana, (b) una porción 5' complementaria al conector de nucleótidos 5' de las moléculas de miARN diana, y (c) una porción adicional, en el que dicha porción adicional comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). La muestra se pone en contacto con la una o más sondas de oligonucleótido en condiciones eficaces para que las porciones 3' y 5' de las sondas de oligonucleótido hibriden de una manera específica según las base con conectores de nucleótidos complementarios en las moléculas de miARN diana, si están presentes en la muestra. El extremo 3' de la sonda de oligonucleótido hibridada se extiende para generar un complemento de una o más moléculas de miARN diana, y el extremo extendido 3' de la sonda de oligonucleótido se une al extremo 5' de la sonda de oligonucleótido para formar un producto fijado circular que comprende una secuencia complementaria al conector de nucleótidos 3' de la molécula de miARN diana, una secuencia complementaria al conector de nucleótidos 5' de la molécula de miARN diana, el complemento de la una o más moléculas de miARN diana, y el porción adicional de la sonda de oligonucleótido. Este procedimiento implica además detectar y distinguir los productos fijados circulares en la muestra, identificando de este modo la presencia de una o más moléculas de miARN diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases.
De acuerdo con la presente divulgación, la Figura 114 muestra un procedimiento para detectar poblaciones genéricas de miARN. El material de partida para este procedimiento es miARN aislado de suero, plasma o exosomas (Figura 114, etapa A). Como se muestra en la Figura 114, etapa B, los conectores de nucleótidos se agregan a los extremos 3' y 5' de las moléculas de ácido ribonucleico diana en la muestra. Como se muestra en la Figura 114, etapa B, el conector 3' contiene un grupo bloqueante en su extremo 3' y un grupo fosfato en su extremo 5' para facilitar la fijación utilizando ARN ligasa T4 (círculos rellenos) en el extremo 3' de la molécula de miARN diana. El conector 5', que también contiene un grupo bloqueante en su extremo 5', está fijado de manera similar al extremo 5' de la molécula de miARN usando ARN ligasa T4. Las sondas de oligonucleótido que contienen una porción 3' complementaria al conector de nucleótidos 3' del miARN diana y una porción 5' complementaria al conector de nucleótidos 5' del miARN diana hibridan con su molécula de miARN diana agregada (Figura 114, etapa C). Las sondas de oligonucleótido también contienen una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una o más secuencias de unión a cebador, o cualquier combinación de las mismas. La retrotranscriptasa que carece de actividad 5'->3' (diamante relleno) extiende el extremo 3' de la sonda de oligonucleótido hibridada, copiando la secuencia de miARN, hasta que está contigua al extremo 5' apto para fijación de la sonda de oligonucleótido (Figura 114, etapa D) Como se muestra en la Figura 114, etapa E, la ADN ligasa T4 (círculos rellenos) sella covalentemente el extremo 3' extendido de la sonda de oligonucleótido para crear un producto de fijación circular. La UDG y la endonucleasa AP (triángulos rellenos) mellan el miARN (Figura 114, etapa E), y la digestión con exonucleasa de todos los productos no fijados o mellados deja solo la construcción circular de ácido nucleico monocatenario deseada que comprende una copia de la diana de miARN acoplada a una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular como se describe en el presente documento.
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de miARN diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de miARN diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases y fijar conectores de nucleótidos a los extremos 3' y 5' de las moléculas de miARN diana de la muestra. Los conectores de nucleótidos se acoplan entre sí por una porción adicional, en el que dicha porción adicional comprende (i) una secuencia de identificador único, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una o más secuencias de unión a cebador, o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii), con lo que dicha fijación forma un producto de fijación circular que comprende la molécula de miARN diana, las secuencias de conectores de nucleótidos 3' y 5', y la porción adicional. Este procedimiento implica además proporcionar uno o más primeros cebadores de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de conector de nucleótidos 3' o 5' del producto de fijación circular, e hibridar el uno o más primeros cebadores de oligonucleótidos con el producto de fijación circular de una manera específica según las bases. El extremo 3' del primer cebador de oligonucleótido se extiende para generar un complemento del producto de fijación circular, y los complementos del producto de fijación circular de la muestra se detectan y distinguen, identificando de este modo la presencia de una o más moléculas de miARN diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases.
De acuerdo con la presente divulgación, la Figura 115 muestra un procedimiento para detectar secuencias de miARN específicas. El miARN aislado de suero o exosomas (Figura 115, etapa A) se fosforila en su extremo 5'. Como se muestra en la Figura 115, etapa B, los conectores de nucleótido acoplados se fijan en los extremos 3' y 5' de las moléculas de ácido ribonucleico diana en la muestra. Los conectores de nucleótido se acoplan por una secuencia de nucleótidos que contiene una secuencia de identificador único, un ribonucleótido 3', una secuencia de identificador de paciente, una o más secuencias de unión a cebador o cualquier combinación de las mismas. La fijación de los conectores de nucleótido acoplados se facilita con una sonda de oligonucleótido que tiene una secuencia 3' complementaria al extremo 3' del conector acoplado, una secuencia 5' complementaria al extremo 5' del conector acoplado y una secuencia complementaria al miARN diana como se muestra en la Figura 115, etapa B. La fijación de los conectores de nucleótido a la molécula de miARN crea productos de fijación circularizados que contienen la molécula de miARN diana. Como se muestra en la Figura 115, etapa C, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados, por ejemplo, la sonda de oligonucleótido, dejando solo la construcción circularizada monocatenaria deseada que contiene el miARN diana. Como se muestra en la Figura 115, etapa D, un cebador fosforilado en 5' hibrida con la construcción circularizada, y una polimerasa que tiene actividad retrotranscriptasa (diamante), pero que carece de actividad 5'->3', extiende el cebador hibridado alrededor de la construcción circularizada generando una copia complementaria de la molécula de miARN. La ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo 3' extendido y el extremo 5' fosforilado del cebador para crear un segundo producto de fijación circularizado como se muestra en la Figura 115, etapa E. La UDG y la endonucleasa AP (triángulo relleno) mellan la molécula de miARN original, y la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo las construcciones de ácido nucleico circular monocatenario deseadas que comprenden una copia de la diana de miARN acoplada a una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular como se describe en el presente documento.
La Figura 116 muestra una variación del procedimiento representado en la Figura 115 para detectar secuencias de miARN específicas. En esta variación, la fijación de los conectores de nucleótido acoplados al miARN diana se facilita usando una sonda de oligonucleótido que tiene un grupo bloqueante 3' y un espaciador interno ("X") dentro de la secuencia que es complementaria a la secuencia de miARN diana (Figura 116, etapa B, panel izquierdo). La fijación de los conectores acoplados al miARN diana forma productos de fijación circularizados como se muestra en la Figura 116, etapa B (panel izquierdo). Un cebador 5'-OH que contiene tiofosfatos hibrida con los productos de fijación circularizados como se muestra en la Figura 116, etapa C. Una polimerasa que tiene actividad retrotranscriptasa y actividad nucleasa 5'->3' (diamantes rellenos) extiende el extremo 3' del cebador hibridado para formar una copia complementaria del producto de fijación circularizado y la molécula de miARN diana contenida en el mismo (Figura 116, etapa C y Figura 116, etapa D, panel izquierdo). La actividad nucleasa 5' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' del cebador, dejando un fosfato 5' apto para fijación (Figura 116, etapa D, panel izquierdo). La ligasa (círculo relleno) sella covalentemente el extremo extendido para crear productos de fijación circular como se muestra en la Figura 116, etapa E. La UDG y la endonucleasa Ap (triángulo relleno) mellan la molécula de miARN original (Figura 116, etapa E, panel izquierdo) y la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el a Dn circular monocatenario deseado que comprende una copia de la diana de miARN acoplada a una secuencia de identificador único (Figura 116, etapa F, panel izquierdo). Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular como se describe en el presente documento. En ausencia de un miARN diana, como se muestra en la Figura 116, etapas B-E, panel derecho, la extensión del cebador con nucleasa 5'->3' crea un hueco con una rotura bicatenaria. Los productos con huecos no se fijan y permanecen lineales (Figura 116, etapa E, panel derecho). Estos productos lineales se eliminan del análisis mediante digestión con exonucleasa (Figura 116, etapa F).
Otra divulgación se dirige a un procedimiento para identificar, en una muestra, una o más moléculas de miARN diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases. Este procedimiento implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de miARN diana que potencialmente contienen una o más diferencias de bases, y proporcionar uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótido, en el que cada conjunto comprende (a) una primera sonda de oligonucleótido que tiene una porción de tallo-bucle 5' y una porción 3' complementaria a una porción 3' de la molécula de miARN diana, (b) una segunda sonda de oligonucleótido que tiene una porción 3' complementaria a una copia del extremo 5' de la molécula de miARN diana, una porción 5' complementaria a la porción en ste5' de la primera sonda de oligonucleótido, y una porción adicional que comprende (i) una secuencia de identificador de diana única, (ii) una secuencia de identificador de paciente, (iii) una secuencia de unión a cebador o cualquier combinación de (i), (ii) y (iii). El procedimiento implica además mezclar la muestra, la una o más primeras sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas, y una retrotranscriptasa para formar una reacción de retrotranscriptasa, y extender el extremo 3' de la primera sonda de oligonucleótido hibridada con su molécula de miARN diana complementaria para generar un complemento de la molécula de miARN diana, si está presente en la muestra. Las una o más segundas sondas de oligonucleótido de un conjunto de sondas hibridan con las primeras sondas de oligonucleótido extendidas que comprenden un complemento de las secuencias de miARN diana, y se generan uno o más puntos de unión aptos para fijación entre los extremos 3' y 5' de cada segunda sonda de oligonucleótido hibridada con una primera sonda de oligonucleótido extendida. El procedimiento implica además unir los extremos 3' y 5' de cada segunda sonda de oligonucleótido para formar productos fijados circulares, en el que cada producto comprende una copia de ácido desoxirribonucleico de la secuencia de miARN diana acoplada a la porción adicional de la segunda sonda de oligonucleótido. Los productos fijados circulares de la muestra se detectan y distinguen, identificando de este modo la presencia de una o más moléculas de miARN diana que difieren de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en una o más bases.
De acuerdo con la presente divulgación, la Figura 117 muestra un procedimiento para detectar secuencias de miARN específicas. El miARN, aislado de suero, plasma o exosomas, hibrida con una primera sonda de oligonucleótido que tiene una secuencia que es complementaria al extremo 3' del miARN diana y un tallo-bucle en su extremo 5' (Figura 117, etapa B). La región de tallo-bucle de la primera sonda de oligonucleótido también contiene un enlace escindible (dU). La primera sonda de oligonucleótido se extiende usando una retrotranscriptasa (diamantes rellenos) formando de este modo una copia complementaria de la molécula de miARN. Como se muestra en la Figura 117, etapa C, una segunda sonda de oligonucleótido que contiene una secuencia 3' que es complementaria al extremo 3' de la primera sonda de oligonucleótido extendida, y una secuencia 5' que es complementaria al tallo-bucle 5' de la primera sonda de oligonucleótido híbrida con regiones complementarias de la primera sonda de oligonucleótido. Las segundas sondas de oligonucleótido también pueden contener una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente, una o más secuencias de unión a cebador, un fosfato 5' o cualquier combinación de los mismos. La polimerasa (diamantes rellenos) extiende el extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido, produciendo una copia complementaria de la secuencia de miARN y colocando el extremo 3' de la sonda contiguo a su extremo 5' para formar un punto de unión para fijación (Figura 117, etapa D). La polimerasa también extiende el extremo 3' de la primera sonda de oligonucleótido (usando la segunda sonda de oligonucleótido hibridada como molde) para crear un punto de unión para fijación con su extremo 5' (Figura 117, etapa D). Como se muestra en la Figura 117, etapa E, la ligasa (círculos rellenos) sella covalentemente los extremos 3' y 5' de las sondas de oligonucleótido primera y segunda en cada punto de unión para fijación respectivo para crear productos de fijación circularizados. Se introduce una mella en el enlace escindible de la primera sonda de oligonucleótido (por ejemplo, escisión con UDG de dU y endonucleasa AP, triángulo relleno). Como se muestra en la Figura 117, etapa E, la digestión con exonucleasa elimina todos los productos no fijados o mellados, dejando solo la construcción circularizada de ácido nucleico monocatenario deseada (es decir, la segunda sonda de oligonucleótido) que comprende una copia de la secuencia diana de miARN acoplada a una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular como se describe en el presente documento.
En la medida en que los siguientes ejemplos están fuera del alcance de las reivindicaciones, se proporcionan con fines ilustrativos.
EJEMPLOS
Ejemplo profético 1: Marcador de mutaciones de alta sensibilidad (cuando está presente en un 1 % a un 0,01 %), mutaciones de una sola base, mutaciones por inserciones pequeñas y deleciones pequeñas en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53).
Los cambios mutacionales en los oncogenes se producen normalmente en regiones o posiciones discretas y, a menudo, pueden conducir a la progresión del tumor. Se puede encontrar una lista de estos genes y sus mutaciones en bases de datos públicas tales como la base de datos "COSMIC" del Centro del Genoma Sanger. La presencia de dichas mutaciones en el suero es un fuerte indicador de algún tejido tumoral en el cuerpo. Tradicionalmente, dichas mutaciones se han identificado utilizando la amplificación por PCR específica de alelos. Este enfoque es susceptible a una falsa amplificación inicial, seguida de la amplificación del producto falso. Otros han usado PCR digital para tratar de cuantificar el ADN mutante en el suero. Sin embargo, los cambios mutacionales en genes supresores de tumores, tales como p53 y APC, son demasiado numerosos para cubrirlos usando enfoques de PCR específica de alelos. Por tanto, el enfoque se ha modificado hacia una secuenciación profunda en todos los exones de la proteína. Cuando el ADN entrante es limitante, es importante lograr una amplificación equitativa de diferentes regiones para garantizar la misma nivel general de cobertura. Han existido intentos de lograr amplificaciones equitativas usando sondas de inversión molecular (MIP), véase, por ejemplo, Akhras et al., "Connector Inversion Probe Technology: A Powerful One-Primer Multiplex DNA Amplification System for Numerous Scientific Applications", PLoS One 2(9):e915 (2007); Hiatt et al., "Single Molecule Molecular Inversion Probes for Targeted, High-Accuracy Detection of Low-Frequency Variation", Genome Res. 23(5):843-54 (2013). Sin embargo, estas técnicas dependen de la preparación de una copia de ADN genómico y, por tanto, corren el riesgo de introducir errores adicionales.
Visión general del enfoque: La idea es capturar fielmente cada fragmento de ADN diana que cubre las regiones o exones de interés, agregar una secuencia de identificador único y un identificador de paciente opcional, y circularizarlos para la secuenciación posterior, como la secuenciación circular. La hebra de ADN diana original se circulariza y secuencia. Esto evita los errores inducidos por la polimerasa que se derivan de la extensión (y circularización) de oligonucleótidos hibridados, lo que conduciría a falsos positivos. Este enfoque proporciona la ventaja de obtener información sobre el número de copias cuando es necesario (es decir, carga vírica, desequilibrio cromosómico en los tumores, detección de aneuploidía en el diagnóstico prenatal no invasivo) y datos mutacionales con la mínima secuenciación requerida.
Variación 1.1 (Figuras 13-16). En esta variación, conectores cortos se fijan a la diana de ADN (ADNlc con longitud promedio de aproximadamente 160 bases). Para capturar las regiones deseadas, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector, y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de la diana. El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en un extremo (se muestra el extremo 5') o un conector escindible opcional. Dependiendo del diseño de la sonda y de las bases de inicio y finalización del fragmento diana, una porción de la diana puede formar un bucle como una región monocatenaria entre el conector 3' y la porción de la diana complementaria a la sonda 3' (Figuras 13 y 14), o una porción del extremo 5' de la secuencia diana puede no hibridar, o una porción de la secuencia de sonda 3' del oligonucleótido puede formar un bucle (Figuras 15 y 16). La adición de una polimerasa permite la extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana, así como la extensión del conector del extremo 3' a través de la secuencia del identificador único y la secuencia del identificador de paciente opcional.
Las condiciones de hibridación se eligen de modo que la hibridación de la región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana lleva la concentración local del extremo 3' del conector en la diana al nivel de su complemento, de modo que hibrida correctamente y se extiende fácilmente por la polimerasa. Sin embargo, si hay una complementariedad insuficiente entre la sonda de oligonucleótido y el ADN diana, entonces el extremo 3' del conector en la diana no hibridará con su complemento, y rara vez se extenderá por la polimerasa. La extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana potencia la asociación de la sonda a la diana y, por tanto, aumenta la capacidad del extremo 3' del conector de hibridar correctamente con su complemento y extenderse por la polimerasa. La actividad de escisión por nucleasa 5'^-3' de la polimerasa (o nucleasa Fen) escinde una base complementaria solapante en 5' de la diana en o cerca de la posición donde el lado 5' de la diana es complementario a la porción 5' de la sonda, dejando un fosfato 5' apto para fijación de la diana auténtica. La polimerasa también extiende el oligonucleótido en la diana, y genera un fosfato 5' apto para fijación (lado izquierdo de las Figuras 13 y 15, etapa D) o no escinde el grupo bloqueante en el extremo 5' del oligonucleótido (lado derecho de Figuras 13 y 15, etapa D).
La ligasa sella covalentemente los extremos 3' extendidos al fosfato 5' apto para fijación para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante evita la circularización de la sonda de oligonucleótido (Figuras 13 y 15, etapa D, lado derecho), o de forma alternativa, se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, seguida de escisión de la cadena principal apurínica con endonucleasa AP, Figuras 13 y 15, etapa D, lado izquierdo). La adición opcional de Uracil-ADN glicosilasa (UDG) y Formamidopirimidina-ADN glicosilasa (Fpg, también conocida como 8-oxoguanina ADN glicosilasa, que actúa como una N-glucosilasa y como una AP-liasa) se puede usar para mellar dianas que contienen bases dañadas. A continuación, se agrega(n) exonucleasa(s) para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original con una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular, o para secuenciación SMRT directa.
Este enfoque requiere una enzima con actividad nucleasa 5 '^3 ' dependiente de la diana, de modo que el fosfato 5' apto para fijación se genere solo cuando haya una hibridación y complementariedad adecuadas entre la región de sonda 5' y la región diana 5'. Cuando se usa la polimerasa con actividad de escisión por nucleasa 5'^3', el desafío es evitar que la polimerasa extienda el conector corto a lo largo de la región de sonda 5' de modo que destruya la región diana 5' (es decir, traducción de mellas) sin una etapa de fijación. La traducción de mellas que destruye el ADN diana original y lo reemplaza por ADN extendido puede introducir inadvertidamente un error de polimerasa que se propagaría y se denominaría erróneamente una mutación. Esto se puede minimizar usando una mezcla de polimerasas, con y sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3' (por ejemplo, en una proporción 1:20) en condiciones de extensión distributiva en presencia de ligasa de modo que la mayor parte de la extensión se realice por la polimerasa sin actividad nucleasa hasta que se requiera polimerasa con actividad nucleasa para crear el punto de unión apto de fijación, seguida de disociación de polimerasa y un acontecimiento de fijación para generar el producto de fijación circular deseado.
El ADNlc, con tamaños en el intervalo de 140 a 170 nucleótidos, refleja la escisión del ADN cromosómico alrededor de las unidades de nucleosomas. Dichos acontecimientos de escisión pueden ser algo escalonados, o algo más aleatorio, generando un número de fragmentos que se pueden distribuir de manera uniforme o desigual. Por tanto, existe la necesidad de diseñar sondas de oligonucleótido que den cobertura independiente de dónde se rompe el fragmento.
Las Figuras 90 a 93 proporcionan algunos ejemplos de diferentes diseños de sondas de oligonucleótido para cubrir fragmentos en una región de 250 bases. En estas figuras, el fragmento diana potencial (desplazado 10 bases en una región) está representado por una barra gris oscura, los conectores por una barra negra corta, las regiones de la sonda como barras grises claras, el identificador de secuencia único y el identificador de paciente opcional como una línea negra más gruesa y la conexión entre dos secuencias dibujada esquemáticamente como una línea más delgada. Las Figuras 100 y 101 ilustran cómo se diseñarían múltiples sondas para cubrir aproximadamente una región de 500 bases contiguas.
En la Figura 90, la región de sonda 5' en dirección 5' (60 bases) es complementaria a las bases diana 50-110, mientras que la región de sonda 3' en dirección 3' (20 bases) es complementaria a las bases diana 140-160. Para los propósitos de este ejemplo, el conector tiene 10 bases, y la secuencia del identificador compuesto tiene 20 bases (12 bases para el identificador de secuencia y 8 bases para el identificador de paciente). Cuando la diana es de la posición 1 a la 160, este diseño de sonda permitirá la circularización de un producto de 140 bases, de las cuales 110 bases, es decir, de la posición 50 a la 160, proporcionan información de la secuencia diana. Cuando la diana es de la posición 11 a la 170, este diseño de sonda permitirá la circularización de un producto de 150 bases, de las cuales 120 bases, es decir, de la posición 50 a la 170, proporcionan información de la secuencia diana. Con este diseño, las 160 bases máximas de información de secuencia se derivarán con la diana comenzando a partir de las posiciones 51 a 81 y terminando en las posiciones 210 a 240, respectivamente. En la figura, cuando la diana es de la posición 61 a la 250, no hay formación de producto circular. Sin embargo, se puede formar algún producto debido a la región de complementariedad más corta entre la región de sonda 5' y el lado 5' de la diana, aunque existe la preocupación de que no siempre hibridarán. Además, con este diseño, existe la preocupación de que la región "en bucle" de la diana de 90 bases en el lado 3' pueda ser demasiado larga para permitir la hibridación eficaz del extremo 3' del conector con su complemento en el oligonucleótido (barras negras cortas en el lado derecho de la ilustración).
En la Figura 91, la región de sonda 5' en dirección 5' (80 bases) es complementaria a las bases diana 30-110, mientras que la región de sonda 3' en dirección 3' (20 bases) es complementaria a las bases diana 140-160. Esta figura es similar a la Figura 90, excepto porque la región de sonda 5' es más larga. Para los 4 primeros ejemplos de dianas, el oligonucleótido más largo permite la captura de más ADN diana, de modo que los círculos resultantes contienen 20 bases adicionales de ADN diana original.
Las Figuras 100 y 101 ilustran cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases en el presente documento). La Figura 100 ilustra cuatro sondas "consecutivas" usando el diseño de la Figura 90, mientras que la Figura 101 ilustra cuatro sondas "consecutivas" usando el diseño de la Figura 91. Se ilustran potenciales fragmentos de 160 pb que se podrían generar en la región (desplazados 10 bases). Debajo se muestra el oligonucleótido que cubriría todos esos fragmentos anteriores. Si el área en la diana está en gris claro, no proporcionará información de secuencia fiable. Si el área en la diana está en gris oscuro, debería proporcionar una buena información de secuencia. En este diagrama, las sondas enumeradas se designan secuencialmente como #1, #2, #3, #4, etc. Para las etapas de extensión multiplexada-fijación, las sondas impares #1, #3, #5 se agrupan en un primer grupo de oligonucleótidos y, a continuación, las sondas pares #2, #4, #6 se agrupan en un segundo grupo. Este enfoque evita que oligonucleótidos contiguos (es decir, #1 y #2) compitan por unirse a la misma hebra diana. Una vez que se ha llevado a cabo la extensión y circularización, se pueden combinar los dos grupos y se puede proceder a las etapas de exonucleasa y etapas posteriores, tales como la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular, o la secuenciación SMRT directa.
Protocolo detallado (V1.1) para la detección de alta sensibilidad de mutaciones de una sola base, mutaciones por inserciones pequeñas y deleciones pequeñas (cuando están presentes en un 1 % a un 0,01 %) en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53):
1.1. a. Comenzando con ADNlc (o, por ejemplo, ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC), cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Opcionalmente, purificar el ADN diana del conector no fijado.
1.1. b. Desnaturalizar los conectores que contienen ADN diana en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias en el lado 5' de las dianas, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias en el lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). La polimerasa Taq y la ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D), los dNTP y KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa) opcional se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
1.1. c. Opcionalmente, escindir la hebra de la sonda de oligonucleótido en un enlace escindible (por ejemplo, U escindido usando UDG y endonucleasa AP). Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: La sonda de oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. De forma alternativa, se puede incluir un enlace escindible en la sonda de oligonucleótido original.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas.
Nota 4: El procedimiento de extensión y fijación se puede llevar a cabo en dos o más tubos de reacción, un conjunto contiene las sondas con numeración "impar" y el segundo conjunto contiene las sondas con numeración "par", para evitar que las sondas compitan por las mismas hebras de ADN diana. Las reacciones separadas se pueden agrupar posteriormente.
Variación 1.2 (Figuras 17-18). En esta variación, el objetivo es capturar toda la secuencia de ADN diana, independientemente de donde se une la sonda a la diana. Como anteriormente, conectores cortos se fijan a la diana de ADN (ADNlc con longitud promedio de aproximadamente 160 bases). Para capturar las regiones deseadas, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de la diana, una secuencia complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector, y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de la diana. La sonda de oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en un extremo (se muestra el extremo 5') o un conector escindible opcional. Dependiendo del diseño de la sonda y de las bases de inicio y finalización del fragmento diana, una porción de la secuencia diana o de la secuencia de la sonda puede formar un bucle como una región monocatenaria entre el conector 3' y la porción de la diana complementaria a la sonda 3', así como entre el conector 5' y la porción de la diana complementaria a la sonda 5' (Figura 17). La adición de una polimerasa permite la extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana, así como la extensión del conector del extremo 3' a través de la secuencia del identificador único y la secuencia del identificador de paciente opcional hasta que esté contiguo al conector 5' en la diana.
Las condiciones de hibridación se eligen de modo que la hibridación de la región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de la diana lleva la concentración local del extremo 3' del conector en la diana, de modo que hibrida correctamente y se extiende fácilmente por la polimerasa. El extremo 5' del conector se puede diseñar para que sea ligeramente más largo, de modo que una vez que la polimerasa extiende el conector 3', no extienda a través de la secuencia complementaria del conector 5' hasta que llegue a la porción de la diana 5' que hibrida con la región de la sonda 5'. Sin embargo, el efecto de hibridación "combinada" de las regiones de conector 3' y de conector 5' con sus complementos en la sonda de oligonucleótido aún debería tener una Tm por debajo de la temperatura de hibridación, de modo que la hibridación aleatoria de la diana incorrecta a la sonda de oligonucleótido raramente da como resultado la extensión y fijación para dar un producto circular.
Esta variación requiere que la sonda de oligonucleótido contenga secuencias complementarias a las hebras de conector 3' y 5', estando dichas secuencias separadas por solo aproximadamente 20 bases. Dado que las secuencias son complementarias a las hebras de conector, que a su vez son complementarias entre sí, se debe evitar el autoemparejamiento de la sonda de oligonucleótido. Una solución es fijar los conectores que contienen una burbuja interna, de modo que los dos conectores retienen el carácter bicatenario a la baja temperatura usada para la fijación del conector (16 °C o incluso 4 °C con ligasa T4). Además, el conector 5' se puede diseñar para que sea más largo que el conector 3'. Finalmente, las regiones de complementariedad dentro del conector se pueden diseñar para tener emparejamientos erróneos sutiles o un análogo de nucleótido (es decir, G:T y T:G; o I:A) que son más desestabilizadores en la sonda de oligonucleótido complementaria (es decir, C:A y A:C; o C:T) de modo que es menos probable que la sonda de oligonucleótido forme el autoemparejamiento interno con un bucle a la temperatura de hibridación global (es decir, 50 °C).
Por ejemplo, un emparejamiento erróneo I:A en el medio de un tramo A en un conector reduciría la Tm en 2,4 °C en comparación con una coincidencia T:A, mientras que el emparejamiento erróneo complementario en el oligonucleótido, C:T, reduce la Tm en 10,1 °C (una diferencia de 7,7 °C). Del mismo modo, un emparejamiento erróneo G:T en el medio de un tramo A en un conector reduciría la Tm en 10,2 °C en comparación con una coincidencia G:C, mientras que el emparejamiento erróneo complementario en el oligonucleótido, A:C, reduce la Tm en 18,0 °C (una diferencia de 7,8 °C). Véase Kawase et al., "Studies on nucleic acid interactions. I. Stabilities of miniduplexes (dG2A4XA4G2-dC2T4YT4C2) and self-complementary d(GGGAAXYTTCCC) containing deoxyinosine and other mismatched bases," Nucleic Acids Res. 14(19):7727-36 (1986)). Por tanto, se prevé que la colocación de ambos emparejamientos erróneos dentro del conector disminuirá la Tm del autoemparejamiento del oligonucleótido en aproximadamente 15,5 °C en comparación con el autoemparejamiento del conector. El valor exacto puede variar en base al contexto de secuencia; sin embargo, debería ser evidente para los expertos en la técnica que el uso de los emparejamientos erróneos I:A y G:T en un dúplex conector-ADN que permanece bicatenario a la temperatura de fijación de 4 °C o 16 °C sería más que suficiente para garantizar que las secuencias complementarias, separadas por aproximadamente 20 bases dentro de un oligonucleótido, no se autoemparejarían (es decir, una horquilla con un bucle de 20 bases) a una temperatura de hibridación más alta de 50 °C.
La extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana potencia la asociación de la sonda a la diana y, por tanto, aumenta la capacidad del extremo 3' del conector de hibridar correctamente con su complemento y extenderse por la polimerasa. La actividad de escisión por nucleasa 5'->3' de la polimerasa (o nucleasa Fen) escinde una base complementaria solapante en 5' del conector 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación en el conector. La polimerasa también extiende el oligonucleótido en la diana, y genera un fosfato 5' apto para fijación o no escinde el grupo bloqueante en el extremo 5' del oligonucleótido.
La ligasa sella covalentemente los extremos 3' extendidos al fosfato 5' apto para fijación para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante evita la circularización de la sonda de oligonucleótido o, de forma alternativa, se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, seguida de escisión de la cadena principal apurínica con endonucleasa AP). La adición opcional de Uracil-ADN glicosilasa (UDG) y Formamidopirimidina-ADN glicosilasa (Fpg, también conocida como 8-oxoguanina ADN glicosilasa, que actúa como una N-glucosilasa y como una AP-liasa) se puede usar para mellar dianas que contienen bases dañadas. A continuación, se agrega(n) exonucleasa(s) para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original con una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular, o para secuenciación SMRT directa.
El desafío aquí es evitar que la polimerasa extienda el conector 3' de modo que destruya el conector 5' sin un etapa de fijación (es decir, traducción de mellas). Esto se puede lograr incorporando enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al conector en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Un enfoque alternativo es usar un conector 5' que contenga un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndolII termoestable (como Tma EndolII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el conector está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el conector monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el conector hibridado al molde sería el sustrato preferente. Cuando se usa EndolII termoestable, la polimerasa de PCR usada carecería de actividad exonucleasa 5'->3'.
Como se mencionó anteriormente, el problema de la traducción de mellas también se puede minimizar usando una mezcla de polimerasas, con y sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3' (por ejemplo, en una proporción 1:20) en condiciones de extensión distributiva en presencia de ligasa de modo que la mayor parte de la extensión se realice por la polimerasa sin actividad nucleasa hasta que se requiera polimerasa con actividad nucleasa para crear el punto de unión apto de fijación, seguida de disociación de polimerasa y un acontecimiento de fijación para generar el producto de fijación circular deseado.
Las Figuras 94 y 95 proporcionan algunos ejemplos de diferentes diseños de sondas de oligonucleótido para cubrir fragmentos en una región de 250 bases. En estas figuras, el fragmento diana potencial (desplazado 10 bases en una región) está representado por una barra gris oscura, los conectores por una barra negra corta, las regiones de la sonda como barras grises claras, el identificador de secuencia único y el identificador de paciente opcional como una línea negra más gruesa y la conexión entre dos secuencias dibujada esquemáticamente como una línea más delgada. Las Figuras 102 y 103 ilustran cómo se diseñarían múltiples sondas para cubrir aproximadamente una región de 500 bases contiguas.
En la Figura 94, la región de sonda 5' en dirección 5' (50 bases) es complementaria a las bases diana 50-100, mientras que la región de sonda 3' en dirección 3' (50 bases) es complementaria a las bases diana 150-200. Para los propósitos de este ejemplo, el conector 3' tiene 10 bases, y la secuencia del identificador compuesto tiene 20 bases (12 bases para el identificador de secuencia y 8 bases para el identificador de paciente) y el conector 5' se ilustra como 10 bases, aunque en otro modo de realización sería algo más largo, de aproximadamente 12 a 18 bases. Cuando la diana es de la posición 1 a la 160, este diseño de sonda permitirá la circularización de un producto de 200 bases, de las cuales las 160 bases proporcionan información de la secuencia diana. Estas sondas se diseñan de modo que, independientemente del lugar donde se encuentre la diana, desde 1 a 160 hasta 91 a 250, aún deberían formar productos de extensión que circularicen para formar productos de aproximadamente 200 bases.
En la Figura 95, la región de sonda 5' en dirección 5' (60 bases) es complementaria a las bases diana 40-100, mientras que la región de sonda 3' en dirección 3' (60 bases) es complementaria a las bases diana 140-200. Esta figura es similar a la Figura 94, excepto que ambas regiones de sonda 3' y 5' son más largas. Este diseño de sonda puede ser más eficaz para capturar dianas en los extremos (es decir, dianas 1 a 160; 11 a 170; 81 a 240; y 91 a 250).
Las Figuras 102 y 103 ilustran cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases en el presente documento). La Figura 102 ilustra cuatro sondas "consecutivas" usando el diseño de la Figura 94, mientras que la Figura 103 ilustra cuatro sondas "consecutivas" usando el diseño de la Figura 95. Se ilustran potenciales fragmentos de 160 pb que se podrían generar en la región (desplazados 10 bases). Debajo se muestra el oligonucleótido que cubriría todos esos fragmentos anteriores. En este diagrama, las sondas enumeradas se designan secuencialmente como #1, #2, #3, #4, etc. Para las etapas de extensión multiplexada-fijación, las sondas impares #1, #3, #5 se agrupan en un primer grupo de oligonucleótidos y, a continuación, las sondas pares #2, #4, #6 se agrupan en un segundo grupo. Este enfoque evita que oligonucleótidos contiguos (es decir, #1 y #2) compitan por unirse a la misma hebra diana. Una vez que se ha llevado a cabo la extensión y circularización, se pueden combinar los dos grupos y se puede proceder a las etapas de exonucleasa y etapas posteriores, tales como la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular, o la secuenciación SMRT directa.
Protocolo detallado (V1.2) para la detección de alta sensibilidad de mutaciones de una sola base, mutaciones por inserciones pequeñas y deleciones pequeñas (cuando están presentes en un 1 % a un 0,01 %) en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53):
1.2. a. Comenzando con ADNlc (o, por ejemplo, ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC), cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 a 4 °C agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Opcionalmente, purificar el ADN diana del conector no fijado.
1.2. b. Desnaturalizar los conectores que contienen ADN diana en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias en el lado 5' de las dianas, una secuencia complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias en el lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
1.2. c. Opcionalmente, escindir la sonda de oligonucleótido en un enlace escindible (por ejemplo, U escindido usando UDG y endonucleasa AP). Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. De forma alternativa, se puede incluir un enlace escindible en el oligonucleótido original.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: El conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al conector en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tma EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el oligonucleótido monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el conector hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 5: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 6: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas.
Nota 7: El procedimiento de extensión y fijación se puede llevar a cabo en dos o más tubos de reacción, un conjunto contiene las sondas con numeración "impar" y el segundo conjunto contiene las sondas con numeración "par", para evitar que las sondas compitan por las mismas hebras de ADN diana. Las reacciones separadas se pueden agrupar posteriormente.
Nota 8: Los oligonucleótidos iSx-003-ShAdT (hebra superior) e iSx-004-pShAdB (hebra inferior) proporcionan ejemplos de conectores que contienen protuberancias "Y" en 3' de una sola base (véase la Tabla 1). Los oligonucleótidos ISX-o06-MdAdT (hebra superior) e ISX-007-pMdAdB (hebra inferior) proporcionan ejemplos de conectores ligeramente más largos, para potenciar la unión a la región del conector (véase la Tabla 1). Los conectores iSx-003-ShAdT e iSx-006-MdAdT (véase la Tabla 1) pueden contener grupos tiofosfato opcionales cerca del extremo 5' para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización de las dianas con los extremos de conector. Los conectores iSx-004-pShAdB e iSx-007-pMdAdB (véase la Tabla 1) pueden contener grupos tiofosfato opcionales cerca de o en el extremo 3' para evitar la degradación si se usa una polimerasa con actividad de corrección de errores, y facilitar la circularización de las dianas con los extremos de conector.
Nota 9: Si no se añaden una base extra al ADN diana (es decir, omitiendo el etapa Klenow), entonces se usa una fijación de extremo romo. Para evitar la fijación de conector a conector, el extremo romo del conector no está fosforilado. Los oligonucleótidos iSx-003-ShAdT (hebra superior) e iSx-005-ShAdB (hebra inferior) proporcionan ejemplos de conectores que contienen extremos romos (véase la Tabla 1).
Nota 10: Cuando se diseñan oligonucleótidos para su uso con secuencias de conector más largas, que comprenden secuencias de "código de barras" o "indexación" para su uso con instrumentos comerciales, puede ser necesario ensamblar el oligonucleótido usando PCR, amplificación de desplazamiento de hebra, o una combinación de los mismos. Durante la PCR, el uso de dUTP en lugar de Tt P incorpora uracilo, adecuado para su posterior escisión por UDG. El cebador de hebra inversa se puede fosforilar, permitiendo su digestión usando exonucleasa lambda o una exonucleasa 5'->3' similar. Se puede agregar una secuencia de dA30 al extremo 5' del cebador directo, lo que permite la amplificación por desplazamiento de hebra. En la Tabla 1 (a continuación) se muestran ejemplos de oligonucleótidos adecuados para ensamblaje y amplificación para la secuenciación de regiones de KRAS, BRAF y exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes e incluyen los siguientes: (i) regiones diana directas e inversas de KRAS (iSx-001-bkA30, iSx-016-bkA30-KRSF11, iSx-017-pKRSF12, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-018-pKRSF13 e iSx-018-pKRSR14) e (iSx-015-pKRSF10, iSx-017-pKRSF12, iSx-008-701F, iSx-009-50lR, iSx-018-pKRSF13, iSx-019-bkA30-KRSRl5 e iSx-001-bkA30); (ii) regiones diana directas e inversas de BRAF (iSx-001-bkA30, iSx-023-bkA30-BRF-FM, iSx-024-pBRF-F12, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-025-pBRF-F13 e iSx-026-pBRF-R14) e (iSx-022-pBRF-F10, iSx-024-pBRF-F12, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-025-pBRF-F13, iSx-027-bkA30-pBRF-Rl5 e iSx-001-bkA30); (iii) regiones diana directas e inversas del exón 5 de TP53 en dirección 5' (iSx-001-bkA30, iSx-035-bkA30-pTP53e5F11, iSx-036-pTP53e5F12, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-037-pTP53e5F13, iSx-038-pTP53e5R14) e (iSx-034-pTP53e5F10, iSx-036-pTP53e5F12, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-037-pTP53e5F13, iSx-039-bkA30-TP53e5R15 e iSx-001-bkA30); (iv) regiones diana directas e inversas del exón 5 de TP53 en dirección 3' (iSx-001-bkA30, iSx-043-bkA30-TP53e5F21, iSx-044-pTP53e5F22, iSx-008-701F. iSx-009-501R, iSx-045-pTP53e5F23 e iSx-046-pTP53e5R24) e (iSx-042-pTP53e5F20, iSx-044-pTP53e5F22, iSx-008-701F. iSx-0o9-501R, iSx-045-pTP53e5F23, iSx-047-bkA30-TP53e5R25 e iSx-001-bkA30); (v) regiones diana directas e inversas del exón 6 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-053-bkA30-TP53e6F31, iSx-054-pTP53e6F32, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-055-pTP53e6F33 e iSx-056-pTP53e6R34) e (iSx-052-pTP53e6F30, iSx-054-pTP53e6F32, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-055-pTP53e6F33, iSx-057-bkA30-TP53e6R35, e iSx-001-bkA30); (vi) regiones diana directas e inversas del exón 7 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-063-bkA30-TP53e7F41, iSx-064-pTP53e7F42, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-065-pTP53e7F43 e iSx-066-pTP53e7R44) e (iSx-062-pTP53e7F40, iSx-064-pTP53e7F42, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-065-pTP53e7F43, iSx-067-pTP53e7R45 e iSx-001-bkA30); y (vii) regiones diana directas e inversas del exón 8 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-073-bkA30-TP53e8F51, iSx-074-pTP53e8F52, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-075-pTP53e8F53 e iSx-076-pTP53e8R54) e (iSx-072-pTP53e8F50, iSx-074-pTP53e8F52, iSx-008-701F, iSx-009-501R, iSx-075-pTP53e8F53, iSx-077-bkA30-TP53e8R55 e iSx-001-bkA30).
Nota 11: Después de generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y los exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes, estas regiones se pueden someter a amplificación por círculo rodante usando cebadores específicos de la diana para generar productos de repetición en tándem. Estos productos se pueden generar antes o después de la captura de las dianas deseadas con oligonucleótidos específicos de la diana sobre un soporte sólido (véase la nota 12 a continuación). Los cebadores pueden contener una base nucleotídica escindible interna o un sitio abásico tal como 1',2'-didesoxirribosa (dSpacer), lo que permite la incorporación de dUTP durante la amplificación por círculo rodante para protección contra la contaminación por arrastre. Los ejemplos de dichos cebadores se muestran en la Tabla 1 a continuación e incluyen los siguientes: (i) cebadores directos e inversos de KRAS (iSx-108-KRS-rcF26, iSx-109-KRS-rcR27); (ii) cebadores directos e inversos de BRAF (iSx-118-BRF-rcF26, iSx-119-BRF-rcR27); (iii) cebadores directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-128-TP53e5-rcF66, iSx-129-TP53e5-rcR67; iSx-130-TP53e5-rcF68, iSx-131-TP53e5-rcR69); (iv) cebadores directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-138-TP53e6-rcF76, iSx-139-TP53e6-rcR77);(v) cebadores directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-148-TP53e7-rcF86, iSx-149-TP53e7-rcR87); y (vi) cebadores directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-158-TP53e8-rcF96, iSx-159-TP53e8-rcR97).
Nota 12: Después de generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y los exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes, y/o generar productos de repetición en tándem, estos productos se pueden capturar mediante hibridación a oligonucleótidos más largos, que contienen un grupo de captura adecuado para la captura posterior sobre un soporte sólido. En la Tabla 1 a continuación se muestran ejemplos de dichos cebadores que contienen grupos biotina adecuados para la captura a través de superficies sólidas recubiertas con estreptavidina e incluyen los siguientes: (i) oligonucleótidos de captura directa e inversa de KRAS (iSx-013-KRS-bcF1, iSx-014-KRS-bcR2); (ii) oligonucleótidos de captura directos e inversos de B
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RF-bcF1, iSx-021-BRF-bcR2); (iii) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-030-TP53e5-bcF1, iSx-031-TP53e5-bcR2; iSx-032-TP53e5-bcF3, iSx-033-TP53e5-bcR4); (iv) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-050-TP53e6-bcF5, iSx-05l-TP53e6-bcR6);(v) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-060-TP53e7-bcF7, iSx-061-TP53e7-bcR8); y (vi) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-070-TP53e8-bcF9, iSx-071-TP53e8-bcR10).
Nota 13: Con los productos antes mencionados generados usando los diseños de cebadores y conectores anteriores, después de la amplificación por agrupamiento o con microesferas, o la captura dentro de un pocillo, dirección o superficie de una cubeta de lectura en un instrumento comercial, se pueden usar los siguientes cebadores para iniciar reacciones de secuenciación: (i) iLx-003-PEsqP1, cebador de secuenciación de extremo emparejado 1; (ii) iLx-004-BrCdR1, cebador de indexación, lectura de código de barras 1; (iii) iLx-001-P5-BrCdR2, lectura de código de barras 2; y (iv) iLx-005-PEsqP2, cebador de secuenciación de extremo emparejado 2 (véase la Tabla 1 para las secuencias de cebador).
Variación 1.3 (véanse, por ejemplo, las Figuras 19-22). En esta variación, en lugar de fijar conectores cortos a la diana de ADN, se agrega una cola de mononucleótido corta usando transferasa terminal (ADNlc con longitud promedio de aproximadamente 160 bases). Los etapas restantes son las mismas que en las Figuras 13 y 15. Es difícil controlar cuántas bases agrega la transferasa terminal. Por lo tanto, la longitud del tramo de homonucleótido
(es decir, poliA) dentro del oligonucleótido determina la Tm de hibridación. Puede ser necesario usar también una polimerasa con actividad de corrección de errores 3'->5' para eliminar parte del tramo de homonucleótido en exceso hasta que esté a nivel con su complemento, y adecuada para la extensión con polimerasa.
Variación 1.4 (véanse, por ejemplo, las Figuras 23-26). En esta variación no se agrega nada a la diana de ADN (ADNlc con longitud promedio de aproximadamente 160 bases). Para capturar las regiones deseadas, la diana hibrida con oligonucleótidos que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de la diana. Las regiones de sonda 5' y 3' contienen emparejamientos erróneos opcionales a intervalos regulares (es decir, 10, 12 o
15 bases). La sonda de oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en un extremo (se muestra el extremo 5') o un conector escindible opcional. Dependiendo del diseño de la sonda y de las bases de inicio y finalización del fragmento diana, una porción del extremo 5' o 3' de la secuencia diana puede no hibridarse (Figura
23). La adición de una polimerasa o un conjunto de polimerasas que contienen actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana, así como la digestión opcional del extremo 3' monocatenario de la diana hasta que esté a nivel con la región de la sonda 3' del oligonucleótido (Figura 23), seguido de la extensión del extremo 3' de la diana a través de la secuencia de identificador único y la secuencia de identificador de paciente opcional.
Las condiciones de hibridación se eligen de modo que la hibridación de la región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana y la hibridación de la región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana se enriquecen sobre las dianas que hibridan a un solo lado (y formarían un producto de extensión improductivo que no circularizaría). La extensión del extremo 3' de la sonda de oligonucleótido en la diana potencia la asociación de la sonda a la diana. La actividad de escisión por nucleasa 5 '^3 ' de la polimerasa (o nucleasa Fen) escinde una base complementaria solapante en 5' de la diana en o cerca de la posición donde el lado 5' de la diana es complementaria a la porción 5' de la sonda, dejando un fosfato 5' apto para fijación de la diana auténtica. La polimerasa también extiende la sonda de oligonucleótido usando la diana en el molde, y genera un fosfato 5' apto para fijación (lado izquierdo de las Figuras 23 y 22) o no escinde el grupo bloqueante en el extremo 5' del oligonucleótido (lado derecho de Figuras 23 y 25).
La ligasa sella covalentemente los extremos 3' extendidos al fosfato 5' apto para fijación para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante evita la circularización de la sonda de oligonucleótido (lado derecho) o, de forma alternativa, se introduce una mella en el enlace escindible (por ejemplo, escisión con UDG de dU, seguida de escisión de la cadena principal apurínica con endonucleasa AP, lado izquierdo). La adición opcional de Uracil-ADN glicosilasa (UDG) y Formamidopirimidina-ADN glicosilasa (Fpg, también conocida como 8-oxoguanina ADN glicosilasa, que actúa como una N-glucosilasa y como una AP-liasa) se puede usar para mellar dianas que contienen bases dañadas. A continuación, se agrega(n) exonucleasa(s) para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original con una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante y secuenciación circular, o para secuenciación SMRT directa.
Este enfoque requiere una enzima o un conjunto de enzimas con actividad nucleasa 5'->3' y 3'->5' dependiente de la diana, de modo que el fosfato 5' apto para fijación se genere solo cuando haya una hibridación y complementariedad adecuadas entre la región de sonda 5' y la región diana 5'. Cuando se usa la polimerasa con actividad de escisión por nucleasa 5'^-3', el desafío es evitar que la polimerasa extienda el conector corto a lo largo de la región de sonda 5' de modo que destruya la región diana 5' (es decir, traducción de mellas) sin una etapa de fijación. La traducción de mellas que destruye el ADN diana original y lo reemplaza por ADN extendido puede introducir inadvertidamente un error de polimerasa que se propagaría y se denominaría erróneamente una mutación. Esto se puede minimizar usando una mezcla de polimerasas, con y sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3' (por ejemplo, en una proporción 1:20) en condiciones de extensión distributiva en presencia de ligasa de modo que la mayor parte de la extensión se realice por la polimerasa sin actividad nucleasa hasta que se requiera polimerasa con actividad nucleasa para crear el punto de unión apto de fijación, seguida de disociación de polimerasa y un acontecimiento de fijación para generar el producto de fijación circular deseado. El uso de un diseño de sonda de oligonucleótido como se representa en las Figuras 25 y 26 puede obviar la necesidad de una polimerasa con actividad nucleasa 3'->5'. El uso de cinasa T4 para agregar un fosfato en el extremo 5' de la diana en una reacción inicial también se puede usar para crear un fosfato 5' apto para fijación, y obviar la necesidad de una polimerasa con actividad nucleasa 5'->3'.
Las Figuras 96-99 proporcionan algunos ejemplos de diferentes diseños de sondas de oligonucleótido para cubrir fragmentos en una región de 250 bases. En estas figuras, el fragmento diana potencial (desplazado 10 bases en una región) está representado por una barra gris oscura, las regiones de la sonda como barras grises claras con líneas negras delgadas dentro de las barras grises que indican bases con emparejamientos erróneos, y el identificador de secuencia único e identificador de paciente opcional como una línea negra más gruesa. Las Figuras 104-107 ilustran cómo se diseñarían múltiples sondas para cubrir aproximadamente una región de 500 bases contiguas.
En la Figura 96, la región de sonda 5' en dirección 5' (50 bases) es complementaria a las bases diana 40-90, mientras que la región de sonda 3' en dirección 3' (50 bases) es complementaria a las bases diana 150-200. Para los propósitos de este ejemplo, existen emparejamientos erróneos cada 10 bases, y la secuencia del identificador compuesto tiene 20 bases (12 bases para el identificador de secuencia y 8 bases para el identificador de paciente). Cuando la diana es de la posición 1 a la 160, este diseño de sonda permitirá la circularización de un producto de 180 bases, de las cuales 110 bases, es decir, de la posición 50 a la 160, proporcionan información de la secuencia diana. Cuando la diana es de la posición 11 a la 170, este diseño de sonda permitirá la circularización de un producto de 180 bases, de las cuales 120 bases, es decir, de la posición 50 a la 170, proporcionan información de la secuencia diana. Con este diseño, las 140 bases máximas de información de secuencia se derivarán con la diana comenzando a partir de las posiciones 31 a 51 y terminando en las posiciones 190 a 210, respectivamente. En la figura, cuando la diana es de la posición 81 a la 250, no hay formación de producto circular. Sin embargo, se puede formar algún producto debido a la región de complementariedad más corta entre la región de sonda 5' y el lado 5' de la diana, aunque existe la preocupación de que no siempre hibridarán.
En la Figura 97, la región de sonda 5' en dirección 5' (60 bases) es complementaria a las bases diana 30-90, mientras que la región de sonda 3' en dirección 3' (60 bases) es complementaria a las bases diana 150-210. Esta figura es similar a la Figura 96, excepto que ambas regiones de sonda 5' y 3' son más largas. Para los 5 primeros ejemplos de dianas, el oligonucleótido más largo permite la captura de más ADN diana, de modo que los círculos resultantes contienen 20 bases adicionales de ADN diana original.
Las Figuras 98 y 99 amplían las tendencias de las Figuras 96 y 97, con regiones de sonda de 70 y 80 bases, respectivamente. Como anteriormente, las regiones de sonda más largas garantizan una mayor cobertura de la diana. Los emparejamientos erróneos ayudan a distinguir la diana auténtico de una copia de la sonda por polimerasa. Cuando el ADN en cuestión contiene la base natural, se originó a partir de la diana, así como la secuencia de ADN contigua a ella. Cuando el ADN contiene el complemento de la base con error de emparejamiento en la sonda, entonces se sabe que la base se generó a partir de la sonda.
Las Figuras 104-107 ilustran cómo diseñar sondas de oligonucleótido con una estrategia de mosaico solapante para secuenciar regiones contiguas más grandes (se muestran aproximadamente 500 bases en el presente documento). La Figura 104 ilustra cuatro sondas "consecutivas" usando el diseño de la Figura 96, mientras que las Figuras 105­ 107 ilustra cuatro sondas "consecutivas" usando el diseño de las Figuras 97-99. Se ilustran potenciales fragmentos de 160 pb que se podrían generar en la región (desplazados 10 bases). Debajo se muestra el oligonucleótido que cubriría todos esos fragmentos anteriores. Si el área en la diana está en gris claro, no proporcionará información de secuencia fiable. Si el área en la diana está en gris oscuro, debería proporcionar una buena información de secuencia. En este diagrama, las sondas enumeradas se designan secuencialmente como #1, #2, #3, #4, etc. Para las etapas de extensión multiplexada-fijación, las sondas impares #1, #3, #5 se agrupan en un primer grupo de oligonucleótidos y, a continuación, las sondas pares #2, #4, #6 se agrupan en un segundo grupo. Este enfoque evita que oligonucleótidos contiguos (es decir, #1 y #2) compitan por unirse a la misma hebra diana. Una vez que se ha llevado a cabo la extensión y circularización, se pueden combinar los dos grupos y se puede proceder a las etapas de exonucleasa y etapas posteriores, tales como la amplificación por círculo rodante y la secuenciación circular, o de forma alternativa, la secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, utilizando la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Protocolo detallado para la detección de alta sensibilidad de mutaciones de una sola base, mutaciones por inserciones pequeñas y deleciones pequeñas (cuando están presentes en un 1 % a un 0,01 %) en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53):
1.4. a. Comenzando con ADNlc (o, por ejemplo, ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC), cortado a aproximadamente 150 pb), desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias en el lado 5' de las dianas, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40 °C o 45 °C durante 2 horas). Reducir la temperatura de la reacción. Las ADN polimerasas (es decir, la polimerasa T4 (que tiene una fuerte actividad de corrección de errores 3'->5') y la ADN polimerasa 1 (que tiene una débil actividad de corrección de errores 3'->5', pero una buena actividad 5'->3'), y opcionalmente el fragmento Klenow (sin actividad 5'->3')), la ADN ligasa (ligasa T4 o ligasa de E. coli) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación. Permitir la extensión y fijación a 23 °C o 30 °C y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 37 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
1.4. b. Opcionalmente, escindir la sonda de oligonucleótido en un enlace escindible (por ejemplo, U escindido usando UDG y endonucleasa AP). Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. De forma alternativa, se puede incluir un enlace escindible en el oligonucleótido original.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa T4 (con actividad nucleasa 5'->3'), ADN polimerasa I (débil actividad de corrección de errores 3'->5', pero buena actividad 5'->3') y fragmento Klenow (ADN polimerasa I sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar la degradación del ADN diana por traducción de mellas.
Nota 4: El procedimiento de extensión y fijación se puede llevar a cabo en dos o más tubos de reacción, un conjunto contiene las sondas con numeración "impar" y el segundo conjunto contiene las sondas con numeración "par", para evitar que las sondas compitan por las mismas hebras de ADN diana. Las reacciones separadas se pueden agrupar posteriormente.
Nota 5: El uso de bases emparejadas de forma errónea en la secuencia de la sonda a intervalos regulares (es decir, 10, 12 o 15 bases) permite distinguir la secuencia de ADN diana auténtica de la secuencia generada copiando la hebra de la sonda. Los oligonucleótidos enumerados en la Nota 6 a continuación contienen bases emparejadas de forma errónea cada aproximadamente 15 bases en las regiones de secuencia diana.
Nota 6: Cuando se diseñan oligonucleótidos para su uso con secuencias de conector más largas, que comprenden secuencias de "código de barras" o "indexación" para su uso con instrumentos comerciales, puede ser necesario ensamblar el oligonucleótido usando PCR, amplificación de desplazamiento de hebra, o una combinación de los mismos. Durante la PCR, el uso de dUTP en lugar de Tt P incorpora uracilo, adecuado para su posterior escisión por UDG. El cebador de hebra inversa se puede fosforilar, permitiendo su digestión usando exonucleasa lambda o una exonucleasa 5'->3' similar. Se puede agregar una secuencia de dA30 al extremo 5' del cebador directo, lo que permite la amplificación por desplazamiento de hebra. En la Tabla 1 (a continuación) se muestran ejemplos de oligonucleótidos adecuados para ensamblaje y amplificación para la secuenciación de regiones de KRAS, BRAF y exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes e incluyen los siguientes: (i) regiones diana directas e inversas KRAS (iSx-001-bkA30, iSx-103-bkA30-KRSF21, iSx-104-pKRSF22, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-105-pKRSF23 e iSx-106-pKRSR24) e (iSx-102-pKRSF20, iSx-104-pKRSF22, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-105-pKRSF23, iSx-107-bkA30-KRSR25 e iSx-001-bkA30); (ii) regiones diana directas e inversas BRAF (iSx-001-bkA30, iSx-113-bkA30-BRF-F21, iSx-114-pBRF-F22, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-115-pBRF-F23 e iSx-116-pBRF-R24) e (iSx-112-pBRF-F20, iSx-114-pBRF-F22, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-115-pBRF-F23, iSx-117-bkA30-BRF-R25 e iSx-001-bkA3o); (iii) regiones diana directas e inversas del exón 5 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-123-bkA30-TP53e5F61, iSx-124-pTP53e5F62, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-125-pTP53e5F63 e iSx-126-pTP53e5R64) e (iSx-122-pTP53e5F60, iSx-124-pTP53e5F62, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-125-pTP53e5F63, iSx-127-bkA30-TP53e5F65 e iSx-001-bkA30); (iv) regiones diana directas e inversas del exón 6 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-133-bkA30-TP53e6F71, iSx-134-pTP53e6F72, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-135-pTP53e6F73 e iSx-136-pTP53e6R74) e (iSx-132-pTP53e6F70, iSx-134-pTP53e6F72, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-135-pTP53e6F73, iSx-137-bkA30-TP53e6F75 e iSx-001-bkA30); (v) regiones diana directas e inversas del exón 7 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-143-bkA30-TP53e7F81, iSx-144-pTP53e7F82, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-145-pTP53e7F83 e iSx-146-pTP53e7R84) e (iSx-142-pTP53e7F80, iSx-144-pTP53e7F82, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-145-pTP53e7F83, iSx-147-bkA30-TP53e7R85 e iSx-001-bkA30); y (vi) regiones diana directas e inversas del exón 8 de TP53 (iSx-001-bkA30, iSx-153-bkA30-TP53e8F91, iSx-154-pTP53e8F92, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-155-pTP53e8F93 e iSx-156-pTP53e8R94) e (iSx-152-pTP53e8F90, iSx-154-pTP53e8F92, iSx-100-705F, iSx-101-502R, iSx-155-pTP53e8F93, iSx-157-bkA30-TP53e8R95 e iSx-001-bkA30).
Nota 7: Después de generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y los exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes, estas regiones se pueden someter a amplificación por círculo rodante usando cebadores específicos de la diana para generar productos de repetición en tándem. Estos productos se pueden generar antes o después de la captura de las dianas deseadas con oligonucleótidos específicos de la diana sobre un soporte sólido (véase la nota 8 a continuación). Los cebadores pueden contener una base nucleotídica escindible interna o un sitio abásico tal como 1',2'-didesoxirribosa (dSpacer), lo que permite la incorporación de dUTP durante la amplificación por círculo rodante para protección contra la contaminación por arrastre. Los ejemplos de dichos cebadores se muestran en la Tabla 1 (a continuación) e incluyen los siguientes: (i) cebadores directos e inversos de KRAS (iSx-108-KRS-rcF26, iSx-109-KRS-rcR27); (ii) cebadores directos e inversos de BRAF (iSx-118-BRF-rcF26, iSx-119-BRF-rcR27); (iii) cebadores directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-128-TP53e5-rcF66, iSx-129-TP53e5-rcR67; iSx-130-TP53e5-rcF68, iSx-131-TP53e5-rcR69); (iv) cebadores directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-138-TP53e6-rcF76, iSx-139-TP53e6-rcR77);(v) cebadores directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-148-TP53e7-rcF86, iSx-149-TP53e7-rcR87); y (vi) cebadores directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-158-TP53e8-rcF96, iSx-159-TP53e8-rcR97).
Nota 8: Después de generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y los exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes, y/o generar productos de repetición en tándem, estos productos se pueden capturar mediante hibridación a oligonucleótidos más largos, que contienen un grupo de captura adecuado para la captura posterior sobre un soporte sólido. En la Tabla 1 (a continuación) se muestran ejemplos de dichos oligonucleótidos de captura, que contienen grupos biotina adecuados para la captura a través de superficies sólidas recubiertas con estreptavidina e incluyen los siguientes: (i) oligonucleótidos de captura directa e inversa de KRAS (iSx-013-KRS-bcF1, iSx-014-KRS-bcR2); (ii) oligonucleótidos de captura directos e inversos de BRAF (iSx-020-BRF-bcF1, iSx-021-BRF-bcR2); (iii) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-030-TP53e5-bcF1, iSx-031-TP53e5-bcR2; iSx-032-TP53e5-bcF3, iSx-033-TP53e5-bcR4); (iv) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-050-TP53e6-bcF5, iSx-051-TP53e6-bcR6);(v) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-060-TP53e7-bcF7, iSx-061-TP53e7-bcR8); y (vi) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-070-TP53e8-bcF9, iSx-071-TP53e8-bcR10).
Nota 9: Con los productos antes mencionados generados usando los diseños de cebadores y conectores anteriores, después de la amplificación por agrupamiento o con microesferas, o la captura dentro de un pocillo, dirección o superficie de una cubeta de lectura en un instrumento comercial, se pueden usar los siguientes cebadores para iniciar reacciones de secuenciación: (i) iLx-003-PEsqP1, cebador de secuenciación de extremo emparejado 1; (ii) iLx-004-BrCdR1, cebador de indexación, lectura de código de barras 1; (iii) iLx-001-P5-BrCdR2, lectura de código de barras 2; y (iv) iLx-005-PEsqP2, cebador de secuenciación de extremo emparejado 2 (las secuencias de cebador se proporcionan en la Tabla 1 a continuación).
Ejemplo profético 2: Detección de marcadores de metilación de alta sensibilidad para la hipermetilación del promotores (cuando está presente en un 1 % a un 0,01 %) en ADN plasmático
La metilación de promotores desempeña un papel importante en la regulación de la expresión génica. Los promotores de genes a menudo tienen regiones de alto contenido de CpG conocidas como "islas CpG". Cuando los genes, tales como los genes supresores de tumores, con las islas CpG del promotor se desactivan, esto va normalmente acompañado de la mutilación de la mayoría de las secuencias de CpG dentro del promotor y de las regiones del 1er exón. Ha habido dos enfoques tradicionales para detectar cambios de mutilación.
El primero aprovecha las enzimas de restricción sensibles a metilo, en las que el ADN genómico se escinde cuando no está metilado, y esto va seguido por una amplificación por PCR usando cebadores que flanquean el sitio o los sitios. Si el ADN estaba metilado, se debería amplificar, si no está metilado, no se debería amplificar. Esta técnica tiene la desventaja de que las digestiones no siempre se completan y, además, no es una técnica exacta para encontrar niveles bajos de ADN metilado cuando la mayoría de la misma secuencia no está metilada, como sería el caso en la detección en plasma.
El segundo enfoque se conoce como "PCR específica de metilo" y se basa en el tratamiento con bisulfito de ADN, que convierte las C no metiladas en U. Si la base está metilada, entonces no se convierte. La PCR específica de metilo se basa en el uso de cebadores y sondas TaqMan que son específicas para la secuencia convertida resultante si estuviera metilada, pero no de la secuencia no metilada. La PCR específica de metilo tiene la ventaja de poder detectar niveles muy bajos de ADN metilado. Una mejora adicional de esta técnica emplea un oligonucleótido de bloqueo que hibrida con la secuencia del ADN no metilado convertido con bisulfito, enriqueciendo por tanto la amplificación del ADN metilado convertido con bisulfito. La desventaja es que el tratamiento con bisulfito destruye del 50 % al 90 % de la integridad del ADN original al mellarlo. Si se comienza con ADN del plasma (con una longitud promedio de aproximadamente 160 bases), esto puede ser un problema importante. Además, la conversión de C en U reduce la complejidad de la secuencia de 4 bases a 3 bases. Como la secuencia convertida es ahora más rica en A:T, también se requieren cebadores de PCR más largos. Por tanto, pueden producirse amplificaciones no específicas, ya que los cebadores tienen más probabilidades de realizar un cebado erróneo en secuencias estrechamente relacionadas pero incorrectas. Esto requiere normalmente un enfoque de PCR con cebadores internos, corre el riesgo de contaminación por arrastre y en general no es ideal para amplificaciones multiplexadas. Visión general del enfoque: La idea es copiar fielmente todos los fragmentos de ADN diana que contengan metilación en sitios de restricción contiguos para las regiones de interés, agregar una secuencia de identificador único y un identificador de paciente opcional, y circularizarlos para la secuenciación posterior. La hebra de ADN oligonucleotídica se circulariza y secuencia. Este enfoque proporciona la ventaja de obtener tanto la información del número de copias cuando es necesario, como los datos de metilación con el mínimo de secuenciación requerido. Detección de metilación en sitios contiguos
Variación 2.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 27). En esta variación, el ADN se escinde inicialmente con HinP1I para reducir significativamente la cantidad de diana no metilada. Para capturar las regiones metiladas deseadas, la diana hibrida con oligonucleótidos que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de la diana. El oligonucleótido contiene secuencias HinP1I no metiladas cerca del extremo 3' de la sonda en dirección 5' y de un extremo 5' bloqueado o no apto para fijación de la sonda en dirección 3'. El extremo 3' contiene emparejamientos erróneos con la diana o está bloqueado para evitar la extensión con polimerasa. HinP1I mellará las hebras no metiladas del híbrido diana de la sonda si el ADN diana estaba metilado, liberando un extremo 3'-OH apto para extensión y un fosfato 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 27). Si la diana no estaba metilada, ambas hebras se escinden, destruyendo el molde de la diana (lado derecho de la Figura 27). La adición de ligasa y polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra y actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' liberado de la sonda en la diana metilada, seguido de la fijación al extremo 5' liberado de la sonda para formar un producto circular que contiene tanto una secuencia de identificador único como una secuencia de identificador de paciente opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la metilación del promotor:
2.1a. Escindir el ADNlc aislado o el ADN enriquecido con metilo con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). En este ejemplo se usa HinP1I. Inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos) y desnaturalizar el Ad N (94 °C, 1 minuto).
2.1b. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40-50 °C durante 2 horas). El oligonucleótido contiene secuencias HinPlI no metiladas cerca de los extremos 3' y 5' de las sondas, que están diseñadas para contener emparejamientos erróneos, grupos bloqueantes o ausencia de fosforilación, de modo que no son sustratos para la polimerasa ni para la ligasa. Enfriar a 37 °C y añadir HinP1I, que mellará las hebras no metiladas del híbrido diana de la sonda si el ADN diana estaba metilada, liberando un extremo 3'-OH apto para extensión y un fosfato 5' apto para fijación. Inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos). KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa) y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o después de la etapa de mellado con endonucleasa de restricción. Permitir la extensión y fijación a 50 °C y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
2.1.c. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El oligonucleótido puede carecer de un fosfato 5' o contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5', de modo que el extremo 5' del oligonucleótido no sea adecuado para la fijación. El oligonucleótido puede contener emparejamientos erróneos en 3', horquilla 3' o un grupo bloqueante opcional en el lado 3', de modo que el extremo 3' del oligonucleótido no es adecuado para la extensión en la diana. En ambos casos, el bloqueo solo se libera mediante el mellado con enzima de restricción de la sonda cuando hibrida con la diana metilada.
Nota 2: El ejemplo anterior usa KlenTaq, una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, así como actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3'. Si el oligonucleótido tiene un grupo bloqueante en el lado 3', entonces se puede usar una polimerasa con actividad nucleasa 3'->5', mientras que si el grupo bloqueante está en el lado 5', se puede usar una polimerasa con actividad nucleasa 5'->3'.
Nota 3: En el ejemplo, la endonucleasa de restricción (HinPlI) se inactiva por calor incubando a 65 °C durante 15 minutos. Un enfoque alternativo (o cuando se usa una enzima insensible al calor como BstilI) es realizar la extensión con análogos de nucleótidos (es decir, 5-metil-dCTP o alfa-tiofosfato dCTP) que hacen que un sitio de restricción sea resistente a la nueva escisión con la endonucleasa relacionada. Si el sitio de restricción en el lado 5' del oligonucleótido no se convierte en una forma resistente mediante el uso de análogos de nucleótidos (es decir, HinPlI), entonces este caso se puede resolver usando un oligonucleótido con un grupo bloqueante en el lado 5', así como una polimerasa que contiene actividad nucleasa 5'->3'. Inicialmente, el grupo bloqueante se elimina por la actividad de mellado de la endonucleasa de restricción. Posteriormente, durante la etapa de extensión usando análogos de nucleótidos, la polimerasa que contiene actividad nucleasa 5'->3' traduce el mellado a través del sitio de reconocimiento, reemplazándolo con nucleótidos que hacen que el sitio sea resistente a una escisión adicional.
Nota 4: En el ejemplo anterior, además de minimizar la traducción de mellas más allá de la secuencia de reconocimiento, se puede sintetizar la porción del oligonucleótido directamente contigua al sitio de restricción de la porción de sonda 5' para que contenga enlaces tiofosfato. Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota 5: Las porciones específicas de la diana de la sonda de oligonucleótido están diseñadas de modo que permanecerán hibridadas con la diana incluso después de la liberación de los extremos 3' y 5' no productivos. Si la diana contiene sitios de restricción adicionales que se solapan con las porciones de la sonda, entonces la sonda se puede sintetizar con 5-metil-dC en esas posiciones. Si la diana está metilada en esas posiciones, entonces el sitio se metilará tanto en la diana como en la sonda de oligonucleótido y, por lo tanto, será resistente al mellado. Sin embargo, si la diana no está metilada en esas posiciones, entonces el sitio se mellará en la hebra diana, interfiriendo por tanto con la hibridación de la sonda con la diana (acortada).
Nota 6: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem complementarias de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 7: Si las sondas de oligonucleótido también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección.
Base de datos del estado de metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos.
La base de datos TCGA actual contiene información sobre el estado de metilación de aproximadamente 450.000 sitios CpG en el genoma humano, tanto para sitios de tejidos normales como para sitios de tejidos de muchos tumores diferentes. Sin embargo, no cubre todo el estado de metilación de sitios HinP1I contiguos ni distinguiría que ambos sitios están metilados en la misma pieza de ADN genómico.
En consecuencia, para que el procedimiento de ensayo anterior sea más útil, sería provechoso crear una base de datos del estado de metilación de sitios de restricción sensibles a metilo contiguos. Dicho enfoque se ilustra en la Figura 28.
Visión general del enfoque: La idea es generar una colección de pequeños fragmentos que solo se podrían haber formado si ambos extremos del fragmento contuvieran sitios de restricción que estaban metilados en el ADN genómico original. Los fragmentos tienen conectores agregados con secuencias de identificador único opcional y de identificador de paciente opcional que ahora son susceptibles de fijación para crear multímeros de fragmentos que serán sustratos para etapas adicionales y secuenciación posterior.
Variación 2.1.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 28). Este enfoque muestra cómo descubrir la metilación en sitios HinP1I contiguos (GC*GC) en todo el genoma. El material de partida puede ser ADN genómico intacto o ADNlc con una longitud promedio de aproximadamente 160 pb. Escindir el ADN genómico con HinP1I para fragmentar el ADN en sitios HinP1I no metilados. Los conectores cortos que contienen un extremo 5' bloqueado en el extremo no fijador se fijan en ambos extremos de los extremos escindidos con HinP1I rellenados y los extremos reparados de los fragmentos diana. (Estos conectores no recrean un sitio HinP1I en el punto de unión de fijación). Unos pocos ciclos de amplificación por PCR usando dNTP no metilados y cebadores bloqueados en 5' generan productos que ahora no están metilados en los sitios HinP1I restantes. Estos productos se escinden a continuación con HinP1I. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios HinP1I contiguos (GCGC) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HinP1I. Los conectores que contienen una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional se fijan a estos extremos escindidos con HinP1I rellenos recientemente generados. Estos nuevos conectores contienen, en su lado no fijador, el extremo 3' bloqueado o una cadena principal que contiene tiofosfato (que se muestra como **** en la Figura 28). Tras la adición de una exonucleasa 3' bicatenaria (es decir, exonucleasa III), los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios, ya que el grupo bloqueante 3' o los tiofosfatos inhiben la digestión con la exonucleasa 3'. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización, por ejemplo usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto. Los productos de fijación comprenden secuencias HinP1I contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcionales. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Protocolo detallado para generar una base de datos del estado de metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos:
2.1.1a. Escindir el ADN genómico aislado o el ADN enriquecido con metilo con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). En este ejemplo se usa HinP1I. Opcionalmente, inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos). Fijar los conectores que están bloqueados en el extremo 5' del extremo no fijado. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. (Véase la Nota 1 a continuación).
2.1.1b. Añadir cebadores bloqueados en 5', polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios HinP1I restantes.
2.1.1.c. Añadir HinP1I para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios HinP1I contiguos (GCGC) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HinP1I. La polimerasa residual de la polimerasa Taq rellenará la protuberancia de 2 bases (opcionalmente, elevar la temperatura a 60 °C). Eliminar los dNTP (a través de una columna de centrifugación) y volver a añadir solo dATP para generar una protuberancia A en 3 de una sola base.
2.1.1. d. Usando ligasa T4, agregar conectores (que contengan una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional) con una protuberancia A en 3' de una sola base en el extremo de fijación a la una protuberancia A de una sola base de las secuencias diana escindidas y rellenadas. El lado 5' no fijador del conector contiene una protuberancia 5' y, opcionalmente, no está fosforilado. El lado 3' no fijador del conector contiene un grupo bloqueante 3' y/o tiofosfatos para inhibir la digestión con la exonucleasa 3'.
2.1.1. e. Añadir una exonucleasa 3' (es decir, exonucleasa III) y digerir a 37 °C. Los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios. La exonucleasa también hará que los conectores se vuelvan monocatenarios. Opcionalmente, eliminar los productos de digestión de los fragmentos deseados con una columna de centrifugación.
2.1.1 .f. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5' usando cinasa T4, (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización. Los productos de fijación comprenden multímeros de fragmentos diana con secuencias HinP1I contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcional. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: En cuanto a las fijaciones de conectores: Como alternativa al rellenado, reparación de los extremos y prolongación A antes de la fijación de conectores con conectores que contienen una protuberancia T de una sola base, se puede aprovechar la protuberancia CpG en 5' generada por HinP1I. Se puede generar una protuberancia C en 3' de una sola base usando Klenow (exo-) y dCTP. Los conectores tienen una protuberancia C en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. De forma alternativa, los conectores con una protuberancia CG se pueden usar directamente, sin rellenado de los sitios, pero los conectores están diseñados de modo que si se autofijan, crean un sitio AcII (AAACGTT). Por tanto, el ADN genómico se escinde con el sitio Hinp1I (GACGC) y el sitio AclI (AAACGTT) en presencia de ambos conectores y ligasa T4 a 37 °C. Hinp1I escinde la fijación de fragmentos entre sí y AclI escinde la fijación de conectores entre sí; sin embargo, ninguna enzima escinde la fijación de conectores a los extremos de los fragmentos, por lo que esta mezcla de fijación de 3 enzimas sirve como una "selección bioquímica" para enriquecer los productos deseados.
Nota: 2: El extremo 3' del conector bloqueado se puede sintetizar para contener un Uracilo o un sitio apurínico (AP) en una posición interna al bloqueo, y después del tratamiento con UDG y endonucleasa AP, liberar un extremo 3' apto para fijación.
Nota 3: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 4: La fijación favorecerá la formación de multímeros usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto.
Detección de metilación en sitios contiguos mediante tratamiento con bisulfito
El enfoque anterior es ideal para identificar y enumerar fragmentos que contienen sitios HinP1I metilados contiguos como un sustituto de la metilación dentro de ese fragmento de ADN. Sin embargo, para algunas aplicaciones, es importante identificar el estado de metilación de sitios CpG individuales dentro de una región determinada. Por tanto, puede ser necesario tratar el ADN entrante con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U.
Visión general del enfoque usando bisulfito: La idea es copiar fielmente todos los fragmentos de ADN diana que estén metilados en los sitios de restricción AciI contiguos de la secuencia (G*CGG) para las regiones de interés, tratar con bisulfito, agregar una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y un identificador de paciente opcional y circularizarlos para la secuenciación posterior. La hebra de ADN oligonucleotídica se circulariza y secuencia. Este enfoque proporciona la ventaja de obtener tanto la información del número de copias cuando es necesario, como los datos de metilación con el mínimo de secuenciación requerido. La idea aprovecha una propiedad única de la secuencia de reconocimiento para AciI. La enzima escinde la secuencia de reconocimiento de 3.5 bases GACGG en una orientación y CACGC en la segunda orientación. Si un sitio AciI metilado se trata con bisulfito en la primera orientación (G*CGG), el sitio permanecerá sin cambios (G*CGG), mientras que en la segunda orientación (C*CGC) cambiará (U*CGU, donde *C indica 5-meC). Después de algunos ciclos de amplificación por PCR, la 5-metil-C se convierte en C, mientras que la U se convierte en T. Por tanto, un sitio AciI metilado en la primera orientación permanece como GCGG, un sitio AciI no metilado en la primera orientación se convierte a GTGG, un sitio AciI metilado en la segunda orientación se convierte a TCGT y un sitio AciI no metilado en la segunda orientación se convierte a TTGT. Cuando se escinde con AciI, solo los sitios AciI contiguos metilados en la diana original crearán fragmentos que son aptos para fijación en ambos extremos 3' y 5'. Un rasgo característico único de este enfoque es que la conversión con bisulfito crea dos hebras no complementarias. Por tanto, la hebra superior tendrá secuencias G*CGG contiguas e, incluso si hay una secuencia C*CGC que interviene, no importa porque se convierte en U*CGU, que después de la conversión por PCR a TCGT no se reconoce como un sitio AciI. Además, incluso si hay un sitio G*CGG o GCGG (es decir, no metilado) que interviene, AciI no lo mellará, ya que estará en una región que es monocatenaria. Aún mejor, las secuencias de la hebra superior de la forma C*CGC serán G*CGG en la hebra inferior. La hebra inferior también se puede usar para consultar el estado de metilación y, dado que las dos secuencias ahora son muy diferentes, las sondas de oligonucleótido para la hebra superior e inferior no hibridarán entre sí, solo con las dianas convertidas. Por tanto, este enfoque permite obtener un estado detallado de metilación en el promotor usando información de las hebras superior e inferior.
El principio de tratar el ADN con bisulfito para convertir el ADN no metilado en una secuencia que no es escindible por una enzima de restricción pero que, si está metilado, sí es escindible por esa misma enzima de restricción, se puede extender a algunos sitios de restricción adicionales. Por ejemplo, un sitio BstilI (CGACG) conserva su misma secuencia después de la conversión con bisulfito siempre que ambos sitios CG estén metilados (es decir, *CG*CG). Del mismo modo, un sitio Hpy99I (CGWCGA) también conserva su misma secuencia después de la conversión con bisulfito siempre que ambos sitios CG estén metilados (*CGW*CG). En un tipo diferente de ejemplo, HpyCH2IV (AACGT) escindirá ambas secuencias de la forma A*CGT y la forma A*CGC después de la conversión con bisulfito, ya que ambas se convierten en A*CGT. Por tanto, las variaciones consideradas a continuación para AciI son igualmente válidas para, pero sin limitarse a, las endonucleasas de restricción BstilI, Hpy99I, HpyCH2IV y sus isoesquizómeros.
Variación 2.2 (véanse, por ejemplo, las Figuras 29-30). En esta variación, los conectores cortos que contienen 5-metil-C se fijan a los extremos del ADN. El ADN se trata después con bisulfito, lo que hace que las hebras no sean complementarias para que se vuelvan monocatenarias. Algunos ciclos de amplificación por PCR generan productos que ahora no están metilados en los sitios AciI restantes. Estos productos se escinden a continuación con AciI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios AciI contiguos (GCGG) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que ahora son aptos para fijación en ambos extremos. Para capturar las regiones deseadas, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementarios a la secuencia del lado 3' de la diana. La adición de ligasa y polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra y actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' de la diana no metilada, seguido de la fijación al extremo 5' de la diana para formar un producto circular que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la metilación del promotor:
2.2. a. Fijación en conectores que contienen 5-metil-C para retener la secuencia después de la conversión con bisulfito. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado. 2.2. b. Añadir cebadores, polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios AciI restantes.
2.2. c. Añadir AciI para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios AciI contiguos (GCGG) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con AciI. La polimerasa residual de la polimerasa Taq rellenará la protuberancia de 2 bases (opcionalmente, elevar la temperatura a 60 °C).
2.2. d. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de las dianas, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50-60 °C durante 2 horas). Añadir KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y dNTP para permitir la extensión y fijación a 50 °C y, opcionalmente, elevar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
2.2. e. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El oligonucleótido puede carecer de un fosfato 5' o contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5', de modo que el extremo 5' del oligonucleótido no sea adecuado para la fijación.
Nota 2: El ejemplo anterior usa KlenTaq, una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, así como actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3'. Si el oligonucleótido tiene un grupo bloqueante en el lado 5', entonces se puede usar polimerasa con actividad nucleasa 5'->3'.
Nota 3: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 4: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. En la variación 2.2 se usan tanto una polimerasa como una ligasa para formar un círculo cerrado covalentemente que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Esto también se puede lograr usando solo una ligasa.
Variación 2.3 (véanse, por ejemplo, las Figuras 31-32). En esta variación, los conectores cortos que contienen 5-metil-C se fijan a los extremos del ADN. El ADN se trata después con bisulfito, lo que hace que las hebras no sean complementarias para que se vuelvan monocatenarias. Algunos ciclos de amplificación por PCR generan productos que ahora no están metilados en los sitios AciI restantes. Estos productos se escinden a continuación con AciI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios AciI contiguos (GCGG) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que ahora son aptos para fijación en ambos extremos. Para capturar las regiones no metiladas deseadas, la diana hibrida con un par de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios que comprende una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la hebra de la primera sonda de oligonucleótido, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la hebra de la primera sonda de oligonucleótido. La adición de ligasa permite la fijación del extremo 3' de la diana al extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' de la diana al extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto circular que contiene un secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor:
2.3. a. Fijación en conectores que contienen 5-metil-C para retener la secuencia después de la conversión con bisulfito. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Incubar el ADNIc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado. 2.3. b. Añadir cebadores, polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios AciI restantes.
2.3. c. Añadir AciI para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios AciI contiguos (GCGG) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con AciI. La polimerasa residual de la polimerasa Taq rellenará la protuberancia de 2 bases (opcionalmente, elevar la temperatura a 60 °C).
2.3. d. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de pares de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios (una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera sonda de oligonucleótido, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera sonda de oligonucleótido), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C-60 °C durante 2 horas). Se añade una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) para permitir la fijación a 60 °C para generar productos circulares.
2.3. e. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 2: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Base de datos del estado de metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos (sitios AciI). La base de datos TCGA actual contiene información sobre el estado de metilación de aproximadamente 450.000 sitios CpG en el genoma humano, tanto para sitios de tejidos normales como para sitios de tejidos de muchos tumores diferentes. Sin embargo, no cubre todo el estado de metilación de sitios AciI contiguos ni distinguiría que ambos sitios están metilados en la misma pieza de ADN genómico.
En consecuencia, para que el procedimiento de ensayo anterior sea más útil, sería provechoso crear una base de datos del estado de metilación de sitios de restricción AciI contiguos de la misma orientación (GCGG). Este enfoque también incluirá sitios de restricción AciI contiguos de la otra orientación (CCGC), ya que serán GCGG en la hebra opuesta después de la conversión con bisulfito. Dicho enfoque se ilustra en la Figura 33.
Visión general del enfoque: La idea es generar una colección de pequeños fragmentos que solo se podrían haber formado si ambos extremos del fragmento contuvieran sitios de restricción que estaban metilados en el ADN genómico original. Esta idea aprovecha una propiedad única de la secuencia de reconocimiento para AciI. La enzima escinde la secuencia de reconocimiento de 3.5 bases GACGG en una orientación y CACGC en la otra orientación. Comenzar con un sitio AciI metilado y tratar con bisulfito. En la primera orientación (G*CGG), el sitio permanecerá sin cambios, mientras que en la segunda orientación cambiará (U*CGU, donde *C indica 5-meC). Después de algunos ciclos de amplificación por PCR, el primer sitio se convierte en GCGG, que es reconocido por AciI, mientras que el segundo sitio se convierte en TCGT, que no se escinde. Por tanto, AciI se puede usar para identificar secuencias metiladas de forma única después del tratamiento con bisulfito. Los fragmentos tienen conectores agregados con secuencias de identificador único opcional y de identificador de paciente opcional que ahora son susceptibles de fijación para crear multímeros de fragmentos que serán sustratos para etapas adicionales y secuenciación posterior.
Variación 2.3.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 33). Este enfoque muestra cómo descubrir la metilación en sitios AciI contiguos (GC*GG) en todo el genoma. El material de partida puede ser ADN genómico intacto o ADNlc con una longitud promedio de aproximadamente 160 pb. Los conectores cortos que contienen un extremo 5' bloqueado en el extremo no fijador se fijan a los extremos del ADN. Tratar el ADN con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. Unos pocos ciclos de amplificación por PCR usando dNTP no metilados y cebadores bloqueados en 5' generan productos que ahora no están metilados en los sitios AciI restantes. Estos productos se escinden a continuación con AciI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios AciI contiguos (GCGG) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con AciI. Los conectores que contienen una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional se fijan a estos extremos escindidos con AciI rellenos recientemente generados. Estos nuevos conectores contienen, en su lado no fijador, el extremo 3' bloqueado o una cadena principal que contiene tiofosfato (que se muestra como **** en la Figura 33). Tras la adición de una exonucleasa 3' bicatenaria (es decir, exonucleasa III), los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios, ya que el grupo bloqueante 3' o los tiofosfatos inhiben la digestión con la exonucleasa 3'. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización, por ejemplo usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto. Los productos de fijación comprenden secuencias AciI contiguas en la misma orientación (es decir, GCGG), originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente opcionales. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Protocolo detallado para generar una base de datos del estado de metilación en sitios de restricción AciI contiguos:
2.3.1. a. Fijar los conectores que están bloqueados en el extremo 5' del extremo no fijado. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado.
2.3.1. b. Añadir cebadores bloqueados en 5', polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios AciI restantes.
2.3.1. c. Añadir AciI para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios AciI contiguos (GCGG) que estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con AciI. La polimerasa residual de la polimerasa Taq rellenará la protuberancia de 2 bases (opcionalmente, elevar la temperatura a 60 °C). Eliminar los dNTP (a través de una columna de centrifugación) y volver a añadir solo dATP para generar una protuberancia A en 3 de una sola base.
2.3.1. d. Usando ligasa T4, agregar conectores (que contengan una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional) con una protuberancia A en 3' de una sola base en el extremo de fijación a la una protuberancia A de una sola base de las secuencias diana escindidas y rellenadas. El lado 5' no fijador del conector contiene una protuberancia 5' y, opcionalmente, no está fosforilado. El lado 3' no fijador del conector contiene un grupo bloqueante 3' y/o tiofosfatos para inhibir la digestión con la exonucleasa 3'.
2.3.1. e. Añadir una exonucleasa 3' (es decir, exonucleasa III) y digerir a 37 °C. Los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios. La exonucleasa también hará que los conectores se vuelvan monocatenarios. Opcionalmente, eliminar los productos de digestión de los fragmentos deseados con una columna de centrifugación.
2.3.1. f. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5' usando cinasa T4, (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización. Los productos de fijación comprenden multímeros de fragmentos diana con secuencias AciI contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcional. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota: 1: El extremo 3' del conector bloqueado se puede sintetizar para contener un Uracilo o un sitio apurínico (AP) en una posición interna al bloqueo, y después del tratamiento con UDG y endonucleasa AP, liberar un extremo 3' apto para fijación.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: La fijación favorecerá la formación de multímeros usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto.
Ejemplo profético 3: Detección de marcadores de no metilación de alta sensibilidad para la hipometilación del promotores (cuando está presente en un 1 % a un 0,1 %) en ADN plasmático total
La mayoría de los cambios de metilación en los tumores se deben a la hipometilación. Cuando dicha hipometilación se produce en una región promotora que anteriormente estaba metilada, puede causar una mayor expresión de un gen, tal como un oncogén. Además, las regiones de elementos repetitivos y los elementos móviles se silencian en general mediante la metilación general, pero dicho silenciamiento se pierde cuando se produce hipometilación en el tumor.
Si bien se pueden usar enzimas de restricción sensibles a metilo para ayudar a amplificar selectivamente e identificar niveles bajos de secuencias metiladas, el enfoque no funciona para identificar niveles bajos de secuencias no metiladas. Se puede usar el tratamiento con bisulfito y el uso de cebadores de PCR dirigidos a ADN no metilado modificado con bisulfito, aunque dichos cebadores son muy ricos en AT y puede haber dificultades para amplificar todos los fragmentos deseados, especialmente cuando se intenta la PCR multiplexada.
Visión general del enfoque: La idea es copiar fielmente todos los fragmentos de ADN diana que no estén metilados en los sitios de restricción contiguos para las regiones de interés, agregar una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y un identificador de paciente opcional y circularizarlos para la secuenciación posterior. La hebra de ADN oligonucleotídica se circulariza y secuencia. Este enfoque proporciona la ventaja de obtener tanto la información del número de copias cuando es necesario, como los datos de no metilación con el mínimo de secuenciación requerido.
Variación 3.1 (véanse, por ejemplo, las Figuras 34 y 35). En esta variación, el ADN se escinde con HinP1I (u otra endonucleasa de restricción sensible a la metilación) para generar extremos 3' y 5' aptos para fijación. Para capturar las regiones no metiladas deseadas, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementarios a la secuencia del lado 3' de la diana. La adición de ligasa y polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra y actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' de la diana no metilada, seguido de la fijación al extremo 5' de la diana para formar un producto circular que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor:
3.1a. Escindir el ADNlc aislado con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). Este ejemplo ilustra el uso de HinP1I. Inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos) y desnaturalizar el ADN (94 °C, 1 minuto).
3.1b. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de las dianas, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50-60 °C durante 2 horas). Añadir KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y dNTP para permitir la extensión y fijación a 50 °C y, opcionalmente, elevar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
3.1.c. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El oligonucleótido puede carecer de un fosfato 5' o contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5', de modo que el extremo 5' del oligonucleótido no sea adecuado para la fijación.
Nota 2: El ejemplo anterior usa KlenTaq, una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, así como actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3'. Si el oligonucleótido tiene un grupo bloqueante en el lado 5', entonces se puede usar polimerasa con actividad nucleasa 5'->3'.
Nota 3: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador. Cuando se usa la secuenciación SMRT directa, la pérdida del estado de metilación del ADN del molde original se puede determinar directamente.
Nota 4: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 5: Se puede usar el mismo enfoque para identificar regiones que están metiladas en regiones promotoras (véanse, por ejemplo, las Figuras 36 y 37). Separar el ADNlc aislado con un cóctel de enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV), así como con enzimas insensibles a metilo (HaeIII y MspI). La figura ilustra esto con sitios AciI metilados, internos a y flanqueados por dos sitios HaeIII. Este enfoque funcionará incluso si solo hay un sitio de restricción insensible a metilo (véanse, por ejemplo, las Figuras 39, 40, 42, 43). Si la endonucleasa de restricción insensible a metilo libera un extremo 3' apto, entonces ese extremo se extendería en el oligonucleótido con la polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3'), y la polimerasa se extendería y escindiría la secuencia 5' extra en la diana, generando un fosfato 5' apto para fijación en la diana que es adecuado para fijación para crear el producto circular (Figura 39). Si la endonucleasa de restricción insensible a metilo libera un fosfato 5' apto, entonces el uso de una polimerasa con actividad nucleasa 3'->5' digeriría la secuencia 3' extra en la diana (si es necesario) y, a continuación, una vez colocado a nivel con la secuencia complementaria en la sonda de oligonucleótido, la polimerasa extendería la hebra diana hasta el fosfato 5' apto para fijación en la diana, y la mella se sellaría por ligasa para crear el producto circular (Figura 40). Después de la digestión con exonucleasa, la supervivencia de la hebra tras la escisión con endonucleasa de restricción sensible a metilo es un marcador de la metilación de esa región. Además, cuando se utiliza la secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, se puede determinar el estado de metilación del ADN del molde original.
Nota 6: Se puede usar el mismo enfoque para identificar regiones que están metiladas en sitios Bsh1236I de regiones promotoras ((véanse, por ejemplo, las Figuras 38, 41, 44, 45, 46). Cortar el ADNlc aislado con Bsh1236I (CGCG), así como con enzimas insensibles a metilo (HaeIII). La Figura 38 ilustra esto con sitios Bsh1236I metilados, internos a y flanqueados por dos sitios HaeIII. Este enfoque funcionará incluso si solo hay un sitio de restricción insensible a metilo (véanse, por ejemplo, las Figuras 41, 44, 45). Si la endonucleasa de restricción insensible a metilo libera un extremo 3' apto, entonces ese extremo se extendería en el oligonucleótido con la polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3'), y la polimerasa se extendería y escindiría la secuencia 5' extra en la diana, generando un fosfato 5' apto para fijación en la diana que es adecuado para fijación para crear el producto circular (Figura 38). Si la endonucleasa de restricción insensible a metilo libera un fosfato 5' apto, entonces el uso de una polimerasa con actividad nucleasa 3'->5' digeriría la secuencia 3' extra en la diana (si es necesario) y, a continuación, una vez colocado a nivel con la secuencia complementaria en la sonda de oligonucleótido, la polimerasa extendería la hebra diana hasta el fosfato 5' apto para fijación en la diana, y la mella se sellaría por ligasa para crear el producto circular (Figuras 41 y 45). Después de la digestión con exonucleasa, la supervivencia de la hebra tras la escisión con endonucleasa de restricción sensible a metilo es un marcador de la metilación de esa región. La replicación por círculo rodante usando polimerasa Bst en presencia de BstilI (CGCG) garantiza que los sitios estaban metilados en la muestra original.
En la variación 3.1 se usan tanto una polimerasa como una ligasa para formar un círculo cerrado covalentemente que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Esto también se puede lograr usando solo una ligasa.
Variación 3.2 (véanse, por ejemplo, las Figuras 47 y 48). En esta variación, el ADN se escinde con HinP1I (u otra endonucleasa de restricción sensible a la metilación) para generar extremos 3' y 5' aptos para fijación. Para capturar las regiones no metiladas deseadas, la diana híbrida con un par de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios que comprende una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera sonda, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera sonda. La adición de ligasa permite la fijación del extremo 3' de la diana al extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' de la diana al extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto circular que contiene un secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor:
3.2. a. Escindir el ADNlc aislado con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). En este ejemplo se usa HinP1I. Inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos) y desnaturalizar el ADN (94 °C, 1 minuto).
3.2. b. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de pares de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios (una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera hebra, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera hebra), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C-60 °C durante 2 horas). Se añade una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) para permitir la fijación a 60 °C para generar productos circulares.
3.2. c. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador. Cuando se usa la secuenciación SMRT directa, la pérdida del estado de metilación del ADN del molde original se puede determinar directamente.
Nota 2: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 3: Se puede usar el mismo enfoque para identificar regiones que están metiladas en regiones promotoras (véanse, por ejemplo, las Figuras 49 y 51). Separar el ADNlc aislado con un cóctel de enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV), así como con enzimas insensibles a metilo (HaeIII y MspI). Estas figuras ilustran sitios AciI metilados, internos a y flanqueados por dos sitios HaeIII. La supervivencia de la hebra tras la escisión con endonucleasa de restricción sensible a metilo es un marcador de la metilación de esa región. Además, cuando se utiliza la secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, se puede determinar el estado de metilación del ADN del molde original.
Base de datos del estado de no metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos.
La base de datos TCGA actual contiene información sobre el estado de metilación de aproximadamente 450.000 sitios CpG en el genoma humano, tanto para sitios de tejidos normales como para sitios de tejidos de muchos tumores diferentes. Sin embargo, no cubre todo el estado de no metilación de sitios HinP1I contiguos ni distinguiría que ambos sitios no están metilados en la misma pieza de ADN genómico.
En consecuencia, para que el procedimiento de ensayo anterior sea más útil, sería provechoso crear una base de datos del estado de no metilación de sitios de restricción sensibles a metilo contiguos. Dicho enfoque se ilustra en la Figura 51.
Visión general del enfoque: La idea es generar una colección de pequeños fragmentos que solo se podrían haber formado si ambos extremos del fragmento contuvieran sitios de restricción que no estaban metilados en el ADN genómico original. Los fragmentos tienen conectores agregados con secuencias de identificador único opcional y de identificador de paciente opcional que ahora son susceptibles de fijación para crear multímeros de fragmentos que serán sustratos para etapas adicionales y secuenciación posterior.
Variación 3.2.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 51). Este enfoque muestra cómo descubrir la no metilación en sitios HinP1I contiguos (GCGC) en todo el genoma. El material de partida puede ser ADN genómico intacto o ADNlc con una longitud promedio de aproximadamente 160 pb. Los conectores cortos que contienen un extremo 5' bloqueado en el extremo no fijador se fijan al ADN diana. Escindir el ADN genómico con HinP1I para fragmentar el ADN en sitios HinP1I no metilados. Los conectores que contienen una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional se fijan a estos extremos escindidos con HinP1I rellenos recientemente generados. Estos nuevos conectores contienen, en su lado no fijador, el extremo 3' bloqueado o una cadena principal que contiene tiofosfato (que se muestra como **** en la Figura 51). Tras la adición de una exonucleasa 3' bicatenaria (es decir, exonucleasa III), los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios, ya que el grupo bloqueante 3' o los tiofosfatos inhiben la digestión con la exonucleasa 3'. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización, por ejemplo usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto. Los productos de fijación comprenden secuencias HinP1I contiguas originalmente no metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcionales. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Protocolo detallado para generar una base de datos del estado de metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos:
3.2.1a. Fijar los conectores que están bloqueados en el extremo 5' del extremo no fijado. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Escindir el ADN genómico aislado o el ADN enriquecido con metilo con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). En este ejemplo se utilizó HinP1I. Opcionalmente, inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos).
3.2.1. b. Añadir HinP1I para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo la diana que contiene sitios HinP1I contiguos (GCGC) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HinP1I. La polimerasa residual de la polimerasa Taq rellenará la protuberancia de 2 bases (opcionalmente, elevar la temperatura a 60 °C). Eliminar los dNTP (a través de una columna de centrifugación) y volver a añadir solo dATP para generar una protuberancia A en 3 de una sola base.
3.2.1. c. Usando ligasa T4, agregar conectores (que contengan una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional) con una protuberancia A en 3' de una sola base en el extremo de fijación a la una protuberancia A de una sola base de las secuencias diana escindidas y rellenadas. El lado 5' no fijador del conector contiene una protuberancia 5' y, opcionalmente, no está fosforilado. El lado 3' no fijador del conector contiene un grupo bloqueante 3' y/o tiofosfatos para inhibir la digestión con la exonucleasa 3'.
3.2.1. d. Añadir una exonucleasa 3' (es decir, exonucleasa III) y digerir a 37 °C. Los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios. La exonucleasa también hará que los conectores se vuelvan monocatenarios. Opcionalmente, eliminar los productos de digestión de los fragmentos deseados con una columna de centrifugación.
3.2.1.1. e. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5' usando cinasa T4, (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización. Los productos de fijación comprenden multímeros de fragmentos diana con secuencias HinP1I contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcional. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota: 1: El extremo 3' del conector bloqueado se puede sintetizar para contener un Uracilo o un sitio apurínico (AP) en una posición interna al bloqueo, y después del tratamiento con UDG y endonucleasa AP, liberar un extremo 3' apto para fijación.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: La fijación favorecerá la formación de multímeros usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto.
Nota 4: Se puede usar el mismo enfoque para identificar regiones que están metiladas en regiones promotoras (véanse, por ejemplo, la Figura 52). Escindir el ADNlc aislado con un cóctel de enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV) y fijar en los conectores cortos con los extremos 5' bloqueados. A continuación, escindir la diana con enzimas insensibles a metilo (HaeIII y MspI). AciI y HaeIII se ilustran en esta figura. La supervivencia de la hebra tras la escisión con endonucleasa de restricción sensible a metilo es un marcador de la metilación de esa región. Solo los sitios HaeIII contiguos (GGCC) con sitios AciI metilados en la diana original generan fragmentos no bloqueados cuando se escinden con HaeIII. La fijación posterior de conectores más largos es como se describe anteriormente. Cuando se usa la secuenciación SMRT directa en los productos fijados, se puede determinar el estado de metilación del ADN del molde original.
Detección de sitios contiguos no metilados en la región promotora
Puede existir el deseo de determinar el estado de no metilación de las secuencias de CpG entre dos sitios de restricción sensibles a metilo en una región promotora. Esto es similar a los enfoques anteriores, e incluye un etapa extra de tratamiento con bisulfito.
Visión general del enfoque: La idea es copiar fielmente todos los fragmentos de ADN diana que no estén metilados en los sitios de restricción contiguos para las regiones de interés, tratar con bisulfito, agregar una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y un identificador de paciente opcional y circularizarlos para la secuenciación posterior. La hebra de ADN oligonucleotídica se circulariza y secuencia. Este enfoque proporciona la ventaja de obtener tanto la información del número de copias cuando es necesario, como los datos de no metilación con el mínimo de secuenciación requerido.
Variación 3.3 (véanse, por ejemplo, las Figuras 53 y 54). En esta variación, el ADN se escinde con HinP1I (u otra endonucleasa de restricción sensible a la metilación) para generar extremos 3' y 5' aptos para fijación. El ADN se trata después con bisulfito, lo que hace que las hebras no sean complementarias para que se vuelvan monocatenarias. Para capturar las regiones no metiladas deseadas, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementarios a la secuencia del lado 3' de la diana. La adición de ligasa y polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra y actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' de la diana no metilada, seguido de la fijación al extremo 5' de la diana para formar un producto circular que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor:
3.3.a. Escindir el ADNlc aislado con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). Este ejemplo describe HinP1I. Inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos) y desnaturalizar el ADN (94 °C, 1 minuto). Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado.
3.3. b. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto, si es necesario) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de las dianas, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50-60 °C durante 2 horas). Añadir KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y dNTP para permitir la extensión y fijación a 50 °C y, opcionalmente, elevar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
3.3. c. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El oligonucleótido puede carecer de un fosfato 5' o contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5', de modo que el extremo 5' del oligonucleótido no sea adecuado para la fijación.
Nota 2: El ejemplo anterior usa KlenTaq, una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, así como actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3'. Si el oligonucleótido tiene un grupo bloqueante en el lado 5', entonces se puede usar polimerasa con actividad nucleasa 5'->3'.
Nota 3: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 4: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. En la variación 3.3 se usaron tanto una polimerasa como una ligasa para formar un círculo cerrado covalentemente que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Esto también se puede lograr usando solo una ligasa.
Variación 3.4 (véanse, por ejemplo, las Figuras 55 y 56). En esta variación, el ADN se escinde con HinP1I (u otra endonucleasa de restricción sensible a la metilación) para generar extremos 3' y 5' aptos para fijación, seguido de un tratamiento con bisulfito. Para capturar las regiones no metiladas deseadas, la diana hibrida con un par de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios que comprende una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera sonda, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera sonda. La adición de ligasa permite la fijación del extremo 3' de la diana al extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' de la diana al extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto circular que contiene un secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor
3.4. a. Escindir el ADNlc aislado con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). Este ejemplo usa HinP1I. Inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos) y desnaturalizar el a Dn (94 °C, 1 minuto). Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado.
3.4. b. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de pares de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios (una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera hebra, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera hebra), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C-60 °C durante 2 horas). Se añade una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) para permitir la fijación a 60 °C para generar productos circulares.
3.4. c. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador. Cuando se usa la secuenciación SMRT directa, la pérdida del estado de metilación del ADN del molde original se puede determinar directamente.
Nota 2: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Base de datos del estado de no metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos.
La base de datos TCGA actual contiene información sobre el estado de metilación de aproximadamente 450.000 sitios CpG en el genoma humano, tanto para sitios de tejidos normales como para sitios de tejidos de muchos tumores diferentes. Sin embargo, no cubre todo el estado de no metilación de sitios HinP1I contiguos, ni los sitios CpG entre esos sitios, ni distinguiría que ambos sitios no están metilados en la misma pieza de ADN genómico. En consecuencia, para que el procedimiento de ensayo anterior sea más útil, sería provechoso crear una base de datos del estado de no metilación de sitios de restricción sensibles a metilo contiguos. Dicho enfoque se ilustra en la Figura 57.
Visión general del enfoque: La idea es generar una colección de pequeños fragmentos que solo se podrían haber formado si ambos extremos del fragmento contuvieran sitios de restricción que no estaban metilados en el ADN genómico original. Los fragmentos tienen conectores agregados con secuencias de identificador único opcional y de identificador de paciente opcional que ahora son susceptibles de fijación para crear multímeros de fragmentos, seguido de tratamiento con bisulfito para revelar las posiciones de metilación o no metilación, que serán sustratos para etapas adicionales y secuenciación posterior.
Variación 3.4.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 57). Este enfoque muestra cómo descubrir la no metilación en sitios HinP1I contiguos (GCGC) en todo el genoma. El material de partida puede ser ADN genómico intacto o ADNlc con una longitud promedio de aproximadamente 160 pb. Los conectores cortos que contienen un extremo 5' bloqueado en el extremo no fijador se fijan al ADN diana. Escindir el ADN genómico con HinP1I para fragmentar el ADN en sitios HinP1I no metilados. Los conectores que contienen una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional se fijan a estos extremos escindidos con HinP1I rellenos recientemente generados. Estos nuevos conectores contienen, en su lado no fijador, el extremo 3' bloqueado o una cadena principal que contiene tiofosfato (que se muestra como **** en la Figura 57). Tras la adición de una exonucleasa 3' bicatenaria (es decir, exonucleasa III), los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios, ya que el grupo bloqueante 3' o los tiofosfatos inhiben la digestión con la exonucleasa 3'. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5' para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización, por ejemplo usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto. Los productos de fijación comprenden secuencias HinP1I contiguas originalmente no metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcionales. A continuación, el producto se incuba con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado. Estos productos monocatenarios son adecuados para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Protocolo detallado para generar una base de datos del estado de metilación en sitios de restricción sensibles a metilo contiguos:
3.4.1a. Fijar los conectores que están bloqueados en el extremo 5' del extremo no fijado. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Escindir el ADN genómico aislado o el ADN enriquecido con metilo con una o más enzimas sensibles a metilo (AciI, HinP1I, Hpy99I y HpyCH4IV). En este ejemplo se usa HinP1I. Opcionalmente, inactivar con calor las endonucleasas (65 °C durante 15 minutos).
3.4.1. b. Añadir HinP1I para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo la diana que contiene sitios HinP1I contiguos (GCGC) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación con los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HinP1I. La polimerasa residual de la polimerasa Taq rellenará la protuberancia de 2 bases (opcionalmente, elevar la temperatura a 60 °C). Eliminar los dNTP (a través de una columna de centrifugación) y volver a añadir solo dATP para generar una protuberancia A en 3 de una sola base.
3.4.1. c. Usando ligasa T4, agregar conectores (que contengan una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional) con una protuberancia A en 3' de una sola base en el extremo de fijación a la una protuberancia A de una sola base de las secuencias diana escindidas y rellenadas. El lado 5' no fijador del conector contiene una protuberancia 5' y, opcionalmente, no está fosforilado. El lado 3' no fijador del conector contiene un grupo bloqueante 3' y/o tiofosfatos para inhibir la digestión con la exonucleasa 3'.
3.4.1. d. Añadir una exonucleasa 3' (es decir, exonucleasa III) y digerir a 37 °C. Los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios. La exonucleasa también hará que los conectores se vuelvan monocatenarios. Opcionalmente, eliminar los productos de digestión de los fragmentos deseados con una columna de centrifugación.
3.4.1.1. e. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5' usando cinasa T4, (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización. Los productos de fijación comprenden multímeros de fragmentos diana con secuencias HinP1I contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcional. Incubar los productos de fijación con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado. Estos productos monocatenarios son adecuados para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota: 1: El extremo 3' del conector bloqueado más largo se puede sintetizar para contener un Uracilo o un sitio apurínico (AP) en una posición interna al bloqueo, y después del tratamiento con UDG y endonucleasa AP, liberar un extremo 3' apto para fijación. Además, estos conectores se pueden sintetizar con 5-metil-C, de modo que después del tratamiento con bisulfito conserven su estado original.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: La fijación favorecerá la formación de multímeros usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto.
Detección del estado de no metilación de sitios CpG individuales dentro de una región determinada
El enfoque anterior es ideal para identificar y enumerar fragmentos que contienen sitios HinP1I no metilados contiguos como un sustituto de la no metilación dentro de ese fragmento de ADN. Sin embargo, para algunas aplicaciones, es importante identificar el estado de no metilación de sitios CpG individuales dentro de una región determinada. Por tanto, puede ser necesario tratar el ADN entrante con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U.
Visión general del enfoque usando bisulfito: La idea es copiar fielmente todos los fragmentos de ADN diana que no estén metilados en los sitios de restricción HphI contiguos de la secuencia (GGTGA) para las regiones de interés, tratar con bisulfito (convertir GGCGA en GGTGA), agregar una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y un identificador de paciente opcional y circularizarlos para la secuenciación posterior. La hebra de ADN oligonucleotídica se circulariza y secuencia. Este enfoque proporciona la ventaja de obtener tanto la información del número de copias cuando es necesario, como los datos de metilación con el mínimo de secuenciación requerido.
La idea aprovecha una propiedad única de la secuencia de reconocimiento para HphI. La enzima escinde la secuencia de reconocimiento de 4.5 bases GGTGA en una orientación y TCACC en la otra orientación. Si el sitio GGCGA no metilado se trata con bisulfito, en la primera orientación, el sitio se convertirá en una secuencia de reconocimiento de HphI GGTGA. Después de algunos ciclos de amplificación por PCR, la 5-metil-C se convierte en C, mientras que la U se convierte en T. Cuando se escinde con HphI, solo los sitios contiguos no metilados en la diana original crearán fragmentos que son aptos para fijación de los extremos 3' y 5'.
Un rasgo característico único de este enfoque es que la conversión con bisulfito crea dos hebras no complementarias. Por tanto, la hebra superior tendrá secuencias GGCGA o GGTGA contiguas e, incluso si hay una secuencia TCACC que interviene, no importa porque se convierte en TUAUU, que no se reconoce como un sitio HphI. Aún mejor, las secuencias de la hebra superior de la forma TCGCC serán GGCGA en la hebra inferior. La hebra inferior también se puede usar para consultar el estado de metilación y, dado que las dos secuencias ahora son muy diferentes, las sondas de oligonucleótido para la hebra superior e inferior no hibridarán entre sí, solo con las dianas convertidas. Por tanto, este enfoque permite obtener un estado detallado de metilación en el promotor usando información de las hebras superior e inferior.
El principio de tratar el ADN con bisulfito para convertir el ADN no metilado en una secuencia que es escindible por una enzima de restricción pero que, si está metilado, no es escindible por esa misma enzima de restricción, se puede extender a algunos sitios de restricción adicionales. Por ejemplo, la secuencia CCGTC se convertirá en un sitio BccI (CCATC), siempre que el CG interno no esté metilado. (Esto es el resultado de la conversión de la hebra opuesta, es decir, GACGG en la secuencia de reconocimiento de hebra opuesta de BccI; es decir, GATGG). Asimismo, la secuencia GGACG se convertirá en un sitio FokI (GGATG), siempre que el CG interno no esté metilado. Por tanto, las variaciones consideradas a continuación para HphI son igualmente válidas para, pero sin limitarse a, las endonucleasas de restricción BccI, FokI y sus isoesquizómeros.
Variación 3.5 (véanse, por ejemplo, las Figuras 58 y 59). En esta variación, los conectores cortos que contienen 5-metil-C se fijan a los extremos del ADN. El ADN se trata después con bisulfito, lo que hace que las hebras no sean complementarias para que se vuelvan monocatenarias. Algunos ciclos de amplificación por PCR generan productos que ahora no están metilados en los sitios HphI. Estos productos se escinden a continuación con HphI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios "HphI" contiguos (GGCGA o GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que ahora son aptos para fijación en ambos extremos. Para capturar las regiones deseadas, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementarios a la secuencia del lado 3' de la diana. La adición de ligasa y polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra y actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' de la diana no metilada, seguido de la fijación al extremo 5' de la diana para formar un producto circular que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor:
3.5. a. Fijación en conectores que contienen 5-metil-C para retener la secuencia después de la conversión con bisulfito. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado. 3.5. b. Añadir cebadores, polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios HphI restantes.
3.5. c. Añadir Hphl para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios HphI contiguos (GGCGA o GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación para los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HphI.
3.5. d. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a las secuencias del lado 5' de las dianas, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a las secuencias del lado 3' de las dianas), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50-60 °C durante 2 horas). Añadir KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y dNTP para permitir la extensión y fijación a 50 °C y, opcionalmente, elevar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
3.5. e. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El oligonucleótido puede carecer de un fosfato 5' o contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5', de modo que el extremo 5' del oligonucleótido no sea adecuado para la fijación.
Nota 2: El ejemplo anterior usa KlenTaq, una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, así como actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3'. Si el oligonucleótido tiene un grupo bloqueante en el lado 5', entonces se puede usar polimerasa con actividad nucleasa 5'->3'.
Nota 3: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 4: Si la sonda de oligonucleótido también comprende sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección.
En la variación 3.5 se usan una polimerasa y una ligasa para formar un círculo cerrado covalentemente que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Esto también se puede lograr usando solo una ligasa.
Variación 3.6 (véanse, por ejemplo, las Figuras 60 y 61). En esta variación, los conectores cortos que contienen 5-metil-C se fijan a los extremos del ADN. El ADN se trata después con bisulfito, lo que hace que las hebras no sean complementarias para que se vuelvan monocatenarias. Algunos ciclos de amplificación por PCR generan productos que ahora no están metilados en los sitios HphI. Estos productos se escinden a continuación con HphI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios "HphI" contiguos (GGCGA o GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que ahora son aptos para fijación en ambos extremos. Para capturar las regiones no metiladas deseadas, la diana hibrida con un par de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios que comprende una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera hebra, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera hebra. La adición de ligasa permite la fijación del extremo 3' de la diana al extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótido y el extremo 5' de la diana al extremo 3' de la segunda sonda de oligonucleótido para formar un producto circular que contiene un secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Al insistir en que la endonucleasa de restricción genere tanto el fosfato 3'-OH como el fosfato 5', esto evita una señal falsa y también debería eliminar cualquier señal de fijación no específica. Por tanto, todos los fragmentos raros de ADN genómico que sean monocatenarios después de la purificación o que no se hayan escindido no formarán un sustrato productivo y serán destruidos en la etapa de tratamiento con exonucleasa.
Protocolo detallado para la detección altamente sensible de la no metilación del promotor:
3.6. a. Fijación en conectores que contienen 5-metil-C para retener la secuencia después de la conversión con bisulfito. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado. 3.6. b. Añadir cebadores, polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios HphI restantes.
3.6. c. Añadir HphI para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios HphI contiguos (GGCGA o GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación para los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HphI.
3.6. d. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de pares de oligonucleótidos parcialmente bicatenarios (una primera sonda de oligonucleótido con una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementaria a la secuencia del lado 3' de la diana, y una segunda sonda de oligonucleótido que comprende una región 5' complementaria a la primera hebra, una secuencia de identificador único y una región 3' complementaria a la primera hebra), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C-60 °C durante 2 horas). Se añade una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) para permitir la fijación a 60 °C para generar productos circulares.
3.6. e. Añadir exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del ADN metilado, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota 1: El producto circular es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 2: Si la sonda de oligonucleótido también comprende sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección.
Base de datos del estado de metilación en sitios de restricción HphI contiguos
La base de datos TCGA actual contiene información sobre el estado de metilación de aproximadamente 450.000 sitios CpG en el genoma humano, tanto para sitios de tejidos normales como para sitios de tejidos de muchos tumores diferentes. Sin embargo, no cubre todo el estado de no metilación de sitios AciI contiguos ni distinguiría que ambos sitios están metilados en la misma pieza de ADN genómico.
En consecuencia, para que el procedimiento de ensayo anterior sea más útil, sería provechoso crear una base de datos del estado de metilación de sitios de restricción HphI contiguos de la misma orientación (GGCGA convertido a GGTGA). Este enfoque también incluirá sitios de restricción HphI contiguos de la otra orientación (TCACC y TCGCC), ya que serán GGTGA en la hebra opuesta después de la conversión con bisulfito. Dicho enfoque se ilustra en la Figura 62.
Visión general del enfoque: La idea es generar una colección de pequeños fragmentos que solo se podrían haber formado si ambos extremos del fragmento contuvieran GGCGA convertido (a GGTGA) que no estaban metilados en el ADN genómico original. La idea aprovecha una propiedad única de la secuencia de reconocimiento para HphI. La enzima escinde la secuencia de reconocimiento de 4.5 bases GGTGA en una orientación y TCACc en la otra orientación. Si un sitio GGCGA no metilado se trata con bisulfito, en la primera orientación, el sitio se convertirá en una secuencia de reconocimiento de HphI GGTGA. Después de algunos ciclos de amplificación por PCR, la 5-metil-C se convierte en C, mientras que la U se convierte en T. Cuando se escinde con HphI, solo los sitios contiguos no metilados en la diana original crearán fragmentos que son aptos para fijación de los extremos 3' y 5'. Los fragmentos tienen conectores agregados con secuencias de identificador único opcional y de identificador de paciente opcional que ahora son susceptibles de fijación para crear multímeros de fragmentos que serán sustratos para etapas adicionales y secuenciación posterior.
Variación 3.6.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 62). En esta variación, los conectores cortos que contienen 5-metil-C se fijan a los extremos del ADN. El ADN se trata después con bisulfito, lo que hace que las hebras no sean complementarias para que se vuelvan monocatenarias. Algunos ciclos de amplificación por PCR generan productos que ahora no están metilados en los sitios HphI. Estos productos se escinden a continuación con HphI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios "HphI" contiguos (GGCGA o GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que ahora son aptos para fijación en ambos extremos. Para capturar las regiones deseadas, la diana hibrida con oligonucleótidos que comprenden una región de sonda 5' complementaria a la secuencia del lado 5' de la diana, una secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional, una secuencia de identificador de paciente opcional y una región de sonda 3' complementarios a la secuencia del lado 3' de la diana. La adición de ligasa y polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra y actividad nucleasa 3'->5' y 5'->3' permite la extensión del extremo 3' de la diana no metilada, seguido de la fijación al extremo 5' de la diana para formar un producto circular que contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional. Los productos no fijados se eliminan por digestión con exonucleasa. Este producto circular es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Variación 3.6.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 62). Este enfoque muestra cómo descubrir la no metilación en sitios "HphI" contiguos (GGCGA o GGTGA) en todo el genoma. El material de partida puede ser ADN genómico intacto o ADNlc con una longitud promedio de aproximadamente 160 pb. Los conectores cortos que contienen un extremo 5' bloqueado en el extremo no fijador se fijan a los extremos del ADN. Tratar el ADN con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. Unos pocos ciclos de amplificación por PCR usando dNTP no metilados y cebadores bloqueados en 5' generan productos que ahora no están metilados en los sitios HphI restantes. Estos productos se escinden a continuación con HphI. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios HphI contiguos (GGCGA y GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación para los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HphI. Los conectores que contienen una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional se fijan a estos extremos escindidos con HphI recientemente generados. Estos nuevos conectores contienen, en su lado no fijador, el extremo 3' bloqueado o una cadena principal que contiene tiofosfato (que se muestra como **** en la Figura 62). Tras la adición de una exonucleasa 3' bicatenaria (es decir, exonucleasa III), los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios, ya que el grupo bloqueante 3' o los tiofosfatos inhiben la digestión con la exonucleasa 3'. Los extremos libres de los fragmentos que contienen conector restantes se vuelven aptos para fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5', (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando nucleasa 5', o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización, por ejemplo usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto. Los productos de fijación comprenden secuencias AciI contiguas en la misma orientación (es decir, GCGG), originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o una secuencia de identificador de paciente opcionales. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Protocolo detallado para generar una base de datos del estado de no metilación en sitios de restricción "HphI" contiguos:
3.6.1. a. Fijar los conectores que están bloqueados en el extremo 5' del extremo no fijado. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4, y posteriormente se genera una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Incubar el ADNlc con bisulfito, que convierte la C regular, pero no la metil-C, en U. El tratamiento con bisulfito convierte las hebras superior e inferior de manera diferente, de modo que después del tratamiento, las hebras ya no serán complementarias entre sí y funden por separado.
3.6.1. b. Añadir cebadores bloqueados en 5', polimerasa Taq y dNTP y realizar algunos ciclos de PCR para generar productos que ahora no están metilados en los sitios HphI restantes.
3.6.1. c. Añadir HphI para escindir los productos que contengan dichos sitios. Solo los amplicones de PCR que contienen sitios HphI contiguos (GGCGA o GGTGA) que no estaban metilados en la diana original generarán fragmentos que están desbloqueados (es decir, aptos para fijación para los conectores) en ambos extremos, cuando se escinden con HphI. Los extremos diana se reparan con polimerasa T4 y cinasa T4. Eliminar los dNTP (a través de una columna de centrifugación) y volver a añadir solo dATP para generar una protuberancia A en 3 de una sola base.
3.6.1. d. Usando ligasa T4, agregar conectores (que contengan una secuencia de identificador único opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional) con una protuberancia A en 3' de una sola base en el extremo de fijación a la una protuberancia A de una sola base de las secuencias diana escindidas y rellenadas. El lado 5' no fijador del conector contiene una protuberancia 5' y, opcionalmente, no está fosforilado. El lado 3' no fijador del conector contiene un grupo bloqueante 3' y/o tiofosfatos para inhibir la digestión con la exonucleasa 3'.
3.6.1. e. Añadir una exonucleasa 3' (es decir, exonucleasa III) y digerir a 37 °C. Los fragmentos que contienen el conector corto original en uno o ambos lados se digerirán y se volverán monocatenarios. Solo los fragmentos con el nuevo conector fijado a ambos lados permanecerán bicatenarios. La exonucleasa también hará que los conectores se vuelvan monocatenarios. Opcionalmente, eliminar los productos de digestión de los fragmentos deseados con una columna de centrifugación.
3.6.1. f. Los extremos libres de los fragmentos restantes que contienen conector se vuelven aptos para la fijación, ya sea (i) fosforilando el extremo 5' usando cinasa T4, (ii) eliminando el grupo 3' bloqueado, o (iii) usando la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación, o cualquier combinación de los mismos. Las condiciones de fijación se diseñan para favorecer la multimerización. Los productos de fijación comprenden multímeros de fragmentos diana con secuencias AciI contiguas originalmente metiladas en el ADN diana con una secuencia de identificador único y/o secuencia de identificador del paciente opcional. Este producto es adecuado para etapas adicionales opcionales y secuenciación posterior.
Nota: 1: El extremo 3' del conector bloqueado se puede sintetizar para contener un Uracilo o un sitio apurínico (AP) en una posición interna al bloqueo, y después del tratamiento con UDG y endonucleasa AP, liberar un extremo 3' apto para fijación.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: La fijación favorecerá la formación de multímeros usando agentes de aglomeración (es decir, PEG al 20 %) y/o mezclando dos conjuntos de productos de fijación, en los que la protuberancia del conector 5' no palindrómico del primer conjunto es complementario a la protuberancia del conector 5' no palindrómico del segundo conjunto.
Ejemplo profético 4: Cuantificación exacta de cambios en el número de copias específicos de tumor en el ADN aislado de células tumorales circulantes.
Los cambios en el número de copias de ADN tumoral puede ser un fuerte indicador de resultados. En los últimos años, la mayoría de los trabajos sobre el número de copias se ha realizado en chips SNP, donde los enfoques bioinformáticos promedian la señal en una región para determinar el número de copias relativo. Para cantidades bajas de células se utilizan enfoques de PCR digital para obtener un recuento exacto de las moléculas iniciales. Visión general del enfoque: En general, los cambios en el número de copias ocurren en grandes regiones de ADN, tales como brazos cromosómicos. Dado que el número de células tumorales es muy bajo, la exactitud de las mediciones se podría mejorar interrogando simultáneamente múltiples regiones de un brazo cromosómico dado y añadiendo o promediando la señal resultante. Del mismo modo, en algunos tumores se amplifican genes específicos (es decir, Her2-neu, IGF2), que pueden predecir el resultado o guiar el tratamiento.
Además de los cambios en el número de copias, la pérdida de heterocigosis se puede seguir no solo contando los cromosomas, sino también buscando la pérdida tradicional de heterocigosis entre los SNP o marcadores polimórficos dentro de la región de interés. Los marcadores más heterogéneos están en secuencias repetitivas. En el presente documento se ilustran los conceptos que usan secuencias repetidas de tetranucleótidos, aunque también se pueden considerar secuencias repetidas de tri y dinucleótidos.
El protocolo detallado para la cuantificación de los cambios en el número de copias específicos de tumor en el ADN aislado de células tumorales circulantes se abordará en la siguiente sección que evalúa las mutaciones de las células tumorales circulantes, ya que el enfoque general es muy similar.
Ejemplo profético 5: Detección de mutaciones en el ADN aislado de células tumorales circulantes o ADNlc Las células tumorales circulantes proporcionan la ventaja de concentrar el ADN que contiene las mutaciones, por lo que ya no es necesario encontrar mutaciones de bajo nivel en un exceso de secuencia natural. Sin embargo, dado que el número de moléculas de ADN de partida es bajo, es importante amplificar todas las regiones con exactitud y verificar que las mutaciones estén realmente presentes.
Visión general del enfoque: El enfoque aquí es similar al de encontrar mutaciones puntuales comunes conocidas o al de secuenciar múltiples exones, como se explica anteriormente. Sin embargo, cuando se trata de cantidades bajas de ADN entrante, existe la posibilidad de un error de polimerasa. Este problema se soluciona usando la secuenciación circular o la secuenciación SMRT.
Dado que el ADN se obtiene de unas pocas células tumorales capturadas, si hay una mutación presente, debería estar presente en algunas, si no en la mayoría de las células capturadas.
A continuación se describe un protocolo detallado para la detección de mutaciones en el ADN aislado de las células tumorales circulantes, incluyendo la cuantificación del número de copias, ya que el enfoque es muy similar.
Variación 5.1 (véanse, por ejemplo, la Figura 63). La idea general aquí es convertir todo el ADNlc o ADN de CTC en círculos monocatenarios, donde cada fragmento contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y una secuencia de unión a cebador opcional. Una vez que se ha llevado a cabo esa conversión, los círculos son ahora adecuados para secuenciación pura, para captura específica de secuencia de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas o para amplificación por círculo rodante y captura potenciada de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas.
En esta variación, el objetivo es capturar toda la secuencia de ADN diana y no diana, sin usar sondas para unirse a la diana. Los conectores se fijan a la diana de ADN (ADNlc con longitud promedio de aproximadamente 160 bases). Para capturar todas las secuencias, la diana hibrida con sondas de oligonucleótido que comprenden una secuencia 5' complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia complementaria al extremo 3' del conector. El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en un extremo (se muestra el extremo 5'). La adición de una polimerasa permite la extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana, así como la extensión del conector del extremo 3' a través de la secuencia del identificador único, la secuencia de unión a cebador opcional y la secuencia del identificador de paciente opcional hasta que esté contiguo al conector 5' en la diana.
El extremo 5' del conector se puede diseñar para que sea ligeramente más largo, de modo que una vez que la polimerasa extiende el conector 3', no extienda a través de la secuencia complementaria del conector 5' hasta que llegue a la porción de la diana 5' que hibrida con la región de la sonda 5'.
Esta variación requiere que la sonda de oligonucleótido contenga secuencias complementarias a las hebras de conector 3' y 5', estando dichas secuencias separadas por solo aproximadamente 20-40 bases. Dado que las secuencias son complementarias a las hebras del conector, que a su vez son complementarias entre sí, es importante evitar que las dos secuencias dentro de la sonda de oligonucleótido formen solo una horquilla interna con un bucle de 20-40 bases. Una solución es fijar los conectores que contienen una burbuja interna, de modo que los dos conectores retienen el carácter bicatenario a la baja temperatura usada para la fijación del conector (16 °C o incluso 4 °C con ligasa T4). Además, el conector 5' se puede diseñar para que sea más largo que el conector 3'. Finalmente, las regiones de complementariedad dentro del conector se pueden diseñar para tener emparejamientos erróneos sutiles (es decir, G:T y T:G) que son más desestabilizadores en la sonda de oligonucleótido complementaria (es decir, C:A y A:C) de modo que es menos probable que la sonda de oligonucleótido forme la horquilla interna a la temperatura de hibridación global (es decir, 40-50 °C).
La extensión del extremo 3' del oligonucleótido en la diana potencia la asociación de la sonda a la diana y, por tanto, aumenta la capacidad del extremo 3' del conector de hibridar correctamente con su complemento y extenderse por la polimerasa. La actividad de escisión por nucleasa 5'->3' de la polimerasa (o nucleasa Fen) escinde una base complementaria solapante en 5' del conector 5', dejando un fosfato 5' apto para fijación en el conector. La polimerasa también extiende el oligonucleótido en la diana, y no escinde el grupo bloqueante en el extremo 5' del oligonucleótido.
La ligasa sella covalentemente los extremos 3' extendidos al fosfato 5' apto para fijación para crear productos de fijación circular. El grupo bloqueante evita la circularización de la sonda de oligonucleótido. La adición opcional de Uracil-ADN glicosilasa (UDG) y Formamidopirimidina-ADN glicosilasa (Fpg, también conocida como 8-oxoguanina ADN glicosilasa, que actúa como una N-glucosilasa y como una AP-liasa) se puede usar para mellar dianas que contienen bases dañadas. A continuación, se agrega(n) exonucleasa(s) para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original con una secuencia de identificador único. Este producto es adecuado para la captura específica de secuencia de las dianas deseados usando sondas biotiniladas, combinada con amplificación por círculo rodante y secuenciación circular, o secuenciación SMRT directa.
El desafío aquí es evitar que la polimerasa extienda el conector 3' de modo que destruya el conector 5' sin un etapa de fijación (es decir, traducción de mellas). Esto se puede lograr incorporando enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Un enfoque alternativo es usar un conector 5' que contenga un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tima EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente. Cuando se usa EndoIII termoestable, la polimerasa de PCR usada carecería de actividad exonucleasa 5'->3'.
Como se mencionó anteriormente, el problema de la traducción de mellas también se puede minimizar usando una mezcla de polimerasas, con y sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3' (por ejemplo, en una proporción 1:20) en condiciones de extensión distributiva en presencia de ligasa de modo que la mayor parte de la extensión se realice por la polimerasa sin actividad nucleasa hasta que se requiera polimerasa con actividad nucleasa para crear el punto de unión apto de fijación, seguida de disociación de polimerasa y un acontecimiento de fijación para generar el producto de fijación circular deseado.
Protocolo detallado para la cuantificación exacta de cambios en el número de copias específicos de tumor o la detección de mutaciones en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53) en el ADN aislado de las células tumorales circulantes o ADNlc:
5.1. a. Comenzando con ADNlc o ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC) (cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 a 4 °C agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Opcionalmente, purificar el ADN diana del conector no fijado.
5.1. b. Desnaturalizar el ADN diana que contiene conectores en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una secuencia 5' complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una secuencia complementaria al extremo 3' del conector), y permitir que las sondas de oligonucleótido hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40-50 °C durante 30 min). Las sondas de oligonucleótido pueden contener un grupo bloqueante opcional en el extremo 5'. La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
5.1. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la captura específica de secuencia de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas, o para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, seguido de una captura potenciada de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector o la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: El conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota: 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tma EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana.
La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 5: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 6: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas. Nota 7: La captura de copias repetidas en tándem de la diana (generadas mediante amplificación por círculo rodante) proporciona la ventaja única de unión multivalente para potenciar la captura de la diana correcta. Esto permite usar condiciones de hibridación/captura más rigurosas, lo que da como resultado mayores eficacias de captura y menos captura de secuencias no deseadas. Este enfoque también se puede usar para capturar todas las dianas que contienen secuencias repetitivas (es decir, repetición de tetranucleótidos AGAt ), lo que permite evaluar la pérdida de heterocigosis, la variación en el número de copias, el haplotipado, el establecimiento de paternidad y otras aplicaciones.
Nota 8: El identificador de secuencia único garantiza que, incluso después de la amplificación por círculo rodante u otras etapas de selección/amplificación, cada secuencia diana original se pueda evaluar de manera única, lo que permite una cuantificación exacta del número de copias originales de cada diana. Nota 9: La secuencia de identificador único se puede añadir a ambos lados del conector. Si no se añaden una base extra al ADN diana (es decir, omitiendo el etapa Klenow), entonces se usa una fijación de extremo romo. Para evitar la fijación de conector a conector, el extremo romo del conector no está fosforilado. Los oligonucleótidos iSx-201-MdAdT (hebra superior) e iSx-202-MdLgAdB-bk (hebra inferior) proporcionan ejemplos de conectores que contienen identificadores únicos y extremos romos (véase la Tabla 1). La hebra superior es más larga, creando una protuberancia monocatenaria en 5' en el lado no fijador. La hebra inferior tiene un 5'-OH y, opcionalmente, contiene un grupo bloqueante 3' para evitar la extensión, así como grupos 5-nitroindol internos para actuar como bases universales cuando se realiza el emparejamiento con las secuencias de identificador único de la hebra superior. Después de la fijación del conector de extremo romo, agregando secuencias únicas a los extremos 5' de la diana de ADN bicatenario, esas secuencias se copian extendiendo el extremo 3' con polimerasa. Opcionalmente, la hebra superior contiene bases dU para la posterior escisión con UDG y FPG para liberar un fosfato 5', adecuado para fijación y circularización en etapas posteriores. El conector iSx-201-MdAdT (véase la Tabla 1) pueden contener grupos tiofosfato opcionales contiguos al fosfato 5' recientemente liberado para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización de las dianas con los extremos de conector.
Nota 10: Cuando se diseñan oligonucleótidos para su uso con secuencias de conector más largas, que comprenden secuencias de "código de barras" o "indexación" para su uso con instrumentos comerciales, puede ser necesario ensamblar el oligonucleótido usando PCR, amplificación de desplazamiento de hebra, o una combinación de los mismos. Durante la PCR, el uso de dUTP en lugar de Tt P incorpora uracilo, adecuado para su posterior escisión por UDG. El cebador de hebra inversa se puede fosforilar, permitiendo su digestión usando exonucleasa lambda o una exonucleasa 5'->3' similar. Se puede agregar una secuencia de dA30 al extremo 5' del cebador directo, lo que permite la amplificación por desplazamiento de hebra. Ejemplos de oligonucleótidos para el ensamblaje de una secuencia complementaria inversa, que son adecuados para su uso con los conectores anteriores son: iSx-204-bkA30-Lk-F2, iSx-205-r503-F3, iSx-206-d701-R4 e iSx-207-Lk-R5 (véase la Tabla 1).
Nota 11: En otra variación para agregar la secuencia de identificador único que se puede añadir en ambos lados del conector, una hebra también comprende una secuencia de "código de barras" o "índice" para su uso con instrumentos comerciales (véase, por ejemplo, la Figura 64). Al dividir la región larga entre el conector y el oligonucleótido de hibridación, las diferentes secuencias se pueden sintetizar directamente y se pueden mantener una longitud de aproximadamente 100 bases. Los oligonucleótidos iSx-211-r702-LgAdT (hebra superior) e iSx-202-MdLgAdB-bk(hebra inferior, la misma que anteriormente) proporcionan ejemplos de conectores que contienen secuencias de índice o código de barras, identificadores únicos y extremos romos (véase la Tabla 1). La hebra superior es considerablemente más larga, creando una protuberancia monocatenaria en 5' en el lado no fijador. La hebra inferior tiene un 5'-OH y, opcionalmente, contiene un grupo bloqueante 3' para evitar la extensión, así como grupos 5-nitroindol internos para actuar como bases universales cuando se realiza el emparejamiento con las secuencias de identificador único de la hebra superior. Después de la fijación del conector de extremo romo, agregando secuencias únicas a los extremos 5' de la diana de ADN bicatenario, esas secuencias se copian extendiendo el extremo 3' con polimerasa. Opcionalmente, la hebra superior contiene bases dU para la posterior escisión con UDG y FPG para liberar un fosfato 5', adecuado para fijación y circularización en etapas posteriores. El oligonucleótido puente, iSx-212-r503-R4 (véase la Tabla 1), hibrida con el conector que contiene fosfato 5' escindido, así como con el extremo 3' extendido largo, permitiendo la extensión con polimerasa y la circularización con ligasa.
Nota 12: Con los productos antes mencionados generados usando los diseños de cebadores y conectores anteriores, después de la amplificación por agolpamiento o con microesferas, o la captura dentro de un pocillo, dirección o superficie de una cubeta de lectura en un instrumento comercial, se pueden usar los siguientes cebadores para iniciar reacciones de secuenciación: (i) iLx-003-PEsqP1, cebador de secuenciación de extremo emparejado 1; (ii) iLx-004-BrCdR1, cebador de indexación, lectura de código de barras 1; (iii) iLx-001-P5-BrCdR2, lectura de código de barras 2; y (iv) iLx-005-PEsqP2, cebador de secuenciación de extremo emparejado 2 (las secuencias de cebador se proporcionan en la Tabla 1 a continuación).
El procedimiento anterior usa conectores con un 5'-OH. La variación 5.2 usa conectores con un fosfato 5' para evitar algunos problemas potenciales asociados con el uso de polimerasa con una actividad nucleasa 5'->3' (véase, por ejemplo, la Figura 63).
Protocolo detallado para la cuantificación exacta de cambios en el número de copias específicos de tumor o la detección de mutaciones en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53) en el ADN aislado de las células tumorales circulantes o ADNlc:
5.2. a. Comenzando con ADNlc o ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC) (cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 a 4 °C agrega conectores en ambos extremos del fragmento. El conector 5' contiene un grupo fosfato (opcionalmente añadido usando cinasa T4).
5.2. b. Desnaturalizar el ADN diana que contiene conectores en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una secuencia 5' complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional y una secuencia complementaria al extremo 3' del conector), y permitir que las sondas de oligonucleótido hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40-50 °C durante 30 min). La sonda de oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el extremo 5'. KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa) y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
5.2. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la captura específica de secuencia de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas, o para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, seguido de una captura potenciada de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector o la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5', o un 5'-OH, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice.
Nota 2: Los conectores se pueden sintetizar con fosfato 5', o el fosfato se puede agregar usando cinasa T4. Nota 3: La captura de copias repetidas en tándem de la diana (generadas mediante amplificación por círculo rodante) proporciona la ventaja única de unión multivalente para potenciar la captura de la diana correcta. Esto permite usar condiciones de hibridación/captura más rigurosas, lo que da como resultado mayores eficacias de captura y menos captura de secuencias no deseadas. Este enfoque también se puede usar para capturar todas las dianas que contienen secuencias repetitivas (es decir, repetición de tetranucleótidos AGAt ), lo que permite evaluar la pérdida de heterocigosis, la variación en el número de copias, el haplotipado, el establecimiento de paternidad y otras aplicaciones.
Nota 4: El identificador de secuencia único garantiza que, incluso después de la amplificación por círculo rodante u otras etapas de selección/amplificación, cada secuencia diana original se pueda evaluar de manera única, lo que permite una cuantificación exacta del número de copias originales de cada diana.
Nota 5: Ejemplos de conectores y oligonucleótidos complementarios para facilitar la circularización son: iSx-220-d503-AdT1, iSx-221-pd707-AdB2 e iSx-222-Lk-uRC1, respectivamente (véase la Tabla 1). El conector iSx-220-d503-AdT1 (véase la Tabla 1) puede contener grupos tiofosfato opcionales en la 2a y 3a posición desde el extremo 5' para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización de las dianas con los extremos de conector.
Los enfoques descritos en las Figuras 64 y 65 usan conectores universales para capturar y circularizar el ADN genómico total y, a continuación, realizar etapas posteriores, tales como la captura de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas para seleccionar las dianas para el análisis de secuencia. Las sondas biotiniladas se capturan en microesferas antes de la hibridación o después de la hibridación, por lo que, aunque en el segundo caso el etapa de hibridación puede ser líquida, en última instancia hay un etapa de líquido a sólido, y estas etapas pueden dar como resultado rendimientos menores o pérdidas de fragmentos.
La variación 5.3 describe un enfoque alternativo, en el que el etapa de captura ocurre en líquido, usando sondas diseñadas para hibridar cerca o de forma contigua entre sí en la diana, y a continuación se crea una "plataforma de aterrizaje" para que los conectores en los extremos de la diana hibriden, se extiendan y fijen para crear las dianas circulares cerradas covalentemente. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando se seleccionan dianas que contienen ADN repetitivo.
Protocolo detallado para la cuantificación exacta de cambios en el número de copias específicos de tumor o la detección de mutaciones en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53) en el ADN aislado de las células tumorales circulantes o ADNlc:
5.3. a. Comenzando con ADNlc o ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC) (cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 a 4 °C agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Los conectores se pueden sintetizar con fosfato 5', o el fosfato se puede agregar usando cinasa T4. Opcionalmente, purificar el ADN diana del conector no fijado.
5.3. b. Desnaturalizar el ADN diana que contiene conectores en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una secuencia 5' complementaria a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAt ) de la diana, una región espaciadora opcional, una secuencia complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional, una región espaciadora opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector y una secuencia de 3' complementaria a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) de la diana, y contiguo a la secuencia 5' complementaria a la diana) y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5'. La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que la secuencia del conector tenga un fosfato 5', KlenTaq extiende el extremo 3' hasta que esté directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 70). En el caso de que la secuencia del conector tenga un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 70). Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
5.3. c. Opcionalmente, escindir la sonda de oligonucleótido en un enlace escindible (por ejemplo, U escindido usando UDG y endonucleasa AP). Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la captura específica de secuencia de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas, o para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, seguido de una captura potenciada de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector o la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. De forma alternativa, se puede incluir un enlace escindible en el oligonucleótido original.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: El conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota: 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndolII termoestable (como Tma EndolII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 5: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 6: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas. Nota 7: La captura de copias repetidas en tándem de la diana (generadas mediante amplificación por círculo rodante) proporciona la ventaja única de unión multivalente para potenciar la captura de la diana correcta. Esto permite usar condiciones de hibridación/captura más rigurosas, lo que da como resultado mayores eficacias de captura y menos captura de secuencias no deseadas. Este enfoque también se puede usar para capturar todas las dianas que contienen secuencias repetitivas (es decir, repetición de tetranucleótidos AGAT), lo que permite evaluar la pérdida de heterocigosis, la variación en el número de copias, el haplotipado, el establecimiento de paternidad y otras aplicaciones.
Nota 8: El identificador de secuencia único garantiza que, incluso después de la amplificación por círculo rodante u otras etapas de selección/amplificación, cada secuencia diana original se pueda evaluar de manera única, lo que permite una cuantificación exacta del número de copias originales de cada diana. Nota 9: La secuencia de identificador único se puede añadir en ambos lados de los conectores que comprenden secuencias de "índice" o "código de barras", usando una fijación de protuberancia T de una sola base (véase, por ejemplo, la Figura 67). Reparar los extremos de la diana con polimerasa T4, fosforilar el extremo 5' con cinasa T4. Añadir una base A al extremo 3' de la diana usando el fragmento Klenow que carece de actividad nucleasa 3'->5'. Fijar en conectores de "hueco" de 3 unidades con protuberancia T en 3' usando la ligasa T4 a 30 °C. Usar el fragmento Klenow que carece de actividad nucleasa 3'->5' para llenar el hueco y fijar a una hebra pequeña de conector en presencia de ligasa T4. De manera opcional, usar ADN polimerasa que carece de actividad nucleasa 3'->5' para llenar el hueco y fijar a una hebra de conector pequeño en presencia de ligasa T4. Ejemplos de dichos oligonucleótidos conectores de 3 unidades son: iSx-223-d504-AdT3, iSx-224-pSmAdT4 e iSx-225-pd708-N6AdB5 (véase la Tabla 1). El conector iSx-223-d504-AdT3 (véase la Tabla 1) puede contener grupos tiofosfato opcionales en la 2a y 3a posición desde el extremo 5' para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización de las dianas con los extremos de conector.
Nota 10: La secuencia de identificador único se puede añadir en ambos lados de los conectores que comprenden secuencias de "índice" o "código de barras", usando la fijación de extremo romo. Reparar los extremos de la diana con polimerasa T4. Fijar en conectores de "hueco" de 3 unidades con fosfato 3' y protuberancia roma usando ligasa T4 a 30 °C. Usar el fragmento Klenow que carece de actividad nucleasa 3'->5' para llenar el hueco a 37 °C, calentar a 50 °C para desnaturalizar el conector pequeño. Usar ADN polimerasa Taq (que carece de actividad nucleasa 3'->5', pero con actividad nucleasa 5'->3') para llenar el hueco, y fijar a la diana con ligasa termoestable. Ejemplos de dichos oligonucleótidos conectores de 3 unidades son: iSx-226-d505-AdT6, iSx-227-SmAdT7p e iSx-225-pd708-N6AdB5 (igual que anteriormente, véase la Tabla 1). El conector iSx-226-d505-AdT6 (véase la Tabla 1) puede contener grupos tiofosfato opcionales en la 2a y 3a posición desde el extremo 5' para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización de las dianas con los extremos de conector.
Nota 11: La secuencia de identificador único se puede añadir en ambos lados de los conectores que comprenden secuencias de "índice" o "código de barras", usando retrotranscripción. Reparar los extremos de la diana con polimerasa T4 y fosforilar el extremo 5' con cinasa T4 (véase, por ejemplo, la Figura 68). Añadir 3 bases C al extremo 3' de la diana usando la retrotranscriptasa. Hibridar los pares de conectores donde el primer conector tiene rGrG+G en el extremo 3' (+G es símbolo del ANB, rG3), sitios de unión a cebador con identificador de paciente y único y fosfato 5', mientras que el segundo conector tiene sitios de unión a cebador con identificador de paciente. La retrotranscriptasa experimenta un cambio de hebra y copia un identificador único para llenar el hueco. La ligasa sella covalentemente la diana extendida al segundo conector. La RNasa H2 escinde las bases de ARN, liberando el 3'-OH de rG3 (rGrG+G) en la secuencia del primer conector. La polimerasa llena los huecos y la ligasa sella covalentemente los extremos extendidos. Ejemplos de dichos oligonucleótidos conectores son: iSx-228-d506-AdT83+G e iSx-229-pd709-AdB6. El conector iSx-228-d506-AdT83+G (véase la Tabla 1) puede contener grupos tiofosfato opcionales en la 2a y 3a posición desde el extremo 5' para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización de las dianas con los extremos del conector.
Nota 12: Una variación es usar oligonucleótidos que comprenden múltiples enlaces escindibles, de modo que después de la extensión/fijación y el tratamiento con el agente de escisión, se genera un cebador único en la hebra diana, adecuado para la amplificación por círculo rodante para generar productos de repetición en tándem. En la Tabla 1 a continuación se muestran ejemplos de dichos oligonucleótidos adecuados para generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes e incluyen: (i) oligonucleótidos de extensión/fijación de diana directos e inversos de KrAS (iSx-232-KRS-T32, iSx-233-KRS-B33); (ii) oligonucleótidos de extensión/fijación de diana directos e inversos de BRAS (iSx-234-BRF-T34, iSx-235-BRF-B35); (iii) oligonucleótidos de extensión/fijación de diana directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-241-TP53e5-T41, iSx-242-TP53e5-B42, iSx-243-TP53e5-T43, iSx-244-TP53e5-B44); (iv) oligonucleótidos de extensión/fijación de diana directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-245-TP53e6-T45, iSx-246-TP53e6-B46);(v) oligonucleótidos de extensión/fijación de diana directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-247-TP53e7-T47, iSx-248-TP53e7-B48); y (vi) oligonucleótidos de extensión/fijación de diana directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-249-TP53e8-T49, iSx-250-TP53e8-B50). Los oligonucleótidos de extensión/fijación mencionados anteriormente pueden contener grupos tiofosfato opcionales en la 2a y 3a posición desde el extremo 5' para evitar la traducción de mellas y facilitar la circularización en dianas complementarias.
Nota 13: De forma alternativa, después de generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y los exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes, estas regiones se pueden someter a amplificación por círculo rodante usando cebadores específicos de la diana recién añadidos para generar productos de repetición en tándem. Estos productos se pueden generar antes o después de la captura de las dianas deseadas con oligonucleótidos específicos de la diana sobre un soporte sólido (véase la nota 8 a continuación). Los cebadores pueden contener una base nucleotídica escindible interna o un sitio abásico tal como 1',2'-didesoxirribosa (dSpacer), lo que permite la incorporación de dUTP durante la amplificación por círculo rodante para protección contra la contaminación por arrastre. Los ejemplos de dichos cebadores se muestran en la Tabla 1 a continuación e incluyen los siguientes: (i) cebadores directos e inversos de KRAS (iSx-108-KRS-rcF26, iSx-109-KRS-rcR27); (ii) cebadores directos e inversos de BRAF (iSx-118-BRF-rcF26, iSx-119-BRF-rcR27); (iii) cebadores directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-128-TP53e5-rcF66, iSx-129-TP53e5-rcR67; iSx-130-TP53e5-rcF68, iSx-131-TP53e5-rcR69); (iv) cebadores directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-138-TP53e6-rcF76, iSx-139-TP53e6-rcR77);(v) cebadores directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-148-TP53e7-rcF86, iSx-149-TP53e7-rcR87); y (vi) cebadores directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-158-TP53e8-rcF96, iSx-159-TP53e8-rcR97).
Nota 14: Después de generar los productos circulares que comprenden regiones diana de KRAS, BRAF y los exones 5-8 de TP53 que contienen mutaciones en puntos calientes, y/o generar productos de repetición en tándem, estos productos se pueden capturar mediante hibridación a oligonucleótidos más largos, que contienen un grupo de captura adecuado para la captura posterior sobre un soporte sólido. En la Tabla 1 a continuación se muestran ejemplos de dichos oligonucleótidos de captura, que contienen grupos biotina adecuados para la captura a través de superficies sólidas recubiertas con estreptavidina e incluyen los siguientes: (i) oligonucleótidos de captura directa e inversa de KRAS (iSx-013-KRS-bcF1, iSx-014-KRS-bcR2); (ii) oligonucleótidos de captura directos e inversos de BRAF (iSx-020-BRF-bcF1, iSx-021-BRF-bcR2); (iii) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 5 de TP53 (iSx-030-TP53e5-bcF1, iSx-031-TP53e5-bcR2; iSx-032-TP53e5-bcF3, iSx-033-TP53e5-bcR4); (iv) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 6 de TP53 (iSx-050-TP53e6-bcF5, iSx-051-TP53e6-bcR6);(v) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 7 de TP53 (iSx-060-TP53e7-bcF7, iSx-061-TP53e7-bcR8); y (vi) oligonucleótidos de captura directos e inversos del exón 8 de TP53 (iSx-070-TP53e8-bcF9, iSx-071-TP53e8-bcR10).
Nota 15: Con los productos antes mencionados generados usando los diseños de cebadores y conectores anteriores, después de la amplificación por agrupamiento o con microesferas, o la captura dentro de un pocillo, dirección o superficie de una cubeta de lectura en un instrumento comercial, se pueden usar los siguientes cebadores para iniciar reacciones de secuenciación: (i) iLx-003-PEsqP1, cebador de secuenciación de extremo emparejado 1; (ii) iLx-004-BrCdR1, cebador de indexación, lectura de código de barras 1; (iii) iLx-001-P5-BrCdR2, lectura de código de barras 2; y (iv) iLx-005-PEsqP2, cebador de secuenciación de extremo emparejado 2 (las secuencias de cebador se proporcionan en la Tabla 1 a continuación).
El enfoque descrito en la Figura 70 usó la fijación tanto de la sonda de oligonucleótido como de la diana que contiene el conector, dando como resultado productos de fijación interconectados circulares. Posteriormente se introduce una mella en el enlace escindible. Para secuencias repetitivas, el extremo 3' solo se puede extender usando solo 3 dNTP como se describe a continuación en la Variación 5.4 (véase, por ejemplo, la Figura 77).
Protocolo detallado para la cuantificación exacta de cambios en el número de copias específicos de tumor o la detección de mutaciones en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53) en el ADN aislado de las células tumorales circulantes o ADNlc:
5.4. a. Comenzando con ADNlc o ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC) (cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 a 4 °C agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Los conectores se pueden sintetizar con fosfato 5', o el fosfato se puede agregar usando cinasa T4. Opcionalmente, purificar el ADN diana del conector no fijado.
5.4. b. Desnaturalizar el ADN diana que contiene conectores en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de sondas de oligonucleótido (que comprenden una secuencia 5' complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, un sitio de unión a cebador opcional, una región espaciadora opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector y una secuencia 3' complementaria a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) de la diana), y permitir que las sondas de oligonucleótido hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). Las sondas de oligonucleótido pueden contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5'. La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa) y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y, para el ejemplo de repeticiones AGAT, solo los tres nucleótidos complementarios (es decir, dTTP, dCTP, dATP) se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que la secuencia del conector tenga un fosfato 5', KlenTaq extiende el extremo 3' hasta que esté directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 77). En el caso de que la secuencia del conector tenga un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 77). Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
5.4. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la captura específica de secuencia de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas, o para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, seguido de una captura potenciada de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector o la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: El conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota: 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tma EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana.
La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 5: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 6: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas. Nota 7: La captura de copias repetidas en tándem de la diana (generadas mediante amplificación por círculo rodante) proporciona la ventaja única de unión multivalente para potenciar la captura de la diana correcta. Esto permite usar condiciones de hibridación/captura más rigurosas, lo que da como resultado mayores eficacias de captura y menos captura de secuencias no deseadas. Este enfoque también se puede usar para capturar todas las dianas que contienen secuencias repetitivas (es decir, repetición de tetranucleótidos AGAt ), lo que permite evaluar la pérdida de heterocigosis, la variación en el número de copias, el haplotipado, el establecimiento de paternidad y otras aplicaciones.
Nota 8: El identificador de secuencia único garantiza que, incluso después de la amplificación por círculo rodante u otras etapas de selección/amplificación, cada secuencia diana original se pueda evaluar de manera única, lo que permite una cuantificación exacta del número de copias originales de cada diana. Para evitar problemas con la extensión por polimerasa y la traducción de mellas, el procedimiento se puede realizar sin una etapa de extensión por polimerasa, usando solo ligasa o ligasa combinada con la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, como se ilustra en la Figura 78 (v5.5). El truco consiste en agregar la secuencia de identificador único al conector.
Protocolo detallado para la cuantificación exacta de cambios en el número de copias específicos de tumor o la detección de mutaciones en genes conocidos (por ejemplo, Braf, K-ras, p53) en el ADN aislado de las células tumorales circulantes o ADNlc:
5.5. a. Comenzando con ADNlc o ADN genómico aislado de células tumorales circulantes (CTC) (cortado a aproximadamente 150 pb), reparar los extremos con polimerasa T4 y cinasa T4 y, posteriormente, añadir una protuberancia A en 3' de una sola base con Klenow (exo-) y dATP. Los conectores tienen una protuberancia T en 3' de una sola base, de modo que la fijación usando ligasa T4 a 4 °C agrega conectores en ambos extremos del fragmento. Los conectores contienen una secuencia de identificador único en el lado 5' monocatenario del conector, y se pueden sintetizar con fosfato 5', o el fosfato se puede agregar usando cinasa T4. Opcionalmente, purificar el ADN diana del conector no fijado y/o dNTP.
5.5. b. Desnaturalizar el ADN diana que contiene conectores en ambos extremos (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden una secuencia 5' complementaria a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) de la diana, una región espaciadora opcional, una secuencia complementaria al extremo 5' del conector, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional, una región espaciadora opcional, una secuencia complementaria al extremo 3' del conector y una secuencia de 3' complementaria a una porción única o repetitiva (es decir, repetición AGAT) de la diana, y directamente contiguo a, o con un solapamiento de una sola base o flap con, la secuencia 5' complementaria a la diana) y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5'. Opcionalmente, la polimerasa Taq y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que la secuencia del conector tiene un fosfato 5', el conector 3' está directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 78). En el caso de que la secuencia del conector tenga un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde el flap o base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 78). Permitir la escisión del flap opcional y la fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la fijación, para generar productos circulares.
5.5. c. Opcionalmente, escindir la sonda de oligonucleótido en un enlace escindible (por ejemplo, U escindido usando UDG y endonucleasa AP). Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la captura específica de secuencia de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas, o para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, seguido de una captura potenciada de las dianas deseadas usando sondas biotiniladas. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia del conector o la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: El oligonucleótido puede contener un grupo bloqueante opcional en el lado 5' para interferir con la posterior actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa, de modo que la sonda de oligonucleótido no circularice. De forma alternativa, se puede incluir un enlace escindible en el oligonucleótido original.
Nota 2: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 3: La captura de copias repetidas en tándem de la diana (generadas mediante amplificación por círculo rodante) proporciona la ventaja única de unión multivalente para potenciar la captura de la diana correcta. Esto permite usar condiciones de hibridación/captura más rigurosas, lo que da como resultado mayores eficacias de captura y menos captura de secuencias no deseadas. Este enfoque también se puede usar para capturar todas las dianas que contienen secuencias repetitivas (es decir, repetición de tetranucleótidos AGAt ), lo que permite evaluar la pérdida de heterocigosis, la variación en el número de copias, el haplotipado, el establecimiento de paternidad y otras aplicaciones.
Nota 4: El identificador de secuencia único garantiza que, incluso después de la amplificación por círculo rodante u otras etapas de selección/amplificación, cada secuencia diana original se pueda evaluar de manera única, lo que permite una cuantificación exacta del número de copias originales de cada diana. Ejemplo profético 6: Cuantificación exacta de ARNm específico de tumor o ARNInc aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes (por ejemplo, una decena de marcadores de expresión que predicen el resultado o guían el tratamiento).
Los cambios en la expresión de ARNm específico de tumor o ARNlnc son una potente herramienta para clasificar el estado de la enfermedad de una manera histoespecífica. Esto incluye la detección y cuantificación exactas de exones específicos de ARNm o ARNlnc (véanse, por ejemplo, las Figuras 108, 111, 112) o la detección y cuantificación de fusiones de genes recurrentes presentes en ARNm (véanse, por ejemplo, las Figuras 109 y 110). El ARNm total o poli-A o el ARNlnc poli-A se aíslan de exosomas o de células tumorales circulantes y se convierten en ADNc usando retrotranscriptasa para su uso en el procedimiento. Los ADNc se generan mediante el uso de cebadores específicos de exones usando reglas de diseño estándar para obtener la máxima especificidad de las regiones, que en general abarca los límites exón-intrón de un transcrito específico. De forma alternativa, se puede usar el cebado aleatorio de hexámeros para copiar todo el transcriptoma, o se pueden usar cebadores poli-dT para enriquecer los extremos 3' de todos los transcritos.
Los oligonucleótidos que contienen secuencias complementarias a regiones contiguas pero separadas hibridan con las dianas de ADNc. Las Figuras 108 y 112 muestran un procedimiento de detección y cuantificación de exones que usa un hueco (es decir, 10-20 nucleótidos) entre los oligonucleótidos 5' y 3' en el que se usa la polimerasa para extender los extremos 3' de las secuencias de unión a diana para copiar parte de la secuencia de la diana y cerrar el hueco para generar un punto de unión apto para fijación adecuado para la fijación posterior para formar un producto circular. En un modo de realización, el hueco entre los extremos 5' y 3' de las sondas de oligonucleótido es de 10-20 nucleótidos. Sin embargo, el hueco que se va a copiar se puede adaptar a la longitud de lectura usada en la etapa de secuenciación posterior. La Figura 111 muestra un procedimiento de detección y cuantificación de exones en el que las dos secuencias de unión a diana están inmediatamente contiguas entre sí y no existe ningún hueco.
La enumeración de estos círculos informadores se puede llevar a cabo mediante una variedad de procedimientos cuantitativos que incluyen, pero sin limitarse a, la secuenciación de nueva generación. Además de permitir la detección múltiple simultánea de numerosas secuencias diana mediante la formación de círculos, la secuenciación de nueva generación, a medida que la lectura progresa, proporciona información adicional (dos identificadores únicos) sobre los círculos informadores que distingue fácilmente los productos de fijación legítimos de los artefactos de fijación, aumentando de ese modo la sensibilidad del ensayo.
Las Figuras 109 y 110 describen dos variantes para la detección y cuantificación de fusiones de genes recurrentes encontradas en ARNm. Dado que los puntos de unión de fusión de dos genes se producen de manera imprecisa con la deleción de secuencia de cientos a miles de bases de longitud entre los dos extremos 5' de un gen y el extremo 3' del otro gen, sería difícil diseñar un ensayo que contenga decenas de pares de sondas en dirección 5' y en dirección 3' del punto de unión de fusión indeterminado, de modo que el procedimiento descrito en el presente documento utiliza dos sondas de oligonucleótido semicirculares que tienen cada una un extremo en un exón en dirección 5' y el otro extremo en un exón en dirección 3'. La fijación para formar un único producto circular solo se puede producir después de la hibridación de ambas sondas (cuatro extremos) contiguas con un hueco entre ellas, o inmediatamente contiguas entre sí en la diana de ADNc. La posterior digestión de las sondas de oligonucleótido no fijadas (usando exonucleasas) deja un producto circular que en una variación (véase, por ejemplo, la Figura 109) no contiene información de secuencia adicional (sin hueco) del ADNc diana original. En otra variación (véase, por ejemplo, la Figura 110), la polimerasa extiende los extremos 3' de cada una de las sondas cerrando el hueco hasta que encuentra cada uno de los extremos 5' de las sondas cercanas. Estos dos círculos informadores contienen una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y uno de ellos contiene un sitio de unión a cebador opcional. La enumeración de estos círculos informadores se puede llevar a cabo mediante una variedad de procedimientos cuantitativos que incluyen, pero sin limitarse a, la secuenciación de nueva generación. Además de permitir la detección múltiple simultánea de numerosos transcritos de fusión, la secuenciación de nueva generación proporciona información adicional (dos copias de identificadores únicos) sobre los círculos informadores que distingue fácilmente los productos de fijación legítimos de los artefactos de fijación. Cada una de las dos variaciones (Figuras 109 y 110) muestra también dos enfoques para la generación de extremos 5' aptos para fijación. O bien las sondas poseen fosfatos 5' antes de la hibridación (lado izquierdo de las figuras) o usan la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq para escindir el flap o base complementaria solapante en 5', generando un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de las figuras).
Protocolo detallado para la detección y cuantificación de exones en ARNm o ARNInc aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes. Variación 6.1 (véase, por ejemplo, la Figura 108). 6.1.a Comenzando con ARNm total o poli-A o ARNlnc poli-A aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes, generar ADNc mediante el uso de retrotranscriptasa y cebadores específicos de exones.
6.1. b. Desnaturalizar el ADNc diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden una región de sonda 5' complementaria a una porción del ADNc hacia el lado 5', una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una región de sonda 3' complementaria a otra porción del ADNc hacia el lado 3'), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40-50 °C durante 30 min). Los oligonucleótidos pueden contener un grupo fosfato opcional en el extremo 5' o un flap o base complementaria solapante en 5'. Opcionalmente, la polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa) y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y opcionalmente los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que los oligonucleótidos tengan un fosfato 5' directamente contiguo al 3'-OH en el punto de unión, los dos extremos se pueden unir directamente usando ligasa (lado derecho de la Figura 108). En el caso de que los oligonucleótidos tengan un fosfato 5' con un hueco entre los extremos 5' y 3', el 3'-OH se extiende con KlenTaq. En el caso de que los oligonucleótidos tengan un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa Taq escinde el flap o base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 108). Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
6.1. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia de un tramo corto del ADNc diana original, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 2: El extremo 5' del cebador de oligonucleótido se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota: 3: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tma EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 5: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas. Nota 6: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 7: La retrotranscriptasa MMLV se puede genomanipular para sintetizar ADNc a 50-60 °C a partir del ARN entrante total (Invitrogen Superscript III). De forma alternativa, las ADN polimerasas Tth o Tma se han genomanipulado para mejorar su actividad retrotranscriptasa (puede requerir la adición de cofactor Mn). Finalmente, la ADN polimerasa termófila PyroPhage 3173 tiene actividad de desplazamiento de hebra y de retrotranscripción, y también se puede usar.
Protocolo detallado para la detección y cuantificación de fusiones de genes en ARNm aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes. Variación 6.2 (véase, por ejemplo, la Figura 109). 6.2.a. El ARNm aislado de exosomas o CTC se convierte primero en ADNc mediante una retrotranscriptasa de tal manera que abarque los puntos de unión de cualquier posible transcrito de fusión. En el procedimiento preferente se usan cebadores específicos de exones.
6.2. b. Desnaturalizar el ADNc diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de dos oligonucleótidos (el primero comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #1, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #2 y el segundo comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #2, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #1), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). Una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D), y opcionalmente la polimerasa Taq y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un fosfato 5', no se requiere polimerasa (lado izquierdo de la Figura 109). En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 109). Permitir la escisión del flap y la fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la escisión del flap y la fijación, para generar productos circulares.
6.2. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 2: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 3: En los sistemas que usan dos sondas de oligonucleótido puente, cada una de las cuales contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional, se recomienda que solo uno y no ambos oligonucleótidos contengan un sitio de unión a cebador (ya sea el oligonucleótido en dirección 5' o en dirección 3'). Para un nivel adicional de detección de falsos positivos, se recomienda que la secuencia del identificador único sea diferente en las sondas en dirección 5' y en dirección 3'.
Nota 4: La retrotranscriptasa MMLV se puede genomanipular para sintetizar ADNc a 50-60 °C a partir del ARN entrante total (Invitrogen Superscript III). De forma alternativa, las ADN polimerasas Tth o Tima se han genomanipulado para mejorar su actividad retrotranscriptasa (puede requerir la adición de cofactor Mn). Finalmente, la ADN polimerasa termófila PyroPhage 3173 tiene actividad de desplazamiento de hebra y de retrotranscripción, y también se puede usar.
Protocolo detallado para otra variación para la detección y cuantificación de fusiones de genes en ARNm aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes.
Variación 6.3 (véase, por ejemplo, la Figura 110). 6.3.a. El ARNm aislado de exosomas o CTC se convierte primero en ADNc mediante una retrotranscriptasa de tal manera que abarque los puntos de unión de cualquier posible transcrito de fusión. En el procedimiento preferente se usan cebadores específicos de exones.
6.3. b. Desnaturalizar el ADNc diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de dos oligonucleótidos (el primero comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #1, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #2 y el segundo comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #2, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #1), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótidos tengan un fosfato 5', KlenTaq extiende el extremo 3' hasta que esté directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 110). En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 110). Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
6.3. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 2: El extremo 5' del cebador de oligonucleótido se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota: 3: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tma EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 5: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas. Nota 6: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 7: En los sistemas que usan dos sondas de oligonucleótido puente, cada una de las cuales contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional, se recomienda que solo uno y no ambos oligonucleótidos contengan un sitio de unión a cebador (ya sea el oligonucleótido en dirección 5' o en dirección 3'). Para un nivel adicional de detección de falsos positivos, se recomienda que la secuencia del identificador único sea diferente en las sondas en dirección 5' y en dirección 3'.
Nota 8: La retrotranscriptasa MMLV se puede genomanipular para sintetizar ADNc a 50-60 °C a partir del ARN entrante total (Invitrogen Superscript III). De forma alternativa, las ADN polimerasas Tth o Tma se han genomanipulado para mejorar su actividad retrotranscriptasa (puede requerir la adición de cofactor Mn). Finalmente, la ADN polimerasa termófila PyroPhage 3173 tiene actividad de desplazamiento de hebra y de retrotranscripción, y también se puede usar.
Protocolo detallado para la detección y cuantificación de ARNm que contiene exones específicos (que pueden no ser contiguos entre sí) en ARNm aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes.
Variación 6.4 (véase, por ejemplo, la Figura 111). 6.4.a. El ARNm aislado de exosomas o CTC se convierte primero en ADNc mediante una retrotranscriptasa de tal manera que incluya ambas regiones de exón. En el procedimiento preferente se usan cebadores específicos de exones.
6.4. b. Desnaturalizar el ADNc diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de dos oligonucleótidos (el primero comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #1, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #2 y el segundo comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #2, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #1), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). Una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D), y opcionalmente la polimerasa Taq y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un fosfato 5', no se requiere polimerasa (lado izquierdo de la Figura 111). En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 111). Permitir la escisión del flap y la fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la escisión del flap y la fijación, para generar productos circulares.
6.4. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 2: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 3: En los sistemas que usan dos sondas de oligonucleótido puente, cada una de las cuales contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional, se recomienda que solo uno y no ambos oligonucleótidos contengan un sitio de unión a cebador (ya sea el oligonucleótido en dirección 5' o en dirección 3'). Para un nivel adicional de detección de falsos positivos, se recomienda que la secuencia del identificador único sea diferente en las sondas en dirección 5' y en dirección 3'.
Nota 4: La retrotranscriptasa MMLV se puede genomanipular para sintetizar ADNc a 50-60 °C a partir del ARN entrante total (Invitrogen Superscript III). De forma alternativa, las ADN polimerasas Tth o Tima se han genomanipulado para mejorar su actividad retrotranscriptasa (puede requerir la adición de cofactor Mn). Finalmente, la ADN polimerasa termófila PyroPhage 3173 tiene actividad de desplazamiento de hebra y de retrotranscripción, y también se puede usar.
Protocolo detallado para la detección y cuantificación de ARNm que contiene exones específicos (que pueden no ser contiguos entre sí) en ARNm aislado de exosomas, células tumorales circulantes o glóbulos sanguíneos totales que incluyen células tumorales circulantes.
Variación 6.5 (véase, por ejemplo, la Figura 112). 6.5.a. El ARNm aislado de exosomas o CTC se convierte primero en ADNc mediante una retrotranscriptasa de tal manera que incluya ambas regiones de exón. En el procedimiento preferente se usan cebadores específicos de exones.
6.5. b. Desnaturalizar el ADNc diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de dos oligonucleótidos (el primero comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #1, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #2 y el segundo comprende una secuencia 5' complementaria a una porción única del exón diana #2, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y una secuencia 3' complementaria a una porción única del exón diana #1), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótidos tengan un fosfato 5', KlenTaq extiende el extremo 3' hasta que esté directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 112). En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 112). Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
6.5. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Se puede usar la nucleasa Fen en lugar de la polimerasa con actividad nucleasa 5'->3' para generar el fosfato 5' apto para fijación en el lado 5' de la diana.
Nota 2: El extremo 5' del cebador de oligonucleótido se puede sintetizar para contener enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'-fosfato (que se liberarán por la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa). Para minimizar el desplazamiento de la polimerasa de esas bases, ya que extiende una base en exceso (lo que haría imposible la fijación al cebador en dirección 3'), las bases de la diana en el punto de unión para fijación serían preferentemente ricas en AT en el lado 3' y ricas en GC en el lado 5'.
Nota: 3: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un sitio apurínico (AP) en la posición contigua al fosfato 5' deseado. Este fosfato 5' se libera usando una EndoIII termoestable (como Tma EndoIII). Esta enzima escinde los sitios AP, dejando un fosfato 5' cuando el cebador está unido a la diana. La endonucleasa también escinde el cebador monocatenario, pero con menor eficacia y, por tanto, el cebador hibridado al molde sería el sustrato preferente.
Nota 4: Cuando se usa la polimerasa KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3'), el conector del extremo 5' se puede sintetizar para contener un fosfato 5'. De forma alternativa, el fosfato 5' se puede añadir usando cinasa T4 antes de la fijación al ADN diana o después de ese etapa de fijación.
Nota 5: Se puede usar una mezcla 1:20 de polimerasa Taq (con actividad nucleasa 5'->3') y KlenTaq (polimerasa Taq sin actividad de escisión por nucleasa 5'->3') en condiciones de extensión distributiva (es decir, mayor concentración de sal) para minimizar degradación del ADN diana por traducción de mellas. Nota 6: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otro procedimiento de detección. Nota 7: En los sistemas que usan dos sondas de oligonucleótido puente, cada una de las cuales contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional, se recomienda que solo uno y no ambos oligonucleótidos contengan un sitio de unión a cebador (ya sea el oligonucleótido en dirección 5' o en dirección 3'). Para un nivel adicional de detección de falsos positivos, se recomienda que la secuencia del identificador único sea diferente en las sondas en dirección 5' y en dirección 3'.
Nota 8: La retrotranscriptasa MMLV se puede genomanipular para sintetizar ADNc a 50-60 °C a partir del ARN entrante total (Invitrogen Superscript III). De forma alternativa, las ADN polimerasas Tth o Tma se han genomanipulado para mejorar su actividad retrotranscriptasa (puede requerir la adición de cofactor Mn). Finalmente, la ADN polimerasa termófila PyroPhage 3173 tiene actividad de desplazamiento de hebra y de retrotranscripción, y también se puede usar.
Ejemplo profético 7: Cuantificación exacta de miARN específico de tumor aislado de exosomas o proteínas Argonaut (por ejemplo, una decena de marcadores de microARN que predicen el resultado o guían el tratamiento).
El microARN (miARN) se ha identificado como potenciales marcadores histoespecíficos de la presencia de tumores, su clasificación y pronóstico. Los miARN existen en suero y plasma como complejos con proteínas Ago2 o mediante encapsulación como exosomas.
Las Figuras 114 -117 describen procedimientos para capturar secuencias de miARN para su posterior enumeración mediante secuenciación de alta exactitud. En todos los procedimientos mostrados, el procedimiento implica preparar una copia de ADNc de la secuencia de miARN diana que se convierte en un ADN circular adecuado.
Protocolo detallado para la captura, identificación y cuantificación de todas las especies de miARN que están presentes en suero, plasma o exosomas sin ninguna selección:
Variación 7.1 (véase, por ejemplo, la Figura 114). 7.1.a. Aislar el miARN de los exosomas o CTC. Fijar un conector universal al extremo 3' del miARN usando un conector de ADN con un fosfato 5' y un extremo 3' bloqueado usando ARN ligasa 1.
7.1. b. Fosforilar el extremo 5' del miARN modificado con cinasa T4. Fijar un conector universal al extremo 5' del conector modificado usando un conector de ADN con un fosfato 5' y un extremo 3' bloqueado.
7.1. c. Después de la eliminación del exceso de conectores, desnaturalizar los ácidos nucleicos (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden secuencias complementarias a los extremos 5' y 3' de los conectores, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional, y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40-50 °C durante 30 min). Añadir una retrotranscriptasa que carece de actividad 5'->3' (es decir, ADN polimerasa Tth usando cofactor Mn2+), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP; los componentes se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
7.1. d. Añadir UDG y endonucleasa AP para mellar el miARN en la diana original; a continuación, añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del miARN diana original, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), el ADN circular sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otros procedimientos de detección.
Las siguientes variantes del procedimiento (véanse, por ejemplo, las Figuras 115 - 117) están diseñadas para la captura de secuencias de miARN específicas de miARN total aislado de suero, plasma o exosomas. Estos procedimientos hacen uso de sondas de captura complementarias a todas o parte de las secuencias de miARN diana, pero posteriormente preparan copias de ADNc de la secuencia de miARN original y, por tanto, son capaces de detectar variaciones de una sola base en el miARN o de captura debido a una mala hibridación.
Protocolo detallado para la captura, identificación y cuantificación de especies específicas de miARN que están presentes en suero, plasma o exosomas sin ninguna selección:
Variación 7.2 (véase, por ejemplo, la Figura 115). 7.2.a. Aislar el miARN de los exosomas o CTC. Fosforilar el miARN aislado usando cinasa T4. Hibridar pares de oligonucleótidos, el primero de los cuales comprende una secuencia complementaria a la diana de miARN, flanqueada por secuencias de los conectores 5' y 3' únicos, mientras que el segundo oligonucleótido comprende un extremo fosforilado en 5' seguido del complemento del conector 3' único, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y un complemento del conector 5' único, siendo la última base una base de ribonucleótido. La ARN ligasa T4 2 está presente para sellar covalentemente los extremos del miARN creando productos de fijación circular.
7.2. b. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los oligonucleótidos no fijados, dejando solo las quimeras de miARN y ADN circulares monocatenarias deseadas. Inactivar con calor las exonucleasas a 80 °C durante 20 minutos.
7.2. c. Añadir un cebador universal fosforilado en 5' a los productos circulares, hibridar a 37 °C. Añadir una retrotranscriptasa que carece de actividad exonucleasa 5'->3' (es decir, ADN polimerasa Tth usando cofactor Mn2+), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP; los componentes se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares que ahora contienen una copia del miARN diana original.
7.2. d. Añadir UDG y endonucleasa AP para mellar el miARN en la diana original; a continuación, añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del miARN diana original, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), el ADN circular sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otros procedimientos de detección.
La siguiente variación del procedimiento hace uso de un espaciador C6 o C18 que permite copiar el miARN diana pero evita completar un producto circular y, por tanto, elimina la detección de falsos positivos de niveles bajos del miARN deseado. La traducción de mellas de un cebador universal que contiene tiofosfatos en la 2a y 3a posición con respecto al extremo 5' no es capaz de intercalar el espaciador C6 o C18 en el medio de la secuencia del complemento de unión a miARN diana que permite la destrucción de cualquier sonda de miARN no fijada.
Protocolo detallado para la captura, identificación y cuantificación de especies específicas de miARN que están presentes en suero, plasma o exosomas sin ninguna selección:
Variación 7.3 (véase, por ejemplo, la Figura 116). 7.3.a. Aislar el miARN de los exosomas o CTC. Fosforilar el miARN aislado usando cinasa T4. Hibridar pares de oligonucleótidos, el primero de los cuales comprende una secuencia complementaria a la diana de miARN que contiene un único espaciador C6 o C18, flanqueada por secuencias de los conectores 5' y 3' únicos, mientras que el segundo oligonucleótido comprende un extremo fosforilado en 5' seguido del complemento del conector 3' único, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y un complemento del conector 5' único, siendo la última base una base de ribonucleótido. En la mezcla de hibridación también está presente un cebador universal que contiene enlaces tiofosfato en la 2a y 3a posición desde el extremo 5'. La ARN ligasa T42 está presente para sellar covalentemente los extremos del miARN creando productos de fijación circular.
7.3. b. Añadir una retrotranscriptasa que posee una actividad exonucleasa 5'->3' (ADN polimerasa Tth usando cofactor Mn2+) y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP; los componentes se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares que ahora contienen una copia del miARN diana original.
7.3. c. Añadir UDG y endonucleasa AP para mellar el miARN en la diana original; a continuación, añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia del miARN diana original, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para la amplificación por círculo rodante (usando un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador con la polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada. Esto puede ir seguido de la identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación, o de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador opcional como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), el ADN circular sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otros procedimientos de detección.
Otra variante (Figura 117) aprovecha una sonda de captura de tallo-bucle complementaria a alguna porción del miARN diana. El protocolo detallado es como se describe a continuación:
Protocolo detallado para la captura, identificación y cuantificación de especies específicas de miARN que están presentes en suero, plasma o exosomas sin ninguna selección:
Variación 7.4 (véase, por ejemplo, la Figura 117). 7.4.a. Aislar el miARN de los exosomas o CTC. Hibridar una sonda de tallo-bucle compuesta del extremo 5' que forma un tallo-bucle, una región 3' sobresaliente complementaria a alguna porción del miARN diana. La porción de bucle contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y un enlace escindible opcional. Extender el extremo 3' de la sonda de tallo-bucle con una retrotranscriptasa y los dNTP.
7.4. b. Desnaturalizar los ácidos nucleicos (94 °C, 1 minuto) en presencia de oligonucleótidos (que comprenden secuencias complementarias a la secuencia 5'-tallo-bucle y los extremos 3' del ADNc extendido; además, el extremo 5' está bloqueado para evitar la traducción de mellas) y permite que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 40-50 °C durante 30 min).
7.4. c. Añadir KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa) y una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP; los componentes se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. KlenTaq extiende el extremo 3' hasta que esté directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación. Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
7.4. d. Escindir la sonda de oligonucleótido en un enlace escindible (por ejemplo, U escindido usando UDG y endonucleasa AP). Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados y las sondas en exceso, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende una copia de un tramo corto del ADNc diana original, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Si los oligonucleótidos también comprenden sitios de unión a cebador opcionales (es decir, sitios de unión a cebador universales), el ADN circular sería adecuado para la amplificación por PCR, seguido de la identificación posterior de las dianas mediante secuenciación de nueva generación, ensayos TaqMan, ensayos UniTaq, ensayos de PCR en tiempo real, micromatriz de PCR digital, hibridación u otros procedimientos de detección.
Ejemplo profético 8: Necesidad clínica en diagnóstico prenatal de una muestra de plasma materno.
En el campo de la atención prenatal existe una necesidad urgente de desarrollar ensayos no invasivos para aneuploidías comunes, tales como trisomía 21, 18 o 13, pequeñas deleciones tales como las derivadas de deleciones en el gen de la distrofia muscular de Duchenne (d Md ), otras pequeñas anomalías en el número de copias tales como las responsables del autismo, translocaciones equilibradas para determinar potenciales manifestaciones clínicas, cambios en la metilación que pueden dar como resultado enfermedades asociadas con impronta genómica tales como el síndrome de Angelman o el síndrome de Prader-Willi, cambios en repeticiones triples responsables de enfermedades tales como la enfermedad de Huntington, mutaciones puntuales tales como las del gen CFTR responsable de la fibrosis quística.
Visión general: Un trabajo reciente ha demostrado que el ADN fetal como porcentaje del ADN materno en el plasma es de aproximadamente un 6 %, un 20 % y un 26 % en el 1er, 2° y 3er trimestre, respectivamente. Debido a cómo se degrada el ADN, el ADN materno tiene en general aproximadamente 160 bases y sigue asociado con la histona HI, mientras que el ADN fetal tiene aproximadamente 14o bases y no está asociado con la histona. Dependiendo de la necesidad clínica, y donde el conocimiento proporcionará la mejor atención, se pueden desarrollar pruebas con suficiente sensibilidad para detectar el ADN fetal en el trimestre apropiado.
Existen aproximadamente 3.500 trastornos genéticos recesivos en los que se conoce el gen responsable. Los trastornos más comunes son el resultado de anomalías en el copiado del ADN, ya sea por un cromosoma adicional, tal como en la Trisomía 21, o por la eliminación de una porción de un gen, tal como en el gen de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Al considerar el cribado prenatal, es necesario sopesar la probabilidad de un trastorno genético vs. el riesgo del procedimiento. Actualmente, el procedimiento diagnóstico habitual recomienda la amniocentesis durante la semana 17 para mujeres embarazadas a partir de los 35 años, ya que el riesgo de Trisomía 21 o de otra aneuploidía cromosómica en 1 de cada 200 embarazos coincide ahora con el riesgo de aborto espontáneo después del procedimiento.
Al considerar el uso de los procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos descritos en el presente documento para el cribado prenatal, se recomiendan dos niveles de pruebas. Para el cribado de bajo coste de todos los embarazos para Trisomía 21, 13 y 18, los procedimientos de secuenciación divulgados en el presente documento se pueden usar para identificar rápidamente genes expresados diferencialmente en los cromosomas 21, 13 y 18, por ejemplo, identificar aquellos genes que están desactivados en el feto como consecuencia del silenciamiento de la metilación, pero están presentes en el adulto. Se identifican regiones similares en tres cromosomas de control, es decir, 2, 5, 7. Incluso cuando se aísla el ADN del suero de una madre en el primer trimestre, se puede calcular rápidamente el porcentaje de ADN que procede del feto comparando el ADN metilado con el no metilado entre las regiones cromosómicas de control; en el ejemplo del presente documento, sería de un 6 %. Si existe trisomía en cualquiera de los otros cromosomas, es decir, Trisomía 21, entonces los promotores de ese cromosoma mostrarán metilación en aproximadamente un 9 %; en otras palabras, un 50 % más que en el caso de la disomía normal. Se recomienda evaluar 1.000 equivalentes de genoma, de modo que un recuento de 90 copias metiladas para el caso de trisomía se distinga fácilmente de 60 copias metiladas para la muestra normal.
Como primera etapa en dicho procedimiento, para identificar aquellas regiones promotoras que están metiladas en el ADN fetal durante las primeras etapas de desarrollo, pero que nunca están metiladas en el ADN materno (es decir, WBC). Esto se debe realizar empíricamente, comparando el patrón de metilación del ADNlc aislado de mujeres embarazadas con un feto diploide, un feto que contiene una trisomía y sin embarazo. Para una revisión generalizada sobre el uso de marcadores epigenéticos para diagnóstico prenatal no invasivo, véase Patsalis et al., "A New Non-invasive Prenatal Diagnosis of Down syndrome through Epigenetic Markers and Real-time qPCR", Expert Opin Biol Ther. 12 Supl. 1:S155-61 (2012). Como ejemplo que detecta el estado de metilación en un único marcador PDE9A, véase Lim et al., "Non-invasive Epigenetic Detection of Fetal Trisomy 21 in First Trimester Maternal Plasma", PLoS One 6(11):e27709 (2011). Los enfoques descritos en el presente documento podrán identificar dichos marcadores mucho más rápidamente. Para identificar la metilación en sitios HinPlI contiguos en todo el genoma se utilizaría el enfoque explicado en la Figura 28. De forma alternativa, al centrarse en genes conocidos en los cromosomas seleccionados, se pueden diseñar sondas para regiones diana específicas y evaluar la metilación como en la Figura 27. Este enfoque también se utilizaría en la prueba de cribado prenatal final. Para sitios de metilación más abundantes, es decir, en sitios Acil contiguos entre sitios HaelII, en todo el genoma, se utilizaría el enfoque explicado en la Figura 36. Al centrarse en genes conocidos, se pueden diseñar sondas para regiones diana específicas y evaluar la metilación como en las Figuras 36, 37, 39 y 40. Si los enfoques anteriores no producen suficientes marcadores, se pueden identificar sitios de metilación en sitios AciI contiguos en todo el genoma utilizando el enfoque explicado en la Figura 33. Para estos sitios, se pueden usar los enfoques más dirigidos explicados en las Figuras 29 y 31.
De forma alternativa, existen ciertos genes que se activan durante el desarrollo fetal y que están desactivados en el tejido o la sangre de los adultos. En estas condiciones, sería importante identificar regiones promotoras no metiladas comparando el patrón de no metilación del ADNlc aislado de mujeres embarazadas con un feto diploide, un feto que contiene una trisomía y sin embarazo. Para identificar patrones de pérdida de metilación en todo el genoma, se pueden usar los procedimientos descritos en las Figuras 51, 57 o 62. Para identificar genes conocidos de no metilación en los cromosomas seleccionados, se pueden diseñar sondas para regiones diana específicas y evaluar la metilación como en las Figuras 53, 55, 58, 60,. Este enfoque también se utilizaría en la prueba de cribado prenatal final.
Además, el enfoque anterior podrá cuantificar con exactitud los cambios en la metilación en otras posiciones del genoma, que pueden dar como resultado enfermedades asociadas con la impronta genómica tales como el síndrome de Angelman o el síndrome de Prader-Willi. La capacidad de la presente divulgación para determinar el estado de metilación y al mismo tiempo determinar si la deleción está en el cromosoma paterno o materno por detección de SNP o polimorfismos de secuencia repetitiva (es decir, detección de SNP o polimorfismos de secuencia repetitiva identificadores maternos o paternos ubicados en cis en dirección 5' o 3') potenciará su discriminación diagnóstica de enfermedades de impronta genómica.
Recientemente se ha informado un enfoque basado en ligasa para contar fragmentos cromosómicos para el diagnóstico prenatal no invasivo denominado DANSR (Sparks et al., "Selective Analysis of Cell-free DNA in Maternal Blood for Evaluation of Fetal Trisomy", Prenat Diagn. 32(1):3-9 (2012)). Este enfoque se basa en el uso de 3 fragmentos en una reacción de fijación en el brazo cromosómico: un fragmento izquierdo que contiene una secuencia universal en dirección 5', un fragmento intermedio y un fragmento derecho que contiene una secuencia universal en dirección 3'. Después de una reacción de fijación, los productos se separan de los cebadores entrantes, se amplifican por PCR y se secuencian. Las fijaciones espurias (es decir, en dirección 5' directamente al cebador en dirección 3' incorrecto, sin fragmento intermedio) se distinguen fácilmente por secuenciación y fueron inferiores al 5 %. La presente divulgación también puede usar este enfoque, ya sea capturando dianas específicas de los productos fijados de todo el genoma, como se describe en las Figuras 63-69, o usando sondas específicas de dianas durante el acontecimiento de fijación inicial, como se describe en las Figuras 13-26 o las Figuras 70-78. Dado que el enfoque anterior depende del recuento de las regiones cromosómicas, la exactitud de la técnica se puede mejorar aprovechando los polimorfismos en dichas regiones. Las Figuras 70, 77 y 78 describen un conjunto de técnicas para capturar fragmentos que contienen polimorfismos de secuencia repetitiva. Estos polimorfismos permitirán identificar las diferencias en el número de copias, ya sea en todo el genoma o en lugares definidos, ya sea para ganancias o pérdidas de copias; esto también es relevante para el análisis del genoma del cáncer. La trisomía se puede derivar de la no disyunción durante la meiosis inicial o durante la segunda meiosis. Tomemos el caso de la espermatogénesis. Si la no disyunción ocurre en la primera división meiótica, entonces los cromosomas homólogos se mueven al mismo polo durante la anafase. Cuando estos se dividen a continuación para formar gametos, dos serán disómicos (que contienen 1 de cada uno de los cromosomas originales) y dos serán nulosómicos. Si estos gametos fertilizan un ovocito euploide, los cigotos resultantes serían 2 trisómicos (1 1 1) y dos monosómicos. Si, por otra parte, la no disyunción ocurre en la segunda división meiótica, entonces las cromátidas hermanas se mueven al mismo polo durante la anafase. Cuando estas se dividen a continuación para formar gametos, una será disómica (que contiene 2 de los mismos cromosomas parentales) y una será nulosómica, y dos serán euploides (1 cromosoma cada uno). Si estos gametos fertilizan un ovocito euploide, los cigotos resultantes serían 1 trisómico (2 1), y uno monosómico, y dos euploides (disómicos). Lo mismo ocurre para los cromosomas maternos. Por lo tanto, un feto con trisomía puede tener varias combinaciones diferentes de cromosomas paternos y maternos.
El ejemplo de 1.000 equivalentes de genoma para el ADN materno y 100 equivalentes de genoma para el ADN fetal se puede usar para ilustrar la diferencia en la distinción al evaluar la presencia de copias frente a la presencia de polimorfismos. Cuando se utilizan marcadores altamente polimórficos, tales como las repeticiones de tetranucleótidos, no es inusual que 3 o los 4 polimorfismos sean diferentes. Los resultados se compararán con estos casos, donde los marcadores para el cromosoma materno o paterno son iguales o diferentes. El cromosoma 2 se usará como control y el 21 como ejemplo para la trisomía.
Caso 1 (solo número de copias)
Maternos Feto Total
Crom 2 2.000 200 2.200
Crom 21 2.000 300 2.300
Caso 2 (marcadores maternos homocigóticos, no disyunción materna, primera meiosis) Maternos Feto Total
Crom 2M1 1.000 0
Crom 2M2 1.000 100 2.100*
Crom 2P1 0 100 100
Crom 2P2 0 0 0
Crom 21M1 1.000 100
Crom 21M2 1.000 100 2.200* Crom 21P1 0 100 100
Crom 21P2 0 0 0
* Nota: Dado que los alelos 2M1 y 2M2 son iguales, total = 2.100. Asimismo, dado que los alelos 21M1 y 21M2 son iguales, total = 2.200. Los alelos paternos pueden ser heterocigóticos u homocigóticos.
Caso 3 (marcadores maternos homocigóticos, no disyunción materna, segunda meiosis)
Maternos Feto Total
Crom 2M1 1.000 0 Crom 2M2 1.000 100 2.100* Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 Crom 21M2 1.000 200 2.200* Crom 21P1 0 100 100 Crom 21P2 0 0 0 * Nota: Dado que los alelos 2M1 y 2M2 son iguales, total = 2.100. Asimismo, dado que los alelos 21M1 y 21M2 son iguales, total = 2.200. Los alelos paternos pueden ser heterocigóticos u homocigóticos.
Caso 4 (marcadores maternos heterocigóticos, no disyunción materna, primera meiosis)
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 100 1.100 Crom 21M2 1.000 100 1.100 Crom 21P1 0 100 100 Crom 21P2 0 0 0 Caso 5 (marcadores maternos heterocigóticos, no disyunción materna, segunda meiosis)
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 1.000 Crom 21M2 1.000 200* 1.200 Crom 21P1 0 100 100 Crom 21P2 0 0 0 * Nota: Existe una combinación adicional de trisomía en la que hay 2 copias del alelo 21M1 en el ovocito fertilizado.
Caso 6 (marcadores maternos homocigóticos, no disyunción paterna, primera meiosis)
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0
Crom 2M2 1.000 100 2.100* Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0
Crom 21M1 1.000 0
Crom 21M2 1.000 100 2.100* Crom 21P1 0 100 100 Crom 21P2 0 100 100
* Nota: Dado que los alelos 2M1 y 2M2 son iguales, total = 2.100. Asimismo, dado que los alelos 21M1 y 21M2 son iguales, total = 2.100. Los alelos paternos pueden ser heterocigóticos u homocigóticos.
Caso 7 (marcadores maternos homocigóticos, no disyunción paterna, segunda meiosis)
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 Crom 2M2 1.000 100 2.100* Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 Crom 21M2 1.000 100 2.100* Crom 21P1 0 200 200 Crom 21P2 0 0 0 * Nota: Dado que los alelos 2M1 y 2M2 son iguales, total = 2.100. Asimismo, dado que los alelos 21M1 y 21M2 son iguales, total = 2.100. Los alelos paternos pueden ser heterocigóticos u homocigóticos.
Caso 8 (marcadores maternos heterocigóticos, no disyunción paterna, primera meiosis)
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 1.000 Crom 21M2 1.000 100 1.100 Crom 21P1 0 100 100 Crom 21P2 0 100 100
Caso 9 (marcadores maternos heterocigóticos, no disyunción paterna, segunda meiosis)
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 1.000 Crom 21M2 1.000 100 1.100 Crom 21P1 0 200 200 Crom 21P2 0 0 0 * Nota: Existe una combinación adicional de trisomía en la que hay 2 copias del alelo 21P2 en el ovocito fertilizado.
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 1.000 Crom 21M2 1.000 100 1.100 Crom 21P1 0 200 200 Crom 21P2 0 0 0 * Nota: Existe una combinación adicional de trisomía en la que hay 2 copias del alelo 21P2 en el ovocito fertilizado.
Maternos Feto Total Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom 21M1 1.000 0 1.000 Crom 21M2 1.000 100 1.100 Crom 21P1 0 200 200 Crom 21P2 0 0 0 * Nota: Existe una combinación adicional de trisomía en la que hay 2 copias del alelo 21P2 en el ovocito fertilizado.
A partir de este análisis, está claro que para distinguir la trisomía, los marcadores más útiles son aquellos en los que los loci maternos son polimórficos y los loci paternos son diferentes de ambos alelos maternos. Los loci paternos no necesitan ser polimórficos. Para las deleciones ligadas al cromosoma X, tales como las que se encuentran en la distrofia muscular de Duchenne, el enfoque es más simple, ya que la enfermedad se manifiesta principalmente en niños varones. Nuevamente, comparar el cromosoma 2 con el cromosoma X en el área de la deleción daría como resultado:
Caso 10 (marcadores maternos heterocigóticos, deleción ligada al cromosoma X hereditaria) Maternos Feto Total
Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom XM1 1.000 0 1.000 Crom XM2 0* 0* 0 Crom XP1 0 0 0 Crom YP2 0 100 100 * Nota: deleción de región hereditaria
Caso 11 (marcadores maternos heterocigóticos, el feto no contiene deleción ligada al cromosoma X)
Maternos Feto Total
Crom 2M1 1.000 0 1.000 Crom 2M2 1.000 100 1.100 Crom 2P1 0 100 100 Crom 2P2 0 0 0 Crom XM1 1.000 100 1.100 Crom XM2 0* 0* 0 Crom XP1 0 0 0 Crom YP2 0 100 100 * Nota: deleción de región hereditaria
El caso 10 muestra la distrofia muscular de Duchenne hereditaria, donde la madre es portadora. En estas condiciones, el porcentaje de la cantidad total de dos alelos del cromosoma X parece ser la mitad del de otras posiciones. En el caso 11, el feto no tiene la enfermedad, y en el caso 12 la enfermedad es una mutación esporádica que aparece en el feto. El marcador del cromosoma Y confirma que el feto es varón. Lo anterior muestra cómo se realizaría el genotipado en el locus DMD. Si existe conocimiento previo de que la madre es portadora, entonces se puede determinar la sincronización de la deleción con polimorfismos vecinos (véase a continuación) y, a continuación, estos polimorfismos vecinos también se pueden usar para verificar si el feto también lleva la deleción, y si el feto es varón y susceptible a la enfermedad. Este enfoque se puede usar para encontrar cambios dominantes ligados al cromosoma X y autosómicos.
Para determinar si el feto contiene una mutación hereditaria o esporádica en uno de los otros aproximadamente 3.500 trastornos, que incluyen deleciones, mutaciones puntuales o metilación anómala, se recomendaría un análisis más sofisticado. El análisis de secuencia determina fácilmente la presencia del alelo recesivo en ambos padres. Si la mutación es diferente en los padres, es posible determinar si el niño es un heterocigoto compuesto para la enfermedad evaluando el ADN libre circulante del suero materno. Para obtener la respuesta completa del análisis del ADN fetal en el suero materno este ensayo puede requerir dos partes. La primera es establecer la fase para los SNP o polimorfismos maternos en regiones repetidas que rodean el gen de la enfermedad. Esto se puede lograr aislando el ADN de alto peso molecular de los glóbulos blancos de la madre o de la saliva del padre.
La determinación exacta de la fase o haplotipo se puede lograr mediante el uso de una variación de un enfoque desarrollado por Complete Genomics (véase Peters et al., "Accurate Whole-genome Sequencing and Haplotyping from 10 to 20 Human Cells", Nature 487(7406):190- 5 (2012)). Para la presente solicitud, el ADN de alto peso molecular se distribuye en placas de 96 o 384 pocillos de modo que exista menos de un cromosoma por pocillo. Posteriormente, se utiliza la amplificación del genoma completo para determinar qué pocillos contienen el cromosoma y, a continuación, se determina la fase de 96 SNP o polimorfismos de secuencia repetitiva vecinos al alelo de la enfermedad materna para el gen en cuestión. Una vez logrado esto, se evalúa la presencia del alelo de la enfermedad del padre (como se describe en el enfoque 4 anterior) y, usando la secuenciación, se verifica que el cromosoma que se hereda de la madre también contiene un alelo de la enfermedad. En el presente documento se describen múltiples enfoques para capturar secuencias repetitivas de ADN en todo el genoma, que se pueden usar para identificar polimorfismos a partir de ADN original o amplificado en el genoma completo.
La capacidad de determinar los haplotipos a partir de genomas diploides sigue siendo una tarea técnicamente compleja y costosa que se basa esencialmente en el aislamiento físico de cromosomas o fragmentos subcromosómicos antes del genotipado por secuenciación o alguna otra tecnología. A continuación se describe un procedimiento rápido y sencillo para capturar dos regiones en la misma hebra de ADN genómico para permitir la determinación de la estructura de haplotipo definida por las dos regiones.
Para cada diana potencial, se hibridan simultáneamente dos oligonucleótidos, cada uno conteniendo secuencias complementarias a las porciones en dirección 5' y en dirección 3' que flanquean cada uno de los dos polimorfismos en la diana. Estos polimorfismos pueden ser repeticiones de tetranucleótidos, trinucleótidos o dinucleótidos o SNP. Los polimorfismos que proporcionan más información son aquellos que son polimórficos tanto en los cromosomas maternos como polimórficos en el cromosoma del padre que se transfiere al feto. La polimerasa se usa para la extensión desde cada uno de los dos extremos 3' para cerrar el hueco y determinar el genotipo de los polimorfismos ubicados entre los dos pares de secuencias de unión flanqueantes. Los dos polimorfismos dirigidos no tienen necesariamente que ser contiguos entre sí, y pueden estar separados por otros polimorfismos. La distancia entre los dos polimorfismos de interés está limitada solo por la probabilidad de ser puenteada por las cuatro secuencias de unión contenidas en los dos oligonucleótidos. Cada uno de los oligonucleótidos contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y fosfato opcional en el extremo 5'.
Protocolo detallado para determinar el haplotipo entre dos polimorfismos conocidos:
Variación 8.1 (véase, por ejemplo, la Figura 113). 8.1.a. El ADN genómico se aísla mediante un procedimiento que produce material de alto peso molecular (>15 kb).
8.1. b. Desnaturalizar el ADN diana (94 °C, 1 minuto) en presencia de dos oligonucleótidos (el primero comprende una secuencia 5' complementaria a una región única en dirección 5' del polimorfismo diana #1, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia 3' complementaria a una región única en dirección 3' del polimorfismo diana #2 y el segundo comprende una secuencia 5' complementaria a una región única en dirección 5' del polimorfismo diana #2, una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y una secuencia 3' complementaria a una región única en dirección 3' del polimorfismo diana #1), y permitir que los oligonucleótidos hibriden con sus regiones complementarias en los fragmentos deseados mediante enfriamiento a una temperatura deseada (por ejemplo, 50 °C durante 2 horas). La polimerasa Taq y/o KlenTaq (polimerasa Taq que carece de actividad nucleasa), una ligasa termoestable (preferentemente de la cepa AK16D) y los dNTP se añaden después de la etapa de hibridación o al comienzo del procedimiento. En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótidos tengan un fosfato 5', KlenTaq extiende el extremo 3' hasta que esté directamente contiguo al extremo 5' apto para fijación (lado izquierdo de la Figura 113). En el caso de que ambas secuencias de oligonucleótido tengan un 5'-OH, la actividad nucleasa 5'->3' de la polimerasa escinde la base complementaria solapante en 5' para crear un fosfato 5' apto para fijación (lado derecho de la Figura 113). Permitir la extensión y fijación a la temperatura de hibridación y, opcionalmente, aumentar la temperatura (por ejemplo, 60 °C) para garantizar la finalización de la extensión y la fijación, para generar productos circulares.
8.1. c. Añadir Exonucleasa I (digiere el ADN monocatenario en la dirección 3'->5') y Exonucleasa III (digiere el ADN bicatenario en la dirección 3'->5') para digerir todos los productos no fijados o mellados, dejando solo el ADN circular monocatenario deseado que comprende el ADN diana original, la secuencia del conector, la secuencia de identificador único, una secuencia de unión a cebador opcional y una secuencia de identificador de paciente opcional. Este producto es adecuado para amplificación por círculo rodante (usando cebadores hexámeros aleatorios con polimerasa phi-29) para crear repeticiones en tándem de la secuencia deseada, y posterior identificación de las dianas usando secuenciación de nueva generación o, de forma alternativa, secuenciación SMRT directa en el molde cerrado covalentemente, usando la secuencia de unión a cebador como un sitio de unión a cebador.
Nota 1: Este enfoque también permite establecer fácilmente el haplotipo (es decir, la fase) con la mutación real que causa la enfermedad. Los cebadores se diseñan de modo que uno de los sitios polimórficos es el gen de la enfermedad real.
Nota 2: En los sistemas que usan dos sondas de oligonucleótido puente, cada una de las cuales contiene una secuencia de identificador único, una secuencia de identificador de paciente opcional y un sitio de unión a cebador opcional, se recomienda que solo uno y no ambos oligonucleótidos contengan un sitio de unión a cebador (ya sea el oligonucleótido en dirección 5' o en dirección 3'). Para un nivel adicional de detección de falsos positivos, se recomienda que la secuencia del identificador único sea diferente en las sondas en dirección 5' y en dirección 3'.
Nota 3: Es importante maximizar la formación de productos de fijación donde las dos secuencias de unión al oligo están realmente unidas por un tramo contiguo de ADN, y minimizar la formación de productos de fijación donde los fragmentos puenteados no son contiguos.
Considerar el siguiente ejemplo con propósitos ilustrativos. La región en dirección 5' se denomina "X" y tiene una repetición de tetranucleótido AGAT, mientras que la región en dirección 3' se designa "Y" y tiene una repetición de dinucleótido CA. La región X en dirección 5' se ilustra a continuación como "X-up", el sitio de unión del cebador en dirección 5', AGAT (n) es la región de repetición del tetranucleótido, y "X-dn" es el sitio de unión a cebador en dirección 3'. La región Y en dirección 3' se ilustra a continuación como "Y-up", el sitio de unión del cebador en dirección 5', CA (n) es la región de repetición del dinucleótido, y "Y-dn" es el sitio de unión del cebador en dirección 3'. En este ejemplo, las dos regiones están separadas por 10 kb, y los dos cromosomas maternos tienen la forma:
X-up AGAT(12) X-dn........(10 kb)...... Y-up CA(23) Y-dn
X-up AGAT(16) X-dn........(10 kb)...... Y-up CA(18) Y-dn
A continuación, añadir cebadores de fijación/extensión que se unen a la hebra inferior (como en la Figura 113). Tendrán la forma:
(Izquierda) 5' X-dn -sitio de cebador - identificador #1 - Y-up 3'
(Derecha) 5' Y-dn - identificador #2 - X-up 3'
(En este ejemplo, el sitio de unión a cebador está solo en el cebador izquierdo).
A continuación, los 2 posibles productos de fijación definidos por los haplotipos (linealizados en el sitio de unión a cebador para que sea más fácil de seguir) tendrían la forma:
sitio de cebador - identificador #1 - Y-up CA(23) Y-dn - identificador #2 - X-up AGAT(12) X-dn
sitio de cebador - identificador #1 - Y-up CA(18) Y-dn - identificador #2 - X-up AGAT(16) X-dn
Se puede maximizar la formación de los productos correctos que se derivan de sitios contiguos en los mismos fragmentos cromosómicos diluyendo la reacción, de modo que la probabilidad de que se obtengan productos derivados de sitios no contiguos se vuelve infinitesimalmente pequeña. Además, dado que el cebador está en un gran exceso con respecto al ADN cromosómico, si dos fragmentos no son contiguos, entonces hay una probabilidad mucho mayor de que cada fragmento tenga ya un sitio de unión a cebador compuesto "izquierdo" y "derecho" (4 cebadores que se unen a dos fragmentos separados). Solo cuando los dos fragmentos son contiguos existe una mayor probabilidad de que las dos regiones se unan entre sí por cada uno de los cebadores compuestos "izquierdo" y "derecho". Es un experimento sencillo para optimizar el rendimiento de los productos de fijación correctos mediante la generación de una matriz de condiciones de diferentes concentraciones diana vs. diferentes diluciones de los cebadores de fijación/extensión.
Si existen productos de fijación incorrectos que se derivan de dos regiones cromosómicas diferentes que se unen, se crearía erróneamente un producto donde CA(23) está conjuntamente con AGAT(16), y CA(18) está conjuntamente con AGAT(12).
Como ejemplo, considerar el peor de los escenarios, donde el 80 % del producto de fijación se deriva de fragmentos puenteados que no son contiguos. Por simplicidad, asumir 1.000 equivalentes de genoma. Tener en cuenta que si el producto se deriva de fragmentos puenteados, entonces existe la misma posibilidad de que provengan del mismo cromosoma materno que de que provengan de cromosomas opuestos (es decir, 400 cada uno). Sin embargo, los productos que se deriven del ADN contiguo solo provendrán del mismo cromosoma materno (es decir, 200 cada uno). Por tanto, deben existir las siguientes combinaciones:
CA(23) y AGAT(12) 600 (= 400 200)
CA(23) y AGAT(16) 400
CA(18) y AGAT(12) 400
CA(18) y AGAT(16) 600 (= 400 200)
Incluso si estos números fluctuaran en 50 en la dirección menos favorable (equivalente a que el 90 % de los productos de fijación se deriven de fragmentos puenteados), todavía sería sencillo distinguir el haplotipo en cada cromosoma como CA(23) y AGAT(12); así como Ca (18) y AGAT(16).
CA(23) y AGAT(12) 550 (= 400 - 50 200)
CA(23) y AGAT(16) 450 (= 400 50)
CA(18) y AGAT(12) 450 (= 400 50)
CA(18) y AGAT(16) 550 (= 400 - 50 200)
De forma alternativa, en un segundo enfoque, los genes de enfermedades se pueden dividir en las 20 enfermedades hereditarias más comunes, así como las enfermedades autosómicas dominantes, y a continuación dividirse en 17 grupos de secuencias mutadas menos frecuentes que cubren un promedio de 200 genes cada uno. Cada grupo de genes estaría cubierto por conjuntos de sondas de captura y, a continuación, dependiendo de los resultados del análisis de secuenciación original, la sangre materna recibiría identificadores de pacientes adecuados y se evaluaría con uno o más de los 17 conjuntos de sondas de captura especiales.
El primero de los enfoques anteriores identificará mutaciones hereditarias y esporádicas, y determinará si el feto heredó una región portadora de mutaciones de la madre. Este enfoque también debería ser capaz de determinar la presencia de deleciones para enfermedades hereditarias ligadas al cromosoma X, otras deleciones cromosómicas, metilación aberrante en el feto, enfermedades derivadas de la repetición de tripletes y enfermedades derivadas de translocaciones cromosómicas u otros reordenamientos.
El segundo enfoque identificará las condiciones de enfermedad para los genes interrogados. La cuestión clave será la importancia que otorga la familia a la obtención de la respuesta correcta. Es sencillo determinar si ambos padres son portadores y si las mutaciones son diferentes, y es relativamente sencillo determinar si el alelo de la enfermedad del padre está presente en el feto. Si está ausente, entonces el feto estará libre de enfermedad o será portador. Si está presente, entonces las posibilidades de heredar el alelo materno y contraer la enfermedad son del 50 %. Si se ha determinado el haplotipo para el alelo materno, entonces se pueden usar marcadores de haplotipo para verificar la presencia o ausencia del alelo materno hereditario. También puede ser prudente realizar una amniocentesis y evaluar directamente la presencia del alelo materno. La recomendación actual es secuenciar el gen como se explica anteriormente y evaluar el alelo de la enfermedad paterna. Si está presente, o si las mutaciones específicas de la enfermedad materna y paterna son idénticas, el médico recomienda la amniocentesis.
Los procedimientos de la presente invención también se pueden usar para el diagnóstico prenatal no invasivo y el diagnóstico genético preimplantatorio (DGP) de translocaciones cromosómicas desequilibradas. Las personas que transportan translocaciones cromosómicas tienen un mayor riesgo de infertilidad, aborto espontáneo, muerte fetal y/o tener un hijo con anomalías congénitas. El diagnóstico genético preimplantatorio es capaz de distinguir entre embriones que tienen la cantidad correcta de material genético (equilibrado / normal) y embriones a los que les falta material genético como resultado de la translocación (desequilibrado). Muchas parejas en las que un miembro es portador de translocaciones han experimentado abortos espontáneos o han tenido que enfrentarse a decisiones difíciles al enterarse de un embarazo con un conjunto desequilibrado de cromosomas. Los procedimientos de DGP basado en la presente invención reducirían la probabilidad de tener que lidiar con estas circunstancias particulares sabiendo antes de la concepción que los embriones transferidos tienen translocaciones cromosómicas equilibradas.
El enfoque de evaluación de SNP o polimorfismos de secuencia repetitiva específicos de cromosomas también se puede emplear en el cribado previa a la implantación. A diferencia del embarazo, donde solo la trisomía 21, 18 y 13 llegan a término (así como las anomalías ligadas al cromosoma X e Y), en la fertilización in vitro aún se puede permitir el crecimiento de otras anomalías cromosómicas en la fase de 16, 32 o más células. En consecuencia, se necesitarán polimorfismos en todo el genoma para tener en cuenta tanto el número de copias adecuado como la pérdida o ganancia de regiones cromosómicas. Cuanto mayor sea el número de polimorfismos que se interrogan, más exacta podrá ser la determinación de cambios en el número de copias.
Ejemplo profético 9: Pruebas de paternidad del feto (por ejemplo, apoyo de atención prenatal)
Visión general: El enfoque básico es buscar la presencia de alelos presentes en el padre, pero ausentes en la madre. Existen dos formas generales de abordar esto. Una puede comenzar con los SNP donde el alelo común tiene una frecuencia de alrededor del 70-75 %, de modo que hay aproximadamente un 50 % de posibilidades de que la madre sea homocigótica para el alelo principal. Se comienza con aproximadamente 48 SNP, de los cuales en aproximadamente la mitad de ellos (24) la madre será homocigótica para el alelo común, y existe un 50 % de posibilidades de que el padre sea heterocigótico u homocigótico para el alelo minoritario. Se puntúa simplemente la presencia del alelo minoritario en la sangre materna, de forma similar a la búsqueda de mutaciones, pero también se cuantifica la cantidad presente solo para confirmar que es un alelo minoritario del padre. Un segundo enfoque es comenzar con alelos con una frecuencia de alrededor del 50 %, por lo que existe un 50 % de posibilidades de que la madre sea homocigótica para uno de los alelos, y existe un 75 % de posibilidades de que el padre tenga el otro alelo en esa posición. Este enfoque proporciona algo menos de información para diferenciar a los padres, pero el número de posiciones que proporcionarán información será mayor. Un tercer enfoque es usar polimorfismos de secuencia repetitiva, donde existe un alto grado de polimorfismo, de modo que existe una alta probabilidad de que el alelo del padre sea diferente de cualquiera de los alelos de la madre en una posición determinada. Esto requeriría la menor cantidad de alelos. En todas estas condiciones, el médico debe asegurarse de respetar la privacidad de la madre en caso de que el esposo no sea el padre del feto (no paternidad).
Tabla 1: Secuencias de oligonucleótidos de la divulgación
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para amplificar moléculas de ácido nucleico, en el que dicho procedimiento comprende:
proporcionar una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario, en la que cada construcción comprende:
un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y
un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped, en el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una porción de identificador único, en la que la secuencia de nucleótidos de la porción de identificador único y del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de cualquier otra construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección, en el que dichas construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección están circularizadas y son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación;
mezclar la colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario con una polimerasa y una pluralidad de cebadores cortos que tienen una longitud de 6 a 10 nucleótidos y comprenden bases aleatorias y/o análogos de nucleótidos, en el que uno o más de los cebadores cortos son complementarios a una porción de una o más construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección; con lo que dicho mezclado forma una mezcla de reacción de amplificación; y
someter la mezcla de reacción de amplificación a uno o más tratamientos de hibridación y extensión, en los que el uno o más cebadores cortos hibridan con las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario y la polimerasa extiende los cebadores cortos hibridados para producir una pluralidad de productos de extensión, en el que cada producto de extensión comprende dos o más secuencias lineales en tándem, en el que cada secuencia lineal en tándem es complementaria a una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.
2. Un procedimiento para generar copias lineales en tándem de moléculas de ácido nucleico, en el que dicho procedimiento comprende:
proporcionar una colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario, en la que cada construcción comprende:
un primer segmento monocatenario de ADN genómico original de un organismo huésped y
un segundo segmento de ácido nucleico sintético monocatenario que está unido al primer segmento monocatenario y comprende una secuencia de nucleótidos que es exógena al organismo huésped, en el que dicha secuencia de nucleótidos comprende una porción de identificador único, en la que la secuencia de nucleótidos de la porción de identificador único y del segmento del ADN genómico original distingue una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección de cualquier otra construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección, en el que dichas construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección están circularizadas y son adecuadas para amplificación por círculo rodante y/o secuenciación;
mezclar la colección de diferentes construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario con una polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra y uno o más cebadores principales, en el que el uno o más cebadores principales son complementarios a una porción de una o más construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario de la colección; con lo que dicho mezclado forma una mezcla de extensión por círculo rodante;
someter la mezcla de extensión por círculo rodante a uno o más tratamientos de hibridación y extensión, en los que el uno o más cebadores principales hibridan con las construcciones circulares quiméricas de ácido nucleico monocatenario y la polimerasa extiende los cebadores principales hibridados para producir productos de extensión monocatenarios, en el que cada producto de extensión monocatenario comprende dos o más secuencias lineales en tándem, en el que cada secuencia lineal en tándem es complementaria a una construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección;
proporcionar uno o más conjuntos de cebadores secundarios, en el que cada conjunto de cebadores secundarios comprende (a) un primer cebador secundario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una primera porción de un producto de extensión monocatenario formado a partir del uno o más cebadores principales, y (b) un segundo cebador secundario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda porción de un producto de extensión monocatenario, en el que dicha segunda porción es diferente y está desplazada de la primera porción del producto de extensión monocatenario formado a partir del uno o más más cebadores principales;
proporcionar una endonucleasa que escinde tanto el producto de extensión monocatenario como el primer cebador secundario cuando hibridan entre sí;
mezclar los productos de extensión monocatenarios con una polimerasa que carece de actividad de desplazamiento de hebra, una ligasa, la endonucleasa y el uno o más conjuntos de cebadores secundarios para formar una mezcla de reacción de extensión-fijación-escisión;
someter la mezcla de reacción de extensión-fijación-escisión a un tratamiento de hibridación y extensión, en el que el primer y segundo cebadores secundarios hibridan con los productos de extensión monocatenarios, la polimerasa extiende los cebadores secundarios hibridados, la ligasa une los cebadores secundarios hibridados extendidos para formar productos de extensión bicatenarios, y la endonucleasa escinde los productos de extensión bicatenarios en posiciones donde el primer cebador secundario hibrida con el producto de extensión monocatenario para producir fragmentos de productos de extensión bicatenarios, en el que dichos fragmentos de productos de extensión bicatenarios comprenden dos o más secuencias lineales en tándem complementarias a la construcción quimérica de ácido nucleico monocatenario de la colección.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el número de secuencias lineales en tándem en el fragmento de producto de extensión bicatenario se determina por la proporción entre el primer y el segundo cebador secundario en la mezcla de reacción de extensión-fijación-escisión.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la mezcla de extensión por círculo rodante comprende además: una endonucleasa de restricción sensible a metilo, en la que durante dicho sometimiento de la mezcla de extensión por círculo rodante al uno o más tratamientos de hibridación y extensión, la endonucleasa escinde el ADN bicatenario en una secuencia de reconocimiento si dicha secuencia de reconocimiento no está metilada, formando selectivamente de este modo productos de extensión monocatenarios solo a partir de construcciones quiméricas de ácido nucleico monocatenario que comprenden un primer segmento monocatenario de ADN genómico metilado original.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4 que comprende además:
secuenciar la pluralidad de productos de extensión o fragmentos de productos de extensión bicatenarios; opcionalmente
a) en el que secuencias de conectores universales se agregan a los extremos 5' y 3' de los productos de extensión o fragmentos de los mismos, o a los extremos 5' y 3' de los fragmentos de productos de extensión bicatenarios antes de dicha secuenciación; o
b) en el que dicha secuenciación se lleva a cabo usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en hibridación de cebador fluorescente, hibridación de balizas moleculares, extensión de cebadores, secuenciación basada en exonucleasa, reacción de detección de ligasa, reacción en cadena de ligasa, pirosecuenciación, secuenciación por síntesis basada en fluorescencia, secuenciación por fijación basada en fluorescencia, secuenciación basada en nanoporos, secuenciación por síntesis basada en iones y secuenciación por fijación basada en iones.
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