JPWO2019074004A1 - Ｓｎｐ検出方法 - Google Patents
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Abstract
乾燥濾紙血を用いてＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法が提供される。より具体的には、当該方法は、乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法であって、（Ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程を含む。
Description
本発明は、乾燥濾紙血を用いてＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法等に関する。
遺伝的な病気を出生後すばやく検出及び診断することにより、すみやかに治療を開始することができ、ひいては当該病気の影響が大きくなることを抑制することができる場合がある。例えば、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ：ＳＭＡ）については、出生後早期に診断され、治療が開始されることによって、大幅な症状改善が期待される。
ＳＭＡは、脊髄前角下位運動ニューロン神経細胞体の脱落による、体幹及び四肢に筋萎縮及び筋力低下を示す下位運動ニューロン疾患である。ＳＭＡ患者の９５％に、５番染色体ｑ１３領域にあるＳＭＮ１（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ１）遺伝子の欠失が確認されていることから、ＳＭＮ１遺伝子が疾患遺伝子である。また、同一遺伝子座に相同性の極めて高いＳＭＮ２遺伝子が存在しており、そのコピー数が多くなればＳＭＮ１遺伝子の欠失をある程度補うことから、ＳＭＮ２遺伝子は疾患修飾遺伝子と考えられている。ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子は殆ど同一の塩基配列を有し、コーディング領域の違いは、エクソン７の６番目の一塩基の違いだけである（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）。すなわち、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間にはＳＮＰが存在している。このエクソン７の一塩基の違いはアミノ酸置換を引き起こさないため、ＳＭＮ２遺伝子からも、ＳＭＮ１遺伝子と同じく、機能的なタンパク質も産生されるはずであるが、ＳＭＮ２遺伝子に由来するタンパク質の大部分はエクソン７に由来するタンパクドメインを持たない。これは、ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子ではスプライシングパターンが異なっているためで、ＳＭＮ１遺伝子からは、完全長のｍＲＮＡだけが合成される。ＳＭＮ２遺伝子から産生されるｍＲＮＡの９０％は、エクソン７を欠き、１０％だけがエクソン７を有している。ただ、エクソン７を有しているｍＲＮＡが少なくてもＳＭＮ２遺伝子のコピー数が多ければ、ＳＭＮ２ ｍＲＮＡがかなりの程度産生されることになり、ＳＭＮ１遺伝子の欠失をある程度補うことになる（非特許文献１）。
ＳＭＡの治療戦略として、ＳＭＮ２遺伝子の「スプライシング修正」という治療戦略が考案された。すなわち、ＳＭＮ２遺伝子のスプライシングを人工的に修正して、エクソン７を有するＳＭＮ２ ｍＲＮＡの割合を増加させることにより、ＳＭＮ２遺伝子由来の機能的タンパク質の割合を増加させ、ＳＭＮ１遺伝子の欠失を補うことにより治療を行うという戦略である。２０１６年には、ＳＭＮ２遺伝子のスプライシングを人工的に修正するためのアンチセンス・オリゴヌクレオチド製剤、Ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎの有効性が確認され、ＦＤＡにより米国で認可された。日本でも２０１７年７月３日、この薬剤（スピンラザ（登録商標））が製造承認された。これまで、ＳＭＡ患者は発達遅延児とみなされ、そのまま観察、放置されてしまうことが多かったが、ＳＭＡが治療できる時代に入ったことから、ＳＭＮ１遺伝子欠失患者の早急な検出は一段と重要性が高まったといえる。
Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １０， ５９７−６０９， ２００９
Ｋｏｂｅ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ． ６０， Ｎｏ． ４， ｐｐ． Ｅ７８−Ｅ８５， ２０１４
上記の通り、出生後のすみやかな遺伝子検査により、早期に遺伝疾患を検出する重要性が増大している。また、このような検査は、全ての出生児に対して行うことが望ましく、全出生児に対して簡便に素早く現実的なコストで遺伝子検査を行える手法の開発が望まれる。
特に日本国においては、代謝物による疾患スクリーニングのために、通常生後４〜６日目に全新生児から採血がなされ、血液が染みこんだ乾燥濾紙が作製されている。この乾燥濾紙中の血液（乾燥濾紙血）を用いて遺伝子解析を行うことができれば、合理的なコストで大規模な出生児遺伝子検査が可能になり、全出生児に対して遺伝子検査を行うことも現実的であるといえる。
しかしながら、乾燥濾紙血に含まれる核酸は、品質が悪く、また微量であるため、特にＳＮＰ（一塩基多型）を乾燥濾紙血から検出することは極めて困難であった。そこで、本発明は、乾燥濾紙血を用いてＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、乾燥濾紙血から抽出した核酸のＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行うことにより、乾燥濾紙血からでもＳＮＰを検出できる可能性を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法であって、
（Ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、方法。
項２．
ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片が、当該ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法で識別できる核酸断片である、項１に記載の方法。
項３．
乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰを検出する方法であって、
（Ａ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅する工程、及び
（Ｂ）当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．
工程（Ａ）におけるＰＣＲに用いるプライマーが、検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーである、項３に記載の方法。
項５．
乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法であって、
（ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、方法。
項６．
前記増幅核酸断片が、前記ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片である、項５に記載の方法。
項７．
乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を含む領域をＰＣＲにより増幅する工程、及び
（ｂ）当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、項５又は６に記載の方法。
項８．
工程（ａ）におけるＰＣＲに用いるプライマーが、前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーである、項７に記載の方法。
項９．
前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーが、以下の条件（ｉ）を満たすプライマーである、項８に記載の方法。
（ｉ）：プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）が、少なくとも１種の制限酵素の認識配列に含まれており、当該制限酵素によって一方の遺伝子は切断されるがもう一方の遺伝子は切断されない。
項１０．
前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーが、３’末端から３塩基はすべてＴであり、４塩基目以降の塩基配列が、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子ｃＤＮＡ配列の８４４塩基目以降の塩基配列とアニーリング時ミスマッチ１０％以下である、全長１５〜５０塩基長の核酸である（特に好ましくは、ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴで示される塩基配列からなる核酸である）、
項８又は９に記載の方法。
項１１．
ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーが、ｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅しないプライマー、及び、ｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅しないプライマー、である、項５〜１０のいずれかに記載の方法。
項１２．
ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマーが、
ＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣ、又はＴＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなる核酸であり、
ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマーが、
ＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣ、又はＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなる核酸である、
項１１に記載の方法。
項１３．
以下の（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のプライマーのうち、
少なくとも１つのプライマーを備えるか、
少なくとも２つのプライマーを備えるか、あるいは
全てのプライマーを備える、
乾燥濾紙血からＳＭＮ診断を行うためのキット。
（Ｉ）：ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩ）：ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩＩ）：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）の有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマー
項１．
乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法であって、
（Ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、方法。
項２．
ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片が、当該ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法で識別できる核酸断片である、項１に記載の方法。
項３．
乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰを検出する方法であって、
（Ａ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅する工程、及び
（Ｂ）当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．
工程（Ａ）におけるＰＣＲに用いるプライマーが、検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーである、項３に記載の方法。
項５．
乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法であって、
（ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、方法。
項６．
前記増幅核酸断片が、前記ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片である、項５に記載の方法。
項７．
乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を含む領域をＰＣＲにより増幅する工程、及び
（ｂ）当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、項５又は６に記載の方法。
項８．
工程（ａ）におけるＰＣＲに用いるプライマーが、前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーである、項７に記載の方法。
項９．
前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーが、以下の条件（ｉ）を満たすプライマーである、項８に記載の方法。
（ｉ）：プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）が、少なくとも１種の制限酵素の認識配列に含まれており、当該制限酵素によって一方の遺伝子は切断されるがもう一方の遺伝子は切断されない。
項１０．
前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーが、３’末端から３塩基はすべてＴであり、４塩基目以降の塩基配列が、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子ｃＤＮＡ配列の８４４塩基目以降の塩基配列とアニーリング時ミスマッチ１０％以下である、全長１５〜５０塩基長の核酸である（特に好ましくは、ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴで示される塩基配列からなる核酸である）、
項８又は９に記載の方法。
項１１．
ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーが、ｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅しないプライマー、及び、ｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅しないプライマー、である、項５〜１０のいずれかに記載の方法。
項１２．
ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマーが、
ＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣ、又はＴＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなる核酸であり、
ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマーが、
ＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣ、又はＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなる核酸である、
項１１に記載の方法。
項１３．
以下の（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のプライマーのうち、
少なくとも１つのプライマーを備えるか、
少なくとも２つのプライマーを備えるか、あるいは
全てのプライマーを備える、
乾燥濾紙血からＳＭＮ診断を行うためのキット。
（Ｉ）：ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩ）：ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩＩ）：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）の有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマー
本発明により、乾燥濾紙血からも迅速且つ簡便にＳＮＰを検出することができる。特に、疾患に関連するＳＮＰを検出することにより、当該疾患を診断することもできる。
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。なお、本明細書において、「核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡが包含され、ＤＮＡが好ましい。
本発明に包含されるＳＮＰ検出方法（以下、「本発明のＳＮＰ検出方法」ということがある）は、乾燥濾紙血中の核酸におけるＳＮＰを検出する方法である。乾燥濾紙血は、濾紙に染みこみ乾燥した血液である。上述のように、日本国では、全新生児から採血がなされ、血液が染みこんだ乾燥濾紙が作製されている。本発明に包含されるＳＮＰ検出方法では、この乾燥濾紙中の血液（乾燥濾紙血）を用いることができるため、特に遺伝疾患に関係するＳＮＰを検出して疾患の診断を行う場合には、漏れのない網羅的なスクリーニングが可能となるため、有利である。よって、本発明に用いられる特に好ましい乾燥濾紙血は、既に日本国においては作製されている新生児マススクリーニング用乾燥濾紙血（ガスリーカード血）ということができる。
用いられる濾紙としては、特に制限されず、新生児血液を染みこませるのに用いられている公知の濾紙を用いることができる。また、ＦＴＡカード（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等のＤＮＡ保存用の濾紙は特に好適である。乾燥も、特に制限はされないが、風乾による乾燥が好ましい。
乾燥濾紙血は、特に制限されないが、例えば作製から５年以内のものを用いることが好ましく、４、３、２、又は１年以内のものがより好ましい。
本発明のＳＮＰ検出方法は、乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法であって、工程（Ｂ）：乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を鋳型（テンプレート）とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程を含む。
乾燥濾紙血中の核酸は、公知の方法により抽出することができる。例えば、ＴＥバッファー・煮沸法により抽出することができる。より詳細には、例えば、血を染みこませ乾燥させた乾燥濾紙の血存在部分をパンチ等で打ち抜き、これを滅菌チューブ内で水で洗浄した後、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０（１×ＴＥバッファー）を加えて加熱（例えば９５℃で３０分間）することにより、乾燥濾紙血由来のＤＮＡを抽出することができる。
また、乾燥濾紙血（好ましくは、血を染みこませ乾燥させた乾燥濾紙の血存在部分の打ち抜き片）を核酸増幅用ミックス（例えばＰＣＲミックス）に加えることにより、当該ミックス中に乾燥濾紙血に存在するＤＮＡ（Ｄｒｉｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｐｏｔ ＤＮＡ：ＤＢＳ−ＤＮＡ）が移動するため、前述したような核酸抽出操作を行わずに、そのまま核酸増幅操作（例えばＰＣＲ）を行うことで核酸増幅することも行い得る。
ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片は、当該乾燥濾紙血中の核酸を、例えばＰＣＲにより増幅させて得ることができる。当該ＰＣＲに用いるプライマーセットは、検出対象のＳＮＰを含む領域を増幅させることができれば、特に制限はされない。例えば、増幅断片長は、５０〜１０００ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ：塩基対）、１００〜８００ｂｐ、又は１５０〜５００ｂｐ程度であってよい。また、当該プライマーセットを構成するプライマーも、当該効果が奏される範囲であればその塩基長は特に制限はされず、例えば１５〜５０塩基長、又は２０〜４０塩基長程度であってよい。また、ＰＣＲの条件についても、増幅断片が得られる範囲において特に制限はされず、適宜設定することができる。例えば、核酸増幅用酵素（ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ）やｄＮＴＰミックス等、ＰＣＲのために必要な試薬については公知のものを適宜選択して用いることができる。また例えば、増幅サイクル数についても、用いる核酸増幅用酵素や増幅核酸長等に応じて、適宜設定することができる。例えば、増幅サイクル数としては、１０〜１００サイクルが挙げられ、当該範囲の上限は９０、８０、７０、６０、５０若しくは４０であってもよく、当該範囲の下限は１５、２０、２５、３０、若しくは３５であってもよい。
なお、核酸抽出操作を省く場合（特に、乾燥濾紙の血存在部分の打ち抜き片を直接核酸増幅用ミックスに加え、そのまま核酸増幅を行う場合）には、用いる核酸増幅用酵素としては、比較的長い塩基長を増幅可能な酵素を用いることが好ましい。当該比較的長い塩基長としては、例えば５〜４０ｋｂ程度、好ましくは１０〜３０ｋｂ程度が挙げられる。このような酵素としては、例えば、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）が好ましく挙げられる。
なお、ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片が、一度の増幅反応では少量しか得られない場合には、その増幅産物をテンプレートして再度増幅反応を行い（例えば同一のプライマーセットより、あるいはｎｅｓｔＰＣＲ用プライマーセットにより増幅反応を行い）、ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を更に増やすことで、ＳＮＰ識別の精度を上げることができる。例えば、このようにして増やした増幅核酸断片をテンプレートとして、ＳＮＰ識別プライマーにより下述するような操作を行うことで、ＳＮＰの識別をより高精度で行うことができる。特に下述する操作のうち、リアルタイムＰＣＲ及び／又はＲＦＬＰ法によりＳＮＰの識別を行う場合には、ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を更に増やすことは、好ましい。ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を得るために行う増幅反応（例えばＰＣＲ）は、例えば１回の他、２又は３回程度行うことができる。
ＳＮＰ識別プライマーとは、当該プライマーを用いてＰＣＲを行うことで、ＳＮＰの有無を検出することができるプライマーをいう。より詳細には、ＳＮＰにおける塩基多型が２種ある場合、それぞれをＳＮＰ１及びＳＮＰ２とすると（以下、この「ＳＮＰ１」及び「ＳＮＰ２」という表記を用いることがある）、「ＳＮＰ１を含む領域を増幅するがＳＮＰ２を含む領域を増幅しないプライマー」（ＳＮＰ１識別プライマー）及び「ＳＮＰ２を含む領域を増幅するがＳＮＰ１を含む領域を増幅しないプライマー」（ＳＮＰ２識別プライマー）が好ましいＳＮＰ識別プライマーである。これらのＳＮＰ識別プライマーを用いたＰＣＲの後、増幅産物の有無を調べることでＳＮＰを検出することができ、さらにはＳＮＰ１及びＳＮＰ２のいずれのＳＮＰが存在するかをも判別することができる。
上記の通り、ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子はエクソン７の６番目の一塩基の違いを有する（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）から、例えばＳＮＰ１をｃ．８４０Ｃ、ＳＮＰ２をｃ．８４０Ｔと考えることができる。よって、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰについては、ｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅しないプライマー、及び、ｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅しないプライマー、が好ましいＳＮＰ識別プライマーということができる。なお、「ｃ．８４０Ｃ」及び「ｃ．８４０Ｔ」の「ｃ．」は、ｃＤＮＡにおける塩基であることを示す。つまり、「ｃ．８４０Ｃ」は翻訳開始点から数えて８４０番目の塩基がＣであることを示し、「ｃ．８４０Ｔ」は翻訳開始点から数えて８４０番目の塩基がＴであることを示す。また、本明細書において、「ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ」とは、特に断らない限り、エクソン７の６番目の一塩基多型（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を指す。
ＳＮＰ識別プライマーは、例えば、ＳＮＰ部位をカバーしてアニーリングし、且つＳＮＰ部位においては一方の多型のみに相補的な塩基を有するという条件を満たすプライマーを設計して、実際の実験及びインシリコでのアニーリング結合性強度等を参考として良好なものを絞りこむことで、得ることができる。また、公知であるＳＮＰ識別プライマーを好ましく用いることもできる。特に制限はされないが、ＳＮＰ部位を３’末端とするプライマー、さらにはＳＮＰ部位を３’末端とし且つ３’末端から２〜５塩基目をミスマッチとしたプライマー、等がＳＮＰ識別プライマーとして用いることができる可能性がある。また例えば、プライマーの塩基配列長を比較的短く（例えば、８〜２０、９〜１８、１０〜１６、又は１１〜１４塩基長）することも考えられる。
例えば、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰについてのＳＮＰ識別プライマーとしては、ＳＮＰ部位をプライマー塩基配列の中間とすることが好ましい。また、ミスマッチの無いプライマーが好ましい。例えば、プライマーのＳＮＰ部位アニール塩基の３’側又は５’側に、それぞれ同一又は異なって、４、５、６、７、８、９、又は１０塩基長を有するプライマーが好ましい。例を挙げて説明すると、ＳＭＮ１遺伝子のｃ．８４０Ｃ付近の塩基配列はＧＧＴＴＴＣＡＧＡＣＡであるところ（下線付ＣがＳＮＰ部位）、この領域にミスマッチ無くアニーリングするプライマーとしてはＧＧＴＴＴＣＡＧＡＣＡ（フォワードプライマー）又はＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣ（リバースプライマー）が挙げられるところ（下線付塩基がＳＮＰ部位とアニールする）、いずれのプライマーにおいてもＳＮＰ部位アニール塩基の３’側には５塩基、５’側にも５塩基存在しており、プライマー長は１１塩基長である。なお、ＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなるプライマーを「ＳＭＮ１−ＣＯＰ」と呼ぶことがある。また、これらのプライマーは、ｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅しないプライマーの好ましい例である。
また、ＳＭＮ２遺伝子のｃ．８４０Ｔ付近の塩基配列はＧＧＴＴＴＴＡＧＡＣＡＡであるところ（下線付ＴがＳＮＰ部位）、この領域にミスマッチ無くアニーリングするプライマーとしてはＧＧＴＴＴＴＡＧＡＣＡＡ（フォワードプライマー）又はＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣ（リバースプライマー）が挙げられるところ（下線付塩基がＳＮＰ部位とアニールする）、ＧＧＴＴＴＴＡＧＡＣＡＡではプライマーのＳＮＰ部位アニール塩基の３’側には５塩基、５’側には６塩基存在しており、プライマー長は１２塩基長であり、ＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣではプライマーのＳＮＰ部位アニール塩基の３’側には６塩基、５’側には５塩基存在しており、プライマー長は１２塩基長である。なお、ＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなるプライマーを「ＳＭＮ２−ＣＯＰ」と呼ぶことがある。また、これらのプライマーは、ｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅しないプライマーの好ましい例である。
本発明のＳＮＰ検出方法においては、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う。ここでの「各ＳＮＰ識別プライマー毎」とは、各ＳＮＰ識別プライマー及びその対をなすプライマーのプライマーセット毎、という意味合いである。ＳＮＰにおける塩基多型が２種ある場合、一方のＳＮＰ（ＳＮＰ１）を含む領域は増幅し、もう一方のＳＮＰ（ＳＮＰ２）を含む領域は増幅しないプライマーは、ＳＮＰ識別プライマーとして好ましく用いることができ、当該ＳＮＰ識別プライマー及び当該ＳＮＰ識別プライマーの対となるプライマーをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、増幅の有無を確認すれば、ＳＮＰを検出し、且ついずれのＳＮＰが存在するかをも判別することができる。これとは別に若しくは加えて、ＳＮＰ２を含む領域は増幅し、ＳＮＰ１を含む領域は増幅しないプライマーも、ＳＮＰ識別プライマーとして用いることができ、当該ＳＮＰ識別プライマー及び当該ＳＮＰ識別プライマーの対となるプライマーをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、増幅の有無を確認して、前記の異なるＳＮＰ識別プライマーによる増幅の有無と組み合わせて確認を行えば、ＳＮＰ検出及び判別の正確性が一段と高まる。
ＳＮＰ識別プライマーの対となるプライマーは、ＳＮＰ識別プライマーがフォワードプライマーの場合はリバースプライマーであり、ＳＮＰ識別プライマーがリバースプライマーの場合はフォワードプライマーである。ＳＮＰ識別プライマーの対となるプライマーは、ＳＮＰ識別プライマーと組み合わせて用いることで、ＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅できるものであれば、特に制限はされない。例えば、１０〜５０、１２〜４０、又は１５〜３０塩基長の核酸であり得る。また、ゲノムにおいて、ＳＮＰ識別プライマーがアニーリングする部位から例えば３０〜１０００、５０〜８００、１００〜５００ｂｐ程度離れた領域にアニーリングするプライマーであり得る。
例えば、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ検出について、ＳＮＰ識別プライマーとして「ＳＭＮ１−ＣＯＰ」及び「ＳＭＮ２−ＣＯＰ」を用いる場合には、ＳＭＮ１−ＣＯＰ及びＳＭＮ１−ＣＯＰの対となるプライマーをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、増幅の有無を確認することができる。また、ＳＭＮ２−ＣＯＰ及びＳＭＮ２−ＣＯＰの対となるプライマーをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、増幅の有無を確認することができる。さらに、これらの結果を組み合わせて検証することで、当該ＳＮＰ検出及び判別の正確性が一段と高まる。例えば、同一のサンプルをテンプレートして用いたとすれば、ＳＭＮ１−ＣＯＰを用いたＰＣＲで増幅が見られない場合には、ＳＭＮ２−ＣＯＰを用いたＰＣＲでは増幅が見られるはずであり、この整合性を確認することでＳＮＰ検出及び判別の正確性が一段と高まる。
別反応系で各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを行うとは、各ＳＮＰ識別プライマー及びその対をなすプライマーのプライマーセット毎に、別反応系でＰＣＲを行うことを指す。すなわち、同じ反応系に複数のプライマーセットが存在しないこと、換言すれば１反応系に存在するプライマーセットの組み合わせは１組み合わせしかないことを指す。
例えば、ＳＮＰ識別プライマーとして「ＳＭＮ１−ＣＯＰ」及び「ＳＭＮ２−ＣＯＰ」を用いる場合には、「ＳＭＮ１−ＣＯＰ」及び「ＳＭＮ２−ＣＯＰ」並びにこれらの対プライマーを同じ反応系に含ませることはせず、「ＳＭＮ１−ＣＯＰ」及びその対となるプライマーを用いたＰＣＲと、「ＳＭＮ２−ＣＯＰ」及びその対となるプライマーを用いたＰＣＲとは、別反応系で行う。
ＳＮＰ識別プライマーを用いたＰＣＲの条件も、当該プライマーがＳＮＰを識別して、増幅断片をテンプレートに核酸断片を増幅する限り、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、増幅断片長は、５０〜１０００ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ：塩基対）、１００〜８００ｂｐ、又は１５０〜５００ｂｐ程度であってよい。また、非特異的な増幅を防止するため、ホットスタートＰＣＲを行ってもよい。また、核酸断片の増幅を確認するにあたっては、例えばアガロース電気泳動法等を用いることもできるが、ＳＮＰ識別プライマーを用いたＰＣＲをリアルタイムＰＣＲにより行って増幅を確認する方法が、迅速かつ簡便であり有利である。リアルタイムＰＣＲは、公知の方法で行うことができ、例えばインターカレーション法及びハイブリダイゼーション法を挙げることができる。本発明においては、場合によっては増幅の程度まで確認する必要は必ずしもなく、増幅の有無によりＳＮＰの有無及び／又は型を検出することもできるため、簡便さの観点からはインターカレーションがより好ましい。インターカレーション法に用いるインターカレーターとしては、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｄｙｅ等が挙げられる。
本発明のＳＮＰ検出法では、前記ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片は、当該ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法で識別できる核酸断片であることが好ましい。当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いてＳＮＰを検出した際に、ＳＮＰの存在及び／又は型が確定しづらい結果が出た場合に、鋳型である当該増幅核酸断片をＲＦＬＰ法によって調べ、ＳＮＰの存在及び／又は型を確定することができるため、有利である。特に、例えば大規模なＰＣＲによる一次スクリーニング（全出生児の乾燥濾紙血を用いたＳＮＰ領域の事前増幅及び当該事前増幅産物を鋳型としたＰＣＲ）において、ＰＣＲの増幅の有無及び／又は型が判断できないような場合に、事前増幅産物を制限酵素で処理してＲＦＬＰ法により、迅速かつ確実にＳＮＰの有無及び／型を検出することができる。
増幅核酸断片を、ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片とするためには、例えば、増幅に用いるＰＣＲプライマーを、ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するよう設計することが好ましい。つまり、乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域を増幅するプライマーを、それによって増幅される核酸断片を特定の制限酵素で処理した際にＳＮＰによって切断の有無が決まるよう、設計することが好ましい。例えば、当該プライマーのＳＮＰ対応部位の塩基及び／又はその周辺の塩基配列が、これによりＳＮＰ１から得られる増幅断片の塩基配列がある制限酵素の認識配列である一方で、ＳＮＰ２識別プライマーのＳＮＰ対応部位の塩基及びその周辺の塩基配列は、当該制限酵素の認識配列では無いように、ＳＮＰ１識別プライマー及びＳＮＰ２識別プライマーを設計することが好ましい。
より具体的には、例えば、ＳＭＮ１遺伝子のｃ．８４０Ｃ付近の塩基配列はＧＧＴＴＴＣＡＧＡＣＡであり（下線付ＣがＳＮＰ部位）、また、ＳＭＮ２遺伝子のｃ．８４０Ｔ付近の塩基配列はＧＧＴＴＴＴＡＧＡＣＡＡであるところ（下線付ＴがＳＮＰ部位）、増幅産物におけるＳＭＮ１遺伝子の当該ＳＮＰ周辺の塩基配列がＧＧＴＴＴＣＡＡＡＣＡ（下線付Ａがゲノム配列と異なる部位）となり、増幅産物におけるＳＭＮ２遺伝子の当該ＳＮＰ周辺の塩基配列がＧＧＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡ（下線付Ａがゲノム配列と異なる部位）となるようプライマーを設計することにより、制限酵素ＤｒａＩの認識配列ＴＴＴＡＡＡが、ＳＭＮ１遺伝子の増幅産物には存在せず、一方ＳＭＮ２遺伝子の増幅産物には存在することとなる。このようなプライマーとしては、例えば、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰのすぐ３’側隣の塩基からアニーリングし（すなわち、プライマー自身の３’末端はＴであり）、且つ上記の塩基改変ができるよう３’末端から２番目の塩基もＴであり、ゲノムとアニーリング時にミスマッチしないよう３’末端から３番目の塩基もＴであるプライマー（すなわち、プライマー自身の３’末端から３塩基はすべてＴであるプライマー）、が好ましく挙げられ、さらにそれ以降（つまりプライマー自身の３’末端から４塩基目以降）はアニーリング時にできるだけミスマッチの無い配列（例えばミスマッチ率１０、５、３、２、又は１％以下あるいは０％）であることが好ましい。ミスマッチ率は、（アニーリング時のミスマッチ塩基数／プライマー全塩基数）×１００（％）で求める値である。なお、アニーリング時、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕ以外のペアはミスマッチと判断する。ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーとしては、より具体的には、例えば実施例で用いたプライマーＸ７−Ｄｒａ（ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴ：下線部配列はＳＭＮ１及びＳＭＮ２遺伝子のｃＤＮＡ配列とアニーリング時のミスマッチ０％）が挙げられる。
本発明のＳＮＰ検出方法は、別個体間のＳＮＰを検出するためにも、また同一個体内の遺伝子間のＳＮＰを検出するためにも、用いることができる。つまり、本発明においては、１塩基の差異が存在すれば、別個体間の１塩基の差異であっても、同一個体内の遺伝子間の１塩基の差異であっても、ＳＮＰと呼ぶ。
例えば、別個体間のＳＮＰを検出する場合には、異なる個体（例えば個体１及び個体２）由来の乾燥濾紙血から抽出した核酸を増幅し、個体１由来核酸増幅産物をテンプレートとして、ＳＮＰ１識別プライマーを用いたＰＣＲとＳＮＰ２識別プライマーを用いたＰＣＲとを別反応系で行った結果と、個体２由来核酸増幅産物をテンプレートとして、ＳＮＰ１識別プライマーを用いたＰＣＲとＳＮＰ２識別プライマーを用いたＰＣＲとを別反応系で行った結果とを、比較することで、各個体がＳＮＰ１とＳＮＰ２のいずれのＳＮＰを有するのかを調べることができる。また例えば、同一個体内の遺伝子間のＳＮＰを検出する場合には、乾燥濾紙血から抽出した核酸を増幅し、当該核酸増幅産物をテンプレートとして、ＳＮＰ１識別プライマーを用いたＰＣＲとＳＮＰ２識別プライマーを用いたＰＣＲとを別反応系で行った結果を比較することで、当該同一個体がＳＮＰ１及び／ＳＮＰ２を有するかを調べることができる。
特に、疾患に関連する公知のＳＮＰについては、本発明のＳＮＰ検出方法を適用してＳＮＰを検出することで、疾患診断を行うことができる。また、迅速且つ簡便にＳＮＰを検出して診断を行うことができることから、早期治療が重要であるＳＮＰ関連疾患の診断には特に有利である。従って、例えば、上述した乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法は、ＳＭＮ診断方法として特に好適に用いることができる。
本発明は、以下の（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーを備えるか、少なくとも２つのプライマーを備えるか、あるいは全てのプライマーを備える、
乾燥濾紙血からＳＭＮ診断を行うためのキットも包含する。
（Ｉ）：ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩ）：ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩＩ）：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）の有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマー
これらのプライマーについては、上述したとおりである。
乾燥濾紙血からＳＭＮ診断を行うためのキットも包含する。
（Ｉ）：ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩ）：ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩＩ）：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）の有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマー
これらのプライマーについては、上述したとおりである。
また、当該キットは、その他の試薬を備えていてもよい。例えば、乾燥濾紙血から核酸を抽出するための試薬（例えばＴＥバッファー）や、ＰＣＲミックスの各成分（例えばｄＮＴＰやＴａｑポリメラーゼなど）等を備えていてもよい。
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
乾燥濾紙血からのＤＮＡの抽出
ＳＭＡ患者および対照となる健常人から得た新鮮血液を濾紙の上に滴下し、染み込ませて風乾させた。なお、濾紙としては、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ Ｃａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。得られた血液濾紙は、室温（２０〜２５℃）で暗所に保管した。
ＳＭＡ患者および対照となる健常人から得た新鮮血液を濾紙の上に滴下し、染み込ませて風乾させた。なお、濾紙としては、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ Ｃａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。得られた血液濾紙は、室温（２０〜２５℃）で暗所に保管した。
乾燥濾紙血からのゲノムＤＮＡ抽出には、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ煮沸法を用いた。その詳細は以下のとおりである。
（１）濾紙上の乾燥血のスポットから、４片の直径３ｍｍのサークル（円）をパンチで打ち抜いた。当該４片のサークルに含まれる血液は、およそ全血２５μＬに相当する。
（２）濾紙血を洗浄する目的で、４片のサークルを滅菌チューブに入れ、５０μＬの蒸留水を注ぎ入れ、ボルテックスにより混合した後に、洗浄水を完全に除去した。
（３）ＤＮＡを溶出する目的で、５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０（１×ＴＥバッファー）をチューブに添加し、当該チューブを９５℃で３０分間加熱した後、溶出したＤＮＡ（Ｄｒｉｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｐｏｔ ＤＮＡ：ＤＢＳ−ＤＮＡ）を含むＴＥバッファーを、以後の検討におけるＰＣＲ用ＤＮＡテンプレートとして使用した。ＤＢＳ−ＤＮＡ含有ＴＥバッファーは使用時までは４℃で保存し、抽出から２週間以内に使用した。
（４）なお、得られたＤＢＳ−ＤＮＡ含有ＴＥバッファーは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡ濃度および吸光度比（Ａ２６０／２８０ｎｍ）を測定した。
（１）濾紙上の乾燥血のスポットから、４片の直径３ｍｍのサークル（円）をパンチで打ち抜いた。当該４片のサークルに含まれる血液は、およそ全血２５μＬに相当する。
（２）濾紙血を洗浄する目的で、４片のサークルを滅菌チューブに入れ、５０μＬの蒸留水を注ぎ入れ、ボルテックスにより混合した後に、洗浄水を完全に除去した。
（３）ＤＮＡを溶出する目的で、５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０（１×ＴＥバッファー）をチューブに添加し、当該チューブを９５℃で３０分間加熱した後、溶出したＤＮＡ（Ｄｒｉｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｐｏｔ ＤＮＡ：ＤＢＳ−ＤＮＡ）を含むＴＥバッファーを、以後の検討におけるＰＣＲ用ＤＮＡテンプレートとして使用した。ＤＢＳ−ＤＮＡ含有ＴＥバッファーは使用時までは４℃で保存し、抽出から２週間以内に使用した。
（４）なお、得られたＤＢＳ−ＤＮＡ含有ＴＥバッファーは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡ濃度および吸光度比（Ａ２６０／２８０ｎｍ）を測定した。
ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子含有領域の増幅
ＰＣＲにより、ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子の両方の遺伝子の「イントロン６の３’側とエクソン７の５’側」を増幅した。具体的には、テンプレートとしてＤＢＳ−ＤＮＡ含有ＴＥバッファーを、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマー５４１Ｃ７７０を用い、ＰＣＲを行い、増幅産物（２０２ｂｐ）を得た。（ｂｐは塩基対を示す。）なお、ＰＣＲの条件については、図１並びに表１及び表２に示す。
ＰＣＲにより、ＳＭＮ１遺伝子とＳＭＮ２遺伝子の両方の遺伝子の「イントロン６の３’側とエクソン７の５’側」を増幅した。具体的には、テンプレートとしてＤＢＳ−ＤＮＡ含有ＴＥバッファーを、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマー５４１Ｃ７７０を用い、ＰＣＲを行い、増幅産物（２０２ｂｐ）を得た。（ｂｐは塩基対を示す。）なお、ＰＣＲの条件については、図１並びに表１及び表２に示す。
ＳＮＰ識別プライマーを用いた、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ検出
上記増幅産物（２０２塩基対）をテンプレートして、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰを用いたＰＣＲと、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰを用いたＰＣＲとを、別反応系（別チューブ）で行った。即ち、プライマーとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰのみが含まれる反応系（系（１））でのＰＣＲと、プライマーとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰのみが含まれる反応系（系（２））でのＰＣＲと、を行った。詳細なＰＣＲの条件を図２並びに表３及び表４に記載する。
上記増幅産物（２０２塩基対）をテンプレートして、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰを用いたＰＣＲと、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰを用いたＰＣＲとを、別反応系（別チューブ）で行った。即ち、プライマーとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰのみが含まれる反応系（系（１））でのＰＣＲと、プライマーとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰのみが含まれる反応系（系（２））でのＰＣＲと、を行った。詳細なＰＣＲの条件を図２並びに表３及び表４に記載する。
なお、系（１）では、テンプレートにＳＭＮ１遺伝子が存在していれば、１６８ｂｐの増幅産物が得られる。また、系（２）では、テンプレートにＳＭＮ２遺伝子が存在していれば、１６９ｂｐの増幅産物が得られる。
３％アガロースゲル電気泳動により、当該ＰＣＲにより得られた増幅産物を検出した。結果を図３に示す。図３においては、グループＡには、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の両方を有する健常人の乾燥濾紙血を用いた結果を示す。グループＢには、ＳＭＮ１遺伝子を有するがＳＭＮ２遺伝子を欠損した健常人の乾燥濾紙血を用いた結果を示す（健常人の場合、ＳＭＮ１遺伝子は必ず存在するが、ＳＭＮ２遺伝子は欠失していることもある）。グループＣには、ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子を欠損したＳＭＮ患者の乾燥濾紙血を用いた結果を示す。なお、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の両方が欠失している場合、出生前に死亡してしまうため、ＳＭＮ１遺伝子が欠失しているＳＭＡ患者では、必ずＳＭＮ２遺伝子は存在する。当該結果から、上記の方法により、乾燥濾紙血を用いて、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰを検出できること、ひいてはＳＭＮ患者を識別できること、がわかった。
ＲＦＬＰ法による、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰの検出
次の条件を満たすプライマーを設計した。
・プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間に存在するＳＮＰ（ｃ．８４０ Ｃ／Ｔ）が、少なくとも１種の制限酵素の認識配列に含まれており、当該制限酵素によって一方の遺伝子は切断されるがもう一方の遺伝子は切断されない。
・出来る限り、前記ＳＮＰ部位にはアニーリングしない。
・上記条件を満たす範囲において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子とのミスマッチ（相補的塩基配列ではない塩基）が出来るだけ少なくなるようにする。
次の条件を満たすプライマーを設計した。
・プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間に存在するＳＮＰ（ｃ．８４０ Ｃ／Ｔ）が、少なくとも１種の制限酵素の認識配列に含まれており、当該制限酵素によって一方の遺伝子は切断されるがもう一方の遺伝子は切断されない。
・出来る限り、前記ＳＮＰ部位にはアニーリングしない。
・上記条件を満たす範囲において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子とのミスマッチ（相補的塩基配列ではない塩基）が出来るだけ少なくなるようにする。
これらの条件を満たすプライマーとして、プライマーＸ７−Ｄｒａを作成した。当該プライマーを用いたＰＣＲの概要を図４に示す。また、図５に当該ＰＣＲにより得られる増幅産物を制限酵素ＤｒａＩ（ＤＮＡ配列ＴＴＴＡＡＡを認識してＴとＡの間で切断する）で処理した場合の概要を示す。これらの図に示されるように、リバースプライマーとしてプライマーＸ７−Ｄｒａを用いた場合、ＳＭＮ１遺伝子領域をテンプレートとした増幅産物はＤｒａＩで切断されないのに対し、ＳＭＮ２遺伝子領域をテンプレートとした増幅産物はＤｒａＩで切断されるため、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法により、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰを検出することが可能となる。
ＤＢＳ−ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーセットとしてプライマーＲ１１１及びプライマーＸ７−Ｄｒａを用いたＰＣＲにより増幅産物（１８９ｂｐ）を得、当該増幅産物をＤｒａＩにより処理し、４％アガロースゲル電気泳動により切断の有無の確認を行った。また、事前増幅における増幅産物についても同様にアガロース電気泳動により確認した。
当該検討の詳細な条件を以下に示す。
なお、当該検討では、次に示す４種類の乾燥濾紙血（グループＡ〜Ｄ；保存期間１年又は５年）からＤＢＳ−ＤＮＡを取得して、これを事前増幅のテンプレートとして用いた。グループＡ：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を有する
グループＢ：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を有する
グループＣ：ＳＭＮ１遺伝子を有するがＳＭＮ２遺伝子が欠損
グループＤ（患者）：ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子が欠損
アガロース電気泳動の結果を図６ａに示す。いずれの乾燥濾紙血からも事前増幅により増幅産物が得られ、当該増幅産物についてＲＦＬＰ法によりＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の有無が確認できることが分かった。
グループＢ：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を有する
グループＣ：ＳＭＮ１遺伝子を有するがＳＭＮ２遺伝子が欠損
グループＤ（患者）：ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子が欠損
アガロース電気泳動の結果を図６ａに示す。いずれの乾燥濾紙血からも事前増幅により増幅産物が得られ、当該増幅産物についてＲＦＬＰ法によりＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の有無が確認できることが分かった。
また、乾燥濾紙血から抽出したＤＮＡ（ＤＢＳ−ＤＮＡ）を用いるのではなく、濾紙上の乾燥血のスポットから、４片の直径３ｍｍのサークル（円）をパンチで打ち抜いて得た打ち抜き片を、そのままＰＣＲミックスに加えてＰＣＲを行った以外は、上記と同様にして、増幅産物を得られるか、及び、得られた増幅産物をＤｒａＩにより処理してＲＦＬＰ法によりＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の有無が確認できるか、を検討した。なお、当該検討に用いた前記打ち抜き片は健常人由来乾燥濾紙血から調製したものであり、また当該検討に用いたＰＣＲミックスの組成は次の通りである。２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ ２５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ １０μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ１１１） １．５μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（Ｘ７−Ｄｒａ） １．５μＬ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ １μＬ、前記打ち抜き片１個、ｄＨ２Ｏ ９μＬ。また、ＰＣＲサイクルは、３０、３５、又は４０サイクルとして検討した。
結果を図６ｂに示す。図６ｂにおいて、（１）及び（２）はそれぞれ図６ａの（Ａ）及び（Ｂ）に相当しており、すなわち（１）はpre-amplified productsのアガロース電気泳動結果を、（２）はDraI-digested productsのアガロース電気泳動結果を、それぞれ示す。
図６ｂから分かるように、核酸抽出操作を行わずとも、血を染みこませ乾燥させた乾燥濾紙の血存在部分の打ち抜き片を直接ＰＣＲミックスに加えてＰＣＲを行うことにより、増幅断片得ることができ、且つ当該増幅断片についてＲＦＬＰ法によりＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の有無が確認できた。
ＳＮＰ識別プライマー及びＲＦＬＰ法による、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰの検出
健常人１（ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を有する）、健常人２（ＳＭＮ１遺伝子を有するがＳＭＮ２遺伝子が欠損）、及びＳＭＮ患者３（ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子が欠損）、の３人から採取した血液を乾燥濾紙にスポットし乾燥濾紙血とした。
健常人１（ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を有する）、健常人２（ＳＭＮ１遺伝子を有するがＳＭＮ２遺伝子が欠損）、及びＳＭＮ患者３（ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子が欠損）、の３人から採取した血液を乾燥濾紙にスポットし乾燥濾紙血とした。
上記に記載の方法と同様にして、当該乾燥濾紙血からＤＢＳ−ＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとして、プライマーＲ１１１及びプライマーＸ７−Ｄｒａを用いてＰＣＲ行い増幅産物（１８９ｂｐ）を得た。
当該増幅産物（１８９ｂｐ）をテンプレートとして、２種類のプライマーセット（「プライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ」及び「プライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ」）によるＰＣＲを、別反応系（別チューブ）で行った（別反応系で行わない場合、目的外の増幅が増加し、ＳＮＰが検出できない）。なお、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子含有領域の増幅を行わず、ＤＢＳ−ＤＮＡをそのままテンプレートとして、当該２種類のプライマーセットによるＰＣＲについても、別反応系（別チューブ）で行った。
さらに、採取した血液から直接抽出したゲノムＤＮＡ（抽出にはセパジーンキット（エーディア株式会社）を使用）をテンプレートとして、当該２種類のプライマーセットによるＰＣＲについても、別反応系（別チューブ）で行った。
これらのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動した。結果を図７に示す。乾燥濾紙血から抽出したＤＢＳ−ＤＮＡをＰＣＲのテンプレートに用いた場合には非特異的増幅が生じてしまう一方、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子含有領域を先に増幅させ、当該増幅産物をＰＣＲの概要のテンプレートに用いることで、特異的な増幅のみが得られ、ＳＭＮの正確な診断が可能となることが分かった。
ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子含有領域の事前増幅産物をテンプレートとしたリアルタイムＰＣＲ
上記の通り、当該乾燥濾紙血から抽出したＤＢＳ−ＤＮＡにおいて特定領域（上記検討においては、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子含有領域）をＰＣＲで増幅し、当該増幅産物をテンプレートとしてＳＮＰ識別プライマー（上記検討においては、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ）を用いて別反応系でＰＣＲを行うことで、非特異的増幅が抑制され正確なＳＮＰ検出が可能となることが分かったため、当該事前増幅産物をテンプレートとしＳＮＰ識別プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで、さらに検出速度を高めることを検討した。
上記の通り、当該乾燥濾紙血から抽出したＤＢＳ−ＤＮＡにおいて特定領域（上記検討においては、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子含有領域）をＰＣＲで増幅し、当該増幅産物をテンプレートとしてＳＮＰ識別プライマー（上記検討においては、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ）を用いて別反応系でＰＣＲを行うことで、非特異的増幅が抑制され正確なＳＮＰ検出が可能となることが分かったため、当該事前増幅産物をテンプレートとしＳＮＰ識別プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで、さらに検出速度を高めることを検討した。
リアルタイムＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ）を用いて行った。より詳細には、１．５μｌの２０×ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ， Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）をＰＣＲミックスに追加（その分、水を減少）して、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
なお、上述した４種類の乾燥濾紙血（グループＡ〜Ｄ；保存期間１年又は５年）から得たＤＢＳ−ＤＮＡを、プライマーＲ１１１及びプライマー５４１Ｃ７７０を用いたＰＣＲにより事前増幅した増幅産物をテンプレートして用いた。リアルタイムＰＣＲはプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ、あるいは、プライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰを用いて、別反応系（別チューブ）で行った。結果を図８に示す。図８のサンプル番号は図６ａのサンプル番号と同じである。当該結果から、リアルタイムＰＣＲによっても、乾燥濾紙血を用いて、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰを検出できること、ひいてはＳＭＮ患者を識別できること、がわかった。
また、プライマーＲ１１１及びプライマーＸ７−Ｄｒａを用いたＰＣＲにより事前増幅した増幅産物をテンプレートして用いた以外は、上記と同様にして、リアルタイムＰＣＲを行った。この場合にも、図８の結果と同様、ＳＭＮ１遺伝子については、グループＡ、Ｂ、及びＣにおいて増幅が見られ、またＳＭＮ２遺伝子については、グループＡ、Ｂ、及びＤで増幅が見られた。
ただし、その増幅カーブの立ち上がりが図８よりは遅れていた。より詳細には、図８の結果ではカーブの立ち上がりは約１０〜１５サイクルあたりに存在するのに対し、当該検討ではカーブの立ち上がりは約３０サイクルあたりに存在した。これは、プライマーＲ１１１及びプライマーＸ７−Ｄｒａを用いて得た事前増幅産物のプライマーＸ７−Ｄｒａ端側の塩基配列が、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の塩基配列ではなく、プライマーＸ７−Ｄｒａの塩基配列になっているために、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰと増幅産物とのアニーリングにおける塩基ミスマッチが１塩基増えてしまった（図９参照）ために、リアルタイムＰＣＲにおける増幅のために多くのサイクル数が必要になったことが原因であると考えられた。
そこで、プライマーＸ７−Ｄｒａを用いて得た事前増幅産物のプライマーＸ７−Ｄｒａ端側に塩基ミスマッチが無いプライマーを設計し、これをＳＮＰ識別プライマーとして用いて、再度リアルタイムＰＣＲを行った。
詳細には、図１０に示すように、新たにプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ−Ｄｒａ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ−Ｄｒａを作成し、プライマーＸ７−Ｄｒａを用いて得た事前増幅産物をテンプレートとしてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、図１０には、参考のため、プライマーＲ１１１、プライマーＸ７−Ｄｒａ、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰの塩基配列も併せて示す。当該リアルタイムＰＣＲの結果を、図１１及び図１２に示す。
図１１に示されるように、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の両方を有する健常人の乾燥濾紙血を用いた場合にはいずれの遺伝子も増幅され、ＳＭＮ１遺伝子を有するがＳＭＮ２遺伝子を欠損した健常人の乾燥濾紙血を用いた場合はＳＭＮ１遺伝子のみが増幅され、ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子を欠損したＳＭＮ患者の乾燥濾紙血を用いた場合には、ＳＭＮ２遺伝子のみが増幅され、しかも増幅が見られた場合にはいずれも１０〜１５サイクル程度で増幅カーブの立ち上がりが見られた。
図１２には、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰを用いて、プライマーＸ７−Ｄｒａを用いて得た事前増幅産物をテンプレートとしてリアルタイムＰＣＲを行った結果も併せて示す。リバースプライマーとして、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ−Ｄｒａ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ−Ｄｒａを用いた場合には、増幅カーブの立ち上がりが比較的早い（１０〜１５サイクル）ことが分かった。なお、図１２の結果は、いずれも、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の両方を有する健常人の乾燥濾紙血を用いた検討の結果である。
また、ＳＭＮ２遺伝子を有するがＳＭＮ１遺伝子が欠損した患者３名と、健常者（ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を有する）３名との、合計６名由来乾燥濾紙血から抽出した各ＤＢＳ−ＤＮＡ（サンプル１〜６）をテンプレートとして、プライマーＲ１１１及びプライマー５４１Ｃ７７０を用いてＰＣＲを行ったところ、得られた増幅産物量が少ない場合があった（図１４ａ左側［シングルＰＣＲ］）。そこで、当該増幅産物をテンプレートとして、プライマーＲ１１１及びプライマーＸ７Ｄｒａを用いてＰＣＲ（ネストＰＣＲ）を行い、増幅産物を更に増やした（図１４ａ右側）。
シングルＰＣＲでの増幅産物、及びネストＰＣＲの増幅産物をテンプレートとして、プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ−Ｄｒａ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ−Ｄｒａを用い、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲはプライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ−Ｄｒａ、あるいは、プライマーＲ１１１及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ−Ｄｒａを用いて、別反応系（別チューブ）で行った。結果を図１４ｂに示す。シングルＰＣＲで得られた少量の増幅産物をテンプレートとして用いた場合には、リアルタイムＰＣＲでの増幅カーブの立ち上がりによりＳＮＰ識別が難しかったが（図１４ｂ左側）、ネストＰＣＲで得られた更に増量された増幅産物をテンプレートとして用いた場合には、リアルタイムＰＣＲでの増幅カーブの立ち上がりによりＳＮＰ識別が可能であった（図１４ｂ右側：サンプル１、４、５はＳＭＮ１ポジティブでサンプル２、３、６はＳＭＮ１ネガティブである一方、全てのサンプルがＳＭＮ２ポジティブであった。）。このことから、ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片が、一度の増幅反応では少量しか得られない場合には、その増幅産物をテンプレートして再度増幅反応を行い、ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を更に増やすことで、ＳＮＰ識別の精度を上げられることが分かった。
以上のことから、プライマーＸ７−Ｄｒａを用いて得た事前増幅産物をテンプレートとし、ＳＮＰ識別プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことでＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰを検出できること、また、ＳＮＰ識別プライマーとして、ＳＮＰ塩基以外は事前増幅産物と塩基ミスマッチの無いプライマー（プライマーＳＭＮ１−ＣＯＰ−Ｄｒａ及びプライマーＳＭＮ２−ＣＯＰ−Ｄｒａ）を用いることで、リアルタイムＰＣＲの増幅立ち上がりをより早くできること、がわかった。さらには、当該事前増幅産物をＤｒａＩで処理することにより、ＲＦＬＰ法によってもＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰを検出できることもわかった。このため、大規模なリアルタイムＰＣＲによる一次スクリーニング（全出生児の乾燥濾紙血を用いた事前増幅及びリアルタイムＰＣＲ）において、リアルタイムＰＣＲの増幅の有無及び／又は型が判断できないような場合（例えば、増幅立ち上がりが少しだけ観察されるような場合）に、事前増幅産物をＤｒａＩで処理してＲＦＬＰ法により、迅速かつ確実にＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子の有無及び／型を検出することができる。
Claims (13)
- 乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰ（一塩基多型）を検出する方法であって、
（Ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、方法。 - ＳＮＰを含む領域の増幅核酸断片が、当該ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法で識別できる核酸断片である、請求項１に記載の方法。
- 乾燥濾紙血中の核酸からＳＮＰを検出する方法であって、
（Ａ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅する工程、及び
（Ｂ）当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＮＰ識別プライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、請求項１又は２に記載の方法。 - 工程（Ａ）におけるＰＣＲに用いるプライマーが、検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーである、請求項３に記載の方法。
- 乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法であって、
（ｂ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を含む領域の増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、方法。 - 前記増幅核酸断片が、前記ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片である、請求項５に記載の方法。
- 乾燥濾紙血からＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を検出する方法であって、
（ａ）乾燥濾紙血中の核酸のＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子を含む領域をＰＣＲにより増幅する工程、及び
（ｂ）当該増幅核酸断片を鋳型とし、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーを用いて、各ＳＮＰ識別プライマー毎にＰＣＲを別反応系で行う工程
を含む、請求項５又は６に記載の方法。 - 工程（ａ）におけるＰＣＲに用いるプライマーが、前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーである、請求項７に記載の方法。
- 前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーが、以下の条件（ｉ）を満たすプライマーである、請求項８に記載の方法。
（ｉ）：プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物において、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）が、少なくとも１種の制限酵素の認識配列に含まれており、当該制限酵素によって一方の遺伝子は切断されるがもう一方の遺伝子は切断されない。 - 前記検出対象ＳＮＰの有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマーが、３’末端から３塩基はすべてＴであり、４塩基目以降の塩基配列が、ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子ｃＤＮＡ配列の８４４塩基目以降の塩基配列とアニーリング時ミスマッチ１０％以下である、全長１５〜５０塩基長の核酸である、
請求項８又は９に記載の方法。 - ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）を識別するプライマーが、ｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅しないプライマー、及び、ｃ．８４０Ｔを含む領域は増幅するがｃ．８４０Ｃを含む領域は増幅しないプライマー、である、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
- ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマーが、
ＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣ、又はＴＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなる核酸であり、
ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマーが、
ＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣ、又はＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＣＣで示される塩基配列からなる核酸である、
請求項１１に記載の方法。 - 以下の（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のプライマーのうち、
少なくとも１つのプライマーを備えるか、
少なくとも２つのプライマーを備えるか、あるいは
全てのプライマーを備える、
乾燥濾紙血からＳＭＮ診断を行うためのキット。
（Ｉ）：ＳＭＮ１遺伝子は増幅するがＳＭＮ２遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩ）：ＳＭＮ２遺伝子は増幅するがＳＭＮ１遺伝子は増幅しないプライマー
（ＩＩＩ）：ＳＭＮ１遺伝子及びＳＭＮ２遺伝子間のＳＮＰ（ＳＭＮ１：ｃ．８４０Ｃ， ＳＭＮ２：ｃ．８４０Ｔ）の有無をＲＦＬＰ法で識別できる核酸断片を増幅するプライマー
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