KR102560137B1 - 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법 - Google Patents

극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 검출하고자 하는 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편에 대하여, 상기 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 프라이머의 3'말단에는 상기 검출대상 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하는 제1 프라이머를 포함하는 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 극소량의 희귀 단일 염기 변이의 검출방법에 관한 것이다.

Description

극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법{Primer for detecting the minimum rare single nucleotide variant and method for specific and sensitive detecting of the minimum rare single nucleotide variant using the same}
본 발명은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법에 관한 것이다.
단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)는 단일 염기의 차이를 보이는 변이를 말하며, 단일염기다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)과 점돌연변이(point mutation)를 포함한다.
DNA 또는 RNA 서열에서의 단일 염기 변이 또는 차이는 중요한 생물학적 결과를 가질 수 있으며, 이러한 단일-염기 변이는 생의학 연구 및 임상 적용을 위한 중요한 바이오마커로 간주될 수 있어, 이를 검출하기 위한 기술개발은 오랫동안 핵산 생명 공학의 초점이 되어 왔다. 단일-염기 변이체(SNV) 검출을 위한 종래 방법은 MALDI 질량 분석, DNA 염기서열 분석, 중합 효소 연쇄 반응, 마이크로어레이, 효소-보조 방법 및 혼성화-기반 방법이 개발된 바 있다.
그러나 종래 개발된 이러한 방법들은 극소량의 SNV를 검출하기에는 특이성이 낮은 문제점이 있으며 민감도 역시 좋지 못해 검출 효율이 낮다는 문제가 있고, 많은 시간 및 높은 비용이 소요된다는 한계점들이 있다.
한편, 생명공학의 발전으로 인해 질병과 관련된 단일 염기 변이들이 밝혀지고 있고 따라서 이를 신속하고 정확하게 검출하여 질병을 조기에 진단하고 치료하기 위한 기술들의 관심이 증대되고 있다.
그러나 아직까지 개발된 기술들로는 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 높은민감도 및 높은 특이성으로 분석할 수 있는 기술이 개발되지 못하고 있는 실정이다.
대한민국 등록특허 10-1600039호
이에 본 발명자들은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 고민감도 및 고특이성으로 분석할 수 있는 새로운 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 검출할 수 있는 새로운 PCR 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 높은 민감도 및 높은 특이성으로 검출할 수 있는 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 포함하는 단일 염기 변이체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 극소량의 희귀 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출방법을 제공하는 것이다.
그러므로 본 발명은 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물로서, 검출하고자 하는 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편에 대하여, 상기 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 프라이머의 3' 말단에는 상기 검출대상 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하는 제1 프라이머를 포함하는, 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 상기 검출대상 DNA 단편은 단일 염기 변이를 포함하지 않는 야생형 DNA 단편이며, 프라이머의 3' 말단에는 상기 야생형 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하고, 3' 말단이 인산화되어 있는 제2 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물은 중합효소 연쇄반응(PCR)용일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 포함하는, 단일 염기 변이체 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은, 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편을 주형으로 하고 본 발명의 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는, 극소량의 희귀 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 3'-> 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 없는 DNA 폴리머라제를 이용하여 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 검출대상 DNA 단편에 단일 염기 변이가 존재하는 경우에는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭산물이 생성되고, 검출대상 DNA 단편에 단일 염기 변이가 존재하지 않는 경우에는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭산물이 생성되지 않는 것일 수 있다.
본 발명은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 매우 특이적이며 민감하게 검출할 수 있는 검출용 프라이머 및 이를 이용한 극소량으로 존재하는 희귀 단일 염기 변이체의 검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 단일 염기 변이체 검출용 프라이머의 3` 말단에는 비-상보적인 뉴클레오타이드의 추가로 검출 특이성을 대폭 증가시킬 수 있는 효과가 있다. 특히 본 발명에서 고안된 프라이머가 완전히 서열 상보적으로 단일 염기 변이체에 결합할 경우, 3` 말단의 비-상보적인 뉴클레오타이드의 길이는 유지되는 반면, 단일 뉴클레오타이드 불일치가 있는 주형 가닥에 결합할 경우에는 3` 말단의 비-상보적인 뉴클레오타이드의 길이가 증가하도록 되어 있어, 본 발명에서 제공하는 프라이머는 오직 단일 염기 변이체(SNV)만을 매우 특이적으로 증폭할 수 있는 효과가 있다. 또한, 3` 말단에 비-상보적인 뉴클레오타이드와 인산기를 갖는 야생형 프라이머를 함께 사용할 경우, 검출 특이성을 더욱 증가시킬 수 있어, 본 발명에서 제공하는 단일 염기 변이체 검출방법은 정교하고 복잡한 프라이머 설계를 요구하지 않기 때문에 시간적, 노동적 및 비용적인 측면에서 상당히 효과적이다. 그러므로 본 발명에서 제공하는 프라이머는 극소량으로 존재하는 희귀 단일 염기 변이체(SNV)를 매우 특이적이고 민감하게 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 디자인한 프라이머를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 PCR 방법으로 검출하는 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 디자인한 프라이머들을 이용한 PCR 방법으로 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출 민감도(seneitivity)를 분석하는 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 합성된 MT ultramer template의 다양한 copy에 대한 MT 프라이머의 PCR 민감도 여부를 겔 전기영동을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 디자인한 프라이머들을 이용한 PCR 방법으로 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출 특이도(specificity)를 분석하는 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 nucleotide(T) 30 mer를 추가하여 합성한 MT ultramer template와 WT ultramer template의 다양한 비율 혼합물을 본 발명에서 디자인한 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출 민감도 및 특이도를 분석하는 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 ucleotide(T) 30 mer를 추가하여 합성한 MT ultramer template와 WT ultramer template의 다양한 비율 혼합물을 본 발명에서 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 겔 전기영동을 통해 검출의 민감도 및 특이도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법을 제공함에 특징이 있다.
질병과 관련된 단일 염기 변이체는 체내에 극소량으로 존재하고 있어 질병 진단을 위한 중요한 마커임에도 불구하고 이를 정확하고 신속하게 검출할 수 없는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적으로 민감하고 신속하게 검출할 수 있는 방법을 연구하던 중, 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 고안하였으며, 중합효소 연쇄반응의 간단한 분석 방법으로도 희귀 단일 염기 변이체를 높은 특이도 및 민감도로 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 규명하였다.
따라서 본 발명은 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 조성물은 검출하고자 하는 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편에 대하여, 상기 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 프라이머의 3' 말단에는 상기 검출대상 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하는 제1 프라이머를 포함한다.
또한, 본 발명의 상기 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물에는 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 상기 검출대상 DNA 단편은 단일 염기 변이를 포함하지 않는 야생형 DNA 단편이며, 프라이머의 3' 말단에는 상기 야생형 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하고, 3' 말단이 인산화되어 있는 제2 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
즉, 본 발명의 단일 염기 검출용 프라이머 조성물은, SNV 특이적 프라이머(제1 프라이머)를 포함하는데, 상기 제1 프라이머는 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하며 제1 프라이머의 3' 말단에는 상기 검출대상 DNA 단편과 비상보적인 염기서열을 반드시 포함하도록 디자인한다. 이때 상기 비상보적인 염기서열은 2~10개의 염기서열, 바람직하게는 2~6개의 염기서열, 더 바람직하게는 2~3개의 염기서열로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 단일 염기 검출용 프라이머 조성물은 추가로 WT 특이적 프라이머(제2 프라이머)를 포함할 수 있는데, 상기 제2 프라이머는 단일 염기 변이를 포함하지 않는 야생형 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하며, 제2 프라이머의 3' 말단에는 상기 야생형 DNA 단편과 비상보적인 염기서열을 반드시 포함하도록 디자인한다. 이때 상기 비상보적인 염기서열은 2~10개의 염기서열, 바람직하게는 2~6개의 염기서열, 더 바람직하게는 2~3개의 염기서열로 이루어질 수 있다.
여기서 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머에 포함될 수 있는 비상보적인 염기서열은 검출대상 DNA 단편의 염기서열과 비상보적인 어떠한 염기서열이면 모두 가능하다. 또한, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 비상보적인 염기서열은 동일하다.
또한 상기 제2 프라이머의 3' 말단은 인산화되도록 디자인한다.
본 발명에서는 상기 3' 말단이 인산화된 제2 프라이머를 사용하게 되면 단일 염기 변이를 포함하지 않는 야생형 DNA 단편에 대한 PCR 증폭반응을 차단시킬 수 있어 제1 프라이머에 의한 목적 단일 염기 변이체를 보다 특이적으로 민감하게 검출할 수 있다.
본 발명에서 고안한 상기 단일 염기 검출용 프라이머 조성물을 이용한 단일 염기 변이체의 검출과정 모식도는 도 1에 나타내었는데, 본 발명은 극소량의 단일-염기 변이체(SNV, Single-nucleotide variant)를 매우 특이적이고 민감하게 검출하기 위해, 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 경쟁적 프라이머 조성물을 (competitive composition) 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 진행할 수 있다. 이때 SNV-특이적 프라이머는 3` 말단에 비-상보적인 염기가 있는 구조이며, WT-특이적 프라이머는 3` 말단에 비-상보적인 뉴클레오타이드와 증폭 블로킹을 위한 인산기가 포함된 구조를 갖는다. 두 프라이머의 차이는 3` 말단 영역(도 1의 파란색 영역)상의 단일-염기서열에 있다. 이들 SNV-특이적 프라이머와 WT-특이적 프라이머는 완벽하게 매칭된(perfect match) 주형과 주로 결합을 한다. 따라서 이러한 결합으로 두 개의 프라이머는 3`말단에 비상보적인 염기서열로 인해 짧은 단일 가닥이 존재하는 구조를 가지게 되지만 3`->5` exonuclease 활성이 없는 DNA 중합 효소를 이용하여 증폭반응을 수행하게 된다. 따라서 WT-특이적 프라이머는 3` 말단에 인산이 존재하고 있어 PCR 반응으로 증폭이 될 수 없다. 또한, SNV-특이적 프라이머와 WT-특이적 프라이머는 아주 작은 비율로 미스 매칭된(mismatch) 주형과 결합 할 수 있게 되는데, 그 결과, mismatch 결합은 노이즈(Noise)를 발생시키므로 두 개의 프라이머는 3` 말단에 비교적 긴 단일 가닥 구조를 형성하게 된다. 이로 인해, 3`->5` exonuclease 활성이 없는 DNA 중합효소는 프라이머의 3` 말단을 인식하지 못하여 증폭반응이 진행되지 않는다.
따라서 SNV-특이적 프라이머가 오직 SNV 주형 가닥에 결합한 경우에만 PCR 증폭 반응이 진행될 수 있으므로, 비특이적 PCR 반응산물은 생성되지 않고 극소량의 타겟 SNV만을 증폭할 수 있어 본 발명의 프라이머 조성물을 사용할 경우, 극소량의 단일 염기 변이를 높은 민감도 및 특이성으로 검출할 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 일실시예에서는 암 발생과 관련성이 높은 것으로 알려진 KRAS 유전자의 G12D 변이체 DNA 단편을 제작하여 이를 PCR 분석을 위한 주형으로 사용하였으며, 이때 KRAS 유전자의 G12D 변이를 포함하는 단일 가닥의 주형 DNA 서열을 서열번호 1에 나타내었고, KRAS 유전자의 G12D 야생형 서열을 포함하는 단일 가닥의 주형 DNA 서열을 서열번호 2에 나타내었다.
또한, 이들 서열번호 1 및 서열번호 2의 주형에 공동적으로 완전히 상보적인 서열을 갖는 역방향 프라이머를 디자인하였으며 이를 서열번호 5에 나타내었다.
본 발명의 일실시예에서는 제1 프라이머로서, RAS 유전자의 G12D 변이를 포함하는 단일 가닥인 서열번호 1의 주형 DNA 서열에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하되, 3' 말단에 비상보적인 2개의 염기서열인 'TT'를 포함하는 서열번호 6 의 정방향 프라이머 서열을 제조하였다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 제2 프라이머로서, KRAS 유전자의 G12D 야생형 서열을 포함하는 단일 가닥인 서열번호 2의 주형 DNA 서열에 대하여, 상기 서열번호 2의 서열에 대하여 상보적인 염기서열을 포함하되, 3' 말단에 비상보적인 2개의 염기서열인 'TT'를 포함하는 서열번호 7의 정방향 프라이머 서열을 제조하였으며, 이때 상기 프라이머는 3'말단에 인산화가 되어 있다.
상기 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머를 서열번호 5의 역방향 프라이머와 함께 PCR을 수행한 결과, KRAS 유전자의 G12D 단일 염기 변이를 높은 특이도 및 민감도로 검출이 가능함을 알 수 있었고, 제1 프라이머 만으로도 검출이 가능하다는 것을 알 수 있었고, 나아가 제1 프라이머와 제2 프라이머를 함께 사용한 경우 가장 높은 특이도 및 민감도로 검출이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 단일 염기 변이체 검출용 프라이머를 포함하는 단일 염기 변이체 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 '프라이머'의 용어는, DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라질 수 있다.
또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
또한, 본 발명의 단일 염기 변이체 검출용 키트는 상기 기술된 본 발명의 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, dNTPs, DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 증류수 등을 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 극소량의 희귀 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편을 주형으로 하고 본 발명의 상기 프라이머 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함한다.
이때 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 3'->5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 없는 DNA 폴리머라제를 이용하여 수행한다.
또한 본 발명의 방법의 경우, 검출대상 DNA 단편에 단일 염기 변이가 존재하는 경우에는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭산물이 생성되고, 검출대상 DNA 단편에 단일 염기 변이가 존재하지 않는 경우에는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭산물이 생성되지 않는 특징이 있다.
그러므로 본 발명의 방법을 적용하게 되면, 오로지 목적하는 단일 염기 변이가 존재하는 검출대상 DNA 만을 높은 민감성으로 특이성 있게 검출할 수 있는 효과가 있어, 질병과 관련된 극소량으로 존재하는 단일 염기 변이를 용이하게 검출 및 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법 및 준비예>
본 발명의 실시예에서 사용된 모든 합성된 뉴클레오티드(nucleotide)는 Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)에서 주문하여 사용하였다. 합성된 nucleotide는 동결건조 상태로 받았고 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)로 희석 후 Mixing block (MB102; Bioer) 에서 50℃, 1 시간 인큐베이션 후 실험에 사용하였다. 또한, 본 발명의 real-time PCR 수행에 사용된 합성된 nucleotide는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
상기 표 1에서 1-1 & 1-2의 Template는 KRAS gene G12D mutant type sequence를 포함하는 single stranded Ultramer(195 nt)와 KRAS gene G12D wild type sequence를 포함하는 single stranded Ultramer(195 nt)로 구성된 것이며, 각 single stranded Ultramer 는 3` 말단에 인산화된 형태(phosphorylation modification)를 갖는다.
상기 표 1에서 Mutant type T30 Ultramer Template는 KRAS gene G12D mutant type sequence와 nucleotide T 30 mer를 포함하는 single stranded Ultramer(195 nt)로 구성되며, 3` 말단에 인산화된 형태(phosphorylation modification)를 갖는다.
상기 표 1에서 Forward Primer(FP)는 KRAS gene G12D mutant type Ultramer(template)에 완전히 상보적인 서열을 갖는다.
Reverse Primer(RP)는 KRAS gene G12D mutant type 및 KRAS gene G12D wild type Ultramer (template) 에 공통적으로 완전히 상보적인 서열을 갖는다.
상기 표 1에서 Mutant-specific Forward Primer(FP) 는 오직 KRAS gene G12D mutant type template에 상보적인 서열을 가지며, 3` 말단 영역에 비-상보적인 nucleotides를 갖는다.
상기 표 1에서 Wild-specific Forward Primer(FP)는 오직 KRAS gene G12D wild type template에 상보적인 서열을 가지며, 3` 말단 영역에 비-상보적인 nucleotides를 갖는다. 그리고 추가적으로 3` 말단에 인산화(phosphorylation modification)가 되어 있다.
또한, real-time PCR 증폭 산물의 신호 검출 방법으로 Taqman Probe를 사용하였다. real-time PCR은 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 장비를 사용하여 진행하였고, real-time PCR에 사용된 DNA Polymerase 로 AmpliTaq Gold™ 360 Master Mix (Applied Biosystems™) 제품을 사용하였다.
또한 본 발명의 실험에서 전기영동은 Thermo Fisher Scientific 제품을 사용하였고, 그렇지 않은 경우에는 각 실시예에서 수행한 제품을 별도 표기 하였다.
폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis)은 각 시료에 Novex TBE-샘플 버퍼(5X) 2 μl 넣은 후 잘 섞어주고, Invitrogen 10% TBE 겔에 10 μl 분주하여 180 V 에서 35 분 전기영동 하였다. 전기영동을 마친 젤은 잘 분리하여 증류수 100 ml에 SYBR Gold Nucleic Acid gel stain 5 μl를 희석 후 ROCKER (RF200; BLE)에서 15 분 반응시켰다.
<실시예 1>
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 SNV-PCR 수행 및 민감도(Sensitivity) 확인
상기 준비예에서 본 발명자들이 디자인한 표 1의 주형(template) DNA와 각 프라이머들을 사용하여 본 발명에서 고안한 프라이머에 대한 SNV 검출 민감도를 Ct value 값 측정으로 분석하였다. 구체적으로 Mutant type Ultramer(template)를 대상으로 Mutant-specific Forward 프라이머 및 Wild-specific Forward 프라이머(비-상보적 nucleotide : 0, 2nt)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. real-time PCR의 조건과 각 실험군에 대한 조성은 하기 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같으며, 각 실험군은 주형 농도에 따른 샘플로 구성되었다. 상기 기술된 본 발명에 따른 민감도 분석을 위한 SNV-PCR 수행의 모식도는 도 2에 나타내었다.
상기 실험의 결과는 하기 표 4 및 도 2에 나타내었는데, 이들 결과는 합성된 Mutant type(MT) ultramer template의 다양한 copy에 대한 MT 프라이머의 PCR 민감도를 real-time PCR을 통해 확인한 결과이다. 분석결과, 실험군 4, 즉 Mutant-specific Forward Primer 및 Wild-specific Forward Primer(비-상보적 nucleotide : 2 nt) 세트를 사용한 군이 KRAS gene G12D의 SNV를 검출할 수 있는 것으로 나타났으며, 구체적으로 PCR 60 cycles 미만에서 MT template 102 copy (Ct value. 59) 의 PCR 민감도를 갖는 것으로 나타났다.
또한, 합성된 Mutant type ultramer template의 다양한 copy에 대하여 상기 표 3의 실험군 3 및 실험군 4의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 민감도를 겔 전기영동을 통해서도 확인하였는데, 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, Mutant type ultramer template 102 copy (Ct value. 59) 의 PCR 민감도를 보이는 것으로 나타났다.
<실시예 2>
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 SNV-PCR 수행 및 특이도(Specificity) 확인
나아가 본 발명자들은 본 발명에서 디자인한 프라이머 세트를 사용하여 SNV 검출에 대한 특이도를 분석하였다. 이를 위해 Wild type Ultramer template를 대상으로 Mutant-specific Forward Primer와 Wild-specific Forward Primer (비-상보적 nucleotide : 0, 2 nt)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였고, real-time PCR 조건과 각 실험군에 대한 조성은 하기 표 5 및 표 6에 기재된 바와 같으며, 각 실험군은 template 농도에 따른 샘플로 구성된다. 상기 기술된 본 발명에 따른 민감도 분석을 위한 SNV-PCR 수행의 모식도는 도 4에 나타내었다.
본 발명에서 디자인한 프라이머 세트의 SNV 검출 특이도 분석 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 실험군 4, 즉 Mutant-specific Forward Primer + Wild-specific Forward Primer (비-상보적 nucleotide: 2 nt) 세트를 사용한 군이 KRAS gene G12D의 SNV를 검출할 수 있는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 PCR 60 cycles 미만에서 MT template 102 copy (Ct value. 59) 의 PCR 민감도를 고려하면, PCR 60 cycles 이상에서 103 배의 특이성을 나타내는 것을 알 수 있었고, PCR 60 cycles 미만에서 104 배의 특이성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명에서 디자인한 프라이머 세트를 사용할 경우, 희귀 SNV, 특히 극소량으로 존재하는 SNV를 PCR의 간단한 방법을 통해 매우 우수한 민감도 및 특이도로 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 SNV-PCR 수행에 따른 민감도(Sensitivity) 및 특이도 (Specificity) 확인
또한 본 발명자들은 mutant type T30 Ultramer template와 wild type Ultramer template가 혼합된 혼합 주형 DNA에 대하여 본 발명에서 디자인한 프라이머를 사용하여 SNV 검출에 대한 민감도 및 특이도를 분석하였다. 이를 위해 다양한 비율의 주형 혼합물(mutant type T30 Ultramer template + wild type Ultramer template 혼합물)과 Mutant-specific Forward Primer 및 Wild-specific Forward Primer (비-상보적 nucleotides: 0, 2 nt)을 사용하여 real-time PCR을 수행하였고, 각 실험군에 대한 조성 및 real-time PCR 수행 조건은 하기 표 8 및 표 9에 나타낸 바와 같으며, 상기 기술된 본 발명에 따른 민감도 및 특이도 분석을 위한 RT-PCR 수행과정의 모식도는 도 5에 나타내었다.
또한, 본 실시예에서는 mutant type T30 Ultramer template를 사용하였는데, 이는 2 종류의 ultramer template(MT / WT)를 real-time PCR 반응물에 함께 사용하는 경우, MT ultramer에 의한 PCR 산물과 WT ultramer에 의한 PCR 산물 모두에 TaqMan probe가 공통적으로 어닐링(annealing) 되어 신호를 발생시킬 수 있기 때문에, 보다 정확한 증폭 확인을 위해, 길이의 차이를 두어 MT ultramer template에 의해 증폭된 것인지 WT ultramer template에 의해 증폭된 것인지를 겔 전기영동을 통해 용이하게 확인할 수 있도록 하였다.
amplicon size의 차이를 만들어 주기 위해 nucleotide(T) 30 mer를 추가 합성한 MT T30 Ultramer template와 WT ultramer template를 다양한 비율로 혼합한 혼합물에 대하여 MT 프라이머를 이용하여 실시간 PCR 분석을 통한 민감도 및 특이도를 Ct vlaue 값 분석을 통해 확인하였고, 또한 겔 전기영동을 통해 분석하였다.
그 결과, 표 10 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머를 사용하여 MT 와 WT의 혼합된 template를 사용한 결과에서도 (Mismatch) WT template copy와 관계없이 (Perfect-match) MT template 102 copy의 PCR 민감도를 보이는 것으로 나타났고, 103 배의 PCR 특이도 (VAF. 0.1 %)를 보이는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 프라이머를 이용할 경우, 극소량의 SNV를 PCR을 통한 간단한 방법으로 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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Claims (7)

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  5. 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편을 주형으로 하며 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물을 이용하여 3'->5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 없는 DNA 폴리머라제로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하며,
    검출대상 DNA 단편에 단일 염기 변이가 존재하는 경우에는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭산물이 생성되고, 검출대상 DNA 단편에 단일 염기 변이가 존재하지 않는 경우에는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭산물이 생성되지 않는 것을 특징으로 하고,
    상기 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 조성물은 검출하고자 하는 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)를 포함하는 검출대상 DNA 단편에 대하여, 상기 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 프라이머의 3'말단에는 상기 검출대상 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 검출대상 DNA 단편과 상보적인 염기서열을 포함하되, 상기 검출대상 DNA 단편은 단일 염기 변이를 포함하지 않는 야생형 DNA 단편이며, 프라이머의 3'말단에는 상기 야생형 DNA 단편과 비상보적인 2 ~ 6개의 염기서열을 포함하고, 3'말단이 인산화되어 있는 제2 프라이머;를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    극소량의 희귀 단일 염기 변이(SNV, Single Nucleotide Variant)의 검출방법.
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