JP4601830B2 - カップル性ポリメラーゼ連鎖反応−制限エンドヌクレアーゼ消化−リガーゼ検出反応法 - Google Patents

カップル性ポリメラーゼ連鎖反応−制限エンドヌクレアーゼ消化−リガーゼ検出反応法 Download PDF

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Description

【０００１】
本願は、1999年3月19日に出願された米国仮特許出願第60/125,251号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本発明は、国立保健研究所、助成金第GM-41337-06号、同第GM-43552-05号、同第GM-42722-07号および同第GM-51628-02号に準拠した政府基金を用いて開発された。米国政府は一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、カップル型ポリメラーゼ連鎖反応（coupled polymerase chain reaction）（「PCR」）、制限エンドヌクレアーゼ消化（「RE」）およびリガーゼ検出反応（「LDR」）に関係する方法に関する。
【０００４】
発明の背景
癌の検出
本国の第二の死因として、ほぼ600,000人が年間癌で死亡しており、癌を全ての医学的診断の最も憂慮すべきものの1つにしている。男性および女性に浸潤癌を発生する生涯リスクはそれぞれ50パーセントおよび33パーセントである。1995年には120万例以上の新たな癌の症例が米国において診断されると予測される。1994年の癌の医療費支出は約1040億ドルであった。しかし、癌が家族や社会に与える影響の全ては、診断および治療に支払われた金額によってだけでははかれない。かなりの数の人々が生産年齢に癌に襲われる。癌は1985年には早死にの18パーセントを占め、1991年では米国の9,200人以上の女性が55歳前に乳癌で死亡した。
【０００５】
現在、癌の診断は、病理学者による腫瘍組織の組織学的評価に基づいている。癌が診断されると、主に腫瘍の程度または病期によって治療が決定される。腫瘍の病期は臨床的、放射線的および臨床試験的方法によって規定される。腫瘍を病期段階わけする標準的な分類システムは、癌患者の臨床情報を明確に伝えるように開発されている。病期段階わけは重要な予知情報を提供し、新たな治療方法の試験を可能にする臨床検討の基礎となる。原発腫瘍のサイズ、癌が見つかる所属リンパ節および他の身体部位への転移の有無により腫瘍を分類する病期段階わけシステムが開発された（TNM病期段階わけシステム）。リンパ節への影響がなく、遠隔転移のない小さい癌は早期癌と考えられ、外科的切除によって治癒可能であることが多い。予後の一般的な判定は5-年生存率、すなわち所定の病期の癌の診断後5年生存する患者の割合である。多くの癌の5-年生存率はこの数十年で改善されたが、いくつかの早期病期の癌が5年以内またはそれ以降に再発するという事実により、研究者は、組織学的段階分け、血球計算結果、ホルモン受容体の状態および多数の他の腫瘍マーカーを含む他の別の予後マーカーを調査している。さらに最近では、研究者は、予後指標として癌の分子的変更の使用を調査している。
【０００６】
点変異およびわずかな欠失などの癌において見いだされる遺伝的変更は悪性腫瘍細胞のマーカーとして作用することができる。
【０００７】
少数核酸配列の検出
PCRを使用して癌を検出するために数多くの手法が開示されている。シドランスキー(Sidransky)ら、「検出可能な結腸直腸腫瘍患者の糞便におけるras癌遺伝子変異の同定（Identification of ras Oncogene Mutaions in the Stool of Patients with Curable Colorectal Tumors）」,Science 256: 102-05(1992)は、K-ras変異を同定することによって、結腸癌を検出している。これは、全DNAのPCR増幅、ファージベクターへのクローニング、ファージの培養、いくつかの異なるK-ras変異に特異的な個々のオリゴヌクレオチドによる反復プロービングおよび所定の培養皿上の陽性プラーク割合の計算を含む。これは、完了するのに3日かかり、それによって糞便試料中の野生型DNAに対する変異体の比を測定する技術的に困難な手法である。ブレナン（Brennan）ら、「頭部と頸部の扁平上皮細胞癌腫における組織病理学段階わけの分子レベルでの評価（Molecular Assesment of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck）」, N. Eng. J. Med. 332(7):429-35(1995)は、配列決定によってp53突然変異を見いだしている。次いで、この特定の突然変異を全DNAのPCR増幅を使用して辺縁組織においてプロービングし、ファージベクターにクローニングし、ファージを播き、配列決定によって見いだされる変異に特異的である個別のオリゴヌクレオチドでプロービングし、所定の培養皿の陽性プラークの割合を計数する。ベルセレミー（Berthelemy）ら、「膵臓癌の早期診断における膵液中のK-ras変異同定（Brief Communications--Identification of K-ras Mutations in Pancreatic Juice in the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer）」, Ann. Int. Med. 123(3): 188-91(1995)は、膵臓分泌物中にK-ras突然変異を検出するためにPCR/制限酵素方法を使用している。しかし、この技法は、突然変異が定量されないという点において不十分である。同様に、タダ（Tada）ら、「膵臓腺癌患者の膵液および末梢血中のras遺伝子変異の検出（Detection of as Gene Mutations in Pancreatic Juice and Peripheral Blood of Patients with Pancreatic Adenocarcinoma）」, Cancer Res. 53: 2472-74(1993)およびタダ（Tada）ら、「膵臓腺癌の診断のためのras遺伝子変異の臨床的適用（Clinical Application of ras Gene Mutation for Diagnosis of Pancreatic Adenocarinoma）」, Gastroent. 100: 233-38(1991)は、膵臓癌を検出するためにこのような試料に対立遺伝子-特異的PCRを実施している。これは、ポリメラーゼ伸長のない正常な鋳型による偽陽性を提供する、プライマーダイマーから識別するために産物の電気泳動による分離を必要とする、重複プライマーの妨害により密接に密集する部位を多重化することができない、小さい反復配列中の1塩基または小さい挿入および欠失を検出することができない、および正常なDNAの高いバックグラウンド中で突然変異DNAを定量するのに実際に好適でないという欠点を有する。ハヤシ（Hayashi）ら、「遺伝的検出は組織病理学法では検出不可能な潜伏リンパ節転移を同定する（Genetic Detection Identifies Occult Lymph Node Metastases Undetectable by the Histopathological Method）」, Cancer Res. 54: 3853-56(1994)は、K-rasまたはp53突然変異を見つけて結腸癌の潜伏リンパ節転移を同定するために対立遺伝子-特異的PCR技法を使用している。1000個の正常細胞中の1つの腫瘍細胞の感度が主張されているが、定量的な値を得るには、骨の折れるクローニング法、プレーティング法、およびプロービング法が必要である。ミツドミ（Mitsudomi）ら、「ras遺伝子変異は小細胞性肺癌細胞系統由来の非細胞性肺癌細胞系統の部分集合を認識する（Mutations of ras Genes Distinguish a Subset of Non-small-cell Lung Cancer Cell Lines from Small-cell Lung Cancer Lines）」, Oncogene 6: 1353-62(1991)では、ゲノムDNAのPCR増幅中にミスマッチプライマーによって作製された制限断片長多型を使用して、K-ras、H-ras、およびN-ras遺伝子の点変異についてヒト肺癌細胞系統をスクリーニングしている。このようなプライマー媒介性RFLPの欠点には、正常DNAから突然変異体を識別するための電気泳動による分離の必要性、制限酵素切断部位に変換されている可能性がある部位への限定的適用性、突然変異の性質を判定するための追加の分析の必要性、および正常なDNAの高いバックグラウンドにおいて突然変異DNAを定量する際の困難さが含まれる。さらに、これらの手法は面倒で、不正確である傾向がある。
【０００８】
カップル型PCR/ライゲーション方法は、大多数のヌクレオチド配列の存在下において少数のヌクレオチド配列を検出するために使用されている。PCR/LDR方法は、HIV突然変異体を検出するために、フレンケル（Frenkel）,「ジドブジンおよびジダノシン抵抗性に関連するヒト免疫不全症ウイルス1型pol変異についての特異的高感度迅速アッセイ法（Specific, Sensitive, and Rapid Assay for Human Immunodeficiency Virus Type 1 pol Mutations Associated with Resistance to Zidovudine and Didanosine）」, J. Clin. Microbiol. 33(2): 342-47(1995)において使用されている。しかし、このアッセイ法は多重検出に使用することができない。アブラバヤ（Abravaya）ら、「改変型リガーゼ鎖を用いた点変異の検出（Detection of Point Mutaions With a Modified Ligase Chain ）(Gap-LCR)」,Nucl. Acids Res. 23(4)675-82(1995)およびバレス（Balles）ら、「リガーゼ鎖反応によるまれば組換え体の容易な単離：ドロソフィラ・オプトモアblind遺伝子における遺伝子内交差の選抜（Facilitated Isolation of Rare Recombinants by Ligase Chain Reaction: Selection for Intragenic Crossover Events in the Drosophila optomotor-blind Gene）」, Molec. Gen. Genet. 245: 734-40(1994)も参照。
【０００９】
結腸直腸病変は、PCR増幅およびその後のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法含む方法によって検出されている。ジェン（Jen）ら、「結腸直腸病変における形成異常の分子的決定（Molecular Determinations of Dysplasia in Colorectal Lesions）」, Cancer Res. 54: 5523-26(1994)およびレッドストン（Redston)ら、「大腸炎関連新生物形成スペクトル中のAPC遺伝子およびK-ras遺伝子変異の共通出現（Common Occurrence of APC and K-ras Gene Mutations in the Spectrum of Colitis-Associated Neoplasias）」, Gastroenter. 108: 382-92(1995)を参照。この方法は、ポウウェル(Powell)ら、「家族性腺腫ポリープ病の分子診断（Molecular Diagnosis of Familial Adenomatous Polyposis）」, N. Eng. J. Med. 329(27): 1982-87(1993)を進歩させたものとして開発された。これらの技法は実施が限定され、困難である傾向がある。
【００１０】
少数のヌクレオチド配列を検出するために他の手法が開発されている。ル（Lu）ら、「PCRと制限酵素切断による変異解析の定量的側面（Quantitative Aspects of the Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage）(MAPREC)」PCR Methods and Appl. 3: 176-80(1993)は、PCRおよび制限酵素切断によりウィルスの復帰突然変異体を検出している。MAPRECの欠点には、正常なDNAから突然変異体を識別するために電気泳動による分離を必要とする、制限酵素切断部位に変換されている可能性がある部位への制限的適用性、突然変異の性質を判定するための追加の分析の必要性、および正常なDNAの高いバックグラウンドにおいて突然変異DNAを定量する際の困難さが含まれる。クプスワミー（Kuppuswamy）ら、「遺伝病検出のための一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長：血友病G（IX因子）嚢胞性線維症遺伝子への実験的適用（Single Nucleotide Primer Extension to Detect Genetic Diseases: Experimental Application to Hemophilia G(Factor IX) and Cystic Fibrosis Genes）」, Prc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-47(1991)において、一方はプライマーと正常なコード配列に対応する標識されたヌクレオチドを含有し、もう一方はプライマーと突然変異配列に対応する標識されたヌクレオチドを含有する混合物を含む、増幅される対象の各々の断片の2つの反応混合物を使用して、PCR反応が実施されている。このようなミニ配列決定（すなわち、SNuPe）の欠点は、突然変異が既知でなければならない、重複プライマーの妨害により密接して密集する部位を多重化することができない、小さい反復配列において1塩基または小さい挿入および欠失を検出することができないおよび4つの分離反応が必要であるということである。変異原性的に分離するPCR方法は、ラスナ（Rust）ら、「変異原性的分離PCR(MS-PCR)：容易な変異検出のための高い特異性の一段階方法（Mutagenically Separated PCR(MS-PCR): a Highly Specific One Step Procedure for easy Mutation Detection）」 Nucl. Acids Res. 21(16): 3623-29(1993)において、異なる鎖長の対立遺伝子-特異的プライマーを使用して、正常対立遺伝子および突然変異対立遺伝子を識別するために開示されている。MS-PCRの欠点には、ポリメラーゼ伸長のない正常な鋳型による偽陽性を与える可能性、プライマーダイマーから識別するための電気泳動による産物の分離の必要性、重複プライマーの妨害による密接に密集した部位を多重化することができない、小さい反復配列において1塩基または小さい挿入および欠失を検出することができないおよび正常なDNAの高いバックグラウンドにおいて突然変異DNAを定量するのに理想的には好適でないことが含まれる。スズキ（Suzuki）ら、「ポリメラーゼ連鎖反応産物の一本鎖高次構造によるヒト肺癌におけるras遺伝子変異の検出（Detection of ras Gene Mutations in Human Lung Cancers by Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products）」, Oncogene 5: 1037-43(1990)では、PCR段階、およびその次の増幅されたDNA断片の一本鎖高次構造多型(single strand conformation polymorphism)、SSCPを含む段階を有する方法において突然変異が検出されている。SSCPの欠点には、正常な配座異性体から突然変異配座異性体を識別するために電気泳動による分離を必要とする、生じうる突然変異の30%を検出することができない、突然変異の性質を判定するために追加の分析が必要である、および沈黙多型から突然変異体を識別することができないことが含まれる。
【００１１】
ヌクレオチド変換の忠実度
ポリヌクレオチド試料中の所定の一つもしくは複数の配列の存在を検出する方法の多数は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による少数配列の増幅に関係している。ムリス(Mullis)らに付与された米国特許第4,683,202号およびサイキ（R. K. Saiki）ら、Science 230: 1350(1985)。この方法では、選択された配列の反対の末端部に相補的なプライマーが、加熱サイクルと併用して、プライマー開始型複製の連続的なラウンドを促進するために使用される。増幅された配列は種々の技法によって容易に同定することができる。この方法は、ポリヌクレオチドを含有する試料中の低コピー数配列の存在を検出するのに、例えば、生液試料中の病原体配列を検出するのに特に有用である。しかし、非選択的なPCR方法は、ほぼ等しい効率で突然変異対立遺伝子および野生型対立遺伝子を増幅し、最終産物を少量しか含まない少量存在突然変異対立遺伝子が生ずる。突然変異配列が25%未満の増幅産物を含む場合には、DNA配列決定がこのような対立遺伝子の存在を検出できる可能性は低い。クローニングし、その後対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ASOs）でクローンをプロービングすることによりPCR産物を最初に分離することによって少量存在突然変異体を正確に定量することができるが（サイキ（Saiki）ら、「Analysis of Enzymatically Amplified Beta-Globin and HLA-DQ Alpha DNA with Allele-Specific Oligonucleotide Probes」, Nature, 324(6093): 163-6(1986); シドランスキー（Sidransky）ら、「Identification of Ras Oncogene Mutations in the Stool of Patients with Curable Colorectal Tumors」, Science, 256:102-5(1992);およびブレナン（Brennan)ら、「Molecular Assessment of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of the Head And Neck」, N. Engl. J. Med., 332(7): 429-35(1995))、この方法は時間がかかる。一方、対立遺伝子特異的PCR方法は突然変異対立遺伝子を迅速に且つ主に増幅することができる。例えば、105野生型対立遺伝子における1つの突然変異体の感度でH-ras突然変異を検出するために多重ミスマッチプライマーが使用されており（チャ（Cha）ら、「Mismatch Amplification Mutation Assay(MAMA): Application to the C-H-Ras Gene」, PCR Methods Appl., 2(1): 14-20(1992))、106野生型対立遺伝子における1つの突然変異体と同等の高感度の主張が報告されている（ハリアソス（Haliassos）ら、「Detection of Minority Point Mutations by Modified PCR Technique: A New Approach for a Sensitive Diagnosis of Tumor-Progression Markers」, Nucleic Acid Res., 17:8093-9(1989)およびチェン（Chen)ら、「A Nonradioactive, Allele-Specific Polymerase Chain Reaction for Reproducible Detection of Rare Mutations in Large Amounts of Genomic DNA: Application to Human K-ras」, Anal. Biochem., 244: 191-4(1997))。しかし、注意深い評価は、これらの成功は、3'側プリン-プリンミスマッチによって識別する対立遺伝子特異的プライマーに限定されることを示唆している。より一般的な転位突然変異では、3'側プライマー末端の識別用ミスマッチ（すなわち、G:TまたはC:Aミスマッチ）が、野生型DNAの対向プライマーからの伸長過程中のポリメラーゼエラーにより少量の産物中では除去される。その後、これらのエラー産物が効率的に増幅され、偽陽性シグナルを生じる。このポリメラーゼエラー問題を排除するための方法はPCRの早期に野生型DNAを除去することである。
【００１２】
数人の研究者は、少量存在突然変異配列を濃縮するために、制限エンドヌクレアーゼ(RE)消化によって野生型DNAの選択的な除去を調査している。これらのRELP方法は、ポリメラーゼの感度と制限エンドヌクレアーゼの特異性を組み合わせることによって、106以上の野生型において約1つの突然変異体を検出またはより効果的に検出する。1つの方法は、H-ras遺伝子およびp53遺伝子の制限酵素切断部位内の非常に低いレベルの突然変異を検出するために、ゲノムDNAの消化、およびその後の未切断の断片のPCR増幅（RFLP-PCR）を使用している（サンディ（Sandy)ら、「Genotypic Analysis of Mutations in Taq I Restriction Recognition Sites by Restriction Fragment Length Polymorphism/Polymerase Chain Reaction」, Proc. Natl. Acad. USA, 89: 890-4(1992)およびプアザンド(Pourzand)ら、「Genotypic Mutation Analysis by RFLP/PCR」, Mutat. Res., 88(1): 113-21(1993)）。同様の結果は、消化とその後の突然変異対立遺伝子が濃縮された未切断のDNAのPCRと次の増幅（PCR-RFLP）により得られている(クマー（Kumar)ら、「Oncogene Detection at the Single Cell Level」, Oncogene, 3(6)647-51(1988); クマー（Kumar)ら、「Designed Diagnostic Restriction Fragment Length Polymorphisms for The Detection of Point Mutations in Ras Oncogens」, Oncogene Res., 4(3): 235-41(1989)およびヤコブソン（Jacobson)ら、「A Highly Sensitive Assay for Mutant Ras Genes and its Application to the Study of Presentation and Relapse Genotypes in Acute Leukemia」, Oncogene, 9(2): 553-63(1994))。RFLP検出方法は感度が高く、迅速であるが、突然変異の位置が制限エンドヌクレアーゼ認識配列に一致しなければならないという必要条件によって限定されている。この限定を克服するために、新たな制限酵素切断部位を導入するプライマーが「プライマー媒介型（primer-mediated」RFLPにおいて使用されている（ヤコブソン（Jacobson)ら、「Rapid, Nonradioactives creening for Activating Ras Oncogene Mutations Using PCR-Primer Intoroduced Restriction Analysis(PCR-PIRA)」, PCR Methods Appl.,1(4):299(1992);チェン（Chen）ら、「A Method to Detect Ras Point Mutations in Small Subpopulations of Cells」, Anal. Biochem., 195(1):51-6(1991);ジ ギセッペ（Di Giuseppe)ら、「Detection of K-Ras Mutations in Mucinous Pancreatic Duct Hyperplasia from a Patient with a Family History of Pancreatic Carcinoma」, Am. J. Pathol., 144(5):889-95(1994);カーン（Kahn)ら、「Rapid and Sensitive Nonradioactive Detection of Mutant K-ras Genes Via 'Enriched' PCR Amplification」, Oncogene, 6: 1079-83(1991);レビ（Levi)ら、「Multiple K-Ras Codon 12 Mutations in Cholangiocarcinomas Demonstrated with a Sensitive Polymerase Chain Reaction Technique」, Cancer Research, 51(7月）: 3497-502(1991);およびミツドミ（Mitsudomi)ら、「Mutations of Ras Genes Distinguish a Subset of Non-Small-Cell Lung Cancer Cell Lines from Small-Cell Lung Cancer Cell Lines」, Oncogene, 6(8): 1353-62）。しかし、その後の研究者は、3'側天然塩基ミスマッチを有するプライマーからのポリメラーゼ伸長によってエラーはすぐ隣の塩基で生じることを実証している（ハットリ（Hattori)ら、「Mismatch PCR RFLP Detection of DRD2 Ser311 Cys Polymorphism and Schizophrenia」, Biochem. Biophys. Res. Commun., 202(2)757-63(1994); オデル（O'Dell)ら、「PCR Induction of a TaqI Restriction Site at Any CpG Dinucleotide Using Two Mismatched Primers（CpG-PCR)」, Genome Res., 6(6): 558-68(1996)およびホダノバ（Hodanoba)ら、「Incorrect Assignment of N370S Mutation Status by Mismatched PCR/RFLP Method in Two Grauchher Patients」,J. Inherit. Metab. Dis.,20(4): 611-2(1997)）。このような鋳型は制限消化中に切断せず、突然変異鋳型から伸長される真の陽性の産物と識別できない偽陽性として増幅される。
【００１３】
ヌクレオチド類似物を使用することにより、ポリメラーゼ伸長によって生じるエラーを低下し、塩基変換忠実度を改善することができる。4種の天然塩基の1つ以上と塩基対形成するように設計されているヌクレオチド類似物は「コンバータイド（convertides)」と呼ばれる。異なるコンバータイドに対する塩基導入が試験されている（フープス(Hoops)ら、「Template Directed Incorporation of Nucleotide Mixtures Using Azole-Nucleobase Analogs」, Nucleic Acids Res., 25(24): 4866-71(1997)）。各類似物について、Taqポリメラーゼおよび内部ヌクレオチド類似物を含有するプライマーを使用してPCR産物が作製された。作製された産物は、類似物に対して導入される4種の塩基の特徴的な分布を示した。重要なことに、これらの産物は、全ての天然の塩基位置に元の配列を維持した。コンバータイドは、互変異性変化（ブラウン（Brown)ら、「Synthesis and Duplex Stability of Oligonucleotides Containing Adenine-Guanine Analogues」, Carbohydrate Research, 216: 129-39(1991)）、結合回転（バーグストローム(Bergstrom)ら、Nucleosides and Nucleotides, 15(1-3): 59-68(1996))または塩基スタッキング（バーグストローム(Bergstrom)ら、Journal of the American Chemical Society, 117: 1201-9(1995)およびツアング（Zhang)ら、「Exploratory Studies on Azole Carboxamides as Nucleobase Analogs: Thermal Denaturation Studies on Oligodexyribonucleotide Duplexes Containg Pyrrole-3-Carboxamide」, Nucleic Acids Res., 26: 2208-15(1998))による異なる水素結合パターンを取る能力によって縮重増幅産物を容易に作製する。従って、コンバータイドを含有するPCRプライマーは塩基変換を促進するために使用することができる。原則として、プライマーの3'側末端においてC-様およびT-様の両互変異性型を示すことが知られている、6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン類似物Q6を使用して（ブラウン(Brown)ら、「Synthesis and Duplex Stability of Oligonucleotides Containing Adenine-Guanine Analogues」, Cabohydrate Research, 216: 129-39(1991)）、C-G塩基対をT-A塩基対に変換することができる（図1）。よりよい幾何学のために、DNAポリメラーゼは、T-Gミスマッチではなく、Q6-G対からよりよく「読み取り（read)」または伸長することができる（ゆらぎ塩基対）。同様に、DNAポリメラーゼはQ6に対してG塩基およびA塩基を「書き込み(write)」または導入することができる（ヒル（Hill)ら、「Polymerase Recognition of Synthetic Oligodeoxyribonucleotides Incorporating Degenerate Pyrimidine and Purine Bases」, Pro. Natl. Acad. Sci.,USA,95(8）:4258-63(1998))が、A塩基は常にT塩基に対して挿入される。従って、Q6類似物プライマーは中間体として作用し、縮重プールから望ましい産物を選択的に増幅するために天然の塩基プライマーが添加される前に、「前変換段階（preconversion step)」を提供する。ヌクレオチド類似物は大きな可能性を有するが、それらは高感度アッセイ法において試験されていない。PCR方法において類似物の変換の忠実度を最適化する方法の必要性がある。
【００１４】
PCR/RE/LDRの最適化
上記に考察するように、高忠実度変換方法を用いたPCRは、突然変異遺伝子配列を増幅するための有用な方法を提供すると思われる。1つ以上のミスマッチを有するプライマーを設計することによって、突然変異DNA鋳型を効率的に伸長することができるが、野生型DNA鋳型の伸長は悪い。しかし、これらのプライマーがミスマッチの有無にかかわらず伸長すると、産物はその後のPCRサイクルのプライマーも完全なマッチとなる。従って、偽陽性シグナルがその後のサイクルで増幅される。さらに、PCRエラーは、プライマーに完全にマッチする鋳型の塩基変化を作製することがある。AS-PCRは105中1の感度でピリミジン←→プリン塩基変換を検出することができる（ニュートン（Newton)ら、「Analysis of Any Point Mutation in DNA. The Amplification Refracttory Mutation System(ARMS)」, Nucleic Acids Res., 17(7）:2503-16(1989）およびタダ（Tada)ら、「Detection of Ras Gene Mutations in Pancreatic Juice and Peripheral Blood of Patients with Pancreatic Adenocarcinoma」, Cancer Res., 53(11):2472-4(1993))。にもかかわらず、癌関連突然変異の大多数はC←→TおよびA←→G転位であり、例えば、p53点変異の80%を上回る（デ フロメンテル（de Fromrntel)ら、Genes Chromosomes Cancer, 4(1):1-15(1992)）。DNA診断方法はこの種の少量存在（low abundance）突然変異を正確に定量するために必要とされる。
【００１５】
PCRと併用したライゲーション検出反応（LDR）は、少量のPCR伸長産物を定量するために使用されている。LDRは、DNA配列の任意の位置に見いだされる可能性のある4種の塩基全てを識別するために、2つの隣接するプライマーと熱安定性リガーゼを使用する（バラニー（Barany, F.）、「Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase」, Pro. Natl. Acad. Sci.,USA, 88: 189-93(1991);バラニー（Barany, F.）、「The Ligase Chain Reaction in a PCR World」,PCR Methods Appl.,1:5-16(1991);デイ（Day）ら、「Detection of Steroid 21-Hydroxylase Alleles Using Gene-Specific PCR and a Multiplexed Ligation Detection Reaction」, Genomics, 29:152-62(1995)およびカーナ（Khanna)ら、Oncogene, 18: 27-38(1999)）。熱安定性リガーゼは、識別用塩基が上流プライマーの3'側末端に配置されると、最も高い忠実度を示す（ルオ（Luo)ら、「Improving the Fidelity of Thermus Thermophilus DNA Ligase」, Nucleic Acids Res., 24(15):3071-8(1996)）。PCR/LDR(ゲノムDNA由来の配列PCRおよびその後のLDR)は、4,000の正常な対立遺伝子中で約1つの突然変異対立遺伝子の感度で突然変異を検出することができる（カーナ(Khanna)ら、Oncogene, 18: 27-38(1999)）。106中約1の感度は、野生型のPCRに制限エンドヌクレアーゼ消化を組み合わせることによって達成された（サンディ（Sandy)ら、Pro. Natl. Acad. Sci.,USA,89:890-4(1992）およびプアザンド(Pourzand)ら、「Genotypic Mutation Analysis by RFLP/PCR」, Mutant. Res., 288(1):113-21(1993))。制限酵素切断部位内に生じる突然変異は突然変異対立遺伝子を切断させないが、規定の制限酵素切断部位配列を保有する野生型対立遺伝子は欠失される。結果として、その後のPCRサイクルは主に突然変異DNAを増幅する。突然変異部位が野生型DNAに存在するエンドヌクレアーゼ認識部位内に存在しない場合には、制限酵素切断部位を導入しなければならない。これは、ミスマッチ塩基を有するプライマーを使用したPCRによって典型的に実施される。突然変異はプライマーが及ぶ制限酵素切断部位のどの部分においても検出できるわけではない。その理由はそれらの塩基はプライマーによって直接導入されるからである。ランダムDNA配列では、塩基の20%以上は既存の4塩基の制限酵素切断部位内に含有され、塩基の60%は、1塩基変更によって制限酵素切断部位内で変換されることがある4塩基部分列内にある。これらの小さい部位では、3'側末端塩基ミスマッチプライマーを使用しなければならないことが多い。概念的にはまっすぐであるが、3'側ミスマッチ伸長は困難であることが証明されている（ニュートン（Newton)ら、「Analysis of Any Point Mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System(ARMS)」, Nucleic Acids Res., 17(7): 2503-16(1989; クウォク（Kwok)ら、「Effects of Primer-Template Mismatches on the Polymerase Chain Reaction: Human Immunodeficiency Virus Type 1 Model Studies」, Nucleic Acids Res.,18(4): 999-1005(1990); オデル（O'Dell)ら、Genome Res., 6(6): 558-68(1996)およびデイ（Day)ら、Nucleic Acids Res.,(1999)）。分断パリンドローム制限酵素切断部位を導入することは、一方の半分の部位から介在塩基を介してもう一方の半分の部位に及ぶ内部ミスマッチプライマーを使用してさらに成功している（クマー（Mumar)ら、「Oncogen Detection at the Single Cell Level」, Oncogene, 3(6)647-51(1988)およびアンダーソン（Anderson)ら、「Prevalence of RAS Oncogene Mutation in Head and Neck Carscinomas」, J. Otolaryngol., 21(5): 321-6(1992)）。いくつかの完全にマッチした塩基はミスマッチプライマーの3'側末端を安定化する。しかし、この方法は、第2の半分の部位が野生型DNAに天然に存在する場合にのみ使用することができる。第2の半分の部位の突然変異は消化されない。認識配列内の塩基に生ずる突然変異だけがRFLP方法によって検出可能である。野生型DNAの既存の制限酵素切断部位以外の塩基に生ずる突然変異は、その塩基を含有する新たな制限酵素切断部位を導入することによって検出することができる。
【００１６】
分断パリンドロームを認識制限エンドヌクレアーゼは近接する4塩基および6塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼより存在度が低い。分断パリンドロームを制限酵素切断部位に導入して任意の塩基の突然変異を同定するためには、多重の塩基変更を必要とすることが多い。
【００１７】
さらに最近では、プローブライゲーション方法によって既知の標的配列を同定する方法が報告されている。ウィテリー（M. N. Whiteley）らに付与された米国特許第4,883,750号、ウ（D. Y. Wu)ら、Genomics 4: 560(1989)、ランデグラン（U. Landegren）ら、Science 241: 1077(1988)およびウィン-ディーン（E. Winn-Deen）ら、Clin. Chem. 37: 1522(1991)。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法（「OLA」）として周知の1つの方法では、対象となる標的領域におよぶ2つのプローブまたはプローブ要素を標的領域にハイブリダイゼーションする。プローブ要素が隣接標的塩基と塩基対形成する場合には、プローブ要素の直面する末端は、例えば、リガーゼで処理することによってライゲーションされることにより結合することができる。次いで、リガンドプローブ要素がアッセイされ、標的配列の存在を示す。
【００１８】
この方法の改良法では、リガンドプローブ要素は、相補的なプローブ要素の塩基対形成のための鋳型としてはたらく。プローブ要素の塩基対の存在下におて変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのサイクルを継続すると、標的配列が鎖状に増幅され、ごく少量の標的配列の検出および/または増幅を可能にする。この方法はリガーゼ検出反応と呼ばれる。プローブ要素の2つの相補的な塩基対を使用する場合には、この方法はリガーゼ連鎖反応と呼ばれ、標的配列を指数的に増幅する。バラニー（F. Barany),「Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase」,Pro. Natl. Acad. S ci.,USA, 88: 189-93(1991）およびバラニー(F. Barany)、「The Ligase Chain Reaction(LCR) in a PCR World」, PCR Methods and Applications, 1: 5-16(1991); バラニー（Barany）、1999年3月19日に提出された米国特許出願第S/N60/125,251号。突然変異濃縮を使用するPCR/LDRなどの技法は、ランダムPCRエラーを最小にするために、反応条件の最適化を必要とする。これらのエラーは、臨床試料に最初に存在する突然変異と識別できないと思われる。エラー-最小化の1つの方法はPCRの緩衝液条件の最適化に見いだすことができる。標準的なPCR緩衝液はトリスを含有するが、トリスのpKaは温度に強く依存する。pH 8.3(23℃において測定)のトリスを含有するPCR反応液は約65℃（伸長温度）において約pH7であり、約95℃（鋳型融解温度）において約pH6に低下する。PCRエラーは鋳型分解およびポリメラーゼ誤導入（misincorporation)によって生じることがある。鋳型の分解は、各PCRサイクルの高温および低pH期間に生じ、「long」PCRではサイズを制限する（バーンズ（Barnes)、「PCR Amplification of up to 35-Kb DNA with High Fidelity and High Yield from Lambda Bacteriophage Tmplates」,Pro. Natl. Acad. Sci.,USA, 91(6): 2216-20(1994);チェン（Cheng)ら、「Effective Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA」,Pro. Natl. Acad. Sci.,USA, 91(12):5695-9(1994)およびサン（Sang)ら、「Generation of Site-Directed Mutagenesis by Extralong, High-Fedelity Polymerase Chain Reaction」,Anal. Biochem., 233(1):142-4(1996)）。ロングPCR（long PCR）の緩衝液（トリス9.1を使用）のpHを上昇させると鋳型切断量を低下し、PCR効率を増加する（バーンズ（Barnes)、「PCR Amplification of up to 35-Kb DNA with High Fidelity and High Yield from Lambda Bacteriophage Templates」,Pro. Natl. Acad. Sci.,USA, 91(6）:2216-20(1994))。ロングPCRの効率はpHが上昇すると増加するが、高pHはTaqおよびPfuポリメラーゼの忠実度を低下するので、これらのPCR産物内の突然変異レベルが増加することがある（エカート（Eckert）ら、「High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquqticus DNA Polymerase」,Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990);エカート（Eckert）ら、「DNA Polymerase Fidelity and the Polymerase Chain Reaction」, PCR Methods Appl., 1(1):17-24(1991)およびクリン（Cline)ら、「PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases」,Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51(1996))。より低い｜ΔpKa｜の別のPCR緩衝液を使用すると、より広い温度範囲にわたってより中性のpHを維持することによって忠実度を改善し、さらに鋳型の損傷を低下することができる（エカート（Eckert)ら、「DNA Polymerase Fidelity and the Polymerase Chain Reaction」, PCR Methods appl., 1(1):17-24(1991)およびブレイル（Brail)ら、「Improved Polymerase Fidelity in PCR-SSCPA」, Mutat. Res., 303(4): 171-5(1993)）。グリセロールまたはホルムアミドを添加すると、PCRサイクル中の鋳型の損傷によって生ずる突然変異を低下することができ、ミス塩基対形成プライマーからのミス伸長を回避する働きをすることができる（ボテマ（Bottema)ら、「PCR Amplification of Specific Alleles: Rapid Detection Of Known Mutaions and Polymorphisms」,Mutat. Res., 288(1):93-102(1993)およびチャ（Cha)ら、「Mismatch Amplification Mutation Assay(MAMA): Application to the C-H-Ras Gene」,PCR Methods Appl.,2(1): 14-20(1992)）。
【００１９】
従って、PCRエラーによって生ずるミスマッチの機会を最小にするために、PCRに現在使用されている緩衝液反応条件を改善する必要がある。類似物の変換忠実度だけでは突然変異DNA検出の方法の改善の必要性を解決しない。また、ランダムPCRエラーを低下させるためにPCR反応条件を最適化する必要性があり、最後にPCR伸長産物を感度の高く検出する方法が必要とされる。
【００２０】
発明の概要
本発明は、複数の標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列から、1つまたは複数の単塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数の少量存在配列を同定するための方法に関する。本発明の方法は、第1のポリメラーゼ連鎖反応段階、第2のポリメラーゼ連鎖反応段階、および制限エンドヌクレアーゼ消化反応段階およびその次の第3のポリメラーゼ連鎖反応段階およびリガーゼ検出反応段階を含む。
【００２１】
本発明の出発試料は、試料に存在する大量存在標的配列との少なくとも1配列の差を各々有する1つ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のある試料である。
【００２２】
第1のポリメラーゼ連鎖反応段階では、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供される。一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、標的特異的部分を含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分を含有する第2のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする対応する大量存在および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖のハイブリダイゼーションに好適である。しかし、プライマーは各々、試料に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションされる場合には、このようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を分断するミスマッチを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマー、試料およびポリメラーゼを混和して、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。
【００２３】
一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1サイクル以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する。変性処理はハイブリダイゼーションされる核酸配列を分離する。ハイブリダイゼーション処理は、一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分を標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせる。伸長処理は、ハイブリダイゼーションした一次オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする標的ヌクレオチド配列に相補的な一次伸長産物を形成させる。
【００２４】
次に、第2のポリメラーゼ連鎖反応段階が継続する。この段階は、標的特異的部分と5'側上流二次プライマー特異的部分を有する第1のヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分と5'側上流二次プライマー特異的部分を有する第2のヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。特定のセットの二次オリゴヌクレオチドプライマーは、大量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有または作製し、1つ以上の少量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有または作製しない二次ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする一次伸長産物の相補鎖のハイブリダイゼーションに好適である。一次伸長産物、二次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。
【００２５】
二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1サイクル以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する。変性処理はハイブリダイゼーションされる核酸配列を分離する。ハイブリダイゼーション処理では、二次オリゴヌクレオチドプライマーを一次伸長産物にハイブリダイゼーションする。伸長処理により、ハイブリダイゼーションした一次伸長産物は、ハイブリダイゼーションした一次伸長産物に相補的な二次伸長産物を作製する。大量存在二次伸長産物は制限酵素切断部位を含有するが、少量存在二次伸長産物は制限酵素切断部位を含有しない。
【００２６】
次の段階は、制限エンドヌクレアーゼを二次伸長産物と混和して、エンドヌクレアーゼ消化反応混合物を形成する。制限エンドヌクレアーゼは、特異的に、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を切断する、または二次伸長産物中の大量存在標的を増幅する場合に作製されるが、少量存在標的の場合には作製されないものである。制限エンドヌクレアーゼ消化は、大量存在二次伸長産物を選択的に切断する。
【００２７】
次に、第3のポリメラーゼ連鎖反応段階が継続する。この段階は、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第1のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上流部分と同じ配列を含有する第1の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第2のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上流部分と同じ配列を含有する第2の三次プライマーを有する三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階を含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは二次伸長産物の全てを増幅するために使用することができる。二次伸長産物を三次オリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混和し、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。
【００２８】
三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む1サイクル以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施する。変性処理はハイブリダイゼーションされる核酸配列を分離し、ハイブリダイゼーション処理は、二次伸長産物にハイブリダイゼーションするために、三次オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイゼーションすることを含む。伸長処理中、ハイブリダイゼーションした三次オリゴヌクレオチドプライマーは伸長されて、未切断の二次伸長産物に相補的な三次伸長産物を作製する。
【００２９】
次に、三次伸長産物にリガーゼ検出反応を実施する。これは、各セットが、三次伸長産物特異的部分と検出可能なレポーター標識を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび三次伸長産物特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階を含む。特定のLDRプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的な三次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイゼーションされる場合のライゲーションに好適である。しかし、試料に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする場合には、このようなライゲーションを分断するミスマッチが存在する。
【００３０】
三次伸長産物、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混和して、リガーゼ検出反応混合物を形成する。
【００３１】
リガーゼ検出反応混合物に、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を有する1サイクル以上のリガーゼ検出反応サイクルを実施する。変性処理は、三次伸長産物からハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドを分離する段階を含む。ハイブリダイゼーション処理では、オリゴヌクレオチドプローブセットが、三次伸長産物が存在する場合には、それらのそれぞれの三次伸長産物に塩基特異的に隣接部位にハイブリダイゼーションする。結果として、隣接するプローブが互いにライゲーションして、一体として結合している検出可能なレポーター標識および三次伸長産物特異的部分を含有するライゲーション産物配列を形成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、それぞれの相補的な三次伸長産物ではなくヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることがあるが、1つ以上のミスマッチの存在により一体としてライゲーションされず、変性処理中個別に分離する。このライゲーション検出反応サイクルにより、試料中の1つ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列の存在を示すライゲーション産物配列のレポーター標識が検出される。
【００３２】
本発明はまた、複数の標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列から、1つまたは複数の単塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数の少量存在配列を同定するためのキットに関する。本発明のキットは、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、三次オリゴヌクレオチドプライマーセットと、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとを提供する。
【００３３】
本発明に提供される一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、(a)標的特異的部分を含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、(b)標的特異的部分を含有する第2のオリゴヌクレオチドプライマーとを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマーは、対応する高および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションして一次伸長産物を作製するのに好適である。しかし、プライマーは、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするとき、このようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミスマッチを有する。
【００３４】
本発明のキットに提供される二次オリゴヌクレオチドプライマーは、(a)標的特異的部分と5'側上流二次プライマー特異的部分とを含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび(b)標的特異的部分と5'側上流二次特異的部分とを含有する第2のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。二次オリゴヌクレオチドプライマーは、大量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有または作製し、1つ以上の少量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有または作製しない二次伸長産物の形成を可能にする一次伸長産物の相補鎖のハイブリダイゼーションに好適である。
【００３５】
本発明のキットに提供される三次オリゴヌクレオチドプライマーは、(a)二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第1のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上流部分と同じ配列を含有する第1の三次プライマーおよび(b)二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第2のオリゴヌクレオチドプライマーの5'側上流部分と同じ配列を含有する第2の三次プライマーを有する三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを有する。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは二次伸長産物の全てを増幅するために使用することができる。
【００３６】
本発明のキットはまた、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各セットは、(a)三次伸長産物特異的部分と検出可能なレポーター標識とを含有する第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび(b)三次伸長産物特異的部分を含有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する。特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的な三次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイゼーションされるとき、一体としてライゲーションされるのに好適である。しかし、プローブは、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするとき、このようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する。
【００３７】
増幅および検出段階において多数のエラーの可能性を生ずることなく、複数の標的ヌクレオチド配列において、大量存在配列から、1つまたは複数の単塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる1つまたは複数の少量存在配列を検出し、同定するのに十分な感度のある現在利用可能な生物学的技法はない。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応および制限エンドヌクレアーゼ消化により少量存在DNA標的を選択的に増幅する条件を最適化する方法および、組み合わせたとき、突然変異遺伝子などの少量存在ヌクレオチド配列を増幅し、検出するための高感度な方法となるヌクレオチド検出方法に関する。本発明の手法は臨床および研究用途に有用である。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、多数の標的ヌクレオチド配列の中で、大量存在配列と1以上の1塩基変化、挿入、または欠失により異なる1以上の少量存在配列を同定する方法に関するものである。本方法はポリメラーゼ連鎖反応第1相、ポリメラーゼ連鎖反応第2相、制限エンドヌクレアーゼ消化反応相、続くポリメラーゼ連鎖反応第3相およびリガーゼ検出反応相を含む。
【００３９】
本発明の開始試料は、試料中に存在する大量存在標的配列の各々と少なくとも1つの配列差異を有する1以上の少量存在標的ヌクレオチドを潜在的に含んでいる。
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応第1相において、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが与えられる。一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、標的特異的部分を含む1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分を含む2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマーは、相当する高および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションするために適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする。しかしながら各プライマーは試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配列にハイブリダイズした時も、そのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を阻害するミスマッチを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマー、試料およびポリメラーゼが一次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成するために混和される。
【００４１】
一次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。変性処理はハイブリダイズしている核酸配列を分離する。ハイブリダイゼーション処理は一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。伸長処理は一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列に相補的な一次伸長産物を形成するために、ハイブリダイズした一次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長される。
【００４２】
高頻度の一次ポリメラーゼ連鎖反応産物を、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む二次ポリメラーゼ連鎖反応産物に変換する効率および忠実度は、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを与える前にある操作（前変換という）を実施することにより改善されるかもしれない。この操作は（a）標的特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（b）標的特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプライマー、を有する前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを与えることからなる。標的特異的部分は二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと同一または実質的に同一であるが、少なくとも1つのプライマーは1以上のヌクレオチド類似体を含む。特定の前二次プライマーセットのオリゴヌクレオチドは一次伸長産物の相補鎖へのハイブリダイゼーションに適している。一次伸長産物は変性され、そして一次伸長産物はポリメラーゼおよび前二次オリゴヌクレオチドプライマーと混合され、前二次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成する。混合液は前二次ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする2以上のPCRサイクルに供される。この産物は1以上のヌクレオチド類似体および反対鎖の塩基変化を含み、続く二次ポリメラーゼ連鎖反応において、一次ポリメラーゼ連鎖反応産物配列を制限エンドヌクレアーゼ認識部位に変換することを容易にする。
【００４３】
次に、ポリメラーゼ連鎖反応第2相である。この相は標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含む。特定の組において二次オリゴヌクレオチドプライマーは一次伸長産物の相補鎖へのハイブリダイゼーションに適しており、大量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むまたは創生するが、1以上の少量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含まないまたは創生しない二次ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を可能にする。一次伸長産物、二次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼが二次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成するために混和される。
【００４４】
二次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を備える2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。変性処理はハイブリダイズしている核酸配列の分離を含む。ハイブリダイゼーション処理では二次オリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長産物にハイブリダイズする。伸長処理はハイブリダイズされた一次伸長産物に、一次伸長産物に相補的な二次伸長産物を形成させる。大量存在二次伸長産物は制限酵素切断部位を含むが、少量存在二次伸長産物は含まない。
【００４５】
次の相は制限エンドヌクレアーゼを二次伸長産物と混合し、エンドヌクレアーゼ消化反応混合液を形成することを含む。制限エンドヌクレアーゼは、内部のまたは大量存在標的が増幅された際に創生された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を認識および切断するが、二次伸長産物中の少量存在標的に対しては行わないものである。制限エンドヌクレアーゼ消化は選択的に大量存在二次伸長産物を破壊する。
【００４６】
次に、ポリメラーゼ連鎖反応第3相である。これは、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの1番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同一の配列を含む1番目の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの2番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同一の配列を含む2番目の三次プライマーを有する三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは全二次伸長産物を増幅するために使用されてもよい。二次伸長産物は三次オリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混和され、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成する。
【００４７】
三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を備える2以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。変性処理はハイブリダイズしている核酸配列を分離し、一方ハイブリダイゼーション処理では三次オリゴヌクレオチドプライマーが二次伸長産物にハイブリダイズするためのハイブリダイゼーションを含む。伸長処理中には、ハイブリダイズされた三次オリゴヌクレオチドプライマーが二次伸長産物に相補的な三次伸長産物を形成さるために伸長される。
【００４８】
次に三次伸長産物はリガーゼ検出反応に供される。これは各組が三次伸長産物特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する1番目のオリゴヌクレオチドプローブ、および三次伸長産物特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプローブを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供することを含む。特定の組のオリゴヌクレオチドプローブは相補的三次伸長産物特異的部分上でお互いに隣接してハイブリダイズされる時、共にライゲーションされることに適する。しかしながら試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配列にハイブリダイズした時もそのようなライゲーションを阻害するミスマッチが存在する。
【００４９】
三次伸長産物、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼがリガーゼ検出反応混合液を形成するために混和される。
【００５０】
リガーゼ検出反応混合液は、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む1以上のリガーゼ検出反応サイクルに供される。変性処理はハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドの三次伸長産物からの分離を含む。ハイブリダイゼーション処理においては、オリゴヌクレオチドプローブセットは、もし存在するならば、各々の三次伸長産物に塩基特異的様式で隣接部位にハイブリダイズする。結果として隣接プローブはお互いに連結され、検出可能レポーター標識および互いに連結された三次伸長産物特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは各々の相補的三次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズするかもしれないが、1以上のミスマッチが存在するために互いに連結されず、変性処理の間に各々が分離される。リガーゼ検出反応サイクルに続いて、ライゲーション産物配列のレポーター標識が検出され、それは試料中に1以上の少量存在標的ヌクレオチド配列が存在することを示している。
【００５１】
図1A から図 1Cは本発明の方法に従ったPCR/RE/LDRによる変異DNAの増幅および検出の概略図である。その過程は正常、すなわち野生型の大量存在配列および、あるいはガン遺伝子等の低頻度のその配列の変異体を含む試料を用いて開始される。図1A から図 1Cでは変異型および野生型の配列を比較しており、それらは1塩基に関してのみ異なることが明らかである。野生型配列では識別塩基は「C」であり一方変異型配列は相当する場所に「T」を有する。
【００５２】
最初に、試料は改変型標的配列を創生する一次PCR段階に供される。図1Aの段階1および2に示される一次PCR操作では、野生型および変異型DNAが94℃の変性を受け、1重鎖DNA鋳型を創生する。図1Aの段階1に示されるように、各々3'末端ヌクレオチド類似体を含むプライマーAおよびBがその1重鎖DNA鋳型にアニールする。ポリメラーゼにより促進され、類似体プライマーは図1Aの段階2で示される伸長操作を受ける。2重鎖核酸を変性し、結果として生じる1重鎖核酸にプライマーをハイブリダイズさせ、プライマーを伸長するこの過程が定法のPCR操作に従って繰り返され、ヌクレオチド類似体を含む改変型標的配列体の形で伸長産物を大量に産生する。ポリメラーゼ連鎖反応過程は、これにより参考文献により組み入れられた、H.Erlichら「ポリメラーゼ連鎖反応最近の進展（Recent Advances in Polymerase Chain Reaction）」Science 252：1643〜50（1991）、M.Innisら「PCR 実験法：方法および応用入門書（ PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications ）」Academic Press：ニューヨーク（1990）、およびR.Saikiら「熱安定性DNAポリメラーゼを用いたプライマー指向性のDNAの酵素増幅（Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with Thermostable DNA Polymerase）」Science 239：487〜91（1998）に完全に記載されている。本発明に従ったPCR使用のさらなる詳細は以下の実施例で提供される。
【００５３】
図1Aの段階1に示されるように野生型および変異型配列はこれら配列の識別塩基の近位に相補的なX：WおよびY：Z塩基対を有する。これらの配列が一次PCR操作において変成されると、プライマーAおよびBは、QがYおよびW塩基に結合するようにこれらの配列にハイブリダイズするように構成される。一次PCR段階の引き続くサイクルではポリメラーゼは今度は鋳型鎖となっている中に存在するQ類似体に遭遇する。ポリメラーゼは類似体をいくつかの塩基のなかの1つとして「読み取る」ことができ、Qの反対側に事実上は相同体に「相補的である」いくつかの異なる塩基の1つを「書き込む」だろう。そのような部位では異なる塩基が取りこまれうるので、産物は縮重され、理想的には産物プールの中でQ類似体の反対側の同一部位にG、A、TおよびCを有する。これらの縮重塩基は「N」で示される。図1Aの段階2に示されるように、野生型および変異型配列両者において形成されるミスマッチは塩基「N」で示される。
【００５４】
本発明に適するヌクレオチド類似体は以下のものを含み、ただしそれに限定しない：Q1、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボアミド；Q2、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-3-ニトロピロール；Q5、2'-デオキシイノシン；Q6、6-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2] オキサジン-7-ワン；Q7、2-アミノ-7-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-6-メトキシアミノプリン、Q16；1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-4-ヨードピラゾール；Q18、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）ピロール-3-カルボキサミド；Q19、1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-4-ニトロピラゾール。
【００５５】
次に図1Aの段階3に示されるように二次PCR相が実施される。二次PCR相のオリゴヌクレオチドプライマーセットは標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。これらは図1Aの段階3においてプライマー「C」および「D」により表される。二次PCR相中に、二次PCRプライマーの標的特異的部分は一次伸長産物の相補鎖にハイブリダイズするであろう。図1Aの段階3に示されるようにこれらのハイブリダイズされたプライマーは続いてポリメラーゼを用いて図1Aの段階3に示されるような二次PCR伸長産物を形成するために伸長される。2重鎖核酸の変性、プライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を含む、二次PCR相は、一次PCR伸長産物が十分に増幅されるまで2〜20PCRサイクル繰り返される。
【００５６】
図1A から図 1Cに示されるように変異型配列対野生型配列における「T」対「C」の各差異のために、野生型配列に由来する二次伸長産物内の制限エンドヌクレアーゼ（RE）部位を認識する適切なREを用いて二次伸長産物は処理することができる。しかしながら変異型核酸配列に由来して形成される二次PCR伸長産物は制限エンドヌクレアーゼ部位を含まない。図1A から図 1Cの実施態様では野生型配列に由来する二次伸長産物内に組み入れられた制限エンドヌクレアーゼ認識部位はTaqI認識部位5'-TCGA-3'である。TaqIは2重鎖DNA二次伸長産物の各鎖において認識部位内のTおよびCの間で特異的に切断する。しかしながら他の制限エンドヌクレアーゼ部位およびそれらの相当する制限エンドヌクレアーゼが代わりに用いられることができるであろう。
【００５７】
大量存在標的に制限酵素切断部位が組み入れられると、制限酵素切断部位ヌクレオチド配列が消化されうる条件下で、適切な制限エンドヌクレアーゼが添加される。微生物に由来する制限エンドヌクレアーゼはヌクレオチド鎖内でDNAを切断する酵素である。各制限エンドヌクレアーゼはDNA配列内の4から8残基長の特異的な短いオリゴヌクレオチドを認識する。適切な条件下でREは制限酵素切断部位内のリン酸ジエステル結合において各鎖を切断する。制限エンドヌクレアーゼは純粋なDNA試料をゲル電気泳動により容易に分離できる一貫して再現性の高い断片に切断する。数百の制限エンドヌクレアーゼが同定され、商業的に利用可能である。これにより参考文献により組み入れられたDarnellら「高分子操作（ Manipulating Macromolecules ）」Molecular Cell Biology第2版、ニューヨーク、W.H.Freeman and Companyの189〜225ページ（1990）を参照されたい。本発明の方法にしたがってどのようなREも使用することができる。使用されるREの選択は開始試料中のDNAに対して利用可能な情報に基づいて行われる。遺伝子内に生じるRE部位は本発明の方法を使用する前に、ゲンバンク等の資源、DNAが商業的に得られたならばメーカーを通じて容易に利用可能であり、または遺伝子研究の一部として同定されているであろう。本発明のPCR相のプライマー設計は遺伝子内の制限酵素切断部位の知識に基づいて行われる。RE部位の同定はDNAマッピングおよびDNAクローン化により容易に決定される。これにより参考文献により組み入れられたWatsonら「インビトロ変異導入（In Vitro Mutagenesis）」組換え DNA （Recombinant DNA ）第2版、ニューヨーク、ニューヨーク、W.H.Freeman and Companyの191〜194ページ（1983）を参照されたい。制限エンドヌクレアーゼによる完全切断のための最適条件は特異的である。消化は特定のREに対するメーカーの推奨またはこれにより参考文献により組み入れられたSambrookら「分子クローン化（ Molecular Cloning ）研究室便覧（ A Laboratory Manual ）」第2版、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク（1989）により実施されるべきであろう。
【００５８】
二次伸長産物の制限エンドヌクレアーゼ処理後、三次PCR過程が実施される。図1B段階6に示されるように、これは、二次オリゴヌクレオチド組の1番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む普遍的プライマー（U1）である1番目の三次プライマーおよび二次オリゴヌクレオチド組の2番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む2番目の三次プライマーを提供することを含む。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは制限エンドヌクレアーゼ処理された二次伸長産物の増幅に使用することができる。二次伸長産物は、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液を形成するために、三次オリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼとともに混和される。
【００５９】
三次ポリメラーゼ連鎖反応混合液は、2重鎖核酸の変性、結果として生じる1重鎖核酸に対する三次オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション、およびハイブリダイズしたプライマーの伸長を含むポリメラーゼ連鎖反応条件に供される。この操作は、三次PCR伸長産物を適切量産生するために、これらの段階を含む十分な数のサイクルを介して繰り返される。二次PCR伸長産物は制限エンドヌクレアーゼを用いて処理されるので、野生型核酸配列由来の三次PCR伸長産物は識別塩基に相当するヌクレオチドの近傍でそれらが切断される結果として短い。一方変異型核酸配列由来の三次PCR伸長産物はより大きく、そして識別塩基に相当するヌクレオチドの近傍で切断されない。図1B段階6を参照されたい。結果として変異型核酸配列由来の三次PCR伸長産物は、続くLDR段階において野生型核酸配列由来の産物からは容易に識別される。
【００６０】
別の制限エンドヌクレアーゼ消化はまた、最初のRE段階においてPCRエラーまたは不完全消化のために増幅されたかもしれないいかなる大量存在標的を除去することためにも三次PCR相に続いて使用されるかもしれない。
【００６１】
三次PCR伸長操作に続いて、結果として生じる三次伸長産物は図1C段階7Aまたは7BのいずれかにしたがってLDR操作に供される。これらの選択肢のいずれにおいてもLDR操作は最初に1重鎖DNA（ssDNA）を産生するために三次PCR伸長産物を最初に変性することにより開始される。識別プローブは3'末端に異なるヌクレオチドおよび5'末端に異なる数のアデニン塩基を有することにより識別される。結果として各識別プローブより産生されるライゲーション産物は蛍光標識検出により同定され、そして異なる電気泳動度によりゲル上でお互いに識別される。
【００６２】
図1C段階7AにおいてLDRプローブセットは4種の選択可能な識別プローブおよび4種の識別プローブのいずれとも連結可能な共通プローブを含む。共通プローブはその3'末端に蛍光標識を含む。三次伸長産物、これらのオリゴヌクレオチドプローブ、および熱安定性リガーゼがリガーゼ検出反応混合液を形成するために混合され、一連のリガーゼ検出反応サイクルに供される。
【００６３】
リガーゼ検出反応は一般的には、その開示内容がこれにより参考文献により組み入れられたBaranyらの国際公開公報第90/17239号、「熱安定性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローン化、過剰発現およびヌクレオチド配列（Cloning、Overexpression and Nucleotide Sequence of Thermostable DNA Ligase-encoding Gene）」Gene、109：1〜11（1991）、およびF.Barany「クローン化熱安定性リガーゼを用いた遺伝子病同定およびDNA増幅（Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase）」米国科学アカデミー紀要（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、88：189〜193（1991）およびBaranyらの米国特許第5,494,810号、米国特許第5,830,711号および米国特許第6,027,889号に記載されている。本発明に基づきリガーゼ検出反応は2組の相補性オリゴヌクレオチドを使用することができる。これはリガーゼ連鎖反応として知られ、これにより参考文献により組み入れられた直前の参考文献中に記載されている。またはリガーゼ検出反応はオリゴヌクレオチドライゲーション分析として知られる単一サイクルを含むことができる。これにより参考文献により組み入れられた、Landegrenら「リガーゼ媒介性遺伝子検出技術（A Ligase-Mediated Gene Detection Technique）」、Science 241：1077〜80（1988）、Landegrenら「DNA診断-分子技術および自動化（DNA Diagnostics-Molecular Techniques and Automation）」、Science 242：229〜37（1988）およびLandegrenらの米国特許第4,988,617号を参照されたい。
【００６４】
リガーゼ検出反応相中、変性処理は80℃〜105℃の温度で実施され、ハイブリダイゼーションは50℃〜85℃で行われる。各サイクルは全体で約1分から5分の長さである変性処理および熱的ハイブリダイゼーション処理を備える。典型的にはリガーゼ検出反応は、繰り返し2サイクルから50サイクルの間変性およびハイブリダイズを実施することを含む。リガーゼ検出反応段階の総時間は1分から250分である。
【００６５】
好ましい耐熱性リガーゼはサーマスアクアティカス（Thermus aquaticus）由来のものである。本酵素はその生物より単離することができる。これにより参考文献により組み入れられた、M.Takahashiら「好熱性DNAリガーゼ（Thermophilic DNA Ligase）」、J.Biol.Chem.259：10041〜47（1984）。またはそれは組換え的に調整することができる。（Thermus thermophiliusリガーゼと同様に）サーマス アクアティカスリガーゼの組換え体調整と同様にそのような単離手順も、これにより参考文献により組み入れられた、Baranyらの国際公開公報第90/17239号、F.Baranyらの「耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローン化、過剰発現およびヌクレオチド配列（Cloning、Overexpression and Nucleotide Sequence of Thermostable DNA Ligase-encoding Gene）」Gene、109：1〜11（1991）およびBaranyらの米国特許第5,494,810号および米国特許第5,830,711号に開示されている。これらの参考文献はコードするDNAと同様に本リガーゼの完全配列情報を含む。他の適切なリガーゼはイーコリのリガーゼ、T4リガーゼ、およびピロコッカス（Pyrococcus）リガーゼを含む。
【００６６】
ライゲーション検出反応混合液はサケ精子DNA等のキャリアーDNAを含んでもよい。
【００６７】
好ましくは熱的ハイブリダイゼーション処理であるリガーゼ検出反応のハイブリダイゼーション段階はライゲーション接合点におけるヌクレオチドを識別することに基づいてヌクレオチド配列を識別する。標的ヌクレオチド配列間の差異は、例えば、1核酸塩基差異、核酸欠失、核酸挿入、または転位であることができる。1より多くの塩基を含むそのような配列差異もまた検出することができる。
【００６８】
上述されたオリゴヌクレオチドプローブセットは検出に適したレポーター標識を有してもよい。有用な標識は発色基、蛍光性部分、酵素、抗原、重金属、磁性プローブ、色素、りん光性基、放射性物質、化学発光性部分、および電気化学検出部分を含む。マトリックス支援レーザ脱離イオン化法-飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF）アレイシステム等の質量分析法による識別のための分子量標識もまた適切であろう。
【００６９】
オリゴヌクレオチドプローブセットはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変型リボヌクレオチド、改変型デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、改変型ペプチドヌクレオチド類似体、改変型リン酸-糖-バックボーンオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物の形態であることができる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドは各々66℃〜70℃のハイブリダイゼーションまたは融解温度（すなわちTm）を有する。これらのオリゴヌクレオチドは20ヌクレオチド長〜28ヌクレオチド長である。
【００７１】
図1C段階7Aに示されるように変異核酸配列由来のライゲーション産物はその5'末端に2個のアデニン塩基を有する識別プローブから形成される。他の識別プローブは変異核酸配列が存在する結果として共通プローブに連結されないであろう。
【００７２】
一方多くの場合には上述されたプローブセットを用いて野生型配列よりライゲーション産物が形成されることはないであろう。エンドヌクレアーゼ消化は野生型核酸配列由来の三次伸長産物を切断するため、その結果として、そのプローブセットの共通および識別プローブの両者は共に連結されることが可能な様式ではそのような三次伸長産物にハイブリダイズしないであろうから、これが生じるのである。しかしながら野生型配列由来二次伸長産物のエンドヌクレアーゼ消化はある程度には不完全であり、野生型配列由来の少量の残存未切断三次伸長産物がリガーゼ検出反応混合液中に存在するかもしれない。これは5'末端にアデニンを有さない識別プローブからのライゲーション産物の生成を引き起こすであろう。
【００７３】
図2は、図1C段階7Aのリガーゼ検出反応操作から形成される産物のゲル電気泳動検出を示している。図2に示されるように、非連結プローブは大きな電気泳動度を有し、ゲルの底部にバンドを形成する。野生型配列由来のいくらかの少量の三次伸長産物由来ライゲーション産物は次に大きな電気泳動度を有し、ゲル上の中間位置にバンドを形成する。変異型配列由来ライゲーション産物は野生型ライゲーション産物よりも小さい電気泳動度を有し、野生型ライゲーション産物の少し上部に濃いバンドを形成する。変異型配列が試料中に存在しない場合、そのようなゲルバンドは形成されない。最上部の2つのバンドは電気泳動度が小さい微量ライゲーション産物である。これらの高分子量バンドはアーチファクトであり、おそらくPCR中のポリメラーゼのエラーおよび鋳型分解に起因しているであろう。PCR緩衝液の組成は増幅後の試料中に存在するこれらのPCRエラー産物の割合に強い影響を与える。
【００７４】
電気泳動度の差異に基づくDNA産物の検出にキャピラリーおよびゲル電気泳動法が使用されることはよく知られている。これにより参考文献により組み入れられた、例えばGrossmanら「核酸配列の高密度多重検出：オリゴヌクレオチドライゲーション分析および配列コード分離（High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid Sequences：Oligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded separations）」Nucleic.Acids Res.22（21）：4527〜34（1994）を参照されたい。
【００７５】
図1C段階7Bに示されているリガーゼ検出反応操作の代替として、識別プローブがその5'末端の異なるアドレス特異的部分（すなわちZIP1、ZIP2、ZIP3およびZIP4）と共に提供されることができる。これは識別プローブのアドレス特異的部分に相補的な異なる捕捉オリゴヌクレオチドプローブを有する、位置特定可能なアレイ上でライゲーション産物が検出されることを可能にする。結果として、リガーゼ検出反応相に続くハイブリダイゼーション操作中に各ライゲーション産物はDNAマイクロアレイの異なるアドレスに向かう。ハイブリダイズされたライゲーション産物は全て同一の標識を有するが、ライゲーション産物が固定化された場所によりお互いに区別することができる。または異なる標識が識別塩基上に存在することができ、一方アドレス特異的部分は共通プローブ上に存在する。この実施態様では異なるライゲーション産物は同一の捕捉プローブを有する部位のアレイ上に固定化されるであろう。しかしながら異なるライゲーション産物は異なる標識により識別されるだろう。
【００７６】
図3は位置特定可能なアレイを用いて図1C段階7Bの過程から生じるライゲーション産物を検出することを示している。この場合図1C段階7Bに示されるように共通プローブはある標識を有し、識別プローブはアドレス特異的部分を有する。図3ではライゲーション産物は、ライゲーション産物中のアドレス特異的部分がアレイ上の捕捉オリゴにハイブリダイズすることに効果的な条件下で、位置特定可能なアレイに接触させられる。図3段階2および3に示されているように、ライゲーション産物を形成しない識別プローブ（例えばアドレス特異的部分ZIP4（示さず）およびZIP3（示す）を有するプローブ）はアレイ上に固定化されるが標識がないために検出されない。非結合の共通プローブはアレイにハイブリダイズせず、続いて洗い流され（例えば65℃〜80℃および低塩濃度において）、シグナルを発生しない。野生型核酸配列由来の任意の少量のライゲーション産物（上流での不完全なエンドヌクレアーゼ消化のため）はアドレス特異的部分ZIP1に相補的である捕捉オリゴヌクレオチドに（任意の相当する非結合識別プローブとともに）固定化される。同様に、変異型配列由来の任意のライゲーション産物はアドレス特異的部分ZIP2に相補的である捕捉オリゴヌクレオチドに（任意の相当する非結合プローブとともに）固定化される。変異型配列および/または野生型配列の存在は本実施態様においてはアレイ上の各々異なる場所での蛍光シグナルの存在により検出される。ヘテロ接合性はアドレス特異的部分ZIP1およびZIP2に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドにおける等量のシグナルで示される。シグナルは蛍光イメージ装置を用いて定量化されてもよい。この様式は各対立遺伝子に独自のアドレスを使用し、低レベルシグナル（30アトモルから100アトモルのLDR産物）の非常に正確な検出を達成するために好ましいかもしれない。
【００７７】
捕捉オリゴヌクレオチドのアレイを有する固体支持体の使用は、これにより参考文献により組み入れられた、特許仮出願中米国特許出願第60/011359に完全に開示されている。この方法はオリゴヌクレオチドの固着に適した各々の部位のアレイを有する固体支持体の提供を伴う。各アレイ部位の固体支持体にオリゴヌクレオチドを結合させるために適したリンカーまたは支持体（好ましくは加水分解できない）が固体支持体に固着される。固体支持体上のオリゴヌクレオチドアレイは、活性化アレイ部位に1または複数のヌクレオチドを固着させるために、選択されたアレイ部位を活性化させる一連のサイクルにより形成される。
【００７８】
そのようなアレイを使用する場合に、上記の結合型のPCRおよびLDR相の各々において使用されるオリゴヌクレオチドプローブは位置特定可能なアレイ特異的部分を有する。PCRおよびLDR相が完了した後、そのような過程の産物の位置特定可能なアレイ特異的部分は1重鎖のままで残り、捕捉相中でオリゴヌクレオチドを捕捉するためにハイブリダイズされる。これにより参考文献により組み入れられた、C.Newtonら「新規リン酸アミダイド中間体を取りこむプライマーを用いての5'1重鎖尾部を有するPCR産物の産生（The Production of PCR Products with 5'Single-Stranded Tails Using Primers That Incorporate Novel Phosphoramidite Intermediates）」Nucl.Acids Res.21（5）：1155〜62（1993）。
【００７９】
段階の捕捉相において混合液は45℃〜90℃にて60分までの間、固体支持体に接触される。陽イオン添加、容積排除、およびカオトロピック試薬はハイブリダイゼーションを加速するかもしれない。アレイが数千のアドレスからなる時には正しいライゲーション産物配列が適切なアドレスにハイブリダイズする機会を有することが大切である。これは、高温度の使用によるオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面と接触している液体の機械的運動、または電場によりオリゴヌクレオチドをアレイ上で移動させることにより達成されるかもしれない。ハイブリダイゼーション後、アレイは低ストリンジェンシー洗浄緩衝液および高ストリンジェンシー洗浄緩衝液順を用いて順次洗浄される。
【００８０】
安定した様式でハイブリダイズするであろう捕捉オリゴヌクレオチドおよび位置特定可能なヌクレオチド配列を選択することが重要である。捕捉オリゴヌクレオチドが位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりもより低い温度で標的ヌクレオチド配列にオリゴヌクレオチド組がハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチド組および捕捉オリゴヌクレオチドが構成されるべきことが必要である。オリゴヌクレオチドがこの様式で設計されない場合、標的にハイブリダイズされたのと同じオリゴヌクレオチド組由来の隣接した未反応オリゴヌクレオチドを捕捉するために偽陽性シグナルが生じるかもしれない。
【００８１】
捕捉オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変型リボヌクレオチド、改変型デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、改変型ペプチドヌクレオチド類似体、改変型リン酸-糖-バックボーンオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物の形態であることができる。
【００８２】
位置特定可能なヌクレオチドアレイ特異的部分を含む全未変換非結合LDRオリゴヌクレオチドプローブが、DNAアレイ上にライゲーション産物を捕捉するのに先立ち、化学的または酵素学的に破壊されることが望ましいかもしれない。そのような未変換プローブは、そうしなければ、相補的配列を含む固定支持体アレイ上のアドレスに対する結合をライゲーション産物と競合するであろう。末端を阻止され、プローブのお互いのライゲーションには関係しないLDRプローブとともにエクソヌクレアーゼ3（これにより参考文献により組み入れられた、L-H GuoおよびR.Wu、酵素学手法（ Methods in Enzymology）100：60〜96（1985））等のエクソヌクレアーゼを用いて、破壊を達成することができる。阻止部分はレポーター基またはホスホロチオ酸が可能であるだろう。これにより参考文献により組み入れられた、T.T.Nikiforowら「1重鎖PCR産物の調整および固相ハイブリダイゼーションによる検出のためのホスホロチオ酸プライマーおよびエクソヌクレアーゼ加水分解の使用（The Use of Phosphorothioate Primers and Exonuclease Hydrolysis for the Preparation of Single-stranded PCR Products and their Detection by Solid-phase Hybridization）PCR 方法および応用（ PCR Methods and Applications 3：285〜291（1994）。LDR過程後、反応混合液をエクソヌクレアーゼとともに加温することで非結合プローブは選択的に破壊される。結合プローブはエクソヌクレアーゼ反応開始に必要な遊離3'末端を除去しているために保護される。この研究方法は、特にLDR反応がごく少量の産物のみしか形成しないところでは、シグナル-ノイズ比の増加に繋がる。未結合オリゴヌクレオチドは捕捉オリゴヌクレオチドによる捕捉に対して競合するために、結合オリゴヌクレオチドとのそのような競合はシグナルを低下させる。本方法の付加的な利点は、ハイブリダイズしていない標識含有配列が分解され、それらはDNAアレイからより容易に洗浄により除去されることができるので、従って標的非依存性バックグラウンドシグナルを引き起こすことがよりできにくくなる。
【００８３】
広範囲の感染症が本発明の方法により検出することができる。典型的にはこれらは細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌感染性因子により引き起こされる。様々な感染性因子の薬剤耐性もまた本発明を用いて決定することができる。
【００８４】
本発明により検出される細菌感染性因子は大腸菌、サルモネラ菌、シゲラ菌、肺炎杆菌、緑膿菌、リステリア菌、ヒト結核菌、トリ結核菌細胞内型、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリジウム菌、百日咳菌、バクテロイデス、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、溶血連鎖球菌、コリネバクテリア、レジオネラ、マイコプラズマ、ウレアプラスマ、クラミジア、淋菌、髄膜炎菌、ヘモフィルスインフルエンザ、エンテロコッカス-フェカーリス、尋常変形菌、ミラビリス変形菌、ヘリコバクターピロリ、梅毒トレポネーマ、ライム病菌、回帰熱ボレリア、リケッチア病原微生物、ノカルジアおよび放線菌を含む。
【００８５】
本発明により検出される真菌感染性因子はクリプトコックス-ネオフォルマンス、ブラストマイセス-デルマチチジス、ヒストプラスマ-カプスラーツム、コクシジオイデス-イミチス、パラコクシジオイデス-ブラジリエンシス、カンジダアルビカンスアスペルギルス-フミガーツス、藻菌類（リゾープス属）、スポロトリックス-シェンキィ、クロモミコーシス、およびマズラミコーシスを含む
【００８６】
本発明により検出されるウイルス感染性因子はヒト免疫不全ウイルス、ヒトT細胞リンパ球栄養性ウイルス、肝炎ウイルス（例えばB型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルス）、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブンヤウイルス、アリーナウイルス、ルベラウイルス、レオウイルスを含む
【００８７】
本発明により検出される寄生虫感染性因子は熱帯熱マラリア原虫、プラスモディウムマラリア、卵形マラリア原虫、オンコベルバボルブルス（Onchoverva volvulus）、リーシュマニア、トリパノソーマ種、住血吸虫種、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウム、ジアルジア種、トリコモナス種、大腸バランチジウム、バンクロフト糸状虫、トキソプラズマ種、蟯虫、蛔虫、ヒト鞭虫、メジナ虫、吸虫、広節裂頭条虫、条虫種、ニューモシスティス-カリニ、およびアメリカ十二指腸虫を含む。
【００８８】
本発明はまた感染性因子による薬剤耐性の検出にもまた有用である。例えばバンコマイシン耐性エンテロコッカス-フェシウム、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌、多剤耐性結核菌、およびAZT耐性ヒト免疫不全ウイルス全てが本発明により同定することができる。
【００８９】
遺伝子病もまた本発明の方法により検出することができる。これは出生前または出生後の染色体および遺伝子異常または遺伝子病をスクリーニングすることにより実施することができる。検出可能な遺伝子病の例は、21水酸化酵素欠損症、嚢胞性繊維症、脆弱X症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症またはその他のトリソミー、心臓病、単一遺伝子病、HLA型判定、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球性貧血、テイ-サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リポイド症、肥満障害、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病を含む。
【００９０】
本発明の方法により検出することができる癌は一般的には癌遺伝子、癌抑制遺伝子、またはDNA増幅、複製、組換え、または修復に関わる遺伝子を含む。これらの例はBRCA1遺伝子、p53遺伝子、APC遺伝子、Her2/Neu増幅、Bcr/Abl、K-ras遺伝子およびヒトパピローマウイルス16型および18型を含む。本発明の様々な側面が、下記のよくある癌において上記遺伝子の点変異および小規模欠失/挿入と同様に増幅、大規模欠失を同定するために使用することができる。白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫および他の骨癌、精巣および卵巣癌、頭頚部腫、および子宮頚部腫瘍。
【００９１】
環境モニター領域では、天然および設計された生態系、および市営排水浄化システム内、貯水槽内、または生物学的修復（Bioremediation）を受けている汚染地域内等のマイクロコズムにおける、病原微生物および常在微生物を、検出、同定、およびモニターするために本発明を使用することができる。生体異質物質を代謝可能な遺伝子を含むプラスミドを検出すること、集団動力学研究における特定の標的微生物をモニターすること、または環境中および工業装置中の遺伝子改変微生物を検出、同定、またはモニターすることも可能である。
【００９２】
食物および飼料産業においては本発明は広範囲な応用を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン等を生産するための酵母などの生産生物の同定および特徴づけに使用することができる。他の利用領域は、汚染物質に対する産物および過程の品質管理および保証に関するものである（例えば家畜、殺菌、および食肉加工）。他の利用は、育種目的の植物、球根、および種子の特徴づけ、植物特異的病原体の存在の同定、および家畜感染の検出および同定を含む。
【００９３】
少量存在配列が大量存在配列の量に対して、同一試料中に1：1,000未満のモル比で存在する時、好ましくは1：10,000未満のモル比で存在する時、最も好ましくは1：100,000未満のモル比で存在する時、大量存在配列と1以上の1塩基変化、挿入、欠失、または転座により異なる1以上の少量存在配列の存在を同定するために本発明は有用である。
【００９４】
本発明の別の局面は試料中の標的ヌクレオチド配列を定量する能力である。これは内部標準を確立することにより達成することができる（すなわち、そこでは標準確立物質が試料とともに増幅および検出される）。
【００９５】
内部標準を用いた定量では、量既知の1以上の標識標的ヌクレオチド配列が試料に加えられる。加えて多数の標識特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、リガーゼ、以前に議論されたオリゴヌクレオチドプローブセット、および三次伸長産物とともに混合液に添加される。標識特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは（1）標識標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプローブおよび（2）標識標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する2番目のオリゴヌクレオチドプローブを有する。特定の標識特異的オリゴヌクレオチド組のオリゴヌクレオチドプローブが、相当する標識標的ヌクレオチド配列上で互いに近接してハイブリダイズされた時、共にライゲーションされるのに適する。しかしながら、試料または添加された標識配列中に存在するその他のいかなるヌクレオチド配列にハイブリダイズした時にも、そのようなライゲーションを阻害するミスマッチが存在する。ライゲーション産物配列の存在はレポーター標識の検出により同定される。試料中の標的ヌクレオチド配列の量はその後、量既知の標識標的ヌクレオチド配列から生成されたライゲーション産物配列の量をその他のライゲーション産物配列の量と比較することにより決定される。
【００９６】
本発明は、多数の標的ヌクレオチド配列の中で、大量存在配列と1以上の1塩基変化、挿入、または欠失により異なる1以上の少量存在配列を同定するキットに関するものでもある。このキットは一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、および多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含む。
【００９７】
キットで提供される一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは（a）標的特異的部分を含む1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（b）標的特異的部分を含む2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。一次オリゴヌクレオチドプライマーは、相当する高および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイゼーションするために適しており、一次伸長産物の形成を可能にする。しかしながらプライマーは試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配列にハイブリダイズした時もそのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を阻害するミスマッチを有する。
【００９８】
キットで提供される二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは（a）標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する1番目のオリゴヌクレオチドプライマーおよび（b）標的特異的部分および5'上流二次プライマー特異的部分を有する2番目のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。二次オリゴヌクレオチドプライマーは一次伸長産物の相補鎖へのハイブリダイゼーションに適しており、大量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むまたは創生するが、1以上の少量存在標的を増幅する時には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含まないまたは創生せず、二次伸長産物の形成を可能にする。
【００９９】
キットで提供される三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは（a）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの1番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同一の配列を含む1番目の三次プライマーおよび（b）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの2番目のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同一の配列を含む2番目の三次プライマーを有する。三次オリゴヌクレオチドプライマーセットは全二次伸長産物を増幅するために使用されてもよい。
【０１００】
キットはまた多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。各組は（a）三次伸長産物特異的部分および検出可能なレポーター標識を含む1番目のオリゴヌクレオチドプローブ、および（b）三次伸長産物特異的部分を含む2番目のオリゴヌクレオチドプローブを有する。特定の組のオリゴヌクレオチドプローブは相補的三次伸長産物特異的部分上でお互いに隣接してハイブリダイズされると、ともにライゲーションされることに適する。しかしながら試料中に存在する他のいかなるヌクレオチド配列にハイブリダイズする時もそのようなライゲーションを阻害するミスマッチが存在する。
【０１０１】
キットはまた上述されたようにポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ制限酵素、および/またはリガーゼを含んでもよい。
【０１０２】
実施例
PCR条件下での類似体添加の最適化
実施例 1-類似体効率のためのオリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは0.2μmolスケールでシアノエチルリン酸アミダイド化学によりアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）394DNAシンセサイザーにより合成された。標準500ÅCPGカラムおよび試薬（アプライドバイオシステムズ）が以下の例外を除いては使用された。50塩基長のオリゴヌクレオチドが広孔1000ÅCPGカラム（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。蛍光色素FAMを5'末端に有するオリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有して、FAMリン酸アミダイド（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。5'リン酸塩を有するオリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有して、リン酸化試薬（グレンリサーチ（Glen Research））を用いて合成された。3'ブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドはY-スペーサーCPGカラム（グレンリサーチ）を用いて合成された。3'ヌクレオチド類似体であるQ5）2'-デオキシイノシン、Q6）6-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-cl[1,2] オキサジン-7-ワン]、Q7）2-アミノ-7-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-6-メトキシアミノプリン、を有するオリゴヌクレオチドが図5に示すように2'-デオキシイノシン-CPG、dP-CPGおよびdK-CPGを各々用いて合成された（グレンリサーチ）。Y部位にQ1、Q2およびQ18を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、Ponらの方法（Ponら「固相オリゴヌクレオチド合成用調節孔ガラスビーズ誘導体化（Derivatiztion of Controlled Pore Glass Beads for Solid Phase Oligonucleotide Synthesis）」、Biotechniques、6：768〜75（1988））によりQ1（Johnsonら「デオキシアデニノシン模倣1-（2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル）イミダゾール-4-カルボアミドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成および安定性（The Synthesis and Stability of Oligodeoxyribonucleotides Containing the Deoxyadenosine Mimic 1-（2'-Deoxy-Beta-D-Ribofuranosyl）Imidazole-4-Carboxamide）」、Nucleic.Acid Res.、25：559〜67（1997））、Q2（Bergstromら、Journal of the American Chmistry Society、117：1201〜9（1995））およびQ18（Zhangら、「ヌクレオベース類似体としてのアゾールカルボアミドの探索的研究：ピロール-3-カルボアミドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド2重鎖に関する熱的変性研究（Exploratory Studies on Azole Caroboxamides as Nucleobase Analogs：Thermal Denaturation Studies on Oligodeoxyribonucleotide Duplexes Containing Pyrrole-3-Caroboxamide）」、Nucleic.Acid Res.、26：2208〜15（1998））から合成されたQ1、Q2およびQ18由来CPGから合成された。
【０１０３】
実施例 2-PCRポリメラーゼおよび緩衝液
使用されたDNAポリメラーゼはAmpliTaq、AmpliTaq-ストーフル（Stoeffel）断片、AmpliTaq-蛍光シークエンシング（アプライドバイオシステムズ）、VentおよびVent（exo-）（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs））およびExpandポリメラーゼ混合物（Expand High FidelityキットのTaqおよびPfuポリメラーゼ混合物、ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））。使用された商業的に利用可能な緩衝液はAmpliTaqおよびExpand High Fidelityキットにて供給された。別の緩衝液CiNF、緩衝液G（f）は他所に記載（Dayら、Nucleic.Acids Res.（1999））。簡単にはCiNF反応は20mMクエン酸塩pH7.6、200μg/mlウシ血清アルブミン、2.5mM MgCl2、200μM dNTP（各）および16mM（NH4）2（SO4）または50mM酢酸カリウム、10％ホルムアミド、プライマー、および鋳型DNAを含む。下記に示す全てのPCRおよびLDR反応はパラフィンオイル下で実施された。
【０１０４】
実施例 3-ミスマッチ伸長効率
天然型塩基およびヌクレオチド類似体を含むプライマーは、コドン284を含むMspI部位に、MspI（CCGG）、TaqI（TCGA）、HhaI（GCGC）またはTaiI（ACGT）部位を有する合成2重鎖p53第7エクソン鋳型からの産物生成の効率を比較および測定するためにPCRにおいて使用された。MspI部位の各々の側上にプライマーの3'末端が各側に1塩基伸長して、プライマーは野生型配列にハイブリダイズした。図6Aを参照されたい。4種の各合成鋳型上で平行反応として8種の異なる類似体および4種の天然塩基が試験された。PCRは各ポリメラーゼ用のメーカーにより供給された緩衝液とともにストーフルTaqまたはTaq-蛍光シークエンシングポリメラーゼを用いて実施された。各プライマー10pmolおよび2重鎖鋳型20fmolおよび各dNTP 0.2mMおよび4mM MgCl2が使用された。平行反応は、94℃15秒間、65℃1分間の10、20、30、40および50PCRサイクルを実施した。効率および収量は6％アガロースゲル上で泳動され、臭化エチジウムで染色された試料より決定された。
【０１０５】
実施例 4-ミスマッチ変換産物シークエンシング
各類似体で最も効率よく増幅された産物が水で1000倍希釈された。希釈されたDNA産物は、以前のPCRと同一のポリメラーゼおよび緩衝液を用いて、ただし図6Aに示すように10pmolの「ジップコード（zipcode）」含有プライマーp53zip248（配列番号： 5 ）およびp53zip248R （配列番号： 6 ）を加えて、94℃15秒間、65℃2分間で20サイクル再増幅した。ジップコード配列はいかなる生物のDNA配列に対しても知られている配列類似性を示さないオリゴヌクレオチドである。ジップコードプライマーを用いた増幅は以前のPCRのジップコード含有産物を特異的に増幅することを意図している、すなわち（ジップコードを含まない）ほぼ同一の未変換DNAは増幅されず（ジップコードを含む）変換されたDNAのみが増幅されるであろう。変換産物は8％アガロースゲルで泳動され予測された大きさのバンドが切り出される。DNAはゲル薄片より0.45μmHVLPフィルター（ミリポア（Millipore））を通して30分間235Cマイクロ遠心分離機（フィッシャー（Fisher））内で遠心分離することで抽出される。変換産物を乾燥し、ABIダイターミネーターサイクルシークエンシング反応混合液中に、キットの指示（アプライドバイオシステムズ）に従いジップコードプライマーの1つとともに再懸濁した。等容量（各3μl）のシークエンシング反応物が、83％ホルムアミド（イーストマン（Eastman））、4mM EDTAおよび8mg/mlブルーデキストラン（シグマ）を含む色素混合物と一緒にされた。試料を7M尿素、10％アクリルアミドゲル（ゲルおよび泳動緩衝液中19：1ビス、0.6xTBE）にてABI373DNAシークエンサーで電気泳動した。データはABI373ADNAシークエンサーデータ解析ソフトウェア1.2.0版を用いて解析された。
【０１０６】
実施例 5-前変換段階を有する変換産物同定および有さない変換産物同定
変換忠実度を、9種の異なる合成鋳型を用いて、Q5、Q6およびQ7（実施例1を参照されたい）を含む3種のプライマーを用いた前変換ありおよびなしで試験した。前変換PCRは、ミスマッチプライマー伸長を避ける努力の中で、所望の天然型塩基プライマーを添加する前に、3'類似体プライマーを用いて実施された。50塩基対の2重鎖DNA鋳型は、MspI部位（CCGG）に相当する塩基を除いて、図6Bに示されているコドン248周囲の野生型p53配列を含んでいた。以下の配列はMspI部位において置換された。1）CCGG（野生型、配列番号： 2）、2）CTGG（配列番号： 17 ）、3）CGGG（配列番号： 18 ）、4）CAGG（配列番号： 19 ）、5）TCGA（配列番号： 20 ）、6）GCGC（配列番号： 21 ）、7）ACGT（配列番号： 22 ）、8）CAGT （配列番号： 23 ）、および9）GCGC（配列番号： 24 ）。前二次PCR反応（「前変換」）は、50fmol/μlのp53-248QN （配列番号： 3 ）およびp53-248QNRプライマー（配列番号： 4 ）およびCiNF緩衝液、緩衝液G（f）中のVent（exo-）、および10fmol/μlの2重鎖鋳型を用いたホットスタートにより実施された。前変換は94℃15秒間、55℃1分間、60℃1分間の2回のPCRサイクルを使用した。産物は4℃で保存された。変換反応は同一のポリメラーゼおよび緩衝液を含み、別の付加的な鋳型を含まない1μlの前変換反応物を用いて開始された。各反応は4組のp53zip248Nおよびp53zip248NR（N＝C（配列番号： 25 ）、T（配列番号： 9 ）、G（配列番号： 26 ）またはA（配列番号： 27 ））の1つを用い、各プライマー10pmolを必要とした。前変換なしの平行変換反応は、前変換反応液の分取の代わりに10fmolの合成2重鎖鋳型を加えることによりホットスタートを用いて開始された。PCRサイクルは以下の通りであった：94℃15秒間、55℃（1サイクルに付き＋1℃上昇）1分間、60℃1分間でにて5サイクル、その後94℃15秒間および60℃2分間を20サイクル。最終伸長は60℃5分間で実施された。ポリメラーゼは凍結融解を2度繰り返すことで失活された。産物は水に10倍希釈され、1μlを20μlのExpandポリメラーゼおよび緩衝液混合液に添加することにより再増幅された。PCRは12pmolのジップコードプライマーZtop（配列番号： 7 ）およびZbot（配列番号： 8 ）（図6）を用いて94℃15秒間および65℃2分間の20サイクル（低収率反応では30サイクル）にて実施された。LDRは、形成された変換産物を同定するため、以下に記載のように行われた。
【０１０７】
実施例 6-リガーゼ検出反応
リガーゼ検出反応は標準LDR緩衝液中で行われた（25mMトリスpH7.6、12mM MgCl2、65μg/mlウシ血清アルブミン、100mM KCl、10mMジチオトレイトール）。各20μl反応は、図6Cに示されるように約500fmolの2重鎖DNA（試料1μl）、500fmolの各識別プローブ（配列番号： 11 から配列番号： 14 ）、および750fmolの共通プローブ（配列番号： 15 ）を含んでいた。識別および共通プローブセットは予想変換産物上でLDRが実施されるように合成され、センス鎖のMspI部位に相当する塩基（Bi）において異なった（野生型ではB1B2B3B4＝CCGG）。識別プローブは野生型配列を有し-B1B2（-OH3'）にて終結する。識別プローブはB2部位に各々順にC、T、GおよびAを有する4種のプローブセットとして合成された。共通LDRプローブは、野生型配列が続けられる（5'PO4-）B3B4-を有し、5'塩基が識別プローブの3'塩基に隣接する形で鋳型にハイブリダイズした。識別プローブはMspI部位のB2でのエラー産物を同定するために3'末端塩基が異なっていた。簡単にはB2のみがモニターされた。LDRプローブは予想変換産物に対応した。例えば-CCGG-鋳型の-ACGT-への変換は-AC、-AT、-AGおよび-AAで終結する識別プローブおよび5'pGT-を有する共通プローブを必要とした。識別プローブは異なる長さの5'尾部および蛍光検出のためのFAM標識を有した。尾部長は異なるLDR産物のアクリルアミドゲル上での物理的分離を可能にし、それゆえLDR産物の同定を可能にした。
【０１０８】
LDR反応は5nmolのTthリガーゼを添加する前に、94℃にて1.5分間プレインキュベートされ、続いて94℃15秒間、65℃2分間の10回のLDRサイクルが実施され、最終的に94℃にて短時間保持された。反応物は冷却され-70℃にて保存された。LDR産物は7M尿素を含む10％アクリルアミドゲル上で、ゲルおよび泳動緩衝液に0.6xTBE（1xTBEは、90mMトリス塩、90mMホウ酸塩、2mMEDTA）を用いて分離された。データはABI373DNAシークエンサーをGenescan672ソフトウェアとともに用いて収集された。
【０１０９】
実施例 7-イメージ処理
ゲル画像はABI672解析ソフトウェアを用いて産生された。色素特異的イメージはアドビ、フォトショップ3.0（Adobe Photoshop3.0）で開かれ、切り取られ、サイズ調節され、グレースケールに変換された。グレースケールイメージはNIH Image 1.59で開かれ、白黒反転され、1D垂直バックグラウンドは減算された。バックグラウンド減算後のイメージは再度白黒反転され、強度差が容易に比較できるようにフォトショップにより疑似色が与えられた。色置換を除けば、相対的強度を保存するためにイメージの線形イメージ処理のみが行われた。
【０１１０】
初期の実験は3'末端にヌクレオチド類似体を含むプローブを使用する時にPCR産物を生成する効率を決定するために設計された（上記実施例を参照されたい）。配列の特定の場所である塩基を別の塩基に変換するために。8種の異なる類似体が4種の天然型塩基の2以上と対合するように設計された。ヌクレオチド類似体および4種の天然型塩基の1つをその3'末端に含むプライマー対が4種の異なる鋳型を増幅するために使用された（図6A）。各ヌクレオチド類似体または天然型塩基は、反対鎖の4種の天然型塩基と順番に誤対合（または対合）され、増幅はTaqストーフル断片またはTaq蛍光シークエンシングポリメラーゼのいずれかを用いて試みられた。相対的増幅効率は表1に示すように、臭化エチジウム染色アガロースゲル上で可視産物を生成するために必要なサイクル数により決定された。コドン284周囲のp53配列を含む50塩基対の合成2重鎖DNA鋳型は、示されているようにMspI部位を置換する4塩基により識別される。
【０１１１】
【表１】
Figure 0004601830
1
産物低収量
表1：3'天然型塩基およびヌクレオチド類似体プライマーを用いた伸長効率および変換。4種の異なる鋳型が、順にA,G、CおよびTと対合する3'塩基または類似体からのプライマー伸長を試験するために用いられた。相対的効率はTaqストーフル断片ポリメラーゼを用いて可視産物を生成するために必要なサイクル数により決定された。10サイクル、20サイクル（＋＋）、30サイクル（＋）、40から50サイクル（±）、産物なし（-）。天然型塩基のミスマッチプライマーの2産物がシークエンシングされた。一般的には各類似体において最も効率的に増幅された鋳型が短縮プライマーにより再増幅され、各類似体の反対側にどの塩基が書き込まれたかを決定するためにシークエンシングされた。ある1例（Q1）において高い収量を有する低効率伸長産物がシークエンシングのために選択された。いくつかの類似体に対する混合塩基の書き込み選好性が、最も頻度の高い産物を最初として示されている。
【０１１２】
Taqストーフル（stoeffl）断片およびTaq蛍光シークエンシングポリメラーゼは同程度の量の産物を生成した。完全対合した天然型塩基プライマーは10サイクルの後可視産物を生成したが、いくつかの類似体プライマーは50サイクル後も産物を全く生成しなかった。実際、高効率に増幅した類似体は反対鎖を最もよく「読み取る」ことができる類似体であった。図4を参照されたい。
【０１１３】
各類似体（天然型塩基対照と同様に）に対する1つの産物は再増幅され、表1に示すように、類似体の反対にヌクレオチド塩基を挿入するポリメラーゼの選好性を決定するためにシークエンシングされた。Q1、Q5、Q6、Q16およびQ18プライマーが検出可能な真の変換産物を生成したが、しかしながらQ5だけが真の変換産物のみほとんど独占的に産生した。どの1つの類似体も一般化された変換能力を有する「普遍的塩基」（Hillら「縮重ピリミジンおよびプリン塩基を含む合成オリゴデオキシリボヌクレオチドのポリメラーゼ認識（Polymerase Recognition of Synthetic Oligodeoxyribonucleotides Incorporating Degenerate Pyrimidine and Purine Base）」Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95（8）：4258〜63（1998））としては機能しなかった。予期しなかったことに、いくつかの産物は中央の4塩基にわたって読み取ることが困難である配列を有しており、PCR伸長中の1塩基挿入または欠失を示唆した。これはミスマッチした天然型塩基（以下を参照されたい）から生成された産物において特によく見られた。
【０１１４】
コンバーチドがミスマッチ伸長エラーを減少させる能力を試験するために前変換PCRサイクルが正確性に与える影響を評価した。天然型塩基変換プライマーのみを用いて増幅された鋳型から生成されたPCR産物が、特異的天然型塩基プライマーを用いた選択的増幅が続けられるコンバーチドを用いた初期の2回のPCRサイクルから生じる産物と比較された。これらのコンバーチドが最も効率的に伸長されることが示されていたので、前変換PCRはQ5、Q6、およびQ7類似体を含むプライマーセットを用いて実施された。PCR全体の正確性および3'ミスマッチプライマー伸長を改善するために、CiNF緩衝液、緩衝液G（f）が使用された（Dayら、Nucleic.Acids.Res.（1999））。変異型MspI部位を含む9種の異なる合成2重鎖鋳型（配列番号： 17 から配列番号： 24 ）は、3'類似体前変換プライマーを用いた前変換あり、または、なしで増幅された。図6A〜Bに示されるように、天然型塩基変換プライマーおよび3'類似体前変換プライマーの両方がMspI部位の外側の塩基CCGGを操作するように設計された。いくつかの変換は対照として機能することを意図した。これらの場合には鋳型の元々の塩基は類似体前変換後復原されるか、または全長完全対合プライマーを用いて決して変化されなかった。前変換反応は2サイクルのコンバーチドPCR産物が引き続く増幅のために鋳型として用いられ、一方合成2重鎖が非前変換PCRの開始物質として用いられたことを除いては、全ての段階は前変換および非前変換反応の間で同一に行われた。両方の場合において3'天然型塩基対が選択的に目的最終産物を増幅するために使用された。これらのプライマーは非ハイブリダイズジップコード配列を5'末端に含んでおり、図6Bに示すようにそれらは最終的には最終の20〜30PCRサイクルのプライマー結合部位として機能した。変換産物は図6CのLDRにより定量された
【０１１５】
図7は実験産物を示す。全体としては、天然型塩基ミスマッチ変換は図7A第9レーン、図7B第1、3、5、7、15および17レーンに示されるよう80％超の不正確な変換産物を生成したが、前変換はいくつかの変換の正確性および/または収量を改善できるであろう。一般的には前変換を用いても、転換を達成することは困難であった。G→CおよびA→C変換は、天然型塩基またはQ6プライマー（図7A第11〜14レーン）のいずれを用いても予測産物はほとんど生成されなかった。Q6前変換の使用はG→TおよびA→T変換産物の収量を改善した（図7B第11、13レーンの天然型塩基変換と第12および14レーンのQ6前変換と比較せよ）。塩基転位の場合、C→T変換はCXGG鋳型上で天然型塩基ミスマッチプライマーを用いた場合予期されなかった1塩基短縮のアーチファクトを産生したが（図7B第1、3、5、7、15および17レーン）、図7B第2、4、6、8、16および18レーンに見られるようにQ6前変換を用いると正確な産物が生成された。加えて図7A第9および10レーンに示されるようにQ6プライマーは予測T→C変換産物の収量を実際改善した。対照は予測どおり実施された。全てのC→CおよびT→T非変換反応は図7A第1、3、5、7、15および17レーン、および図5B第9レーンに見られるようにコンバーチドなしで正確に働き、相当するQ6前変換産物は、図7A第2、4、6、8、16および18レーン、および図7B第10レーンに示されるように元々の配列に復元された。要約するとQ6前変換は天然型塩基のC→TおよびT→C変換により産生されるアーチファクトを減少または消失させ、一般的に塩基転位を促進した。転換は部分的に成功しただけであった。G→TおよびA→T変換は前変換により改善されうるであろうが、G→CおよびA→C変換は達成され得ないであろう。
【０１１６】
見かけ上正確な変換が、試みられたC→GおよびC→A転換に関して観察されたが、しかしながら、注意深く設計された対照鋳型はこれらの「変換」がアーチファクトであることを示した。C→GおよびC→A変換は中央にCpGジヌクレオチドを含む鋳型に対して成功したようであった（図8Aおよび図8B、第1〜3、13〜21レーン）。しかしながら同一の最終変換産物は中央CpGジヌクレオチドを欠く他の鋳型を用いても観察され、これはもう明らかに不正確である。例えばGCGC産物は、予測産物がT、GまたはAを2番目の部位に含んでいたであろう反応におけるG変換中に生じた（図8A第4〜12レーン）。またACGT産物は、予測産物が2番目の部位に非C塩基を挿入していたであろう変換中に生じた（図8B第4〜12レーンおよび22〜27レーン）。認識部位の外側の塩基を変更するためのミスマッチプライマーは中央ジヌクレオチドには到達しなかったが、これらの塩基は変更された。「成功した」変換が予期した機構を通じて生じたかは疑わしく、したがって偶然のアーチファクトを表している。LDR産物の収量は効率的なPCRにもかかわらず2つのパリンドローム鋳型では低かった（図8Aおよび図8B両方の第22〜27レーン）。これらの変換反応産物は、現在のLDRプローブセットでは同定することができない大きな割合の挿入または欠失をおそらく含むであろう。要約すると、C→G変換はQ5（図8A、第5、8、11および23レーン）および天然型塩基G（図8A、第4、7、10および22）の両者により部分的に達成された。しかしながら、前変換は変換を改善するようではなかった。C→G変換は配列依存性を示した。
【０１１７】
前変換研究の結果は、天然型塩基変換においてエラーは多く見られ、しかし前変換でのQ5 、Q6およびQ7コンバーチドの使用はある場合にポリメラーゼエラーを減少させた。変換反応の点からは塩基転位は転換より容易に達成される。これは以前の知見と一致している。Newtonらは3'末端にC-T、A-A、およびT-Tミスマッチ（転換）を有するプライマーにおいて、プリン-ピリミジンミスマッチ（塩基転位）を有するプライマーよりも伸長において多くのエラーを観察した（Newtonら「DNAにおける全ての点突然変異の分析。増幅抵抗性変異系（ARMS）（Analysis of Any Point Mutation in DNA.The Amplification Refractory Mutation System（ARMS））」Nucleic.Acids Res.17（7）：2503〜16（1989））。ここでは、ピリミジン-ピリミジン変換は通常、特にコンバーチドを使用した場合、予測産物を生成した。プリン-ピリミジンおよびピリミジン-プリン変換の場合は不正確な産物がしばしば生成された。結果の要約が以下の表2に示される。図9に示されるように、不正確な変換産物の形成は部分的には鋳型上に誤整列された部位に対するプライマー3'ヌクレオチド（または類似体）の一時的な塩基対滑りにより説明され得る。結果として、ミスマッチに続く配列は元々の鋳型には相補的ではない。初期のシークエンス実験中に類似体直後の不解読配列が観察されたことはこの仮説と一致する。パリンドローム産物、特にCpGジヌクレオチド自身は滑りおよび伸長を起こしやすい。パリンドローム産物は非パリンドローム鋳型から頻繁に産生された。これらのアーチファクトはPCR緩衝液中に10％ホルムアミドが存在することにより、おそらく誤整列構造を不安定化することを通じて、減少された。最終的にはヌクレオチド類似体は天然型塩基に比べてより少ないアーチファクトを生じた。異なる類似体は、おそらく塩基対合および滑り誤整列安定化の相対的な能力にしたがって、異なる種類および量のアーチファクトを産生した。したがって鋳型とよく塩基対合していない類似体からのポリメラーゼ伸長が遅いならば、滑りにより生成される強固な一時的な塩基対からの伸長は、弱い塩基対合の3'末端塩基からの伸長を上回ることができるであろう。
【０１１８】
【表２】
Figure 0004601830
aコドン248周囲のp53配列を含む50塩基対の合成2重鎖DNA鋳型は示されたMspI部位を置換する4塩基により識別される。
表2：最も効果的な変換のために、図5および6を参照されたい。9種の2重鎖DNA鋳型が変換反応に使用された。各々は、MspI部位が異なる4種の塩基配列（B1B2B3B4）で置換されたことを除いては、コドン248周囲のp53と同一の配列を含んでいた。B1およびB4-（反対鎖）は、天然型塩基プライマーを用いたPCRにより直接、または天然型塩基プライマーによるPCRが続くヌクレオチド類似体プライマーによる前変換PCRのいずれかにより同時に順々にC、T、GおよびAに変換された。非変換対照反応では変換産物は元々の鋳型と同一である。天然型塩基は対照反応、および前変換が変換を改善しなかった例を示すために使用された。前変換はCからTへの変換を促進するためにQ6が使用され、CからAへの変換を促進するためにQ5およびQ7が使用され実施された。変換プライマーはB1およびB4を決定する。（理想的には変換後変化しない）B2における意図しない塩基変化を検出するためにLDRが実施された。前変換により改善された変換は使用されたヌクレオチド類似体により示された。対照反応において天然型塩基プライマーと同等に効果的である前変換もまた使用された類似体により示された。低い変換正確性は多くのB2エラーに繋がる。主要なB2エラー産物は同定され（例えばerrCはB2部位がCであることを示す）、正しい産物が存在しないことは変換方法が失敗であったことを示した（Xは正しい産物なし）。おそらく偶然の機構により形成された見かけ上正しい産物は指摘されている（FPは偽陽性）。
【０１１９】
以前議論されたようにPCR-RFLPは稀な変異を同定するために幅広く用いられてきた。この技術の限界は野生型または変異型鋳型のいずれかにおいて制限酵素切断部位を生成するように改変されうる変異を生じる偶然性に依存していることである。本研究方法に課せられた2番目の限界は、3'末端ミスマッチプライマーからの伸長はエラーを生じやすいことが知られているので、これらプライマーの使用をさけなければならないことである。現在までのところ成功した試みの大多数は3'末端ミスマッチプライマーの使用をさけるために分断型パリンドローム制限酵素切断部位を使用した。K-rasおよびH-rasを引き起こすガンにおける変異は、分断型パリンドローム酵素XmnI（Kumarら、「1細胞レベルでのガン遺伝子検出（Oncogene Detection at the Single Cell Level）」Oncogene、3（6）：647〜51（1988））、AlwNI（Andersonら、「頭頚部ガンにおけるRASガン遺伝子変異の存在率（Prevalence of RAS Oncogene Mutation in Head and Neck Carcinoma）」、J.Otolaryngol. 21（5）：321〜6（1992））、およびBstNIまたはMvaI（Urbanら「PCR/RFLP解析によるC-Ki-Ras変異の検出および膵腺ガン診断」（Detection of C-Ki-Ras Mutation by PCR/RFLP Analysis and Diagnosis of Pancreatic Adenocarcinomas））、J.Natl.Cancer.Inst.85（24）：2008〜12（1993）；およびRonaiら、「定量的濃縮PCR（QEPCR）、K-Rasガン遺伝子変異超高感度検出法（Quantitative Enriched PCR（QEPCR）、a Highly Sensitive Method for Detection of K-Ras Oncogene Mutation）」、Hum.Mutat.10（4）：322〜5（1997））を用いたPCR/RFLPにより105に1個の感度で検出された。これらのPCR-RFLP実験およびその他（Hattoriら、「DRD2 セリン311システイン多型および精神分裂症のミスマッチPCR RFLP検出（Mismatch PCR RFLP Detection of DRD2 Ser311Cys Porymorphism and Schizophrenia）」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、202（2）：757〜63（1994）；Beutlerら「「ミスマッチ」PCRによるグルコセレブロシダーゼNt1226変異の簡単な検出（The Facile Detection of the Nt 1226 Mutation of Glucocerebrosidase by “Mismatched” PCR）」、Clin.Chim.Acta.、194（2-3）：161〜6（1990）；Hinogoraniら「1型アンジオテンシン2受容体遺伝子のC1166変異体の簡単分子分析（A Simple Molecular Assay for the C1166 Variant of the Angiotensin II Type 1 Receptor Gene）」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、213（2）：725〜9（1995）；Kuwataら、J.Allergy.Clin.Immunol、96（6Pt2）：1051〜60（1995）；Nishiwakiら、「ミスマッチPCR-RFLPを用いた早期発症アルツハイマー病を有する患者のAPP遺伝子の変異スクリーニング（Mutational Screening of APP Gene in Patients with Early-Onset Alzheimer Disease Utilizing Mismatched PCR-RFLP）」、Clin.Genet.49（3）：119〜23（1996）；Ishiharaら「サルコイドーシスにおけるTAP2遺伝子の対立遺伝子変異解析（Analysis of Allelic Variation of the TAP2 Gene in Sarcoidosis）」、Tissue Antigens、49（2）：107〜10（1997））は3'末端ミスマッチを避けているが、しかしながらほとんどのガン変異は、例えばCpGジヌクレオチド等の分断型パリンドロームに変換することができない配列中に存在する。もし連続した認識配列が分断型パリンドローム認識配列と同じ位少ないエラーで導入することができるならば、大きな割合の変異が検出標的になるであろう。現時点では、連続した制限酵素切断部位は、エラーを起こしやすい末端3'ミスマッチプライマー伸長により導入されている。オデール（O'Dell）らはミスマッチPCRを用いてCpGジヌクレオチドに異なる制限酵素切断部位を導入するための一般的方法を試験した（オデール（O'Dell）ら、「2つのミスマッチプライマーを用いたあらゆるCpGジヌクレオチドへのTaqI制限酵素切断部位のPCR誘導（CpG-PCR）（PCR Induction of a TaqI Restriction Site at Any CpG Dinucleotide Using Two Mismatched Primers（CpG-PCR））」、Genome Res.6（6）：558〜68（1996））。ヒトLDL受容体遺伝子の4つの異なるCpGジヌクレオチドの外側の塩基がTaqI（TCGA）、MspI（CCGG）、またはRhaI（GCGC）部位を創生するように変化させられた。これらの標的ではTaqI部位が3'Tミスマッチプライマーにより生成に成功した。その方法はホモ接合体およびヘテロ接合体の個人を検出可能であった。しかしながら各対立遺伝子を代表する産物の比は、生殖細胞変異において予測されるように、同じではなかった。Tミスマッチ変換がTaqI部位を創生できなかったいくつかの例がここに示されている。したがってその方法は配列依存的である。オデール（O'Dell）らはCおよびGミスマッチ変換が失敗したことを発見した。これらの結果は、より強い塩基対合が鋳型上のプライマー滑りの安定化をおそらく介してミスプライミングに繋がるというオデール（O'Dell）の結論と一致する。Gotodaらは、T→C塩基転位を産生するために3'C-Aミスマッチ伸長によりMaeII部位（ACGT）を導入するためにPCR-RFLPを使用することに成功したと主張する（「遺伝子増幅および制限エンドヌクレアーゼ消化によるヒトリポタンパク質リパーゼ遺伝子の3つの分離DNA多型の検出（Detection of Three Separate DNA Polymorphisms in the Human Lipoprotien Lipase Gene by Gene Amplification and Restriction Endonuclease Digestion）」、J.Lipid.Res.33（7）：1067〜72（1992））。Athmaらは2種類の対立遺伝子を識別するための制限酵素切断部位を創出するために3'末端ミスマッチプライマーのPCR伸長を用いた（Athmaら「運動失調毛細管拡張症座位に連鎖する1塩基多型はミスマッチPCRにより検出される（Single Base Polymorphism Linked to the Ataxia-Telangiectasia Locus is detected by Mismatch PCR）」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、210（3）：982〜6（1995））。G-TミスマッチはA→G塩基転位を通じてMvaI部位（CC A/T GG）を産生した。A→G変換の成功は本発明の方法に従って天然型塩基ミスマッチを用いて実施されたが、天然型塩基プライマーによるT→C変換が困難であることに直面した。塩基転移は転換よりも容易に達成することができるが、正確な産物の収量は配列依存的でありうる。他者もまたPCR-RFLPが偽陽性結果を生じる可能性があることを発見した（Hodanovaら、「2人のゴーシェ病患者におけるミスマッチPCR/RFLP法によるN370S変異状態の不正確な指定（Incorrect Assignment of N370S Mutation Status by Mismatched PCR/RFLP Methods in Two Gaucher Patients）」、J.Inherit.Metab.Dis.、20（4）：611〜2（1997））。この中でのリガーゼ検出反応の使用は生成された誤伸展産物の正確な量を決定することを可能にする。
【０１２０】
3'天然型塩基およびヌクレオチド類似体を含むプライマーからのポリメラーゼ伸長の正確性が測定された。天然型ミスマッチプライマー伸長は、ある与えられた配列においてRFLP解析のための制限酵素切断部位を創生するための一般的な方法としては使用することができないことを結果は示していた。プライマー滑りがミスマッチプライマー伸長においてエラーを産生する重要な機構であるようである。この原因のエラーはいくつかの対立遺伝子特異的PCRおよびその他の高感度変異検出法に大きな影響を与えるかもしれない。変換を促進するヌクレオチド類似体のさらなる開発および試験により、ミスマッチプライマー伸長はほとんどアーチファクトなしに目的の変異を効率的に導入することができる技術となるかもしれない。いくつかのヌクレオチド類似体がミスマッチプライマー伸長を改善することが示された（表3、下を参照されたい）。3'ミスマッチ伸長のさらなる改善が、転換で見られた高頻度の前後関係依存性エラーを最小限にするために必要とされるであろう、そしてそれが感度の改善およびより広い範囲のPCR/RFLPを基礎とする変異検出につながるであろう。
【０１２１】
【表３】
Figure 0004601830
表3：変換戦略の概略。Qnコンバーチドは、天然型塩基プライマーによる最終変換の前に示されたコンバーチドを用いた前変換が必要であることを示す。いくつかの場合には別の付加的なコンバーチドまたは天然型塩基のみを用いて目的の変換を生ずることができる。
【０１２２】
実施例 9-PCR/RE/LDR用オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは0.2μmolスケールでシアノエチルリン酸アミダイド化学によりアプライドバイオシステムズ394DNAシンセサイザーにより合成された。標準500ÅCPGカラムおよび試薬（アプライドバイオシステムズ）が以下の例外を除いては使用された。オリゴヌクレオチド50塩基長が広孔1000ÅCPGカラム（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。蛍光色素FAMを5'末端に有するオリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有してFAMリン酸アミダイド（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。5'リン酸塩を有するオリゴヌクレオチドは15分間の結合段階を有してリン酸化試薬（グレンリサーチ）を用いて合成された。3'ブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドは3'-スペーサーCPGカラム（グレンリサーチ）を用いて合成された。3'ヌクレオチド類似体6-（2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2] オキサジン-7-ワン]（Q6）はdP-CPGカラム（グレンリサーチ）を用いて合成された。
【０１２３】
実施例 10-PCR/RE/LDR用PCRポリメラーゼおよび緩衝液
使用されたポリメラーゼはAmpliTaq（アプライドバイオシステムズ）、VentおよびVent（exo-）（ニューイングランドバイオラボ）、およびExpandポリメラーゼ混合物（Expand High FidelityキットのTaqおよびPwoIポリメラーゼ混合物、ベーリンガーマンハイム）であった。使用された商業的に利用可能な緩衝液はAmpliTaqおよびExpandキットにて供給された。トリスpH9.1（pH値は23℃にて1M原液を用いて測定された）、トリシンpH8.7、EPPS（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-3-プロパンスルホン酸）pH8.4、およびクエン酸塩pH7.6（シグマ）が選択可能なPCR緩衝液として使用された。別途記載されない場合、各20μl反応は20mMトリス、トリシン、またはクエン酸塩、200pg/mlウシ血清アルブミン、2.5mMMgCl2、200μM dNTP（各）および16mM（NH4）2SO4または50mM酢酸カリウムを含んでいた。10％濃度のホルムアルデヒドが示されたように使用された（実施例11、下を参照されたい）。PCR緩衝液は、必要ならばホルムアミド、dNTPsおよびオリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型DNAの添加を必要とする10％ストックとして調整された。
【０１２４】
実施例 11-酵素緩衝液表記法
試験用PCR緩衝液は、一種類以上の成分を含んでいることが分かるように名前を付けてある。トリス/酢酸カリウム＝緩衝液A；トリス/硫酸アンモニウム＝緩衝液B；トリシン/硫酸アンモニウム＝緩衝液D；EPPS/硫酸カリウム＝緩衝液E；EPPS/硫酸アンモニウム＝緩衝液F；およびクエン酸/硫酸アンモニウム＝緩衝液G各成分の濃度は上記されている。
【０１２５】
実施例12-ゲノムDNA由来のp53エキソン7の増幅
コドン248の回りにあるp53エキソン7部分を、図10に示したように増幅した。上流プライマーは、以下の配列番号:35:
5'-GCCTCATCTTGGGCCTGTGTTATC-3'
に相当する塩基配列をもっており、その前に存在するイントロンとハイブリダイズし、下流プライマーは、以下の配列番号:36:
5'-GTGGATGGGTAGTAGTATGGAAGAAATC-3'
に相当する塩基配列をもっており、エキソン7の中でハイブリダイズする。全体にわたって記載のあるPCR、制限酵素分解、およびライゲーションの段階はすべて、GeneAmp PCR System 2400（パーキン-エルマー（Perkin-Elmer）社製）を用いて行なわれた。いくつかの緩衝液および酵素は、実施例10および11に示されている通りに使用した。ゲノムDNAからのp53エキソン7の増幅は、50 ngのDNA、2.5 mMの各dNTP、および12.5 pmolの各プライマーを、ポリメラーゼを含まない1×緩衝液の中に含む20μlの反応混合液から開始させた。この反応混合液をパラフィンオイルで覆い、必要なユニット数のポリメラーゼを導入するために、1×緩衝液中に希釈した1μlのポリメラーゼを加えてホットスタートを行うために、94℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした。エキソン7セグメントを、94℃で15秒間、65℃で2分間というサイクルを40サイクル増幅し、最後のサイクルが終わったところで、さらに65℃で5分間増幅した。この処理手順とは異なるPCR増幅を示した通りに行なった。
【０１２６】
実施例 13-PCR/RE/LDR：フィデリティー・アッセイ法
コドン248のMspI部位（CCGG）の中央にある2塩基対を挟む変換プライマー対（conversion primer pairs）を用いて、鋳型を増幅した（図11B）。一反応当たり10 fmolのPCR増幅したp53エキソン7または野生型合成二本鎖鋳型のいずれか、PCR緩衝液、およびプライマーを含むチューブを調製した。並行反応においては、248番目のコドンのMspI部位に代えてCGGGという配列をもつ、50 pbの合成二本鎖マーカー鋳型（MK）を、10-3、10-4、10-5および0というモル比で野生型鋳型に加えた。CiNF緩衝液、緩衝液G(f)に含まれているVent(exo-)ポリメラーゼ以外の成分をすべて含む反応液を94℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした。1μlのポリメラーゼを94℃で加えて「ホットスタート」を行なった。予備変換を行なう場合には、プライマーp53-248Q6およびp53-248Q6Rを各々500 fmolとともに、94℃で15秒間、55℃で1分間、60℃で1分間というサイクルを2サイクル行なった。その後、1 pmolのp53Taq248Tプライマーとp53Taq248TRプライマーを加えた。予備変換を行わないときには、反応液には、プライマーp53Taq248T（配列番号：30）とp53Taq248TR（配列番号： 31 ）を各々1 pmolずつか、対照用プライマーp53Msp248Cおよびp53Msp248CRを加えた。予備変換を行なったり、行わなかったりして反応を行なった後、予備変換PCRを以下のようにして行なった。すなわち、94℃で15秒間、55℃＋1°/cyc 1分間（温度勾配）、60℃で1分間というサイクルを5サイクル、次に、94℃で15秒間、60℃で2分間というサイクルを20サイクル、そして、最後に、60℃でさらに5分間置いた。温度勾配を3サイクル行なった後、10 pmolの長いジップコード（zipcode）変換プライマーp53zip248T （配列番号： 9 ）およびp53zip248TR（配列番号： 10 ）、またはp53zip248Cまたはp53zip248CRを加えた。変換後、20サイクルの「ジップコード」PCR（後述）の間、野生型DNAを定期的に分解した。ポリメラーゼは、凍結融解を2回行なって不活性化した。最後に、元の鋳型の関与なしに変換産物を検出するためにLDRを行なった（非変換対照用反応を除く）。
【０１２７】
実施例 14-PCR/RE/LDR：「ジップコード」PCR
野生型配列、または野生型変換産物を制限酵素消化によって除去した。適当な制限エンドヌクレアーゼを反応用チューブに加え、効率的な消化を促すために必要とされるMgCl2をさらに添加した。MspI消化は、クエン酸緩衝液を使用するとき以外はMgCl2を加えずに37℃で15分間行なった。TaqI消化は、140 mM MgCl2に希釈した1μlの酵素を加え、6 mMのMg2+存在下、65℃で30分間行なった。10 pmolの「ジップコード」プライマーZtop（配列番号： 7 ）とZbot（配列番号： 8 ）（図6B）を含む20μlのPCR反応液に1μlの10×希釈液を加えたものから、制限酵素消化しない変換産物を再増幅した。これらのジップコードプライマーは、それぞれ、試料中に存在するゲノム配列とは配列が似ていないDNA配列を含む。そのため、ジップコードプライマー配列を含むプライマーを用いた以前のPCR産物のみが効率的に増幅される。Expandポリメラーゼ混合液および緩衝液を用いて、変換産物を増幅した（実施例10参照）。最初にRE消化した後、ジップコードPCR再増幅を行なった後、以下のようにして再消化を行なった。すなわち、反応液を94℃で少なくとも1.5分間プレインキュベートした後、RE消化した試料（10倍希釈液の1μl）0.1μlを20μlの反応液に加えてホットスタートを開始させた。94℃で15秒間、60℃で2分間というサイクルを10サイクル行なった。上記の記載通り、ジップコードPCR増幅産物を再消化した。
【０１２８】
実施例 15-PCR/RE/LDR：リガーゼ検出反応
リガーゼ検出反応は、標準的なLDR緩衝液（25 mMトリスpH 7.6、12 mM MgCl2、65μg/mlウシ血清アルブミン、100 mM KCl、および10 mM DTT）の中で行なった。各20 μlの反応液には、約500 fmolのdsDNA（1 μlのPCR試料）、図11Cに示す500 fmolの各識別プローブ（配列番号： 11 から配列番号： 14 ）、および750 fmolの汎用プローブ（配列番号：15）が含まれている。期待される変換産物、すなわち、MspIの位置でのCNGGまたはTNGAへの変換を検出するために識別プローブおよび汎用プローブのセットを合成した。3'-スペーサーC3 CPGカラムを用いて汎用プローブを合成し、リン酸化試薬を用いて、カラム上で5'末端をリン酸化した。各セットの識別プローブは、3'末端側の塩基が変えてあり、その位置にある塩基を調べられるようになっている。識別プローブには、さまざまな長さの5'末尾が付いており、また、蛍光検出するためにFMAで標識されていた。5'末尾の長さによってプローブを同定し、アクリルアミドゲル上で、異なったLDR産物を物理的に分離することができた。
【０１２９】
LDR反応液を94℃で1.5分間プレインキュベートしてから、ミネラルオイル層の下に、5 nmolのTthリガーゼ酵素を添加した。94℃で15秒間、65℃で2分間という10LDRサイクルを用いた。そして、反応液を94℃で保持した後、氷上で急冷して-70℃で保存した。ゲルおよび泳動緩衝液に使用する0.6×TBE（1×TBEは、90 mMトリスベース、90 mMホウ酸、2 mM EDTAを含む）とともに7 Mウレアを含む10％アクリルアミドゲル上でLDR産物を分離した。ABI 373自動化DNAシークエンサーと、アプライドバイオシステムズ・ジーンスキャン672ソフトウエア（Applied Biosystems Genescan）（GS回収およびGS解析）を用いてデータを集めた。
【０１３０】
実施例 16-PCR/RE/LDRに関する画像処理
ABI GS解析ソフトウエアによって、未加工のゲル図を作成した。染色特異的な図をアドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）3.0で開き、トリミングし、大きさを変えてから、グレイスケールに変換した。グレイスケール画像をNIHイメージ（NIH Image）1.59で開き、反転させて、1D垂直方向の背景を除去した。選択的には、NIHイメージ（NIH Image）1.59は、補正された2-D画像から3-Dプロットを作成することができた。バックグラウンドを補正した画像を再反転させ、比較がしやすくなるよう、カラーテーブルを入れ換えて微妙な濃度の違いをつけることによって、フォトショップでシュードカラーを付けた。色の置換以外には、相対的な濃度を保存するために、直線画像の処理を行なっただけである。
【０１３１】
実施例 17-PCR/RE/LDR最適化
図10では、p53遺伝子のコドン248にあるMspI部位（CCGG）の中で生じた低量の変異を検出同定するために、PCR/RE/LDRが開発された。最初のPCRで、ゲノムDNAからエキソン7が増幅されたことが、図10Aに示されている。この産物は、MspI部位の中央にあるCpGジヌクレオチドを増幅する二回目のPCR行なうための鋳型として役立つ。前から存在する部位をもたない配列の中に制限酵素部位を作出するために、ミスマッチプライマーを用いて、CpGジヌクレオチドに隣接する一個以上の塩基を変更する。この結果、例えば、図10Bに示すように、制限酵素（NCGN→TCGA）TaqI部位を作出する変換PCRがもたらされた。連続的なII型制限酵素部位を導入するための一般化した方法では、変換PCRプライマーは必ず3'末端にミスマッチをもつ。好ましくない自然の塩基ミスマッチによって、隣の部位に間違った塩基が挿入される（O'Dellら、Genome Res., 6(6):558-68(1996)；およびEikenら、「PKU変異を診断するための天然のおよび増幅によって作出した制限酵素部位（Application of Natural and Amplification Created Restriction Sites for the Diagnosis of PKU Mutations）」、Nucleic Acids Res., (1999)）のを回避するために、3'ヌクレオチドアナログのプライマーによる予備変換を行なう。しかし、3'アナログプライマーによる伸長によって、縮退産物のプールができる（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999)）。したがって、この予備変換段階の後、自然の塩基プライマーを用いて、所望の産物を選択的に増幅する。
【０１３２】
並行非変換対照反応を行ない、また、予備変換を行なったときと行わないときの真の変換反応を行なうことによって、PCRエラーと比較したときのミスマッチ変換によるエラーを見積もった。非変換反応産物は、MspI部位（CCGG）を保持していた（図10A参照）が、一方、変換産物はTaqI部位（TCGA）を導入していた（図10B参照）。PCR/RE/LDRの段階はすべて、プライマーと制限用エンドヌクレアーゼ（MspIまたはTaqI）だけを変えつつ同じ条件下で行われた。どちらの場合にも、切断できないDNAが選択的に増幅された。野生型DNAを制限酵素消化によって選択的に除去するときには、ほぼ100％野生型である、試料中のDNAの最初の量に対して、産生されたDNAで不正確な配列をもつものの割合を決定する必要がある。既知の画分であるマーカー（MK）DNA存在下で並行反応を行なった。MK DNAは、MspI部位が1塩基変化している（CGGG）ため、MspIで切断できなくなっている。C→Gの転換は、ポリメラーゼのエラーによっては起こりにくい。MKの標準曲線によって、LDRで検出した変異の定量が可能になる。図10Cは、マーカーを用いた変異配列のLDR定量法を示すものである。PCRエラーを最小限にするためのPCR条件（非変換反応に見られる）およびミスマッチ伸長エラー（変換反応で見られる付加エラー）を調べた。
【０１３３】
ゲノムDNAの標的配列増殖、変換、およびPCR/RE/LDRの再増殖段階では、異なったポリメラーゼ特性が必要となるため、校正作用をもつポリメラーゼ、をもたないポリメラーゼ、さまざまなポリメラーゼを調べた。PCR/RE/LDR全体にわたって、LDRで測定される塩基の変化を最小限に抑えることが必須であるため、最高の忠実度を保つためには校正作用をもつポリメラーゼを選ぶのが論理的であると考えられよう（Keohavongら、PCR Meth. Appl., 2:288-92 (1993)）が、これらのポリメラーゼは、ミスマッチプライマー伸長によって、変換に干渉する可能性がある。したがって、非校正作用ポリメラーゼの忠実度を最大にするPCR条件を見つけだすべきである（Keohavongら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86）23):9253-7)。
【０１３４】
まず、PCR/RE/LDRを最も感度のよいアッセイ法として用いて、処理全体を通じて最高の忠実度を維持するPCR条件を判定した。エラーの主要な原因は以下のものと予想される：1）ポリメラーゼによる取り込み間違い、および2）鋳型DNAの分解。PCR緩衝液のpHを上げると、おそらく、DNA鎖の切断をもたらす脱プリン化が抑えられるため、ロングPCRが改善された（Barnes、「ラムダバクテリオファージ鋳型からの35-KbまでのDNA増幅法で、高忠実度かつ高収量が得られる方法(PCR Amplification of up to 35-Kb DNA with High Fidelity and High Yield from Lambda Bacteriophage Templates.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(6):2216-20 (1994); Chengら、「クロニーングした挿入配列およびヒトのゲノムDNAからの長いDNA標的配列の効果的な増幅(Effective Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA)」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(12):569-9 (1994);およびSang、「非常に長い配列の忠実度が高いポリメラーゼ連鎖反応による部位特異的変異誘発(Generation of Site-Directed Mutagenesis by Extralong, High Fidelity Polymerase Chain Reaction)」、 Anal. Biochem., 233(1):142-4 (1996))。pHを高くすると、鋳型の損傷を抑えることができるが、高pHは、ポリメラーゼの忠実度に悪影響を与えることも知られている（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度に忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA Polymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Eckertら、「DNAポリメラーゼの忠実度とポリメラーゼ連鎖反応（DNA Polymerase Fidelity and the Polymerase Chain Reaction）」、PCR Methods Appl. 1(1):17-24 (1991); およびClineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR忠実度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996)）。したがって、他に、トリシン、EPPS、およびクエン酸の各緩衝液も調べたが、これらは、pKaが7から8の範囲で、|ΔpKa|がトリスよりも低い。ほとんどのPCR忠実度とロングPCRの研究にはトリスを使用するが、トリスは、鋳型の完全性を維持するために、高い温度では僅かにアルカリ性pHであるべきで、ポリメラーゼの忠実度を維持するために、伸長温度ではpHが中性であるべきという二重の制約を満たすことができない。トリスに代わる、より低い|ΔpKa|をもつ緩衝液の使用を目指す研究者もいた（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度に忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA Polymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Eckertら、「DNAポリメラーゼの忠実度とポリメラーゼ連鎖反応（DNA Polymerase Fidelity and the Polymerase Chain Reaction）」、PCR Methods Appl. 1(1):17-24 (1991); Brailら、「PCR-PPCPAにおける、改良されたポリメラーゼの忠実度(Improved Polymerase Fedility in PCR-PPCPA)」、Mutat. Res., 303(4):171-5 (1993)）。本発明の緩衝液条件を最適化させる目的で、緩衝用化合物以外は同じ成分を含むPCR緩衝液を作製して、PCRに対する緩衝液特異的な効果を調べた。硫酸アンモニウムを含む試験用PCR緩衝液のセットを作製し、また、別に酢酸カリウムを含むセットを作製して、塩の効果を調べた。純粋な溶液の中、および1×PCR緩衝液混合液の中で各緩衝液のΔpKaを測定した（データは示さない）。これらの試験結果は、小さな定数（.005 pHユニット/℃）で補正することによって、純粋な緩衝液について公表されているΔpKa値と一致していた（Good、生物学研究に役立つアミン緩衝液（Amine Buffers Useful for Biological Research））、Fasman編「生化学および分子生物学のハンドブック（Handbook of Biochemistry and Molecular Biology）」、オハイオ州クリーブランド（Cleveland, Ohio）: CRCプレス社（CRC Press Inc）、 pp. 367-369 (1976); およびBlanchard、「酵素用緩衝液(Buffers for Enzymes)」 Meth. Enzymol., 104:404-14 (1984)）が、これは、pH検出針そのものに温度依存性があるためであろう。各試験用PCR緩衝液のpHを調整して、65℃でほぼ中性のpHになるようにした。しかし、1×PCR緩衝液では、純粋な緩衝液に較べるといくらか異なったΔpKaをもっていた。例えば、緩衝液Bである1×TsNでは、ΔpKa＝-.033/℃であるのに対して、100 mMトリスでは、-.030/℃、また、、緩衝液Cである1×TcKでは、ΔpKa＝-.022/℃であるのに対して、100 mMトリシンでは、-.025/℃である。
【０１３５】
トリス、トリシン、EPPSを含む試験用PCR緩衝液を用いて、p53の248番目のコドンにあるMspI部位（CCGG）に変換を起こさないことで、PCRの忠実度を調べた（図12）。本実験における目的は、さまざまな緩衝液とポリメラーゼ酵素を用いて、PCRの誤差率を調べることであった。エラーが起きると、選択された制限酵素によって切断できなくなる鋳型ができるため、このエラーが起きた鋳型が、本当の変異DNAに沿って増幅されるにつれて、偽陽性が蓄積され続ける。これによって、エラーを最小限に抑えつつ、増幅を行なうために必要な条件が設定できた。ゲノムDNAからのp53エキソン7の予備増幅と、「変換」段階の両方において、同一のポリメラーゼと緩衝液のセットを用いた。既に述べたように、「変換」段階では、中央のCpGに隣接するCおよびG塩基で3'末端が終結する、完全一致プライマーを用いることによって、MspI部位が維持される。最初のMspI消化の後、10サイクル毎定期的に、鋳型と再増幅産物を再消化して、WT配列を取り除いた。CGGG配列をもつ合成マーカー変異MKを、これらの反応液に10-3、10-4、10-5および0という割合で野生型（WT）に加えた。MKは、MspI制限酵素消化によっては切断されないが、各PCRサイクルで増幅され、産物の量を測定するための内部対照を提供する（下記参照）。また、変換段階における完全一致プライマーが、中央のGGに隣接するCおよびG塩基上で再び終結すると、MK産物も、自らの配列を維持する。MKのPCRによって生じるエラー産物には、通常、MspI部位がなく、一般的に、鋳型MKと区別することができない。偶然にMspI部位ができると、この産物は消化によって分解される。偽のLDRエラーが起きたとしても、「マーカーなし」対照と比較することによって検出することができる。
【０１３６】
各緩衝液について、生起したCGGGエラーのバックグラウンド量を示す0 MK対照を用いて、4種類の並行反応の各々でLDRによりMKを検出した。LDRによって検出された、この他のエラー産物の量をMKと比較して、生成された各エラー産物の画分を評価した。図12Aに示したように、AmpliTaqは、ほとんど転換（C→GまたはC→A）を起こさなかったが、大量のC→T移行が観察された。Ventは、AmpliTaqに較べてC→T移行がずっと少なかった（図12B）。AmpliTaqは、緩衝液B、D、およびFにおける硫酸アンモニウム（図12A、レーン5〜8、13〜16、21〜24）と対比すると、緩衝液A、C、およびEにおいて酢酸カリウムの存在に対し、僅かな依存性を示した（図12A、レーン1〜4、9〜12、17〜20）。以前説明した（Barnes、「ラムダバクテリオファージ鋳型からの35-KbまでのDNA増幅法で、高忠実度かつ高収量が得られる方法(PCR Amplification of up to 35-Kb DNA with High Fidelity and High Yield from Lambda Bacteriophage Templates.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(6):2216-20 (1994); Keohavongら、PCR Meth. Appl., 2:288-92 (1993); Carielloら、「変性勾配ゲル電気泳動によって測定した、サーモコッカス・リトラリスのDNAポリメラーゼ（Vent）のPCRにおける忠実度(Fidelity of Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR Determined by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)」、Nucleic Acids Tes., 19(15): 4193-8 (1991); およびMattilaら、「サーモコッカス・リトラリスのDNAポリメラーゼのDNA合成の忠実度-校正活性をもった超高温安定性酵素 (Fidelity of DNA Synthesis by the Thermococcus Litoralis DNA Polymerase- An Extremely Heat Stable Enzyme with Proofreading Activity)」、Nucelic Acids Res., 19(18):4967-73(1991)ように、Ventポリメラーゼは、トリス/酢酸カリウム緩衝液Aよりもトリス/硫酸アンモニウム緩衝液Bにおける方がより効率的に鋳型を増幅した（図12B、レーン1〜4対レーン5〜8）。しかしながら、Ventは、トリシン/硫酸アンモニウム緩衝液D（図12B、レーン13〜16）およびEPPS/硫酸アンモニウム緩衝液F（図12B、レーン21〜24）と比較すると、トリシン/酢酸カリウム緩衝液C（図12B、レーン9〜12）およびEPPS緩衝液E（図12B、レーン17〜20）において忠実度の向上を示した。
【０１３７】
ポリメラーゼ-緩衝液の異なった組合せの相対的忠実度は、最初に存在したWTに対するMKの割合のlog10として表される、それらの「感度」によって表示することができる。トリス/酢酸カリウム緩衝液Aにおける、AmpliTaq増幅でのC→Tエラーを例に採ることができる。CTGGエラー産物のシグナル（図12A、レーン2）を、MKのCGGGエラー（12A、レーン1〜3）と比較すると、シグナルの強さは、10-3MK:WT希釈（図12A、レーン1）にもっともよく似ている。すなわち、-log[MK/WT]=-log[10-3]=3であるから、C→Tエラー率が10-3のときには、感度は3となる。このことから、感度が高くなるほど、エラー率が下がることが分かる。各変異に対する感度が高い反応ほど、全体的な忠実度が高くなる（結果は表1にまとめた）。Vent反応液の多くは、すべての変異について感度が5であった（すなわち、105に1回）（図12B）が、図12Aに示すように、AmpliTaq反応液の感度は3であった（すなわち、103に1回）（図12A）。感度は、ポリメラーゼの誤差率よりもアッセイ法の有用性を表すものである。消化前の65サイクル（D）にわたって蓄積された一つに塩基で起きる変異のすべての画分（F）から、各サイクルの各塩基当たりのエラー（ER）を評価することができる。本発明の目的からすれば、非飽和PCRを何回も行なったため、サイクル回数を複製の回数の推定値とする。ER＝F/Dから、Ventポリメラーゼは、トリシン/酢酸カリウム緩衝液Cでは、1×10-7/塩基/サイクルよりも小さなエラー率をもち、トリシン/硫酸アンモニウム緩衝液Dでは、約2×10-7/塩基/サイクル、また、TsN緩衝液Bでは2×10-6/塩基/サイクルであった。2×10-5/塩基/サイクルというエラー率も見られた。これは、主に、トリス/酢酸カリウム緩衝液Aにおける、C→T移行のエラーによるものであった。このアーティファクトを除去すると、AmpliTaqの忠実度を10倍以上に改善することができた。クロニーング法およびスクリーニング法を用いて、ポリメラーゼのエラーを評価した者もいた（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度に忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA Polymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Clineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR忠実度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996); Mattilaら、「サーモコッカス・リトラリスDNAポリメラーゼのDNA合成の忠実度-校正活性をもった超高温安定性酵素 (Fidelity of DNA Synthesis by the Thermococcus Litoralis DNA Polymerase- An Extremely Heat Stable Enzyme with Proofreading Activity)」、Nucelic Acids Res., 19(18):4967-73(1991); Huangら、「インビトロDNA増幅の過程において、野生型ディープVentおよびエキソヌクレアーゼ欠失DNAポリメラーゼが生み出す忠実度と優性変異（Fidelity and Predominant Mutations Produced by Deep Vent Wild-Type and Exonuclease-Deficient DNA Polymerase During in Vitro DNA Amplification）DNA Cell Biol., 15(7):589-94 (1996)）。また、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用いた者もいた（Keohavongら、PCR Meth. Appl., 2:288-92 (1993); Keohavongら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86）23):9253-7; Carielloら、「変性勾配ゲル電気泳動によって測定した、サーモコッカス・リトラリスのDNAポリメラーゼ（Vent）のPCRにおける忠実度(Fidelity of Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR Determined by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)」、Nucleic Acids Tes., 19(15): 4193-8 (1991);およびLingら、「忠実度に関するポリメラーゼ連鎖反応の最適化：改良T7 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、およびVent DNAポリメラーゼ（Optimization of the Polymerase Chain Reaction with Regard to Fidelity: Modified T7, Taq, and Vent DNA Polymerases）」、PCR Methods Appl., 1(1):63-9 (1991))。しかし、これらの方法は、変異DNAを直接測定するものではなく、すべての変異を検出するものでもない。クロニーング法およびDGGE法では、Ventポリメラーゼは、0.3から4×10-5/塩基/サイクルと評価されたエラー率をもつ（Carielloら、「変性勾配ゲル電気泳動によって測定した、サーモコッカス・リトラリスのDNAポリメラーゼ（Vent）のPCRにおける忠実度(Fidelity of Thermococcus Litoralis DNA Polymerase (Vent) in PCR Determined by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)」、Nucleic Acids Tes., 19(15): 4193-8 (1991);およびLingら、「忠実度に関するポリメラーゼ連鎖反応の最適化：改良T7 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、およびVent DNAポリメラーゼ（Optimization of the Polymerase Chain Reaction with Regard to Fidelity: Modified T7, Taq, and Vent DNA Polymerases）」、PCR Methods Appl., 1(1):63-9 (1991))。Taqポリメラーゼのエラー率は、我々が、Tsk、すなわち緩衝液Aで観察したAmpliTaqのエラー率に匹敵する0.8から9×10-5/塩基/サイクルをもつ評価されている（Eckertら、「サーマス・アクアティカスのDNAポリメラーゼによる高度に忠実なDNA合成(High Fidelity DNA Synthesis by the Thermus Aquaticus DNA Polymerase)」、Nucleic Acids Res., 18(13):3739-44(1990); Clineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR忠実度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996);および Brailら、「PCR-PPCPAにおける、改良されたポリメラーゼの忠実度(Improved Polymerase Fedility in PCR-PPCPA)」、Mutat. Res., 303(4):171-5 (1993)）。熱安定性ポリメラーゼの中で、Pfuが、報告された中で最も低い、0.7から1.6×10-6/塩基/サイクルと評価されたエラー率をもつ（Clineら、「Pfu DNAポリメラーゼおよび他の熱安定的DNAポリメラーゼのPCR忠実度(PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases)」、Nucleic Acids Res., 24(18):3546-51 (1996); Lundbergラ、「パイロコッカス・フリオサスから単離した熱安定性DNAポリメラーゼを用いた高度に忠実な増幅（High-Fedility Amplification Using a Thermostable DNA Polymerase Isolated from Pyrococcus Furiosus）」、Gene, 108(1):1-6 (1991); Andreら、「ヒトミトコンドリアDNA配列に対するPfu DNAポリメラーゼの忠実度と変異範囲（Fidelity and Mutational Spectrum of Pfu DNA Polymerase on Human Mitochondorial DNA Sequence）」、Genome Res., 7(8):843-52 (1997)）。また、Pfuポリメラーゼは、トリシン、またはその他の低|ΔpKa|緩衝液においてより高い忠実度を示す。
【０１３８】
高い忠実度と校正作用をもつ酵素が、ゲノムDNAからの増幅を改善させると考えられるが、それでもなお、変換段階での校正を避ける必要がある。変換条件を固定して、高度に忠実なゲノム増幅条件をいくつか変えて調べた。ゲノム増幅は、Vent(exo-)クエン酸/硫酸アンモニウム緩衝液G、または、Vent(exo-)クエン酸/硫酸アンモニウム緩衝液Gに10％ホルムアミドを入れた緩衝液G(f)のいずれかで行なった（表4参照）。ミスマッチプライマー伸長による変換を見越して、PCRの忠実度を最適化するため、Vent(exo-)とともに非変換プライマーを用いた。もっとも忠実度の高い条件は以下の通りであった。Expand/10％ホルムアミド入り緩衝液Cからのゲノム増幅産物を3サイクル目に加えて、Vent/緩衝液Gによるゲノム増幅を開始させた。これらのVent/緩衝液G反応には、Mg2+およびPCRプライマーが必要であったが、それ以外にDNAを用意する必要はなかった。その他の調査条件についてのエラー率の観測値については、表4を参照のこと。
【０１３９】
【表４】
Figure 0004601830
a 最小限全部で50サイクルした結果に基づくから、すなわち観察エラー数÷50、
b ゲノムDNAからのVent PCR産物は見られなかった。Vent変換PCRに対するTaqによる増幅産物を使用した。
c 緩衝液C中のExpandポリメラーゼを用いて行なった並行ゲノムDNA増幅における反応物から1μlを採って、3回目のPCRサイクルの後に加えた鋳型
表4.標的配列を増幅するためのPCRおよび変換PCRを行なうためのさまざまな緩衝液における、校正作用をもつポリメラーゼと、その作用をもたないポリメラーゼを用いたときの忠実度の比較。まず、ゲノム増幅と変換のために一種類の緩衝液を用いて、TaqポリメラーゼとVentポリメラーゼを調べた。変換段階で、短い完全一致プライマーを用いて、ポリメラーゼエラーのバックグラウンドレベルを測定するために、p53の248番目のコドン近くにあるMspI部位の非変換のみを行なった。LDRによって、MspI部位の2番目の位置（CCGG→CNGG）における変異を定量した。校正作用をもつポリメラーゼと、その作用をもたないポリメラーゼを用いた並行反応によって、ゲノム増幅と変換における忠実度を比較した。まず、Taqポリメラーゼに校正機能をもつPfuポリメラーゼを加えたExpandポリメラーゼを用いて、ゲノムDNAからの標的配列の増幅を開始し、その後、高忠実度VentポリメラーゼPCRを行なった。Ventポリメラーゼの代わりに校正機能をもたないVent(exo-)を用いて、校正機能が必要か否かを決定し、また、校正が許されない変換段階を行なった。変換用PCR緩衝液における10％ホルムアミドの効果も調べた。すべての緩衝液には、200 μg/mlのウシ血清アルブミン、2.5 mMのMgCl2、および200 μMのdNTP（各々）が入っていた。具体的な成分は、A（Tsk）20 mMトリス pH 9.1、50 mM酢酸カリウム（標準的Taqポリメラーゼ緩衝液）、B（TsN）20 mMトリス pH 9.1、16 mM硫酸アンモニウム（標準的Ventポリメラーゼ緩衝液）、C（TcK）20 mMトリシン pH 8.7、50 mM酢酸カリウム、D（TcN）20 mMトリシン pH 8.7、16 mM硫酸アンモニウム、E（EpK）20 mM EPPS pH 8.4、50 mM酢酸カリウム、F（EpN）20 mM EPPS pH 8.4、16 mM硫酸アンモニウム、G（GiN）20 mMクエン酸 pH 7.6、16 mM硫酸アンモニウム、(f)は、10％ホルムアミドが入っていることを示している。(4)は、4 mM MgCl2まで上昇させたことを示す。(8)は、8 mM MgCl2まで上昇させたことを示す。
【０１４０】
PCR/RE/LDRの各段階について、ミスマッチ変換を行わないときに高忠実度を維持するPCR条件を見つけた。また、既知の高忠実度PCR条件を用いて、p53の248番目のコドンにあるMspI部位（CCGG）をTaqI部位（TCGA）に変更して、変換を調べた。前に、最初に野生型DNAと対比したときの忠実度を測定するための並行反応で行なったように、MK（CGGG）を添加した。上記のように高忠実度PCRを行ない、いくつかの反応（全部ではない）については、予備変換を行なった。図10Bに示したように、3'末端に縮退ピリミジンヌクレオチドQ6をもつプライマーを用いて、予備変換を行なった。最終変換は、天然の塩基である3'Tミスマッチプライマーを用いて行なった。LDRを用いて、MspI、TaqI、およびMKの配列における二番目の塩基、すなわち、CNGGまたはTNGAを調べるために産物の検出を行なった。予備変換を行なった場合と行わなかった場合の変換の忠実度を、非変換対照と比較した。変換がうまく起きると、MspI部位（CCGG）がTaqI部位（TCGA）に変わり、MKも、CGGGからTGGAに変化する。しかし、変換に成功するための主要な問題は、あらゆる場合に中央部の塩基、すなわち、TaqI変換の場合にはCpG、MKの場合にはGpGを維持できるかにある。図13は、変換の結果を示すものである。図13のレーン1〜4（C:G）は、MspIで制限酵素消化された非変換反応であり、レーン5〜8（Q6:G）は、TaqIで制限酵素消化された予備変換/変換反応であり、レーン9〜12（T:G）は、予備変換を行わなかった変換反応で、TaqIで制限酵素消化したものである。図13のC:Gレーン1〜4に示されているように、以前決定した予備増幅および変換にとって最良の条件を用いたとき、変換を行わないPCR/RE/LDRは、104中1よりも高い感度を示した。図13のT:Gレーン9〜12、Tミスマッチプライマーによって、MspI部位がTaqIに変化したPCR/RE/LDRは、一見非常にうまくいったように見えた。変換がうまくいったときに予想されているように、図の_CG_領域においてMspI産物を検出することはできず、そのため、この部位がTaqIに変換してから酵素消化されたように見える。しかし、図13のT:Gレーン9〜11で、添加したMKとの反応によって大量のMK（CGGG）画分が見られ、同じような大量の画分が、図13のT:Gレーン12の0 MK対照でも観察されている。したがって、MKは全量とも、天然の塩基プライマーのミスマッチ伸長によって産生されたアーティファクトである。この現象は、伸長反応の過程で、MKの内部配列をまねるように（CCGG→TGGA）、MspI部位の2番目のCがGに変換するというものである。Q6:Gレーン5〜8、Q6プライマーによる予備変換によって、MKアーティファクトは消失する。
【０１４１】
レーン5〜8のQ6変換試料と比較して、図13のレーン1〜4の非変換試料に大量に存在するWTが、ホルムアミドによるMspI消化阻害の原因である可能性がある。C:Gレーンでは、非変換対照において強い野生型LDRバンド（WT）が存在し、Q6:GレーンとT:Gレーンで、変換した配列をTaqI消化した後は、このバンドが存在しなくなるということが証明しているように、ホルムアミドは、明らかに、MspI酵素消化を阻害する。
【０１４２】
それぞれの非変換対照用反応（図13、C:Gレーン2、3）と比較して、10-4および10-5のMKレーン（図13、Q6:Gレーン6、7）に見えるMK産物が低量なのは、MKの変換の効率が低いからであろう。実際、TaqI部位の作出には、中央にあるCpGジヌクレオチドの両側の2箇所で変換が起こる必要がある。MKの濃度を10倍低くすると、MK変換は10倍よりもずっと低くなる。したがって、その産物の多くが、MK配列の片側だけで変化するため、LDRプローブの半分が、この配列に正確にハイブリダイズできなくなり、ライゲーションが起きなくなる。LDR検出は、完全に変換した少量の鋳型の存在を示すのみである。それにもかかわらず、これら2本のレーンでは、MK産物の量の方が対照の量よりもずっと多い。図13のレーン8を図13のレーン6および7と比較されたい。ホルムアミドは、変換効率を低下させるが、変換の忠実度は大いに向上する。
【０１４３】
Newtonらは、「DNAの点突然変異の解析：増幅不応性変異系（ARMS）（Analysis of Any Point Mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS)）」、Nucleic Acids Res. 17(7):2503-16 (1989)において、C・T、A・AおよびT・Tミスマッチはすべて、プリン-ピリミジンミスマッチに較べて、Taqポリメラーゼで伸長することが非常に難しいことを発見した。また、自然の塩基ミスマッチを伸長させると忠実度が低くなることを観察した者もいる（O'Dellら、Genome Res. 6(6):558-68 (1996); およびEikenら、「PKU変異を診断するための天然のおよび増幅によって作出した制限酵素部位（Application of Natural and Amplification Created Restriction Sites for the Diagnosis of PKU Mutations）」、Nucleic Acids Res., (1999)）。多数の塩基に対して構造的に類似しているヌクレオチドアナログを使用すると、異なった塩基と対合したときに、アナログからのポリメラーゼによる伸長（読み取り）が可能になり、アナログの反対側に異なった塩基を挿入すること（書き込み）が可能になることがある。本発明の目的にとって、予備変換処理の効率は、必ずしも高いものである必要はない。しかし、変換に成功するには、変換の標的となる塩基のみを確実に変更するために、高いPCR忠実度が要求される。変異を検出する対象となる配列の中で、変換の標的となった塩基以外の塩基に変化が起きると、偽陽性変異というアーティファクトが起こる。Q6:Gミスマッチを生じさせる3'Q6プライマーを用いた予備変換によって、G・Tミスマッチによるポリメラーゼ伸長を避けることができる。その後に続く増幅サイクルにおいて、Q6の反対側には、明らかにしばしばAが書き込まれる。この観察結果は、Q6が、ほぼ同じ頻度でCおよびTと同じように塩基対合するというヒル（Hill）らの結果と矛盾しない（Hillら、「ポリメラーゼによる、縮退したピリミジンおよびプリン塩基を取り込んだ合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの認識（Polymerase Recognition of Synthetic Oligondeoxyribonucleotides Incorporating Degenerate Pyrimidine and Purine Bases）」、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(8): 4258-63 (1998)）。互変が容易であれば、Q6は、塩基対合をしたときにどちらかのピリミジンを模倣して、ミスマッチによるゆらぎ（wobble）を避けることが可能になる。予備変換の後で、天然の塩基プライマーを加えると、既に、相当量の完全一致する鋳型が存在しているか、そうでなければ、予備変換の有無に関わらず、MKアーティファクトが反応液中に出現しているはずである。Q6以外のヌクレオチドアナログを、より効率的な変換の架橋として使用することも可能である（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999)）。
【０１４４】
PCRにおいてプライマーからのポリメラーゼ伸長反応の忠実度を測定して、場合によっては忠実度を向上させる条件を発見した。思うに、より高い忠実度は、ポリメラーゼによる間違った取り込み、プライマーのずれ、および鋳型の分解を減少させることによってもたらされる。PCR/RE/LDRによって、野生型配列以外の配列を選択的に増幅して、非常に低量の「変異」配列を測定することが可能になる。本発明に係る方法によって、天然の塩基ミスマッチプライマーによる伸長反応は、RFLP解析を行なうために、制限酵素部位を配列中に人為的に作出するための一般的な技術としては使用できないことが明確に示されている。図13に示したように、また、以前から観察されていたように（O'Dellら、Genome Res. 6(6):558-68 (1996); およびEikenら、「PKU変異を診断するための天然のおよび増幅によって作出した制限酵素部位（Application of Natural and Amplification Created Restriction Sites for the Diagnosis of PKU Mutations）」、Nucleic Acids Res., (1999)）、自然の塩基ミスマッチ伸長反応にはエラーが生じやすい。既存の配列から制限酵素部位を完璧に作出するには、エラーを許さない方法が必要である。本発明に係る方法を用いた、これらの実施例の結果は、ヌクレオチドアナログを高忠実度PCR条件と組み合わせて用いると、徹底的にエラーを減らすことができる。LDRは、特異的なPCRエラーを正確かつ高感度で測定することができるため、これらの実験では、プライマー伸長反応の本当の特異性を観察することができた。すなわち、さまざまなポリメラーゼおよび緩衝液の産物を、PCR/RE/LDRの過程のさまざまな段階で測定して、PCRの効率と忠実度を両方とも最大にすることができた。その結果、PCR/RE/LDR法をまとめて、105という感度目標を達成することができた。しかし、このように高い感度は、前から存在していたMspI部位に変換が起こっていない場合という特別の場合にだけ達成できた。現時点では、プライマーのずれが、ミスマッチプライマー伸長反応のエラーが生じうる重要な機構として残っている（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999)）。このエラー原因の生体内での重要性ははっきりしないが、対立遺伝子特異的なPCRや、他のインビトロでの変異検出法に重大な影響を与える可能性がある。さらに別のエラー原因が、ヌクレオチドアナログによる予備変換の後に、天然の塩基プライマーを用いて、増幅するための特異的な配列を選択する場合に生じる。これは、選択した天然の塩基プライマー画分が、目的の塩基以外の塩基とミスマッチ対合を形成する可能性があるからである。異なった塩基が反対側に挿入されるヌクレオチドアナログの特徴的なセットが知られている（Dayら、Nucleic Acids Res., (1999); Hillら、「ポリメラーゼによる、縮退したピリミジンおよびプリン塩基を取り込んだ合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの認識（Polymerase Recognition of Synthetic Oligondeoxyribonucleotides Incorporating Degenerate Pyrimidine and Purine Bases）」、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(8): 4258-63 (1998)）。したがって、高忠実度ミスマッチプライマー伸長反応プロトコールを作成するには、これらの問題を克服することができる新しい変換法の開発が待たれる。高忠実度PCRと、効率を監視するLDR法を組み合わせるときには、ミスマッチプライマー伸長反応が、所望の変異をアーティファクトなしに正確に導入するための技術となる可能性もある。
【０１４５】
具体的に説明するために本発明を詳細に説明してきたが、このような細部は、単にこの目的のためだけのものであると理解されたい。当業者は、以下の特許請求の範囲で限定されている発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を加えることができると思われる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜Ｃ】 本発明のカップル型ポリメラーゼ連鎖反応（coupled polymerase chain reaction）-制限エンドヌクレアーゼ消化-リガーゼ検出反応過程の略図である。
【図２】 ゲル電気泳動を使用した、図1A 〜 Cの過程によって生ずるライゲーション産物の検出を示す。
【図３】 位置特定可能なアレイを使用した、図1A 〜 Cの過程によって生ずるライゲーション産物の検出を示す。
【図４】 ヌクレオチド類似物の事前変換によって促進される変換を示す。配列中のC:G塩基対はT:A塩基対への変換の標的になる。直接変換を試みるために3'側天然塩基ミスマッチプライマーを使用しないで、ヌクレオチド類似物（Q6）プライマーを事前変換に使用する。Q6類似物はG塩基を読み、ポリメラーゼに3'側Q6プライマーから効率的に伸長させる。PCR中、逆方向のプライマーがQ6PCR産物にアニーリングし、ポリメラーゼによって伸長されて、対向鎖を合成する。ポリメラーゼが鋳型のQ6類似物に到達すると、ポリメラーゼは類似物に対してA(またはG、示していない)を書き、鎖の合成を継続する。2,3サイクル後、類似物にたいする縮重配列を有する産物のプールが作製される。次いで、望ましい塩基変更を有する産物を選択的に増幅するために、天然の塩基プライマーを添加する。
【図５Ａ〜Ｉ】 PCRプライマーに使用するヌクレオチド類似物を示す。最終的な脱保護されたオリゴヌクレオチドにおいて、示す塩基類似物を含有するヌクレオチドの名前は以下のようである：Q1、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)イミダゾール-4-カルボキサミド（図5A）；Q2、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール（図5B）；Q5、2'-デオキシイノシン（図5C)；Q6、6-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン（図5D)；Q7、2-アミノ-7-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6-メトキシアミノプリン（図5E)；Q16、1-(21-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-4-ヨードピラゾール（図5F)；Q18、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)ピロール-3-カルボキサミド（図5G)；Q19、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-4-ニトロピラゾール（図5H)。塩基類似物（Q）はデオキシリボフラノースの1'位に結合する。ヌクレオチド類似物は、スクシニルリンカー（R=CPGのリンカー）を介して制御式細孔ガラス（controlled pore glass(CPG)）カラムに結合される。オリゴヌクレオチドは、ジメトキシトリチル（DMT）保護基を除去し、3'側末端に類似物を配置した後、5'側ヒドロキシルから合成される。CPGカラムから切断し、脱保護後、オリゴヌクレオチドは3'側塩基類似物ヒドロキシル基（R=H）からポリメラーゼによって伸長される（図5I）。
【図６Ａ〜Ｃ】 ミスマッチ伸長および3'側ヌクレオチド類似物変換に使用されるプライマーを示す。相補的な（-鎖）配列は逆方向（3-5'）、例えば逆方向の鎖プライマー（名前の最後に「R」をつける）で示す。図6Aでは、9つの異なる合成50 bpの2本鎖（ - 鎖、配列番号： 1 ； + 鎖、配列番号： 2 ）の1つを融解した状態で示し、プライマーを相補的な配列に並べて示す。プライマー伸長は、3'側天然塩基およびヌクレオチド類似物プライマー（p53-248X（配列番号： 3 ）およびp53-248XR（配列番号： 4 ））を使用して実施した。いくつかの伸長産物は、切断型ジップコードプライマーp53zip248（配列番号： 5 ）およびp53zip248R（配列番号： 6 ）を使用して再度増幅し、ジップコードプライマーの一方である、 Ztop （配列番号： 7 ）または Zbot （配列番号： 8 ）を使用して配列決定した。図6Bでは、3'側ヌクレオチド類似物プライマー、例えばp53-248Q6 （配列番号： 3 ）およびp53-248Q6R（配列番号： 4 ）を使用して、9の異なる50 bp合成2本鎖鋳型（唯一の鋳型である、配列番号： 1 および配列番号： 2 を示す）に事前変換を実施した。事前変換の有無にかかわらず、変換は、3'側天然塩基、例えばプライマーp53zip248T（配列番号： 9 ）およびp53zip248TR（配列番号： 10 ）を含有するプライマーを使用して実施した。これらの変換産物を、ジップコードプライマーを使用して再度増幅し、LDRによって同定した。図6Cでは、変換産物中の特定の塩基の変更を同定するためにLDRプローブセットを設計した。LDRプローブは、互いに競合して、変換産物にアニーリングする。好ましくは、重複またはギャップのない相補的な上流LDRプローブおよび下流LDRプローブが高い特異性でライゲーションする。識別用プローブは異なる長さの5'側末端を有し、アクリルアミドゲルでの特定の産物の分離を可能にした。野生型鋳型の非変換時におけるPCRエラー産物を同定するために使用されるプローブセットを示す。そのようなプローブを、 p53LDR24 8FCA （配列番号： 11 ）、p53LDR248FCG（配列番号： 12 ）、 p53LDR248FCT （配列番号：13）、 p53LDR248FCC （配列番号： 14 ）、および p53LDR248PGG （配列番号： 15 ）と命名する。
【図７Ａ〜Ｂ】 天然の塩基およびQ6コンバータイド（convertide)による変換の結果を示す。9の鋳型からの変換産物はPCR/LDRによって検出された。各鋳型は、配列を示してある中央の4塩基を除いて、同一の配列の50-bp塩基対の合成2本鎖DNAであった。図 7A および図 7B に示されたように、鋳型 CCGG は配列番号： 2 を、鋳型 CTGG は配列番号： 17 を、鋳型 CGGG は配列番号： 18 を、鋳型CAGGは配列番号： 19 を、鋳型 TCGA は配列番号： 20 を、鋳型 GCGC は配列番号：21を、鋳型 ACGT は配列番号： 22 を、鋳型 CATG は配列番号： 23 を、および鋳型 CGCG は配列番号： 24 を指す。変換はこれらの4塩基内で生じた。示した3'側天然塩基またはコンバータイドを有する変換プライマーから出発することによって作製される予測される変換産物を示す。図7Aは、Q6事前変換の有無にかかわらず、プライマーp53zip248C（配列番号： 25 ）を用いた第1の塩基のCへの変換を示す。図7Bは、Q6事前変換の有無にかかわらず、プライマー p53zip248T （配列番号： 9 ）を用いた第1の塩基のTへの変換を示す。
【図８Ａ〜Ｂ】 天然の塩基、Q5およびQ7コンバータイド（convertides)による変換を示す。配列番号： 2 および配列番号： 17 から 24 に対応する9個の鋳型からの変換産物はPCR/LDRによって検出された。各鋳型は、配列を示してある中央の4塩基を除いて、同一の配列の50-bp塩基対の合成2本鎖DNAであった。変換はこれらの4塩基内で生じた。示した3'側天然塩基またはコンバータイドを有する変換プライマーから出発することによって作製される予測される変換産物を示す。図8Aは、Q5またはQ7事前変換の有無にかかわらず、プライマー p53zip248G （配列番号： 26 ）を用いた第1の塩基のGへの変換を示す。図8Bは、Q5またはQ7事前変換の有無にかかわらず、プライマー p53zip248A （配列番号： 27 ）を用いた第1の塩基のAへの変換を示す。
【図９Ａ〜Ｈ】 ポリメラーゼ伸長の忠実度を示す。プライマーのずれは観察された伸長産物の多数を占める（図7および図8）。図9Aでは、完全に相補的なプライマーにより適切な産物が得られる。図9Bでは、第2の塩基のT:GミスマッチがTGGA(または、TGCA)産物を説明している。図9Cでは、CCGG鋳型のマイナス鎖にずれがないQ6:G塩基対からの伸長（その後の3'側T変換プライマー）により、予測されるTCGA産物が得られた。図9Dは、CTGG鋳型およびいくつかの他の鋳型のマイナス鎖にずれがないQ6:G塩基対からの伸長（その後の3'側T変換プライマー）により、予測される産物が得られることを示す。図9Eでは、GGミスマッチ伸長により、明らかに、1つの鋳型の予測されるGC産物が得られたが、おそらく偶然にすぎない（図9F参照）。図9Fでは、GGミスマッチからの全ての伸長により、先行する塩基のずれによって形成されるGTミスマッチに一致する、GC伸長産物が得られた。図9Gでは、Q5:GおよびQ7:G伸長産物により、明らかに、1つの鋳型の予期されるGC産物が得られたが、おそらく偶然にすぎない（図9H参照）。図9Hでは、Q5:GおよびQ7:Gミスマッチからの全ての伸長（その後の3'側G変換プライマー）により、先行する塩基のQ5:TミスマッチまたはQ7:Tミスマッチに一致したGC伸長産物が得られた。
【図１０Ａ〜Ｃ】 ゲノムDNAからのp53エクソン7の増幅の略図（図10A）および正常なMspI部位のTaqI部位への変換である。まず、鋳型にp53エクソン7のPCR増幅を実施する（図10B）。次に、PCR変換段階を実施し、コドン248をtheに変換して(TCGA）TaqI制限酵素切断部位を作製する（図10B）。
【図１１Ａ〜Ｃ】 変換エラーを回避するために、既存の制限酵素切断部位のPCR/RE/LDRによってポリメラーゼ忠実度を測定するために使用したPCRプライマーを示す。使用した方法は、変換段階について図6に記載されているものである。しかし、図11に示す忠実度の実験では、変換過程内の最適な緩衝液条件を試験するために、緩衝液成分を改良した。図11AはPCR忠実度アッセイ法を示す。合成50塩基対2本鎖マーカー鋳型（MK）および野生型p53エクソン7PCR産物を平行反応において既知の比で混合する。完全なマッチプライマーp53-248short（配列番号： 28 ）およびp53-248shortR（配列番号： 29 ）は野生型CCGGおよびCGGGを増幅する。次いで、プライマーp53zip248short（配列番号： 5 ）およびp53zip248shortR（配列番号： 6 ）を含有するより長いジップコードを添加した。最後に、野生型を繰り返し消化し、ジップコードプライマーである Ztop （配列番号： 7 ）および Zbot （配列番号： 8 ）で再度増幅した。図11Bでは、3'側コンバータイド、例えばp53-248Q6 （配列番号： 3 ）を含有するプライマーを使用して事前変換を実施した。事前変換の有無にかかわらず、MspI部位のTaqI部位への変換は3'側天然塩基プライマーp53zip248T（配列番号： 9 ）およびp53zip248TR（配列番号： 10 ）を使用して実施した。上記のように長いプライマーを添加し、変換産物をさらに増幅した。野生型産物を、新たな部位に適当な制限エンドヌクレアーゼで消化した。突然変異産物は主にジップコードプライマーで増幅された。図 11B におけるその他のプライマーには、 p53Taq248T （配列番号： 30 ）、p53Taq248TR（配列番号： 31 ）、 p53Taq248Q 6 （配列番号： 32 ）、および p53Taq248Q 6 R （配列番号： 4 ）が含まれる。図11Cでは、ライゲーション点周囲の鋳型配列を照会するために、LDRプローブセットを設計した。重複またはギャップのない完全にハイブリダイゼーションされた上流および下流のLDRプローブは主に高い特異性でライゲーションされた。識別用プローブは、アクリルアミドゲルでの特定の産物の分離を可能にする異なる鎖長の5'側末端を有する。示されたプローブ（配列番号： 11 から 14 ）は、MspI部位の第2の塩基に生じる突然変異を同定するために使用した（変換はない）。余分なプローブp53LDR248FTCL （配列番号： 33 ）は、MspI部位の第1塩基と第2塩基のC→T転位を比較するために使用した。識別プライマーの3'側末端前塩基にT、共通プローブの5'側末端前塩基にAを有する変換産物のTaqI部位の第2塩基の突然変異を同定するために、識別用プローブと共通プローブの同等のセットを使用した。
【図１２Ａ〜Ｂ】 図11に示すPCR/RE/LDR実験によって検出される緩衝液および酵素依存的PCRエラーを示す。示すポリメラーゼ/緩衝液の組み合わせを使用して、ゲノムDNAからp53エクソン7を増幅した。同じ緩衝液を完全なマッチプライマーによる反応に使用して、MspI部位を再度増幅した。図12Aでは、Taqポリメラーゼ（T）を種々の試験用PCR緩衝液に使用したが、図12Bでは、Ventポリメラーゼ（V）を種々の試験用緩衝液に使用した。Ventポリメラーゼは、TsK、緩衝液A、緩衝液でゲノムDNAからp53エクソン7を増幅しなかった。この場合だけでは、2つの異なる酵素/緩衝液セットを事前増幅および「変換」（完全なマッチプライマーを使用したので、実際の変換ではない）に使用した。AmpliTaqT/Tskエクソン7ゲノムDNAPCR産物をVent V/Tskに置換し、緩衝液A中で再度増幅した。「C」はMKが添加されていないことを示す（対照反応）。
【図１３】 変換の忠実度の比較結果を示す。変換反応産物の相対的な強度は、3-Dプロットにおける各々のピークの色と高さによって示す。マーカー（MK）DNA（CGGGがMspI部位で交換されている）を平行反応において野生型（WT）に既知の比で添加した。-log(MK:WT)は、存在するMKの相対的な画分を示し、例えば、-log(MK:WT)=3はMK:WTの比が1:1000であることを意味する。「C」はMKが添加されていないことを示す（対照反応）。非変換対照反応（C:G）は完全なマッチ3'側Cプライマーを使用して実施した。MspI部位(CCGG)のTaqI部位（TCGA）への変換は、3'側Q6ヌクレオチド類似物プライマーを使用した事前変換の有無にかかわらず（それぞれ、Q6:G反応およびT:G反応）、天然の塩基3'側Tプライマー を使用して実施した。MspI非変換のLDR産物はCNGGを含有し、TaqI変換の産物はTNGAを含有するが、中央の塩基だけ（第2塩基および第3塩基）を_NG_と示す。LDR産物は、サイズが2塩基異なることによってアクリルアミドゲルで分離するように設計された。中間サイズの未測定のバンドも観察された。レーン1〜4はPCR/RE/LDR中にMspIで消化したが、レーン5〜12はTaqIで消化した。

Claims (22)

  1. 以下の段階を含む、複数の標的ヌクレオチド配列において大量存在配列（high abundance sequence）から、一つまたはそれ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる一つまたはそれ以上の少量存在配列（low abundance sequence）を同定する方法：
    それぞれが大量存在標的配列と少なくとも一つの配列の差を有する、一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列を含む可能性がある試料を提供する段階；
    一次オリゴヌクレオチドプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応産物が形成されるように、対応する大量存在および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖上でのハイブリダイゼーションに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合にそのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミスマッチを有する、（a）標的特異的部分を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを特徴とする一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
    ポリメラーゼを提供する段階；
    試料、一次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混和して、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
    一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離される変性処理と、一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした一次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、それに対して一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列と相補的な一次伸長産物を形成する伸長処理とを含む、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行う段階；
    特定のセットにおける二次オリゴヌクレオチドプライマーが、大量に存在する標的を増幅する場合に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むもしくは作製するが、一つもしくはそれ以上の少量存在する標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含まないもしくは作製しない、二次ポリメラーゼ連鎖反応産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖上でのハイブリダイゼーションに適している、（a）標的特異的部分と5'上流の二次プライマー特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分と5'上流の二次プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを特徴とする、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
    ポリメラーゼを提供する段階；
    一次伸長産物、二次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混和して、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
    二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離される変性処理と、二次オリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長産物とハイブリダイズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした二次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、一次伸長産物と相補的な二次伸長産物を形成する伸長処理とを含み、大量に存在する二次伸長産物が制限酵素切断部位を含むが、少量存在する二次伸長産物は含まない、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行う段階；
    制限エンドヌクレアーゼを提供する段階；
    二次伸長産物と制限エンドヌクレアーゼとを混和して、エンドヌクレアーゼ消化反応混合物を形成する段階；
    制限エンドヌクレアーゼが、二次伸長産物において大量に存在する標的を増幅する場合にはその中に含まれるもしくは作製される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を認識して切断するが、少量存在する標的を増幅する場合には認識して切断せず、このようにして、大量に存在する二次伸長産物が選択的に破壊されるように、エンドヌクレアーゼ消化反応混合物にエンドヌクレアーゼ消化反応を行う段階；
    三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、二次伸長産物の全てを増幅してもよい、（a）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第一のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第一の三次プライマーと、（b）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第二のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第二の三次プライマーとを特徴とする三次オリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
    二次伸長産物、三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、およびポリメラーゼを混和して、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
    三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離される変性処理と、三次オリゴヌクレオチドプライマーが二次伸長産物とハイブリダイズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした三次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、二次伸長産物と相補的な三次伸長産物を形成する伸長処理とを含む、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行う段階；
    特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、相補的な三次伸長産物特異的部分上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に共にライゲーションされることに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合にそのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、各セットが、（a）三次伸長産物特異的部分と検出可能なリポーター標識とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブと、（b）三次伸長産物特異的部分を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブとを特徴とする、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階；
    リガーゼを提供する段階；
    三次伸長産物、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット、およびリガーゼを混和して、リガーゼ検出反応混合物を形成する段階；
    オリゴヌクレオチドプローブセットが、それぞれの相補的三次伸長産物以外のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてもよいが、一つまたはそれ以上のミスマッチが存在するために互いにライゲーションせず、変性処理において個々に分離したままである、リガーゼ検出反応混合物を、ハイブリダイズした任意のオリゴヌクレオチドを三次伸長産物から分離する変性処理と、オリゴヌクレオチドプローブセットが、それぞれの三次伸長産物が存在すれば、それらに対して隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズして、互いにライゲーションして、（a）検出可能なレポーター標識、および（b）互いに結合した三次伸長産物特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成するハイブリダイゼーション処理とを含む、一回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイクルを行う段階；ならびに
    ライゲーション産物配列のレポーター標識を検出することによって、試料中に一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列が存在することが示される段階。
  2. 以下の段階を含む、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、それらが形成するライゲーション産物配列が他の核酸と区別されうるように、独自の長さを有する、請求項１記載の方法：
    ライゲーション産物配列を、上記の検出段階の前に電気泳動移動度によって分離する段階；および
    上記の検出段階の後、電気泳動移動度が異なるライゲーション産物配列を識別する段階。
  3. 以下の段階をさらに含む、各オリゴヌクレオチドプローブセットの第二のオリゴヌクレオチドプローブが、位置特定可能なアレイ特異的部分を有する、請求項１記載の方法：
    捕捉オリゴヌクレオチドが位置特異的可能なアレイ特異的部分と相補的なヌクレオチド配列を有する、異なる特定の部位に異なる捕捉オリゴヌクレオチドが固定された固相支持体を提供する段階、および
    検出段階が、位置特定可能なアレイ特異的部分を用いて捕捉され、固相支持体の特定の部位に固定されたライゲーション産物配列が存在することを示し、それによって試料中に一つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列が存在することが示される、ライゲーション産物配列が捕捉オリゴヌクレオチドと塩基特異的にハイブリダイズするために有効な条件で、リガーゼ検出反応混合物を、一回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイクルに供した後に、固相支持体と接触させて、それによって位置特定可能なアレイ特異的部分を、固相支持体の相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で捕捉する段階。
  4. 以下の段階をさらに含む、複数の標的ヌクレオチドにおける一つまたはそれ以上の大量存在配列に対する、一つまたはそれ以上の単一塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、試料中に未知量で存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が定量される、請求項１記載の方法：
    一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に一回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行った後に、一次伸長産物の量を定量する段階；
    既知量の一つまたはそれ以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階；
    マーカー標的ヌクレオチド配列のために特にデザインされたプローブセットを含む、一つまたはそれ以上の配列特異的プローブセットを提供する段階；
    マーカー標的ヌクレオチド配列と、マーカー標的ヌクレオチド配列のために特にデザインされたプローブセットを、リガーゼ検出反応混合物と共に混和する段階；
    ライゲーション産物配列の量を定量する段階；および
    試料中の一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列の相対的レベルの定量的測定を提供するために、未知の少量存在試料から生成されたライゲーション産物配列の量を、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生成されたライゲーション産物の量と比較する段階。
  5. 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が、複数の標的ヌクレオチドにおける大量存在配列の量と比較して１：1,000モル比未満で存在する、請求項４記載の方法。
  6. 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：10,000モル比未満で存在する、請求項４記載の方法。
  7. 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：100,000モル比未満で存在する、請求項４記載の方法。
  8. 大量存在一次ポリメラーゼ連鎖反応産物を、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む二次ポリメラーゼ連鎖反応産物に変換する効率と精度が、二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階の前に以下の段階を実施することによって改善される、請求項１記載の方法：
    標的特異的部分が二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと同一または実質的に同一であるが、少なくとも一つのプライマーが一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体を含み、特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプライマーが、一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体と反対鎖塩基変化とを含む前二次ポリメラーゼ連鎖反応産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖とのハイブリダイゼーションに適しており、前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、一次ポリメラーゼ連鎖反応産物配列をその後の二次ポリメラーゼ連鎖反応における制限エンドヌクレアーゼ部位へ変換することを促進する、（a）標的特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分を有する第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを特徴とする前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
    ポリメラーゼを提供する段階；
    一次伸長産物、前二次オリゴヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼを混和して、前二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
    前二次伸長産物が、その後の二次ポリメラーゼ連鎖反応における制限エンドヌクレアーゼ認識部位への一次ポリメラーゼ連鎖反応産物配列の変換を促進する、一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体と反対鎖塩基変化とを含み、前二次伸長産物が二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物において一次伸長産物の代わりに用いられる、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に、ハイブリダイズした核酸配列が分離される変性処理と、二次オリゴヌクレオチドプライマーが一次伸長産物とハイブリダイズするハイブリダイゼーション処理と、ハイブリダイズした二次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、一次伸長産物と相補的な前二次伸長産物を形成する伸長処理とを含む、二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行う段階。
  9. 以下の段階を含む、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、それらが形成するライゲーション産物配列が他の核酸と区別されうるように独自の長さを有する、請求項８記載の方法：
    上記の検出段階の前に電気泳動移動度によってライゲーション産物配列を分離する段階；および
    上記の検出段階の後に、電気泳動移動度が異なるライゲーション産物配列を区別する段階。
  10. 以下の段階をさらに含む、各セットの第二のオリゴヌクレオチドプローブが位置特定可能なアレイ特異的部分を有する、請求項８記載の方法：
    捕捉オリゴヌクレオチドが、位置特定可能なアレイ特異的部分と相補的なヌクレオチド配列を有する、異なる捕捉オリゴヌクレオチドが異なる特定の部位に固定された固相支持体を提供する段階；および
    検出する段階が、位置特定可能なアレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固相支持体に固定されたライゲーション産物配列の存在を示し、それによって試料中に一つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列が存在することが示される、リガーゼ検出反応混合物に一回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイクルを行った後、ライゲーション産物配列が捕捉オリゴヌクレオチドと塩基特異的にハイブリダイズするために有効な条件で、固相支持体と接触させ、それによって固相支持体の相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で位置特定可能なアレイ特異的部分を捕捉する段階。
  11. 以下の段階をさらに含む、１つまたはそれ以上の単一塩基の変化、挿入、置換または転位のために異なり、試料中に未知量で存在する一つまたはそれ以上の少量存在配列の、複数の標的ヌクレオチドにおける一つまたはそれ以上の大量存在配列に対する相対量が定量される、請求項８記載の方法：
    一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に一回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行った後、一次伸長産物の量を定量する段階；
    一つまたはそれ以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を提供する段階；
    マーカー標的ヌクレオチド配列のために特にデザインされたプローブセットを含む一つまたはそれ以上の配列特異的プローブセットを提供する段階；
    マーカー標的ヌクレオチド配列、およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特にデザインされたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と共に混和する段階；
    ライゲーション産物配列の量を定量する段階；および
    試料中の一つまたはそれ以上の少量存在標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量的測定を提供するために、未知の少量存在試料から生成されたライゲーション産物配列の量を、既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成されたライゲーション産物の量と比較する段階。
  12. 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：1,000モル比未満で存在する、請求項１１記載の方法。
  13. 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：10,000モル比未満で存在する、請求項１１記載の方法。
  14. 一つまたはそれ以上の単塩基の変化、挿入、欠失、または転位のために異なり、未知量で試料中に存在する少量存在配列の一つまたはそれ以上の相対量が、試料中の大量存在配列の量と比較して１：100,000モル比未満で存在する、請求項１１記載の方法。
  15. 前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド類似体がプライマーの3'末端である、請求項８記載の方法。
  16. ヌクレオチド類似体が、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)イミダゾール-4-カルボキサミド、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、2'-デオキシイノシン、6-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン、2-アミノ-7-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-6-メトキシアミノプリン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-4-ヨードピラゾール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)ピロール-3-カルボキサミド、および1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-4-ニトロピラゾールからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
  17. 以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法：
    エンドヌクレアーゼ消化反応を繰り返すあいだに、制限エンドヌクレアーゼが残っている任意の大量存在標的の中に含まれる制限エンドヌクレアーゼ認識部位も認識して切断し、それによって、大量に存在する三次伸長産物が選択的に破壊される、三次ポリメラーゼ連鎖反応混合物に二回またはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを行う段階の後、そしてリガーゼ検出反応混合物に一回またはそれ以上のリガーゼ検出反応サイクルを行う段階の後に、エンドヌクレアーゼ消化反応を繰り返す段階。
  18. 以下を含む、複数の標的ヌクレオチド配列における大量存在配列から、一つまたはそれ以上の単一塩基の変化、挿入、または欠失のために異なる一つまたはそれ以上の少量存在配列を同定するキット：
    一次オリゴヌクレオチドプライマーが、一次伸長産物が形成されるように、対応する大量存在および少量存在標的ヌクレオチド配列の相補鎖上でのハイブリダイゼーションに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合にそのようなポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミスマッチを有する、（a）標的特異的部分を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを特徴とする一次オリゴヌクレオチドプライマーセット；
    特定のセットにおける二次オリゴヌクレオチドプライマーが、大量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むまたは作製するが、一つまたはそれ以上の少量存在標的を増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含まないまたは作製しない、二次伸長産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖上でのハイブリダイゼーションに適している（a）標的特異的部分と5'上流二次プライマー特異的部分とを有する第一のオリゴヌクレオチドプライマー、および（b）標的特異的部分と5'上流二次プライマー特異的部分とを有する第二のオリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする二次オリゴヌクレオチドプライマー；
    三次オリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、二次伸長産物の全てを増幅してもよい、（a）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第一のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第一の三次プライマーと、（b）二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第二のオリゴヌクレオチドプライマーの5'上流部分と同じ配列を含む第二の三次プライマーとを特徴とする三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；ならびに
    特定のセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブが、相補的三次伸長産物特異的部分上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に共にライゲーションされることに適しているが、試料中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合にそのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、各セットが、（a）三次伸長産物特異的部分と検出可能なレポーター標識とを有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および（b）三次伸長産物特異的部分を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブを特徴とする、複数のオリゴヌクレオチドプローブセット。
  19. 以下をさらに含む、請求項１８記載のキット：
    標的特異的部分が二次オリゴヌクレオチドプライマーセットと同一または実質的に同一であるが、少なくとも一つのプライマーが一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体を含み、特定のセットにおける前二次オリゴヌクレオチドプライマーが、一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体と反対鎖塩基変化とを含む前二次伸長産物が形成されるように、一次伸長産物の相補鎖上でのハイブリダイゼーションに適している、前二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、その後の二次ポリメラーゼ連鎖反応における制限エンドヌクレアーゼ認識部位への一次伸長産物配列の変換を促進する、（a）標的特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーと、（b）標的特異的部分を有する第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを特徴とする前二次オリゴヌクレオチドプライマーセット。
  20. リガーゼをさらに含む請求項１８記載のキット。
  21. ポリメラーゼをさらに含む、請求項１８記載のキット。
  22. 制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項１８記載のキット。
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