JP6201540B2 - 細胞の遺伝子発現量の定量方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、細胞の遺伝子発現量あるいは、導入遺伝子などの発現量を定量する方法に関する。

組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核生物、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属など）および哺乳類細胞を含む真核細胞の両者が用いられている。これらの中で、動物細胞、特に哺乳類細胞における発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳類動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与し、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞発現システムを利用した方が、研究用及び治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。

しかしながら、哺乳類細胞を宿主とした場合、他の発現系に比べ生産性が低いという問題がある。そのため、高いタンパク質の生産性が要求される場合では、目的タンパク質をコードする導入遺伝子のコピー数を遺伝子増幅法により増幅させる方法が一般的に行われている。例えば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ遺伝子増幅システムなどが挙げられ、導入遺伝子を数百から数千コピーに増幅することにより、高生産性を実現している。

高発現株を取得するためには、多サンプルからスクリーニングを実施する必要性がある。その一つとして、導入遺伝子の増幅後のコピー数を測定する方法が挙げられ、リアルタイムＰＣＲによる定量が行われている（特許文献１）。遺伝子増幅した目的遺伝子の定量を実施することで、導入遺伝子の増幅率が高い株を選択することができる。

リアルタイムＰＣＲを行うことにより、短時間で、遺伝子増幅した目的遺伝子のコピー数を定量することができる。しかしながら、測定自体は短時間であるにも関わらず、リアルタイムＰＣＲを行う前に培養細胞からゲノムＤＮＡを抽出・精製等の前処理を行う必要があるため、前処理方法の簡便性、迅速性において改善の余地が残されている。

ＷＯ２００９／０２２６５６

高発現株のスクリーニングは、多サンプルの解析が必要であることが多いため、操作が簡便で迅速であることが重要となっている。特に、細胞に含まれる遺伝子をリアルタイムＰＣＲで定量する上では、前処理に時間を要してしまう点に問題がある。
そのため、本発明が解決しようとする課題は、細胞からゲノムの抽出・精製を行うことなく、迅速に遺伝子発現量あるいは、導入遺伝子などの発現量を定量する方法を提供することである。

本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、細胞からＤＮＡの抽出・精製を行うことなく、直接、細胞を反応溶液に添加するだけで、遺伝子の発現量を定量することができることを見出し、本発明を開発させるに至った。
従来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを代表とするファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼを用いた検出では、細胞の前処理が必要であり、細胞をそのまま添加しただけでは、遺伝子の定量が困難であった。これに対し、本発明では新たに、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、細胞からのＤＮＡ抽出・精製を行うことなく、細胞から直接定量することが可能となった。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］細胞の遺伝子発現量の定量方法であって、細胞の核酸抽出もしくは精製を行わず、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とする、細胞の遺伝子発現量の定量方法。
［２］培養細胞の導入遺伝子量を定量する方法である、［１］に記載の定量方法。
［３］ＤＮＡ検出剤、もしくはＱＰｒｏｂｅを用いて定量することを特徴とする、［１］または［２］に記載の定量方法。
［４］ＤＮＡ検出剤が、インターカレーターである［３］に記載の定量方法。
［５］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）由来である［１］−［４］のいずれかに記載の定量方法。

本発明により、細胞からＤＮＡを抽出・精製することなく、細胞の遺伝子発現を定量することを可能としている。これにより、従来よりも短時間で定量が可能となった。本発明は、細胞の発現遺伝子解析等の研究分野での応用に始め、導入遺伝子の定量によるスクリーニングなどにおいて広く使用することができる。また、短時間で定量が可能になったことから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が特に期待できる。

ファミリーＡに属するポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲにおける細胞耐性能を調べた結果の図である。 ファミリーＢに属するポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲにおける細胞耐性能を調べた結果の図である。 細胞の水懸濁液から直接、宿主ＤＮＡを検出した結果の図である。 ＣＨＯ細胞に遺伝子導入したＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを検出した結果の図である

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細胞の遺伝子発現の定量方法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、細胞から直接定量することに大きな特徴がある。

本発明におけるファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、プロメガなど）、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、Ｕｌｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）などが挙げられる。本発明において使用する酵素は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであればよく、上記のＤＮＡポリメラーゼに特に限定されるものではないが、なかでもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。

本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。該変異体は、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。

本発明における細胞から直接定量するとは、細胞からＤＮＡを抽出・精製することなく、ＰＣＲ反応液に細胞を添加し、リアルタイムＰＣＲを行うことである。細胞の種類は限定されるものではないが、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＣＫ細胞、３Ｔ３細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ａ４５９細胞、ＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。
また、細胞の反応系への添加は、細胞培養液を直接添加してもよく、細胞培養液から細胞を回収し、直接添加、または水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁して添加してもよい。

さらに、ＰＣＲの増幅効率の観点から、簡易的な前処理を実施してもよい。具体的には、加熱処理する方法、ホモジナイズする方法が挙げられる。

加熱処理する方法では、回収した細胞をそのまま加熱処理してもよいが、前記細胞を水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後、加熱処理することが好ましい。加熱処理工程における加熱温度は特に制限されないが、例えば８０℃以上であり、好ましくは８０℃〜９９℃、より好ましくは、９０℃〜９９℃である。また、処理時間も制限されるものではないが、例えば３０秒以上であり、好ましくは１分以上〜３０分、より好ましくは５分〜１５分である。加熱処理後の生体試料はそのままＰＣＲ反応液に添加してもよいが、ｐＨの中和を行った後に添加してもよく、水やバッファー等で希釈した後に添加してもよい。また、添加割合は特に制限されることはなく、ＰＣＲ反応による増幅が認められる範囲で添加すればよい。

細胞をホモジナイズする工程は、前記細胞をそのままホモジナイズしてもよいが、前記細胞を水やバッファー、アルカリ溶液等で懸濁・希釈後、ホモジナイズすることが好ましい。ホモジナイズは、細胞を磨り潰せばよく、乳鉢等を用いて磨り潰しでもよく、商業的に入手可能なホモジナイザーやペッスル等を用いてホモジナイズを行ってもよい。ホモジナイズを実施した細胞は、そのままＰＣＲ反応液に添加してもよいが、ｐＨの中和を行った後に添加してもよく、水やバッファー等で希釈した後に添加してもよい。また、添加割合は特に制限せれることはなく、ＰＣＲ反応による増幅が認められる範囲で添加すればよい。

本発明におけるリアルタイムＰＣＲの検出は、ＤＮＡ検出剤、もしくはＱＰｒｏｂｅを用いて定量することを特徴とする。リアルタイムＰＣＲによる検出法は特に限定されるものではないが、なかでもＤＮＡ検出剤が望ましい。

本発明に用いるＤＮＡ検出剤は特に限定されず、ＤＮＡ表面のリン酸基に結合する色素や塩基間にインターカレートする色素（インターカレーター）などが挙げられるが、インターカレーターを用いることが好ましい。
インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。

多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標） ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標） ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９， ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

本発明におけるＰＣＲ反応液は、前記ＤＮＡ検出剤あるいはＱＰｒｏｂｅ、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ以外に、目的遺伝子の増幅用プライマー、テンプレートとして細胞を含む。さらに、これ以外の成分は特に限定されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も限定されるものではない。前記組成成分として、１種類以上のデオキシヌクレオチド三リン酸または、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。

緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ^２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。

さらに、反応バッファー中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。

本発明における細胞の遺伝子の定量は、リアルタイムＰＣＲ機器が使用される。その具体例としては、ロッシュ・ダイアグノスティック社のライトサイクラー（登録商標）、アプライドバイオシステム社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００ ／ ７７００、７５００ ／ ７５００ ＦＡＳＴ リアルタイムＰＣＲシステム、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム、ＳｔｅｐＯｎｅ ／ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム、キアゲン社のＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ、タカラバイオ社のＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド社のＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈ、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ、アジレント・テクノロジー社のＭｘ３０００Ｐ、Ｍｘ３００５Ｐ、Ｍｘ４０００等が挙げられるが、限定されるものではない。

リアルタイムＰＣＲを用いた定量方法として、絶対定量と相対定量がある。どちらを用いて定量しても構わないが、濃度既存のプラスミド等による検量線からコピー数を算出する絶対定量を使用することが望ましい。また、１細胞あたりのコピー数を求めるために、宿主細胞に含まれる内在性コントロール遺伝子のコピー数も測定し、一細胞あたりの目的遺伝子のコピー数を算出することが好ましい。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１：細胞による阻害の確認
従来から使用されているファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合と、本発明であるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合で、細胞による阻害の違いを確認した。
ファミリーＡに属するポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。具体的には、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをベースとしたリアルタイムＰＣＲ試薬であるＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標） ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、ＰＣＲバッファーとして、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）に添付のものを使用した。また、インターカレーターは、１／３０，０００倍希釈のＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ を使用した。

本実施例では、細胞に対する阻害効果を確認するために、ＨｅＬａ細胞の１０^５細胞から１０^０細胞までの１／１０段階懸濁液に２×１０^６コピーのプラスミド（ｐＢＲ３２２）を添加した。この添加したｐＢＲ３２２特異的プライマーにてリアルタイムＰＣＲを行い、立ち上がり（Ｃｔ値）を評価することで、細胞の阻害効果を確認することとした。
具体的には、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合のＰＣＲ反応液、反応条件を表１、表２に示す。また、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合の条件を表３、表４に示す。リアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）にて実施した。

これらの結果を図１、図２に示す。図１は、ファミリーＡに属するポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲにおける細胞耐性能を調べた結果である。その結果、１細胞〜１０細胞までは、細胞添加なしと同じ立ち上がりであったが、１００細胞以上添加すると立ち上がり（Ｃｔ値）が低下した。つまり、１０細胞以下でないと定量できないことを意味していた。

図２は、ファミリーＢに属するポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲにおける細胞耐性能を調べた結果である。その結果、１０^４細胞まで立ち上がり（Ｃｔ値）が同じであり、細胞耐性能が高いことを確認することができた。つまり、従来のファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼでは、細胞による阻害により細胞から直接定量できないが、使用するＤＮＡポリメラーゼをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにすることで、細胞から直接、細胞の遺伝子の定量が可能であることが示された。

実施例２：細胞の導入遺伝子の直接検出
本実施例では、細胞の導入遺伝子の直接定量が可能であるかを確認するために、細胞の段階希釈懸濁液を鋳型とし、増幅曲線から求められるＣｔ値と添加細胞量から作成した検量線の直線性が保たれるか確認した。用いた細胞は、特開２０１３−３４４７４の実施例に記載された方法に従って取得した遺伝子増幅を行った細胞株である。詳細には、特開２０１３−３４４７４の実施例２−１で構築したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ ３Ｇ８）を実施例２−２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクションし、ピューロマイシンで選択後に高発現株を取得し、この細胞株をＭＴＸで選択培養することで得た細胞株である。このＣＨＯ細胞を用いて、導入された抗ＫＯＤ抗体の検出を行った。検出のターゲットは、ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ、宿主ＤＮＡとしてＥＦ１αプロモーターとした。

本実施例では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、ＰＣＲバッファーとして、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）に添付のものを使用した。また、インターカレーターは、１／３０，０００倍希釈のＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ を使用した。具体的には、表５に記載の反応組成、表６に記載のＰＣＲサイクルにて、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて実施した。

これらの結果を図３、図４に示す。図３は、細胞の水懸濁液から直接、宿主ＤＮＡを検出した結果である。その結果、１０細胞から１０^４細胞まで、定量的で特異性の高い増幅が認められた。つまり、増幅曲線から求められるＣｔ値と添加した細胞数から検量線を作成すると直線となるため、１０^４細胞までの範囲において、細胞から直接定量が可能であることが示されたことになる。

図４は、細胞の水懸濁液から直接、ＣＨＯ細胞に遺伝子導入したＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを検出した結果である。その結果、宿主ＤＮＡと同様に１０細胞から１０^４細胞まで、定量的で特異性の高い増幅が認められた。つまり、増幅曲線から求められるＣｔ値と添加した細胞数から検量線を作成すると直線となるため、１０^４細胞までの範囲において、細胞から直接定量が可能であることが示されたことになる。

本発明により、細胞からＤＮＡを抽出・精製することなく、細胞の遺伝子発現を定量することを可能としている。これにより、従来よりも短時間で定量が可能となった。本発明は、細胞の発現遺伝子解析等の研究分野での応用に始め、導入遺伝子の定量によるスクリーニングなどにおいて広く使用することができる。また、短時間で定量が可能になったことから、特に多サンプルのスクリーニングが必要な産業用途での利用が特に期待できる。

Claims (4)

1. 細胞の遺伝子発現量の定量方法であって、細胞の核酸抽出もしくは精製を行わず、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）由来のＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより求められるＣｔ値と細胞数との検量線を作成することを特徴とする、細胞の遺伝子発現量の定量方法。
2. 細胞が培養細胞である、請求項１に記載の定量方法。
3. ＤＮＡ検出剤もしくはＱＰｒｏｂｅを用いて定量することを特徴とする、請求項１または２に記載の定量方法。
4. ＤＮＡ検出剤が、インターカレーターである請求項３に記載の定量方法。