TR201815755T4 - Allele özgü reaktif primer kullanan nükleik asit amplifikasyon yöntemi. - Google Patents
Allele özgü reaktif primer kullanan nükleik asit amplifikasyon yöntemi. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201815755T4 TR201815755T4 TR2018/15755T TR201815755T TR201815755T4 TR 201815755 T4 TR201815755 T4 TR 201815755T4 TR 2018/15755 T TR2018/15755 T TR 2018/15755T TR 201815755 T TR201815755 T TR 201815755T TR 201815755 T4 TR201815755 T4 TR 201815755T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- primer
- nucleotide
- allele
- Prior art date
Links
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 160
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 143
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 141
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 139
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 139
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 41
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 7
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 9
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 8
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 18
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 5
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 79
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 14
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 10
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 10
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 10
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 101000692109 Homo sapiens Syndecan-2 Proteins 0.000 description 5
- 102100026087 Syndecan-2 Human genes 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 3
- 102100035767 Adrenocortical dysplasia protein homolog Human genes 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 101000929940 Homo sapiens Adrenocortical dysplasia protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241001379910 Ephemera danica Species 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010077182 raf Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000009929 raf Kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000246 remedial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
- C12M1/38—Temperature-responsive control
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
- C12Q2521/319—Exonuclease
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Virology (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, konvansiyonel allele özgü PCR'nin sorunlarını çözmek için tasarlanan bir allele özgü reaktif primer (ASRP) kullanan nükleik asit amplifikasyon yöntemiyle ilgilidir. Daha spesifik olarak, mevcut buluş, düzeltme etkinliğine sahip bir DNA polimeraz ve hedef nükleik asidi tamamlayıcı bir baz sekansını içeren bir hedef nükleik asidin tespit edilme yöntemiyle ilgili olmakta; burada hedef nükleik asit, 3' ucunda tamamlayıcı olmayan bazın mevcut olması halinde DNA polimerazın düzeltme etkinliği tarafından kesilen bir bazın 5' ucu yönünde, hemen önündeki bazdan 5'ucundaki baza kadar olan bölgedeki bir veya daha fazla bazın polimerizasyona yönelik bir primer olarak görev yapamayacağı şekilde modifiye edilen bir ASRP mevcudiyetinde güçlendirilmektedir. Mevcut buluşa göre allele özgü reaktif primeri (ASRP) kullanan tespit yöntemi, ASRP'nin ve düzeltici DNA polimerazın karakteristik özelliklerinden dolayı çok yüksek amplifikasyon özgüllüğüne sahip bir tekniktir ve tek nükleotid polimorfizm (SNP) dahil olmak üzere mutasyonları (nokta mutasyonu, ekleme, silme ve benzeri) etkili bir şekilde tespit edebilmektedir. İlaveten yöntem, aynı zamanda bisülfit işleminden sonra CpG'nin metillenmesini tespit etmek veya DNA kütüphanesinden istenen nükleotid sekansıyla başlanarak bir hedef DNA'yı güçlendirmek ve tespit etmek için kullanılabilmektedir.
Description
TEKNIK ALAN
Mevcut bulus, konvansiyonel allele özgü PCR sorunlarIEtçözmek için tasarlanan bir allele
özgü reaktif primer (ASRP) kullanilârak nükleik asidin güçlendirilmesine yönelik bir yöntem
ile, ve bilhassa, bir hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir yöntem ile ilgili olmakta;
söz konusu yöntem, düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimerazÇlve i) hedef nükleik asidi
tamamlaylEEbir nükleotid sekansa ve ii) allele özgü reaktif primerdeki nükleotidin polimeraz
reaksiyonuna yönelik bir primer olarak hareket edememesi amaclîda, tamamlaylEEblmayan
nükleotidin 3' ucunda mevcut olmasEhalinde DNA polimeraz. düzeltme etkinligi tarafIan
ortadan kald lEliâcak, primerin 5' yönüne tamamlaylEEblmayan nükleotidin hemen öncesinde
bulunan bir nükleotidden, primerin 5' ucunda bulunan bir nükleotide kadar olan bölgede
bulunan bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotidi(leri) içeren bir allele özgü reaktif
primerin (ASRP) mevcudiyetinde hedef nükleik asidin güçlendirilmesini içermektedir.
ÖNCEKI TEKNIK
Tek nükleotid polimorfizm (SNP), tek nükleotidin diger üç nükleotidden biriyle degistirilmesi
durumunda meydana gelen bir DNA sekansIaki genetik varyasyondur. Bu, patojenik
sebepler veya terapötik ilaçlara yan[Ellar gibi bireyler aras-a farkllIJEJara yol açmaktadE Tek
nükleotid polimorfizmlerin tespiti ve tanIiIanmasÇlyalnlîta kisisellestirilmis ilaçlara degil, aynEI
zamanda yeni ilaç gelistirmeyle de baglantlüiîîilmasian dolayllok fazla dikkat çekmistir.
Tek nükleotid polimorûzmlerin hlZElbir sekilde tespit edilmesi için, gerçek zamanIlZIPCR
teknolojisine dayalEesitli algilâma yöntemleri kullanlimlStE Bu algilâma yöntemlerinin tipik
örnekleri, DNA'IarI aras. eklenen flüorlgllîboyalar kullanan tahliller, DNA sondalarlîlkullanan
tahliller ve PNA sondalarEkuIlanan tahlilleri içermektedir. Ancak bu yöntemler, DNA'larI
araleb eklenen fiüorlgl] boyalarI kullanIiII sIlElllZlolmasElve erime egrilerinin analiz
edilmesi için bir programi gerekli olmasEldezavantajlarI sahiptir (Kirk M. Ririe vd.,
3'->5' düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz, DNA replikasyonunda yüksek duyarlilm
saglamakta (Drake, J.W. vd., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 33:339, 1968; Drake,
eksonükleaz etkinligine sahip birçok düzeltme polimerazlîkesfedilmistir.
Düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz, DNA replikasyonunda in i//i/o olarak yüksek
duyarIIDEl saglamakta, ancak düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz. konvansiyonel allele
özgü primerlerle yapllân polimeraz zincir reaksiyonuna uygulanmasülurumunda, 3' ucundaki
uyumsuz bazI çllîhrilßîaslâdan dolayÇlsablon olarak kullanilân DNA'ya sahip primerin tam
hibridizasyonuna veya tamamlanmamlgl hibridizasyona baklE1aks-primerin ucunun
Bu sorundan dolayÇl düzeltmeye sahip DNA polimerazI etkinligi, mutasyonlarI tespitine
yönelik incelemelerde nadiren kullanllBilStB Ancak, son y[[[larda, primerlerin 3' ucunun
etiketlenmesi veya 3' ucuna 3' eksonükleaza dirençli faktörün birlestirilmesi yöntemi veya 3'
ucunda nükleotid -OH grubunun çiElarilBwasljl'eya -OH grubunun diger kallEtEla degistirilmesi
yöntemi gibi primerlerin 3' ucunun modifiye edilmesi yöntemi kullanilârak hedef nükleik
asitteki bir mutasyonun tespit edilmesi yöntemine yönelik incelemeler yapilBilStlîlahang, J.
vd., Current Drug Disc., 9:21, 2001; Bi, W.L. and Sambrook, P.J., Nucleic Acids Res.,
allele özgü primeri açHZJamaktadlB DI GIUSTO DANIEL A VD. (NUCLEIC ACIDS RESEARCH,
önceki pozisyonda LNA kallEtEEliçeren bir allele özgü primeri açilZJamaktadlB Örnegin,
primerin 3' ucunun etiketlendigi vakada, primerin tamamlaylEEbir sekilde sablon DNA'ya
baglanmasü durumunda, 3' ucundaki etiket korunurken nihai amplifikasyon ürünü
üretilmekte, ancak primerin sablon DNA ile uyumsuz olmaslîiliurumunda, 3' ucundaki etiket,
düzeltmeye sahip DNA polimerazI düzeltme etkinligi tarafIan ortadan kaldlîllüiakta ve
böylelikle, nihai amplifikasyon ürününden yoksun etiket üretilmekte ve bu da, etiketin
mevcudiyetinde veya yoklugunda bir mutasyonun tespit edilebilecegini isaret etmektedir. Bu
ilkeye dayanarak, çesitli yollarla modifiye edilmis 3' uçlari sahip allele özgü primerler ve
düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz, gerçek zamanIEIPCR, çok kuyucuklu plaka ve mikro
dizi teknikleri dahil olmak üzere çesitli platformlara uygulanabilmektedir.
Buna bagIElolarak, mevcut bulus sahipleri, 3' ucu modifiye edilmis primer ve düzeltme
etkinligine sahip bir DNA polimeraz kullanarak bir hedef nükleik asidi tespit etme konusunda
kapsamlßabalar sarf etmis ve düzeltme etkinligine sahip DNA polimerazI mevcudiyetinde 3'
uçtaki nükleotidin modifiye edildigi bir allele özgü reaktif primer (ASRP) kullanarak hedef
nükleik asidin spesifik olarak güçlendirildigini kesfetmis ve böylelikle mevcut bulusu
tamamlamlgtlîl
BULUSUN AÇIKLAMASI
TEKNIK SORUN
Mevcut bulusun bir amacühedef nükleik asidi tamamlayiEEbir nükleotid sekansiIiçeren ve
allele özgü reaktif primerdeki nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer olarak
hareket edememesi amaclýla, tamamlayiîlîblmayan nükleotidin 3' ucunda mevcut olmasEi
durumunda DNA polimeraz. düzeltme etkinligi tarafIdan ortadan kaldiEllâcak olan,
tamamlaymlmayan nükleotidin hemen önünde bulunan bir nükleotidden primerin 5' yönüne
ve primerin 5' ucunda bulunan nükleotide kadar olan bir bölgede bulundugu bir allele özgü
reaktif primer (ASRP) kullanllârak hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir yöntemin
ve bir DNA kütüphanesinden bir hedef nükleik asidin seçici bir sekilde güçlendirilmesine
yönelik bir yöntemin saglanmasIlEI
TEKNIK ÇÖZÜM
YukariElhki amaca ulasmak amacMa, mevcut bulus, ekli istemlerde tannlandig'ilîlgibi, bir
hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir yöntem saglamakta, söz konusu yöntem,
düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimerazüve i) hedef nükleik asidi tamamlaylîEbir
nükleotid sekansa ve ii) allele özgü reaktif primerdeki nükleotidin polimeraz reaksiyonuna
yönelik bir primer olarak hareket edememesi amaclila, tamamlaylîljalmayan nükleotidin 3'
ucunda mevcut olmasiZihaIinde DNA polimerazlEl düzeltme etkinligi tarafIan ortadan
kaldlîilâcak, primerin 5' yönüne tamamlaylEÜJImayan nükleotidin hemen öncesinde bulunan
bir nükleotidden, primerin 5' ucunda bulunan bir nükleotide kadar olan bölgede bulunan bir
veya daha fazla modifiye edilmis nükleotidi(leri) içeren bir allele özgü reaktif primerin (ASRP)
mevcudiyetinde hedef nükleik asidin güçlendirilmesini içermektedir.
Mevcut bulus, aynEizamanda DNA kütüphanesinden spesifik bir nükleotid sekansEIa
baslayarak bir hedef nükleik asidin güçlendirilmesi yöntemi ile ilgili olmakta; söz konusu
yöntem, allele özgü reaktif primerdeki nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer
olarak hareket edememesi için 3' ucunda hedef nükleik asit ve degistirilmis nükleotide(lere)
tamamlaylEDair nükleotid sekansIDve 5' ucunda DNA kütüphanesinin adaptör sekansIlZl
tamamlaylEDair nükleotid sekansElçeren bir allele özgü reaktif primer (ASRP) ve düzeltme
etkinligine sahip bir DNA polimeraz. mevcudiyetinde DNA kütüphanesinden gelen hedef
nükleik asidin güçlendirilmesini Içermektedir.
Mevcut bulus, aynüamanda bir hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir yöntem ile
ilgili olmakta; söz konusu yöntem: (i) 5' ucunda hedef nükleik asidi tamamlaylîüilmayan bir
nükleotid sekans, modifiye edilmis tek nükleotid ve hedef nükleik asidi tamamlaylEljbir
nükleotid sekansElçeren bir etiketleme sekansIlZlçeren allele özgü reaktif primer (ASRP),
burada söz konusu allele özgü reaktif primer (ASRP), allele özgü reaktif primerdeki
nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer olarak hareket edememesi için 3'
ucunda bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotide(lere) sahiptir; (ii) hedef nükleik asidi
tamamlayEEhükleotid sekansII bir klîfnllîlçeren bir raportör sablonu ve bir etiketleme
sekansLîl ve (iii) 3' -> 5' eksonükleaz etkinligine sahip bir DNA polimeraz mevcudiyetinde
hedef nükleik asidin güçlendirilmesini içermektedir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
SEKIL 1, allele özgü reaktif primer (ASRP) kullanan bir tespit sistemini gösteren bir
sematik diyagrade
SEKIL 2, tek nükleotid mutasyonunu tespit etmek amacüla ASRP ve genel primer
kullanliârak gerçeklestirilen PCR amplifikasyon deneylerinin sonuçlarlügjöstermektedir.
SEKIL 3, metillenmeyi tespit etmek amaclîla ASRP ve genel primer kullanilârak
gerçeklestirilen PCR amplifikasyon deneylerinin sonuçlarllîgiiöstermektedir.
SEKIL 4, allele özgü reaktif primer (ASRP) kullanilârak bir DNA kütüphanesinden Istenen
nükleotid sekanslîla baslanarak bir hedef DNA'nI güçlendirilmesi sürecini gösteren bir
sematik çizelgedir.
SEKIL 5, bir etiketleme sekansüdegistirilmis tek nükleotid sekansüie hedef nükleik asidi
tamamlaylEDbir hedefe özgü sekanslîiçeren bir allele özgü reaktif primer (ASRP) ve 3'->5'
eksonükleaz etkinligine sahip olan ve hiçbir düzeltme etkinligine sahip olmayan bir DNA
polimerazEllullanan bir tespit sistemini gösteren bir sematik çizelgedir.
BULUSUN GERÇEKLESTIRILMESINE YÖNELIK EN IYI MOD
Aksi belirtilmedikçe, burada kullanilân teknik ve bilimsel terimlerin tamamümevcut bulusun
ait oldugu teknikte uzman kisiler tarafIEUan yayglEl olarak anlasilânla aynEhnlama sahiptir.
Genellikle, burada kullanHân terminoloji, iyi bilinmekte ve teknikte yayglEl olarak
kullanilîhaktadlü
Bir yönde, mevcut bulus, bir hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir yöntemle ilgili
olmakta; söz konusu yöntem, düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimerazÇlve i) hedef
nükleik asidi tamamlaylîlîl bir nükleotid sekansa ve ii) allele özgü reaktif primerdeki
nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer olarak hareket edememesi amaclýla,
tamamlayüßlmayan nükleotidin 3' ucunda mevcut olmasEliiaIinde DNA polimeraz düzeltme
etkinligi taraf-an ortadan kaldlBIâcak, primerin 5' yönüne tamamlaylEIZblmayan nükleotidin
hemen öncesinde bulunan bir nükleotidden, primerin 5' ucunda bulunan bir nükleotide kadar
olan bölgede bulunan bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotidi(leri) içeren bir allele
özgü reaktif primerin (ASRP) mevcudiyetinde hedef nükleik asidin güçlendirilmesini
içermektedir.
Mevcut bulusta kullanllân allele özgü reaktif primer (bundan sonra “ASRP” olarak ifade
edilecek), konvansiyonel allele özgü PCR'lerin sorunlarIElçözmek için tasarlanan bir
primerdir. Mevcut bulusa göre, hedef nükleik asit, allele özgü primerdeki nükleotidin
polimeraz reaksiyon için bir primer olarak hareket edememesi için, 3' ucunda tamamlayIEEl
olmayan bir nükleotidin mevcut olmasüdurumunda DNA polimeraz. düzeltme etkinligi
tarafEtlan ortadan kaIdIEIlâcak, tamamlayülmayan nükleotidin hemen önünde bulunan bir
nükleotidden, primerin 5' yönüne, primerin 5' ucunda bulunan bir nükleotide kadar olan
bölgede bulunan bir veya daha fazla istenen modifiye edilmis nükleotidi(leri) spesifik olarak
güçlendirebilmek amaclýla hedef nükleotid asidi tamamlaylîlîbir nükleotid sekanslîiçeren
allele özgü reaktif primer ve düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz kullanllârak spesifik bir
sekilde güçlendirilebilmektedir.
Burada kullanIlgiügibi, "hedef nükleik asit” terimi, tespit edilecek nükleik asit sekansIEaDNA
veya RNA) ifade etmekte ve hedef nükleik asit, bir primer veya hibridizasyon, tavlama veya
amplifikasyon kosullarElaltIaki sonda halinde melezlestirilmektedir. “Hedef nükleik asit”
terimi, burada kullanHân “hedef nükleik asit sekansEl veya “hedef sekans" terimleriyle
degistirilebilir bir sekilde kullanilB1aktadlB
Burada kullanI[g]l:gibi, “hibridizasyon” terimi, tamamlaylEEtek zincirli nükleik asitlerin çift
zincirli nükleik asidi olusturmaslîlanlam. gelmektedir. Hibridizasyon, iki nükleik asit zinciri
araletlaki tamamlaylEllIglEl, mükemmel olmasEl(mükemmel uyum) veya bazlîluyumsuz
kallEtHârI mevcut olmasEldurumunda meydana gelebilmektedir. Hibridizasyona yönelik
tamamlaylîlliKl seviyesi, hibridizasyon kosullar., özellikle slîlakllgh baglü olarak
degisebilmektedir.
Mevcut bulusta, allele özgü reaktif primer, allele özgü reaktif primerin modifiye edilmis
nükleotidinin sonraki 3' tarafIa bulunan bir nükleotidin hedef nükleik asidi tamamlaylîlîl
olmasEhalinde, DNA polimeraz. düzeltme etkinligi taraflEtlan ortadan kaldEllBiamasElve
nükleotidin hedef nükleik asidi tamamlaylEElolmamasEldurumunda ise DNA polimeraz.
düzeltme etkinligi taraf-an ortadan kaldlElIBwasEl/e böylelikle modifiye edilmis nükleotidin 3'
ucunda kalmaslîile karakterize edilmektedir.
Mevcut bulusta, düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz, 3' -> 5' etkinligine sahip
olabilmektedir.
Mevcut bulusta, allele özgü reaktif primerde polimeraz reaksiyonuna yönelik bir polimer
olarak hareket edemeyen nükleotid gibi degistirilmis nükleotid, deoksinükleotid ve ters (geri)
deoksinükleotidden olusan gruptan seçilen en az biriyle ikame edilmis nükleotid
olabilmektedir. Mevcut bulus örneginde, 3' ucundaki nükleotidin deoksinükleotid ile
degistirildigi ASRP kullanlliilgl olmakla birlikte, herhangi bir sIEhma yapIIIhamakta ve
teknikte bilinen herhangi konvansiyonel nükleotid modifikasyon yöntemi kullanllâbilmektedir.
Mevcut bulusa göre bir hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik yöntem: (a) bir
hibridizasyon ürünü elde etmek amaclsîla hedef nükleik asidin allele özgü reaktif primerle
(ASRP) karlgtlîllîhaslîlve melezlestirilmesi; (b) düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz
mevcudiyetinde hibridizasyon ürününde hedef nükleik asidin güçlendirilmesi; ve (c) hedef
nükleik asidin amplifikasyon ürününün varlglüa veya yokluguna bagllîblarak hedef nükleik
asidin tespit edilmesi ad larügermektedir.
Mevcut bulusta, ASRP mevcudiyetinde hedefe özgü amplifikasyon için, 3' -> 5' düzeltici
eksonükleaza sahip bir DNA polimeraz. kullanllîhaslîgerekmektedir. Enzim DNA polimeraz
mevcudiyetinde, genel primerin bir sablon DNA'ya (hedef nükleik asit) baglanmasEl
durumunda ve primerin 3' ucunun sablon DNA'yEtamamlaylEDiitelikte olmaslîdurumunda,
DNA polimeraz reaksiyonu, düzeltme olmadan 5' -> 3' yönünde ilerlerken (SEKIL 1A), 3'
ucundaki bir veya daha fazla nükleotidin sablonu tamamlaylîlîlolmayan nitelikte olmasü
durumunda, nükleotidlerin tamamIElyaran düzeltme reaksiyonu, tamamlaylEElolmayan
nükleotidlerin say_ bakilîhaks- gerçeklestirilmekte ve daha sonra, sablonu tamamlaylED
yeni bir nükleotid sekanslîlsentezlenmektedir (SEKIL IB). Mevcut bulusa göre ASRP'nin
kullanI[g]I:l/akada, primerin 3' ucunun sablonu tamamlaylEEhitelikte olmasEhaIinde, DNA
polimeraz reaksiyonu, düzeltme olmadan 5' -> 3' yönünde ilerlerken (SEKIL 1C), genel
primerin kullanIiIa oldugu gibi, 3' ucundaki nükleotidlerin sablonu tamamlaylElZblmayan
nitelikte olmasüdurumunda, tamamlaylEEIolmayan nükleotidlerin tamami: tamamlaylîEl
olmayan nükleotidlerin say_ bakliüiakslîlîil, düzeltme reaksiyonu taraflEblan ortadan
kaldlBliiaktadB (SEKIL 1D). Düzeltme reaksiyonunun tamamlanmasIan sonra,
deoksinükleotid, 3' ucunda kalmakta ve DNA polimeraz reaksiyonu durdurulmakta, çünkü bu
yaplýla sahip ASRP, polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer olarak hareket edememektedir.
Dolaylîlîla, düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz ve ASRP kombinasyonunun DNA
polimeraz reaksiyonunu indüklemek için kullanilüiaslîtlurumunda, yalnlîta spesifik sekansa
sahip sablon DNA'slÇlseçici bir sekilde güçlendirilebilmekte, çünkü ASRP, yalnlîta kendisini
tamamlaylîßablonla bulusmasülurumunda polimeraz reaksiyonuna sebep olmaktadE
Mevcut bulusta, allele özgü reaktif primer (ASRP) derisimi, 0.1 ila 20 M olabilmektedir ve
ad! (b)'deki amplifikasyon islemi, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafIan
gerçeklestirilebilmektedir.
Mevcut bulusta, allele özgü reaktif primerin, hedef nükleik asidi tamamlayüîhitelikte olmasi]
durumunda, hedef nükleik asidin amplifikasyon ürünü üretilmekte (Uyum/AçüZD, ve allele
özgü reaktif primerin hedef nükleik asidi tamamlaylEßlmayan nitelikte olmaslîdlurumunda ise
uyumsuz nükleotidler, DNA polimeraz düzeltme etkinligi tarafEUan ortadan kaIdIElIÜiakta ve
hedef nükleik asidin amplifikasyon ürünü, primerin 3' ucunda kalan modifiye edilmis
nükleotidden dolayEiIiretilmemektedir (Uyumsuz/KapalDZl
Mevcut bulusta, hedef nükleik asit, DNA veya RNA olabilmekte ve bir mutasyon veya patojen,
mevcut bulusun hedef nükleik asit tespiti kullan [lârak tespit edilebilmektedir.
Mevcut bulusun yönteminin bir mutasyonu tespit etmek için kullanmaslîrliurumunda, yalnlîta
tek nükleotid polimorfizm degil, aynEkamanda hedef nükleik asidin nükleotidinin ikamesi,
silinmesi veya eklenmesinin sebep oldugu mutasyon da tespit edilebilmektedir. Buna ek
olarak, hedef nükleik asitte hiçbir mutasyonun mevcut olmamasEliialinde, hedef nükleik asidin
amplifikasyon ürünü üretilecek ve mutasyonun hedef nükleik asitte mevcut olmasü
durumunda ise, hedef nükleik asidin amplifikasyon ürünü üretilmeyecektir.
Mevcut bulusun bir örneginde, mevcut bulusun allele özgü reaktif primerini (ASRP) kullanarak
bir mutasyonu tespit etmek amaclýla, tipik bir kanser hücresi mutasyonu olan BRAFI/öûûE
somatik nokta mutasyonunun tespit edilmesine yönelik bir deney gerçeklestirilmistir. Sonuç
olarak, genel primerin kullanIJBiasD durumunda, yalnlîta BRAFI/öUUE mutasyonunun
amplifikasyonu degil (SEKIL 2'deki 2. serit), aynüzamanda yabanllîltip BRAFI spesifik
olmayan amplifikasyonunun (SEKIL 2'deki 1. serit) da meydana geldigi görülebilmektedir.
Ancak, ASRP kullanllârak PCR'nin gerçeklestirilmesi durumunda, sablon olarak kullanElân
yabanlllip BRAF, güçlendirilmemis (SEKIL 2'deki 5. serit) ve yalnlîta sablon olarak kullanllân
BRAFVâÜÜL-'mutasyonu güçlendirilmistir (SEKIL 2'deki 4. serit).
Mevcut bulusun yöntemi kullanllârak bir patojenin tespit edilmesi yöntemi, hedef nükleik
asidin amplifikasyon ürününün patojen mevcudiyetinde üretilmesi ve patojenin yoklugunda
üretilmemesi ile karakterize edilmektedir. Mevcut bulusta kullanllân patojen, bir hastal[gla
sebep olan mikro organizma olmakta ve virüs, öbakteri, mantar ve protozoadan olusan
gruptan seçilebilmekte, ancak bununla sIlElllllmamakta ve dogrudan hastaligb sebep olacak
sekilde insanlarlîxle hayvanlarßnfekte eden herhangi organizmayülçermektedir.
Buna ilaveten, mevcut bulusun hedef nükleik asit tespit yöntemi, sitozin ile metillenmis geni
tespit etmek için kullanllâbilmektedir. Bu durumda, metillenmis hedef nükleik asidin
amplifikasyon ürünü üretilmekte ve metillenmemis hedef nükleik asidin amplifikasyon ürünü
ise üretilmemektedir.
Burada kullanIlglElgibi, “metillenme” terimi, bir metil grubunun 5-metilsitozin (5-mC)
olusturmak için sitozin halkalelEl 5-karbonuna takllmasljnlam- gelmektedir. 5-metilsitozin,
her zaman yalnlîta CG dinükleotidin (5'-mCG-3') C'sine takllBiakta ve bu CG, sllZIlKla CpG
olarak Ifade edilmektedir. Bu CpG'nin metillenmesi, alu veya transpozon gibi genomlardaki
yinelemeli sekansI ekspresyonunu inhibe etmektedir. Buna ek olarak, CpG, memeli
hücrelerindeki epigenetik degisimin en sllZllKla meydana geldigi bir alandlE Bu CpG'nin 5-
mC'si, dogal yolla T'ye deamine edilmekte ve böylelikle, memeli genomlarIdaki CpG, normal
frekanstan (1/4 x 1/4 = %6,25) çok daha düsük olan yalnlîta %1 oranIa frekans
sergilemektedir.
CpG'nin son derece entegre oldugu bölgeler, CpG adalarlîblarak bilinmektedir. CpG adalarÇl
0.2-3 kb uzunlugunda olan ve %50'den daha fazla C+G içerigine ve %3.75'ten daha fazla
CpG oranlüb sahip olan alanlarElfade etmektedir. Insan genomunda takriben 45,000 CpG
adasübulunmakta ve bunlar çogunlukla genlerin ekspresyonunu düzenleyen promotör
bölgelerde bulunmaktadEi Esasen, CpG adalarÇlinsan genlerinin takriben %50'sine tekabül
eden referans genlerin promotörlerinde meydana gelmektedir (Cross, S. & Bird, A.P., Curr.
Opin. Gene Develop., 5:309, 1995).
Mevcut bulusa göre metillenmis hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik yöntem,
spesifik olarak: (a) metillenmis sitozin nükleotidi dönüstürmeden, metillenmemis sitozin
nükleotidi urasil veya sitozinin dlgEUaki diger nükleotidlere dönüstürmek amaciyla hedef
nükleik asidin kimyasal veya enzimatik olarak islenmesi; (b) hibridizasyon ürünü elde etmek
amaclîla kimyasal veya enzimatik olarak islenmis hedef nükleik asidin allele özgü reaktif
primerle (ASRP) karlgtlEllBiasDi/e melezlestirilmesi ve düzeltme etkinligine sahip bir DNA
polimeraz mevcudiyetinde hibridizasyon ürününde hedef ürünün güçlendirilmesi; ve (c) hedef
nükleik asidin amplifikasyon ürününün varl[g]lEb veya yokluguna baglEbIarak hedef nükleik
asidin metillenmesinin tespit edilmesi adIiIarIÜlçermektedir.
Mevcut bulusa göre ASRP kullanilârak hedef nükleik asidin metillenmesinin tespit edilmesi
yöntemi, metillenmis sitozin nükleotidi dönüstürmeden, metillenmemis sitozin nükleotidi
urasil veya sitozinin dElEdaki diger nükleotidlere dönüstürmek amaclsîla hedef nükleik asidin
kimyasal veya enzimatik olarak islenmesi adIiIIZIçermektedir. Metillenmis nükleik asidin
tespit edilmesi için, 3' -> 5' düzeltme eksonükleaza sahip bir DNA polimerazI kullanHEhaslZl
gerekmektedir. Genel primerin bir sablona baglanmasEl/e primerin 3' ucunun metillenmis
hedef nükleik asidi tamamlayIEEInitelikte olmasEIdurumunda, DNA polimeraz reaksiyonu,
düzeltme yapmadan 5' -> 3' yönünde ilerlemektedir. Metillenmemis sitozin nükleotidin urasil
veya sitozinin dSIEUaki diger nükleotidlere dönüstürülmesi durumunda, 3' ucundaki
nükleotidin sablonu tamamlaylEEblmayan nitelikte olmaslîtlurumunda bile, DNA polimeraz.
düzeltme etkinligi taraflüdan tamamlaylEEiblmayan nükleotidi yaran bir düzeltme reaksiyonu
gerçeklestirilmekte ve daha sonra sablonu tamamlaylEEl yeni nükleotid sekansEl
sentezlenmektedir.
Mevcut bulusa göre ASRP'nin kullanIlglElvakada, primerin 3' ucunun metillenmis hedef
nükleik asidi tamamlaylîllitelikte olmasEdurumunda, DNA polimeraz reaksiyonu, düzeltme
yapmadan 5' -> 3' yönünde ilerlerken, metillenmemis sitozin nükleotidin urasil veya sitozinin
dlglEUaki diger nükleotidlere dönüstürülmesi ve primerin 3' ucundaki nükleotidlerin sablonu
tamamlaylajolmayan özellikte olmasElhalinde, tamamlaylîljolmayan nükleotidler, DNA
polimeraz. düzeltme reaksiyonu tarafIan ortadan kaldBlIhaktadlEl Düzeltme
reaksiyonunun tamamlanmasIan sonra, deoksinükleotid, 3' ucunda kalmakta ve DNA
polimeraz reaksiyonu durdurulmakta, çünkü bu yapiya sahip ASRP, DNA polimeraz
reaksiyonuna yönelik bir primer olarak hareket edememektedir.
Mevcut bulusun diger örneginde, mevcut bulusun allele özgü reaktif primeri (ASRP)
kullanllârak bir metillenmis geni tespit etmek amaclýla, insan SDCZ geninin metillenmesinin
tespit edilmesine yönelik bir deney gerçeklestirilmistir. Sonuç olarak, genel primerin
kullanilIhaslZdurumunda, amplifikasyon ürününün metillenmeye özgü primer kullanllga bile
hem metillenmis SDCZ (SEKIL 3'teki 1. serit) hem de metillenmemis SDCZde (SEKIL 3'teki
serit 2) göründügü, buna karsHJKi SDCZ metillenmeye özgü ASRP'nin kullanilIhaslZl
durumunda, spesifik amplifikasyon ürününün metillenmis 5062'de (SEKIL 3'teki 4. serit)
gözlemlendigi, ancak metillenmemis SDCZ'de (SEKIL 3'teki 5. serit) hiçbir amplifikasyonun
meydana gelmedigi gösterilmistir.
Mevcut bulusta, metillenmemis sitozin nükleotidin urasile dönüstürülmesine yönelik bir
bilesik, bisülfit olabilmektedir. Mevcut bulusun bir örneginde kullanilân SDCZ geni, sitozin
nükleotidin urasile dönüstürüldügü bir nükleotid sekansEkullanllârak sentezlenmis bir gen
olmus ve bisülût isleme süreci, bu örnekte yer almam [SIE
Diger yönde, mevcut bulus, DNA kütüphanesinden gelen spesifik nükleotid sekansIan
baslayarak bir hedef nükleik asidin güçlendirilmesine iliskin bir yöntemle ilgili olmakta; söz
konusu yöntem, düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz ve, 5' ucunda, DNA
kütüphanesinin adaptör sekansIEtamamlaylîEhükleotid sekansIElçeren ve 3' ucunda ise
allele özgü reaktif primerdeki nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer olarak
hareket edememesi için hedef nükleik asit ve modifiye edilmis nükleotidi(leri) tamamlaylED
nükleotid sekansEliçeren bir allele özgü reaktif primer (ASRP) mevcudiyetinde, DNA
kütüphanesinden gelen spesifik nükleik asidin güçlendirilmesini içermektedir.
Burada kullanIlglElgibi, “DNA kütüphanesi" terimi, spesifik bir organizmada mevcut tek
genlerin tamamIEIçerebilecek sekilde yeterli sayIElla klondan olusan bir koleksiyonu ifade
etmektedir. Bir genomik DNA kütüphanesi, toplam hücre DNA'sII izole edilmesi, izole edilen
DNA'nI kEinen sindirilmesi ve üretilen fragmanlar vektörler halinde klonlanmasBracEigilýla
olusturulmaktadlü Vektör olarak, daha büyük gen veya gen kümesinin klonlanabildigi BAC,
YAC, Fosmid, Cosmid ve benzeri kullanUIhas- ragmen, genellikle kullanliîhlgl olan bir
plazmid de kullanllBiaktadlB
Mevcut bulusta, hedef nükleik asidin nükleotid sekansIEiçeren DNA fragmanüseçici bir
sekilde DNA kütüphanesinden güçlendirilebilmektedir. Mevcut bulusun yöntemine göre,
spesifik nükleotid sekans- sahip bir hedef nükleik asit, allele özgü reaktif primer kullanan
yeni nesil sekanslama (NGS) kütüphanesinden güçlendirilebilmektedir.
Mevcut bulusa göre DNA kütüphanesinden gelen spesifik nükleotid sekansEla sahip bir hedef
nükleik asidin güçlendirilmesi yöntemi, spesifik olarak: (a) bir genomik DNA'nI rasgele
sindirilmesi ve bir DNA kütüphanesi hazIEliamak amaclýla, sindirilen DNA fragmanlari. hem
' hem de 3' uçlari sekanslayElldaptör sekanlelI baglanmasü(b) DNA kütüphanesinin
allele özgü reaktif primerle (ASRP) karlgtlElBrasEi/e melezlestirilmesi, burada allele özgü
reaktif primer (ASRP), DNA kütüphanesinin adaptör sekanslay-EtamamlaylEEhükleotid
sekanslîlve allele özgü reaktif primerdeki nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir
primer olarak hareket edememesi için, tamamlayEEblmayan nükleotidin 3' ucunda mevcut
olmasEIdurumunda DNA polimeraz. düzeltme etkinligi tarafßtlan ortadan kaldlElIâcak,
tamamlaylEDolmayan nükleotidin hemen öncesinde bulunan bir nükleotidden primerin 5'
yönüne ve primerin 5' ucunda bulunan nükleotide kadar olan bir bölgede bulunan bir veya
daha fazla modifiye edilmis nükleotidi(leri) içermekte; ve (c) düzeltme etkinligine sahip DNA
polimeraz. mevcudiyetinde hibridizasyon ürününde spesifik nükleotid sekanletlan
baslayarak amplifikasyonun gerçeklestirilmesi adIiIIarlZIiçermektedir. Yöntemde, hedef
nükleik asidin DNA kütüphanesinde mevcut olmasüdurumunda, amplifikasyon ürününü
üretmek amaclýla tamamlaylîlîbir sekilde allele özgü reaktif primere baglanmakta ve hedef
nükleik asidin allele özgü reaktif primeri tamamlaylEElniteIikte olmamasEldurumunda,
tamamlaylEDolmayan nükleotid, DNA polimerazI düzeltme etkinligi tarafIan ortadan
kaldlîllîhakta ve amplifikasyon ürünü, 3' ucunda kalan modifiye edilmis nükleotidlerden dolayEl
üretilmemektedir.
Mevcut bulusun yöntemine göre, yeni nesil sekanslama (NGS), DNA fragmanlarEhazlEllamak
amaclýla genomik DNA'nI rasgele sindirilmesi, sekanslaylEEladaptör sekansII bir DNA
kütüphanesi olusturmak amacEla DNA fragmanlarlüi hem 5' hem de 3' uçlari baglanmasEl
ve DNA kütüphanesinden gelen spesifik nükleotid sekans- sahip DNA fragmanlarII seçici
bir sekilde güçlendirilmesi araciEigNla gerçeklestirilebilmektedir. SEKIL 4A'da gösterildigi gibi,
bir kütüphane olusturulmakta, sekanslamaya yönelik adaptörün 5' ucundaki nükleotidin
ardIan Zi"Ci nükleotidi içeren nükleotidler araletlan seçilen, modifiye edilmis nükleotidin 3'
tarafia bulunan nükleotidlerin bir veya daha fazlasi. tamamlaylEßlmayan nitelikte olmasD
halinde, örnegin, N'nin (; A, T, C, G) (adaptör sekansII ucundaki nükleotidin hemen
öncesinde bulunan 1inCI nükleotid) ASRP'yi tamamlaylED nitelikte olmasüdurumunda,
kütüphane, düzeltme olmadan güçlendirilmekte, tamamlaylElZlolmayan nitelikte olmasIZI
halinde, nükleotid, düzeltme islemi aracülgllîla ortadan kaldlElB'iakta ve polimerizasyon
meydana gelmemektedir. DolayElýla, bu sürece göre, yalnlîta spesifik nükleotidden
baslayarak genomik DNA fragmanIEIhtiva eden DNA fragmanlarÇlseçici bir sekilde bir DNA
kütüphanesinden güçlendirilebilmektedir.
Mevcut bulusa göre, bir metillenmis hedef nükleik asit, bir DNA kütüphanesinden
güçlendirilebilmektedir. Spesifik olarak, bir metillenmis hedef nükleik asidin amplifikasyonuna
yönelik yöntem: (a) metillenmis sitozin nükleotidi dönüstürmeden, metillenmemis sitozin
nükleotidi urasil veya diger nükleotidlere dönüstürmek amacMa bir genomik DNA'nI
kimyasal veya enzimatik olarak islenmesi; (b) genomik DNA'nI rasgele sindirilmesi ve bir
DNA kütüphanesi olusturmak amacMa sekanslama adaptörünün sindirilmis DNA
fragmanlar.. hem 5' hem de 3' uçlarlEla baglanmaslîl(c) DNA kütüphanesinin bir allele özgü
reaktif primerle (ASRP) karlgtlîllEwasB/e melezlestirilmesi, burada ASRP, allele özgü reaktif
primerdeki nükleotidin bir polimeraz reaksiyonuna yönelik primer olarak hareket edememesi
amacüla 3' ucunda sitozin ve bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotid(ler) ve DNA
kütüphanesinin adaptör sekansIEtamamlayEEbir nükleotid sekansIDçermektedir; ve (d)
düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz. mevcudiyetinde hibridizasyon ürünündeki
metillenmis hedef nükleik asidin nükleotid sekansIE] içeren bir DNA fragmanII
güçlendirilmesi, burada metillenmis hedef nükleik asit, güçlendirilmekte ve metillenmemis
hedef nükleik asit güçlendirilmemektedir.
Yeni nesil sekanslamanI (NGS), genomik DNA'nlEl bisülfit ile islenmesinden sonra
gerçeklestirilmesi durumunda, yeni nesil sekanslama (NGS) islemi, sekanslama sekansII
hem 5' hem de 3' uçlari baglanmasßraclüglýla olusturulan kütüphaneden mevcut bulusun
yöntemi kullanilârak metillenmis nükleotid sekanleh sahip DNA fragmanlarII seçici bir
sekilde güçlendirilmesi araclEglýla gerçeklestirilebilmektedir. SEKIL 4B'de gösterildigi gibi,
bisülfit ile islenmis genomik DNA kullanilârak olusturulan bir kütüphanenin, 5' ucunda bir
adaptör sekans. ve 3' ucunda ise deoksinükleotid ile modifiye edilmis nükleotid sekanleb
ve metillenmis sitozin (C) sekanlela sahip olmak için hazlühnan ASRP kullanüârak düzeltme
etkinligine sahip bir DNA polimeraz ile güçlendirilmesi durumunda, DNA kütüphanesindeki
DNA fragmanII birinci nükleotidinin metillenmis sitozin olmaslZlhalinde, DNA fragmanü
düzeltme olmadan güçlendirilmekte ve nükleotidin tamamlaylEElolmayan nitelikte olmasEl
halinde, düzeltme reaksiyonu tarafIan ortadan kaldlîllmakta ve DNA fragmanÇB' ucunda
kalan modifiye edilmis nükleotidden dolayElgüçlendirilmemektedir. DolayElýla, bu sürece
göre, bir metillenmis DNA fragmanEliçeren DNA fragmanlarü seçici bir sekilde bir DNA
kütüphanesinden güçlendirilebilmektedir.
Yine diger yönde, mevcut bulus, bir hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir
yöntemle ilgili olmakta, söz konusu yöntem, (i) 5' ucunda, hedef nükleik asidi tamamlaylEEl
olmayan bir nükleotid sekansIEilçeren bir etiketleme sekansÇlmodifiye edilmis tek nükleotid
ve hedef nükleik asidi tamamlaylEEbir nükleotid sekansIEiçeren allele özgü reaktif primer
(ASRP), söz konusu allele özgü reaktif primer (ASRP), primerin DNA polimeraz. yönelik bir
primer olarak hareket edemeyecegi sekilde modifiye edilen bir 3' ucuna sahiptir; (ii) bir
etiketleme sekansIElve hedef nükleik asidi tamamlaylîElnükIeotid sekansII bir klgmIEI
içeren bir raportör sablon; ve (iii) 3'->5' eksonükleaz etkinligine sahip bir DNA polimeraz
mevcudiyetinde, hedef nükleik asidin güçlendirilmesini içermektedir.
Mevcut bulusta, allele özgü reaktif primerin etiketleme sekansÇ] 15 ila 30 nükleotidden
olusabilmekte ve modifiye edilmis tek nükleotid, DNA polimeraz. yönelik bir primer olarak
hareket edememektedir.
Mevcut bulusa göre raportör salon, 3' ucunda etiketleme sekans. baglanabilen bir nükleotid
sekansElve hedef nükleik asidi (hedefe özgü sekans) tamamlaylEElnükIeotid sekansa
tamamlaylEEbir sekilde baglanabilen tek nükleotidi (N: A, T, C veya G) içermekte ve 5'
ucunda ise 20 hp veya daha büyük bir boyuta sahip bir yapay sekans içermektedir.
Mevcut bulusa göre bir hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik yöntem, su adIilarEl
içermektedir: (a) spesifik olarak hedef nükleik asidin: (i) 5' ucunda hedef nükleik asidi
tamamlaymlmayan nükleotid sekanslülçeren bir etiketleme sekanslümodifiye edilmis tek
nükleotidi ve hedef nükleik asidi tamamlaylEÜhükIeotid sekansIEilçeren ve allele özgü reaktif
primerdeki nükleotidin polimeraz reaksiyonuna yönelik bir primer olarak hareket edememesi
amacüla 3' ucunda bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotide(lere) sahip olan bir allele
özgü reaktif primer (ASRP); (ii) etiketleme sekansDve hedef nükleik asidi tamamlaylED
nükleotid sekansII bir klîmIEliçeren bir raportör sablon; ve (iii) hedef nükleik asidi
tamamlaylEEEJir primer ile karlgtlîlllîhasüle melezlestirilmesi; (b) 3'->5' eksonükleaz etkinligine
sahip bir DNA polimerazlZl/e bunu takiben raportör sablona hibridizasyon aracHJEIýla, hedef
nükleik asitle melezlesmeyen 5' ucu etiketleme sekanlelEiçeren allele özgü reaktif primerin
bir kEmII ortadan kald lEllIhaslîlve (c) melezlestirilmis raportör sablonun güçlendirilmesi ve
raportör sablonun ampliûkasyon ürününün varllgi. veya yokluguna baglElolarak hedef
nükleik asidin tespit edilmesi. Bu yöntemde, hedef nükleik asidin mevcut olmamasEl/eya
hedef nükleik asidin bir mutasyon ihtiva etmesi durumunda, raportör sablonun amplifikasyon
ürünü üretilmekte ve hedef nükleik asidin mevcut olmasülurumunda ise amplifikasyon ürünü
üretilmemektedir.
SEKIL 5'te gösterildigi gibi, mevcut bulusta, 3'->5' eksonükleaz etkinligine sahip bir DNA
polimeraz kullanilârak PCR gerçeklestirmek için, sablonun (hedef nükleik asit) orta klîl'nl
tamamlaylEEbir sekilde baglanabilen bir allele özgü reaktif primer, her iki uç primerine ek
olarak olusturulmustur. Mevcut bulusun allele özgü reaktif primerinin, DNA polimerazlEla
yönelik bir primer ve PCR reaksiyonunda bir primer olarak hareket edemeyecek sekilde 3' ucu
modifiye edilmistir. Allele özgü reaktif primerin 5' ucuna, ikincil PCR'ye yönelik bir sablon
olarak kullanllâcak olan ve bir PCR primeri olarak hareket edebilen bir raportör sablona
baglanan bir etiketleme sekansEbaglIlE Etiketleme sekansEEi, deoksinükleotid (dN: dA, dT,
dG veya dC) halinde modifiye edilmis tek nükleotid ve hedef nükleik asidi (hedefe özgü
sekans) tamamlaylîüliükleotid sekansEBJaglanmaktadE
Mevcut bulusta, allele özgü reaktif primerin modifiye edilmis tek nükleotidinin (dN) 3'
tarafIa bulunan nükleotidin (N), hedef nükleik asitle uyumlu olmasEhalinde, etiketleme
sekansII 3' ucuna baglElnodifiye edilmis tek nükleotidi (dN) içeren bir fragman, 3'->5'
eksonükleaz etkinligine sahip DNA polimeraz tarafüdan yapllüîaktadß Bu fragman,
tamamlaylEEbir sekilde raportör sablona baglanabilmekte, ancak fragman. amplifikasyonu
meydana gelmemekte ve fragman. amplifikasyon ürünü üretilmemekte, çünkü 3' ucundaki
nükleotid, deoksinükleotid halinde modinye edilmektedir. Ancak, allele özgü reaktif primerin
modifiye edilmis tek nükleotidinin (dN) 3' tarafIa bulunan nükleotidin (N) hedef nükleik
asidin mutasyonundan dolayElhedef nükleik asidin nükleotid sekanslîla uyumsuz olmasü
durumunda, etiketleme sekansII 3' ucundaki modifiye edilmis tek nükleotid (dN) ve
modifiye edilmis tek nükleotidin (dN) 3' tarafIda bulunan nükleotid (N: A, T, G veya C), 3'-
>5' eksonükleaz etkinligine sahip DNA polimeraz tarafHan baglüdurumdayken ortadan
kaldlBIB'iakta ve böylelikle raportör plakaya tamamlaylEElbir sekilde baglanabilen bir fragman
yapmaktadir-al Bu fragman, raportör sablonuna tamamlayüîlbir sekilde baglanmakta ve
modifiye edilmis nükleotid degil, genel nükleotid (N), fragman. 3' ucuna baglanmaktadlEi
Böylelikle, fragman. amplifikasyonu meydana gelmekte ve fragman. amplifikasyon ürünü
üretilmektedir.
Mevcut bulusta, hedef nükleik asit, DNA veya RNA olabilmekte ve mevcut bulusun hedef
nükleik asit tespit yöntemi, bir mutasyonu tespit etmek için kullan Hâbilmektedir.
Mevcut bulusun yönteminin bir mutasyonu tespit etmek için kullanilmasmurumunda, yalnlîta
tek nükleotid polimorfizmi degil, aynElzamanda bir nükleotidin ikamesi, silinmesi veya
eklenmesinin sebep oldugu mutasyon da tespit edilebilmektedir. Buna ek olarak, hedef
nükleik asitte hiçbir mutasyonun mevcut olmamasEhaIinde, raportör sablonun amplifikasyon
ürünü üretilecek ve mutasyonun hedef nükleik asitte mevcut olmasüiurumunda ise, raportör
sablonun amplifikasyon ürünü üretilmeyecektir.
Mevcut bulusun allele özgü reaktif primerini (ASRP) ihtiva eden bir kit hazlEIianabilmektedir.
Kit, amaçlanan kullanIia baglEblarak çesitli yollarda yapllândlîilâbilmektedir. Tercihen kit,
hedef nükleik asitteki bir mutasyonun tespit edilmesi, hedef nükleik asidin metillenmesinin
tespit edilmesi ve bir DNA kütüphanesinden gelen hedef nükleik asidin seçici amplifikasyonu
için kullanüâbilmektedir.
Kit, amaçlanan kullanIia baglEblarak düzeltme etkinligine sahip DNA polimeraz veya 3'->5'
eksonükleaz etkinligine sahip DNA polimeraz içerebilmekte ve opsiyonel olarak, tampon ve
deoksiribonükleotid-S-trifosfat gibi hedef amplifikasyon PCR reaksiyonu (örnegin PCR
reaksiyonu) için gerekli reaktifleri içerebilmektedir. Opsiyonel olarak kit, aynüamanda çesitli
polinükleotid moleküller, çesitli tamponlar, reaktifler ve DNA polimeraz. inhibe edilmesine
yönelik antikorlar içerebilmektedir.
Kitte, spesifik reaksiyonlarda kullanllân reaktiflerin en uygun miktarü tarifnamenin
açlEIamaleUan teknikte uzman kisiler tarafüdan belirlenebilmektedir. Tipik olarak kit, ayrElbir
ambalaj seklinde veya yukari bahsedilen bilesenleri ihtiva eden bir bölme seklinde
hazlEhnmaktadlEI
ÖRNEKLER
Bundan sonra mevcut bulus, örneklere atlflîa bulunarak ayrlEtiJIIIJir sekilde açlElanacaktlEl Bu
örneklerin yalnEta açiEiama amaclîlgüttügü ve mevcut bulusun kapsamIIüleliamayEl
amaçlamadlglüteknikte uzman kisiler için belirgin olacaktlü DolayElsîla, mevcut bulusun
önemli bir kapsamlÇlekteki istemler araclIJIjIEa tanIiIanacaktlEl
Örnek 1: ASRP kullanarak BMFVöOOEmutasvonunun tespiti
Mevcut bulusun allele özgü reaktif primerini (ASRP) kullanarak bir mutasyonu tespit etmek
için, tipik olarak bir kanser hücresi mutasyonu olan (BRAFVöOOEI'1799A) somatik nokta
mutasyonunun tespitine yönelik bir deney gerçeklestirilmistir.
Bir mutasyon (yabanlllip BRAF(B-tipi Raf kinaz; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1) BRAFV600E
(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2)) hazlîiiamak için, T-A mutasyonuna sahip BRAFVöOOE geni
sentezlenmis (Bioneer, Kore), ve TOPcloner TA core kit (Enzynomics, Kore) (Bioneer, Kore)
kullanilârak pTOP TA V2 plazmid vektörünün (Enzynomics, Kore) içinde klonlanmlgtlEl
BRAFVöOOE nokta mutasyonunun amplifikasyonu için, BRAFl/6005'yi tamamlayIEESekansa
sahip bir ileri genel primer (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3), BRAFl/600E'yi tamamlaylEEl
sekansa sahip olan ve 3' ucunda 2"Ci nükleotide iliskin bir deoksiguanin (dG) ikamesine sahip
olan bir ileri ASRP primer (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4) ve BRAFI/öÜÜEyI tamamlaylEIZI
sekansa sahip ters primer (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5), sentezlenmistir (Bioneer, Kore):
105 kopya yabaniEItip BRAF ve BRAFVöOOE mutant plazmidi, PCR amplifikasyonuna yönelik
sablonlar olarak kullanllîhlgi ve 3' -> 5' düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz olarak,
Pfu polimeraz (HelixAmpTM Power-Pfu Polymerase, Nanohelix, Kore) kullaniIÜilStlEl PCR islemi,
Veriti® lîlDdöngüleyici (Applied Biosystems, Singapur) kullanilârak gerçeklestirilmis ve PCR
kosullarüsu sekildedir. 105 kopya sablon, 2.5 ,u/ 10X Power-pfu tampon, 1 p/dNTP karlSImEl
(10 mM), 1 ,u/ her bir primer (4 pmoI/ul), ve Pfu polimeraz (HelixAmpTM Power-Pfu
Polymerase, 1.25 birim) ise, toplam 25 ,u/ hacmine ilave edilmis ve daha sonra PCR islemi,
asaglki Tablo 1'de gösterilen kosullar aItIda gerçeklestirilmistir.
Tablo 1: PCR reaksiyon kOSullarEl
SIEthilZl Reaksiyon süresi
95 °C 5 dk. 1 çevrim
95 °C 20 sn. 40 çevrim
59 °C 40 sn.
72 °C 40 sn.
72 °C 5 dk. 1 çevrim
,u/ PCR reaksiyon ürünü, 5X DNA yükleme boyasgla karlgtlElB'iS] ve %3 agaroz jel
(SeaKem LE Agarose, ABD) üstüne yüklenmis ve amplifikasyon ürününün boyutu analiz
edilmistir.
Sonuç olarak, genel primerin kullanüBiaslZUurumunda, yalnlîta BRAFI/EOOE mutasyonunun
amplifikasyonu degil (SEKIL 2'deki 2. serit), aynlZlzamanda yabanlEltip BRAF'I spesifik
olmayan amplifikasyonunun (SEKIL 2'deki 1. serit) da meydana geldigi görülebilmektedir.
Ancak, ASRP kullanllârak PCR'nin gerçeklestirilmesi durumunda, sablon olarak kullanilan
yabanEEtip BRAF, güçlendirilmemis (SEKIL 2'deki 5. serit) ve yalnlîta sablon olarak kullanllân
BRAFVöOOL-'mutasyonu güçlendirilmistir (SEKIL 2'deki 4. serit).
Örnek 2: ASRP kullan [Birak metillenmenin tespit edilmesi
Mevcut bulusun allele özgü reaktif primerini (ASRP) kullanarak metillenmis geni tespit etmek
için, insan SDCZ geninin metillenmesinin tespit edilmesine yönelik bir deney
gerçeklestirilmistir.
Metillenmis SDCZ (Syndecan-Z) nükleotid sekansEl(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6) ve
metillenmemis SDCZ nükleotid sekansEaSEKANS KIMLIK NUMARASI: 7), gen sentez yöntemi
aracillgllýla olusturulmus (Bioneer, Kore), ve TOPcloner TA core kit (Enzynomics, Kore)
(Bioneer, Kore) kullanllârak pTOP TA V2 plazmid vektörünün (Enzynomics, Kore) içinde
klonlanmlgtlEl Metillenmis SDCZnin amplifikasyonu için, metillenmis SDCZ'yi tamamlayIED
sekansa sahip bir ileri genel primer (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8), metillenmis SDCZ'yi
tamamlaylîllekansa sahip olan ve 3' ucunda 2nCI nükleotide iliskin bir deoksiguanin (dG)
ikamesine sahip olan bir ileri ASRP primer (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9) ve metillenmis
SDCZ'yi tamamlaylEDsekansa sahip ters primer (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10),
sentezlenmistir:
105 kopya metillenmis SDCZ ve metillenmemis SDCZ plazmidi, PCR amplifikasyonuna yönelik
sablonlar olarak kullanüîhlgl ve 3' -> 5' düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz olarak,
Pfu polimeraz (HelixAmpTM Power-Pfu Polymerase, Nanohelix, Kore) kullanüßügtß PCR islemi,
Veriti® ElDdöngüleyici (Applied Biosystems, Singapur) kullanllârak gerçeklestirilmis ve PCR
kosullarüsu sekildedir. 105 kopya sablon, 2.5 p/ 10X Power-pfu tampon, 1 ,u/dNTP karlgEiiEl
(10 mM), 1 p/ her bir primer (4 pmol/ul), ve Pfu polimeraz (HelixAmpTM Power-Pfu
Polymerase, 1.25 birim) ise, toplam 25 ,u/ hacmine ilave edilmis ve daha sonra PCR islemi,
asag-ki Tablo 2'de gösterilen kosullar altIa gerçeklestirilmistir.
Tablo 2: PCR reaksiyon kosullarEl
SlElakllK] Reaksiyon Süresi
95 °C 5 dk. 1 çevrim
95 °C 20 sn. 40 çevrim
59 °C 40 sn.
72 °C 40 sn.
72 °C 5 dk. 1 çevrim
,u/ PCR reaksiyon ürünü, 5X DNA yükleme boyaslýla karlgtlîllmg ve %3 agaroz jel
(SeaKem LE Agarose, ABD) üstüne yüklenmis ve amplifikasyon ürününün boyutu analiz
edilmistir.
Sonuç olarak, genel primerin kullanEIB1asEUurumunda, yalnlîta BRAFl/EOOE mutasyonunun
amplifikasyonu degil (SEKIL 2'deki 2. serit), aynElzamanda yabanHJtip BRAFI spesifik
olmayan amplifikasyonunun (SEKIL 2'deki 1. serit) da meydana geldigi görülebilmektedir.
Ancak, ASRP kullanilarak PCR'nin gerçeklestirilmesi durumunda, sablon olarak kullanilân
yabantllip BRAF, güçlendirilmemis (SEKIL 2'deki 5. serit) ve yalnlîta sablon olarak kullanilân
BRAFl/öÜÜEmutasyonu güçlendirilmistir (SEKIL 2'deki 4. serit).
Sonuç olarak, genel primerin kullanllüiasülurumunda, amplifikasyon ürününün metillenmeye
özgü primer kullanllga bile hem metillenmis SDCZ (SEKIL 3'teki 1. serit) hem de
metillenmemis SDCZde (SEKIL 3'teki serit 2) göründügü, buna karsEIJZl SDCZ metillenmeye
özgü ASRP'nin kullanüBiaslîlurumunda, spesifik amplifikasyon ürününün metillenmis SDCZ'de
(SEKIL 3'teki 4. serit) gözlemlendigi, ancak metillenmemis SDCZ'de (SEKIL 3'teki 5. serit)
hiçbir amplifikasyonun meydana gelmedigi gösterilmistir.
ENDÜSTRIYEL UYGULANABILIRLIK
Yukari açllZland[glEbibi, mevcut bulusa göre allele özgü reaktif primeri (ASRP) kullanan
tespit yöntemi, ASRP'nin ve düzeltici DNA polimerazI karakteristik özelliklerinden dolayüpk
yüksek amplifikasyon özgüllügüne sahip bir tekniktir. Tespit yöntemi, tek nükleotid
polimorfizm (SNP) dahil olmak üzere mutasyonlarEKnokta mutasyonu, ekleme, silme ve
benzeri) etkili bir sekilde tespit edebilmekte ve aynElzamanda bisülfit isleminden sonra
CpG'nin metillenmesini tespit etmek veya DNA kütüphanesinden istenen nükleotid sekansüla
baslanarak bir hedef DNA'ylîgiüçlendirmek ve tespit etmek için kullan Dâbilmektedir.
Mevcut bulusun spesifik özelliklere atlfila bulunarak ayrlEtlUDair sekilde açlElanmE olmas
ragmen, bu açlElamanI yalnlîta tercih edilen bir yapllândlülnaya yönelik oldugu ve mevcut
bulusun kapsamIIEIleIlamadlglü teknikte uzman kisiler için açliZtlE DolayEIýla, mevcut
bulusun önemli bir kapsamÇlekteki istemler araclDgEla tanlEilanacaktlE
< 110› Genomictree
<120> Allele özgü reaksiyon primerlerini kullanan Nükleik Asit Amplifikasyonuna yönelik
Yöntem
<130> PP-81218
<160> 10
<170> Kopatentln 2.0
<210> 1
<211> 352
<212> DNA
<400> 1
<210> 2
<211> 352
<212> DNA
<213> BRAF(B-tipi Raf kinazLIIVöOOE
<400> 2
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> BRAFV600E ileri primer
<400> 3
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> BRAFV600E ileri ASRP
<220>
<221> çesitli_fark
<222> (21)
<223> deoksiguanin
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> BRAFV600E geri primer
<400> 5
<210> 6
<211> 350
<212> DNA
<213> metilleme SDC2
<400> 6
<210> 7
<211> 350
<212> DNA
<213> metilllememe SDC2
<400> 7
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> metilleme SDC2 ileri primeri
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
9t9C9C999t
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> metilleme SDC2 ileri ASRP
<220>
<221> çesitli_fark
<222> (22)
<223> deoksiguanin
<400> 9
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> metilleme SDC2 geri primer
<400> 10
Claims (1)
- ISTEMLER Hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik bir yöntem olup, söz konusu yöntem, düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz ve i) hedef nükleik asidi tamamlaylEEbir nükleotid sekansEl/e ii) 3'-de0ksinükleotid ile ikame edilen bir nükleotidi içeren allele özgü reaktif primer (ASRP) mevcudiyetinde hedef nükleik asidin güçlendirilmesini içermektedir, burada allele özgü reaktif primerin hedef nükleik asidi tamamlaylElIihiteIikte olmasüiurumunda hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürünü üretilmektedir, ve allele özgü reaktif primerin hedef nükleik asidi tamamlaylEEblmayan nitelikte olmasEl durumunda ise primerin 3' ucunda mevcut hedef nükleik asidi tamamlaylîljblmayan bir nükleotid, DNA polimerazlEl düzeltme etkinligi tarafIdan ortadan kaldiEllIhaktadlEl ve hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürünü, primerin 3' ucunda kalan 3'- deoksinükleotidden dolayEiiiretilmemektedir. Düzeltme etkinligine sahip DNA polimerazlEI, 3' -> 5' eksonükleaz etkinligine sahip 3'-de0ksinükle0tidin ve allele özgü reaktif primerin 3' ucunun bitisiginde bulunan bir nükleotidin hedef nükleik asidi tamamlaylîEl nitelikte olmasEl durumunda, 3'- deoksinükleotidin ve allele özgü reaktif primerin 3' ucunun bitisiginde bulunan bir nükleotidin DNA polimeraz. düzeltme etkinligi taraflöhan ortadan kaldiEllB1ad[g]Çl\/e deoksinükleotid ve 3' ucunun bitisiginde bulunan nükleotidin hedef nükleik asidi tamamlaylEEiolmayan nitelikte olmasEIdurumunda 3'-de0ksinükle0tidin ve allele özgü reaktif primerin 3' ucunun bitisiginde bulunan bir nükleotidin ortadan kald-[giElve böylelikle 3'-de0ksinükle0tidin 3' ucunda kald IgiüIstem 1'e göre yöntem. Istem 1'e göre yöntem olup, söz konusu yöntem, asaglki adllarEigermektedir: (a) bir hibridizasyon ürününün elde edilmesi amaclîla hedef nükleik asidin allele özgü reaktif primerle (ASRP) karlgtlElllBwasEie melezlestirilmesi; (b) düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz mevcudiyetinde hibridizasyon Ürününde hedef nükleik asidin güçlendirilmesi; ve (c) hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürününün varllglüla veya yokluguna baglEI olarak hedef nükleik asidin tespit edilmesi. Allele özgü reaktif primerin (ASRP) derisiminin, 0.1 ila 20 M oldugu, Istem 4'e göre yöntem. Adli (b)'deki amplifikasyonun, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafIdan gerçeklestirildigi, Istem 4'e göre yöntem. Hedef nükleik asidin, DNA veya RNA oldugu, Istem 1'e göre yöntem. Hedef nükleik asidin bir mutasyona sahip oldugu, Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre yöntem. Mutasyonun, hedef nükleik asidin bir nükleotidinin ikamesi, silinmesi veya eklenmesi vaslliislîla sebep olundugu, Istem 8'e göre yöntem. Hedef nükleik asitte hiçbir mutasyonun mevcut olmamasEldurumunda hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürününün üretildigi, ve hedef nükleik asitte bir mutasyonun mevcut olmasüjurumunda hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürününün üretilmedigi, Istem 8'e göre yöntem. Hedef nükleik asidin bir patojenden oldugu, Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre yöntem. Patojenin virüsler, öbakteriler ve mantarlardan olusan gruptan seçildigi, Istem 11'e göre yöntem. Hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürününün, bir patojenin mevcudiyetinde üretildigi ve bir patojenin yoklugunda üretilmedigi, Istem 11'e göre yöntem. Hedef nükleik asidin sitozin ile metillenmis oldugu, Istemler 1 ila 7'den herhangi birine göre yöntem. Istem 14'e göre yöntem olup, burada metillenmis hedef nükleik asidin tespit edilmesine yönelik yöntem, asagldiaki ad larmermektedir: (a) metillenmis bir sitozin nükleotidi dönüstürmeden, metillenmemis bir sitozin nükleotidi urasil veya diger nükleotidlere dönüstürmek amaclîcla hedef nükleik asidin kimyasal veya enzimatik olarak islenmesi; (b) bir hibridizasyon ürününün elde edilmesi amacMa kimyasal veya enzimatik olarak islenmis hedef nükleik asidin allele özgü reaktif primerle (ASRP) karlStlEllBiasü 5 ve melezlestirilmesi, ve düzeltme etkinligine sahip bir DNA polimeraz mevcudiyetinde hibridizasyon ürününde hedef ürünün güçlendirilmesi; ve (c) hedef nükleik asidin amplifikasyon ürününün varllgll veya yokluguna baglEl olarak hedef nükleik asidin metillenmesinin tespit edilmesi. 10 16. Metillenmis hedef nükleik asidin bir amplifikasyon ürünü ürettigi ve metillenmemis hedef nükleik asidin ise bir amplifikasyon ürünü üretmedigi, Istem 15'e göre yöntem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130035343 | 2013-04-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201815755T4 true TR201815755T4 (tr) | 2018-11-21 |
Family
ID=51658507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/15755T TR201815755T4 (tr) | 2013-04-01 | 2013-04-16 | Allele özgü reaktif primer kullanan nükleik asit amplifikasyon yöntemi. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10023908B2 (tr) |
| EP (1) | EP2982762B1 (tr) |
| KR (3) | KR101557975B1 (tr) |
| CN (2) | CN109517888B (tr) |
| DK (1) | DK2982762T3 (tr) |
| ES (1) | ES2693133T3 (tr) |
| TR (1) | TR201815755T4 (tr) |
| WO (1) | WO2014163225A1 (tr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101719285B1 (ko) | 2014-11-04 | 2017-03-23 | 한국과학기술원 | 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법 |
| KR101961642B1 (ko) * | 2016-04-25 | 2019-03-25 | (주)진매트릭스 | 절단된 상보적인 태그 절편을 이용한 표적 핵산 서열 검출 방법 및 그 조성물 |
| CN107400716A (zh) * | 2017-08-24 | 2017-11-28 | 上海生物芯片有限公司 | 人braf基因v600e突变的pcr检测方法、引物、探针及试剂盒 |
| CN109943638A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-06-28 | 湖南百伯基因技术有限公司 | 一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒 |
| CN110283911A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-27 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 用于粪便样本进行早期结直肠癌基因甲基化检测的引物对和探针及试剂盒 |
| KR102560137B1 (ko) | 2019-12-20 | 2023-07-26 | 고려대학교 산학협력단 | 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| CN1414110A (zh) * | 2002-08-19 | 2003-04-30 | 张旭 | 利用具有3'至5'外切酶活性的多聚酶进行基因序列分析 |
| EP2290106B1 (en) * | 2004-03-08 | 2018-01-03 | Rubicon Genomics, Inc. | Method for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
| EP1627924B1 (en) * | 2004-08-19 | 2011-04-06 | Epigenomics AG | Method for the analysis of methylated DNA |
| JP2006141255A (ja) * | 2004-11-18 | 2006-06-08 | Eiken Chem Co Ltd | 遺伝子変異を検出する方法 |
| CN1896284B (zh) * | 2006-06-30 | 2013-09-11 | 博奥生物有限公司 | 一种鉴别等位基因类型的方法 |
| ATE555219T1 (de) | 2008-08-12 | 2012-05-15 | Hoffmann La Roche | Korrekturlese-primerverlängerung |
| CN102399859A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于荧光共振能量转移的甲基化dna检测方法 |
| US8609343B2 (en) * | 2011-03-11 | 2013-12-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Detection of bladder cancer |
-
2013
- 2013-04-16 TR TR2018/15755T patent/TR201815755T4/tr unknown
- 2013-04-16 US US14/779,356 patent/US10023908B2/en active Active
- 2013-04-16 DK DK13881318.3T patent/DK2982762T3/en active
- 2013-04-16 EP EP13881318.3A patent/EP2982762B1/en active Active
- 2013-04-16 WO PCT/KR2013/003185 patent/WO2014163225A1/ko active Application Filing
- 2013-04-16 ES ES13881318.3T patent/ES2693133T3/es active Active
- 2013-04-16 CN CN201811303065.8A patent/CN109517888B/zh active Active
- 2013-04-16 CN CN201380077114.XA patent/CN105247071B/zh active Active
- 2013-05-02 KR KR1020130049499A patent/KR101557975B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-07-14 KR KR1020150100017A patent/KR101600039B1/ko active IP Right Grant
- 2015-07-14 KR KR1020150100018A patent/KR20150088772A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2693133T3 (es) | 2018-12-07 |
| US20160194695A1 (en) | 2016-07-07 |
| CN105247071B (zh) | 2018-11-23 |
| CN109517888B (zh) | 2022-07-26 |
| EP2982762B1 (en) | 2018-08-01 |
| WO2014163225A1 (ko) | 2014-10-09 |
| EP2982762A4 (en) | 2016-11-16 |
| CN105247071A (zh) | 2016-01-13 |
| KR20150088772A (ko) | 2015-08-03 |
| EP2982762A1 (en) | 2016-02-10 |
| US10023908B2 (en) | 2018-07-17 |
| KR101557975B1 (ko) | 2015-10-15 |
| CN109517888A (zh) | 2019-03-26 |
| KR20140119602A (ko) | 2014-10-10 |
| DK2982762T3 (en) | 2018-11-19 |
| KR20150089987A (ko) | 2015-08-05 |
| KR101600039B1 (ko) | 2016-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20180216166A1 (en) | Attenuators | |
| AU2008307153B2 (en) | Nucleic acid amplification | |
| EP3346006B1 (en) | Method for amplifying dna | |
| TR201815755T4 (tr) | Allele özgü reaktif primer kullanan nükleik asit amplifikasyon yöntemi. | |
| JP6100933B2 (ja) | アレリックラダー遺伝子座 | |
| WO2012118802A9 (en) | Kit and method for sequencing a target dna in a mixed population | |
| JP2007530026A (ja) | 核酸配列決定 | |
| CN114555830A (zh) | 靶核酸的检测方法、核酸结合分子的检测方法、及核酸结合能力的评价方法 | |
| JP2011500063A (ja) | Ｄｎａ増幅方法 | |
| JP2008048648A (ja) | 核酸増幅用プライマーセット及び核酸の増幅方法 | |
| US20180051330A1 (en) | Methods of amplifying nucleic acids and compositions and kits for practicing the same | |
| KR101134120B1 (ko) | 지노믹 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 백혈구 항원 유전자형 분석방법 | |
| Lee et al. | Rapid ABO genotyping using whole blood without DNA purification | |
| KR20240006024A (ko) | 단일 가닥 dna의 증폭 | |
| JP4491276B2 (ja) | 標的ｄｎａ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法及びキット | |
| JP4145129B2 (ja) | Ｐｃｒクランピング法 | |
| CN111989408A (zh) | 检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法 | |
| KR102575618B1 (ko) | 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물 | |
| WO2022256926A1 (en) | Detecting a dinucleotide sequence in a target polynucleotide | |
| JP2006280333A (ja) | 遺伝子組み込み部位の解析方法 | |
| JP2014223026A (ja) | 核酸配列の欠失または導入を判定する方法 |