CN101441148B - 咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是提供咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法。具体地说，本发明提供测定咪唑立宾和/或利巴韦林的简单方法，其中，使用能够催化第一反应的第一酶和能够催化第二反应的第二酶，所述第一反应是将咪唑立宾和/或利巴韦林磷酸化的反应，所述第二反应是与该第一反应不同的反应，其不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制。

Description

咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法

技术领域

本发明涉及咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法及其磷酸化方法。

背景技术

5-羟基-1-β-D-呋喃核糖基-1H-咪唑-4-羧酰胺(4-carbamoyl-1-β-D-ribofuranosylimidazolium-5-olate，以下有时记作咪唑立宾(Mizoribine))在对肾移植的排斥反应的抑制等方面的有效性得到认可，是已有市售的免疫抑制剂(专利文献1、2)。

另外，对咪唑立宾进行了各种机理的研究(非专利文献1)。此外，作为现有的咪唑立宾的测定方法，已知有利用HPLC、LC/MS/MS的测定方法(非专利文献2)。

1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4，-三氮唑-3-羧酰胺(1-β-D-ribofuranosyl-1H-1，2，4-tri-azole-3-carboxamide，以下有时记作利巴韦林(Ribavirin))是已有市售的抗病毒药，其与干扰素α合用时，能提高对慢性丙型肝炎等的治疗效果。作为现有的利巴韦林的测定方法，已知有利用HPLC、LC/MS/MS的测定方法(非专利文献3、4)。

另外，后文中作为本件发明的第一酶的优选实例举出了来自泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)的蛋白质，作为该蛋白质的信息，非专利文献5中公开了可能是该蛋白质的碱基序列、核糖激酶的内容。

专利文献1：USP3888843

专利文献2：USP5442051

非专利文献1：Pediatr.Int.，44，196-198，2002年

非专利文献2：J.Chromato.，222卷，156页，1981年

非专利文献3：Yeh L.T.等，J.Chromatogr.Sci.，41卷，255页，2003年

非专利文献4：Yeh L.T.等，J.Pharm.Biomed.Anal.，43卷，1057页，2007年

非专利文献5：BMC Genomics 6，174-187，2005年

发明内容

本发明的课题是提供测定咪唑立宾和/或利巴韦林的简单方法。

为了解决上述课题，本发明人反复进行了深入研究，结果新发现了可对将咪唑立宾和/或利巴韦林有效磷酸化的第一反应进行催化的第一酶，从而完成了咪唑立宾和/或利巴韦林的磷酸化方法。进而完成了使用该第一酶的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法。即，开发出了利用该第一酶和能够催化第二反应的第二酶的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法及其测定用组合物，从而完成了本发明，所述第二反应是与所述第一反应不同的反应，其不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制。

即，本发明涉及下述技术方案。

[0]咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其包括下述(1)工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化。

[1]如[0]所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其包括下述(1)、(2)和(3)各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化；

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述<a>～<c>中任意一个反应，

<a>不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制的反应，

<b>不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制的反应，

<c>不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应；

(3)检测第二反应受抑制程度的工序。

[1-1]如[0]或[1]所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其包括下述(1)、(2)和(3)中的各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化；

(2)抑制第二反应的工序，其中，进行第二反应时，使上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与第一反应不同的反应，其不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制；

(3)检测第二反应受抑制程度的工序。

[1-1-1]如[1-1]所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，上述的(2)工序如下：

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述<a>～<c>中任意一个反应，

<a>不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制的反应，

<b>不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制的反应，

<c>不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应。

[1-2]如[0]、[1]～[1-1]任一项所述的测定方法，其中，第一酶是如下任意一种酶：

〔1〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；或者

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[1-3]如[0]、[1]～[1-2]任一项所述的测定方法，其中，第一酶是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成。

[1-4]如[0]、[1]～[1-3]任一项所述的测定方法，其中，第一酶是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列。

[1-5]如[0]、[1]～[1-4]任一项所述的测定方法，其中，编码第一酶的碱基序列是序列表序列编号2表示的碱基序列。

[1-6]如[0]、[1]～[1-5]任一项所述的测定方法，其中，第一酶是具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶：

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[1-7]如[1-6]所述的测定方法，其中，该磷酸供体是ATP。

[1-8]如[0]、[1]～[1-7]任一项所述的测定方法，其中，第一酶来自伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)属。

[1-9]如[0]、[1]～[1-8]任一项所述的测定方法，其中，第一酶来自泰国伯克霍尔德氏菌。

[1-10]如[0]、[1]～[1-9]任一项所述的测定方法，其中，第一酶来自泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株。

[1-11]如[0]、[1]～[1-10]任一项所述的测定方法，其中，第一酶通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量约为34kDa。

[1-12]如[0]、[1]～[1-11]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是受磷酸咪唑立宾抑制、受磷酸利巴韦林抑制或者受磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的酶。

[1-13]如[0]、[1]～[1-12]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是受磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的酶。

[1-14]如[0]、[1]～[1-13]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

[1-15]如[0]、[1]～[1-14]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是如下任意一种酶：

《1》能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列构成；

《2》能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号11的氨基酸序列和序列表序列编号12的氨基酸序列；或者

《3》具有下述的<i>～<v>的理化性质的酶，

<i>作用

作用于NAD(P)类和肌苷5’一磷酸，催化生成NAD(P)H类和黄苷5’一磷酸的反应；

<ii>最适pH

pH 8～9；

<iii>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～11的范围保持70％以上的活性；

<iv>热稳定性

在含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7的水溶液中，于60℃进行30分钟的热处理时，保持85％以上的活性；

<v>抑制作用

至少磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制其作用。

[1-16]如[0]、[1]～[1-15]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是还具有下述的<vi>的理化性质的酶：

<vi>分子量

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为52～54kDa。

[1-17]如[0]、[1]～[1-16]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列构成。

[1-18]如[0]、[1]～[1-17]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由在序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，并且该氨基酸序列含有序列表序列编号11的氨基酸序列和序列表序列编号12的氨基酸序列。

[1-19]如[0]、[1]～[1-18]任一项所述的测定方法，其中，编码第二酶的碱基序列是以序列表序列编号8或序列表序列编号10表示的碱基序列。

[1-20]如[0]、[1]～[1-19]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是具有下述的<i>～<v>的理化性质的酶：

<i>作用

作用于NAD(P)类和肌苷5’一磷酸，催化生成NAD(P)H类和黄苷5’一磷酸的反应；

<ii>最适pH

pH 8～9；

<iii>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～11的范围保持70％以上的活性；

<iv>热稳定性

在含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7的水溶液中，于60℃进行30分钟的热处理时，保持85％以上的活性；

<v>抑制作用

至少磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制其作用。

[1-21]如[0]、[1]～[1-20]任一项所述的测定方法，其中，第二酶是还具有下述的<vi>的理化性质的酶：

<vi>分子量

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为52～54kDa。

[1-22]如[0]、[1]～[1-21]任一项所述的测定方法，其中，第二酶来自芽孢杆菌(Bacillus)属或海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)属。

[1-23]如[0]、[1]～[1-22]任一项所述的测定方法，其中，第二酶来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)或Oceanobacillus iheyensis。

[1-24]如[0]、[1]～[1-23]任一项所述的测定方法，其中，第二酶来自枯草杆菌ATCC23857株或Oceanobacillus iheyensis DSM14731株。

[1-25]如[0]、[1]～[1-24]任一项所述的测定方法，其中，(1)工序是还含有磷酸供体的工序。

[1-26]如[0]、[1]～[1-25]任一项所述的测定方法，其中，(1)的工序是还含有金属离子的工序。

[1-27]如[1-26]所述的测定方法，其中，该磷酸供体是ATP。

[1-28]如[1-27]所述的测定方法，其中，金属离子是镁离子、钴离子、镍离子和锰离子中的任意一种以上。

[1-29]如[0]、[1]～[1-28]任一项所述的测定方法，其中，(2)工序是还含有肌苷5’一磷酸的工序。

[1-30]如[0]、[1]～[1-29]任一项所述的测定方法，其中，(2)工序是还含有NAD(P)类的工序。

[1-31]如[0]、[1]～[1-30]任一项所述的测定方法，其中，该磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林是单磷酸咪唑立宾和单磷酸利巴韦林。

[1-32]如[0]、[1]～[1-31]任一项所述的测定方法，其中，(3)工序中抑制程度的检测是测定第二酶反应速度的工序。

[1-33]如[0]、[1]～[1-32]任一项所述的测定方法，其中，(3)工序中抑制程度的检测是测定NAD(P)类的变化量的工序。

[1-34]如[0]、[1]～[1-33]任一项所述的测定方法，其中，(3)工序中抑制程度的检测是如下的工序：对工序(1)和(2)处理后的已知量的咪唑立宾和/或利巴韦林所引起的变化量和测定对象所引起的变化量进行检测并比较，从而对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行定量。

[2]咪唑立宾的测定方法，其中，所述方法包括下述(1)、(2)和(3)各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾进行磷酸化；

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化该第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的该磷酸咪唑立宾与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸咪唑立宾的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，其不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制；和

(3)检测第二反应受抑制程度的工序。

[2-1]如上述[2]所述的咪唑立宾的测定方法，其中，所述方法具有上述[0]、[1]～[1-34]中记载的至少任意一个特征。

[3]利巴韦林的测定方法，其中，所述方法包括下述(1)、(2)和(3)各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对利巴韦林进行磷酸化的酶的存在下，对试样中可能含有的利巴韦林进行磷酸化；

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化该第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的该磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，其不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制；和

(3)检测第二反应受抑制程度的工序。

[3-1]如上述[3]所述的利巴韦林的测定方法，其中，所述方法具有上述[0]、[1]～[1-34]中记载的至少任意一个特征。

[4]咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其包括下述(a)～(c)中的各工序：

(a)包括反应I的工序，在所述反应I中，在下述〔1〕～〔3〕中任意的酶和ATP的存在下，使试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林和ADP；

〔1〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成，

〔2〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，并且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列，

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在ATP存在下，催化使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林和ADP的反应；或者，

至少在ATP存在下，催化使咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林变成磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性；

(b)在催化与上述反应I不同的反应II或两个以上的反应II的酶B或两个以上的酶B的存在下，使反应II产生的测定对象对应上述反应I产生的ADP的量发生变化的工序；

(c)检测该测定对象的变化量，测定试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林的量的工序。

[4-1]如[4]所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林是单磷酸咪唑立宾和/或单磷酸利巴韦林。

[4-2]如[4]～[4-1]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶是由序列表序列编号1所述的氨基酸序列构成的酶。

[4-3]如[4]～[4-2]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶是由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成的酶。

[4-4]如[4]～[4-3]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列。

[4-5]如[4]～[4-4]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶是具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶：

<1>作用

至少在ATP存在下，催化使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林和ADP的反应；或者，

至少在ATP存在下，催化使咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林变成磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[4-6]如[4]～[4-5]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶来自泰国伯克霍尔德氏菌。

[4-7]如[4]～[4-6]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶来自泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株。

[4-8]如[4]～[4-7]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(a)工序中的所述酶至少利用镁离子、钴离子、镍离子或锰离子。

[4-9]如[4]～[4-8]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，

(b)工序中包括(b-1)反应和(b-2)反应，(b-1)反应中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下，使葡萄糖和ADP变成葡萄糖-6-磷酸和AMP；(b-2)反应中，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下，使NAD(P)类和上述反应生成的葡萄糖-6-磷酸变成NAD(P)H类和葡糖酸内酯-6-磷酸；NAD(P)H类对应上述反应I生成的ADP的量增加，

(c)工序是检测NAD(P)H类的增加量的工序。

[4-10]如[4]～[4-9]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，

(b)工序中包括(b-1)反应和(b-2)反应，(b-1)反应中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和磷酸烯醇丙酮酸(本说明书有时记作PEP)变成ATP和丙酮酸；(b-2)反应中，在乳酸脱氢酶的存在下，使NAD(P)H类和上述反应生成的丙酮酸变成NAD(P)类和乳酸；NAD(P)H类对应上述反应I生成的ADP的量减少，

(c)工序是检测NAD(P)H类的减少量的工序。

[4-11]如[4]～[4-10]任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，

(b)工序中包括(b-1)反应和(b-2)反应，(b-1)反应中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和PEP变成丙酮酸和ATP；(b-2)反应中，在丙酮酸氧化酶的存在下，使氧、磷酸和上述反应生成的丙酮酸变成过氧化氢和乙酰磷酸；过氧化氢对应上述反应I生成的ADP的量增加，

(c)工序是用过氧化氢指示剂等检测过氧化氢的量的工序。

[4-12]如[4]～[4-11]中任一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，(c)工序中变化量的检测是如下的工序：对工序(a)和(b)处理后的已知量的咪唑立宾和/或利巴韦林所引起的变化量和测定对象所引起的变化量进行检测并比较，从而对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行定量。

[4-13]如[4]～[4-12]中任意一项所述的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其中，该酶利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为约34kDa。

[5]咪唑立宾的测定方法，该方法包括下述(a)～(c)各工序。

(a)包括反应I的工序，在所述反应I中，在下述〔1〕～〔3〕中任意的酶和ATP的存在下，使试样中可能含有的咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾和ADP；

〔1〕能对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成，

〔2〕能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其是由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列，

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在ATP存在下，催化使咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾和ADP的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性；

(b)在催化与上述反应I不同的反应II或两个以上的反应II的酶B或两个以上的酶B的存在下，使反应II产生的测定对象对应上述反应I产生的ADP的量发生变化的工序；

(c)检测该测定对象的变化量，测定试样中可能含有的咪唑立宾的量的工序。

[5-1]如上述[5]所述的测定方法，其中，所述方法具有上述[4]～[4-13]中记载的至少任意一项特征。

[6]利巴韦林的测定方法，该方法包括下述(a)～(c)中的各工序。

(a)包括反应I的工序，在所述反应I中，在下述〔1〕～〔3〕中任意的酶和ATP的存在下，使试样中可能含有的利巴韦林变成磷酸利巴韦林和ADP；

〔1〕能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成，

〔2〕能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列，

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在ATP存在下，催化使利巴韦林变成磷酸利巴韦林和ADP的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性；

(b)在催化与上述反应I不同的反应II或两个以上的反应II的酶B或两个以上的酶B的存在下，使反应II产生的测定对象对应上述反应I产生的ADP的量发生变化的工序；

(c)检测该测定对象的变化量，测定试样中可能含有的利巴韦林的量的工序。

[6-1]如上述[6]所述的测定方法，其中，所述方法具有上述[4]～[4-13]中记载的至少任意一项特征。

[7]咪唑立宾和/或利巴韦林的磷酸化方法，该方法使用下述〔1〕～〔3〕中任意一种酶：

〔1〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[7-1]如[7]所述的磷酸化方法，其中，该磷酸供体是ATP。

[7-2]如[7]～[7-1]任一项所述的磷酸化方法，其中，该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林是单磷酸咪唑立宾和/或单磷酸利巴韦林。

[7-3]如[7]～[7-2]任一项所述的磷酸化方法，其中，能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量约为34kDa。

[7-4]如[7]～[7-3]任一项所述的磷酸化方法，其中，使用由序列表序列编号1中记载的氨基酸序列构成的酶。

[7-5]如[7]～[7-4]任一项所述的磷酸化方法，其中，使用能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，该酶由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列。

[7-6]如[7]～[7-5]任一项所述的磷酸化方法，其中，编码该酶的碱基序列是以序列表序列编号2表示的碱基序列。

[7-7]如[7]～[7-6]任一项所述的磷酸化方法，其中，使用具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶：

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[7-8]如[7-7]所述的磷酸化方法，其中，该磷酸供体是ATP。

[7-9]如[7]～[7-8]任一项所述的磷酸化方法，其中，该酶利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为约34kDa。

[7-10]如[7]～[7-9]任一项所述的磷酸化方法，其中，该酶来自伯克霍尔德氏菌属。

[7-11]如[7]～[7-10]任一项所述的磷酸化方法，其中，该酶来自泰国伯克霍尔德氏菌。

[7-12]如[7]～[7-11]任一项所述的磷酸化方法，其中，该酶来自泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株。

[8]咪唑立宾的磷酸化方法，该方法使用下述〔1〕～〔3〕中任意一种酶：

〔1〕能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下，催化使咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[8-1]如上述[8]所述的咪唑立宾的磷酸化方法，其中，所述方法具有上述[7]～[7-12]记载的至少任意一项特征。

[9]利巴韦林的磷酸化方法，该方法使用下述〔1〕～〔3〕中任意一种酶：

〔1〕能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4<的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下，催化使利巴韦林变成磷酸利巴韦林的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[9-1]如上述[9]所述的利巴韦林的磷酸化方法，其中，所述方法具有上述[7]～[7-12]中记载的至少任意一项特征。

[10]磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的制造方法，其中，使用下述〔1〕～〔3〕中任意一种酶，使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林；

〔1〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[10-1]如上述[10]所述的制造方法，其中，所述方法具有上述[7]～[7-12]记载的至少任意一项特征。

[11]磷酸咪唑立宾的制造方法，其中，使用下述〔1〕～〔3〕中任意一种酶，使咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾；

〔1〕能对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下，催化使咪唑立宾变成磷酸咪唑立宾的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[11-1]如上述[11]所述的制造方法，其中，所述方法具有上述[7]～[7-12]记载的至少任意一项特征。

[12]磷酸利巴韦林的制造方法，其中，使用下述〔1〕～〔3〕中任意一种酶，使利巴韦林变成磷酸利巴韦林；

〔1〕能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成；

〔2〕能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下，催化使利巴韦林变成磷酸利巴韦林的反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[12-1]如上述[12]所述的制造方法，其中，所述方法具有上述[7]～[7-12]记载的至少任意一项特征。

[13]一种组合物，其含有下述成分：

(A1)第一酶，其能够催化对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一反应；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其能够催化第二反应，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述<a>～<c>中任意一个反应，

<a>不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制的反应，

<b>不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制的反应，

<c>不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

[13-0-1]如[13]所述的组合物，其中，其用于咪唑立宾和/或利巴韦林的测定。

[13-0-2]咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物，其含有下述的(A)和(B)：

(A)第1试剂，其至少含有下述(A1)～(A4)：

(A1)有效量的第一酶，其能够催化对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一反应；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4)有效量的第二酶、肌苷5’一磷酸和NAD(P)类中任意一个或两个成分，所述第二酶催化与第一反应不同的反应，其受磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制；

(B)第2试剂，其至少含有有效量的受磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制的第二酶、肌苷5’一磷酸以及NAD(P)类之中第1试剂中不含的成分。

[13-0-3]如[13]所述的组合物，其是含有下述成分的咪唑立宾测定用组合物：

(A1)第一酶，其能够催化对咪唑立宾进行磷酸化的第一反应；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其催化与上述第一反应不同的第二反应，其不受咪唑立宾抑制，但受磷酸咪唑立宾抑制；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

[13-0-4]如[13]所述的组合物，其是含有下述成分的利巴韦林测定用组合物：

(A1)第一酶，其能够催化对利巴韦林进行磷酸化的第一反应；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其催化与上述第一反应不同的第二反应，其不受利巴韦林抑制，但受磷酸利巴韦林抑制；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

[13-0-5]如[13]所述的组合物，其是含有下述成分的磷酸咪唑立宾测定用组合物：

(A4-1)第二酶，其催化与上述第一反应不同的第二反应，受磷酸咪唑立宾抑制；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

[13-0-6]如[13]所述的组合物，其是含有下述成分的磷酸利巴韦林测定用组合物：

(A4-1)第二酶，其催化与上述第一反应不同的第二反应，受磷酸利巴韦林抑制；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

[13-0-7]如[13]～[13-0-6]任一项所述的组合物，其中，在该测定用组合物中，下述3种成分之中任意一种以上是在即将测定前加入的：

(A4-1)第二酶；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

[13-1]如[13]所述的组合物，其中，该磷酸供体是ATP。

[13-2]如[13]～[13-1]所述的组合物，其中，金属离子是镁离子、钴离子、镍离子和锰离子之中的任意一个以上。

[13-3]咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物，其含有下述的(A)和(B)：

(A)第1试剂，其至少含有下述(A1)～(A4)：

(A1)有效量的第一酶，其可对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4)有效量的第二酶、以及NAD(P)类，所述第二酶受磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制；

(B)第2试剂，其至少含有有效量的肌苷5’一磷酸。

[13-4]如[13-3]所述的组合物，其中，该磷酸供体是ATP。

[13-5]如[13-3]～[13-4]中任一项所述的组合物，其中，金属离子是镁离子、钴离子、镍离子和锰离子之中的任意一个以上。

[13-6]如[13]～[13-5]任一项所述的组合物，其进一步含有下述(C)：

(C)标准试剂，其至少含有已知量的咪唑立宾和/或利巴韦林。

[13-7]如[13]～[13-6]任一项所述的组合物，其中，第一酶是下述酶中的任意一种酶：

〔1〕由序列表序列编号1的氨基酸序列构成的酶；

〔2〕由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的酶，该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；或者

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[13-8]如[13]～[13-7]任一项所述的组合物，其中，第一酶是由序列表序列编号1的氨基酸序列构成的酶。

[13-9]如[13]～[13-8]任一项所述的组合物，其中，第一酶是由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成的酶，该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列。

[13-10]如[13]～[13-9]任一项所述的组合物，其中，编码第一酶的碱基序列是序列表序列编号2表示的碱基序列。

[13-11]如[13]～[13-10]任一项所述的组合物，其中，第一酶是具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶：

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[13-12]如[13-11]所述的组合物，其中，该磷酸供体是ATP。

[13-13]如[13-11]～[13-12]任一项所述的组合物，其中，该磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林是单磷酸咪唑立宾和单磷酸利巴韦林。

[13-14]如[13]～[13-13]任一项所述的组合物，其中，第一酶来自伯克霍尔德氏菌属。

[13-15]如[13]～[13-14]任一项所述的组合物，其中，第一酶来自泰国伯克霍尔德氏菌。

[13-16]如[13]～[13-15]任一项所述的组合物，其中，第一酶来自泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株。

[13-17]如[13]～[13-16]任一项所述的组合物，其中，第二酶是受磷酸咪唑立宾抑制、受磷酸利巴韦林抑制或者受磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的酶。

[13-18]如[13]～[13-17]任一项所述的组合物，其中，第二酶是受磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的酶。

[13-19]如[13]～[13-18]任一项所述的组合物，其中，第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

[13-20]如[13]～[13-19]任一项所述的组合物，其中，第二酶是如下任意一种酶：

《1》能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列构成；

《2》能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号11的氨基酸序列和序列表序列编号12的氨基酸序列：或者

《3》具有下述的<i>～<v>的理化性质的酶，

<i>作用

作用于NAD(P)类和肌苷5’一磷酸，催化生成NAD(P)H类和黄苷5’一磷酸的反应；

<ii>最适pH

pH 8～9；

<iii>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～11的范围保持70％以上的活性；

<iv>热稳定性

在含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7的水溶液中，于60℃进行30分钟的热处理时，保持85％以上的活性；

<v>抑制作用

至少磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制其作用。

[13-21]如[13]～[13-20]任一项所述的组合物，其中，第二酶是还具有下述的<vi>的理化性质的酶：

<vi>分子量

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为52～54kDa。

[13-22]如[13]～[13-21]任一项所述的组合物，其中，第二酶是能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列构成。

[13-23]如[13]～[13-22]任一项所述的组合物，其中，第二酶是能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由在序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列构成，并且该氨基酸序列含有序列表序列编号11的氨基酸序列和序列表序列编号12的氨基酸序列。

[13-24]如[13]～[13-23]任一项所述的组合物，其中，编码第二酶的碱基序列是以序列表序列编号8或序列表序列编号10表示的碱基序列。

[13-25]如[13]～[13-24]任一项所述的组合物，其中，第二酶是具有下述的<i>～<v>的理化性质的酶：

<i>作用

作用于NAD(P)类和肌苷5’一磷酸，催化生成NAD(P)H类和黄苷5’一磷酸的反应；

<ii>最适pH

pH 8～9；

<iii>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～11的范围保持70％以上的活性；

<iv>热稳定性

在含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7的水溶液中，于60℃进行30分钟的热处理时，保持85％以上的活性；

<v>抑制作用

至少磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制其作用。

[13-26]如[13]～[13-25]任一项所述的组合物，其中，第二酶是还具有下述的<vi>的理化性质的酶：

<vi>分子量

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为52～54kDa。

[13-27]如[13]～[13-26]任一项所述的组合物，其中，第二酶来自芽孢杆菌属或海洋芽孢杆菌属。

[13-28]如[13]～[13-27]任一项所述的组合物，其中，第二酶来自枯草杆菌或Oceanobacillus iheyensis。

[13-29]如[13]～[13-28]任一项所述的组合物，其中，第二酶来自枯草杆菌ATCC23857株或Oceanobacillus iheyensis DSM14731株。

[14]酶的制造方法，其是以下〔1〕～〔3〕中任意一种酶的制造方法，所述方法包括根据编码该酶的碱基序列形成该酶的工序和获得该酶的工序；

〔1〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成：

〔2〕能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成，并且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列；

〔3〕具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶，

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[14-1]如[14]所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用含有编码该酶的碱基序列的细胞的步骤。

[14-2]如[14]～[14-1]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用导入有编码该酶的碱基序列的转化体的步骤。

[14-3]如[14]～[14-2]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用具有编码该酶的碱基序列的微生物的步骤。

[15]如[14]～[14-3]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用属于伯克霍尔德氏菌属的微生物的步骤，所述微生物产生能够催化使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应的酶。

[15-1]如[14]～[15]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用泰国伯克霍尔德氏菌的步骤。

[15-2]如[14]～[15-1]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株的步骤。

[16]如[14]～[15-2]任一项所述的制造方法，其中，该酶是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成。

[16-1]如[14]～[16]任一项所述的制造方法，其中，该酶是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成。

[16-2]如[14]～[16-1]任一项所述的制造方法，其中，该酶是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成，并且该氨基酸序列含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列。

[17]如[14]～[16-2]任一项所述的制造方法，其中，获得在根据编码该酶的碱基序列形成该酶的工序中所形成的该酶时，进一步包括精制后获得酶的工序。

[17-1]如[14]～[17]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用含有编码该酶的碱基序列的细胞的步骤。

[17-2]如[14]～[17-1]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用导入有编码该酶的碱基序列的转化体的步骤。

[18]如[14]～[17-2]任一项所述的制造方法，其中，编码该酶的碱基序列是序列表序列编号2表示的碱基序列。

[21]如[14]～[18]任一项所述的制造方法，其中，该酶是具有下述的<1>～<4>的理化性质的酶：

<1>作用

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾和/或利巴韦林成为磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应；或者，

至少在磷酸供体存在下催化使咪唑立宾成为磷酸咪唑立宾的反应或使利巴韦林成为磷酸利巴韦林的反应中的至少任意一种反应；

<2>最适pH

pH 5.5～6.5；

<3>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性；

<4>热稳定性

在100mM磷酸钾缓冲液的pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[19-1]如[19]所述的制造方法，其中，该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林是单磷酸咪唑立宾和/或单磷酸利巴韦林。

[19-2]如[19]～[19-1]任一项所述的制造方法，其中，该磷酸供体是ATP。

[19-3]如[14]～[19-2]任一项所述的制造方法，其中，该酶利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为约34kDa。

[20]一种酶制造方法，其是以下的《1》～《3》中任意一种酶的制造方法，所述方法包括根据编码该酶的碱基序列形成该酶的工序和获得该酶的工序；

《1》能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号9的氨基酸序列构成；

《2》能够对肌苷5’一磷酸进行氧化的酶，其由序列表序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或者添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成，且该氨基酸序列含有序列表序列编号11的氨基酸序列和序列表序列编号12的氨基酸序列；

《3》具有下述的<i>～<v>的理化性质的酶，

<i>作用

作用于NAD(P)类和肌苷5’一磷酸，催化生成NAD(P)H类和黄苷5’一磷酸的反应；

<ii>最适pH

pH 8～9；

<iii>pH稳定性

在37℃、3小时的条件下在pH 6～11的范围保持70％以上的活性；

<iv>热稳定性

在含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7的水溶液中，于60℃进行30分钟的热处理时，保持85％以上的活性；

<v>抑制作用

至少磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制其作用。

[20-1]如[20]所述的制造方法，其中，《3》中限定的酶是还具有下述的<vi>的理化性质的酶：

<vi>分子量

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为52～54kDa。

[20-2]如[20]～[20-1]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用含有编码该酶的碱基序列的细胞的步骤。

[20-3]如[20]～[20-2]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用导入有编码该酶的碱基序列的转化体的步骤。

[20-4]如[20]～[20-3]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用具有编码该酶的碱基序列的微生物的步骤。

[20-5]如[20]～[20-4]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用属于海洋芽孢杆菌属的微生物的步骤。

[20-6]如[20]～[20-5]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用Oceanobacillus iheyensis株的步骤。

[20-7]如[20]～[20-6]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用Oceanobacillus iheyensis DSM14731株的步骤。

[20-8]如[20]～[20-7]任一项所述的制造方法，其中，获得根据编码该酶的碱基序列形成该酶的工序中所形成的该酶时，精制后获得该酶。

[20-9]如[20]～[20-8]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用含有编码该酶的碱基序列的细胞的步骤。

[20-10]如[20]～[20-9]任一项所述的制造方法，其中，形成该酶的工序包括使用导入有编码该酶的碱基序列的转化体的步骤。

[21]如[20]～[20-10]任一项所述的制造方法，其中，编码该酶的碱基序列是序列表序列编号10表示的碱基序列。

[22]磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的测定方法，该方法包括下述『1』和『2』各工序：

『1』抑制第二反应的工序，其中，在能够催化下述<A>～<C>中任一个第二反应的第二酶的存在下，使试样中可能含有的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，

<A>受试样中可能含有的磷酸咪唑立宾抑制的反应、

<B>受试样中可能含有的磷酸利巴韦林抑制的反应、

<C>受试样中可能含有的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应；

『2』检测第二反应受抑制程度的工序。

[22-1]如上述[22]所述的测定方法，其中，第二酶具有上述[1-12]～[1-22]中记载的至少任意一项特征。

[22-2]如上述[22]～[22-1]所述的测定方法，其中，『1』工序具有上述[1-29]～[1-30]任一项中记载的至少任意一个特征。

[22-3]如上述[22]～[22-2]所述的测定方法，其中，该磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林是单磷酸咪唑立宾和单磷酸利巴韦林。

[22-4]如上述[22]～[22-3]所述的测定方法，其中，『2』工序中抑制程度的检测具有上述[1-32]～[1-33]任一项中记载的至少任意一项特征。

[22-5]如[22]～[22-4]任一项所述的测定方法，其中，『2』工序中的抑制程度的检测是如下的工序：对已知量的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林所引起的变化量和测定对象所引起的变化量进行检测并比较，从而对试样中可能含有的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林进行定量。

根据本发明，至少能够提供测定咪唑立宾和/或利巴韦林的简单方法。

附图说明

图1(A)是显示培养转化有pTip QC1/BthNK的红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)所得到的粗酶液的SDS-PAGE的图。图1(B)是显示培养转化有pTip QC2/BthNK的红串红球菌所得到的粗酶液的SDS-PAGE的图。

图2是显示培养转化有pET21a(+)/BthNK的大肠杆菌BL21(DE3)得到的粗酶液的SDS-PAGE的图。

图3(A)是用HPLC分离标准品磷酸咪唑立宾得到的色谱图。图3(B)是用HPLC分离实施例14的反应前的反应液得到的色谱图。图3(C)是用HPLC分离实施例14的反应后的反应液得到的色谱图。

图4是说明BthNK的最适pH的图。

图5是说明BthNK的pH稳定性的图。

图6是说明BthNK的热稳定性的图。

图7是显示BthNK的SDS-PAGE的图。

图8是显示BthNK的作用温度范围的图。

图9是显示BthNK的作用温度范围的阿累尼乌斯图。

图10(A)是用HPLC分离标准品ATP、ADP、AMP以及腺苷混合物得到的色谱图。图10(B)是实施实施例23所述的腺苷的磷酸化方法前的色谱图。图10(C)是实施实施例23所述的腺苷的磷酸化方法后的色谱图。

图11是显示利用使用了BthNK的组合物测定腺苷、肌苷以及鸟苷混合物的校准曲线的图。

图12是显示利用使用了BthNK的组合物测定腺苷的校准曲线的图。

图13是显示利用使用了BthNK的组合物测定肌苷的校准曲线的图。

图14是显示利用使用了BthNK的组合物测定鸟苷的校准曲线的图。

图15是显示利用使用了BthNK的组合物测定腺苷的校准曲线的图。

图16是显示利用使用了BthNK的组合物测定肌苷的校准曲线的图。

图17是显示利用使用了BthNK的组合物测定鸟苷的校准曲线的图。

图18是说明BsuIMPDH(A)和ObIMPDH(B)的最适pH的图。

图19是说明BsuIMPDH(A)和ObIMPDH(B)的pH稳定性的图。

图20是说明BsuIMPDH(A)和ObIMPDH(B)的热稳定性的图。

图21是显示BsuIMPDH(B)和ObIMPDH(A)的SDS-PAGE的图。

图22是说明KCl(○)和氯化铵(●)对BsuIMPDH(B)和ObIMPDH(A)的活性的影响的图。

图23是显示利用使用了实施例2制备的第一酶和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定咪唑立宾的校准曲线的图。

图24是显示利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定利巴韦林的校准曲线的图。

图25是显示利用使用了实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定咪唑立宾的校准曲线的图。

图26是显示利用使用了实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定以蒸馏水稀释的咪唑立宾的校准曲线(○)和测定以血清稀释的咪唑立宾的校准曲线(●)的图。

图27是显示利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH(○)或实施例34制备的ObIMPDH(●)的组合物测定咪唑立宾的校准曲线的图。

图28是利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定2μg/ml的咪唑立宾时干涉物质的影响的图。关于干涉物质，(A)中是胆红素F、(B)中是胆红素C、(C)中是乳糜、(D)中是血红蛋白。

图29是显示利用使用了实施例12制备的BthNK(●)或实施例13制备的BthNK(○)和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定咪唑立宾的校准曲线的图。

图30是显示利用使用了实施例13制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定咪唑立宾的校准曲线的图。关于测定范围，(A)中是0～7.5μg/ml、(B)中是0～0.5μg/ml。

图31是显示利用使用了实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定以血清稀释的咪唑立宾的校准曲线(●)和测定以血细胞破坏液稀释的咪唑立宾的校准曲线(○)的图。

图32是利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物的本发明的咪唑立宾测定方法(X轴)与实施例1所述的利用HPLC的咪唑立宾测定(Y轴)的关系图。

图33是显示利用使用了实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定磷酸咪唑立宾的校准曲线的图。

图34是利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物的本发明的咪唑立宾测定方法(Y轴)与利用Journalof chromatography、432卷、1988年、340-345页记载的使用HPLC的方法的咪唑立宾测定(X轴)的关系图。

具体实施方式

本发明涉及包括下述(1)工序的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法。(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化。

本发明的咪唑立宾或利巴韦林包括公知的咪唑立宾或利巴韦林(CAS编号50924-49-7或36791-04-5)，并不受来源、剂型、结晶型、添加物、商品名等的限定。

本发明的磷酸咪唑立宾或磷酸利巴韦林是结合有磷酸基的咪唑立宾或利巴韦林。磷酸基的数量可以是1、2或3，优选磷酸基的数量为1，即优选单磷酸咪唑立宾或单磷酸利巴韦林。对于可被磷酸化的部位没有特别限制，可以是其糖部分即核糖部分的任意羟基，可以举出1’位、2’位或5’位，有时还可以形成环，以单磷酸咪唑立宾或单磷酸利巴韦林的情况为例，优选结合在5’位。即，该单磷酸咪唑立宾或单磷酸利巴韦林优选咪唑立宾5’一磷酸或利巴韦林5’一磷酸。

本发明的能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶包括具有上述理化性质之中<1>作用的性质的酶。本说明书中，有时将能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化(包括催化第一反应)的酶记作第一酶。本发明的测定方法的工序(1)中可以存在该第一酶，作为该第一酶，从其理化性质方面出发，只要是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶即可，并不受酶名称、EC编号或制造方法等的限制。作为该第一酶，优选具有上述<1>～<4>的理化性质或本申请说明书所记载的该第一酶的性质中的任意性质的酶。即，优选具有上述<1>～<4>的理化性质之中的<1>作用，对于有无其他性质没有特别的限制，还优选具有上述<1>～<4>的理化性质或本申请说明书所记载的该第一酶的性质之中任意的1个或2个以上性质。对于本发明的第一酶，还可以采用本申请说明书所记载的该第一酶的性质的其他理化性质、物理性能等。

本发明的第一酶只要是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，则没有特别限制，选择至少对要测定的对象物进行磷酸化的酶即可。例如，可以举出能够对咪唑立宾和利巴韦林进行磷酸化的酶或能对咪唑立宾或利巴韦林中的任一方进行磷酸化的酶。即本发明的第一酶包括：能够对咪唑立宾和利巴韦林进行同等程度的磷酸化的酶；能够对咪唑立宾和利巴韦林进行磷酸化，但能够对咪唑立宾或利巴韦林中某一方更有效地进行磷酸化的酶；能够仅选择性地对咪唑立宾或利巴韦林中的某一方进行磷酸化的酶。

本发明的第一酶只要是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，则对其来源没有限制，例如可以来自天然生物，但从容易培养、容易获得酶的方面考虑，优选来源于微生物的酶。作为优选的来源于微生物的本发明的第一酶，可以举出例如来源于伯克霍尔德氏菌属或其近缘的黄单胞菌(Xanthomonas)属等的酶，优选来源于泰国伯克霍尔德氏菌的酶，最优选来源于泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株的酶。该菌株可以由后述的菌种库购买，也可以使用由其他菌种库购买的该菌株的同等菌株、用Epidemiol.Infect.，118卷137-148页、1995年所记载的方法分离出的同等菌株，确认其能够生成具有本发明的酶的各性质的酶后，将其用于本发明的测定方法。

另外，作为本发明的第一酶，还可以使用包括腺苷激酶、磷酸果糖激酶-B的核苷激酶或磷酸酶等。作为来源于微生物的本发明的第一酶，可以举出被认为是来源于大肠杆菌的鸟苷肌苷激酶、来源于詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的磷酸果糖激酶-B、来源于闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的磷酸果糖激酶-B的蛋白质。作为来源于其他微生物的本发明的第一酶，可以举出来源于面包酵母、分枝杆菌的能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的腺苷激酶。另外，虽然来源于哺乳动物的酶难以获得，且效率也不一定高，但这样的酶也可以使用，例如可以举出来源于人的腺苷激酶或来源于小鼠、大鼠、兔子等的公知的腺苷激酶。

本发明的第一酶只要是能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，对其氨基酸序列没有限定，例如可以是序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列。该氨基酸序列优选为含有序列表序列编号5的氨基酸序列和序列表序列编号6的氨基酸序列的序列(其中，序列表序列编号5和6中的Xaa表示任意的氨基酸)，最优选是序列表序列编号1的氨基酸序列。作为序列表序列编号1的氨基酸序列中的氨基酸的缺失、取代或添加的例子，可以举出在第一酶的N末端侧和/或C末端侧添加了硫氧还蛋白酶等功能性酶或由其他的氨基酸序列构成的部分的例子，也优选制成融合蛋白质，可以举出与能够利用该添加的部分进行精制或确认等的被称作标记(tag)的部分融合的情况，有时，可以将该标记部分去除，有时也可以残留该部分的全部或一部分。例如，可以添加用于将第一酶向菌体外、细胞周质传输的约20个信号肽、或用于进行有效精制的5～10个His，添加这些时，可以连成一列。另外，还可以将几个蛋白酶识别氨基酸序列配置在这些氨基酸序列之间等处。可以与上述的添加的例子同样地进行缺失或取代，例如，存在由与本发明的第一酶的本质功能无关的几个氨基酸构成的结构域的情况下、存在由序列表序列编号1的氨基酸序列中的两个以上氨基酸构成的缺口的情况下，也可以组合这些氨基酸的缺失。另外，还可适当组合缺失、取代或添加。作为这样的氨基酸序列，更优选含有序列RREFGGCA(G、A或T)NI(A或G)(Y或F)(A、S、T或N)L以及DPTG(C、A、V或I)GDA(F、Y、W或H)R(G、A或S)G的能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶。另外，序列表序列编号1的氨基酸序列中，该序列表序列编号1的氨基酸序列的N末端侧以及C末端侧可以含有即添加有氨基酸残基或多肽残基，作为该添加氨基酸残基，可以举出信号肽、TEE序列、S标记或者His标记等。序列表序列编号1的氨基酸缺失的情况下，例如，可以举出从N末端侧或C末端侧依次切除氨基酸的例子。序列表序列编号1的氨基酸序列中缺失了N末端的Met的酶或N末端受酰基、烷基等修饰等的经翻译后修饰的酶也是本发明的第一酶。另外，还可以利用公知的方法，利用琥珀酸酐、PEG等对第一酶进行化学修饰，以使第一酶的最适pH、稳定性等性质变化为易于被利用的状态。上述情况下，有时第一酶的分子量会发生变化，例如，利用后述的pTipQC1、pTip QC2在N末端添加His标记时，分子量大了约1000。对本发明的第一酶的氨基酸序列的二次结构、三次结构以及四次结构没有特别限制。

本发明的第一酶的碱基序列只要是编码本发明的第一酶的碱基序列，则没有特别的限制，例如在编码序列表序列编号1的氨基酸序列的碱基序列的情况中，可以是编码与序列表序列编号1实质上均等的氨基酸序列的碱基序列，例如可以是序列表序列编号1的氨基酸序列之中与上述第一反应的催化作用无关的一部分氨基酸发生了变异的氨基酸序列(如缺失、取代或添加了一个或两个以上氨基酸的原氨基酸序列的均等物)进行编码的碱基序列。特别优选含有编码序列表序列编号5和序列表序列编号6的各自的氨基酸序列的碱基序列。作为编码序列表序列编号1的氨基酸序列的碱基序列，可以举出序列表序列编号2的碱基序列、或结合大肠杆菌、放线菌等宿主的密码子使用频率而对序列表序列编号2的碱基序列进行了改变的碱基序列。

制备编码第一酶的碱基序列时，可以利用通常使用的公知的基因操作手段，例如可以举出部位特异性的变异法、用人工变异碱基取代目的基因的特定碱基片段的方法等各种方法。

本说明书中，有时将由序列表序列编号1的氨基酸序列构成的第一酶记作BthNK。

只要能够测定咪唑立宾和/或利巴韦林，对本发明的测定方法的工序(1)中使用的第一酶的量没有特别限制，可以根据试样所含有的咪唑立宾和/或利巴韦林的存在量、对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的目的程度、使用的装置、第一酶的纯度和/或经济状况等，确定一个能够得到理想结果的量。本发明的测定方法的工序(1)中还使用了磷酸供体、金属离子的情况下，对于其种类和量也是相同的。

例如，在条件是原料、试样所含有的咪唑立宾和/或利巴韦林的存在量为1mM以下且要将其全部磷酸化的情况下，本发明的测定方法的工序(1)中使用的第一酶的量的下限为0.01U/ml以上，优选为0.05U/ml以上，进一步优选为0.1U/ml以上，对上限没有特别限制，但通常为5U/ml以下，优选为2U/ml以下，进一步优选为1U/ml以下。

本发明的测定方法的工序(1)优选至少在磷酸供体的存在下进行，该磷酸供体也可以是CTP、GTP、TTP或者多磷酸等，但特别优选ATP。以ATP为例，上述条件下使用的磷酸供体的量的下限为0.1mM以上，优选为1mM以上，进一步优选为5mM以上，对上限没有特别限制，但优选为500mM以下，进一步优选为200mM以下，特别优选为50mM以下。

本发明的测定方法的工序(1)优选至少在金属离子的存在下进行，所述金属离子可以是镁离子、钴离子、镍离子或锰离子之中任意一种以上的金属离子，但特别优选镁离子。以镁离子为例，上述条件下使用的金属离子的量的下限为磷酸供体的浓度的0.1当量以上，优选为0.5当量以上，进一步优选为1当量以上，上限为10当量以下，优选为5当量以下，进一步优选为3当量以下。最优选的浓度是磷酸供体的2当量。

本发明的测定方法能够在各种条件下精密准确地实施测定，这一点可以得到本发明说明书实施例的支持。对本发明的试样没有特别的限制，可以举出含有全血、血浆、血清、血球、髓液、淋巴液、尿等的生物试样、研究用试样和这些的提取物等，这些试样优选是推测含有咪唑立宾和/或利巴韦林的试样，更优选是推测含有咪唑立宾或利巴韦林中某一方的试样。试样是生物试样的情况下，还优选选取咪唑立宾和/或利巴韦林的靶向脏器(例如白血球、肝细胞、病毒感染细胞等)制成试样，试样是白血球的情况下，还优选选取T细胞、B细胞、淋巴球等制成试样。采集推测含有咪唑立宾和/或利巴韦林的生物试样情况下，采集方法可以是公知的方法，采集全血的情况下，对是否使用分离剂、抗纤溶酶剂等没有限制，对是否使用EDTA、氟化钠、柠檬酸钠、肝素钠等抗凝固剂、糖酵解抑制剂也没有限制。作为其他试样，可以举出例如海水、天然水、果汁、饮料、废液等。

判断试样中是否可能含有咪唑立宾和/或利巴韦林时，包括在实施本发明的测定方法之前能够判断试样中是否可能含有咪唑立宾和/或利巴韦林的情况，例如可以通过用药经历、饮食经历等来判断是否可能含有，还可以通过HPLC、LC/MS/MS等上述现有技术来判断是否有可能。另外，还可以通过实施本发明的测定方法来判断试样中是否可能含有。同样，判断试样中是否可能含有磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林时也可以利用现有技术和后述的方法。通常可以通过用药经历来判断试样中是否可能含有咪唑立宾和/或利巴韦林。

本发明中，试样中可以同时存在咪唑立宾、利巴韦林、磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林，对同时存在咪唑立宾、利巴韦林、磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林的试样中的咪唑立宾或利巴韦林的存在量进行测定的情况下，可以适当将本发明的测定方法与现有技术或后述的测定磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的存在量的方法和/或上述的利用HPLC、LC/MS/MS测定咪唑立宾或利巴韦林的存在量的方法组合来实施，通过减去这些数值来计算出咪唑立宾、利巴韦林的存在量。通常优选对单独存在咪唑立宾或利巴韦林的试样进行测定。

本发明是还含有下述(2)工序的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法。(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述<a>～<c>中任意一个反应：

<a>不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制的反应；

<b>不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制的反应；

<c>不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应。

本说明书中，有时将能够催化该第二反应的酶记作第二酶。本发明的测定方法的工序(2)中可以存在该第二酶，从其理化性质方面出发，只要是能够催化上述第二反应的酶即可，并不受酶名称、EC编号和/或制造方法等的限制。该第二酶可以是能够催化不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应的酶。另外，该第二酶还可以是能够催化不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制的反应的酶。再者，该第二酶还可以是能够催化不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制的反应的酶。作为该第二酶，优选具有上述<i>～<vi>的理化性质或本申请说明书所记载的该第二酶的性质中的任意性质的酶，上述<i>～<vi>的理化性质之中优选具有<v>抑制作用，对于有无其他的性质没有特别的限制，还优选具有上述<i>～<vi>的理化性质、本申请说明书所记载的该第二酶的性质之中任意1个或2个以上的性质。更优选的是能够催化受到与第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林的存在量对应程度的抑制的反应的酶，最优选肌苷5’一磷酸脱氢酶。肌苷5’一磷酸脱氢酶有时表示为EC 1.1.1.205。采用肌苷5’一磷酸脱氢酶作为本发明的第二酶的情况下，对来源没有限制，例如可以来源于天然生物，另外，来源于微生物的情况下，例如可以是来源于人、大肠杆菌、白色念珠菌(Candida albicans)、胎儿三毛滴虫(Tritrichomonasfoetus)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、大鼠、兔子、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等的公知的肌苷5’一磷酸脱氢酶，也可以是这些的同功酶(S.F.Carr等、J.Biol.Chem.、268卷、27286页、1993年；H.J.Gilbert等、Biochem.J.、183卷、481页、1979年；G.A.Koehler等、J.Bacteriol.、179卷、2331页、1997年；F.G.Whitby等、36卷、10666页、1997年；X.Zhou等、J.Biol.Chem.、272卷、21977页、1997年等)。作为形成能够用作第二酶的肌苷5’一磷酸脱氢酶的天然微生物的典型例，可以举出属于芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌属的微生物，更优选枯草杆菌或Oceanobacillus iheyensis，最优选枯草杆菌ATCC23857株或Oceanobacillusiheyensis DSM14731株。另外，也可以使用由其他菌种库购买的该菌株的同等菌株或使用用上述方法从自然界分离的同等菌株，确认能够生成具有本发明的酶的各性质的酶后，将其用于本发明的测定方法。

本发明的第二酶只要是能够催化上述第二反应的酶，对其氨基酸序列没有限制，例如为序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列的情况下，可以是缺失、取代或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列，但该氨基酸序列优选含有序列表序列编号11的氨基酸序列和序列表序列编号12的氨基酸序列，更优选含有序列表序列编号23的序列，进一步优选含有序列表序列编号24的序列，特别优选为序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列。在本发明的序列表序列编号7或序列表序列编号9中的两个以上的氨基酸缺失、取代或添加、翻译后修饰、化学修饰方面、其最终分子量的变化方面、氨基酸序列的结构方面，均与上述第一酶的情况相同。本发明的第二酶为例如序列表序列编号7的氨基酸序列的情况下，作为取代了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列的例子，可以举出V432I(表示序列表序列编号7的432位的V被取代成I，下同)、K449I、K345N、D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E以及L367I和这些取代的任意组合。该任意的组合可以举出例如[V432I、K449I](表示序列表序列编号7的432位的V被取代成I且同时449位的K被取代成I，下同)、[D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E]。

本发明的第二酶的碱基序列只要是编码本发明的第二酶的碱基序列，则没有特别的限制，可以举出编码序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列的碱基序列、含有与上述第一酶的情况相同的变异、变更的碱基序列。

制备编码本发明的第二酶的碱基序列时，可以利用与上述第一酶的情况相同的基因操作手段。

本说明书中，有时将由序列表序列编号7的氨基酸序列构成的第二酶记作BsuIMPDH，将由序列表序列编号9的氨基酸序列构成的第二酶记作ObIMPDH。

只要能够测定咪唑立宾和/或利巴韦林，对本发明的测定方法的工序(2)中使用的第二酶的量没有特别限制，可以根据试样所含有的咪唑立宾和/或利巴韦林的存在量、对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的目的程度、使用的装置、第二酶的纯度和/或经济状况等，确定一个能够得到理想结果的量。本发明的测定方法的工序(2)中使用对应于所使用的第二酶的底物、辅酶的情况下，或者使用肌苷5’一磷酸、NAD(P)类的情况下，对于其种类和量也是相同的。

例如，在原料、试样所含有的咪唑立宾和/或利巴韦林的存在量为1mM以下且要将其全部磷酸化、使用肌苷5’一磷酸脱氢酶作为第二酶的情况下，本发明的测定方法的工序(2)中使用的第二酶的量的下限为0.01U/ml以上，优选为0.05U/ml以上，进一步优选为0.1U/ml以上，对上限没有特别限定，但通常为1U/ml以下，优选为0.5U/ml以下，进一步优选为0.3U/ml以下。

本发明的测定方法的工序(2)优选至少在肌苷5’一磷酸的存在下进行，该肌苷5’一磷酸并未限定盐的种类和有无结晶水。上述条件下使用的肌苷5’一磷酸的量的下限为1mM以上，优选为3mM以上，进一步优选为5mM以上，对上限没有特别限定，但优选为100mM以下，进一步优选为50mM以下，特别优选为30mM以下。

本发明的测定方法的工序(2)优选至少在NAD(P)类的存在下进行，NAD(P)类中可以举出NAD(P)、脱酰胺NAD(P)(NAAD(P))、硫代NAD(P)、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(磷酸)、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(磷酸)等，可以是其中任意一个以上，特别优选NAD。例如在NAD的情况下，上述条件下使用的NAD(P)类的量的下限为0.1mM以上，优选为0.5mM以上，进一步优选为1mM以上，对上限没有特别限定，但优选为50mM以下，进一步优选为10mM以下，特别优选为7mM以下。

本发明的测定方法是包括下述(3)工序的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法。(3)检测第二反应受抑制程度的工序。

本发明的检测方法的工序(3)可以是通过定性反应检测抑制程度的工序，优选抑制程度的检测是检测能够催化第二反应的第二酶的反应速度的工序，更优选抑制程度的检测是检测NAD(P)类的变化量的工序，最优选抑制程度的检测是检测NAD(P)类的变化量并定量的工序。

进行定量的测定方法如下。对可能含有咪唑立宾和/或利巴韦林的试样与含有已知浓度的咪唑立宾和/或利巴韦林的试样分别单独用工序(1)～(3)进行处理，在工序(3)检测各自的变化量。将通过工序(3)对可能含有咪唑立宾和/或利巴韦林的试样检测到的变化量和通过工序(3)对含有已知浓度的咪唑立宾和/或利巴韦林的试样检测到的变化量作以比较，由此对可能含有咪唑立宾和/或利巴韦林的试样中的咪唑立宾和/或利巴韦林的浓度进行定量。

检测NAD(P)类的变化量的方法中，用公知的方法检测该测定对象的变化量。一般可以举出使用装置通过光学方法检测伴随该测定对象的变化发生的该测定对象的吸收光谱、吸光强度的变化的方法，也可以是检测伴随NAD(P)类的氧化还原产生的吸收光谱、特定波长下的吸光强度的变化的方法。另外，还可检测NAD(P)H类的荧光变化。基于提高灵敏度或通过目视检测等目的，还可以使其中存在DI(P)(心肌黄酶，Diaphorase)或甲臜(formazan)色素。另外，为了进一步提高灵敏度等，还可以采用NAD(P)类循环反应。测定NAD(P)类的氧化还原所致的电位差时，使用电极。可以将使用的酶固定于碳糊等制成电极，用于咪唑立宾和/或利巴韦林的测定。

实施本发明的测定方法时，可以在液相、气相或固相等实施，或者在各自的临界面实施，优选在液相实施。液相包括水相、有机溶剂相等，以水相实施本发明的测定方法的情况下，水相可以举出例如水、水溶液、含有适当有机溶剂的水性介质，并优选使用适当的pH缓冲剂。使用pH缓冲剂的情况下，只要能保持目的pH且能测定试样中的咪唑立宾和利巴韦林，则对其种类没有特别的限制，可以举出Good’s pH缓冲液、Tris/HCl缓冲液、磷酸钾缓冲液、乙酸/NaOH缓冲液、柠檬酸/NaOH缓冲液。只要能够测定试样中的咪唑立宾和/或利巴韦林，对实施本发明的测定方法时的pH没有特别的限制，工序(1)中，pH的下限可以举出为pH 4以上，优选为pH 4.8以上，更优选为pH 5.2以上，上限可以举出为pH 8.5以下，优选为pH 8以下，更优选为pH 7.5以下。工序(2)和(3)中，下限可以举出为pH 5.5以上，优选为pH 6以上，更优选为pH 7以上，上限可以举出为pH 10.5以下，优选为pH 9.5以下，更优选为pH 8.5以下。只要能够保持目的pH且能够测定咪唑立宾和利巴韦林，对pH缓冲剂的浓度没有特别的限制，下限可以举出为3mM以上，优选为5mM以上，进一步优选为10mM以上，上限可以举出为500mM以下，优选为200mM以下，进一步优选为100mM以下。

作为本发明的测定方法的其他的优选液相，可以举出例如溶胶-凝胶。为了制成溶胶-凝胶，可以利用例如琼脂等多糖类。区分溶胶-凝胶和乳浊液的情况下，还可制成乳浊液实施测定。为了制成乳浊液，可以利用例如有机溶剂等，利用双亲媒性物质时，还可制成胶束来实施测定。任一种情况下，如果使用pH缓冲剂，其情况与上述相同。

本发明的测定方法中的(1)～(3)各工序可分别在不同的反应槽(相)中实施，但优选在同一反应槽(相)中实施。另外，(1)～(3)各工序可以间断实施，但优选连续实施。另外，(1)～(3)各工序可以按(1)、(2)、(3)的顺序进行；也可同时进行(1)和(2)，然后进行(3)；还可以先进行(1)，然后同时进行(2)和(3)；还可以同时进行(1)、(2)、(3)；等，根据目的、试样、使用的装置等确定一个能够得到理想结果的顺序。另外，不实施本发明的测定方法的工序(1)就实施工序(2)和工序(3)的方法时，能够测定磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林的存在量。

只要能够测定试样中的咪唑立宾和/或利巴韦林，对本发明的工序(1)～(3)的反应时间没有特别的限制，各自的下限为15秒以上，优选为1分钟以上，进一步优选为3分钟以上。没有对上限进行特别设置，但优选为30分钟以下，进一步优选为15分钟以下，特别优选为10分钟以下。(1)～(3)各工序的反应时间可以是不均等的。

对实施本发明的测定方法的温度没有特别的限制，只要是能够测定试样中的咪唑立宾和/或利巴韦林的温度即可，优选在所使用的酶的作用温度的范围内，并且，下限为15℃以上，优选为20℃以上，进一步优选为25℃以上，上限为70℃以下，优选为50℃以下，进一步优选为40℃以下。(1)～(3)各工序的温度可以是不均等的。

作为本发明的与包括上述(1)～(3)的工序的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法不同的其他测定方法，可以是包括下述(a)～(c)各工序的测定方法。(a)包括反应I的工序，在所述反应I中，在上述第一酶和ATP的存在下使试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林和ADP；(b)在催化与上述反应I不同的反应II或两个以上的反应II的酶B或两个以上的酶B的存在下，使反应II产生的测定对象对应上述反应I产生的ADP的量发生变化的工序；(c)检测该测定对象的变化量，测定试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林的量的工序。

对本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法中的咪唑立宾和/或利巴韦林的来源没有限制，但优选上述的试样。实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的相、以液相实施时的pH缓冲剂的条件、时间和温度的条件、反应槽(相)的条件、实施工序的顺序等与上述相同。

在本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(a)中使用的第一酶的量、使用磷酸供体和金属离子的情况下的所用种类和量等条件等与上述工序(1)中相同。即，本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(a)可以以与本发明的测定方法中的工序(1)相同的条件实施。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b)是在催化与上述反应I不同的反应II或两个以上的反应II的酶B或两个以上的酶B的存在下，使反应II产生的测定对象对应上述反应I产生的ADP的量发生变化的工序。

作为本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b)的例子，可以举出如下工序：(b)工序包括(b-1)反应和(b-2)反应，(b-1)反应中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下，使葡萄糖和ADP变成葡萄糖-6-磷酸和AMP；(b-2)反应中，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下，使NAD(P)类和上述反应生成的葡萄糖-6-磷酸变成NAD(P)H类和葡糖酸内酯-6-磷酸；NAD(P)H类对应上述反应I生成的ADP的量增加(本说明书有时记作工序(b(α)))，(c)工序中检测NAD(P)H类的增加量。

只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b(α))中的ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的来源或起源没有特别限制。只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对工序(b(α))中的ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度没有特别的限制，例如，下限为0.1U/ml以上，优选为1U/ml以上，进一步优选为2U/ml以上，没有特别设定上限，优选为20U/ml以下，进一步优选为10U/ml以下。工序(b(α))中可以存在ADP依赖性己糖激酶对于反应所要求的底物、金属离子。只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对底物、金属离子的种类和浓度没有特别的限制，但该种类和浓度会因所使用的ADP依赖性己糖激酶的来源或起源的不同而有所不同。作为葡萄糖作底物的例子，例如浓度为0.01mM以上，优选为0.1mM以上，进一步优选为1mM以上，没有特别设定上限，优选为500mM以下，进一步优选为100mM以下。作为氯化镁作金属离子的例子，例如浓度为0.1mM以上，优选为1mM以上，进一步优选为5mM以上，没有特别设定上限，优选为100mM以下，进一步优选为10mM以下。工序(b(α))中可以存在NAD(P)类，其是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的辅酶。只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对NAD(P)类的种类、浓度没有特别的限制，但该种类和浓度会因所使用的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的来源或起源的不同而有所不同。作为NAD(P)作辅酶的例子，例如浓度为0.1mM以上，优选为1mM以上，进一步优选为3mM以上，没有特别设定上限，优选为50mM以下，进一步优选为10mM以下。NAD(P)类的种类与上述相同。

作为本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b)的其他例子，可以举出如下工序：(b)工序中包括(b-1)反应和(b-2)反应，(b-1)反应中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和PEP变成丙酮酸和ATP；(b-2)反应中，在乳酸脱氢酶的存在下，使NAD(P)H类和上述反应生成的丙酮酸变成NAD(P)类和乳酸；NAD(P)H类对应上述第一反应生成的ADP的量减少(本说明书有时记作工序(b(β)))，(c)工序中检测NAD(P)H类的减少量。

只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b(β))中的丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的来源或起源没有特别限制。只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对工序(b(β))中的丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的浓度没有特别的限制，例如，下限为1U/ml以上，优选为5U/ml以上，进一步优选为10U/ml以上，没有特别设定上限，优选为100U/ml以下，进一步优选为50U/ml以下。工序(b(β))中可以存在丙酮酸激酶对于反应所要求的底物、金属离子。只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对底物、金属离子的种类和浓度没有特别的限制，但该种类和浓度会因所使用的丙酮酸激酶的来源或起源的不同而有所不同。作为PEP作底物的例子，例如浓度为0.1mM以上，优选为0.5mM以上，进一步优选为1mM以上，没有特别设定上限，优选为50mM以下，进一步优选为10mM以下。作为氯化镁作金属离子的例子，例如浓度为0.1mM以上，优选为0.5mM以上，进一步优选为1mM以上，没有特别设定上限，优选为50mM以下，进一步优选为10mM以下。工序(b(β))中可以存在NAD(P)H类，其是乳酸脱氢酶的辅酶。只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对NAD(P)H类的种类、浓度没有特别的限制，但该种类和浓度会因所使用的乳酸脱氢酶的来源或起源的不同而有所不同，也因所使用的比色杯的光程长、比色计的性能而不同。以光程长1cm的比色杯为例，浓度为0.01mM以上，优选为0.03mM以上，进一步优选为0.07mM以上，上限为0.2mM以下，优选为0.17mM以下，进一步优选为0.15mM以下。

作为本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b)的另一个其他例子，可以举出如下工序：(b)工序中包括(b-1)反应和(b-2)反应，(b-1)反应中，在丙酮酸激酶的存在下，使ADP和PEP变成丙酮酸和ATP；(b-2)反应中，在丙酮酸氧化酶的存在下，使氧、磷酸和上述反应生成的丙酮酸变成过氧化氢和乙酰磷酸；过氧化氢对应上述第一反应生成的ADP的量增加(本说明书有时称作工序(b(γ)))，(c)工序中用过氧化氢指示剂等检测过氧化氢的量。

只要能够实施本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法，则对本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(b(γ))中的丙酮酸激酶和丙酮酸氧化酶的来源或起源没有特别限制。工序(b(γ))中的丙酮酸激酶和丙酮酸氧化酶的浓度与上述的丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的情况相同。工序(b(γ))中丙酮酸激酶对于反应所要求的底物、金属离子的种类和浓度与上述相同。工序(b(γ))中的过氧化氢指示剂使用过氧化酶的同时还可以使用4-氨基安替比林、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙等色偶、氯苯酚等苯酚类或TOOS、N，N-二甲基苯胺等苯胺类及它们的衍生物等色原体、或是隐色型的色原体等。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(c)中的对该测定对象的变化量进行检测的方法中，检测NAD(P)类的变化量的方法与上述相同。使用过氧化氢指示剂的情况下，可以检测伴随该过氧化氢指示剂的变化而发生的吸收光谱、特定波长的吸光强度的变化。另外，检测消耗的氧的情况下，利用氧电极。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法的工序(c)中的检测方法可以与上述本发明的测定方法的工序(3)相同。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的磷酸化方法是使用本发明的第一酶使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的方法。

另外，本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的磷酸化方法例如优选是如下的方法：使用本发明的第一酶，至少在磷酸供体存在下使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林；优选使至少镁离子、钴离子、镍离子或锰离子之中任意一种以上的金属离子、咪唑立宾和/或利巴韦林、磷酸供体以及本发明的第一酶相接触。对于接触的顺序没有特别限制。

本发明的磷酸化方法中的咪唑立宾和/或利巴韦林的来源与上述相同。实施本发明的磷酸化方法的相、以液相实施的情况下的pH缓冲剂的条件等、时间、温度的条件等与上述相同。另外，该方法中使用的第一酶的量、使用磷酸供体、金属离子的情况下这些物质的种类和量等条件等与上述相同。即，本发明的磷酸化方法可以以与本发明的测定方法中的工序(1)相同的条件来实施。

本发明的使咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的制造方法中，通过上述本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的磷酸化方法，由咪唑立宾和/或利巴韦林制造磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林。所制造的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林可以保持与原料、其他制造物等混合存在的状态，但优选根据目的、用途等情况使其实质性地不包含杂质，通常制成例如50％以上、70％以上、95％以上的各种纯度。可以用公知的精制方法对磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林进行精制，例如可以举出使用溶剂等的提取、使用硅胶、氧化铝和/或硅藻土等的层析法和/或利用重结晶等的精制方法。

本发明的第一酶和/或第二酶可以制成咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物。本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物可以用于上述的本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法和本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的其他测定方法。另外，还可用于将咪唑立宾和/或利巴韦林制成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的方法、将咪唑立宾和/或利巴韦林制成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的制造方法。

本发明的组合物可以举出含有下述的(A1)～(A4-3)成分的组合物。该组合物可以是咪唑立宾测定用组合物、利巴韦林测定用组合物、咪唑立宾和利巴韦林测定用组合物中的任意一种。

(A1)第一酶，其能够催化对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一反应；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其能够催化第二反应，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述<a>～<c>中任意一个反应：

<a>不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾抑制的反应，

<b>不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的磷酸利巴韦林抑制的反应，

<c>不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制的反应；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

本发明的组合物中包含上述(A1)～(A3)和下述的含有(A4-1)～(A4-3)成分的组合物。该组合物可以是磷酸咪唑立宾测定用组合物、磷酸利巴韦林测定用组合物、磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林测定用组合物。

(A4-1)第二酶，催化与上述第一反应不同的反应，受磷酸利巴韦林的抑制；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类。

另外，本发明的组合物优选下述3种成分之中任意一种以上的成分在即将测定前加入，以制成本发明的组合物。即，制成具有测定时所需的全部成分的本发明的组合物时，优选在测定以前至少下述的3种成分或任意的一种或2种成分是与组合物分开的。将下述的3种成分之中任意一种、两种或三种成分在即将测定前合并到组合物中的情况下，合并的顺序是任意的，可以一个一个合并，也可以同时合并2个或3个。

(A4-1)第二酶、

(A4-2)肌苷5’一磷酸、以及

(A4-3)NAD(P)类。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物是含有下述的(A)和(B)的组合物。

(A)第1试剂，其至少含有下述(A1)～(A4)：

(A1)有效量的本发明的第一酶、

(A2)磷酸供体、

(A3)金属离子、

(A4)有效量的本发明的第二酶、肌苷5’一磷酸和NAD(P)类中的任意一个以上的成分；

(B)第2试剂，其至少含有有效量的受磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林抑制的第二酶、肌苷5’一磷酸以及NAD(P)类之中第1试剂中不含的成分。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物优选含有下述的(A)和(B)。

(A)第1试剂，其至少含有以下的(A1)～(A4)：

(A1)有效量的本发明的第一酶、

(A2)磷酸供体、

(A3)金属离子、

(A4)本发明的第二酶和NAD(P)类；

(B)第2试剂，其至少含有有效量的肌苷5’一磷酸。

上述本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物(A)和(B)也优选含有适当的pH缓冲剂。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物可以还含有下述的(C)。(C)标准试剂，其至少含有已知量的咪唑立宾和/或利巴韦林。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物所含有的、本发明的第一酶、本发明的第二酶、磷酸供体、金属离子、肌苷5’一磷酸以及NAD(P)类的种类和有效量即该组合物成为咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物所需的有效添加量和pH缓冲剂的条件等与上述的本发明的测定方法相同。

本发明的标准试剂可以是至少含有已知量的咪唑立宾和/或利巴韦林的试剂，优选为含有pH缓冲剂；叠氮化钠、抗生素等防腐剂；糖等稳定剂的试剂。含有pH缓冲剂的情况下，其种类、浓度等条件等与本发明的测定方法的工序(1)的情况相同。含有叠氮化钠、抗生素等的情况下，只要具有防腐效果，则对其种类、浓度没有限定，例如以叠氮化钠为例，下限为0.005％以上，优选为0.01％以上，进一步优选为0.03％以上；上限为1％以下，优选为0.5％以下，进一步优选为0.1％以下。例如以抗生物质为例，下限为5μg/ml以上，优选为10μg/ml以上，进一步优选为30μg/ml以上；上限为100μg/ml以下，优选为75μg/ml以下，进一步优选为60μg/ml以下。含有稳定剂的情况下，其种类、浓度等条件等与上述第一酶的稳定剂相同。校准方法可以选择单点检测法、多点检测法(折线或样条(スプライン))或多点检测的线性回归等。

对于该已知量没有特别限制，只要选择能够准确测定试样中的咪唑立宾和/或利巴韦林的量即可。另外，使用两个以上的标准试剂的情况下，标准试剂的已知量也相同。例如以咪唑立宾为例时，下限为0.00μg/ml以上，优选为0.005μg/ml以上，进一步优选为0.01μg/ml以上；上限为20μg/ml以下，优选为10μg/ml以下，进一步优选为8μg/ml以下。

本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物和标准试剂可以以液态品、液态品的冷冻物、液态品的冷冻干燥品或液态品的干燥品(通过加热干燥和/或风干和/或减压干燥等方式得到)的形式提供。优选液态品的冷冻物，更优选液态品的冷冻干燥品，最优选液态品。作为其他方式，有时也优选液态品的冷冻物。作为其他的其他方式，有时优选液态品的冷冻干燥品。本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林测定用组合物可以是单试剂的组合物，但通常优选上述那样分成二试剂以上。另外，基于提高试剂的品质等目的，可以在其中混合NaCl、KCl等盐；TX-100、Tween20等表面活性剂；和/或叠氮化钠、抗生素等防腐剂。另外，例如用于POC的毛细管柱或者作为酶传感器使用的情况下，优选各成分的浓度大于平时的浓度，例如优选进行固定化、或吸印在纸张或膜、或制成凝胶-溶胶状组合物使用。混合盐的情况下，对盐的种类、浓度没有限定，通常的范围为5～200mM，混合表面活性剂的情况下，对表面活性剂的种类、浓度没有限定，通常为0.001％～2％，混合防腐剂的情况下，与上述标准试剂的情况相同。

下面对本发明的第一酶的制造方法进行说明。

对于本发明的第一酶来说，可通过公知的方法由自然界寻找(筛选)形成该第一酶的天然生物，并从该生物的细胞获得第一酶。该生物只要是形成能催化第一反应的酶的生物，则没有限制，例如可以举出包括真正细菌、真核生物或者古细菌的微生物。以微生物作为筛选对象的情况下，利用公知的方法，从自然界分离微生物即可，可以从包括高温、低温、高压、酸、碱性环境等极限环境的土壤、水中；含有降落菌、冰核等的空中；以及生物的体内等得到。特别是从高温环境分离的微生物，可以期待从这样的微生物得到稳定性高的第一酶。另外，微生物还可以从ATCC、DSM等菌种库购买。分离的微生物经极限稀释法、形成单菌落等公知的方法进行纯分离，用基础培养基、LB培养基、肉汤培养基等进行纯培养，确认该培养物中有无能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶活性，由此可筛选形成第一酶的生物。另外，还可由使用咪唑立宾和/或利巴韦林的富集培养得到微生物、向培养基添加咪唑立宾和/或利巴韦林来诱导产生第一酶等，这些是可以提高筛选效率的方法。根据非专利文献1公开的方法等，本领域技术人员能够容易地确认有无第一酶。

分离的菌株的鉴定可以按照实验书(铃木健一朗等、微生物の分類·同定実験法—分子遺伝学·分子生物学的手法を中心に(微生物的分类·鉴定实验法—以分子遗传学·分子生物学的方法为主)，Springer-Verlag东京)等进行，另外，还可以使用市售的各种菌株鉴定试剂盒(日本BIOMERIEUX社等)，还可委托财团法人日本食品分析中心(东京都涉谷区元代代木町52番1号)等鉴定。

如此得到的形成第一酶的天然微生物还可以进一步用NTG等药剂、紫外线和/或放射线进行处理而制成变异株。该变异株有的能提高第一酶的生产率，有的能形成第一酶的变异体，还可能形成具有优异的稳定性、生产率、反应性等性质的变异体。

另外，可以使用上述的第一酶或形成该第一酶的天然微生物，通过蛋白质序列、DNA序列或公知基因工学方法获得编码所得到的该第一酶的碱基序列或其信息。

本发明的第一酶也可通过公知的生物信息学方法获得。序列表序列编号1和序列表序列编号2是作为本发明的测定方法的工序(1)中优选的实例的第一酶的氨基酸序列和碱基序列，所以可以以查询(query)的方式在NCBI、EMBL、GenomeNet等数据库用BLAST搜索等对这些序列进行同源检索，从而获得具有与序列表序列编号1或序列表序列编号2一致或类似的氨基酸序列或碱基序列的蛋白质或基因即有产生第一酶的可能性的生物的信息或基因信息。

该酶的制造方法包括获得基于利用上述的方法得到的形成第一酶的天然微生物、第一酶的碱基序列或碱基序列的信息形成的该酶的工序，利用该酶的制造方法可以获得该第一酶。作为形成该第一酶的工序，可以举出例如含有编码该酶的碱基序列的无细胞酶合成系，优选举出使用含有编码该酶的碱基序列的细胞的工序、使用形成该酶的天然微生物等具有编码该酶的碱基序列的微生物的工序、使用导入有编码该酶的碱基序列的转化体的工序等。

采用含有编码第一酶的碱基序列的无细胞酶合成系的情况下，将编码上述第一酶的碱基序列用于来源于小麦胚芽、来源于大肠杆菌、来源于兔子网状红血球或来源于昆虫细胞等公知的无细胞酶合成系即可。

另外，采用使用含有编码该酶的碱基序列的细胞的工序的情况下，例如，可以将上述编码第一酶的碱基序列插入载体，导入宿主微生物，制成转化体，使用该转化体形成该酶。

导入有编码第一酶的碱基序列的转化体包括将插入了该碱基序列的载体即重组噬菌体或重组质粒导入宿主而成的细胞或者微生物。编码第一酶的碱基序列可以合成部分或全部来使用，优选使用公知的方法从基因供体获得编码第一酶的碱基序列。作为基因供体，只要是能形成第一酶的细胞，则没有限定，优选以上述筛选方法筛选出的天然的微生物、包括用生物信息学方法获得信息的生物在内的形成第一酶的生物。

作为插入编码第一酶的碱基序列的载体，优选在宿主微生物体内能够自律增殖的用于基因重组而构建的噬菌体或质粒，作为噬菌体载体，例如以属于大肠杆菌的微生物为宿主的情况下，可以使用λgt·λC、λgt·λB等。另外，作为质粒载体，例如以大肠杆菌为宿主的情况下，可以使用Novagen社的pET载体或pBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pINI、BluescriptKS+；以枯草杆菌为宿主的情况下，可以使用pWH1520、pUB110、pKH300PLK；以放线菌为宿主的情况下，可以使用pIJ680、pIJ702；以酵母特别是酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)为宿主的情况下，可以使用YRp7、pYC1、YEp13等。本发明中，优选以大肠杆菌为宿主的质粒载体。启动子只要是能够在宿主中表达的，则没有特别限制。

利用限制性内切酶切断上述载体，使其生成的末端与通过用于切断编码第一酶的碱基序列的限制性内切酶所生成的碱基序列末端相同，制成载体片段，根据常规方法，将编码第一酶的碱基序列的片段和载体片段用DNA连接酶连接，将编码第一酶的碱基序列插入目的载体，制成重组噬菌体或重组质粒。

作为导入重组质粒的宿主，只要是重组质粒可稳定且自律增殖的细胞或微生物即可，例如宿主微生物是属于大肠杆菌的微生物时，可以使用包括大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH1、大肠杆菌JM109、大肠杆菌JM101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600等的大肠杆菌B株、K株、C株或它们的溶原菌。另外，宿主微生物是属于芽孢杆菌属的微生物时，可以使用枯草杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等；宿主微生物是属于放线菌的微生物时，可以使用变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24等；宿主微生物是属于酿酒酵母菌的微生物时，可以使用酿酒酵母菌INVSC1等。本发明优选以大肠杆菌为宿主微生物。

作为可以使用导入有编码第一酶的碱基序列的转化体形成该酶的优选的其他例子，可以举出形成红球菌属细菌的重组酶的方法(日本特许第3944577号公报、日本特许第3793812号公报)。具体地说，给出了如下方法：在适合低温形成重组酶的pTip QC1、pTip QC2等质粒载体中插入编码第一酶的碱基序列，将该重组质粒导入溶菌酶敏感性微生物，形成转化体，从而使用该转化体。作为溶菌酶敏感性微生物，优选属于红球菌属的微生物(日本特许第3876310号公报)。

形成第一酶的天然微生物、导入有编码该酶的碱基序列的转化体等的培养条件可以考虑其营养生理性质来选择，通常进行液体培养，工业上进行深层通气搅拌培养是有利的。作为培养基的营养源，可以广泛使用通常用于微生物培养的物质。培养温度可以在作为宿主的微生物发育、能形成第一酶的范围进行适当变更，宿主为大肠杆菌时，温度下限为10℃以上，优选为20℃以上，进一步优选为25℃以上；上限为45℃以下，优选为42℃以下，进一步优选为38℃以下。宿主为放线菌时，下限为4℃以上，优选为10℃以上，进一步优选为20℃以上；上限为50℃以下，优选为42℃以下，进一步优选为37℃以下。培养条件因条件而多少有些不同，估算第一酶达到最高形成量的时期，在适当的时期结束培养即可，宿主为大肠杆菌时，通常下限为10小时以上，优选为12小时以上，进一步优选为17小时以上；上限为60小时以下，优选为48小时以下，进一步优选为30小时以下。宿主为放线菌时，通常下限为17小时以上，优选为20小时以上，进一步优选为24小时以上；上限为80小时以下，优选为72小时以下，进一步优选为48小时以下。培养基的pH可以在细菌发育并形成第一酶的范围进行适当变更，宿主是大肠杆菌、放线菌的情况下优选下限为pH 5.8以上，更优选为pH 6.2以上，上限为pH 8.5以下，优选为pH 7.5以下。

第一酶可以通过包括获得如上形成的第一酶的工序的方法来制造，其可以直接是含有简单的杀菌或没杀菌的菌体的细胞等，但优选制成简单除去了培养杂质、细胞破碎物等的含有杂质的酶。另外，第一酶的粗酶优选根据目的、用途等制成实质上不含杂质的酶，通常可以举出制成例如50％以上、70％以上、95％以上的各种纯度。纯度可通过SDS-PAGE、HPLC等公知方法确认。

利用培养上述筛选出来的天然微生物、导入有编码该酶的碱基序列的转化体的微生物等进而获得第一酶的方法来制造第一酶的情况下，首先将该微生物等用营养培养基培养，使菌体内或培养液中形成该酶，在菌体内形成该酶的情况下，培养结束后，通过过滤或离心分离等手段从所得到的培养物中收集菌体。接下来将该菌体用机械方法或溶菌酶等酶方法破坏，并根据需要添加EDTA和/或适当的表面活性剂等，浓缩或不浓缩该酶的条件下，实施利用丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂的分级沉淀法；利用硫酸铵、食盐等的盐析法等，使第一酶沉淀从而回收。根据需要，对该沉淀物进行透析、等电点沉淀后，可以通过凝胶过滤、亲和层析法等吸附层析法、离子交换层析法、疏水层析法进行处理，得到第一酶。另外，还可适当组合这些方法。另外，在培养液中形成本发明的酶的情况下，通过过滤或离心分离等手段从培养物中除去菌体，对培养液进行与上述本发明的酶形成在菌体内时相同的处理即可。

对于如此得到的第一酶，加入或不加入各种盐类、糖类、酶、脂质、表面活性剂等作为稳定剂或赋形剂，通过超滤浓缩、冷冻干燥等方法可以得到液态或固态的第一酶，另外，适宜进行冷冻干燥的情况下，可以添加0.5～10％左右的蔗糖、甘露醇、食盐、白蛋白等作为稳定剂或赋形剂。

形成本发明的第一酶的天然微生物的典型例是泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株。本发明的测定方法的工序(1)中的第一酶的氨基酸序列的典型例是序列表序列编号1的氨基酸序列。编码该氨基酸序列的碱基序列的一个例子是序列表序列编号2的碱基序列。根据H.S.Stanley等、BMC Genomics、6卷、174页、2005年的发表内容，通过泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株的全基因组解析查明了该碱基序列，但迄今一直没有阐明该碱基序列编码的酶的性质，仅是简单推测其类似于核糖激酶。即，以往完全不知道序列表序列编号2的碱基编码的序列表序列编号1的氨基酸序列对针对咪唑立宾和/或利巴韦林的反应有催化作用。

下面对本发明的第二酶的制造方法进行说明。

本发明的第二酶与上述第一酶的情况相同，可以通过公知的方法，从自然界寻找形成该第二酶的天然生物，从该生物的细胞中获得本发明的第二酶。咪唑立宾和/或利巴韦林对该第二酶的抑制可以通过例如比较该第二酶在存在和不存在咪唑立宾和/或利巴韦林的情况下的反应速度之差来加以确认。磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林对第二酶的抑制可以通过比较第二酶的反应速度、例如该第二酶在存在和不存在磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的情况下的反应速度之差来加以确认。计算抑制常数进行比较的情况下，可以根据蛋白质·酶的基础实验法(参照修订第2版、堀尾武一、1994年、南光堂)所记载的方法等进行计算、确认。磷酸咪唑立宾或磷酸利巴韦林可以通过后述的将咪唑立宾和/或利巴韦林制成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的制造方法制造，也可以通过Shuto S.等、J.Chem.Soc.、Perkin Trans.1卷、3603页、2000年所记载的方法合成。

第二酶的碱基序列获得方法、生物信息学方法得到的碱基序列和产生该酶的生物的信息的获得方法、形成方法以及利用包括获得工序的方法的制造方法等与上述第一酶的情况相同。

本发明的第二酶的典型例是肌苷5’一磷酸脱氢酶。形成本发明的第二酶的天然微生物的典型例是枯草杆菌ATCC23857株或Oceanobacillusiheyensis DSM14731株。本发明的测定方法的工序(2)中的第二酶的氨基酸序列的典型例是序列表序列编号7或序列表序列编号9的氨基酸序列。编码该氨基酸序列的碱基序列的一个例子是序列表序列编号8或序列表序列编号10的碱基序列。根据Wu T.W.等、Can.J.Biochem.、51卷、1391页、1973年的发表内容，表明序列表序列编号8的碱基序列编码肌苷5’一磷酸脱氢酶，但是以往完全不知道该肌苷5’一磷酸脱氢酶不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制而受磷酸咪唑立宾和磷酸利巴韦林这两者抑制。另外，根据Takamami H.等、Nucleic.Acids.Res.、30卷、3927页、2002年的发表内容，通过Oceanobacillus iheyensis DSM14731株的全基因组解析查明了序列表序列编号10的碱基序列，但是迄今一直没有阐明该碱基序列编码的酶的性质，以往尚不知道序列表序列编号10的碱基编码的序列表序列编号9的氨基酸序列是肌苷5’一磷酸脱氢酶。另外，以往完全不知道该酶不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制而受磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林这两者抑制。

实施例

下面基于实施例等对本发明进行说明，但本发明的范围不应解释为仅限于下述实施例等。此外，记为“通过常规方法”的技术是可以按照例如Maniatis等的方法(Maniatis，T.等，分子克隆，冷泉港实验室，1982年、1989年)、上述的蛋白质·酶的基础实验法、市售的各种酶或试剂盒类中附带的操作方法实施的。另外，由于测定条件、使用机器的精度等，下面给出的测定值等有可能有变化。

此外，没有特别指出的话，本发明使用的试剂类为和光纯药工业株式会社、SIGMA-ALDRICH公司、Takara-Bio株式会社等的制品，可以使用易于从市售获得的试剂。DSM菌株可以在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH购买。ATCC菌株可以在American Type Culture Collection购买。对试剂的生产商、纯度等没有特别限制。另外，本发明中使用的血清等生物材料是市售品、或获得了知情同意(在正确说明了使用目的的信息的基础上得到了同意)的材料。

本发明的第一酶的活性量是通过下述的活性测定法1或活性测定法3测定的，本发明的第二酶的活性量是通过下述的活性测定法2测定的。本发明的第一酶的活性测定法3的反应工序少，能够简单地测定准确的活性值。本发明的第一酶的活性测定法1能够以任意物质作为底物进行测定。此外，本说明书中，需要明确本发明的第一酶的活性量时，没有特别说明测定法时，全部换算成活性测定法1中的活性量进行表示。换算时，可以用各测定方法测定相同的检体，根据该值的变化量的比率进行换算。由于测定条件、使用机器的精度等，变化量的比率有可能有变化，例如测定法1：测定法3＝0.7：3.0。

[活性测定法1]

[反应试剂混合液]

20mM  Tris/HCl缓冲液pH 7.5

20mM  葡萄糖

1mM   ATP(pH 7)

1mM   氯化镁

1mM   NADP

50mM  KCl

5U/ml 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(旭化成制药株式会社制造)

5U/ml ADP依赖性HK(旭化成制药株式会社制造)

1mM   咪唑立宾

在石英制的1.0cm比色杯中量取1.3ml反应试剂混合液，在37℃预加热2分钟。加入0.03ml经20mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5稀释成适当的浓度的第一酶溶液，进行混和，在37℃开始反应。反应开始后，测定340nm处的吸光度，求出线性反应中每1分钟的吸光变化。将求出的吸光变化记作As/min，将用精制水代替第一酶溶液的盲检记作Ab/min，利用(式2)计算出酶活性(U/ml)。

(式2)

酶活性(U/ml)＝{(As/min-Ab/min)/6.22}×1.33/0.03×稀释倍数

[活性测定法2]

[反应试剂混合液]

50mM  Tris/HCl缓冲液pH 8.0

2mM   肌苷5’一磷酸

2mM   NAD、50mM KCl

在石英制的1.0cm比色杯中量取2ml反应试剂混合液，在37℃预加热2分钟。加入0.03ml经50mM Tris/HCl缓冲液pH 8.0稀释成适当的浓度的第二酶溶液，进行混和，在37℃开始反应。反应开始后，测定340nm处的吸光度，求出线性反应中每1分钟的吸光变化。将求出的吸光变化记作As/min，将用精制水代替第二酶溶液的盲检记作Ab/min，利用(式3)计算出酶活性(U/ml)。

(式3)

酶活性(U/ml)＝{(As/min-Ab/min)/6.22}×2.03/0.03×稀释倍数

[活性测定法3]

[反应试剂混合液1]

30mM  磷酸钾缓冲液pH 7.0

10mM  ATP(pH 7)

20mM  氯化镁

5mM   肌苷

50mM  氯化钾

[反应试剂混合液2]

100mM  Tris/HCl缓冲液pH 9.0

13U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

20mM  NAD

50mM  氯化钾

1mM   DTT

200mM EDTA(pH 9)

在石英制的1.0cm比色杯中量取1.0ml反应试剂混合液，在37℃预加热2分钟。加入0.01ml经用30mM磷酸钾缓冲液pH7.0稀释成适当的浓度的本发明的酶溶液，进行混和，在37℃开始反应。反应开始5分钟后，混合2ml0.1N的盐酸，结束反应，测定550nm处的吸光度，求出吸光变化。将求出的吸光变化记作As/min，将用精制水代替第一酶溶液的盲检记作Ab/min，利用(式4)计算出酶活性(U/ml)。

(式4)

酶活性(U/ml)＝{(As/min-Ab/min)/19}×3.01/0.01×稀释倍数

[蛋白质浓度测定]

本发明的第一酶和第二酶等的蛋白质浓度通过常规方法使用Bio-Rad社的蛋白定量试剂盒进行测定，以BSA为标准进行计算。

[实施例1]

<能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的寻找1>

将通过常规方法从粪肥中分离的微生物用含有0.5％的肌苷的100mlLB培养基在37℃培养17小时，经离心分离得到菌体。将菌体用10ml的10mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5悬浮，进行超声波破碎，经离心分离得到粗酶液。在500μl下述的反应液中添加10μl粗酶液，在37℃反应30分钟。用精制水将反应后的反应液稀释10倍，用HPLC对25μl进行分离。HPLC使用昭和电工社制的Asahipak GS-320，移动相为200mM磷酸钠缓冲液pH 3.0，流速为0.5ml/min，在室温实施分离，监视260nm的吸光，检测到能够对咪唑立宾进行磷酸化的活性即本发明的第一酶的活性，所以筛选该微生物为形成第一酶的微生物。使10ml上述的粗酶液吸附于经10mM的Tris/HCl缓冲液pH 8.0平衡化的Q sep.FF(通用电气医疗生物科学社制造)。用10mM的Tris/HCl缓冲液pH8.0充分清洗后，使用含有0和0.5M的KCl的10mM的Tris/HCl缓冲液pH 8.0进行线性梯度洗脱。在活性组分中添加硫酸铵，使其最终浓度为15％，使其吸附于经含有15％硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液pH7.5平衡化的Phenyl sep.FF(通用电气医疗生物科学社制造)，使用含有15％和0％的硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5进行线性梯度洗脱。活性组分用经10mM磷酸钾缓冲液pH7.5平衡化的G-25(通用电气医疗生物科学社制造)脱盐后，使其吸附于经10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5平衡化的ResourceQ(通用电气医疗生物科学社制造)。用10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5充分清洗后，使用含有0和0.5M的KCl的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5进行线性梯度洗脱。活性组分用经10mM磷酸钾缓冲液pH 7.0平衡化的G-25脱盐，得到第一酶。将该酶用SDS-PAGE分离，使主要蛋白吸印在PVDF膜上，进行蛋白质测序，结果证明了本实施例得到的本发明的第一酶是大肠杆菌的鸟苷肌苷激酶。本实施例得到的第一酶的比活性为0.01U/mg以下。于是，根据H.Kawasaki等、Biosci.Biotechnol.Biochem.、64卷、972页、2000年记载的方法，制备大肠杆菌JM109的大量表达鸟苷肌苷激酶的转化体，获取该鸟苷肌苷激酶，检测能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性，结果得到了与上述相同的结果。

[反应液]10mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5、30mM KCl、5mM氯化镁、5mM ATP pH7、1mM DTT、1mM咪唑立宾。

[实施例2]

<能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的寻找2>

根据Thomas Hansen等、Extremophiles、11卷、105-114页、2007年所记载的方法，制备来源于詹氏甲烷球菌的磷酸果糖激酶-B(Phosphofructokinase-B)。具体地说，以詹氏甲烷球菌DSM2661株作为模板，使用序列表序列编号13和序列表序列编号14的引物进行PCR扩增，将PCR扩增基因连接于pET17b，转化在大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化体用LB培养基培养，用IPTG诱导表达该基因编码的磷酸果糖激酶-B，用与上述实施例1相同的方法精制该酶。通过与上述实施例1相同的HPLC，确认到精制酶具有能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性即本发明的第一酶的活性。本实施例得到的第一酶的比活性约为0.02U/mg。

[实施例3]

<能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的寻找3>

以闪烁古生球菌DSM4304株作为模板，使用序列表序列编号15和序列表序列编号16的引物进行PCR扩增，将PCR扩增基因连接于pET21a(+)，转化在大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化体用LB培养基培养，用IPTG诱导表达该基因编码的酶，用与上述实施例1相同的方法精制该酶。通过与实施例1相同的HPLC，确认到精制酶具有能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性即本发明的第一酶的活性。本实施例得到的第一酶的比活性为0.01U/mg以下。

[实施例4]

<能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的寻找4>

参考B.Sahin等、Eur.J.Biochem、271卷、3547页、2004年中记载的方法，制备来源于小鼠的腺苷激酶。具体地说，以小鼠脑的cDNA(Clontech社)作为模板，使用序列表序列编号17和序列表序列编号18的引物进行PCR扩增，将PCR扩增基因连接于pET21a(+)，转化在大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化体用LB培养基培养，用IPTG诱导表达该基因编码的酶，用与上述实施例1相同的方法精制该酶。通过与实施例1相同的HPLC，确认到精制酶具有能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性即本发明的第一酶的活性。本实施例得到的第一酶的比活性为0.01U/mg以下，与实施例2得到的第一酶的反应速度相比，反应速度约为其二分之一。另外，来源于小鼠的腺苷激酶和来源于人的腺苷激酶的氨基酸序列的相同性近似约90％，保存了活性中心的氨基酸，所以推测来源于小鼠的腺苷激酶和来源于人的腺苷激酶的性质相同(Structure、1998年、6卷、183-193页等)。即，来源于人的腺苷激酶也可以与来源于小鼠的腺苷激酶同样地成为本发明的第一酶，据推测比活性为0.01U/mg以下，但实施例2得到的第一酶的反应速度好，约为二倍。

[实施例5]

<能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的寻找5>

将泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株用含有0.5％的肌苷的100mlLB培养基在30℃培养2天，进行离心分离，得到菌体。将菌体用10ml的10mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5悬浮，进行超声波破碎，经离心分离得到粗酶液。通过与实施例1相同的HPLC，确认到粗酶液具有能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性即本发明的第一酶的活性。

[实施例6]

<DNA的提取>

使用LB培养基，在30℃培养泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株2天，对经集菌的菌体用含有50mM Tris/HCl缓冲液pH 8.0、50mM EDTA、15％蔗糖的1mg/ml溶菌酶溶液于37℃处理10分钟后，添加SDS，使其最终浓度为0.25％，溶解菌体。另外，加入等量的苯酚/三氯甲烷的1：1混合液，搅拌30分钟后，进行离心分离(12,000rpm、15分钟)，回收水层。在回收的水层中混合十分之一量的3M乙酸钠(pH 5.5)后，轻轻地添加2倍量的乙醇，用玻璃棒卷起基因组DNA进行分离。将经分离的基因组DNA溶解在10mM Tris/HCl缓冲液pH 8.0、1mM EDTA水溶液(以下有时记作TE)中，加入适量的RNase A，在37℃保温1小时，分解混合存在的RNA。接下来，加入等量的苯酚/三氯甲烷的1：1混合液，进行与上述相同的处理，分取水层。在分取的水层中加入十分之一量的3M乙酸钠(pH 5.5)和2倍量的乙醇，用上述方法再次分离基因组DNA。将该染色体溶解于TE中，加入TE饱和的苯酚和三氯甲烷的1：1混合液，将全部悬浮后，反复进行相同的离心分离，将上层再次转移到其他的容器。在该分离的上层中加入3M乙酸钠缓冲液(pH 5.5)和乙醇，搅拌后在-70℃冷却5分钟，然后进行离心分离(2,000G、4℃、15分钟)，将沉淀的染色体用75％乙醇清洗，进行减压干燥。通过以上的操作，得到了泰国伯克霍尔德氏菌DSM13276株的DNA标准品。

[实施例7]

<利用PCR法进行序列表序列编号2所示基因的扩增>

设计序列表序列编号3和序列表序列编号4的引物，以便在pTip QC1或pTip QC2(日本特许第3944577号公报以及日本特许第3793812号公报)的多克隆位点NdeI和BamHI部位插入序列表序列编号2的基因。PCR使用KOD DNA聚合酶(东洋纺社制造)。PCR条件依照使用说明书记载的方法。所得到的约1.0kbp的PCR产物按常规方法精制。

[实施例8]

<与表达载体的连接>

按照常规方法，用NdeI和BamHI对实施例7中精制的PCR产物进行限制性内切酶处理，制成插入片段。将经常规方法精制的插入片段与用NdeI和BamHI进行限制性内切酶处理后精制的pTip QC1或pTip QC2用常规方法连接，制成pTip QC1/BthNK和pTip QC2/BthNK。通过常规方法将pTip QC1/BthNK和pTip QC2/BthNK导入大肠杆菌DH5α，进行转化，通过DNA测序确认到由利用菌落直接PCR法得到的阳性克隆精制的重组质粒的插入片段序列是正确的。

[实施例9]

<pTip QC1/BthNK以及pTip QC2/BthNK在红串红球菌中的转化>

pTip QC1/BthNK以及pTip QC2/BthNK在红串红球菌中的转化是按照日本特开2004-073116号公报等所记载的方法利用电穿孔法(electroporation)实施的。电穿孔条件如下。融化感受态细胞，与pTipQC1/BthNK或pTip QC2/BthNK混合，放入2mm的专用杯，在7.5mS、2500V、25μF、400Ω的条件下施加脉冲。

[实施例10]

<表达确认>

将实施例9得到的转化体接种于含有34μg/ml氯霉素的LB培养基中，在30℃培养2天，制成种子。在含有34μg/ml氯霉素和1μg/ml硫链丝菌素的LB培养基中接种1/10量的上述种子，在30℃培养1天。离心分离培养液，进行集菌，悬浮于培养液的1/5倍量的20mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5中，进行超声波破碎，经离心分离，将得到的上清作为粗酶液。粗酶液的SDS-PAGE结果见图1，确认到酶的大量表达。此外，图1(A)中箭头和图1(B)中箭头分别是在pTip QC1/BthNK、pTip QC2/BthNK的转化体中表达的第一酶(BthNK)(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)。

[实施例11]

<由pTip QC1/BthNK转化体精制能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶>

使实施例10中培养pTip QC1/BthNK转化体所得到的粗酶液吸附于用含有0.1M氯化镍以及0.3M氯化钠的50mM磷酸缓冲液pH 8.0平衡化的Cherating Sepharose FF(通用电气医疗生物科学社制造)。用含有0.3M氯化钠的50mM的磷酸缓冲液pH 8.0充分清洗后，用含有10％甘油和0.3M氯化钠的50mM磷酸缓冲液pH 6.0充分清洗。用含有0.4M咪唑、10％甘油和0.3M氯化钠的50mM磷酸缓冲液pH 6.0洗脱。活性组分用含有0.03M氯化钠、0.05M KCl和1mM DTT的30mM磷酸缓冲液pH 7.0透析，得到第一酶(BthNK)(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)。本实施例得到的BthNK的比活性约为0.04U/mg。1L的培养得到约80mg BthNK。

[实施例12]

<由pTip QC2/BthNK转化体精制能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶>

使实施例10中培养pTip QC2/BthNK转化体所得到的粗酶液吸附于用10mM的Tris/HCl缓冲液pH 8.0平衡化的Q sep.BB(通用电气医疗生物科学社制造)。用10mM的Tris/HCl缓冲液pH 8.0充分清洗后，使用含有0和0.5M KCl的10mM的Tris/HCl缓冲液pH 8.0进行线性梯度洗脱。在活性组分中添加硫酸铵，使其最终浓度为15％，使活性组分吸附于用含有15％的硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5平衡化的Phenyl sep.FF，使用含有15％和0％的硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5进行线性梯度洗脱。活性组分用经10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5平衡化的G-25脱盐后，使其吸附于用10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5平衡化的DEAE sep.FF(通用电气医疗生物科学社制造)。用10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5充分清洗后，使用含有0和0.5M KCl的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5进行线性梯度洗脱。活性组分用经10mM磷酸钾缓冲液pH 7.0平衡化的G-25脱盐，得到第一酶(BthNK)(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)。本实施例得到的BthNK的比活性约为0.04U/mg。1L的培养得到约50mg BthNK。

[实施例13]

<使用了pET系统的能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的表达>

通过常规方法将实施例7得到的插入片段与用NdeI和BamHI进行限制性内切酶处理后精制的pET21a(+)连接，制成pET21a(+)/BthNK。通过常规方法将pET21a(+)/BthNK导入大肠杆菌BL21(DE3)，进行转化，通过DNA测序确认到由利用菌落直接PCR法得到的阳性克隆精制的重组质粒的插入片段序列是正确的。将所得到的转化体接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。在30℃培养1天，制成种子。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种1/100量的上述种子，在30℃培养一天。加入IPTG，使培养液中的浓度为1mM，进一步在30℃培养3小时。对培养液进行离心分离而集菌，悬浮于培养液的1/5倍量的20mM Tris/HCl缓冲液pH 8.5中，进行超声波破碎，经离心分离，将得到的上清作为粗酶液。粗酶液的SDS-PAGE结果见图2，确认到酶的大量表达。此外，图中箭头是本发明的第一酶(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)。粗酶液以与实施例12相同的方法精制。本实施例得到的第一酶(BthNK)(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)的比活性约为0.04U/mg。1L的培养得到约50mgBthNK。

[实施例14]

<咪唑立宾的磷酸化方法和磷酸咪唑立宾的制造>

在500μl实施例1所述的反应液中加入10μl用10mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5稀释的实施例12中制备的BthNK，在37℃反应30分钟。通过与实施例1相同的HPLC分离反应后的反应液。反应后的色谱图见图3(C)，反应前的色谱图见图3(B)。图3(A)是在相同的HPLC条件下用HPLC对标准品的磷酸咪唑立宾进行分离得到的色谱图。确认到实施例12中制备的BthNK具有能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性。同样，也确认到实施例13中制备的BthNK具有能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶活性。

[实施例15]

<底物特异性>

使用由实施例12制备的BthNK。使用表1中的各底物代替咪唑立宾，利用上述的活性测定法1测定BthNK的相对活性。表1给出比较了相对活性的底物特异性。

【表1】

 

底物	相对活性(％)
		无	0
咪唑立宾	11
		利巴韦林	1
鸟苷	19
		胞苷	0
腺苷	81
		2-脱氧腺苷	5
胸苷	0
		尿苷	2
D-核糖	0
		L-核糖	0
果糖	0
		葡萄糖	0
2-脱氧葡萄糖	0
		黄苷	0
半乳糖	0
		木糖	0
N-乙酰葡糖胺	0
		果糖-6-磷酸	0
甘露糖-6-磷酸	0
		核糖-5-磷酸	0
肌苷	100

本实施例的结果表明，BthNK即本发明的第一酶(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)至少在磷酸供体存在下催化将核苷变成磷酸核苷的反应。特别作用于腺苷、肌苷以及鸟苷，而实质上(即在本实施例的条件下)不作用于胞苷和黄苷，也实质上不作用于核糖。

另外，本实施例的结果表明，BthNK即本发明的第一酶(能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶)催化将咪唑立宾和/或利巴韦林变成磷酸咪唑立宾和/或磷酸利巴韦林的反应。

[实施例16]

<最适pH>

使用由实施例12制备的BthNK。改变活性测定法3中的缓冲液，进行活性测定，测定最适pH，其中pH 4.5～6.0的范围使用柠檬酸/NaOH(图4中用○表示)，pH 6.0～7.5的范围使用磷酸钾缓冲液(图4中用●表示)，pH 7.0～9.0的范围使用Tris/HCl缓冲液(图4中用△表示)，pH 9.5使用甘氨酸/NaOH缓冲液(图4中用□表示)。图4给出了以最大活性为100％的相对活性(％)。BthNK表现出最大活性的最适pH在pH 5.5～7.5的范围。

[实施例17]

<pH稳定性>

使用由实施例12制备的BthNK，测定pH稳定性。将BthNK按pH稀释到100mM下述缓冲液中，使浓度为0.475mg/ml，在37℃加温处理3小时后，用活性测定法3测定BthNK的残存活性，其中，pH 4.5～6.0的范围使用柠檬酸/NaOH(图5中用○表示)，pH 6.0～7.5的范围使用磷酸钾缓冲液(图5中用●表示)，pH 7.0～9.0的范围使用Tris/HCl缓冲液(图5中用△表示)，pH 9.5～11.0使用甘氨酸/NaOH缓冲液(图5中用□表示)。如图5所示，BthNK在37℃、3小时的条件下在pH 6～10的范围保持70％以上的活性。

[实施例18]

<热稳定性>

使用由实施例12制备的BthNK，测定热稳定性。将BthNK稀释到100mM磷酸钾缓冲液pH 7.0中，使浓度为0.475mg/ml，在各温度热处理20分钟后，用活性测定法3测定BthNK的残存活性。如图6所示，BthNK在100mM磷酸钾缓冲液pH 7.0的水溶液中，于50℃进行20分钟的热处理时，保持80％以上的活性。

[实施例19]

<BthNK的分子量>

如图7所示，由实施例12制备的BthNK的基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)的分子量约为34kDa。由序列表序列编号1的氨基酸序列得到的计算值为33994。

[实施例20]

<BthNK的作用温度范围>

用活性测定法3测定由实施例12制备的BthNK，其中，在15～70℃的范围改变反应温度，测定BthNK对肌苷进行磷酸化的反应速度(图8)。对其结果做阿累尼乌斯图，示于图9。如图8所示，作用温度的范围至少是15～70℃。另外，由图9可知，20～45℃之间的活化能约为64kJ/mol。此外，图9中T表示绝对温度。另外，由图8可见，在50℃以上相对活性没有提高，据认为这是由于反应液中的BthNK的稳定性和ATP的分解导致的结果。

[实施例21]

<金属的利用性>

在使用了由实施例12制备的BthNK的下述[混合物]中，使用表2所示的金属化合物，测定此时利用BthNK生成AMP的速度，以相对比的形式将其结果列于表2。

在1ml[混合物]中添加腺苷，使其最终浓度为1mM，在37℃对腺苷进行30分钟磷酸化。用精制水将磷酸化后的[混合物]稀释10倍，将25μl用HPLC分离。HPLC使用昭和电工社制的Asahipak GS-320，移动相使用200mM磷酸钠缓冲液pH3.0，流速为0.5ml/min，在室温实施分离，以260nm的吸光测定AMP的生成量。

[混合物]

50mM      Tris/HCl缓冲液pH 7.5

2.5mM     ATP

5mM       表2所示的金属化合物

0.5mU/ml  实施例12制备的BthNK

【表2】

 

金属化合物	相对比(％)
		氯化镁	90
氯化锰	100
		氯化镍	86
氯化钴	85

BthNK至少利用镁离子、钴离子、镍离子或锰离子之中的任意一种以上。

[实施例22]

<Vmax和Km>

用活性测定法1测定由实施例12制备的BthNK，其中，在Km值的1/10倍～10倍之间调整底物浓度为5个以上的不同浓度，利用Lineweaver-Burk倒数作图法，计算各表观的Vmax和Km值。其结果见表3。

【表3】

 

底物	Vmax(μmol/min/mg)	Km(mM)
			咪唑立宾	0.04	0.27
腺苷	0.19	0.02
			鸟苷	0.17	0.54
肌苷	0.46	0.10

另外，利用其他方法测定由实施例12制备的BthNK对肌苷的Vmax和Km。

[反应试剂混合液1]

30mM  磷酸钾缓冲液pH 7.0

10mM  ATP(pH 7)

20mM  氯化镁

5mM   肌苷

50mM  KCl

[反应试剂混合液2]

100mM  Tris/HCl缓冲液pH 9.0

13U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

20mM   NAD

50mM   KCl

1mM    DTT

200mM  EDTA(pH 9)

在石英制的1.0cm比色杯中量取1.0ml反应试剂混合液1，在37℃预加热2分钟。加入0.05ml用30mM磷酸钾缓冲液pH 7.0稀释成适当的浓度的BthNK，进行混和，在37℃开始反应。5分钟后混合1.0ml反应试剂混合液2，测定340nm处的吸光度，求出吸光变化。在Km值的1/10倍～10倍之间调整肌苷浓度和NAD浓度为5个以上的不同的浓度，根据Lineweaver-Burk倒数作图法计算出对肌苷的Km和Vmax。其结果为，Vmax＝1.59μmol/min/mg、Km＝0.18μmol/min/mg。

[实施例23]

<核苷的磷酸化方法和磷酸核苷的制造>

使用由实施例12制备的BthNK，制备下述的[组合物]作为核苷的磷酸化剂，实施腺苷的磷酸化方法，由腺苷制造磷酸腺苷(AMP)。在1ml[组合物]中添加腺苷，使其最终浓度为1mM，在37℃实施30分钟腺苷的磷酸化方法。用精制水将实施腺苷的磷酸化方法后的[组合物]稀释10倍，将25μl用HPLC分离。与实施例1中记载的方法同样地实施HPLC。实施腺苷的磷酸化方法后的色谱图见图10(C)，实施前的色谱图见图10(B)。图10(A)是在相同HPLC条件下对标准品的ATP、ADP、AMP以及腺苷组合物用HPLC进行分离得到的色谱图。用使用了本发明的能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶的核苷的磷酸化剂来实施腺苷的磷酸化方法，可以由腺苷制造磷酸腺苷(AMP)。盲检使用精制水代替由实施例12制备的BthNK进行实施，确认到实施前后的色谱图与图10(B)无变化。

[组合物]

50mM       Tris/HCl缓冲液pH 7.5

2.5mM      ATP

5mM        氯化镁

0.5mU/ml   由实施例12制备的BthNK

[实施例24]

<核苷混合物的测定>

使用由实施例12制备的BthNK，制成下述的[组合物]，实施腺苷、肌苷以及鸟苷的混合物的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为5μl、R1为100μl[组合物1]、R2为100μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为1点终点法、10分钟反应、0-31，减去精制水产生的空白。试样使用腺苷、肌苷以及鸟苷的1：1：1混合物，将合计浓度调整到图11的横轴范围，测定结果见图11。利用使用了BthNK的组合物实施了腺苷、肌苷以及鸟苷混合物的测定。需要说明的是，所谓1点终点法、10分钟反应、0-31指的是测定机器(日立7080型自动分析机)的测定方法之一，本领域技术人员可以通过参照日立7080型自动分析机的操作说明书来理解。

[组合物1]

20mM      磷酸钾缓冲液pH 7.0

10mM      ATP(pH7)

20mM      氯化镁

0.025U/ml BthNK

50mM      KCl

[组合物2]

20mM  磷酸钾缓冲液pH 7.0

20mM  葡萄糖

20mM  氯化镁

50mM  KCl

5mM   NADP

5U/ml 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

5U/ml ADP依赖性HK

[实施例25]

<核苷的测定>

使用由实施例12制备的BthNK，制作下述的[组合物]，实施腺苷、肌苷以及鸟苷的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为3μl、R1为130μl[组合物]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、5分钟反应、7-9，减去精制水产生的空白。试样使用腺苷、肌苷以及鸟苷，将各自的浓度调整到图12～图14的横轴的浓度范围，此时的测定结果见图12～图14。利用使用了BthNK的组合物实施了腺苷、肌苷以及鸟苷的测定。需要说明的是，所谓速率法A(RATE-A)、5分钟反应、7-9(下文中为20-22)指的是测定机器(日立7080型自动分析机)的测定方法之一，本领域技术人员可以通过参照日立7080型自动分析机的操作说明书来理解。

[组合物]

50mM  磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM      KCl

1mM       ATP(pH 7)

0.5mM     氯化镁

0.5mM     PEP

0.1mM     NADH

50U/ml    丙酮酸激酶

15U/ml    乳酸脱氢酶

2mM       DTT

2.5mU/ml  BthNK

[实施例26]

<核苷的测定>

使用由实施例12制备的BthNK，制作下述的[组合物]，实施腺苷、肌苷以及鸟苷的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为3μl、R1为130μl[组合物]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、5分钟反应、7-9，减去精制水产生的空白。试样使用腺苷、肌苷以及鸟苷，将各自的浓度调整到图15～图17的横轴的浓度范围，此时的测定结果见图15～图17。利用使用了BthNK的组合物实施了腺苷、肌苷以及鸟苷的测定。

[组合物]：

20mM      磷酸钾缓冲液pH 7.0、

20mM      葡萄糖、

1mM       ATP(pH 7)、

1mM       氯化镁、

1mM       NADP、

50mM      KCl、

5U/ml     葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、

5U/ml     ADP依赖性HK、

0.6mU/ml  BthNK。

[实施例27]

对由实施例11制备的BthNK、由实施例12制备的BthNK和由实施例13制备的BthNK同时进行上述的理化性质<1>～<4>的测定，并进行比较。结果确认到该3种BthNK是具有上述的理化性质<1>～<4>的酶。

[实施例28]

<DNA的提取>

使用含有2.3％营养物、0.2％马铃薯提取液的培养基，对枯草杆菌ATCC23857株在26℃培养1天，得到菌体。将5g/L蛋白胨、1g/L酵母提取液、20g/L NaCl、0.1g/L柠檬酸铁、5.9g/L氯化镁、3.24g/L硫酸钠用工业用水溶解，配制成pH7.6的培养基，使用该培养基将Oceanobacillusiheyensis DSM14731株在25℃培养1天，得到菌体。通过与实施例5同样的操作，由这些菌体得到枯草杆菌ATCC23857株和Oceanobacillusiheyensis DSM14731株的DNA标准品。

[实施例29]

<利用PCR法进行序列表序列编号8所示基因的扩增>

以实施例28得到的枯草杆菌ATCC23857株的DNA作为模板，使用序列表序列编号19和序列表序列编号20的引物以PCR进行基因扩增。使用KOD DNA聚合酶按照常规方法进行PCR。所得到的约1.5kbp的PCR产物按照常规方法进行精制。

[实施例30]

<利用PCR法进行序列表序列编号10所示基因的扩增>

以实施例28得到的Oceanobacillus iheyensis DSM14731株的DNA作为模板，使用序列表序列编号21和序列表序列编号22的引物以PCR进行基因扩增。使用KOD DNA聚合酶按照常规方法进行PCR。所得到的约1.5kbp的PCR产物按照常规方法进行精制。

[实施例31]

<与表达载体的连接>

按照常规方法，用XbaI和SacI对实施例29中精制的PCR产物进行限制性内切酶处理，制成插入片段。按照常规方法，将经常规方法精制的插入片段与用XbaI和SacI进行限制性内切酶处理后精制的pHSG399连接，制成pHSG399/BsuIMPDH。通过常规方法将pHSG399/BsuIMPDH导入大肠杆菌W3110，进行转化，通过DNA测序确认到由利用菌落直接PCR法得到的阳性克隆精制的重组质粒的插入片段序列是正确的。

[实施例32]

<与表达载体的连接>

按照常规方法，用XbaI和SacI对实施例29中精制的PCR产物进行限制性内切酶处理，制成插入片段。按照常规方法，将经常规方法精制的插入片段与用XbaI和SacI进行限制性内切酶处理后精制的pHSG399连接，制成pHSG399/ObIMPDH。通过常规方法将pHSG399/ObIMPDH导入大肠杆菌W3110，进行转化，通过DNA测序确认到由利用菌落直接PCR法得到的阳性克隆精制的重组质粒的插入片段序列是正确的。

[实施例33]

<BsuIMPDH的获得>

将实施例31得到的转化体接种于含有34μg/ml氯霉素和1mM IPTG的LB培养基中，在30℃培养1天。对培养液进行离心分离而集菌，悬浮于培养液的1/5倍量的含有1mM DTT的20mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5中，进行超声波破碎，经离心分离得到粗酶液。使该粗酶液吸附于经含有1mM DTT的10mM Tris/HCl缓冲液pH 8.0平衡化的Q sep.BB。用含有1mM DTT的10mM Tris/HCl缓冲液pH 8.0充分清洗后，使用含有1mMDTT和0或0.5M KCl的10mM Tris/HCl缓冲液pH 8.0进行线性梯度洗脱。在活性组分中加入最终浓度为15％的硫酸铵，使其吸附于经含有1mMDTT和15％的硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5平衡化的Phenyl sep.FF，使用含有1mM DTT和15％或0％的硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5进行线性梯度洗脱。活性组分用经10mM磷酸钾缓冲液pH 7.5平衡化的G-25脱盐，得到来源于枯草杆菌的肌苷5’一磷酸脱氢酶(BsuIMPDH)。1L的培养得到约10mg的BsuIMPDH。

[实施例34]

<ObIMPDH的获得>

使用实施例32得到的转化体，与实施例33同样地操作，得到来源于Oceanobacillus iheyensis的肌苷5’一磷酸脱氢酶(ObIMPDH)。1L的培养得到约10mg的ObIMPDH。

[实施例35]

<BsuIMPDH和ObIMPDH的最适pH>

测定实施例33和实施例34中制备的BsuIMPDH和ObIMPDH的最适pH。改变上述活性测定法2中的缓冲液，进行活性测定，测定最适pH，其中，pH 4.5～6.0的范围使用柠檬酸/NaOH(图18中用○表示)，pH 6.0～7.5的范围使用磷酸钾缓冲液(图18中用●表示)，pH 7.0～9.0的范围使用Tris/HCl缓冲液(图18中用△表示)，pH 9.5～10.5使用甘氨酸/NaOH(图18中用□表示)。图18给出了以最大活性为100％的相对活性(％)。图18的(A)是BsuIMPDH，(B)是ObIMPDH。BsuIMPDH和ObIMPDH表现出最大活性的最适pH在pH 8～9的范围。

[实施例36]

<BsuIMPDH和ObIMPDH的pH稳定性>

测定实施例33和实施例34制备的BsuIMPDH和ObIMPDH的pH稳定性。将BsuIMPDH和ObIMPDH按pH稀释到100mM下述缓冲液中，使浓度为1mg/ml，在37℃加温处理3小时后，用活性测定法2测定残存活性，其中，pH 4.5～6.0的范围使用柠檬酸/NaOH(图19中用○表示)，pH 6.0～7.5的范围使用磷酸钾缓冲液(图19中用●表示)，pH 7.0～9.0的范围使用Tris/HCl缓冲液(图19中用△表示)，pH 9.5～11.0使用甘氨酸/NaOH(图19中用□表示)，pH 10.5～12.5使用磷酸钠缓冲液(图19中用■表示)。图19中，(A)是BsuIMPDH，(B)是ObIMPDH。BsuIMPDH和ObIMPDH在37℃、3小时的条件下在pH 6～11的范围保持70％以上的活性。

[实施例37]

<BsuIMPDH和ObIMPDH的热稳定性>

测定实施例33和实施例34制备的BsuIMPDH和ObIMPDH的热稳定性。将BsuIMPDH和ObIMPDH稀释到含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.0中，使浓度为1mg/ml，在各温度热处理30分钟后，用活性测定法2测定残存活性。图20中，(A)是BsuIMPDH，(B)是ObIMPDH。如图20所示，BsuIMPDH和ObIMPDH在含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7的水溶液中，于60℃进行30分钟的热处理时，保持85％以上的活性。

[实施例38]

<BsuIMPDH和ObIMPDH的分子量>

如图21所示，实施例33和实施例34中制备的BsuIMPDH和ObIMPDH的基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法的分子量为52～54kDa。图21中，(A)是ObIMPDH，(B)是BsuIMPDH。根据由序列表序列编号7和序列表序列编号9的氨基酸序列得到的计算值，BsuIMPDH为52990，ObIMPDH为52487。

[实施例39]

<盐对BsuIMPDH和ObIMPDH的活性的影响>

改变上述活性测定法2中的KCl浓度，测定实施例33和实施例34制备的BsuIMPDH和ObIMPDH的活性，其结果在图22中用(○)表示，将KCl换成氯化铵并改变浓度进行测定的结果在图22中用(●)表示。图22中，(A)是ObIMPDH，(B)是BsuIMPDH。在50～100mM的KCl或氯化铵中，BsuIMPDH和ObIMPDH的活性最大。

[实施例40]

<BsuIMPDH和ObIMPDH的动力学参数>

使用实施例33和实施例34制备的BsuIMPDH和ObIMPDH。在Km的1/10倍～10倍之间，将上述活性测定法2中的NAD和肌苷5’一磷酸(表中表示为IMP)的浓度调整为5个以上的不同浓度，用Lineweaver-Burk倒数作图法测定BsuIMPDH和ObIMPDH的Vmax和Km，结果见表4。

在上述活性测定法2的反应试剂混合液中，在Ki’的1/10倍～10倍之间调整霉酚酸(表中表示为MPA)的浓度为5个以上的不同浓度，利用Lineweaver-Burk作图法的2次作图测定BsuIMPDH和ObIMPDH的Ki’，结果见表4。

在上述活性测定法2的反应试剂混合液中，在Ki的1/10倍～10倍之间调整磷酸咪唑立宾、黄苷5’一磷酸(表中表示为MZR-P、XMP)、ATP、ADP、AMP的浓度为5个以上的不同浓度，用Dixon作图法测定BsuIMPDH和ObIMPDH的Ki，结果见表4。

结果BsuIMPDH和ObIMPDH不受咪唑立宾和利巴韦林这两者的抑制。

抑制形式中，UC表示反竞争性抑制，CO表示竞争性抑制，NC表示非竞争性抑制，CO+NC表示竞争性抑制和非竞争性抑制的混合型。

由本实施例的结果确认到BsuIMPDH和ObIMPDH是能够催化第二反应的酶即第二酶。

【表4】

 

	BsuIMPDH	ObIMPDH	抑制形式
				Vmax(μmol/min/mg)	2.0	0.6
Km
				NAD(mM)	1.4	0.8
IMP(mM)	0.1	0.1
				Ki’
MPA(mM)	14	12	UC
				Ki
MZR-P(nM)	72	157	CO+NC
				XMP(mM)	0.15	0.60	CO
ATP(mM)	1.2	11	CO+NC
				ADP(mM)	5.0	9.2	CO+NC
AMP(mM)	1.6	1.4	CO+NC

[实施例41]

<咪唑立宾的测定1>

使用实施例2制备的第一酶，制成下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为5μl、R1为100μl[组合物1]、R2为50μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、23-25。作为试样，将咪唑立宾用PBS分别在0～10μM的范围进行调整后进行测定，测定结果见图23。利用使用了实施例2制备的第一酶的组合物实施了咪唑立宾的测定。

[组合物1]

30mM    磷酸钾缓冲液pH 7.0

75mM    KCl

5mM     ATP(pH 7)

10mM    氯化镁

1mM     DTT

2mM     肌苷5’一磷酸

[组合物2]

50mM    Tris/HCl缓冲液pH 8.5

75mM    KCl

10mM    NAD

1mM     DTT

0.2U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

[实施例42]

<利巴韦林的测定>

使用实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制成下述的[组合物]，实施利巴韦林的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为10μl、R1为200μl[组合物1]、R2为100μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。作为试样，将利巴韦林用PBS分别在0～10mM的范围调整后进行测定，测定结果见图24。利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物实施了利巴韦林的测定。

[组合物1]

30mM    磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM    KCl

10mM    ATP(pH 7)

5mM     NAD

20mM    氯化镁

0.05％  TX-100

4U/ml   实施例12制备的BthNK

0.2U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

1mM     DTT

30mM    NaCl

0.05％  叠氮化钠

[组合物2]

100mM   Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM    KCl

0.05％  TX-100

1mM     DTT

20mM    肌苷5’一磷酸

0.05％  叠氮化钠

[实施例43]

<咪唑立宾的测定2>

使用实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为2μl、R1为230μl[组合物1]、R2为115μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。作为试样，将咪唑立宾用PBS分别在0～40μM的范围调整后进行测定，测定结果见图25。利用使用了实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物实施了咪唑立宾的测定。

[组合物1]

30mM  磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM  KCl

10mM  ATP(pH 7)

5mM   NAD

20mM  氯化镁

0.05％   TX-100

0.3U/ml  实施例11制备的BthNK

0.29U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

1mM      DTT

[组合物2]

100mM    Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM     KCl

0.05％   TX-100

1mM      DTT

20mM     肌苷5’一磷酸

[实施例44]

<咪唑立宾的测定3>

使用实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为2μl、R1为230μl[组合物1]、R2为115μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。将0～2μM范围的用蒸馏水稀释咪唑立宾的试样的测定结果在图26中用○表示，将用血清(SeronormHuman(Sero社))稀释的试样的测定结果在图26中用●表示。利用使用了实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物实施了蒸馏水中的咪唑立宾和血清中的咪唑立宾的测定。

[组合物1]

30mM    磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM    KCl

10mM    ATP(pH 7)

5mM     NAD

20mM    氯化镁

0.05％  TX-100

0.3U/ml 实施例11制备的BthNK

0.06U/ml  实施例33制备的BsuIMPDH

1mM       DTT

[组合物2]

100mM     Tris/HCl缓冲液pH 7.0

50mM      KCl

0.05％    TX-100

1mM       DTT

20mM      肌苷5’一磷酸

[实施例45]

<咪唑立宾的测定4>

使用实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH或实施例34制备的ObIMPDH，制作下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为2μl、R1为230μl[组合物1]、R2为115μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。作为试样，将咪唑立宾用PBS分别在0～40μM的范围调整，使用其中使用了实施例33制备的BsuIMPDH的组合物1的情况在图27中用○表示，使用其中使用了实施例34制备的ObIMPDH的组合物1的情况在图27中用●表示。利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH或实施例34制备的ObIMPDH的组合物实施了咪唑立宾的测定。

[组合物1]：

30mM      磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM      KCl

10mM      ATP(pH 7)

5mM       NAD

20mM      氯化镁

0.05％    TX-100

0.3U/ml   实施例12制备的BthNK

0.12U/ml  实施例33制备的BsuIMPDH或实施例34制备的ObIMPDH

1mM    DTT

30mM   NaCl

[组合物2]

100mM      Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM       KCl

0.05％     TX-100

1mM        DTT

20mM       肌苷5’一磷酸

[实施例46]

<咪唑立宾的测定5>

使用实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，研究干涉物质对测定值的影响。干涉物质使用国际试剂社制的干涉检验A(干涉チエツクA)。在混合有图28(A)～(D)的横轴浓度的胆红素C、胆红素F、乳糜、血红蛋白的血清中溶解2μg/ml的咪唑立宾，用下述的[组合物]进行测定。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为2.2μl、R1为200μl[组合物1]、R2为100μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。利用使用了实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物实施了咪唑立宾的测定而不受干涉物质的影响。

[组合物1]

30mM     磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM     KCl

10mM     ATP(pH 7)

5mM      NAD

20mM     氯化镁

0.05％   TX-100

0.4U/ml  实施例12制备的BthNK

0.16U/ml  实施例33制备的BsuIMPDH

1mM       DTT

30mM      NaCl

[组合物2]

100mM     Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM      KCl

0.05％    TX-100

1mM       DTT

20mM      肌苷5’一磷酸

[实施例47]

<咪唑立宾的测定6>

使用实施例12制备的BthNK或实施例13制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为2.2μl、R1为200μl[组合物1]、R2为100μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。作为试样，将咪唑立宾用PBS分别在0～5μg/ml的范围调整，使用其中使用了实施例12制备的BthNK的组合物1的情况在图29中用○表示，使用其中使用了实施例13制备的BthNK的组合物1的情况在图29中用●表示。利用使用了实施例12制备的BthNK或实施例13制备的BthNK的组合物实施了咪唑立宾的测定。

[组合物1]：

30mM     磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM     KCl

10mM     ATP(pH 7)

5mM      NAD

20mM     氯化镁

0.4U/ml  实施例12制备的BthNK或实施例13制备的BthNK

0.16U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

2mM     DTT

30mM    NaCl

0.05％  TX-100

0.05％  叠氮化钠

[组合物2]

100mM   Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM    KCl

0.05％  TX-100

2mM     DTT

20mM    肌苷5’一磷酸

0.05％  叠氮化钠

[实施例48]

<咪唑立宾的测定7>

使用实施例13制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。参数是试样为2μl、R1为200μl[组合物1]、R2为100μl[组合物2]的情况下，测定用PBS调整在0～7.5μg/ml的范围的试样(图30(A))。参数是试样为5μl、R1为100μl[组合物1]、R2为50μl[组合物2]的情况下，测定用PBS调整在0～0.5μg/ml的范围的试样(图30(B))。利用使用了实施例13制备的BthNK的组合物测定了0～7.5μg/ml范围和0～0.5μg/ml范围的咪唑立宾。

[组合物1]

30mM    磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM    KCl

10mM    ATP(pH 7)

5mM     NAD

20mM    氯化镁

0.05％  TX-100

0.4U/ml  实施例13制备的BthNK

0.12U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

1mM      DTT

30mM     NaCl

[组合物2]

100mM    Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM     KCl

0.05％   TX-100

1mM      DTT

20mM     肌苷5’一磷酸

[实施例49]

<咪唑立宾的测定8>

使用实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，实施咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。参数如下：试样为5μl、R1为100μl[组合物1]、R2为50μl[组合物2]。作为试样，用血清稀释制备咪唑立宾(0～2μM)的情况在图31中用●表示，用以蒸馏水5倍稀释血细胞而成的血细胞破坏液稀释制备咪唑立宾(0～2μM)的情况在图31用○表示。利用使用了实施例11制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH的组合物测定了0～2μM范围的血清稀释的咪唑立宾和血细胞破坏液稀释的咪唑立宾。

[组合物1]

30mM      Tris/HCl缓冲液pH 7.5

50mM      KCl

10mM      ATP(pH 7)

5mM       肌苷5’一磷酸

20mM      氯化镁

0.05％    TX-100

0.1U/ml   实施例11制备的BthNK

[组合物2]

100mM    Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM     KCl

10mM     NAD

0.05％   TX-100

1mM      DTT

0.06U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

[实施例50]

<咪唑立宾的测定9>

在人血清40个检体中添加0.5～6.9μg/ml范围的咪唑立宾，制成试样。对于该试样，将使用实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH并使用下述的[组合物]测定血清中咪唑立宾得到的结果(本发明的咪唑立宾测定方法)与通过使用实施例1所述的HPLC的方法(利用HPLC测定咪唑立宾)测定血清中咪唑立宾得到的结果作以比较。如图32所示，本发明的咪唑立宾测定方法(X轴)和利用HPLC的咪唑立宾测定(Y轴)的关系式约为Y＝1.1X+0.09。从而确认到，本发明的咪唑立宾测定方法与利用HPLC的咪唑立宾测定方法具有同等的准确性。

[组合物1]

30mM     磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM     KCl

10mM     ATP(pH 7)

5mM      NAD

20mM     氯化镁

0.05％   TX-100

0.19U/ml 实施例12制备的BthNK

0.16U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

1mM      DTT

30mM     NaCl

[组合物2]

100mM    Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM     KCl

0.05％   TX-100

1mM      DTT

20mM     肌苷5’一磷酸

[实施例51]

<磷酸咪唑立宾的测定>

使用实施例33制备的BsuIMPDH，制作下述的[组合物]，实施磷酸咪唑立宾的测定方法。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为2μl、R1为230μl[组合物1]、R2为115μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。0～35μM范围的以蒸馏水稀释磷酸咪唑立宾的试样的测定结果见图33。利用使用了实施例33制备的BsuIMPDH的组合物实施了蒸馏水中的磷酸咪唑立宾的测定。

[组合物1]

30mM     磷酸钾缓冲液pH 7.0

50mM     KCl

5mM      NAD

0.05％   TX-100

0.16U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

1mM      DTT

[组合物2]

100mM    Tris/HCl缓冲液pH 7.0

50mM     KCl

0.05％   TX-100

1mM      DTT

20mM     肌苷5’一磷酸

[实施例52]

<咪唑立宾的测定10>

以从正在使用咪唑立宾的患者采集到的血清47个检体作为试样。将使用实施例12制备的BthNK和实施例33制备的BsuIMPDH并使用下述的[组合物]测定血清中咪唑立宾得到的结果(本发明的咪唑立宾测定方法)与通过Journal of chromatography、432卷、1988年、340-345页记载的使用HPLC的方法(利用HPLC测定咪唑立宾)测定血清中咪唑立宾得到的结果作以比较。如图34所示，本发明的咪唑立宾测定方法(Y轴)与利用HPLC的咪唑立宾测定(X轴)的关系式约为Y＝1.1X+0.06。从而确认到，本发明的咪唑立宾测定方法与利用HPLC的咪唑立宾测定方法具有同等的准确性。

[组合物1]

30mM     磷酸钾缓冲液pH 6.0

50mM     KCl

10mM     ATP(pH 7)

5mM      NAD

20mM     氯化镁

0.05％   TX-100

0.19U/ml 实施例12制备的BthNK

0.16U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

1mM      DTT

30mM     NaCl

[组合物2]

100mM    Tris/HCl缓冲液pH 9.0

50mM     KCl

0.05％   TX-100

1mM      DTT

20mM     肌苷5’一磷酸

[实施例53]

<第一酶的比较>

使用实施例33制备的BsuIMPDH、实施例2制备的来源于詹氏甲烷球菌的第一酶、或实施例3制备的来源于闪烁古生球菌的第一酶、或实施例12制备的BthNK，制成下述的[组合物]，测定1μg/ml的咪唑立宾。测定中使用日立7080型自动分析机。参数如下：试样为5μl、R1为100μl[组合物1]、R2为50μl[组合物2]、测定主波长为340nm、测定副波长为405nm，测定条件为速率法A、10分钟反应、20-22。

其结果如下：使用实施例2制备的来源于詹氏甲烷球菌的第一酶的情况下，得到了约80mAbs/分钟(9.3mAbs/分钟/mg)的灵敏度；使用实施例3制备的来源于闪烁古生球菌的第一酶的情况下，得到了约80mAbs/分钟(16.7mAbs/分钟/mg)的灵敏度；使用实施例12制备的BthNK的情况下，得到了约200mAbs/分钟(100mAbs/分钟/mg)的灵敏度。由该结果可知，实施例12制备的BthNK对咪唑立宾的磷酸化的效率至少是实施例2制备的第一酶的10.7倍以上、实施例3制备的第一酶的6倍以上。另外，结合考虑该结果和实施例4的结果，推测实施例12制备的BthNK对咪唑立宾的磷酸化的效率是来源于小鼠的腺苷激酶、或来源于人的腺苷激酶的21倍以上。因此，虽然来源于闪烁古生球菌的第一酶、来源于詹氏甲烷球菌的第一酶、来源于小鼠的腺苷激酶、来源于人的腺苷激酶均可用作本发明的咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法中的第一酶，但通常需要增加该酶的用量，所以BthNK最适合作为本发明的第一酶。

[组合物1]

30mM     磷酸钾缓冲液pH 7.0

75mM     KCl

5mM      ATP(pH 7)

5mM      氯化镁

1mM      肌苷5’一磷酸

1mM      DTT

8.6mg/ml 实施例2制备的第一酶、或

4.8mg/ml 实施例3制备的第一酶、或

2.0mg/ml 实施例12制备的BthNK

[组合物2]

50mM    Tris/HCl缓冲液pH 8.5

75mM    KCl

10mM    NAD

1mM     DTT

0.3U/ml 实施例33制备的BsuIMPDH

[实施例54]

<制作第二酶的变异体>

以与实施例28、实施例29以及实施例31相同的方法制作pHSG399/BsuIMPDH。以该pHSG399/BsuIMPDH为模板，使用序列表序列编号25、序列表序列编号26、序列表序列编号27以及序列表序列编号28的引物，通过使用PCR的常规方法或与实施例28、实施例29以及实施例31相同的方法，制备pHSG399/BsuIMPDH[V432I、K449I]，其是含有编码BsuIMPDH的2氨基酸变异体的碱基序列的质粒。使用序列表序列编号29、序列表序列编号30、序列表序列编号31、序列表序列编号32、序列表序列编号33、序列表序列编号34、序列表序列编号35、序列表序列编号36、序列表序列编号37以及序列表序列编号38的引物，同样地制作pHSG399/BsuIMPDH[D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E]，其是含有编码BsuIMPDH的5氨基酸变异体的碱基序列的质粒。同样地制作pHSG399/BsuIMPDH K345N和pHSG399/BsuIMPDH L367I，它们是含有编码BsuIMPDH的1氨基酸变异体的碱基序列的质粒。将通过与实施例31相同的方法得到的各转化体接种于含有34μg/ml氯霉素和1mMIPTG的LB培养基中，在30℃培养1天。其结果，pHSG399/BsuIMPDH、pHSG399/BsuIMPDH[V432I、K449I]、pHSG399/BsuIMPDH K345N、pHSG399/BsuIMPDH[D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E]以及pHSG399/BsuIMPDH L367I的转化体的培养效价分别是0.64U/ml、1.57U/ml，2.69U/ml、2.82U/ml以及3.09U/ml。通过这些取代，在本发明的第二酶的制造方法中，提高了本发明的第二酶的生产量。

[实施例55]

<红血球中的咪唑立宾的测定>

在5ml肝素采血的全血中添加10μg/ml的咪唑立宾，在37度进行培养。培养开始后，在表5所示的时间每次采集0.5ml培养中的全血，并将其离心分离为血浆和血细胞。血细胞用生理盐水清洗3次后，悬浮于0.5ml蒸馏水中，进行超声波破碎，用Ultrafree-MC Centrifugal Filter UnitsBiomax-10过滤。利用与实施例52相同的方法测定所得到的血浆中的咪唑立宾的浓度和滤液中的咪唑立宾的浓度。结果见表5，实现了血红细胞中的咪唑立宾的测定。

【表5】

 

培养时间(小时)	即将添加前	0.5	1	2	4	6	22
								血浆中的咪唑立宾浓度(μg/ml)	-0.06	4.84	4.85	4.84	4.84	4.83	4.79
滤液(含血细胞)中的咪唑立宾浓度(μg/ml)	-0.19	4.64	3.43	3.50	3.65	3.31	3.96

[实施例56]

<白细胞中的咪唑立宾的测定>

将小鼠淋巴瘤L5178Y细胞在由500ml DMEM(GIBCO)、FBS(GIBCO)、100U青霉素、100μg/ml链霉素组成的培养基中培养，使细胞悬浮液浓度为3×10⁶个/ml。在其中加入5μg/ml或10μg/ml的咪唑立宾，进一步在37℃培养3小时或18小时。将20ml培养液离心分离成离心上清和细胞。细胞用1ml的PBS清洗3次后，悬浮于0.5ml的蒸馏水中，进行超声波破碎，用Ultrafree-MC Centrifugal Filter Units Biomax-10过滤。用与实施例52相同的方法测定所得到的离心上清中的咪唑立宾的浓度和滤液中的咪唑立宾的浓度。结果见表6，实现了白细胞中的咪唑立宾的测定。

【表6】

 

培养时间(小时)	3小时	3小时	3小时	18小时	18小时	18小时
							咪唑立宾添加量(μg/ml)	0	5	10	0	5	10
离心上清中的咪唑立宾浓度(μg/ml)	0.04	3.69	7.75	0.02	3.60	8.08
							细胞破碎滤液中的咪唑立宾浓度(μg/ml)	0.05	0.03	0.04	0.05	0.13	0.20

[实施例57]

<白细胞中的磷酸咪唑立宾的测定>

在与实施例56相同的浓度为3×10⁶个/ml的小鼠淋巴瘤L5178Y细胞悬浮液中添加表8所示浓度的咪唑立宾，进一步在37℃培养4小时。利用与实施例56相同的方法得到细胞破碎滤液。利用与实施例52相同的方法测定所得到的滤液的咪唑立宾的浓度，用与实施例51相同的方法测定磷酸咪唑立宾的浓度。咪唑立宾的浓度测定结果见表7，磷酸咪唑立宾的浓度测定结果见表8。实现了白细胞中的咪唑立宾和磷酸咪唑立宾的测定。

【表7】

 

咪唑立宾添加量(μg/ml)	0	10	20	40	60	80	100	150	200
										细胞破碎滤液中的咪唑立宾浓度(μg/ml)	0.1	2	5	6	10	10	18	24	27

【表8】

 

咪唑立宾添加量(μg/ml)	0	10	20	40	60	80	100	150	200
										细胞破碎滤液中的磷酸咪唑立宾浓度(μg/ml)	0.18	0.29	0.35	0.33	0.40	0.35	0.44	0.45	0.47

[实施例58]

<本发明的测定方法的再现性>

由实施例52中使用的从正在使用咪唑立宾的患者采集到的血清47个检体中选出任意的10个检体，测定本发明的测定方法的再现性(n＝5)。咪唑立宾的测定方法通过与实施例52相同的方法进行。表9中给出了平均值、2S.D.(标准偏差)、CV(％)(变动系数)。由该表可知，CV(％)大时也不过是1％，本发明的咪唑立宾测定方法是再现性好的方法。

【表9】

 

检体No.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											平均(μg/ml)	2.47	4.51	2.47	4.15	1.14	2.91	3.43	4.71	5.80	1.21
2S.D.	0.05	0.03	0.04	0.04	0.02	0.06	0.02	0.03	0.01	0.01
											CV(％)	1.09	0.33	0.75	0.05	0.89	1.03	0.34	0.28	0.08	0.62

[实施例59]

<标准试剂的制作>

在含有3.75％蔗糖、0.5％甘露醇以及4.5％ NaCl的水溶液中溶解咪唑立宾，使浓度为约25μg/ml、15μg/ml或5μg/ml，制成标准试剂的冷冻干燥用母液。将这些母液各0.6ml地分别注入冷冻干燥用玻管瓶，用常规方法进行冷冻干燥，制成标准试剂。该标准试剂用3ml蒸馏水溶解后使用。用HPLC法测定标准试剂中的咪唑立宾浓度，结果如下：以浓度为25μg/ml的冷冻干燥用母液制成的校准液为4.90μg/ml、以浓度为15μg/ml的冷冻干燥用母液制成的校准液为3.40μg/ml、以浓度为5μg/ml的冷冻干燥用母液制成的校准液为1.01μg/ml。

[实施例60]

<本发明的测定方法的日内差和日间差>

用与实施例52相同的方法测定实施例59中制作的标准试剂，测定本发明的测定方法的日内差和日间差。日内差通过在同日内测定5次来进行计算，日间差通过连续5天在同日内测定1次来进行计算。结果如表10所示，日内差的CV(％)的平均值为0.64％、日间差的CV(％)的平均值为1.67％。据报道，J.Chromato.、432卷、340页、1988年记载的HPLC法的日内差和日间差为2.503％和3.898％，所以本发明的咪唑立宾测定方法是HPLC法同等以上的能够以良好精度进行测定的方法。

【表10】

产业上的可利用性

本发明提供了测定咪唑立宾和/或利巴韦林的简单方法。

序列表

<110>旭化成制药株式会社

<120>咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法

<130>X1071061

<140>

<141>

<160>38

<210>1

<211>312

<212>PRT

<213>泰国伯克霍尔德氏菌DSM 13276

<400>1

<210>2

<211>939

<212>DNA

<213>泰国伯克霍尔德氏菌DSM 13276

<221>

<222>(0001)..(936)

<400>2

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>未知

<223>Xaa表示任意的氨基酸

<400>5

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>未知

<223>Xaa表示任意的氨基酸

<400>6

<210>7

<211>487

<212>PRT

<213>枯草杆菌ATCC23867

<223>

<400>7

<210>8

<211>1467

<212>DNA

<213>枯草杆菌ATCC23867

<221>

<222>(0001)..(1464)

<400>8

<210>9

<211>489

<212>PRT

<213>0ceanobacillus iheyensis DSM14731

<223>

<400>9

<210>10

<211>1470

<212>DNA

<213>Oceanobacillus iheyensis DSM14731

<221>

<222>(0001)..(1467)

<400>10

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<400>11

<210>12

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<400>12

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

<210>23

<211>11

<212>PRT

<213>未知

<400>23

<210>24

<211>17

<212>PRT

<213>未知

<400>24

<210>25

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

<210>26

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

<210>27

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>28

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>29

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>30

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>31

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>32

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>33

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>34

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>35

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>36

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>37

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

<210>38

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

Claims (14)

1.一种咪唑立宾和/或利巴韦林的测定方法，其包括下述(1)、(2)和(3)各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化产生一磷酸咪唑立宾和/或一磷酸利巴韦林，所述第一酶为序列编号1的酶；

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾和/或一磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与该一磷酸咪唑立宾和/或一磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述＜a＞～＜c＞中任意一个反应，所述第二酶为序列编号7的酶、或序列编号9的酶、或序列为BsuIMPDH［V432I、K449I］、BsuIMPDH K345N、BsuIMPDH［D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E］或BsuIMPDH L367I的酶，其中BsuIMPDH由序列表序列编号7的氨基酸序列构成；

＜a＞不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾抑制的反应，

＜b＞不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸利巴韦林抑制的反应，

＜c＞不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾和一磷酸利巴韦林这两者抑制的反应；和

(3)检测第二反应受抑制程度的工序；

所述第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

2.一种咪唑立宾的测定方法，其中，所述方法包括下述(1)、(2)和(3)各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对咪唑立宾进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的咪唑立宾进行磷酸化产生一磷酸咪唑立宾，所述第一酶为序列编号1的酶；

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化该第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾与第二酶接触，使第二反应受到与一磷酸咪唑立宾的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，其不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾抑制，所述第二酶为序列编号7的酶、或序列编号9的酶、或序列为BsuIMPDH［V432I、K449I］、BsuIMPDH K345N、BsuIMPDH［D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E］或BsuIMPDH L367I的酶，其中BsuIMPDH由序列表序列编号7的氨基酸序列构成；和

(3)检测第二反应受抑制程度的工序；

所述第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

3.一种利巴韦林的测定方法，其中，所述方法包括下述(1)、(2)和(3)各工序：

(1)包括第一反应的工序，在所述第一反应中，在能够对利巴韦林进行磷酸化的第一酶的存在下，对试样中可能含有的利巴韦林进行磷酸化产生一磷酸利巴韦林，所述第一酶为序列编号1的酶；

(2)抑制第二反应的工序，其中，在能够催化该第二反应的第二酶的存在下，进行第二反应时，使上述第一反应生成的一磷酸利巴韦林与第二酶接触，使第二反应受到与一磷酸利巴韦林的存在量对应的程度的抑制，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，其不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸利巴韦林抑制，所述第二酶为序列编号7的酶、或序列编号9的酶、或序列为BsuIMPDH［V432I、K449I］、BsuIMPDH K345N、BsuIMPDH［D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E］或BsuIMPDH L367I的酶，其中BsuIMPDH由序列表序列编号7的氨基酸序列构成；和

(3)检测第二反应受抑制程度的工序；

所述第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

4.如权利要求1～3任一项所述的测定方法，其中，第一酶来自泰国伯克霍尔德氏菌。

5.如权利要求1～3任一项所述的测定方法，其中，第二酶来自枯草杆菌或Oceanobacillus iheyensis。

6.一种咪唑立宾和/或利巴韦林的磷酸化方法，该方法使用下述酶：

能够对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成。

7.一种咪唑立宾的磷酸化方法，该方法使用下述酶：

能够对咪唑立宾进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成。

8.一种利巴韦林的磷酸化方法，该方法使用下述酶：

能够对利巴韦林进行磷酸化的酶，其由序列表序列编号1的氨基酸序列构成。

9.一种测定用组合物，其含有下述成分：

(A1)第一酶，其能够催化对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化产生一磷酸咪唑立宾和/或一磷酸利巴韦林的第一反应，所述第一酶为序列编号1的酶；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其能够催化第二反应，所述第二反应是与上述第一反应不同的反应，是下述＜a＞～＜c＞中任意一个反应，所述第二酶为序列编号7的酶、或序列编号9的酶、或序列为BsuIMPDH［V432I、K449I］、BsuIMPDH K345N、BsuIMPDH［D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E］或BsuIMPDH L367I的酶，其中BsuIMPDH由序列表序列编号7的氨基酸序列构成，

＜a＞不受咪唑立宾抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾抑制的反应，

＜b＞不受利巴韦林抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸利巴韦林抑制的反应，

＜c＞不受咪唑立宾和利巴韦林这两者抑制，但受上述第一反应生成的一磷酸咪唑立宾和一磷酸利巴韦林这两者抑制的反应；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类；

所述第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

10.如权利要求9所述的组合物，其中，该组合物是含有下述成分的咪唑立宾测定用组合物，所述成分是：

(A1)第一酶，其能够催化对咪唑立宾进行磷酸化产生一磷酸咪唑立宾的第一反应，所述第一酶为序列编号1的酶；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其催化与上述第一反应不同的反应，其不受咪唑立宾抑制，但受一磷酸咪唑立宾抑制，所述第二酶为序列编号7的酶、或序列编号9的酶、或序列为BsuIMPDH［V432I、K449I］、BsuIMPDH K345N、BsuIMPDH［D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E］或BsuIMPDH L367I的酶；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类；

所述第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

11.如权利要求9所述的组合物，其中，该组合物是含有下述成分的利巴韦林测定用组合物，所述成分是：

(A1)第一酶，其能够催化对利巴韦林进行磷酸化产生一磷酸利巴韦林的第一反应，所述第一酶为序列编号1的酶；

(A2)磷酸供体；

(A3)金属离子；

(A4-1)第二酶，其催化与上述第一反应不同的反应，其不受利巴韦林抑制，但受一磷酸利巴韦林抑制，所述第二酶为序列编号7的酶、或序列编号9的酶、或序列为BsuIMPDH［V432I、K449I］、BsuIMPDH K345N、BsuIMPDH［D29N、S33Y、T158S、T270A、V387E］或BsuIMPDH L367I的酶；

(A4-2)肌苷5’一磷酸；以及

(A4-3)NAD(P)类；

所述第二酶是肌苷5’一磷酸脱氢酶。

12.如权利要求9～11任一项所述的组合物，其中，在该测定用组合物中，下述3种成分之中任意一种以上是在即将测定前加入的：

(A4-1)第二酶、

(A4-2)肌苷5’一磷酸、以及

(A4-3)NAD(P)类。

13.如权利要求9～11任一项所述的组合物，其中，能够催化对咪唑立宾和/或利巴韦林进行磷酸化的第一反应的第一酶来自泰国伯克霍尔德氏菌。

14.如权利要求9～11任一项所述的组合物，其中，能够催化第二反应的第二酶来自枯草杆菌或Oceanobacillus iheyensis。

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