KR102126744B1

KR102126744B1 - 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법

Info

Publication number: KR102126744B1
Application number: KR1020157028341A
Authority: KR
Inventors: 키요유키 마스무라; 나리아키 타카츠; 타카시 우에모리; 히로유키 무카이
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2020-06-26
Also published as: EP2975124B1; CN105189746B; US20190100736A1; US20190017037A1; EP2975124A4; KR20150131146A; JPWO2014142261A1; US10131890B2; JP2016168061A; WO2014142261A1; US20190085307A1; US20160017300A1; US10294465B2; KR102213886B1; KR20200053661A; US10280412B2; US10196618B1; EP2975124A1; JP6009649B2; JP6216416B2

Abstract

신규의 내열성 미스매치 뉴클레아제를 사용한 미스매치 특이적 절단반응, 미스매치 뉴클레아제를 이용한 핵산 증폭반응에 있어서의 에러의 제거방법, 핵산 증폭반응 중에 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법, 및 그 억제방법을 이용한 1염기 다형 돌연변이를 가지는 핵산을 검출하는 방법이 제공된다.

Description

내열성 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법{METHOD FOR USING HEAT-RESISTANT MISMATCH ENDONUCLEASE}

본 발명은 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 염기쌍을 인식해서 절단하는 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물, 및 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 방법에 관한 것이다.

최근의 생물공학기술의 발전은 현저한데, 특히 게놈 해석법의 진보에 따른 대규모 게놈해석의 결과, 방대한 게놈 서열정보가 축적되어 오고 있다. 추가로 상기 정보를 각종 생리기능 해석과 조합시킴으로써, 기능적인 유전자 돌연변이가 많이 발견되었다. 이것들의 돌연변이 해석은 농작물의 개량이나 유용 미생물의 분리, 제작뿐만 아니라, 인간의 유전자 진단 등에도 이용되게 되어 오고 있고, 일반생활 상에도 커다란 혜택을 제공하고 있다.

이것들의 돌연변이의 해석법으로서는 게놈 서열을 직접 해석하는 이외에, 미스매치 염기쌍을 인식하는 효소그룹을 이용하는 방법이 수행되어 왔다. 돌연변이형과 야생형의 DNA를 짝짓기시켜서 형성된 미스매치 염기쌍에 대해서, 특이적 결합능력이 있는 인자를 결합시켜서 검출하는 해석방법이 그 하나이다. 대표적인 예로서는 대장균의 MutS, MutT, MutL 복합체를 이용한 돌연변이 부위의 검색을 들 수 있다(특허문헌 1).

또, 미스매치 부위를 특이적으로 절단하는 미스매치 엔도뉴클레아제를 이용하는 방법도 수행되고 있다. 이 경우에는, 미스매치 엔도뉴클레아제를 이용하고, 미스매치 염기쌍 부근에서 절단된 DNA 단편을 해석함으로써, 돌연변이의 유무나 그 위치를 검출한다. 대표적인 예로서는, 셀러리 유래의 CelI 유전자 산물을 이용하는 방법이 알려져 있으며(특허문헌 2), 실제로 돌연변이 염기의 해석에 이용되고 있다. 그러나, 이 효소는 내열성을 가지지 않고, PCR법 등 고온의 반응과정을 포함하는 수법에는 직접 사용할 수 없다. 이 때문에, 돌연변이 염기의 검출을 실시할 때에도 증폭, 미스매치 형성, 미스매치 절단, 검출의 4스텝이 필요하게 된다.

또, 돌연변이 해석 외에도 큰 영향을 끼치고 있는 생물 공학적 기술로서는 핵산 증폭기술을 들 수 있다.

이 핵산 증폭기술 중에서, 대표적인 기술인 폴리머라아제 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)법은 시험관 내에서 간편하게 소망하는 핵산단편을 증폭하는 기술로, 유전자에 관한 연구뿐만 아니라, 생물학, 의학, 농업 등의 폭넓은 분야에서 불가결의 실험수법이 되고 있다. PCR법은 돌연변이형 유전자의 검출이나, DNA의 메틸화의 해석에도 응용되고 있다.

또, LAMP법이나 ICAN법 등의 등온 핵산 증폭법은 특별한 기기를 필요로 하지 않기 때문에, 보다 저렴한 핵산 검출법으로서 사용되고 있다.

또, 최근에 수행되게 된 게놈 전체의 구조해석에 있어서는 특히 희소한 시료로부터의 해석을 실시한 후에, 전체 게놈 증폭법은 중요한 기술이다.

이것들의 핵산 증폭법의 문제점으로서, 일정 확률로 틀린 염기의 합입을 일으키는 것을 들 수 있다. 폴리머라아제의 개량 등을 통해서, 이 확률은 저감되어 왔지만, 여전히 정밀한 해석 시에는 장애가 되고 있다.

또, 핵산 증폭기술은 어떤 특정한 염기서열을 가지는 DNA의 증폭뿐만 아니라, 공통의 염기서열 영역을 양단에 지니는 DNA의 혼합물을 증폭할 때에도 사용된다. 구체적인 예로서는, 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리의 구축 등을 들 수 있지만, 그 때에 함유율이 높은 DNA 분자가 우선적으로 증폭되고, 다양한 종류의 DNA의 해석이나 스크리닝의 장애가 되는 경우가 있다.

그 문제를 해결하기 위해서, 자기 하이브리다이제이션을 이용한 정규화(normalization)에 의해 함유율이 높은 DNA의 비율의 저감이 수행되고 있다(비특허문헌 1). 또 PCR법과 자기 하이브리다이제이션을 조합시킨 SSH-PCR법도 사용되고 있지만(비특허문헌 2), 함유율이 높은 DNA와 상동성을 가지는 DNA도 제거될 위험성도 존재하고 있다.

또, 핵산 증폭법에 의한 DNA의 검출에 있어서는 검출대상의 DNA의 증폭과, 검출대상이 아닌 DNA의 증폭이 경합할 수 있는 경우가 있다. 즉, 검출대상 이외의 DNA도 동시에 증폭되어 대상의 DNA의 검출이 곤란한 경우이다. 사이클링 프로브나 TaqMan 프로브 등의 프로브를 사용한 리얼타임 PCR에 의해 검출대상의 DNA의 증폭만을 검출해서 상기한 문제를 해소할 수 있는 경우도 있지만, 검출대상이 아닌 DNA가 검출대상의 DNA에 대해서 대과잉으로 존재하는 경우에는, 대다수의 유사 DNA의 존재에 의한 위양성(false-positive)반응 때문에, 검출대상의 DNA의 검출은 곤란하게 된다.

이러한 문제는, 예를 들면 정상 대립 유전자의 존재하에서의 소수의 돌연변이 대립 유전자의 검출(혈중 순환 종양 DNA의 검출 등), 에피제네틱 어세이에서의 소수의 메틸화 혹은 비메틸화 대립 유전자의 검출, 모친의 혈액 중에 순환하는 소량의 태아 DNA서열의 검출 등의 실시에 있어서 일어날 수 있다.

상기의 문제를 해결하기 위해서, Restriction endonuclease-mediated selective polymerase chain reaction(REMS PCR)이라 불리는 방법이 개발되었다(비특허문헌 3). 이 방법은 내열성의 제한효소를 이용하고, 예를 들면 주형이 정상형의 염기서열을 가지는 경우에만 이 제한효소에 의한 절단이 일어나도록 설계한 프라이머를 사용해서, 돌연변이형의 염기서열을 가지는 DNA만을 선택적으로 검출하는 방법이다. 그렇지만, 검출하려고 하는 DNA에 따라서는 REMS PCR에 의한 선택적 검출에 적합한 인식서열을 가지는 내열성의 제한효소가 존재하지 않는 경우도 있다.

미국특허 제5922539호 명세서 국제공개 제01/062974호 팸플릿

"Nucleic Acids Research", 2004년 2월, 제32권, 3호, e37 "Methodsin Molecular Biology", 2009년, 제496권, 2호, p.223-243 "American Journal of Pathology", 1998년 8월, 제153권, 2호, p.373-379

본 발명의 목적은 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물, 및 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기의 사정을 감안해서 예의 노력한 결과, 복제기구의 1인자라고 생각되고 있었던 고세균 유래의 단백질이 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제의 효소활성을 가지고 있음을 발견했다.

또, 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리다이즈시켰을 때에 1이상의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드와 이 미스매치 엔도뉴클레아제의 존재하에서 핵산 증폭반응을 실시함으로써, 특정한 염기서열을 가지는 DNA의 증폭을 억제하는 것이 가능하게 되었다.

게다가, 이 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제를 기초로 해서, 염기특이성을 향상시킨 돌연변이형 미스매치 엔도뉴클레아제의 창제에 성공했다. 그리고 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용함으로써, 특정한 미스매치 염기쌍 이외의 절단이 억제되고, 보다 특이적인 증폭 억제가 가능한 것을 발견해 내고, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명의 제1 발명은 하기에 관한 것이다.

(1) 더블-스트랜드 핵산의 절단방법으로써, 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드를 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 작용시키고, 당해 더블-스트랜드 핵산의 양쇄를 미스매치 염기쌍 부위에서 절단하는 것을 특징으로 하는 방법:

(i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드,

(2) 상기 (1)에서, 미스매치 염기쌍이 더블-스트랜드 핵산상, 통상의 염기짝짓기를 실시하는 2개의 염기쌍 사이에 존재하는, 연속해서 1 이상 8 이하의 미스매치 염기쌍인 방법,

(3) 하기 (a)∼(c)를 포함하는 조성물:

(a) DNA 폴리머라아제;

(b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및

(c) 하기 (i)∼(iii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 일종의 폴리펩티드:

(4) 핵산의 증폭방법으로써, 하기 (a)∼(b)의 공정을 포함하는 방법:

(a) 상기 (3)에 기재된 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정; 및

(b) 공정 (a)에 의해 수득된 조성물을 적절한 조건하에서 반응시키고, 핵산증폭을 실시하는 공정,

(5) 상기 (4)에서, 핵산증폭이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법, 등온 핵산 증폭법, 또는 MDA(multiple displacement amplification)법으로 실시되는 방법,

(6) 하기 (A)∼(C)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 폴리펩티드:

(A) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 77번째의 트립토판이 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(B) 상기 (A)의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 77번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1∼10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(C) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판에 대응하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드,

(7) 상기 (6)에서, 하기 (A)∼(C)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 폴리펩티드:

(A) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(B) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 77번째의 페닐알라닌을 제외하는 1∼10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(C) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판에 대응하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌에 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드,

(8) 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로써, 하기의 (a)∼(d)의 존재하에서 핵산 증폭반응을 실시하는 공정을 포함하는 방법:

(a) 상기 특정한 염기서열을 가지는 핵산 또는 그 상보쇄와 하이브리다이즈시켰을 때에 1개 혹은 수 개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드;

(b) DNA 폴리머라아제;

(c) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및

(d) 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드,

(9) 상기 (8)에서, 핵산 증폭반응이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법, 또는 등온 핵산 증폭법인 방법,

(10) 상기 (8)에서, 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 하기 (i)∼(vi)로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 일종의 폴리펩티드인 방법;

(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(iv) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(v) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 77번째의 페닐알라닌을 제외하는 1∼10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(vi) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판에 대응하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌에 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드,

(11) 표적 DNA를 우선적으로 증폭하는 방법으로써, 당해 표적 DNA와 1개 혹은 수 개의 염기가 다른 염기서열의 DNA의 증폭을 상기 (8)에 기재된 방법으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법,

(12) 상기 (11)에서, 야생형 염기서열의 DNA와, 당해 DNA에 1염기 다형 돌연변이가 발생한 DNA를 구별해서 증폭하는 목적으로 사용되는 방법,

(13) 상기 (12)에서, 1염기 다형 돌연변이가 암화, 또는 암치료용 약제에 의한 치료효과와 상관하는 1염기 다형 돌연변이인 방법, 및

(14) 상기 (11)에서, DNA 증폭 반응이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR), 또는 등온 핵산 증폭법으로 실시되는 방법.

본 발명에 의해, 생물 공학상 이용가치가 높은 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제, 당해 미스매치 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물, 및 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용한 방법이 제공된다.

도 1은 실시예 2에서의 폴리아크릴아미드 겔전기영동의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 2에서의 PF0012 단백질의 미스매치 절단활성을 형광강도의 상승을 지표에 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 3에서의 PF0012 상동 단백질의 미스매치 절단활성을 형광강도의 상승을 지표로 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 5에서의 돌연변이형 PF0012 상동 단백질의 미스매치 절단활성을 형광강도의 상승을 지표로 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 6에서의 특이적 서열을 가지는 DNA의 증폭억제를 리얼타임 PCR의 기술을 사용해서 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 6에서의 HRM 해석법을 사용한 1염기 돌연변이 유전자의 검출을 나타내는 도면이다.

본 발명에 있어서 미스매치란 더블-스트랜드 핵산 중에 존재하는 James Dewey Watson-클릭 염기쌍과는 다른 염기의 짝짓기, 즉, G(구아닌 염기)-C(사이토신 염기), A(아데닌 염기)-T(타이민 염기) 또는 U(우라실 염기)의 염기쌍 결합 이외의 조합의 염기결합을 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드(미스매치 엔도뉴클레아제라고 기재하는 경우가 있다)란 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 부위를 절단하는 활성을 가지는 뉴클레아제를 의미한다. 상기의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성은 미스매치 염기쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에 인접하는 인산 디에스테르 결합을 절단하는 활성 외에, 미스매치 염기쌍으로부터 1∼5염기쌍, 바람직하게는 1∼3염기쌍 떨어진 뉴클레오타이드에 인접하는 인산 디에스테르 결합을 절단하는 활성을 포함한다. 본 발명에 있어서 미스매치 엔도뉴클레아제는 특정한 미스매치 염기쌍을 특이적으로 인식해서 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 활성을 가지는 것(예를 들면, GT 미스매치를 특이적으로 인식하는 것이나, GT 미스매치 및 GG 미스매치를 특이적으로 인식하는 것 등)일 수도 있다. 또, 본 발명에 있어서 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 부위를 절단하는 활성 외에, 싱글-스트랜드 DNA, 싱글-스트랜드 핵산과 더블-스트랜드 핵산의 정션부분, 더블 플랩 구조, 리플리케이션 포크구조, D-루프 구조, 및/또는 닉(nick)이 들어 간 홀리데이 정션 구조를 인식해서 핵산을 절단하는 활성을 가지고 있을 수 있다. 또, 본 명세서에 있어서 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제란 50℃ 이상의 온도에 있어서 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 부위를 절단하는 활성을 나타내는 뉴클레아제를 의미하고, 본 발명에서는 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제의 사용이 바람직하다.

본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에 사용되는 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제로서는 고세균 유래의 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다. 본 발명자들은, 지금까지 복제계의 1인자로 생각되고 있었던 Pyrococcus furiosus 유래의 폴리펩티드 PF0012(RefSeq ID: NP_577741, 서열목록의 서열번호 1)가 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제인 것을 알아냈다. 게다가, PF0012의 호모로그인 Methanocaldococcus jannaschii 유래의 폴리펩티드 MJ_0225(RefSeq ID: NP_247194, 서열목록의 서열번호 8), 및 Thermococcus barophilus 유래의 폴리펩티드 TERMP_01877(RefSeq ID: YP_004072075, 서열목록의 서열번호 7)도 동일하게 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제인 것을 알아냈다. 또, MJ_0225, TERMP_01877은 각각 PF0012의 아미노산 서열에 대해서 57%, 73%의 서열 동일성을 갖는다. 따라서 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는, 본 발명에 있어서의 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제로서 호적하다. 게다가, 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드도, 본 발명에 있어서의 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제로서 호적하다. 또, 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드도, 본 발명에 있어서의 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제로서 호적하다.

추가로, 본 발명자들은 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 중, 77번째의 트립토판 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 페닐알라닌에 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 G(구아닌 염기)-G(구아닌 염기) 미스매치를 특이적으로 인식하는 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제인 것을 알아냈다. 당해 미스매치 엔도뉴클레아제의 구아닌 염기끼리로 형성된 미스매치 염기쌍에 대한 절단활성을 측정한 바, 다른 미스매치 염기쌍에 대한 절단활성의 10배 이상이었다. 따라서 이렇게 해서 작성된 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 그 호모로그는 본 발명의 1형태이다. 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 및 그 호모로그로서는 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 77번째의 아미노산 잔기를 제외하는 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이며, 또, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판 잔기에 대응하는 아미노산 잔기가 트립토판 이외의 아미노산 잔기이고, 각각이 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다. 이러한 미스매치 엔도뉴클레아제는 후술하는 여러 가지의 용도, 예를 들면 특이적 DNA서열을 함유하는 DNA를 배제하고, 기타의 DNA를 증폭, 검출하는 방법에 호적하다.

여기에서, 미스매치 엔도뉴클레아제의 활성은 미스매치 염기쌍을 함유하는 더블-스트랜드 핵산을 기질로 해서 측정할 수 있다. 구체적으로는, 미스매치 염기쌍을 함유하는 더블-스트랜드 핵산을 조제한 후, 미스매치 엔도뉴클레아제에 대해서 과잉량의 당해 더블-스트랜드 핵산을 미스매치 엔도뉴클레아제와 반응시키고, 단위 시간당의 절단 핵산량을 측정함으로써 활성측정이 실시된다. 절단된 더블-스트랜드 핵산은 전기영동 등에 의해 절단을 받지 않은 핵산과 분리해서 정량하는 것이 가능하다. 절단을 받았을 경우에만 형광강도의 증가가 검출될 수 있도록 형광물질과 소광물질로 이중으로 표지한 더블-스트랜드 핵산을 사용하면, 반응용액 중의 형광강도를 적당한 시간별로 측정하는 것에 의해 활성을 간편하게 측정할 수 있다. 또, 기질이 되는 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 염기쌍의 염기를 변경함으로써, 특정한 미스매치 염기쌍에 대한 절단활성을 조사하는 것도 가능하다.

본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법은 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 그 호모로그를 작용시킴으로써 수행된다. 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모로그로서는 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 상기한 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 및 그 호모로그가 예시된다. 또, 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에서의 폴리펩티드의 유래생물로서는 고세균이 예시되고, 적합하게는 내열성의 고세균이, 더 적합하게는 Pyrococcus furiosus, Thermococcus barophilus, Methanocaldococcus jannaschii 등의 내열성의 고세균이 예시된다. 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에 있어서는, PF0012의 호모로그인 Methanocaldococcus jannaschii 유래의 폴리펩티드 MJ_0225(RefSeq ID: NP_247194, 서열목록의 서열번호 8) 또는 그 호모로그, 혹은 Thermococcus barophilus 유래의 폴리펩티드 TERMP_01877(RefSeq ID: YP_004072075, 서열목록의 서열번호 7) 또는 그 호모로그도 사용할 수 있다. 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모로그로서는 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다.서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 호모로그로서는 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 예시된다.

본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에 있어서의 미스매치 염기쌍은 더블-스트랜드 핵산의 내부(통상의 염기짝짓기를 실시하는 2개의 염기쌍 사이)에 존재하는 것이라면 더블-스트랜드 핵산 중에 1개의 미스매치 염기쌍이 존재하는 것에 한정되지 않고, 미스매치 염기쌍이 간격을 두고 복수 개 존재하는 것일 수도 있고, 2이상의 연속하는 미스매치 염기쌍이 존재할 수 있다. 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에서의 미스매치 염기쌍으로서는 바람직하게는 더블-스트랜드 핵산의 내부에 존재하는 1 또는 8 이하의 연속하는 미스매치 염기쌍, 더 바람직하게는 1 또는 4 이하의 연속하는 미스매치 염기쌍, 더욱 바람직하게는 2개의 연속하는 미스매치 염기쌍 또는 1개의 미스매치 염기쌍이 예시된다. 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법에 있어서, 더블-스트랜드 핵산 중에 복수의 미스매치 염기쌍이 존재하는 경우에는, 그 복수의 미스매치 염기쌍은 동종의 미스매치 염기쌍일 수도 있고, 또는 다른 종류의 미스매치 염기쌍일 수도 있다.

미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산으로서는 PCR산물, 게놈 DNA나 그 단편 등의 생물시료 유래의 핵산, 및 합성 핵산 등이 예시된다. 또, 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산은 복수의 생물시료 유래의 혼합물 또는 생물시료 유래의 핵산과 합성 핵산의 혼합물을 융해, 재어닐링시켜서 생성된 핵산혼합물일 수도 있다. 예를 들면, 돌연변이를 가지는 핵산과 야생형의 핵산을 혼합하고, 융해, 재어닐링 했을 경우, 미스매치 염기쌍이 형성되고, 이 부위에서 미스매치 엔도뉴클레아제의 절단을 받는다. 이렇게 해서 발생한 미스매치 엔도뉴클레아제에 의한 절단 후의 핵산단편의 크기를 관찰함으로써, 돌연변이의 유무, 위치를 검증할 수 있다. 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제를 이용하는 것에 의해, PCR법 등의 핵산 증폭법의 반응액에 이 미스매치 엔도뉴클레아제를 첨가하는 것 만의 1단계의 반응으로 돌연변이 해석을 실시하는 것이 가능하다. PCR법에 있어서는, 그 사이클 수를 일정 수 이상 증가시켜도, 증폭효과를 얻을 수 없게 된다는 것이 알려져 있다. 첨가되어 있는 핵산의 고갈이나, 프라이머와 반응 산물의 어닐링의 경합이 그 주된 원인이지만, 이 때에는 반응산물끼리의 어닐링이 일어나고 있으며, 돌연변이를 가지는 주형과 야생형의 주형이 혼재하고 있으면, 이것들로부터 증폭한 반응산물끼리의 어닐링에 의해 돌연변이 부위에 미스매치 염기쌍이 발생하게 된다. 따라서 본 발명의 미스매치 엔도뉴클레아제의 공존 하에서의 PCR를 통상보다도 증가시킨 사이클 수로 실시하는 것만으로, 돌연변이 해석이 가능하게 된다. 즉, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 더블-스트랜드 핵산에 작용시키는 것을 포함하는, 돌연변이 해석방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 더블-스트랜드 핵산에 작용시키는 것을 포함하는, 돌연변이 해석방법을 제공한다. 또한 추가로, 본 발명은 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 더블-스트랜드 핵산에 작용시키는 것을 포함하는, 돌연변이 해석방법을 제공한다.

또, 핵산 증폭반응의 과정에서도 본 발명의 더블-스트랜드 핵산의 절단방법을 실시할 수 있다. 핵산증폭의 반응액에 미스매치 엔도뉴클레아제를 첨가함으로써, 증폭과정이 잘못된 뉴클레오타이드의 합입으로 발생한 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산이 절단된다. 이 결과, 반응개시 전의 주형핵산과는 다른 서열의 핵산의 증폭이 억제된다. 이렇게 해서, 에러율이 저감된 핵산증폭이 가능하게 된다. 즉, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 사용해서 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 공정을 포함하는, 핵산 증폭방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 사용해서 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 공정을 포함하는, 핵산 증폭방법을 제공한다. 또 추가로, 본 발명은 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 그 호모로그를 사용해서 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 공정을 포함하는, 핵산 증폭방법을 제공한다. 그 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산을 절단하는 공정은 핵산 증폭공정과 동시에 수행될 수도 있다. 또, (a) DNA폴리머라아제, (b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 (c) (i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 (iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드를 포함하는 조성물도 본 발명의 1형태이다. 또, 본 발명의 다른 형태로서, (a) DNA 폴리머라아제, (b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 (c) (i) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (ii) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 (iii) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 또, 본 발명의 또 다른 형태로서, (a) DNA폴리머라아제, (b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 (c) (i) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (ii) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 (iii) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 동일하게, 추가로 상기의 핵산 증폭반응용의 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 포함하는 조성물을 조제하는 공정, 및 수득된 이 조성물을 적절한 조건하에서 반응시키고, 핵산증폭을 실시하는 공정을 포함하는 핵산의 증폭방법도 본 발명의 1형태이다.

상기의 조성물은 추가로 반응 완충제, 2가의 금속이온, 데옥시리보뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 및 인터컬레이팅 색소로부터 선택되는 적어도 1종을 포함할 수도 있다. 또, 상기의 조성물을 핵산 증폭반응에 사용하는 경우, 상기의 조성물은, 추가로 핵산 증폭반응의 주형이 되는 핵산을 포함할 수도 있다. 상기의 반응 완충제란 반응용액의 수소이온농도(pH)의 변동을 부드럽게 하는 작용을 가지는 화합물 또는 혼합물을 말한다. 일반적으로 약산과 그 염,혹은 약염기와 그 염의 혼합용액은 강한 완충작용을 가지므로, 반응 완충제로서 pH컨트롤의 목적으로 널리 사용되고 있다. 본 발명에 사용되는 반응 완충제로서는 예를 들면 Tris-HCl, HEPES-KOH 등의 굿버퍼(good's buffers)나 인산나트륨 버퍼 등의 인산 버퍼를 들 수 있다. 상기의 2가의 금속이온으로서는 예를 들면 마그네슘 이온, 망간 이온, 아연 이온, 및 코발트 이온을 들 수 있다. 2가의 금속이온은 염화물, 황산염, 또는 아세트산염 등의 염의 형태로 공급될 수 있다.

상기의 핵산의 증폭법으로서는 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, DNA를 증폭하는 방법이 예시된다. DNA를 증폭하는 방법으로서는 예를 들면 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법, MDA(Multiple displacement amplification)법, 및 ICAN법이나 LAMP법 등의 등온 핵산 증폭법을 들 수 있다.

상기의 핵산 증폭반응용의 조성물 중의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 농도는 적당하게 각각의 반응계에서 DNA의 증폭반응을 저해하지 않는 농도나 미스매치 염기쌍의 절단에 유효한 농도를 검정해서 결정하면 된다.

상기의 핵산 증폭반응용의 조성물에 사용되는 적어도 한 쌍의 프라이머로서는 각종 핵산 증폭법에 적합한 2개 이상의 프라이머가 선택된다. 이것들은, 소망하는 증폭이 발생하는 것이라면 DNA, RNA의 외, DNA의 일부가 RNA로 치환되어 있는 이른바 키메라 프라이머일 수도 있다. 또, 공지의 핵산 아날로그를 포함하는 프라이머나 검출 등을 목적으로 한 형광색소 등에 의해 표지된 프라이머일 수도 있다.

추가로, 본 발명자들은 미스매치 엔도뉴클레아제와 적절하게 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드를 이용해서, 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제 가능한 것을 발견했다. 따라서 (a) 상기 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리다이즈시켰을 때에 1개 혹은 수 개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드, (b) DNA폴리머라아제, (c) 적어도 한 쌍의 프라이머, 및 (d) 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 존재하에서 핵산 증폭반응을 실시하는 공정을 포함하는, 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법도 본 발명의 1형태이다. 또, 이 방법을 사용해서 표적핵산의 염기서열과 1개 혹은 수 개의 염기가 다른 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 것에 의해서, 표적핵산을 우선적으로 증폭하는 방법도 본 발명의 1형태이다.

상기의 (a)의 올리고데옥시 뉴클레오타이드는, 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리다이즈시켰을 때에 1개 혹은 수 개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드이라면 특별하게 한정은 없고, DNA의 일부가 RNA에 치환되어 있는 소위 키메라올리고데욕시 뉴클레오타이드일 수도 있다. 또, 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 이 올리고데옥시 뉴클레오타이드의 3'말단은 이 올리고데옥시 뉴클레오타이드로부터의 DNA 폴리머라아제에 의한 신장반응을 억제하기 위한 변형이 가해져 있을 수도 있다. 예를 들면, 아미노화 등의 변형이 예시된다. 또, 올리고데옥시 뉴클레오타이드는 이 올리고데옥시 뉴클레오타이드가 결합하는 핵산이 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 절단을 받는 한에 있어서, 포스포로티오에이트화나 기타의 변형에 의해 데옥시리보뉴클레아제부터의 절단으로부터 보호되고 있을 수 있다. 추가로, 검출 등을 목적으로 한 형광색소나 소광물질 등에 의해 표지되어 있을 수도 있다.

상기 올리고데옥시 뉴클레오타이드의 쇄길이는 실시되는 반응의 조건하에서 상기 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 이 올리고데옥시 뉴클레오타이드가 하이브리다이즈될 수 있도록, 적당하게 결정할 수 있다. 또, 특정한 염기서열을 가지는 핵산과 하이브리다이즈시켰을 때에 미스매치를 발생하는 위치는 이 올리고데옥시 뉴클레오타이드의 5'말단, 3'말단의 양쪽으로부터 적어도 3뉴클레오타이드 이상 떨어져 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에는, 미스매치 부위를 특이적으로 절단하는 활성을 가지는 임의의 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭법으로서 고온에서의 반응을 포함하는 PCR법과 같은 방법으로, 내열성 DNA 폴리머라아제를 사용하는 경우에는, 미스매치 엔도뉴클레아제도 내열성을 가지는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 이러한 경우에는, 상기의 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제, 즉, (i) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, (iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, (iv) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (v)서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, (vi) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, (vii) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, (viii) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 및 (ix) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1종의 폴리펩티드를 사용하는 것이 호적하다.

본 발명의 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에는 특정한 미스매치 염기쌍을 포함하는 더블-스트랜드 핵산만을 특이적으로 절단하는 활성을 가지는 미스매치 엔도뉴클레아제를 사용하는 것이 더 바람직하다. 이 경우, 증폭 억제하는 염기서열을 1종류로 한정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는, G(구아닌 염기)-G(구아닌 염기) 미스매치를 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 특이적으로 절단하기 위해서, G(구아닌 염기) 이외의 염기가 미스매치를 발생하는 위치에 존재하는 더블-스트랜드 핵산은 절단되지 않고, 증폭억제를 받는 경우가 없다. 즉, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 이루어지는 폴리펩티드, 및 그 호모로그는 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에 호적하다.

따라서 본 발명은 추가로, 하기 (a)∼(d)를 포함하는 핵산 증폭반응용 조성물을 제공한다:

(a) 특정한 염기서열을 가지는 핵산 또는 그 상보쇄와 하이브리다이즈시켰을 때에 1개 혹은 수 개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드;

(b) DNA 폴리머라아제;

(c) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및

(d) 하기 (i)∼(xii)으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 일종의 폴리펩티드:

(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(iii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(v) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 77번째의 페닐알라닌을 제외하는 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(vi) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 77번째의 트립토판에 대응하는 아미노산 잔기가 페닐알라닌에 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(vii) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(viii) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(ix) 서열목록의 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드;

(x) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(xi) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드; 및

(xii) 서열목록의 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열에 대해서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 또 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드. 상기한 조성물은 추가로 반응 완충제, 2가의 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 및 인터컬레이팅 색소로부터 선택되는 적어도 1종을 포함할 수도 있다. 또, 상기한 조성물은 추가로 핵산 증폭반응의 주형이 되는 핵산을 포함할 수도 있다.

본 발명의 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법은 임의의 핵산 증폭법에 있어서 실시할 수 있다. 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, DNA를 증폭하는 방법에 특히 호적하다. 예를 들면 PCR법, MDA법, 및 ICAN법이나 LAMP법 등의 등온 핵산 증폭법 등으로 본 발명을 수행할 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법은 임의의 핵산을 대상으로 해서 실시할 수 있다. DNA를 증폭 대상으로 하는 경우에는, 인공적으로 제작된 DNA 혼합물, 환경유래 시료나 생물유래의 시료, 또는 그 시료보다 조제된 DNA 혼합물 중에 존재하는 DNA가 예시된다. 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 생물유래의 시료로서는 인간 등의 포유류 유래의 시료가 예시된다. 또, 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, DNA 혼합물로서는 단편화된 게놈 DNA 혼합물, mRNA으로부터 역전사 반응에 의해 발생한 cDNA 혼합물, 복수의 PCR 산물의 혼합물 등이 예시된다. 증폭이 억제되는 특정한 염기서열을 가지는 DNA로서는 분리되지 않고 남는 rRNA 유래의 역전사 산물이나, 프라이머끼리의 짝짓기에 의해 발생하는 저분자 DNA 등이 예시된다. 나중에 기능적 스크리닝을 실시하는 유전자 라이브러리를 증폭하는 경우에는, 양성을 나타내는 기지의 유전자의 서열을 가지는 DNA의 증폭을 억제함으로써, 보다 효율적으로 미지유전자를 탐색할 수 있는 라이브러리의 제작도 가능하게 된다.

본 발명(8)의, 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에 있어서의 (d)의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 농도는 적당하게 각각의 반응계에서 DNA의 증폭 반응을 저해하지 않는 농도나 미스매치 염기쌍의 절단에 유효한 농도를 검정해서 결정할 수 있다. (a) 의 올리고데옥시 뉴클레오타이드의 농도는 주형량이나 목적 DNA의 증폭효율을 감안해서, 사용농도를 최적화하고, 결정할 수 있다. 예를 들면 증폭반응에 사용되는 프라이머의 농도의 0.1배∼10배의 농도로 실시 가능하다.

본 발명(11)의, 표적 DNA를 우선적으로 증폭하는 방법은, 추가로 증폭된 표적 DNA를 검출하는 공정을 포함할 수도 있다. 본 명세서에서는 본 발명의 이 형태를 「본 발명의 검출방법」이라고 기재하는 경우가 있다. 예를 들면, DNA를 검출대상으로 하는 본 발명의 검출방법에 의하면, 검출대상이 아닌 DNA(특정한 염기서열을 가지는 DNA)가 검출대상의 DNA(표적 DNA)에 대해서 대과잉으로 존재하는 경우에 있어서도, 본 발명(8)의 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법에 있어서의 (a)의 올리고데옥시 뉴클레오타이드와 (d)의 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드에 의해서 검출대상이 아닌 DNA를 주형으로 한 DNA의 증폭이 억제되기 때문에, 검출대상의 DNA의 검출을 실시하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 검출방법은 예를 들면 돌연변이의 존재가 알려져 있는 유전자에 대응하는 핵산에 대해서, 야생형과 돌연변이형을 구별해서 검출하는 것을 가능하게 한다. 특정한 염기서열을 가지는 핵산으로서, 야생형의 염기서열을 함유하는 DNA를 설정해서 본 발명의 검출방법을 실시하는 것에 의해, 대과잉의 정상 대립 유전자(즉 야생형의 염기서열을 가지는 DNA)의 존재하에서의 소수의 돌연변이 대립 유전자의 검출이 가능하게 된다. 예를 들면 혈중 순환 종양 DNA의 검출이나 모친의 혈액 중에 함유되어 있는 소량의 태아 DNA 서열의 검출에 본 발명의 방법은 유용하다. 당해 돌연변이로서는 미소결실 및 점돌연변이가 예시된다. 또, 점돌연변이에 의해 발생한 다형은 1염기 다형 (SNPs)이라고 불린다. 본 명세서에서는 SNPs 중 돌연변이형의 염기서열을 가지는 DNA를, 1염기 다형 돌연변이를 가지는 DNA라고 기재하는 경우가 있다.

본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 상기의 특정한 염기서열을 가지는 핵산으로서는 종양 마커로서 이용되는 1염기 다형 돌연변이, 암치료용 약제에 의한 치료효과와 상관하는 1염기 다형 돌연변이, 및 세포의 암화와의 상관이 알려져 있는 1염기 다형 돌연변이로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1개의 1염기 다형 돌연변이를 포함하는 핵산이 바람직하다. SNPs에는 종양세포에 고빈도로 인정되는 것이나, 암치료용 약제에 의한 치료효과나 발암과의 상관이 알려져 있는 것이 있다. 이러한 SNPs로서는 K-ras 유전자, B-raf 유전자, 표피성장인자 수용체(EGFR) 유전자의 SNPs가 예시된다. K-ras 유전자의 체세포 돌연변이는 결장직장암, 폐선암, 갑상선암 등에 있어서 고빈도로 인정된다. B-raf 유전자의 체세포 돌연변이는 결장직장암, 악성 흑색종, 갑상선 유두암, 비소세포폐암, 폐선암 등에 있어서 고빈도로 인정된다. 또, EGFR 유전자의 체세포 돌연변이는 다양한 고형종양에 있어서 고빈도로 인정된다. 게피티닙이나 엘로티닙 등의 EGFR 저해제에 의한 암의 치료는 암조직의 EGFR 유전자가 특정한 1염기 다형 돌연변이를 가지는 경우에 유효한 가능성이 높을 것이 알려져 있다. 한편, 암조직의 K-ras 유전자가 1염기 다형 돌연변이를 가지는 경우에는, EGFR 저해제로의 저항성을 나타낼 가능성이 높은 것이 알려져 있다.

본 발명의 검출방법은 생물유래 시료로부터 추출한 메틸화 DNA를 포함하는 조성물을 아황산 수소염 처리한 후에 수득된 DNA를 재료로 해서 실시할 수도 있다. 본 발명의 검출방법에 의하면, 대과잉의 비메틸화 대립 유전자의 존재하에서의 소수의 메틸화 대립 유전자의 검출, 혹은 대과잉의 메틸화 대립 유전자의 존재하에서의 소수의 비메틸화 대립 유전자의 검출을 실시할 수 있다.

상기의 아황산 수소염에 의한 처리로서, 메틸화 DNA의 검출에 사용되는 공지의 아황산 수소염법(바이셀파이트법)을 이용할 수 있다. 당해 처리에 의해 비메틸화 사이토신은 우라실로 변환되지만, 메틸화 사이토신은 변화되지 않는다. 또, 이 바이설파이트 처리완료의 반응액을 PCR법으로 증폭하면, 우라실은 타이민으로 변환되어고 메틸화 사이토신은 사이토신이 된다. 즉 특정한 부위에서의 대과잉의 비메틸화 대립 유전자의 존재하에서의 소수의 메틸화 대립 유전자의 검출, 혹은 대과잉의 메틸화 대립 유전자의 존재하에서의 소수의 비메틸화 대립 유전자의 검출은 각각 대과잉의 타이민 중의 사이토신의 존재, 또는 대과잉의 사이토신 중의 타이민의 존재를 검증하는 것이다. 여기에서 대과잉으로 존재하는 타이민 혹은 사이토신을 함유하는 DNA로부터의 증폭을 억제할 수 있으면, 소수의 메틸화 대립 유전자 혹은 비메틸화 대립 유전자의 존재는 간단하게 검증할 수 있다.

본 발명의 검출방법에서의 표적핵산을 검출하는 공정에는, 전기영동, 염기서열해석, 사이클링 프로브나 TaqMan 프로브 등의 프로브를 사용거나, 리얼타임 PCR을 이용할 수 있다. 이것들의 검정방법은 일반적인 수법을 그대로 사용하는 것이 가능하다. 특히 HRM(High Resolution Melting) 해석법을 사용했을 경우, 목적 DNA의 증폭과 검출을 1단계로 실시할 수 있고, 신속 또한 간편한 목적 DNA의 검증이 가능하게 된다.

실시예

이하에 본 발명을 실시예에 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

조제예 1: 게놈 DNA의 조제

Pyrococcu sfuriosus의 게놈 DNA의 조제는, 일본특허 제3742659호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 실시했다. Thermococcus barophilus, 및 Methanocaldococcus jannaschii의 게놈 DNA의 조제는 균주로서 Thermococcus litoralis의 대신에 Thermococcus barophilus, 또는 Methanocaldococcus jannaschii를 사용하는 이외는 국제공개 제02/22831호 팸플릿의 실시예 8에 기재된 방법에 따라서 수행했다. 또, 이것들의 균주는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에서 구입 가능하다.

조제예 2: PF0012 단백질의 조제

(1) PF0012의 발현용 플라스미드 pET-PF12의 제작

PF0012 단백질의 기능해석을 실시하기 위해서, 대장균에서의 강제 발현계를 구축했다. Genbank Acc.NC_003413에서 공개되어 있는 Pyrococcus furiosus PF0012 유전자의 단백질 번역영역(염기번호 11810-12610)을 In-Fusion(등록상표) HD Cloning Kit(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 클로닝하기 위해서, 2종의 프라이머, PF12F와 PF12R를 설계했다. PF0012의 아미노산 서열을 서열번호 1에, 프라이머 PF12F와 PF12R의 염기서열을 각각 서열번호 3, 4에 나타낸다. Pyrococcus furiosus의 게놈 DNA를 주형으로 해서, 이것들의 프라이머를 사용해서 PrimeSTAR(등록상표) HS DNA Polymerase(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 당해 영역을 증폭했다. 이 증폭영역의 염기서열을 서열번호 5에 나타낸다. 이 증폭단편을 In-Fusion(등록상표) HD Cloning Kit를 사용해서 플라스미드 pET15b(Merck Millipore Corporation.)의 NdeI, BamHI 절단 사이트 사이에 삽입했다. 이 In-Fusion 반응액을 사용해서 대장균 JM109주를 형질전환하고, 암피실린 내성이 된 클론으로부터, PF0012 발현 플라스미드 pET-PF12를 분리했다. 이 플라스미드를 지니는 대장균의 조추출액으로브터 후술하는 실시예 2에 기재된 방법에 의해 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 검출할 수 있었다. 그러나 이 플라스미드는 매우 안정성이 나쁘고, 내부결실을 고빈도로 일으키기 때문에, 단백질 생산에는 적당하지 않았다.

(2) 최적화 PF0012 발현용 플라스미드 pET-optPF12의 제작

pET-PF12를 사용한 PF0012 단백질의 발현이 안정하지 않았기 때문에, PF0012의 아미노산 서열을 대장균형의 코돈으로 코딩하는 염기서열을 설계하고, 이 서열을 포함하는 DNA를 인공 합성했다. 이 DNA의 염기서열을 서열번호 6에 나타낸다. 이 DNA를 제한효소 NdeI, BamHI로 절단한 후, 정제를 실시하고, 수득된 DNA 단편을 플라스미드 pET15b의 동일한 제한효소 부위 사이에 DNA Ligation Kit <Mighty Mix>(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 삽입했다. 이 Ligation 반응액을 사용해서 대장균 JM109주를 형질전환하고, 암피실린 내성이 된 클론을 선택했다. 이 클론으로부터 최적화 PF0012 발현 플라스미드 pET-optPF12를 얻었다.

(3) PF0012 단백질의 발현

플라스미드 pET-optPF12로 대장균 BL21 DE3주를 형질전환하고, 암피실린 내성이 된 클론을 분리했다. 수득된 신선한 단일 콜로니를 암피실린 100㎍/㎖을 포함하는 LB배지(이하, 'LB-AP배지'라고 한다.) 2㎖에 접종하고, 37℃에서 철야 배양을 실시했다. 철야 배양액 500㎕을 50㎖의 LB-AP배지에 첨가해서 37℃에서 3시간 배양한 후, 배양액에 최종농도 1mM의 IPTG을 첨가해서 추가로 37℃에서 3시간 배양했다. 배양종료 후, 6000×g 10분의 원심분리를 실시해서 배양액에서 균체를 채취했다.

(4) PF0012 단백질의 정제

상기에서 수득된 균체를 3㎖의 50mM Tris·HCl pH7.5, 100mM NaCl용액(이하, 'Buffer A'라고 한다.)에 현탁하고, VP-5SUltras. Homogenizer(TAITEC사)를 사용해서 초음파 파쇄를 실시했다. 30초간의 초음파처리를 3회 반복하는 조작을 실시하고, 현탁액이 투명해지는 것을 확인했다.

초음파 파쇄 후의 현탁액을 95℃ 10분, 가온해서 역열성 단백질을 변성시키고, 17000×g, 10분 원심해서 상청액을 회수했다. 이렇게 해서 얻은 조추출액에 대해서 500㎕의 Ni-NTA Agarose(Qiagen사)를 첨가해서 4℃에서 2시간 느릿하게 교반했다. 이 수지를 Econo-Pac(등록상표) 칼럼(Bio-rad사)에 충전하고, 5mM 이미다졸을 포함하는 Buffer A 20㎖로 세정했다. 세정 후 1㎖의 300mM 이미다졸을 포함하는 Buffer A로 PF0012 단백질을 용출했다. 용출액을 4℃, Buffer A로 2회 투석하고, 추가로 50% Glycerol을 포함하는 Buffer A로 4℃ 철야 투석하고, PF0012 단백질 용액을 얻었다.

조제예 3: PF0012 상동 단백질의 조제

(1) PF0012 상동 단백질의 발현용 플라스미드 pET-TBA, pET-MJA의 제작

고세균에 속하는 Thermococcus barophilus, Methanocaldococcus jannaschii의 2개의 균주로부터 PF0012 상동 단백질의 분리를 목표로 하고, 이것들을 코딩하는 영역의 클로닝을 실시했다. 이 2개의 주 유래의 PF0012 상동 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 7, 8에 나타낸다.

각각, Genbank Acc.CP002372.1 , Genbank Acc.NC_000909.1 에서 공개되어 있는 염기서열정보로부터, 각각의 PF0012 상동 단백질의 번역영역에 상당하는 서열정보(TERMP_01877: 염기번호 1674836-1675591, MJ_0225: 염기번호 215449-216240)를 취득하고, 대응 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머의 설계 및 제작을 실시했다. TERMP_01877 유전자의 클로닝에는 TBA1877F, TBA1877R의 프라이머쌍, MJ_0225유전자의 클로닝에는 MJ255F, MJ255R의 프라이머쌍을 사용했다. 각각의 프라이머의 염기서열을 각각 서열번호 9, 10, 11, 12에 나타낸다.

Thermococcus barophilus , Methanocaldococcus jannaschii의 게놈 DNA를 주형으로 해서, 상기의 프라이머쌍과 PrimeSTAR(등록상표) HS DNA Polymerase(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 당해 영역을 증폭했다. 증폭된 DNA의 서열을 염기서열 13, 14에 나타낸다. 상기한 pET-PF12의 제작과 동일하게, 이 증폭 DNA를 각각 플라스미드 pET15b에 삽입하고, 플라스미드 pET-TBA, 플라스미드 pET-MJA를 제작했다.

(2) PF0012 상동 단백질의 발현

PF0012 상동 단백질의 발현, 정제는 사용하는 플라스미드를 pET-TBA, pET-MJA로 변경하고, 균체 파쇄후의 이열성 단백질을 침전시키기 위한 고온처리를 75℃, 10분으로 변경하는 이외는, 상기한 PF0012 단백질의 발현의 경우와 동일하게 수행하고, PF0012 상동 단백질인 TERMP_01877 단백질, MJ_0225 단백질을 얻었다.

실시예 1: 돌연변이형 PF0012 단백질의 조제

(1) 돌연변이형 PF0012의 발현용 플라스미드 pET-optPF12-W77F의 제작

PF0012 단백질의 상동 단백질 NucS의 해석(The EMBO Journal, 2009년, 제28권, p.2479-2489)으로, ssDNA 결합영역으로 생각된 PF0012 단백질(서열번호 1)의 77번째의 아미노산 트립토판(코돈 TGG)을 페닐알라닌(코돈 TTT)로 변환한 돌연변이형 PF0012을 코딩하는 유전자를 제작했다. 이 돌연변이형 PF0012 단백질(이하, 'W77F 돌연변이체'라고 기재한다.)의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다.

돌연변이 도입용의 프라이머로서 서열번호 15, 16에 나타나는 mutF1, mutR1을 제작했다. pET-optPF12을 주형으로서 상기의 프라이머와 PrimeSTAR(등록상표) Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 PCR를 실시했다. 이 증폭 반응액을 사용해서 대장균 JM109을 형질전환하고, 암피실린 내성이 된 클론으로부터, W77F 돌연변이체 발현 플라스미드 pET-optPF12-W77F를 얻었다.

(2) W77F 돌연변이체의 발현, 정제

W77F 돌연변이체의 발현, 정제는 사용하는 플라스미드를 pET-optPF12-W77F로 변경한 이외는, 상기한 야생형 PF0012 단백질의 경우와 동일하게 실시했다.

실시예 2: PF0012 단백질의 미스매치 절단활성

(1) 절단활성 측정용 기질의 제작1

PF0012 단백질의 미스매치 절단활성을 확인하기 위해서, 활성검출용 기질을 제작했다.

FAM 및 ROX로 각각 5'말단을 표지한 2개의 합성 DNA를 혼합, 어닐링한 것을 기질로서 사용했다. ROX 표지 DNA는 ROX-probe-G, ROX-probe-A, ROX-probe-T, ROX-probe-C의 4종을 합성했다. 이들 4종 각각의 염기서열을 서열번호 17, 18, 19, 20에 나타낸다. ROX-probe-G , ROX-probe-A, ROX-probe-T, ROX-probe-C는 5'말단으로부터 11번째의 염기 이외는 동일한 염기서열을 하고 있고, 11번째에는 각각 G, A, T, C의 염기가 삽입되어 있다. FAM 표지 DNA는 FAM-probe-G, FAM-probe-A, FAM-probe-T, FAM-probe-C의 4종을 합성했다. 각각의 염기서열을 서열번호 21, 22, 23, 24에 나타낸다. FAM-probe-G , FAM-probe-A, FAM-probe-T, FAM-probe-C도, 동알하게 5'말단으로부터 15번째의 염기(각각 G, A, T, C) 이외는 동일한 서열이다. 이들 중 ROX 표지 DNA와 FAM 표지 DNA를 각각 1종 선택해서 혼합해서 하이브리다이즈시키고, 미스매치 절단활성을 검출하기 위한 기질로 했다. 이들 기질은 ROX로 표지된 염기로부터 세서 11번째의 염기 이외에서 염기쌍을 형성하고, 11번째의 염기에 1개소의 미스매치 염기쌍을 보유하는 더블-스트랜드 DNA이다.

(2) PF0012 단백질에 의한 미스매치 절단반응(PAGE에 의한 검출)

5μM ROX 표지 DNA 1종 1㎕, 5μM FAM 표지 DNA 1종 1㎕, 10×Ex taq Buffer(TAKARA BIO INC. TaKaRaExTaq(등록상표)에 부속) 1㎕, PF0012 단백질과 H₂O를 첨가하는 것으로 최종 반응액량 10㎕로 했다. 이 반응액을 60℃에서 1시간 보온한 후, 반응을 정지시켜서, 10% 폴리아크릴아미드 변성 겔로 전기영동을 실시했다. 영동 후, 겔 중의 형광 시그널을 FMBIO(등록상표)(Hitachi Solutions, Ltd.)로 검출했다.

도 1의 a)는 ROX의 시그널을 검출한 도면이고, 도 1의 b)는 같은 동일한 겔로부터 FAM의 시그널로 검출한 것이다. 도면의 상부의 ROX의 왼쪽에 나타난 알파벳은 사용한 ROX 표지 DNA의 종류를 나타내고 있다. 즉 G, A, T, C는 각각 ROX-probe-G, ROX-probe-A, ROX-probe-T, ROX-probe-C가 사용된 것을 나타내고 있다. 동일하게 FAM의 왼쪽의 알파벳은 FAM 표지 DNA의 종류를 나타내고, G, A, T, C는 각각 FAM-probe-G, FAM-probe-A, FAM-probe-T, FAM-probe-C가 사용된 것을 나타내고 있다. 공란으로 되어 있는 경우에는 FAM 표지 DNA는 사용되지 않고, ROX 표지 DNA에서만 반응된 것을 나타낸다.

양쪽의 검출계에 있어서, G-G, G-T, T-G, T-T의 미스매치가 존재하는 기질을 사용했을 경우만, 저분자 영역에 절단단편으로 생각되는 DNA 유래의 형광 시그널이 관찰되었다. 이것은 PF0012 단백질이 G-G, G-T, T-G, T-T의 미스매치 부위를 인식하고, 그 부근에서 DNA의 양쇄를 절단하는 활성을 가지는 것을 나타내고 있다.

또, 절단단편에 의한 시그널이 스미어 패턴을 나타내지 않는 것으로부터, PF0012 단백질은 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는 것으로 생각되었다. 또, 단일 형광표지 DNA만을 사용했을 경우에도 저분자 영역에 형광 시그널은 관찰되지 않는 것으로부터, PF0012 단백질은 싱글-스트랜드의 DNA에 대한 절단활성도 거의 가지지 않는 것이 밝혀졌다.

PF0012 단백질은 절단할 수 있는 미스매치의 염기에 선택성을 가지지만, 미스매치에 대한 특이성이 높고, 통상의 염기쌍을 형성하는 더블-스트랜드 DNA, 및 싱글-스트랜드의 DNA에 대해서는 반응성이 낮은 것이 분명하게 되었다. 본 단백질의 높은 미스매치에 대한 특이성은 핵산 증폭반응으로의 첨가라고 하는 점에서, 반응저해를 일으키기 어려워 유리하다.

(3) 절단활성 측정용 기질의 제작2

PF0012에 의한 미스매치 절단활성을 연속적으로 관찰하기 위해서, 절단에 의해 형광 시그널을 출발하는 기질을 제작했다.

5 '말단에 소광물질인 eclipse, 3'말단에 FAM을 결합시킨 서열번호 25, 26, 27, 28으로 나타나는 염기서열의 DNA, DD-probe-G, DD-probe-A, DD-probe-T, DD-probe-C를 합성했다. 추가로 상보쇄측의 template DNA로서 서열번호 29, 30으로 나타나는 template-G, template-T를 제작했다. 형광 표지된 DNA와 template DNA를 혼합함으로써, 5'말단의 염기로부터 5번째에 미스매치 염기쌍을 보유하는 더블-스트랜드 DNA기질을 제작했다.

(4) PF0012 단백질에 의한 미스매치 절단반응의 연속적 관찰

5μM 형광 표지된 DNA(DD-probe-G, DD-probe-A, DD-probe-T, DD-probe-C의 어느 하나) 1.5㎕, 25μM template-G 1㎕, 10×Ex taq Buffer 2.5㎕, PF0012 단백질과 H₂O를 첨가하는 것으로 25㎕로 했다. 이 반응액을 55℃에서 1시간 반응시키고, 1분 단위로 형광강도의 변화를 관찰했다. 반응 및 형광 시그널의 측정에는 Thermal Cycler Dice(등록상표) Real Time System(TAKARA BIO INC.)을 사용했다.

도 2는 1분 단위로 형광강도를 측정한 것이다. 미절단의 기질에서는 FAM 유래의 형광은 eclipse에 의해 소광되고 있다. 그러나, PF0012 단백질에 의해 기질이 절단되면, FAM과 eclipse의 사이의 거리가 증대하기 때문에 FAM의 형광이 관찰될 수 있게 된다.

실제로 G-G, G-T 미스매치가 존재하는 기질을 사용했을 경우만, 형광강도의 상승을 관찰할 수 있고, G-A 미스매치나 G-C 염기결합을 지니는 기질에서는 형광강도의 상승은 관찰할 수 없었다. 이 실험에 있어서도 PF0012 단백질은 G, T의 개재하는 미스매치를 절단하는 활성을 가지는 것이 나타났다. 또, 개개의 미스매치 염기쌍에 대한 절단활성은, 반응개시 시점의 처음 속도, 즉, 직선성을 지니고 있는 구간의 경사에 각각의 기질의 형광강도의 보정을 첨가한 값으로 나타낸다. 도 2의 곡선으로부터 산출되는 반응의 처음속도의 비교로부터는 PF0012 단백질의 G-G 미스매치에 대한 절단활성은, G-T 미스매치에 대해 2배 정도 높은 것을 알았다.

실시예 3: PF0012 상동 단백질의 미스매치 절단활성

(1) PF0012 상동 단백질에 의한 미스매치 절단반응

Thermococcus barophilus , Methanocaldococcus jannaschii 유래의 PF0012 상동 단백질에 대해서도, 미스매치 절단활성 및 그 염기 특이성에 대해서 검증했다.

효소 단백질을 PF0012 상동 단백질(TERMP_01877 단백질, MJ_0225단백질)로 변경한 이외는, PF0012 단백질에 의한 미스매치 절단반응의 연속적 관찰과 동일하게 수행하고, 미스매치 절단활성을 형광강도의 증가를 지표로 관찰했다.

그 결과, 도 3에 나타내는 바와 같이, Thermococcus barophilus, Methanocaldococcus jannaschii 유래의 단백질에 대해서도, PF0012 단백질과 동일하게 G, T의 개재하는 미스매치 부위를 절단하는 활성을 가지는 것이 나타났다.

실시예 4: PF0012 단백질 첨가에 의한 PCR법을 사용한 유전자 증폭의 에러율의 감소

PF0012 단백질은 더블-스트랜드 핵산 중의 미스매치 염기쌍을 인식해서 그 양쇄를 절단할 수 있다. 또 이 단백질은 내열성이기 때문에, PCR과 같은 고온의 반응계에 직접 첨가하는 것이 가능하다. PCR 중에 발생한 미스매치 염기쌍을 포함하는 더블-스트랜드 핵산을 특이적으로 절단함으로써, 증폭반응에서 발생하는 에러를 억제하는 것을 기대할 수 있다.

(1) PF0012 단백질을 첨가한 PCR

PCR의 반응액에 PF0012 단백질을 첨가하고, Thermus thermophilus HB8 의 게놈 DNA를 주형으로서 4개의 프라이머쌍을 사용해서 PCR를 실시했다. 사용한 프라이머쌍은 Tth1F(서열번호 31)과 Tth1R(서열번호 32), Tth2F(서열번호 33)과 Tth2R(서열번호 34), Tth3F(서열번호 35)과 Tth3R(서열번호 36), Tth4F(서열번호 37)과 Tth4R(서열번호 38)이다. Thermus thermophilus HB8 Genomic DNA Solution(TAKARA BIO INC.)을 주형으로서, 상기 프라이머쌍과 PF0012 단백질을 첨가하고, TaKaRaTaq(등록상표) Hot Start Version(TAKARA BIO INC.)을 사용해서, 98℃ 10초, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 조건으로 30사이클 실시하는 PCR을 실시했다.

(2) PCR에 의한 에러율의 산출

상기에서 증폭한 DNA단편을 NucleoSpin(등록상표) Gel and PCR Clean-up(TAKARA BIO INC.)을 사용해서 정제하고, 그 DNA단편을 pMD19(simple) 플라스미드(TAKARA BIO INC.)에 TA 클로닝을 실시했다. 각 증폭 DNA 단편에 대해서 96개, 합쳐서 384개의 클론의 플라스미드에 대해서 증폭영역의 염기서열 결정을 실시했다.

목적 DNA를 포함하지 않는 것이나 염기서열 해석 조작 시에 발생한 에러로 생각되는 서열정보를 제거한 후, 증폭영역의 염기서열을 원래의 게놈 DNA서열과 비교해서, 다른 염기수를 해석된 총 염기수로 나누어서 에러율로 했다.

PF0012 단백질을 포함하지 않는 PCR로부터 증폭된 DNA 중에는, 128826bp 중 71bp의 에러가 발견되어 에러율은 0.055%이었다. PF0012 단백질을 첨가한 PCR에서는 97112bp 중 28bp의 에러가 발견되어 에러율은 0.029%이었다.

이렇게, PCR의 반응액에 PF0012 단백질을 첨가하는 것 만으로 핵산증폭에 의해 발생하는 에러를 감소시키는 것이 가능했다.

실시예 5: W77F 돌연변이체의 미스매치 절단활성

PF0012 단백질은 원래 G, T를 포함하는 미스매치 염기쌍에 대해서 선택성을 가지고 있다. 이 단백질에 돌연변이를 도입함으로써, 인식하는 미스매치 염기쌍을 추가로 한정시킨 효소 단백질을 제작하는 것을 시도했다.

(1) W77F 돌연변이체에 의한 미스매치 절단반응의 연속적 관찰

실시예 1에서 제작된 W77F 돌연변이체의 미스매치 절단활성, 및 그 염기 특이성을 전술한 형광DNA기질을 사용해서 관찰했다. PF0012 단백질로 바꾸고, W77F 돌연변이체를 사용하고, DD-probe-G , DD-probe-T와 template-G, template-T를 조합시켜서 실험을 실시했다. 그 밖의 반응조건은 실시예 2(4)의 연속적 미스매치 절단활성의 측정과 동일하게 실시했다.

도 4에 나타내는 바와 같이, W77F 돌연변이체는 G-G의 미스매치는 잘 절단할 수 있지만, G-T의 미스매치에 대한 절단활성은 그 1/20 이하로, T-T의 미스매치에 대해서는 절단할 수 없었다. 야생형 PF0012 단백질의 G-T의 미스매치에 대한 활성은 도 2에 나타내는 바와 같이, G-G의 미스매치에 대한 활성과 비교하면 1/2 정도이므로, W77F 돌연변이체는 G-G의 미스매치에 대해서 보다 특이적인 절단활성을 가지고 있는 것임을 알았다.

실시예 6: W77F 돌연변이체 첨가에 의한 희소 혼입 돌연변이형 유전자의 특이적 증폭

(1) 주형 플라스미드의 조제

돌연변이 유전자 증폭시험을 위해서, 주형이 되는 플라스미드를 조제했다.

Genbank Acc.NG_017013에서 공개되어 있는 human TP53 유전자영역의 서열정보로부터 서열번호 39, 40로 각각 나타나는 2종의 프라이머, TP53CloneF와 TP53CloneR를 설계, 합성했다. 이것들의 프라이머를 사용해서 human genomic DNA(Clontech사)을 주형으로 해서, PrimeSTAR(등록상표) HS DNA Polymerase를 사용해서 당해 영역을 증폭했다. 증폭한 영역의 염기서열정보는 서열번호 41에 나타낸다. 이 증폭한 DNA 단편을 플라스미드pMD19(simple)(TAKARA BIO INC.)에 TA클로닝을 실시했다. 수득된 플라스미드를 pTP53(G)로 했다. 이 pTP53(G)을 주형으로 TP53유전자의 증폭영역의 99번째의 염기G로 A로 변환하기 위해서, 돌연변이 도입용 프라이머로서 서열번호 42, 43에 나타나는 TP53AF, TP53AR를 설계, 제작했다. 플라스미드pTP53(G)을 주형으로 이 돌연변이 도입용 프라이머쌍과 PrimeSTAR(등록상표) Mutagenesis Basal Kit를 사용해서 목적부위의 G를 A로 변환시킨 돌연변이체 플라스미드 pTP53(A)을 제작했다.

(2) 특이적 돌연변이형 유전자절단용 프로브의 설계, 조제

특이적 돌연변이형 유전자 절단용 올리고뉴클레오타이드로서, pTP53(G) 상의 돌연변이를 도입한 부위의 5'측에 8염기, 3'측에 7염기 늘린 영역의 상보쇄의 서열을 가지고, 돌연변이 부위에 대응하는 C를 G로 변환한 올리고뉴클레오타이드를 설계했다. 본 올리고뉴클레오타이드는 pTP53(G)에 하이브리다이즈하면 G-G의 미스매치를 발생한다. 또, 이 올리고뉴클레오타이드로부터의 신장반응이 일어나지 않도록, 올리고뉴클레오타이드의 3'말단의 하이드록시기는 아미노기로 치환되어 있다. 이 올리고뉴클레오타이드를 특이적 SNP 절단용 올리고뉴클레오타이드, TP53deg이라고 명명했다. TP53deg의 염기서열을 서열번호 44에 나타낸다.

(3) 특이적 돌연변이형 유전자 증폭억제 PCR

플라스미드 pTP53(G) 단독, 플라스미드 pTP53(A) 단독, 및 양쪽 플라스미드를 혼합했지만 각각을 주형으로 해서, W77F 돌연변이체와 TP53deg을 첨가해서 PCR를 실시했다. 플라스미드의 혼합비는 pTP53(G) 100n에 대해서, pTP53(A) 100ng(1/1) , 10ng(1/10), 1ng(1/100), 100pg(1/1000), 10pg(1/10000)을 혼합한 것을 각각 준비했다. 반응액은 Roche사의 LightCycler(등록상표) 480 High Resolution Melting Master에 따라서 조제했다. 증폭용 프라이머로서 서열번호 45, 46로 각각 나타내는 프라이머 TP53AmpF, TP53AmpR를 최종농도 3μM, 특이적 돌연변이형 유전자 절단용 올리고뉴클레오타이드로서 TP53deg을 최종농도로 3μM첨가하고, W77F 돌연변이체를 첨가해서 최종용량을 20㎕로 했다. PCR 및 형광검출은 Rosch사의 LC480로 실시했다. PCR의 반응조건은 95℃ 5분의 예온 후, 95℃ 10초, 95℃ 20초, 72℃ 20초의 3step반응을 40cycle 수행하고, 마지막으로 해리반응으로서 95℃ 1분, 40℃ 1분의 후, 50℃에서 95℃까지 연속적으로 온도를 상승시키고, 각 온도의 형광강도를 관찰했다. 또, W77F 돌연변이체를 첨가하지 않는 반응액에서 동일한 측정을 실시했다.

(4) 희소 돌연변이형 유전자의 검출

이 PCR의 증폭곡선을 나타낸 것이 도 5가 된다. 또, 이 측정 결과로부터 계산되는 Ct값을 표 1에 나타낸다. 반응액에 W77F 돌연변이체를 포함하지 않을 경우에는, 주형의 혼합비에 의한 Ct값의 변화는 거의 관찰되지 않았다. 한편, W77F 돌연변이체를 첨가해서 PCR를 실시한 경우에는, 플라스미드 pTP53(G)을 단독으로 주형으로 사용하는 반응은 억제를 받고, Ct값에서 10 이상의 지연이 있었다. 이것은 이 플라스미드로부터의 DNA의 증폭이 W77F 돌연변이체에 의해 1000배 이상 억제되어 있다는 것을 나타내고 있다. 한편, 플라스미드 pTP53(A)을 단독으로 주형으로 사용하는 증폭에 대해서는 W77F 돌연변이체를 첨가한 경우에도, Ct값은 거의 변화되지 않고, 거의 억제를 받지 않았다. 또, 플라스미드 혼합물을 주형으로 했을 경우에는, pTP53(A)의 량에 따른 증폭을 관찰할 수 있었다. 이것은, W77F 돌연변이체는 PCR의 반응액 중에 pTP53(G)와 TP53deg가 형성하는 G-G의 미스매치 염기쌍을 포함하는 더블-스트랜드 핵산은 절단하는데도 불구하고, pTP53(A)와 TP53deg가 형성하는 G-A의 미스매치 염기쌍에 대해서는 거의 절단활성을 나타내지 않는 것을 나타내고 있다. 또, 미스매치를 가지지 않는 핵산에 대해서는, W77F 돌연변이체는 증폭 저해효과를 나타내지 않는 것임을 알았다. 또, pTP53(G)에 대해서 1/10000의 카피수의 pTP53(A)가 포함되어 있는 경우에도 Ct값은 pTP53(G) 플라스미드 단독의 경우보다 작고, W77F 돌연변이체에 의해 1/10000의 혼입비율의 주형으로부터도 돌연변이형(A)의 유전자 영역이 특이적으로 증폭되어 있는 것임을 시사하고 있다.

각 증폭 산물을 50℃에서 95℃까지 온도 상승시키면서 형광강도를 측정하고, 융해 곡선해석(Melting curve Analysis)을 실시했다. 각 온도에 대한 형광강도의 1차 미분의 그래프를 나타낸 것이 도 6이다. 도 6의 a)에 나타내는 바와 같이, W77F 돌연변이체를 첨가하지 않고 PCR를 실시했을 경우에는, pTP53(G)를 단독으로 주형으로 사용한 증폭산물의 해리곡선 해석으로 90.2℃에 peak가 나타났다. pTP53(A) 을 단독으로 주형으로 사용했을 경우에는, 89.6℃의 peak가 되고, 추가로 양쪽 플라스미드가 1대 1로 존재하는 헤테로 2중쇄의 경우에는, 단독 시에 나타나는 peak에 부가해서 88.5℃ 부근의 폭이 넓은 peak를 나타냈다. 이렇게 해리곡선의 1차 미분의 peak의 차이를 이용하고, 야생형(G)와 돌연변이형(A)를 가지는 주형을 판별하는 것이 가능하다.

W77F 돌연변이체를 첨가해서 PCR를 실시한 경우에는, 도 6의 b)에 나타내는 바와 같이 플라스미드 pTP53(A)의 혼합비율이 1/100이상의 경우에는 pTP53(A)를 단독으로 주형으로 사용했을 경우의 파형과 거의 동일하게 되고, pTP53(A) 만을 주형으로 한 증폭만이 일어나고 있는 것이 나타났다. 1/1000 , 1/10000의 혼합비율의 경우에도 pTP53(A)에 유래한다고 생각되는 89.6℃의 피크를 관찰할 수 있고, 동시에 헤테로 2중쇄에 유래한다고 생각되는 88.5℃ 부근의 폭이 넓은 피크도 볼 수 있었다. 이것은, 이것들의 혼입율의 경우에도 pTP53(A) 유래의 단편이 우선적으로 증폭되고 있는 것임을 나타내고 있다.

본 실시예에 있어서, 반응액 중에 PF0012 단백질의 돌연변이체와 목적 유전자영역의 염기서열 사이에 미스매치를 발생하는 올리고데옥시 뉴클레오타이드를 첨가하는 것에 의해, 상기 염기서열을 가지는 유전자의 증폭을 억제하고, 희소인 SNP를 가지는 유전자를 특이적으로 증폭하는 것이 가능하게 되는 것이 나타났다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명은 유전자공학, 생물학, 의학, 농업 등 폭넓은 분야에서 유용하다.

서열목록 프리텍스트

SEQ ID NO:1 ; The amino acid sequence of PF0012 from Pyrococcus furiosus

SEQ ID NO:2 ; The amino acid sequence of PF0012 Y77 Fmutant

SEQ ID NO:3-4 ; A designed oligonucleotide primer for PCR

SEQ ID NO:5 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning PF0012 gene.

SEQ ID NO:6 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning a designed sequence deduced from PF0012 amino acid sequence.

SEQ ID NO:7 ; The amino acid sequence of TERMP_01877 from Thermococcus barophilus

SEQ ID NO:8 ; The amino acid sequence of MJ_0225f rom Methanocaldococcus jannaschii

SEQ ID NO:9-12 ; A designed oligonucleotide primer for PCR

SEQ ID NO:13 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning TERMP_01877 gene.

SEQ ID NO:14 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning MJ_0225 gene.

SEQ ID NO:15-16 ; A designed oligonucleotide primer for PCR

SEQ ID NO:17-30 ; A designed oligonucleotide DNA for assay of a mismatch nuclease activity.

SEQ ID NO:31-40 ; A designed oligonucleotide primer for PCR

SEQ ID NO:41 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning partial TP53 gene.

SEQ ID NO:42-43 ; A designed oligonucleotide primer for PCR

SEQ ID NO:44 ; A designed oligonucleotide DNA for suppression of amplification of specific TP53 fragment

SEQ ID NO:45-46 ; A designed oligonucleotide primer for PCR

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Thermostable mismatch endonucleases and uses thereof <130> 671898 <150> JP2013-52265 <151> 2013-03-14 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 1 Met Glu Met Thr Lys Ala Ile Val Lys Glu Asn Pro Arg Ile Glu Glu 1 5 10 15 Ile Lys Glu Leu Leu Glu Val Ala Glu Ser Arg Glu Gly Leu Leu Thr 20 25 30 Ile Phe Ala Arg Cys Thr Val Tyr Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Glu 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Asp Arg Ile Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Leu Ile His Gln Lys Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Pro 65 70 75 80 Gly Ser Lys Val Lys Met Glu Gly Asn Ser Leu Ile Ser Ile Arg Arg 85 90 95 Asn Pro Lys Glu Thr Leu Lys Val Asp Ile Ile Glu Ala Tyr Ala Ala 100 105 110 Val Leu Phe Met Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Thr Leu Thr Gly Ser 115 120 125 Glu Ala Glu Met Ala Glu Leu Ile Phe Gln Asn Pro Asn Val Ile Glu 130 135 140 Glu Gly Phe Lys Pro Met Phe Arg Glu Lys Pro Ile Lys His Gly Ile 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Gly Val Asp Arg Glu Gly Asn Ile Val Val Leu Glu 165 170 175 Leu Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu His Ala Val Ser Gln Leu Lys Arg 180 185 190 Tyr Val Asp Ala Leu Lys Glu Glu His Gly Asn Lys Val Arg Gly Ile 195 200 205 Leu Val Ala Pro Ser Leu Thr Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys 210 215 220 Leu Gly Leu Glu Phe Arg Lys Leu Glu Pro Pro Lys Lys Gly Lys Lys 225 230 235 240 Lys Ser Ser Lys Gln Lys Thr Leu Asp Phe Leu Asn Asp Thr Val Arg 245 250 255 Ile Thr Gly Ala Ser Pro Pro Glu Ala Ile Gln 260 265 <210> 2 <211> 267 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 2 Met Glu Met Thr Lys Ala Ile Val Lys Glu Asn Pro Arg Ile Glu Glu 1 5 10 15 Ile Lys Glu Leu Leu Glu Val Ala Glu Ser Arg Glu Gly Leu Leu Thr 20 25 30 Ile Phe Ala Arg Cys Thr Val Tyr Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Glu 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Asp Arg Ile Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Leu Ile His Gln Lys Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Phe Gln Pro Pro 65 70 75 80 Gly Ser Lys Val Lys Met Glu Gly Asn Ser Leu Ile Ser Ile Arg Arg 85 90 95 Asn Pro Lys Glu Thr Leu Lys Val Asp Ile Ile Glu Ala Tyr Ala Ala 100 105 110 Val Leu Phe Met Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Thr Leu Thr Gly Ser 115 120 125 Glu Ala Glu Met Ala Glu Leu Ile Phe Gln Asn Pro Asn Val Ile Glu 130 135 140 Glu Gly Phe Lys Pro Met Phe Arg Glu Lys Pro Ile Lys His Gly Ile 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Gly Val Asp Arg Glu Gly Asn Ile Val Val Leu Glu 165 170 175 Leu Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu His Ala Val Ser Gln Leu Lys Arg 180 185 190 Tyr Val Asp Ala Leu Lys Glu Glu His Gly Asn Lys Val Arg Gly Ile 195 200 205 Leu Val Ala Pro Ser Leu Thr Glu Gly Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys 210 215 220 Leu Gly Leu Glu Phe Arg Lys Leu Glu Pro Pro Lys Lys Gly Lys Lys 225 230 235 240 Lys Ser Ser Lys Gln Lys Thr Leu Asp Phe Leu Asn Asp Thr Val Arg 245 250 255 Ile Thr Gly Ala Ser Pro Pro Glu Ala Ile Gln 260 265 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 3 cgcgcggcag ccatatggaa atgacgaaag caatag 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 4 gttagcagcc ggatccttac tgaatggctt caggag 36 <210> 5 <211> 834 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 5 cgcgcggcag ccatatggaa atgacgaaag caatagtaaa agaaaatccc aggattgaag 60 agataaaaga gttattggaa gttgcagaga gtagggaagg gttacttaca atttttgcta 120 ggtgtaccgt ttattatgag ggaagggcca agagtgagct tggagaagga gacaggatta 180 taataataaa gcctgatgga agcttcctta tccaccagaa gaagaaaagg gagcctgtca 240 attggcaacc ccctgggagt aaagtaaaaa tggaaggaaa ctccttaatt agcattagaa 300 ggaacccaaa agaaacactc aaagttgata taattgaagc atatgcagca gttcttttca 360 tggcagagga ctatgaggag ctaaccctaa ctggaagtga agcagagatg gctgagctca 420 ttttccaaaa tcccaatgtt atcgaggaag gatttaaacc aatgtttaga gagaagccaa 480 taaagcatgg aatagttgat gtacttggcg tggacagaga gggaaatata gtagttctag 540 aactgaaaag gaggagggcc gatttacacg cggttagtca gttaaagagg tacgtagatg 600 cactaaaaga agaacatgga aataaagtaa gaggaatatt ggtggcacct tctctaacgg 660 aaggagctaa aaagctttta gagaaacttg ggctagagtt tagaaagtta gaacctccta 720 aaaaaggtaa aaagaaaagt tcaaagcaaa aaactctaga cttcctcaac gatactgtta 780 ggataactgg ggcatcacct cctgaagcca ttcagtaagg atccggctgc taac 834 <210> 6 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a designed sequence deduced from PF0012 amino acid sequence <400> 6 catatggaaa tgaccaaagc gattgtgaaa gaaaacccgc gcattgaaga aattaaagaa 60 ctgctggaag tggcggaaag ccgcgaaggc ctgctgacca tttttgcgcg ctgcaccgtg 120 tattatgaag gccgcgcgaa aagcgaactg ggcgaaggcg atcgcattat tattattaaa 180 ccggatggca gctttctgat tcatcagaaa aagaaacgcg aaccggtgaa ctggcagccg 240 ccgggcagca aagtgaaaat ggaaggcaac agcctgatta gcattcgccg caacccgaaa 300 gaaaccctga aagtggatat tattgaagcg tatgcggcgg tgctgtttat ggcggaagat 360 tatgaagaac tgaccctgac cggcagcgaa gcggaaatgg cggaactgat ttttcagaac 420 ccgaacgtga ttgaagaagg ctttaaaccg atgtttcgcg aaaaaccgat taaacatggc 480 attgtggatg tgctgggcgt ggatcgcgaa ggcaacattg tggtgctgga actgaaacgc 540 cgccgcgcgg atctgcatgc ggtgagccag ctgaaacgct atgtggatgc gctgaaagaa 600 gaacatggca acaaagtgcg cggcattctg gtggcgccga gcctgaccga aggcgcgaaa 660 aaactgctgg aaaaactggg cctggaattt cgcaaactgg aaccgccgaa aaaaggcaaa 720 aagaaaagca gcaaacagaa aaccctggat tttctgaacg ataccgtgcg cattaccggc 780 gcgagcccgc cggaagcgat tcagtaagga tcc 813 <210> 7 <211> 251 <212> PRT <213> Thermococcus barophilus <400> 7 Met Glu Ala Lys Val Glu Pro Ser His Glu Glu Ile Ile Glu Ile Leu 1 5 10 15 Asp Lys Ala Leu Ser Val Glu Ala Ile Ile Thr Leu Phe Ala Tyr Cys 20 25 30 Arg Val Phe Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Glu Leu Gly Pro Gly Asp 35 40 45 Arg Val Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ser Phe Leu Ile His Gln Lys 50 55 60 Asn Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Pro Gly Ser Val Val Ser 65 70 75 80 Ile Val Leu Glu Asp Gly Arg Ile Met Leu Arg Ser Val Arg Arg Lys 85 90 95 Pro Lys Glu Thr Leu Glu Val Glu Leu Ile Lys Thr Tyr Leu Val Ser 100 105 110 Tyr Phe Gln Ala Glu Asp Tyr Glu Glu Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu 115 120 125 Ala Glu Met Ala Asp Leu Ile Phe Glu Asn Pro Ser Leu Ile Glu Glu 130 135 140 Gly Phe Lys Pro Leu Phe Lys Glu Lys Pro Ile Lys His Gly Ile Val 145 150 155 160 Asp Val Leu Gly Lys Asp Lys His Gly Asn Leu Val Val Leu Glu Leu 165 170 175 Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu His Ala Val Ser Gln Leu Lys Arg Tyr 180 185 190 Val Asp Ser Leu Arg Glu Glu His Lys Asn Val Arg Gly Ile Leu Val 195 200 205 Ala Pro Ser Leu Thr Ala Gly Ala Lys Lys Leu Leu Glu Lys Glu Gly 210 215 220 Leu Glu Phe Lys Lys Leu Asn Pro Pro Lys Arg Glu Lys Arg Lys Lys 225 230 235 240 Gly Lys Gln Lys Thr Leu Asp Phe Leu Ser Pro 245 250 <210> 8 <211> 263 <212> PRT <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 8 Met Met Arg Leu Glu Lys Val Phe Tyr Leu Thr Asn Pro Thr Thr Lys 1 5 10 15 Asp Leu Glu Asn Phe Ile Asp Met Tyr Val Phe Lys Tyr Ile Leu Ile 20 25 30 Leu Leu Ala Arg Cys Lys Val Phe Tyr Glu Gly Arg Ala Lys Ser Gln 35 40 45 Leu Glu Glu Gly Asp Arg Val Ile Ile Ile Lys Pro Asp Gly Ala Phe 50 55 60 Leu Ile His Lys Asp Lys Lys Arg Glu Pro Val Asn Trp Gln Pro Ser 65 70 75 80 Gly Ser Ser Ile Ile Trp Glu Val Glu Asp Asn Phe Phe Ile Leu Lys 85 90 95 Ser Ile Arg Arg Lys Pro Lys Glu Glu Leu Lys Val Val Ile Ser Glu 100 105 110 Val Tyr His Ala Cys Ala Phe Asn Cys Glu Asp Tyr Glu Glu Ile Asn 115 120 125 Leu Arg Gly Ser Glu Ser Glu Met Ala Glu Met Ile Phe Arg Asn Pro 130 135 140 Asp Leu Ile Glu Glu Gly Phe Lys Pro Ile Ser Arg Glu Tyr Gln Ile 145 150 155 160 Pro Thr Gly Ile Val Asp Ile Leu Gly Lys Asp Lys Glu Asn Lys Trp 165 170 175 Val Ile Leu Glu Leu Lys Arg Arg Arg Ala Asp Leu Gln Ala Val Ser 180 185 190 Gln Leu Lys Arg Tyr Val Glu Tyr Phe Lys Asn Lys Tyr Gly Glu Asp 195 200 205 Lys Val Arg Gly Ile Leu Val Ser Pro Ser Leu Thr Thr Gly Ala Glu 210 215 220 Lys Leu Leu Lys Glu Glu Asn Leu Glu Phe Lys Arg Leu Asn Pro Pro 225 230 235 240 Lys Gly Ser Lys Arg Asp Leu Lys His Asn Ile Lys Thr Lys Lys Thr 245 250 255 Thr Val Leu Asp Glu Trp Leu 260 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 9 cgcgcggcag ccatatggaa gctaaggttg aaccctc 37 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 10 gttagcagcc ggatccctat gggctgagaa aatcaag 37 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 11 cgcgcggcag ccatatgatg agattggaga aagttttc 38 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 12 gttagcagcc ggatccttat agccattcat ctaaaactg 39 <210> 13 <211> 786 <212> DNA <213> Thermococcus barophilus <400> 13 cgcgcggcag ccatatggaa gctaaggttg aaccctctca cgaagaaata attgaaattt 60 tggataaagc cctctctgtt gaggctatca taactctttt tgcttattgt agggtattct 120 atgaggggag agccaagagt gagcttggcc ccggagatag ggtcattata atcaagccag 180 atggctcttt tttaattcac cagaagaaca aaagagaacc tgttaactgg cagccgccgg 240 ggagtgttgt cagcatcgtt cttgaggatg ggagaataat gctgagaagt gttaggagaa 300 aaccgaaaga aacccttgaa gttgagctca ttaaaactta tcttgtgagt tatttccaag 360 cagaggatta tgaggagctg acattaactg gaagtgaagc agagatggct gatttgatct 420 ttgagaatcc ctcattaatt gaggaaggat ttaaaccgct ctttaaggaa aagccaatta 480 aacatggaat agttgatgtg cttggaaaag acaaacatgg caatttggtt gtccttgagc 540 ttaagcgcag gagagcagat ctgcatgcgg tcagtcaact taaaagatat gttgattctc 600 tgagggagga gcataaaaat gttcgtggga ttttggttgc cccttctctt acggctgggg 660 ctaaaaaatt acttgaaaaa gaagggctgg aatttaaaaa gctgaatcca ccaaagcgtg 720 aaaagaggaa aaaaggcaag cagaaaaccc ttgattttct cagcccatag ggatccggct 780 gctaac 786 <210> 14 <211> 822 <212> DNA <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 14 cgcgcggcag ccatatgatg agattggaga aagttttcta tctaaccaat cctactacca 60 aagatttaga aaattttatt gatatgtatg tgtttaaata tatattaata ttattagctc 120 gatgtaaagt tttttatgaa ggcagagcta aaagtcagtt agaagaggga gatagagtca 180 ttataataaa accagatgga gcctttttaa ttcataaaga taaaaaaaga gaacctgtaa 240 attggcaacc ttctggaagt agtataatat gggaagttga agataacttt ttcattttaa 300 aaagcattag aagaaagcca aaagaagagt taaaggttgt tatttcagaa gtttatcatg 360 catgtgcttt taactgtgaa gattatgaag agataaatct aaggggtagt gaatcagaga 420 tggcagagat gatttttaga aatccagatt tgattgaaga aggatttaag cccatatcaa 480 gagagtatca gattcccact ggaatcgttg atattttagg aaaagataaa gagaataaat 540 gggttatctt agagctaaag agaaggagag ctgatttaca ggcagtttct caactaaaaa 600 ggtatgtgga atattttaaa aacaaatatg gtgaggataa agttagagga attttggttt 660 ctccctcttt aactactggg gcggaaaaat tgctgaaaga ggagaactta gaatttaaaa 720 gacttaatcc accaaaagga agtaaaagag atttaaaaca taacataaaa actaaaaaaa 780 caacagtttt agatgaatgg ctataaggat ccggctgcta ac 822 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 15 gtgaactttc agccgccggg cagcaaag 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 16 cggctgaaag ttcaccggtt cgcgtttc 28 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 17 ctaaacttgg gtctcctcag ggttc 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 18 ctaaacttgg atctcctcag ggttc 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 19 ctaaacttgg ttctcctcag ggttc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 20 ctaaacttgg ctctcctcag ggttc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 21 gaaccctgag gagagccaag tttag 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 22 gaaccctgag gagaaccaag tttag 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 23 gaaccctgag gagatccaag tttag 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 24 gaaccctgag gagacccaag tttag 25 <210> 25 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 25 atgcctagcg ga 12 <210> 26 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 26 atgcctatcg ga 12 <210> 27 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 27 atgcctaacg ga 12 <210> 28 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 28 atgcctaccg ga 12 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 29 aatatccggt aggcattgaa gca 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo sequence <400> 30 aatatccgtt aggcattgaa gca 23 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 31 gagccttccc tggtccttta cggcg 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 32 gttgcggagg aggtcgtcca ggag 24 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 33 gagcggaacc acgagaacac cctgg 25 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 34 ctccaggtcc gcctcttccc gctt 24 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 35 cggccctacc gctttagcct ggagg 25 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 36 ccacggcacc tccaagaagg cctc 24 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 37 gtagaggaag tggttcttcc cggcg 25 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 38 gaagctcccc ttcagggcct ccac 24 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 cctggtaggt tttctgggaa gggac 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 ctggtcctct gactgctctt ttcac 25 <210> 41 <211> 252 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 cctggtaggt tttctgggaa gggacagaag atgacagggg ccaggagggg gctggtgcag 60 gggccgccgg tgtaggagct gctggtgcag gggccacggg gggagcagcc tctggcattc 120 tgggagcttc atctggacct gggtcttcag tgaaccattg ttcaatatcg tccggggaca 180 gcatcaaatc atccattgct tgggacggca agggggactg tagatgggtg aaaagagcag 240 tcagaggacc ag 252 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 42 gctggtgcag gggccacgag gggagc 26 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 43 ggccacgagg ggagcagcct ctggca 26 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 44 tgctccccgc gtggcc 16 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 45 gcaatggatg atttgatgct 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligo nucleotide <400> 46 aacgacggcc agtgaattag 20

Claims

더블-스트랜드 핵산의 절단방법으로써,
하기 (i) 및 (ii)로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드를 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 작용시키고, 당해 더블-스트랜드 핵산의 양쇄를 미스매치 염기쌍 부위에서 절단하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 서열목록의 서열번호 1, 2, 7 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 77번째의 트립토판이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 또한 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 미스매치 염기쌍이 더블-스트랜드 핵산 상에서 정상적으로 염기쌍을 형성하는 2개의 염기쌍 사이에 존재하는 연속해서 1 내지 8개의 미스매치 염기쌍을 포함하는 방법.
하기 (a)∼(c)를 함유하는 조성물:
(a) DNA 폴리머라아제;
(b) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
(c) 하기 (i) 및 (ii)로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드:
(i) 서열목록의 서열번호 1, 2, 7 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 77번째의 트립토판이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 또한 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
핵산의 증폭방법으로써,
하기 (a)∼(b)의 공정을 포함하는 방법:
(a) 제 3 항에 기재된 조성물과 주형이 되는 핵산분자를 함유하는 조성물을 조제하는 공정; 및
(b) 공정(a)에 의해 수득된 조성물을 반응시키고, 핵산증폭을 실시하는 공정.
제 4 항에 있어서, 핵산증폭이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법, 등온 핵산 증폭법, 또는 MDA(multiple displacement amplification)법으로 실시되는 방법.
서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 77번째의 트립토판이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 또한 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
제 6 항에 있어서, 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드.
핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로써, 하기 (a)∼(d)의 존재하에서 핵산 증폭반응을 실시하는 공정을 포함하고:
(a) 상기 특정한 염기서열을 가지는 핵산 또는 그 상보쇄와 하이브리다이즈시켰을 때에 1개 혹은 수 개의 미스매치를 발생하도록 설계된 올리고데옥시 뉴클레오타이드;
(b) DNA 폴리머라아제;
(c) 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
(d) 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드,
상기 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드는 상기 올리고데옥시 뉴클레오타이드와 특정한 염기서열을 가지는 핵산 또는 그 상보쇄 간의 하이브리다이제이션에 의해 생성된 미스매치 염기쌍을 가지는 더블-스트랜드 핵산에 작용하여 상기 더블-스트랜드 핵산의 양쇄를 미스매치 염기쌍 부위에서 절단하는, 핵산 증폭반응에 있어서 특정한 염기서열을 가지는 핵산의 증폭을 억제하는 방법.
제 8 항에 있어서, 핵산 증폭반응이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법, 또는 등온 핵산 증폭법인 방법.
제 8 항에 있어서, 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 하기 (i) 및 (ii)로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 폴리펩티드인 방법;
(i) 서열목록의 서열번호 1, 2, 7 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및
(ii) 서열목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 77번째의 트립토판이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 또한 미스매치 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 폴리펩티드.
표적 DNA를 우선적으로 증폭하는 방법으로써,
당해 표적 DNA와 1개 혹은 수 개의 염기가 다른 염기서열의 DNA의 증폭을 제 8 항에 기재된 방법으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 야생형 염기서열의 DNA와, 당해 DNA에 1염기 다형 돌연변이가 발생한 DNA를 구별해서 증폭하는 목적으로 사용되는 방법.
제 12 항에 있어서, 1염기 다형 돌연변이가 암화, 또는 암치료용 약제에 의한 치료효과와 상관하는 1염기 다형 돌연변이인 방법.
제 11 항에 있어서, DNA 증폭 반응이 폴리머라아제 연쇄반응(PCR), 또는 등온 핵산 증폭법으로 실시되는 방법.