JP2014223026A - 核酸配列の欠失または導入を判定する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】より迅速に、より簡便に核酸配列の欠失または導入の判定行うために、電気泳動を行わずに、欠失または導入の判定を行う方法を提供することである。
【解決手段】DNAポリメラーゼ、DNA検出剤、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを使用することで、電気泳動をすることなく、融解曲線解析により、迅速に配列の欠失または、導入を判定することができる。さらに、使用するDNAポリメラーゼをファミリーBに属するDNAポリメラーゼにすることにより、ゲノムDNAの分離精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することが可能となった。
【選択図】なし
【解決手段】DNAポリメラーゼ、DNA検出剤、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを使用することで、電気泳動をすることなく、融解曲線解析により、迅速に配列の欠失または、導入を判定することができる。さらに、使用するDNAポリメラーゼをファミリーBに属するDNAポリメラーゼにすることにより、ゲノムDNAの分離精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することが可能となった。
【選択図】なし
Description
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、融解曲線解析を用いて標的核酸中の配列欠失、配列導入を判定する方法などに関する。
本発明における配列の欠失とは、野生型の塩基配列の数個から数万個の塩基が失われた配列を有することをいい、配列導入とは、野生型の塩基配列に数個から数万個の塩基が導入された配列を有することをいう。この配列の欠失または、配列の導入は、人為的であっても、自然的に生じたものであってもよい。塩基の欠質または導入の好ましい個数は10個以上である。
自然的な配列の欠失とは、先天的あるいは、後天的に染色体から遺伝子断片が欠失している状態であり、欠失が起こる位置により、様々な疾患や障害を引き起こすことが知られている。特に、配列欠失は、多くの癌細胞に認められる異常の一つであり、特定の癌には特定の配列欠失のパターンが存在し、共通して欠失が認められる領域には癌抑制遺伝子の存在が示唆されている。そのため、これらの配列欠失を迅速に検出することは、研究用途のみならず、臨床用途においても重要なこととなっている。
一方、人為的な配列の欠失、導入は、遺伝子改変技術により、野生型に対し、配列を欠失させた状態または配列を導入した状態である。この遺伝子改変技術を利用した配列の欠失、導入は、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、メダカ、シロイヌナズナ、イネ等に挙げられるモデル生物に対して実施されており、遺伝子研究、病態解析、生物資源の改良等、様々な用途に利用されている。これらの遺伝子改変を行う上で、遺伝子改変後や、系統維持において遺伝子型の判定が必要であり、配列欠失または配列導入を迅速に検出することが重要となっている。
従来の配列の欠失、配列導入を判定する技術としては、例えば、核酸配列決定法(シークエンシング法)、サザンブロット法、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)、リアルタイムPCR法などが知られている。しかし、操作の簡便さや迅速性が必要な遺伝子型の判定において、シークエンシング法やサザンブロット法、FISH法は、煩雑な作業が必要であり時間がかかるため、問題があった。また、リアルタイムPCR法は、時間が短縮できるものの、確実に鋳型の2倍量の差を識別する必要があるため、サンプル調製を厳密に行う必要があった。
一方、定性的に遺伝子型を判定する方法として、近傍プライマーによるPCR法が知られている(非特許文献1)。この方法の場合、厳密な操作が不要であり、PCR後、電気泳動をするだけで遺伝子型の判定が可能である。また、ゲノムDNAの精製を行うことなくPCRを実施し、電気泳動により遺伝子の判定を行う方法が開発されており、より短時間での検出が可能となっている(非特許文献2)。
しかしながら、かかる遺伝子型検出方法は、検出の簡便化が進められているものの、PCR後、電気泳動が必要であるため、PCR後にも操作が必要であり、操作の簡便性と迅速性においてさらに改善の余地がある。また、PCR後、一度チューブを開放し、電気泳動をする方法は、キャリーオーバーをもたらす可能性が指摘されている。
Exp Anim. 2004 Apr;53(2):103−11.
WaKo BioWindow 2007 Oct:No.84 11頁
核酸配列の欠失または導入の判定は、多サンプルの処理や頻繁な処理が必要であることが多いため、操作が簡便で、迅速であることが重要となっている。そのため、本発明が解決しようとする課題は、電気泳動を行わずに、迅速な核酸配列の欠失または導入の判定方法を提供することである。
本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、DNAポリメラーゼ、DNA検出剤、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを使用することで、電気泳動をすることなく、融解曲線解析により、迅速に配列の欠失または、導入を判定することができることを見出し、本発明の完成に至った。さらに、使用するDNAポリメラーゼをファミリーBに属するDNAポリメラーゼにすることにより、DNAの精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することができることを見出した。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
[1]標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法であって、
(a)DNAポリメラーゼ
(b)DNA検出剤
(c)Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー
を含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたTm値から判定する方法。
[2]標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるPCR反応、融解曲線解析により行うことを特徴とする[1]に記載の方法。
[3]各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせることで、Tm値の異なる増幅産物を与えることを特徴とする[1]または[2]に記載の方法。
[4]DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである[1]−[3]のいずれかに記載の方法
[5]DNAポリメラーゼが、Thermococcus kodakaraensis(KOD)由来である[1]−[4]のいずれかに記載の方法
[6]DNA検出剤がインターカレーターである、[1]−[5]のいずれかに記載の方法
[7]ゲノムDNAの分離精製を行っていない生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を行うことを特徴とする[1]−[6]のいずれかに記載の方法。
[8]生体試料が、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞からなる群より選ばれる[7]に記載の方法。
[9]生体試料が、動物組織である[7]に記載の方法。
[10]生体試料が、ヒト、マウスあるいはラットから採取された組織である[7]−[9]のいずれかに記載の方法。
[11]生体試料の加熱処理を施す工程を含む、[7]−[10]のいずれかに記載の方法。
[12]生体試料をホモジナイズする工程を含む、[7]−[10]のいずれかに記載の方法。
[13](a1)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、(b)DNA検出剤、および、(c)Tm値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキット。
[1]標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法であって、
(a)DNAポリメラーゼ
(b)DNA検出剤
(c)Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー
を含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたTm値から判定する方法。
[2]標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるPCR反応、融解曲線解析により行うことを特徴とする[1]に記載の方法。
[3]各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせることで、Tm値の異なる増幅産物を与えることを特徴とする[1]または[2]に記載の方法。
[4]DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである[1]−[3]のいずれかに記載の方法
[5]DNAポリメラーゼが、Thermococcus kodakaraensis(KOD)由来である[1]−[4]のいずれかに記載の方法
[6]DNA検出剤がインターカレーターである、[1]−[5]のいずれかに記載の方法
[7]ゲノムDNAの分離精製を行っていない生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を行うことを特徴とする[1]−[6]のいずれかに記載の方法。
[8]生体試料が、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞からなる群より選ばれる[7]に記載の方法。
[9]生体試料が、動物組織である[7]に記載の方法。
[10]生体試料が、ヒト、マウスあるいはラットから採取された組織である[7]−[9]のいずれかに記載の方法。
[11]生体試料の加熱処理を施す工程を含む、[7]−[10]のいずれかに記載の方法。
[12]生体試料をホモジナイズする工程を含む、[7]−[10]のいずれかに記載の方法。
[13](a1)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、(b)DNA検出剤、および、(c)Tm値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキット。
本発明により、電気泳動をすることなく、Tm値の異なる増幅産物を与えるプライマーを用い、PCR増幅、融解曲線解析を行うことで、配列の欠失または、導入を判定することを可能とした。これにより、電気泳動のための操作が不要となるため、操作の煩雑さがなくなり、時間も短縮することができる。また、電気泳動のためにPCR後にチューブを開ける必要性がないため、PCR増幅産物の飛散によるキャリーオーバーのリスクを大幅に低減することができる。
さらに本発明では、使用するDNAポリメラーゼをファミリーBに属するポリメラーゼとすることで、DNAの精製を行うことなく、より迅速に配列の欠失または、導入を検出することが可能となった。本発明は、研究分野での応用に始め、診断用途などにおいて広く使用することができる。また、短時間で検出が可能になったことから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の核酸配列の欠失または導入を判定する方法は、(a)DNAポリメラーゼ、(b)DNA検出剤、および、(c)Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたTm値から核酸配列の欠失または導入を判定することを特徴とする。
本発明の核酸配列の欠失または導入を判定する方法は、(a)DNAポリメラーゼ、(b)DNA検出剤、および、(c)Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたTm値から核酸配列の欠失または導入を判定することを特徴とする。
本発明に用いるDNA検出剤は特に限定されず、DNA表面のリン酸基に結合する色素や塩基間にインターカレートする色素(インターカレーター)などが挙げられるが、インターカレーターを用いることが好ましい。
インターカレーターとは、二本鎖DNAに挿入(インターカレート)することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖DNAに挿入して蛍光を発する色素である。
インターカレーターとは、二本鎖DNAに挿入(インターカレート)することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖DNAに挿入して蛍光を発する色素である。
多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ethidium bromide、シアニン色素(例えば、TOTO(登録商標)、YOYO(登録商標)、BOBOおよびPOPO)、SYBR(登録商標) Green I、SYBR(登録商標) Green ER、SYBR(登録商標) Green Gold、SYBR(登録商標) DX、PicoGreen(登録商標)、LCGeen(登録商標)、EvaGreen(登録商標)、SYTOX(登録商標) Green、ResoLight、ヨウ化プロピジウム、Acridine orange、7−アミノ−アクチノマイシン D、CyQUANT(登録商標) GR、SYTO(登録商標)9, SYTO(登録商標)10、SYTO(登録商標)13、SYTO(登録商標)14、SYTO(登録商標)82、FUN−1などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
本発明におけるTm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーは、DNA検出剤を用いた融解曲線解析による標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法に利用される。該方法において、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーは、核酸配列の欠失または導入の有無、あるいは、欠失または導入の態様に応じて、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与えるよう設計されている。
例えば、各増幅産物それぞれに、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーの対を作製して、増幅反応を行い、融解曲線解析により標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定すればよい。この方法においていずれかのプライマーを共通化してもよい。
本発明の核酸配列の欠失または導入を判定する方法においては、標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるPCR反応、融解曲線解析により行ってもよいし、各増幅産物それぞれに対して増幅、融解曲線解析を別々の反応液で行ってもよい。例えば、複数の増幅産物に共通のプライマーと、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーを同時に用いて増幅反応を行い、融解曲線解析により標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定することができる。
本発明におけるTm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマーは、増幅産物のTm値の差異が、1℃以上、好ましくは3℃以上、より好ましくは5℃以上になるように設計すればよい。この各増幅産物のTm値は、各リアルタイムPCR装置、解析ソフトウェアにより求められる。また、増幅産物の融解温度は、市販のプライマー設計プログラム、または公共機関等が提供するオンラインのプログラム、例えばOligo CalculatorのBasic法(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html#helpthermo)などを利用することで、容易に推測することができる。
各遺伝子型によって、増幅産物のTm値に差異を生じさせることは、増幅長に差異を持たせることにより可能となる。増幅産物の鎖長に差異を持たせる方法は、ある増幅長までは、増幅長によりTm値が異なる点を利用している。そのため、2種類以上の増幅産物の鎖長の差異が、50bp以上であることが好ましい。また、一番長い増幅産物の鎖長が2kb以下、好ましくは、1kb以下、より好ましくは、500bp以下であることが望ましい。また、増幅長の長短の組み合わせは限定されるものではなく、野生型が短くても、配列欠失型または配列導入型が短くてもよい。
本発明におけるプライマーの長さとしては、好ましくは13〜35塩基であり、より好ましくは16塩基以上であり、また、30塩基以下が好ましい。また、PCR反応に用いる各プライマー量比は限定されることはなく、増幅産物のピーク比を確認しながら、適宜調整すればよいが、ピークが高くなる増幅産物を与えるプライマー比を下げ、ピークのバランスを揃えることが望ましい。
図1、図2を用いてさらに詳細に説明する。図1Aは、標的遺伝子の配列の欠失を検出するためのプライマー設計例である。この例では、フォワードプライマーを共通プライマーとし、野生型特異的プライマーによる増幅産物の増幅長が、欠失型特異的プライマーによる増幅産物の増幅長よりも長くなるように設計している。そのため、野生型特異的増幅産物のTm値が、欠失型特異的増幅産物よりも高くなる。つまり、上記のプライマー3種を混合し、PCR反応、融解曲線解析を実施した場合、野生型はTm値が高い増幅産物のみが検出され、欠失型はTm値が低い増幅産物のみが検出させる。また、ヘテロ接合体は、この両者が増幅され、融解曲線におけるピークが2本検出される。このように野生型と配列欠失型、そのヘテロ接合体の識別を増幅長の違いによるTm値の差異により可能としている。
このプライマー設計例は、特に限定されるものではなく、図1Bに示すように野生型を短い増幅産物として配列の欠失を検出してもよく、図2Aに示すように野生型を長い増幅産物として配列の導入を検出してもよく、図2Bに示すように野生型を短い増幅産物として配列の導入を検出してもよい。
そのため、本発明では、各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせ、Tm値の異なる増幅産物を与えることで、標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるPCR反応、融解曲線解析により行うことを可能としている。
そのため、本発明では、各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせ、Tm値の異なる増幅産物を与えることで、標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるPCR反応、融解曲線解析により行うことを可能としている。
本発明におけるDNAポリメラーゼは、特に限定されず、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体的には、ファミリーA(PolI型)に属するTaq DNAポリメラーゼやTth DNAポリメラーゼ、ファミリーB(α型)に属するKOD DNAポリメラーゼ(TOYOBO)、Pfu DNAポリメラーゼ(ストラタジーン、プロメガなど)、Pwo DNAポリメラーゼ(ロッシュ・アプライド・サイエンス)、Ultima DNAポリメラーゼ(ライフテクノロジーズ)、PrimeSTAR(登録商標) DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)などが挙げられる。
ゲノムDNAの分離精製を行っていない生体試料を用いて配列の欠失または、導入の判定を行う場合は、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用することが望ましい。なかでも、KOD DNAポリメラーゼがより好ましいものであるが、本発明に使用するDNAポリメラーゼは、ゲノムDNAの分離精製を行っていない生体試料から増幅が可能なDNAポリメラーゼであればよく、それらのいずれにおいても適用することが可能であり、特に限定されるものではない。
本発明で使用するDNAポリメラーゼは、上記のDNAポリメラーゼにおいて、アミノ酸配列に1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。該変異体は、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。
本発明では、生体試料からゲノムDNAの分離精製を行い、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を実施してもよい。このゲノムDNAの分離精製は、限定されるものではないが、商業的に入手可能なMagExtractor −Genome−(TOYOBO)、MagExtractor −Plant Genome−(TOYOBO)、NucleoSpin(登録商標)Tissue(タカラバイオ)、NucleoSpin(登録商標) Plant II(タカラバイオ)、Wizard(登録商標) Genomic DNA Purification Kit(プロメガ)、FlexiGene DNA Kit(キアゲン)等を用いることができる。
また、本発明における特徴は、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用することにより、ゲノムDNAを分離精製することなく生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入を判定することにもある。ゲノムDNAの分離精製が不要であるため、前処理時間の短縮、操作の煩雑さの低減につながる。生体試料は特に限定されるものではないが、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞等が挙げられ、より具体的には、イネ葉やタバコ葉、米粒などの植物組織、ヒトやマウス、ラットから採取された組織等が挙げられる。また、前記生体試料は乾燥や凍結を行ったものであってもよい。
さらに、生体試料は直接添加し検出してもよいし、水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後添加し検出してもよいが、PCRの増幅効率の観点から、簡易的な前処理を実施してもよい。具体的には、加熱処理する方法、ホモジナイズする方法が挙げられる。
加熱処理する方法では、前記生体試料をそのまま加熱処理してもよいが、前記生体試料を水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後、加熱処理することが好ましい。加熱処理工程における加熱温度は特に制限されないが、例えば80℃以上であり、好ましくは80℃〜99℃、より好ましくは、90℃〜99℃である。また、処理時間も制限されるものではないが、例えば30秒以上であり、好ましくは1分以上〜30分、より好ましくは5分〜15分である。加熱処理後の生体試料はそのままPCR反応液に添加してもよいが、pHの中和を行った後に添加してもよく、水やBuffer等で希釈した後に添加してもよい。また、添加割合は特に制限されることはなく、PCR反応による増幅が認められる範囲で添加すればよい。
生体試料をホモジナイズする工程は、前記生体試料をそのままホモジナイズしてもよいが、前記生体試料を水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後、ホモジナイズすることが好ましい。ホモジナイズは、生体試料を磨り潰せばよく、乳鉢等を用いて磨り潰しでもよく、商業的に入手可能なホモジナイザーやペッスル等を用いてホモジナイズを行ってもよい。ホモジナイズを実施した生体試料は、そのままPCR反応液に添加してもよいが、pHの中和を行った後に添加してもよく、水やBuffer等で希釈した後に添加してもよい。また、添加割合は特に制限せれることはなく、PCR反応による増幅が認められる範囲で添加すればよい。
本発明におけるPCR反応液は、前記DNA検出剤、Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー、DNAポリメラーゼ、テンプレート以外の組成成分は、特に限定されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も限定されるものではない。前記組成成分として、1種類以上のデオキシヌクレオチド三リン酸または、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも1つを含有することが好ましい。
緩衝剤としては、例えば、トリス(TRIS)、トリシン(TRICINE)、ビス−トリシン(BIS−TRICINE)、へペス(HEPES)、モプス(MOPS)、テス(TES)、タプス(TAPS)、ピペス(PIPES)、及びキャプス(CAPS)などが挙げられるが、特に限定されない。
また、反応バッファー中には、1.0〜5mM、好ましくは1.5〜2.5mM程度の濃度でMg2+を含むことが好ましい。更には、KClを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
また、反応バッファー中には、1.0〜5mM、好ましくは1.5〜2.5mM程度の濃度でMg2+を含むことが好ましい。更には、KClを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
さらに、反応バッファー中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、PCR反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
本発明はまた、(a)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、(b)DNA検出剤、および、(c)Tm値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキットである。
本発明における標的遺伝子の配列の欠失または導入を検出するためには、融解曲線解析が可能な機器を使用する。融解曲線解析を実施可能な機器として、リアルタイムPCR機器が挙げられるが限定されるものではない。具体例としては、ロッシュ・ダイアグノスティック社のライトサイクラー(登録商標)、アプライドバイオシステム社のABI PRI
SM(登録商標)7000 / 7700、7500 / 7500 FAST リアルタイムPCRシステム、7900HT Fast リアルタイムPCRシステム、StepOne / StepOnePlusリアルタイムPCRシステム、キアゲン社のRotor Gene、タカラバイオ社のThermal Cycler Dice(登録商標) Real Time System、バイオ・ラッド社のMiniOpticon、CFX384 Touch、CFX96 Touch、アジレント・テクノロジー社のMx3000P、Mx3005P、Mx4000等が挙げられる。また、PCR反応については、上記のリアルタイムPCR機器を使用してもよいが、融解曲線解析と独立して、サーマルサイクラーを使用してもよい。
SM(登録商標)7000 / 7700、7500 / 7500 FAST リアルタイムPCRシステム、7900HT Fast リアルタイムPCRシステム、StepOne / StepOnePlusリアルタイムPCRシステム、キアゲン社のRotor Gene、タカラバイオ社のThermal Cycler Dice(登録商標) Real Time System、バイオ・ラッド社のMiniOpticon、CFX384 Touch、CFX96 Touch、アジレント・テクノロジー社のMx3000P、Mx3005P、Mx4000等が挙げられる。また、PCR反応については、上記のリアルタイムPCR機器を使用してもよいが、融解曲線解析と独立して、サーマルサイクラーを使用してもよい。
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例1:マウス精製ゲノムからの導入配列の検出
本実施例においては、Rosa26の領域にCreERを導入したノックインマウスの遺伝子型の判定を、精製ゲノムを用いて実施した。精製ゲノムは、野生型マウス、ヘテロマウス、ノックインマウスそれぞれについて、3mm程度のマウステールから、MagExtractor −Genome−(TOYOBO)を使用しDNAの分離精製を行うことにより得た。
本実施例においては、Rosa26の領域にCreERを導入したノックインマウスの遺伝子型の判定を、精製ゲノムを用いて実施した。精製ゲノムは、野生型マウス、ヘテロマウス、ノックインマウスそれぞれについて、3mm程度のマウステールから、MagExtractor −Genome−(TOYOBO)を使用しDNAの分離精製を行うことにより得た。
本実施例におけるプライマー設計は、まず共通プライマーを設計した後、各々の遺伝子型特異的増幅産物のTm値に差異が生じるように各遺伝子型特異的増幅産物を生じさせるプライマーの位置を、Tm値計算プログラムのBasic法(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html#helpthermo)を用いて増幅産物のTm値を予測し決定した。この際、各遺伝子型の増幅長が異なるように設計することで、Tm値に差異が生じるように設計している。
具体的には、共通プライマー#1(配列番号1)の位置を決定した後、野生型増幅産物の増幅長が64bp(予測Tm値;79℃)、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が229bp(予測Tm値:83度℃)になるように、野生型プライマー#1(配列番号2)、ノックイン型プライマー#1(配列番号3)を設計した。
また、上記とは各遺伝子型の増幅長が逆になるように、共通プライマー#1(配列番号1)に対し、野生型増幅産物の増幅長が83bp(予測Tm値:79℃)となるように野生型プライマー#2(配列番号4)、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が54bp(予測Tm値:74℃)になるようにノックイン型プライマー#2(配列番号5)を設計した。
具体的には、共通プライマー#1(配列番号1)の位置を決定した後、野生型増幅産物の増幅長が64bp(予測Tm値;79℃)、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が229bp(予測Tm値:83度℃)になるように、野生型プライマー#1(配列番号2)、ノックイン型プライマー#1(配列番号3)を設計した。
また、上記とは各遺伝子型の増幅長が逆になるように、共通プライマー#1(配列番号1)に対し、野生型増幅産物の増幅長が83bp(予測Tm値:79℃)となるように野生型プライマー#2(配列番号4)、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が54bp(予測Tm値:74℃)になるようにノックイン型プライマー#2(配列番号5)を設計した。
本実施例では、ファミリーAに属するポリメラーゼであるTaq DNAポリメラーゼをベースとしたリアルタイムPCR試薬であるTHUNDERBIRD(登録商標) SYBR(登録商標) qPCR Mix(TOYOBO)を使用した。テンプレートしては、上記のマウス精製ゲノムを使用し、表2に示す反応液を調製後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を用いて、表3に示す下記条件にてPCR反応による増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
これらの結果を図3に示す。図3は、Taq DNAポリメラーゼを用い、精製ゲノムDNAからPCRを実施し、融解曲線解析を用いてノックインマウスの遺伝子型判定を実施した結果である。その結果、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせTm値を変えることで、野生型、ヘテロ型、ノックイン型それぞれの遺伝子型の判定が可能であった。また、各遺伝子型の増幅長の差異を利用しTm値に差異が生じるようにプライマーを設計するだけで、遺伝子型の判定が可能であることを確認することができた。
実施例2:生体試料からの導入配列の検出
本実施例においては、Rosa26の領域にCreERを導入したノックインマウスの遺伝子型の判定を、生体試料を用いて実施した。生体試料は、野生型マウス、ヘテロマウス、ノックインマウスそれぞれについて、3mm程度のマウステールに50mM NaOHを180μL添加し、95℃、10分間熱処理を実施、その後、1M Tris−HCl(pH8.0)20μLにて中和することにより得た。
本実施例においては、Rosa26の領域にCreERを導入したノックインマウスの遺伝子型の判定を、生体試料を用いて実施した。生体試料は、野生型マウス、ヘテロマウス、ノックインマウスそれぞれについて、3mm程度のマウステールに50mM NaOHを180μL添加し、95℃、10分間熱処理を実施、その後、1M Tris−HCl(pH8.0)20μLにて中和することにより得た。
本実施例におけるプライマー設計は、実施例1と同様な方法にて設計した。具体的には、表4に示すように、共通プライマー#2(配列番号6)を設計し、野生型増幅産物の増幅長が100bp(予測Tm値:79℃)となるように野生型プライマー#3(配列番号7)、ノックイン特異的増幅産物の増幅長が341bp(予測Tm値:84℃)になるようにノックイン型プライマー#3(配列番号8)を設計した。
本実施例では、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとして、KOD DNA polymerase (TOYOBO)を使用し、PCRバッファーは、KOD −Plus− Ver.2(TOYOBO)に添付のものを使用した。また、インターカレーターは、1/30,000倍希釈のSYBR(登録商標) Green I を使用し、PCR反応液を表5に示す反応組成になるように調製した。前記PCR反応液ついて、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を用いて、表6に示す下記条件にてPCR反応による増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
また、同様なプライマー設計、サンプルを用い、クルードサンプルから増幅可能なMightyAmp(登録商標) for Real Time(SYBR(登録商標) Plus)(タカラバイオ)を使用し、表7、表8に記載の条件にて検出を実施した。
これらの結果を図4に示す。図4は、ゲノムDNAの分離精製を行うことなく生体試料からPCRを実施し、融解曲線解析を用いてノックインマウスの遺伝子型判定を実施した結果である。その結果、ゲノムDNAの分離精製を行わずに、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせTm値を変えることで、野生型、ヘテロ型、ノックイン型それぞれの遺伝子型の判定が可能であった。
実施例3:生体試料からの遺伝子の検出
実施例1、2では、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせTm値に差異を生じさせることで遺伝子型の判定が可能になることを示した。続いて、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用することで、生体試料から遺伝子の検出が可能であるか検証した。生体試料として、イネ葉、血液、口腔粘膜、培養細胞、牛肉、豚肉、毛髪、爪を使用した。
実施例1、2では、各遺伝子型の増幅長に差異を生じさせTm値に差異を生じさせることで遺伝子型の判定が可能になることを示した。続いて、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用することで、生体試料から遺伝子の検出が可能であるか検証した。生体試料として、イネ葉、血液、口腔粘膜、培養細胞、牛肉、豚肉、毛髪、爪を使用した。
本実施例に用いた生体試料の前処理方法を詳細に記載する。
イネ葉:3mm各のイネ葉に100mM Tris−HCl(pH9.5)、1M KCl、10mM EDTAからなるバッファーを100μL添加し、ペッスルにてホモジナイズを実施、その後、水にて1/25に希釈することによりサンプルを得た。
血液:水で、1/25に希釈したものをサンプルとした。
口腔粘膜:口腔粘膜を綿棒で採取し、200μLの水で懸濁することにより、サンプルを得た。
培養細胞:培養細胞(HeLa細胞)を回収し、10の6条細胞を500μLの水で懸濁し、サンプルとした。
牛肉・豚肉:約15mgの牛肉・豚肉に、50mM NaOHを180μL添加し、95℃で10分間熱処理を実施した。その後、1M Tris−HCl(pH8.0)20μLにて中和することによりサンプルを得た。
毛髪:毛根を含む範囲で毛髪1cm程度をサンプルとした。
爪:3mm各程度の爪をサンプルとした。
イネ葉:3mm各のイネ葉に100mM Tris−HCl(pH9.5)、1M KCl、10mM EDTAからなるバッファーを100μL添加し、ペッスルにてホモジナイズを実施、その後、水にて1/25に希釈することによりサンプルを得た。
血液:水で、1/25に希釈したものをサンプルとした。
口腔粘膜:口腔粘膜を綿棒で採取し、200μLの水で懸濁することにより、サンプルを得た。
培養細胞:培養細胞(HeLa細胞)を回収し、10の6条細胞を500μLの水で懸濁し、サンプルとした。
牛肉・豚肉:約15mgの牛肉・豚肉に、50mM NaOHを180μL添加し、95℃で10分間熱処理を実施した。その後、1M Tris−HCl(pH8.0)20μLにて中和することによりサンプルを得た。
毛髪:毛根を含む範囲で毛髪1cm程度をサンプルとした。
爪:3mm各程度の爪をサンプルとした。
本実施例では、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとして、KOD DNA polymerase (TOYOBO)を使用し、表9に記載のプライマー(表の上の行から順に配列番号9〜16)、表10に記載の反応組成、表11に記載のPCR反応条件にて、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を用いて増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
これらの結果を図5に示す。図5は、ゲノムDNAの分離精製を行うことなく生体試料からPCRを実施し、融解曲線解析を用いて、生体試料から遺伝子の検出を実施した結果である。その結果、各生体試料から、ゲノムDNAの分離精製を行うことなく、融解曲線解析にて標的核酸を検出できることを確認することができた。
本発明により、電気泳動をすることなく、Tm値の異なる増幅産物を与えるプライマーを用い、PCR増幅、融解曲線解析を行うことでより簡便に、迅速に標的核酸中の配列欠失または導入を判定することが可能となった。また、使用するDNAポリメラーゼをファミリーBに属するDNAポリメラーゼとすることで、DNAの分離精製を行うことなく、より迅速にPCR反応を開始することが可能となった。本発明は、研究分野での応用に始め、診断用途などにおいて広く使用することができるが、短時間に操作も簡便に判定が可能となったことから、特に、多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。さらに本発明では、電気泳動のためにPCR後にチューブを開ける必要性がないため、PCR増幅産物の飛散によるキャリーオーバーのリスクを大幅に低減することができ、擬陽性等のリスクを低減させることができるため、産業上利用する際の擬陽性等のリスク低減に繋がることができる。
Claims (13)
- 標的核酸中の配列の欠失または、導入を判定する方法であって、
(a)DNAポリメラーゼ
(b)DNA検出剤
(c)Tm値の異なる2種類以上の増幅産物を与える特異的プライマー
を含む反応組成中で増幅反応を行い、融解曲線解析によって得られたTm値から判定する方法。 - 標的核酸中の配列の欠失または、導入の判定を1つの反応液におけるPCR反応、融解曲線解析により行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 各遺伝子型によって、増幅産物の鎖長に差異を持たせることで、Tm値の異なる増幅産物を与えることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである請求項1−3のいずれかに記載の方法
- DNAポリメラーゼが、Thermococcus kodakaraensis(KOD)由来である請求項1−4のいずれかに記載の方法
- DNA検出剤がインターカレーターである、請求項1−5のいずれかに記載の方法
- ゲノムDNAの分離精製を行っていない生体試料を用いて、標的核酸中の配列の欠失または導入の判定を行うことを特徴とする請求項1−6のいずれかに記載の方法。
- 生体試料が、培養細胞、植物組織、植物細胞、動物組織、動物細胞からなる群より選ばれる請求項7に記載の方法。
- 生体試料が、動物組織である請求項7に記載の方法。
- 生体試料が、ヒト、マウスあるいはラットから採取された組織である請求項7−9のいずれかに記載の方法。
- 生体試料の加熱処理を施す工程を含む、請求項7−10のいずれかに記載の方法。
- 生体試料をホモジナイズする工程を含む、請求項7−10のいずれかに記載の方法。
- (a1)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、(b)DNA検出剤、および、(c)Tm値の異なる増幅産物を与える特異的プライマーを含む、標的核酸中の配列欠失または導入を判定するためのキット。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010082640A1 (ja) * | 2009-01-15 | 2010-07-22 | 北海道三井化学株式会社 | 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 |
JP2010246419A (ja) * | 2009-04-13 | 2010-11-04 | Shimane Prefecture | リアルタイムpcr法による食品媒介病原菌の網羅的迅速検出方法 |
JP2011019505A (ja) * | 2009-01-29 | 2011-02-03 | Mukogawa Gakuin | 特定遺伝子を検出する方法 |
JP2013046617A (ja) * | 2006-05-02 | 2013-03-07 | Wako Pure Chem Ind Ltd | マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法 |
-
2013
- 2013-05-15 JP JP2013102941A patent/JP2014223026A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013046617A (ja) * | 2006-05-02 | 2013-03-07 | Wako Pure Chem Ind Ltd | マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法 |
WO2010082640A1 (ja) * | 2009-01-15 | 2010-07-22 | 北海道三井化学株式会社 | 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 |
JP2011019505A (ja) * | 2009-01-29 | 2011-02-03 | Mukogawa Gakuin | 特定遺伝子を検出する方法 |
JP2010246419A (ja) * | 2009-04-13 | 2010-11-04 | Shimane Prefecture | リアルタイムpcr法による食品媒介病原菌の網羅的迅速検出方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
UPLOAD, vol. 91, JPN7012000545, 2008, pages 3 - 4, ISSN: 0003562234 * |
UPLOAD, vol. 92, JPN7012000546, 2008, pages 15 - 16, ISSN: 0003562235 * |
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