CN105505844B - 一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法。它是将单菌落接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，摇床震荡培养，然后将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，摇床震荡培养后，将深孔板离心，取上清液测胞苷含量。在酶标板的微孔中加入发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，于30‑40℃温浴反应10‑40 min；反应结束后立即加入反应液A和反应液B，于30‑40℃温浴反应20‑50 min，然后采用酶标仪测定反应液的吸光度值，根据标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量。本发明实现了高通量培养、发酵液的高通量制备及胞苷的高通量测定的目标。

Description

一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，属于微生物育种和发酵工程技术领域。

背景技术

胞苷( cytidine)又名胞嘧啶核苷、胞啶、1-β-D-呋喃核苷胞嘧啶。胞苷作为嘧啶核苷主要用于生产抗肿瘤、抗病毒药物的中间体，是制造阿糖胞苷(Ara-CR)、环胞苷(CycloC)、三磷酸胞苷(CTP)、胞二磷胆碱(CDP- Choline)等药物的主要原料。目前胞苷的生产方法有RNA水解法、发酵法和合成法相结合、以尿嘧啶为前体的发酵法、直接发酵法等（张克旭，杜连祥，译. 核酸发酵[M]. 北京:中国轻工业出版社，1987）。随着对抗病毒、抗肿瘤、治疗艾滋病药物研究的深入，对天然胞苷的需求量也日益增加，人们期望得到廉价的、能大规模生产胞苷的工艺方法。利用微生物的变异菌株直接发酵大量生产核苷是现代微生物学的杰出成果。相对于其他方法，此类方法具有条件简单、周期短、易控制、产率高、产量大和成本低等突出优点。国外在20世纪90年代中期才有关于胞苷可以经发酵法大规模生产的报道，而我国有关发酵法生产胞苷的研究尚属空白。随着对胞苷需求量的不断增加，发酵法生产胞苷的研究也日益得到更广泛的重视(乔宾福. 微生物产生核苷和核酸[J]. 工业微生物, 1998,28(1):2)。

在微生物发酵代谢过程中，胞苷作为产物会被释放到培养基中，为了验证微生物生产胞苷的能力，需要测定培养基中胞苷的含量。目前胞苷测定的常用方法主要包括纸层析法和高效液相色谱法。纸层析法检测胞苷精度不高，而且所用的有机溶剂如丙酮等，一般有挥发性、并有一定毒性。高效液相色谱法能坚持微量胞苷，精密度和准确性很高，但仪器昂贵、操作和维护繁琐。因此，寻求简便、快速、准确和应用广泛的胞苷分析法倍受重视。

采用高通量方法筛选胞苷高产菌株，即可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高筛选速度。开发一种简便、快速、准确的方法检测发酵液中的胞苷含量，对于高通量筛选生产胞苷的菌株进行胞苷生产具有重要意义。

发明内容

为了克服筛选胞苷高产菌株的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本发明提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量筛选方法。高通量筛选胞苷高产菌株的方法如下：

（1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-14 h；

（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-48 h；

（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30 min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；

（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40 min；

（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50 min；

（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；

（7）根据胞苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得胞苷高产菌株，

其中，所述反应液A包含氢氧化钠20-30 g/L、水杨酸45-75 g/L和亚硝基铁氰化钠1-3 g/L，反应液B包含次氯酸钠40-60 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700 nm。

在另一优选例中，所述反应液A包含苯酚15-30 ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3 g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15 g/L和次氯酸钠20-40 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630 nm。

在另一优选例中，所述胞苷生产菌的单菌落为自然界含菌样品或通过物理化学等诱变方法获得的突变株。

在另一优选例中，所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3 mL，但是每孔中加入0.5-2.5 mL的培养基。

在另一优选例中，所述溶液种子培养基为：酵母粉2-10 g/L，蛋白胨5-15 g/L，氯化钠5-15 g/L，pH7.0、121℃灭菌20 min。

在另一优选例中，所述发酵培养基为：葡萄糖 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8.96 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素 2 g/L，L-色氨酸 0.05 g/L，1000×微量元素 1 mL，MgSO₄·7H₂0 0.49 g/L，CaCl₂ 0.011 g/L，

其中，所述1000×微量元素组分为：MnCl₂ 1 g/L，ZnCl₂ 1.7 g/L，CuCl₂·2H₂O0.43 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.6 g/L，FeCl₃ 8.125 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.6 g/L，

所述各组分灭菌条件为：葡萄糖 110℃灭菌20 min，尿素和色氨酸过滤除菌，其它组分121℃灭菌20 min。

在另一优选例中，所述的上清液中不能含有菌体，稀释后的上清液与所述缓冲液混合均匀，稀释后的上清液中胞苷的浓度为0.01-10 mM。

在另一优选例中，所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液和HEPES缓冲液之中的一种，所述缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为0.01-0.1M。

在另一优选例中，所述胞苷脱氨酶来源于枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，反应时加入1-20 U胞苷脱氨酶。

在另一优选例中，所述步骤（4）发酵上清液与缓冲液的体积比为1:1-4，和/或

所述步骤（5）反应液A与B的体积比为1:1-4。

在另一优选例中，所述检测样本中胞苷含量与所述发酵培养基中的胞苷标准曲线的建立同时进行。

胞苷脱氨酶酶活的定义：在指定的温度和pH条件下，每分钟转化1μmol胞苷释放产生氨所需的酶量，为一个酶活单位（U）。

本发明的检测方法，可以简单、快速、准确地检测发酵液中胞苷含量，克服现有技术中设备昂贵，操作繁琐，测量耗时等不足。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明提供的高通量筛选胞苷高产菌株的方法如下：

（1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-14 h；

（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-48 h；

（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30 min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；

（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40 min；

（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50 min；

（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；

（7）根据胞苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得胞苷高产菌株，

其中，所述反应液A包含氢氧化钠20-30 g/L、水杨酸45-75 g/L和亚硝基铁氰化钠1-3 g/L，反应液B包含次氯酸钠40-60 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700 nm。

在另一优选例中，所述反应液A包含苯酚15-30 ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3 g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15 g/L和次氯酸钠20-40 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630 nm。

在另一优选例中，所述胞苷生产菌的单菌落为自然界含菌样品或通过物理化学等诱变方法获得的突变株。

在另一优选例中，所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3 mL，但是每孔中加入0.5-2.5 mL的培养基。

在另一优选例中，所述溶液种子培养基为：酵母粉2-10 g/L，蛋白胨5-15 g/L，氯化钠5-15 g/L，pH7.0、121℃灭菌20 min。

在另一优选例中，所述发酵培养基为：葡萄糖 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8.96 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素 2 g/L，L-色氨酸 0.05 g/L，1000×微量元素 1 mL，MgSO₄·7H₂0 0.49 g/L，CaCl₂ 0.011 g/L，

其中，所述1000×微量元素组分为：MnCl₂ 1 g/L，ZnCl₂ 1.7 g/L，CuCl₂·2H₂O0.43 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.6 g/L，FeCl₃ 8.125 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.6 g/L，

所述各组分灭菌条件为：葡萄糖 110℃灭菌20 min，尿素和色氨酸过滤除菌，其它组分121℃灭菌20 min。

在另一优选例中，所述的上清液中不能含有菌体，稀释后的上清液与所述缓冲液混合均匀，稀释后的上清液中胞苷的浓度为0.01-10 mM。

在另一优选例中，所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液和HEPES缓冲液之中的一种，所述缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为0.01-0.1M。

在另一优选例中，所述胞苷脱氨酶来源于枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，反应时加入1-20 U胞苷脱氨酶。

在另一优选例中，所述步骤（4）发酵上清液与缓冲液的体积比为1:1-4，和/或

所述步骤（5）反应液A与B的体积比为1:1-4。

在另一优选例中，所述检测样本中胞苷含量与所述发酵培养基中的胞苷标准曲线的建立同时进行。

本发明中，所述胞苷脱氨酶（CDA）来源于枯草芽孢杆菌或大肠杆菌中的一种或两种以上。CDA的获得没有特别的限制，可以采用本领域已知的各种方法。在优选例中，采用以下方法获得CDA：

以枯草芽孢杆菌基因组为模板PCR得到cdd基因，并将其连接到pET28载体(购自美国invitrogen公司)转化BL21(DE3)菌株，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，表达2h后离心收菌，加入Lysis Buffer(含有PMSF和DTT)后进行超声破碎，上清与已平衡的His纯化树脂过夜结合后，加入Wash Buffer重复洗涤3-4次后加入Elution Buffer洗脱蛋白。由于纯化的CDA蛋白含有高浓度的咪唑(250 mM)，因此需进行透析处理。将洗脱液置于透析袋中放入盛有透析液的烧杯中，4℃透析过夜。将透析好的CDA蛋白溶液加入30%的甘油并分装为200 μL/管后置于-20℃备用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明与现有技术相比所具有的优点如下：

1、检测通量高。所谓“高通量”(High throughput screening，HTS)是指利用可批量操作的工具及可进行自动化分析的操作系统执行实验的过程，并通过快速灵敏的检测器采集实验数据并进行批量处理分析的一种方法。本法涉及一种以CDA酶作为工具酶并将反应产生的靛酚蓝的吸光度值与胞苷的产量相偶联的检测方法。本法可以在200 μL的微孔中进行，利用96孔板和酶标仪可以实现高通量的操作，能够满足工业生产时上批量样品检测的要求。

2、检测费用低。本发明提供的测定方法中所需的设备和试剂均为实验室常备且价格低廉。与高效液相色谱(HPLC)等相比，此法省去了昂贵的设备使用费，并且高通量操作时可进一步降低样品的检测费用。

3、检测时间短。本方法涉及的检测方法一次测定时间约为一个小时，利用96孔板一次实验即可得到大量样品的结果。本法同时测定标准样品(简称为标品)和样品，样品中胞苷的含量通过读数即可。另外，此法只需要对样品进行简单的离心取上层发酵液即可，与高效液相色谱(HPLC)相比，此法大大缩短了检测样品所需要的时间，从而能够快速的获得实验结果并指导后续实验。

4、操作步骤简单，对实验设备及操作人员要求低，可以快速掌握。本方法中所用仪器为多道移液器、离心机、酶标仪及数据的处理软件Excel等均为实验室较常用的技能，只需简单地培训即可在短时间内掌握。

5、实验数据准确，平行性好。通过该方法测定的发酵液中胞苷的含量与HPLC测定的结果进行比较后发现基本一致，差值在操作误差范围之内，且样品之间重复性良好，同一样品数次测量的差值保持在5%之内，对生产具有比较高的指导意义。

附图说明：

图1为H₂O中胞苷的标准曲线；

图2为M9培养基中胞苷的标准曲线；

图3为应用本发明方法与HPLC方法检测M9培养基发酵液中胞苷的含量的结果图；

图4为发酵液上清加标回收实验结果图；

图5为本发明方法与HPLC方法检测应用本发明方法筛选出的胞苷高产菌的胞苷产量结果比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800 rpm摇床培养8h；

（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中， 40℃、300 rpm摇床培养20 h；

（3）将深孔板II放置于孔板离心机，8000×g离心30 min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；

（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于35℃温浴反应20 min；发酵上清液与缓冲液的体积比为1:1-4；

（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于35℃温浴反应30 min；反应液A与B的体积比为1:1-4。

（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；

（7）根据胞苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得胞苷高产菌株，

其中，所述反应液A包含：氢氧化钠20 g/L、水杨酸45 g/L和亚硝基铁氰化钠1-3g/L；反应液B包含：次氯酸钠40 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700 nm，或

所述反应液A包含苯酚15-ml/L和亚硝基铁氰化钠2 g/L，反应液B为包含氢氧化钠10 g/L和次氯酸钠20 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630nm。

所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3 mL，但是每孔中加入2 mL的培养基。所述溶液种子培养基为：酵母粉2 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0、121℃灭菌20 min。所述发酵培养基为：葡萄糖 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8.96 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素 2 g/L，L-色氨酸 0.05 g/L，1000×微量元素 1 mL，MgSO₄·7H₂0 0.49g/L，CaCl₂ 0.011 g/L，所述1000×微量元素组分为：MnCl₂ 1 g/L，ZnCl₂ 1.7 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.43 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.6 g/L，FeCl₃ 8.125 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.6 g/L，

所述各组分灭菌条件为：葡萄糖 110℃灭菌20 min，尿素和色氨酸过滤除菌，其它组分121℃灭菌20 min。

实施例2

H₂O中胞苷的标准曲线。

配制反应液A和反应液B：

反应液A：氢氧化钠26 g/L、水杨酸68 g/L和亚硝基铁氰化钠2 g/L；

反应液B：次氯酸钠45 ml/L。

胞苷标品用去离子水溶解，将胞苷标品稀释到的终浓度为0.01 mM，0.05 mM，0.1mM，0.25 mM，0.5 mM，1 mM，2 mM，3 mM，4 mM，5 mM，6 mM，7 mM，8 mM，9 mM，10 mM。

在酶标板的微孔中加入25μL不同浓度的胞苷标准品，100μL 0.01M的PBS缓冲液和3U CDA（从-20℃取出后冰上融化），于37℃温浴反应30 min；反应结束后立即用排枪加入50μL 反应液A和50 μL反应液B，于37℃温浴反应30 min，然后采用酶标仪测定反应液在696nm处的吸光度值。每个样品做3个重复。用Excel对数据进行处理后，分别以胞苷浓度和OD₆₉₆值为横纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

实施例3

M9培养基中胞苷的标准曲线。

1000×微量元素：MnCl₂ 1 g/L；ZnCl₂ 1.7 g/L；CuCl₂·2H₂O 0.43 g/L；CoCl₂·6H₂O 0.6 g/L；FeCl₃ 8.125 g/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.6 g/L。

M9培养基配方：葡萄糖10 g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 8.96 g/L；KH₂PO₄ 1.5 g/L；NaCl2.5 g/L；尿素 2 g/L；L-色氨酸 0.05 g/L；1000×微量元素1 mL；MgSO₄·7H₂O 0.49 g/L；CaCl₂ 0.011 g/L。

反应液A和B的配制方法同实施例1。

胞苷标品用M9溶解，将胞苷标品用M9稀释到终浓度为0.01 mM，0.05 mM，0.1 mM，0.25 mM，0.5 mM，1 mM，2 mM，3 mM，4 mM，5 mM，6 mM，7 mM，8 mM，9 mM，10 mM。。

在酶标板的微孔中加入25μL不同浓度的胞苷标准品，100μL 0.01M的PBS缓冲液和3U CDA（从-20℃取出后冰上融化），于37℃温浴反应30 min；反应结束后立即用排枪加入50μL反应液A和50μL反应液B，于37℃温浴反应30 min，然后采用酶标仪测定反应液在696 nm处的吸光度值。每个样品做3个重复。用Excel对数据进行处理后，分别以胞苷浓度和OD₆₉₆值为横纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

实施例4

抗干扰实验

本实施例将常用的培养基中的盐离子及其他复合成分对上述方法的准确性影响进行了研究。在体系中添加2 mM胞苷，以不添加任何干扰成分作为对照组，分别添加表1中各种成分后作为实验组，将对照组测定的胞苷结果的相对值设为100，实验组的测定结果与对照组进行比较后得出相对值。

实验结果如表1所示。

表1 不同组分对CDA检测结果的影响

由上述检测结果可知，大多数常用培养基中的组分对本发明方法没有影响，本发明的方法具有较强的抗干扰能力。本实施例用的M9培养基由于含有葡萄糖，SO₄ ^2-，Mg²⁺，Na⁺，Cl^-等对上述方法没有影响的盐离子，因此本发明的方法特别适用于以此培养基培养的菌株发酵得到的发酵液中的胞苷含量的测定。

实施例5

利用CDA方法和HPLC方法检测M9发酵培养基中胞苷含量比较。

本实施例中所用种子培养基为酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。所用发酵培养基同实施例3中的M9培养基，发酵菌种为产胞苷枯草芽孢杆菌。HPLC检测所用仪器及条件：Agilent 1200 series高效液相色谱仪(高压二元泵，紫外检测器，自动进样器，柱温箱，Chem station工作站)；色谱柱：Agilent C18柱(250 mm×416mm，5 μm)；检测器：紫外检测器；检测波长：280 nm；流动相：水( pH=3.0)：乙腈=94：6；流速：0.8 mL/min；柱温：35℃：进样量：10 μL。

取-80℃保藏菌种划线接种于活化平板，37℃恒温静置培养16 h。按1%接种量接种到装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，37℃，200 r/min，培养12 h。然后按初始OD600为0.2接种到装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃，200 r/min，培养48 h。每隔8h取一次样，分别用CDA方法和HPLC方法检测发酵液中的胞苷含量，结果见图3。

通过比较两种方法的结果发现，两种方法的结果基本一致，表明本发明中所用检测方法具有较高的准确性。

实施例6

加标回收实验。

本实施例在实施例5中的24 h发酵液样品中加入0-2 mM的胞苷标准品，然后检测反应液的吸光度值，结果见图4。

从图4可以看出，本发明中的检测方法检测到的胞苷含量与加入的胞苷含量非常接近，在发酵液中加入不同浓度的胞苷的检测值呈现很好的线性关系（R²=0.9971）。直线的斜率表示回收率，本方法的回收率为98.69%。这些结果说明该方法有很好的准确性和可重复性。

实施例7

利用CDA方法高通量筛选胞苷高产菌株。

本实施例所用出发菌株为实施例5中的产胞苷枯草芽孢杆菌。首先将此菌株用实施例5中的种子培养基将菌株活化，然后用402 nm的激光诱变器进行诱变照射1-3 min。诱变菌株用常用LB平板分选后，随机挑取95个单菌落接种到装有1 mL种子培养基的总体积为3 mL的96孔深孔培养板中，37℃，200 r/min培养16 h。然后按1%接种量转接一次装有1 mL发酵培养基的总体积为3 mL的96孔深孔培养板，37℃，200 r/min培养24 h。然后检测发酵液上清中的胞苷含量。

表2显示的是深孔培养板中发酵液上清的胞苷含量，图5表示用本发明检测方法和HPLC同时检测用本发明检测方法筛选出的胞苷高产的4个菌株的胞苷产量。结果显示两个方法的相关性较好。

表2 96孔深孔板中胞苷含量

Claims (6)

1.一种对胞苷生产菌发酵培养物中胞苷产量的检测方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800rpm摇床培养8-14h；

(2)将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800rpm摇床培养8-48h；

(3)将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；

(4)在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40min；

(5)反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50min；

(6)步骤(5)反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据发酵培养基中的胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；

其中，所述反应液A包含：氢氧化钠20-30g/L、水杨酸45-75g/L和亚硝基铁氰化钠1-3g/L；反应液B包含：次氯酸钠40-60ml/L，步骤(3)反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700nm，或

所述反应液A包含苯酚15-30ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15g/L和次氯酸钠20-40ml/L，步骤(3)反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630nm。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的发酵液上清中不能含有菌体，稀释后的发酵液上清与所述缓冲液混合均匀，稀释后的发酵液上清中胞苷的浓度为0.01-10mM。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液和HEPES缓冲液之中的一种，所述缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为0.01-0.1M。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述胞苷脱氨酶来源于枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，反应时加入1-20U胞苷脱氨酶。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(4)发酵液上清与缓冲液的体积比为1:1-4，所述步骤(5)反应液A与B的体积比为1:1-4。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述发酵液上清中胞苷含量与所述发酵培养基中的胞苷标准曲线的建立同时进行。