CN102676513A

CN102676513A - 一种胎儿表观遗传学标志物及其应用

Info

Publication number: CN102676513A
Application number: CN2012101687680A
Authority: CN
Inventors: 郑芳; 荣媛; 张元珍; 高嘉嘉; 杨娜; 刘松梅
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2012-05-28
Filing date: 2012-05-28
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明提供了一种新的胎儿表观遗传学标志物的检测方法，这一标志物位于21号染色体21q22.3的DSCR(21三体关键区域)上，为SEQIDNo.1所示的DNA，或者该DNA的特异性片段，该特异性片段至少包括SEQIDNo.1的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点碱基中的至少一个。本发明标志物不受胎儿性别以及SNP多态性位点限制，特异性的存在于孕妇血浆中。该遗传标记可以用于区分孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA，并进一步用于21三体的无创性产前诊断。

Description

一种胎儿表观遗传学标志物及其应用

技术领域

本发明涉及无创性产前诊断领域，具体涉及一种胎儿表观遗传学标志物，还涉及该表观遗传学标志物的用途。

背景技术

孕妇血浆中存在的胎儿游离核酸首先于1997年由Lo YMD等人发现[Lo YMD，CorbettaN，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet，1997，350:485–487.]，但由于血浆胎儿游离DNA毕竟只占母血浆游离DNA的3-6%，为了将胎儿遗传物质从母亲来源的游离DNA的强大背景中相区分并应用于胎儿无创性产前诊断，胎儿游离表观遗传学标志物应运而生。

基于胎盘组织和外周血DNA差异甲基化的研究，以及胎盘组织是孕妇血浆中游离胎儿核酸的重要来源，而孕妇血浆中母体DNA则主要来源于造血细胞作为理论依据依据[AlberryM,Maddocks D,Jones M et al.Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies:confirmation that the origin is the trophoblast.Prenatal Diagnosis 200727:415-18；Lui YYN，ChikK-W，Chiu RWK et al.Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serumafter sex-mismatched bone marrow transplantation.Clinical Chemistry 200248,421-27]。胎儿表观遗传学标志物在妊娠早期和晚期其甲基化状态没有发生改变，对于无创性产前诊断唐氏综合征而言是一个重要的候选遗传学标志物。截至目前为止，尚没有21号染色体特异的游离胎儿DNA表观遗传学标志物用于临床实际无创性产前诊断的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种方法用于检测位于21号染色体上位于唐氏综合症关键区域的新的胎儿表观遗传学标志物。

本发明运用甲基化敏感性限制性核酸内切酶-PCR（Methylation-sensitive RestrictionEnzyme，MSRE-PCR）技术，进行差异甲基化位点的筛选，并将筛选出的差异甲基化位点采用重亚硫酸盐转化克隆测序技术进一步验证，收集孕妇血浆以及未孕妇女血浆并提取游离DNA，甲基化敏感性核酸内切酶Hin6I消化作用后，运用实时荧光定量PCR进行胎儿表观遗传标记的检测以及定量，发现了出一个新的胎儿表观遗传学标志物，高甲基化的TSPEAR(hypermethylated TSPEAR,M-TSPEAR)标志物位于21号染色体的唐氏综合症关键区域（Downs syndrome critical region,DSCR）,与胎儿性别无关,可以通过甲基化敏感性核酸内切酶消化将孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA区分开来，易于在临床上进一步应用。

具体地，本发明所涉及的胎儿表观遗传学标志物，其为SEQ ID No.1所示的DNA，或者该DNA的特异性片段，所述特异性片段至少包括SEQ ID No.1的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点碱基中的至少一个。

通过检测上述位点的甲基化状况，可以将孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA区分开来的。

检测上述甲基化位点的方法包括但不限于：甲基化特异性PCR，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸，甲基化敏感性单链构象分析，甲基化敏感性解链曲线分析，结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法，DNA微阵列法，甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增等技术。

本发明还提供一种用于检测上述表观遗传学标志物的引物，该引物能特异性扩增上述的遗传标志物，引物的设计可以采用本领域常规的设计方法。本发明提供的试剂盒进一步包括甲基化敏感性核酸内切酶，该内切酶的识别序列至少包括SEQ ID No.1序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点之一。

在本发明的一个实施例中，所述引物为：正义引物:5’-CCACGGCCCGGTGCCT-3’反义引物:5’-TGGGAAGCACAGGCGCG-3’；其还包括TaqMan探针：5’-FAM-CACGCGCACAGCGACAC-3’-BHQ1。所述内切酶为Hin6I。

本发明还提供一种区分孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA的方法，它包括步骤：提取胎盘组织及其相应的外周血DNA，鉴定SEQ ID No.1所示序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点碱基的甲基化状况。

本发明所涉及的表观遗传学标志物可以应用于21三体无创性产前诊断。

本发明基于胎盘组织与孕妇外周血的DNA甲基化差异，TESPEAR(Thrombospondin-typelaminin G domain and EAR repeats-containing protein)基因内含子在胎盘组织中高甲基化，同时在外周血中低甲基化，并在孕妇血浆中检测出高甲基化的TESPEAR，可以作为胎儿表观遗传学标志物（M-TSPEAR），该标志物不受胎儿性别以及SNP多态性位点限制，特异地存在于孕妇血浆中。

附图说明

图1显示的TSPEAR基因内含子在孕早期和晚期胎盘组织和外周血DNA中重亚硫酸盐转化克隆测序结果，第一列中不同CG位点依据距离基因转录起始位点（0）的碱基数目命名，每一列中记录单个克隆不同CG位点的甲基化状态，“●”表示甲基化状态，“○”表示未甲基化状态，第一列括弧中数字标识与图5序列中表示的甲基化位点相对应；

图2显示的是胎盘组织与外周血基因组M-TSPEAR的相对拷贝数；

图3显示的是孕妇血浆与外周血基因组M-TSPEAR的相对拷贝数；

图4显示的是产前孕妇血浆中与产后母体血浆中M-TSPEAR的相对拷贝数；

图5是CpG位点4(TSPEAR内含子)基因组序列（chr21 4612292-46129789，498bp），图中下划线部位为CG位点，方框内为普通PCR引物结合序列区域。

具体实施的方式

基于甲基化敏感性核酸内切酶能够特异性识别甲基化的胞嘧啶（^mC）和未甲基化的胞嘧啶，并特异性切割未甲基化的胞嘧啶的特性，采用MSRE-PCR的方法通过筛选胎盘组织与外周血基因组的差异甲基化位点，并通过重亚硫酸盐克隆测序的方法进行验证。采用甲基化敏感性核酸内切酶消化作用消除母体DNA未甲基化的背景后，进行胎儿特异性M-TSPEAR的检测。本发明中采用MSRE-PCR方法所筛选出的新的胎儿表观遗传标记物，通过重亚硫酸克隆测序的验证后，易于在孕妇血浆中检测。

本技术领域的人员均知道，有许多的分析技术可以用于差异甲基化位点的筛选。这些技术包括（但不局限于）：甲基化特异性PCR，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸，甲基化敏感性单链构象分析，甲基化敏感性解链曲线分析，结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法，DNA微阵列法，甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增等技术。

本发明中筛选所采用的检测方法MSRE-PCR简单，易行，同时引入了酶切消化的质量控制，消除由于酶切消化不完全和星活性所带来的实验误差。

用于本发明方法所涉及的引物和探针，均采用常规的合成技术进行合成即可。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规进行，或者按照试剂盒建议的条件完成。

实施例1基因组的抽提和差异甲基化位点的筛选

提取胎盘组织及其相应的外周血DNA，甲基化敏感性核酸内切酶（Hin6I）消化后，将酶切消化前以及消化后产物用于常规PCR扩增，同时在酶切消化体系中加入质粒pBS-T（购自天根生物有限公司），并设计相应的引物作为酶切消化是否完全的质量控制。

质控引物序列如下：

正义引物5’-GGCGGGTGTGGTGGTTAC-3’

反义引物5’-CGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTC-3’,

选取位于21号染色体唐氏综合症关键区域（Down Syndrome Critical Region，DSCR）上12个CpG位点并设计引物扩增，进行差异甲基化位点的筛选，筛选出一个差异甲基化位点（CpG位点：TSPEAR内含子）,该位点在胎盘组织和外周血中具有差异甲基化，其甲基化状态如表.1所示，收集20例孕妇胎盘组织以及外周血，该位点在胎盘组织中高甲基化，而在外周血中低甲基化(P<0.01)。

表.1胎盘组织和孕妇外周血DNA中TSPEAR内含子片段在甲基化敏感性内切酶作用前后的扩增结果

实施例2差异甲基化位点（TSPEAR内含子）的验证

采用重亚硫酸盐转化克隆测序技术，收集2例孕早期绒毛组织和2例孕晚期胎盘组织及其相应的4例母体外周血标本，提取DNA获得TSPEAR基因内含子序列的甲基化状态，确定胎盘组织中TSPEAR基因内含子的高甲基化状态和外周血细胞中TSPEAR基因内含子的低甲基化状态。各个样本甲基化频率结果如图1所示，结果表明SEQ IDNo.1序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点（图5中的1~15CG位点，与TSPEAR基因的对应关系是+1821(1)+1818(2)、+1810(3)、+1805(4)、+1794(5)、+1792(6)、+1785(7)、+1767(8)、+1758(9)、+1750(10)、+1725(11)、+1721(12)、+1719(13)、+1717(14)、+1700(15)）甲基化状态在胎盘和外周血之间存在有差异,尤其是联合多个位点检测时，差异更加明显。

实施例3孕妇血浆中M-TSPEAR的检测

孕妇血浆DNA提取采用德国Qiagen公司的QIAamp Ultrasens virus kit试剂盒，按照试剂盒操作说明进行提取。采用实时相对荧光定量PCR技术，对胎盘组织和外周血DNA,孕妇血浆和外周血DNA，孕妇产前和产后血浆DNA，分别进行甲基化敏感性核酸内切酶切前后Ct值的计算，建立该新的胎儿表观遗传标记物M-TSPEAR的检测方法。所采用的引物和探针序列如下：

正义引物:5’-CCACGGCCCGGTGCCT-3’

反义引物:5’-TGGGAAGCACAGGCGCG-3’

TaqMan探针5’-FAM-CACGCGCACAGCGACAC-3’-BHQ1.

收集5对胎盘组织及其相应的孕妇外周血标本，6对孕妇血浆标本及其外周血细胞标本，和10对孕妇产前和产后血浆标本，提取DNA后，BstUI酶切消化60°C，16小时，取酶切消化前和酶切后DNA进行实时荧光PCR扩增，扩增反应体系如下：1x TaqMan Universal PCRMaster Mix(Applied Biosystems),正义引物和反义引物(Invitrogen)250nM,TaqMan探针(Applied Biosystems)200nM以及模板DNA。循环条件如下：50°C，2min,95°C，10min,95°C，30s,60°C，1min，50个循环，每个标本各做3个复孔，计算其平均CT值（具体考察图.5中的CG位点5,6,12,13,14.共五个位点）。

对胎盘组织和外周血，孕妇血浆和外周血，孕妇产前血浆和产后血浆中M-TSPEAR的检测，分别进行2^-△△CT统计学分析，计算出胎盘组织以及孕妇血浆中M-TSPEAR的相对拷贝数。结果如图2~4所示。图2所示为M-TSPEAR在胎盘组织和孕妇外周血中的相对拷贝数，将样本DNA酶切消化前DNA的C_T值的作为内参，计算样本酶切消化前后的△C_T值后，进一步计算出胎盘组织与外周血的△△C_T。采用2^-△△CT统计学分析方法，从而得出胎盘组织中M-TSPEAR相对于孕妇外周血中的相对拷贝数。图3所示为M-TSPEAR在孕妇血浆中和外周血中相对拷贝数，统计方法同图1，通过计算孕妇血浆与外周血的△△C_T，采用2^-△△CT统计学分析，计算中孕妇血浆中相对于外周血的M-TSPEAR相对拷贝数。图4所示为M-TSPEAR在孕妇产前和产后血浆中的相对拷贝数，统计方法同图1，计算孕妇产前和产后血浆的△△C_T，采用2^-△△CT统计学分析，计算中孕妇产前血浆中相对于产后血浆中的M-TSPEAR相对拷贝数。从图2~4中可以看出，孕妇血浆及胎盘组织的TESPEAR(Thrombospondin-type lamininG domain and EAR repeats-containing protein)基因内含子高甲基化，而在外周血中低甲基化，可以作为胎儿表观遗传学标志物（M-TSPEAR）。

应理解在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明进行各种修改或改动，这些等价形式同样落后于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110> 武汉大学

<120> 一种胎儿表观遗传标记物及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 498

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctcccttgct gcccacgggg ctggagccgc ctgaaaatcc cagcccacaa cttccccaaa 60

gcctggcagt cacttgaata gccaaatgag tcctagaaag cgagagacga gaggggaatg 120

agcgccgaaa atcaaagcag gttcccctcc tgacaactcc agagaaggcg catgggcccc 180

gtggcagacc cgaaccccca gcctcgcgac cgcctgtgac ctgcgggtca accacccgcc 240

gcggctccac gccgtgggca cagactcagg gagcaggatg agaaagctga gacggcgcag 300

ccacggcccg gtgccttcac gcgcacagcg acacagcccc agccagcggg gcccacgcta 360

aggcggaatc ccacagaagc ctacagagcg agcgcgcgcc tgtgcttccc aaaacggaat 420

ggaaccaagg tgacttctac agaacgatct gaagccctgg ctggccctta tgctagtctc 480

ttgggagcgt tccaaatg 498

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcgggtgtg gtggttac 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgagataggg ttgagtgttg ttc 23

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccacggcccg gtgcct 16

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgggaagcac aggcgcg 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cacgcgcaca gcgacac 17

Claims

1.一种胎儿表观遗传学标志物，其为SEQ ID No.1所示的DNA，或者该DNA的特异性片段，所述特异性片段至少包括SEQ ID No.1的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点碱基中的至少一个。

2.权利要求1所述遗传标志物在区分孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA中的应用。

3.一种用于检测权利要求1所述表观遗传学标志物的引物，所述引物能特异性扩增含权利要求1所述的遗传标志物的DNA片段。

4.一种用于检测权利要求1所述遗传学标志物的试剂盒，其包括权利要求3所述的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括甲基化敏感性核酸内切酶，该内切酶的识别序列至少包括SEQ ID No.1序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点之一。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其还包括：

正义引物: 5’-CCACGGCCCGGTGCCT-3’

反义引物: 5’-TGGGAAGCACAGGCGCG-3’ 。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其还包括TaqMan探针：

5’-FAM-CACGCGCACAGCGACAC-3’-BHQ1 。

8.根据权利要求5~7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述内切酶为BstU I。

9.一种区分孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA的方法，其特征在于，它包括步骤：提取胎盘组织及其相应的外周血DNA，鉴定SEQ ID No.1所示序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点碱基的甲基化状况。