JP4891764B2 - Dna中におけるアルキル化シトシンの検出方法 - Google Patents
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Description
本発明の1つの態様においては、個体から取得した、ゲノム又はミトコンドリア二本鎖DNAのサンプル中におけるアルキル化シトシンの存在又はレベルを検出する方法であって、
(a) 個体由来の二本鎖DNAのサンプルを取得すること、
(b) 該二本鎖DNAの少なくとも1つの領域を一本鎖DNAに変換すること、
(c) ステップ(b)で得られた該一本鎖DNAの標的領域を少なくとも1つの酵素と反応させること、ただし、該酵素はアルキル化シトシンとシトシンを異なって改変するものであること、及び
(d) 該酵素による標的領域の酵素的改変のレベルを決定すること、
を含む、上記方法を提供する。
上記酵素と反応した一本鎖DNAの標的領域を、サーモサイクリング及びプライマーを含む方法により増幅して増幅産物を取得すること、及び
一本鎖DNAの標的領域中のアルキル化シトシンの存在と一致する配列の変異について増幅産物を解析すること、
をさらに含む。
(a) 個体由来のゲノムDNAのサンプルを取得すること、
(b) 該ゲノムDNAの少なくとも1つの領域を一本鎖DNAに変換すること、
(c) ステップ(b)で得られた該一本鎖DNAの標的領域を少なくとも1つの酵素と反応させること、ただし、該酵素はアルキル化シトシン及びシトシンを異なって改変するものであること、及び
(d) 該酵素による標的領域の酵素的改変のレベルを決定すること、
を含む、上記方法を提供する。
(a) 個体由来のゲノムDNAのサンプルを取得すること、
(b) 該ゲノムDNAの少なくとも1つの領域を一本鎖DNAに変換すること、
(c) ステップ(b)で得られた該一本鎖DNAの標的領域を少なくとも1つの酵素と反応させること、ただし、該酵素はアルキル化シトシン及びシトシンを異なって改変するものであること、及び
(d) 該酵素による標的領域の酵素的改変のレベルを決定すること、
を含む、上記方法を提供する。
通常、本発明の方法において用いられる酵素は、シチジン又はシトシンのデアミナーゼ活性を有し、ゲノムDNA中のシトシン塩基を、実質的にDNA中の5-メチルシトシン塩基を1つも脱アミノ化することなく、ウラシルへと脱アミノ化することができる。上記酵素は好熱菌由来の熱安定性のシチジン又はシトシンデアミナーゼでありうる。
最初に、当技術分野で周知の標準的な抽出プロトコルを用いて、ゲノムDNAを個体由来の血液又は組織サンプルから抽出する。p16遺伝子のプロモーターに存在するCpGアイランド中の5-メチルシトシンを検出するための陽性対照として、全ての遺伝子について普遍的にメチル化されたヒトゲノムDNA(CpGenomeTM Universally Methylated DNA)を用いる。
実施例1と同様に、最初に当技術分野で周知の標準的な抽出プロトコルを用いてゲノムDNAを個体由来の血液又は組織サンプルから抽出する。全ての遺伝子について普遍的にメチル化されたヒトゲノムDNA(CpGenomeTM Universally Methylated DNA)を、p16遺伝子(CDKN2遺伝子とも呼ばれる、GenBank登録番号X94154)のプロモーターに存在するCpGアイランド内部の5-メチルシトシンを検出するための陽性対照として用いる。
A. 基質の調製
E-カドヘリンプロモーター領域(GenBank登録番号L34545)のヌクレオチド塩基920番〜999番と同じヌクレオチド配列を有する非メチル化80bpオリゴヌクレオチド(Ecad80)を50mM NaClで希釈して4μMとした。Ecad80の配列は以下の通りである:5’cgc tgc tga ttg gct gtg gcc ggc agg tga acc ctc agc caa tca gcg gta Cgg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct gg 3’。この配列中の52番目のヌクレオチド塩基(大文字Cで表す)を、下記のDで説明するサイクルシークエンシングプライマー伸長アッセイにおいてプライマー3ECAD11bによりスクリーニングする。52番目の上記ヌクレオチド塩基は、E-カドヘリンプロモーター領域(GenBank登録番号L34545)の972番目の塩基に対応する。
相補オリゴヌクレオチドAA1(tgt ttt ggg tgt gta tgg ttt ggg tgt)及びAA2(aca ccc aaa cca tac aca ccc aaa aca)を20mM NaClで希釈してそれぞれ30μMとした。この混合物を95℃に5分間加熱し、室温まで徐々に冷却して相補鎖をアニーリングさせた。結果として生じる二本鎖「トラップDNA」鋳型を、下記の20μLのAID反応混合物中でエキソヌクレアーゼ活性のおとり(decoy)として使用した。
20μLのAID反応混合物は、50mM Hepes pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmole トラップDNA(AA1/AA2)、4pmole Ecad80基質、200ng RNaseA、及び100nM野生型AIDを含んでいた。この酵素混合物を37℃でインキュベートし、15分後にフェノール:イソアミルアルコール:クロロホルム(25:24:1、Amresco番号0883-100ml)を加えて反応を停止させた。上記基質を含有する水相は、Eppendorf Phase Lock GelTMチューブ(Light、0.5mlカタログ番号0032 005.004)を用いてフェノール:クロロホルム相から分離した。水相は、サンプルをBioRad Micro Bio-spin6クロマトグラフィーカラム(カタログ番号732-6200)を通して溶出することにより、さらに精製した。
32P標識プライマーを用いたサイクルシークエンシングプライマー伸長は、シトシン脱アミノ化の尺度を提供する。DNA基質中のCを含む部位にddAが取り込まれることは、Cが脱アミノ化してUになることと一致する。これについては、図2を参照して以下でさらに詳細に説明する。
ポリアクリルアミドゲル上に結果として生じるバンドパターンは、サイクルシークエンシングアッセイの鋳型の配列を表す。972位のシトシンのAID誘発脱アミノ化は、プライマー伸長アッセイにおけるddAの取込みの程度を変えることとなり、結果として生じるバンドパターンは以下のように説明される。反応がAIDをまったく含まない場合は、鋳型配列は未変化のままである(図2A)。これは、結果的に、最初のT(GenBank登録番号L34545のE-カドヘリンプロモーター配列中の970位又はEcad80の50位)までddAレーン中で伸長する32P標識プライマーをもたらす。AIDが媒介して、E-カドヘリンプロモーター配列中の972位又はEcad80中の52位のシトシンをウラシルへと脱アミノ化すると、この位置にddAが取り込まれることとなり、これを「陽性」バンドと言う(図2B及び図2C)。この「陽性」バンドはより小さい断片(鋳型中の最初のTまで読み通しは、プライマー伸長反応産物に2つの余分な塩基を付加する)に対応し、ポリアクリルアミドゲル上でより速く移動する。「陽性」バンドの強度は、ImageQuant Softoware (Molecular Dynamics, USA)で測定することが可能であり、このバンドを含む上記の全てのバンド(この停止位置を越えたPCR伸長を表し、それゆえ972位で変換されていない鋳型を示す)の強度と比較される。この割合は、AIDによってウラシルへと脱アミノ化された基質の、この位置におけるシトシンの割合を表す。
A. 基質の調製
次の配列: cgc tgc tga ttg gct gtg gcX1 ggc agg tga acc ctc agc caa tca gX2g gta X3gg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct ggを有するDNAオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。ただし上記配列において、Xは非修飾(Ecad80−全てがシトシン)又は修飾された5’-メチルシトシン(5’-MeC)(Ecad80M3−X1、X2、X3の位置に3つの5-MeC塩基を含む)のいずれかである。Ecad80又はEcad80M3を(50mM NaClの存在下で)4μMへと希釈した。
相補オリゴヌクレオチドT1(att ata ttt aaa tat ata aaa tat ata tta ata aat)及びT2(att tat taa tat ata ttt tat ata ttt aaa tat aat)を20mM NaClの存在下で各々30μMへと希釈した。実施例3に記載したように、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせてトラップDNAとして機能させた。
20μLのAID反応混合物を、50mM Hepes pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(T1/T2)、4pmoleの基質、200ng RNase A及び100nM AIDを含有するように調製した。反応物を37℃で15分インキュベートした。
実施例3のとおりに伸長反応を実施したが、下記の熱サイクル条件を用いた: (95℃を2分、55℃を30秒、72℃を2分)を15サイクル。ポリアクリルアミドゲルで60Wにて3時間分離させ、1時間乾燥させてから解析を行った。
A: 基質としてのゲノムDNAの調製
American Type Tissue Collection(Rockville, Md, USA)より取得したヒト細胞株SW480(番号CCL-228)から、QIAamp DNA Blood Mini Kit(50)(Qiagen)を製造業者の使用説明書のとおりに用いて、ゲノムDNAを抽出した。標準的な亜硫酸水素塩及び配列決定方法を用いて実施した実験は、SW480から取得したゲノムDNAが、E-カドヘリンプロモーター領域(GenBank登録番号L34545)の972位でメチル化されていないことを明らかにした。ゲノムDNAを滅菌水中で10ng/μLに希釈した。
全ての反応は、50mM Hepes pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(実施例3のとおりに調製したAA1/AA2)、5ngのゲノムDNA、200ngのRNase A及び200nMのAIDを含んでいた。反応物を37℃で15分インキュベートした。実施例3に記載したように、サイクルシークエンシングプライマー伸長及びポリアクリルアミドゲル解析を実施した。
A: 基質の調製
Ecad80を50mM NaClで4μMとなるまで希釈し、Ecad80のアンチセンス配列であるASEcad80を3倍過剰に加えた(ASEcad80配列:5’cc agg tga gcc ccg gag cac cgc ccc ccg tac cgc tga ttg gct gag ggt tca cct gcc ggc cac agc caa tca gca gcg 3’)。混合物を95℃に5分間加熱し、室温まで徐々に冷却して、相補鎖同士をアニーリングさせた。
標的鎖にアニーリングして標的部位で一本鎖ループを形成するように設計した、過剰のオリゴヌクレオチドプローブを、本実施例のステップAで調製した二本鎖鋳型に添加した。下記のルーピングプローブDNA配列を化学的に合成した:
LP10 - 5’CGA CCG CCC CGA TTG GCT GAG G 3’(3’リン酸を有する);
LP26 - 5’GCC CCG GAG CGA GGG TTC ACC TG 3’(3’リン酸を有する);及び
LP26+1 - 5’GCC CCG GAG CGG AGG GTT CAC CTG 3’(3’リン酸を有する)。
20μlのAID反応混合物を、50mM Hepes pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(AA1/AA2)、4pmoleの基質、200ng RNase A及び100nM AIDを含むように調製した。37℃で15分間反応物をインキュベートした。
実施例4のとおりに実施した。60Wで3時間ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、1時間15分乾燥させてから解析を行った。
選択した酵素のためにはどのように反応条件を最適化すればよいかを示し、またバッファーイオン及び濃度の様々な条件がAID媒介シトシン脱アミノ化に与える影響を示すために、下記の実施例を行った。
Ecad80(5’cgc tgc tga ttg gct gtg gcc ggc agg tga acc ctc agc caa tca gcg gta Cgg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct gg 3’)を50mM NaClで4μMへと希釈した。
反応は下記のような範囲のバッファーの種類及び濃度を含んでいた:10、50又は100mMのTris-HCl、Hepes、Pipes又はイミダゾールバッファーイオン。全ての反応はpH7.5で実施し、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(実施例4で調製したT1/T2)、4pmoleのEcad80、200ngのRNase A及び100nMのAIDを含んでいた。反応を37℃で15分間インキュベートした。実施例3に記載するとおりに、サイクルシークエンシングプライマー伸長及びポリアクリルアミドゲル解析を実施した。
プライマー3ECAD11bは本実施例のステップAにおいて示したようにEcad80中のCをスクリーニングする。上記塩基はゲノムDNAのE-カドヘリンプロモーター領域の972番目のヌクレオチド塩基に相当する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を9Wで9時間実施し、1時間乾燥させてから解析した。
A: 基質の調製
この研究のための基質は実施例7のとおりに調製した。
AID反応混合物は、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(実施例4で調製したT1/T2配列)、4pmoleのEcad80、200ngのRNase A及び100nMの野生型AIDを含んでいた。酵素の混合物を、37℃で5分間又は30分間インキュベートした。実施例3のとおりにサイクルシークエンシングプライマー伸長及びポリアクリルアミドゲル解析を実施した。ただしポリアクリルアミドゲル電気泳動を9Wで9時間実施し、1時間乾燥させてから解析した。
A: 基質の調製
この研究のための基質は実施例7のとおりに調製した。
AID反応混合物は、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(実施例4で調製したT1/T2配列)、4pmoleのEcad80、200ngのRNase A及び100nM又は200nMのAIDを含んでいた。酵素の混合物を37℃で20分間または30分間インキュベートした。実施例3のとおりにサイクルシークエンシングプライマー伸長及びポリアクリルアミドゲル解析を実施した。ただしポリアクリルアミドゲル電気泳動を9Wで9時間実施し、1時間乾燥させてから解析した。
シトシンデアミナーゼ活性は、AID及びAPOBEC相同体を含む天然の酵素によって生じさせることができる。さらに、これらのタンパク質の変異型を、ランダム突然変異又は合理的突然変異のいずれかによって作出することができ、これらの変異体をスクリーニングして、より高い比率で脱アミノ化を行い、シトシンと5-メチルシトシンとを区別するタンパク質を見つけることができる。
この研究のための基質は実施例7のとおりに調製した。
AID反応混合物は、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmoleのトラップDNA(実施例2で調製したT1/T2配列)、4pmoleの基質、500ngのRNase A及び100nMの野生型AID、100nMのAPOBEC3G又は100nMのAID変異体R35E/R36D(米国南カリフォルニア大学、分子生物化学部のMyron Goodman教授より提供された)のいずれかを含んでいた。反応物を37℃で15分間インキュベートした。
下記の熱サイクルプロトコルに従って、実施例4のとおりにサイクルシークエンシングプライマー伸長を行った: (95℃を2分、55℃を30秒、72℃を2分)を20サイクル。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を9Wで9時間実施し、1時間乾燥させてから解析した。
表8に示した結果は、Ecad80の52番目のヌクレオチド塩基の脱アミノ化に関してAID変異体R35E/R36Dは野生型AIDよりも高い活性を有することを実証する。AID変異体R35E/R36Dは、野生型タンパク質と比べてほぼ2倍も多く基質を脱アミノ化した。APOBEC3Gが示したシトシン脱アミノ化活性の量は低めだが、反応条件(例えばバッファーの種類、バッファーの濃度、pH及び酵素濃度)のさらなる最適化によって、APOBEC3Gが媒介するシトシン脱アミノ化の比率は高まるかもしれない。この実施例は、シトシン脱アミノ化活性を有する酵素の変異体及び天然の変異体を評価することの有用性をさらに示す。
Claims (34)
- 個体から取得した、ゲノムまたはミトコンドリア二本鎖DNAのサンプル中におけるアルキル化シトシンの存在またはレベルを検出する方法であって、
(a) 個体由来の二本鎖DNAのサンプルを取得すること、
(b) 該二本鎖DNAの少なくとも1つの領域を一本鎖DNAに変換すること、
(c) ステップ(b)で得られた該一本鎖DNAの標的領域を少なくとも1つの酵素と反応させること、ただし、該酵素はアルキル化シトシンおよびシトシンを異なって改変するものであり、該酵素はシチジンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、デオキシシチジンデアミナーゼ、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素(ApoBRe)、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド1(APOBEC1)、活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)、および活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)変異体R35E/R36Dより成る群から選択されるものであること、および
(d) 該酵素による標的領域の酵素的改変のレベルを決定すること、
を含む、上記方法。 - 前記酵素が前記一本鎖DNAのアルキル化シトシンまたはシトシンのいずれかと反応するが、双方とは反応しない条件下で、該一本鎖DNAを酵素と反応させる、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が前記一本鎖DNAのアルキル化シトシンまたはシトシンの一方のみと反応することができる、請求項1に記載の方法。
- 二本鎖DNAの前記領域を一本鎖DNAに変換することが、該二本鎖DNAの2本の鎖を少なくとも部分的に分離することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 1または複数の鎖置換プローブを利用して前記二本鎖DNAの2本の鎖を少なくとも部分的に分離する、請求項4に記載の方法。
- 前記のそれぞれの鎖置換プローブが、核酸アナログプローブ、PNA含有プローブ、LNA含有プローブ、PNAプローブおよびLNAプローブからなる群より独立に選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記二本鎖DNAの2本の鎖が分離して、酵素による標的領域への接近が容易になった場合には、該二本鎖DNAの2本の鎖が一緒にアニーリングするのを抑制することをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記2本の鎖の分離に続いて、少なくとも1つのプローブを前記二本鎖DNAの1本の鎖にハイブリダイズさせ、それによって2本の鎖が一緒にアニーリングするのを抑制することをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記プローブが、センスプローブ、ルーピングプローブ、アンチセンスプローブおよびこれらの混合物からなる群より独立に選択される、請求項8に記載の方法。
- 少なくとも2つの前記プローブが、二本鎖DNAの1本の鎖とハイブリダイズし、該プローブのうち1つは標的領域の下流にある該鎖の領域にハイブリダイズし、別のプローブは標的領域の上流にある該鎖の領域にハイブリダイズする、請求項8に記載の方法。
- 前記標的領域を組み込んだループまたはバブルが鎖中で形成されるように、前記プローブが、標的領域に隣接する鎖の上流領域および下流領域にハイブリダイズする、請求項8に記載の方法。
- 前記プローブが、前記二本鎖DNAの鎖に標的領域の両側でハイブリダイズし、かつ標的領域を組み込んだループまたはバブルが鎖中で形成されるように、該プローブが、標的領域とハイブリダイズしない非相補配列の中間領域を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記プローブと前記二本鎖DNAの鎖とのハイブリダイゼーションに続いて、該プローブの中間領域が、一緒にハイブリダイズする逆方向反復配列を組み込んでいる、請求項12に記載の方法。
- 前記一本鎖DNAの酵素的改変のレベルを決定することが、酵素による該一本鎖DNAの標的領域の酵素的改変により生じた配列の変異を解析することを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素的改変のレベルを決定することが、前記一本鎖DNAの標的領域をサーモサイクリングとプライマーを含む増幅法に供して、増幅産物を取得し、増幅産物を配列の変異について解析することを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記増幅産物の解析が、核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限酵素による消化、および特定の核酸配列に結合するプローブの使用を含む技法からなる群から選択された技法に、増幅産物を供することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記増幅産物の解析が、増幅産物をポリメラーゼ連鎖反応法に供することを含む、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記酵素が、前記一本鎖DNAの標的領域中のアルキル化シトシンまたはシトシンを脱アミノ化する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 異なる前記酵素の組み合わせを用いて、前記標的領域のアルキル化シトシンおよびシトシンを異なって改変する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素が、ApoBRe、AIDおよびAID変異体R35E/R36Dからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子もしくは遺伝子の非コード領域、またはそれらの断片中のアルキル化シトシンの存在またはレベルを検出することを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子の5’非コード領域中のアルキル化シトシンの存在またはレベルを検出することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記レベルのアルキル化シトシンが高メチル化を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記レベルのアルキル化シトシンが低メチル化を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記遺伝子がp16、E-カドヘリン、VHL遺伝子、BRCA1、p15、hMLH1、ER、HIC1、MDG1、GST-π、O6-MGMT、カルシトニン、myo-D、ウロキナーゼおよびS100A4からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記一本鎖DNAの標的領域中におけるアルキル化シトシンの改変レベルを検出することが疾患または症状のマーカーとなる、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 疾患または症状が癌である、請求項26に記載の方法。
- 胎児DNAの存在または不在を示すためにアルキル化シトシンの存在またはレベルを検出する、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一本鎖DNAの標的領域中のアルキル化シトシンの存在またはレベルを基準にして個体の疾患あるいは症状を診断することをさらに含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 変異遺伝子のインプリンティング状態の存在または不在を示すためにアルキル化シトシンの存在またはレベルを検出する、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 病原体または微生物の存在もしくは不在を示すためにアルキル化シトシンの存在もしくはレベルを検出する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- アルキル化シトシンがメチル化シトシンである、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- メチル化シトシンが5-メチルシトシンである、請求項32に記載の方法。
- 二本鎖DNAがゲノムDNAである、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
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