JPWO2014142261A1 - 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この核酸増幅技術の中で代表的な技術であるポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;PCR)法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等の幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。PCR法は、変異型遺伝子の検出や、DNAのメチル化の解析にも応用されている。
また、LAMP法やICAN法などの等温核酸増幅法は特別な機器を必要としないことから、より安価な核酸検出法として使用されている。
さらに近年になり行われるようになったゲノム全体の構造解析においては、特に希少な試料からの解析を行う上で、全ゲノム増幅法は重要な技術である。
[1]二本鎖核酸の切断方法であって、下記(i)〜(iii)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドをミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用させ、当該二本鎖核酸の両鎖をミスマッチ塩基対部位で切断することを特徴とする、方法:
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
[2]ミスマッチ塩基対が、二本鎖核酸上、通常の塩基対合を行う2個の塩基対の間に存在する、連続して1以上8以下のミスマッチ塩基対である、[1]に記載の方法、
[3]下記(a)〜(c)を含む組成物:
(a)DNAポリメラーゼ;
(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(c)下記(i)〜(iii)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド:
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
[4]核酸の増幅方法であって、下記(a)〜(b)の工程を含む方法:
(a)[3]に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程;及び
(b)工程(a)により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程、
[5]核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、等温核酸増幅法、又はMDA(multiple displacement amplification)法で実施される[4]に記載の方法、
[6]下記(A)〜(C)からなる群より選択されるポリペプチド:
(A)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、77番目のトリプトファンが他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性するポリペプチド;
(B)前記(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、77番目のアミノ酸残基を除く1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(C)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
[7]下記(A)〜(C)からなる群より選択される、[6]記載のポリペプチド:
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、77番目のフェニルアラニンを除く1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(C)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
[8]核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法であって、下記の(a)〜(d)の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む方法:
(a)前記特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に1個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド;
(b)DNAポリメラーゼ;
(c)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(d)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
[9]核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、又は等温核酸増幅法である、[8]に記載の方法、
[10]ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、下記(i)〜(vi)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドである、[8]に記載の方法;
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(iv)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(v)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、77番目のフェニルアラニンを除く1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(vi)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
[11]標的DNAを優先的に増幅する方法であって、当該標的DNAと1個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列のDNAの増幅を[8]記載の方法で抑制することを特徴とする方法、
[12]野生型塩基配列のDNAと、当該DNAに一塩基多型変異が生じたDNAとを区別して増幅する目的に使用される[11]に記載の方法、
[13]一塩基多型変異が、癌化、又は癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異である、[12]に記載の方法、および
[14]DNA増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、又は等温核酸増幅法で実施される[11]に記載の方法
に関する。
ここで、ミスマッチエンドヌクレアーゼの活性は、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を基質として測定することができる。具体的には、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を調製した後、ミスマッチエンドヌクレアーゼに対して過剰量の当該二本鎖核酸をミスマッチエンドヌクレアーゼと反応させ、単位時間当たりの切断核酸量を測定することで活性測定が実施される。切断された二本鎖核酸は、電気泳動などにより切断を受けなかった核酸と分離して定量することが可能である。切断を受けた場合にのみ蛍光強度の増加が検出できるように蛍光物質と消光物質とで二重に標識した二本鎖核酸を使用すれば、反応溶液中の蛍光強度を適当な時間ごとに測定することにより活性を簡便に測定することができる。また、基質となる二本鎖核酸の中のミスマッチ塩基対の塩基を変えることで、特定のミスマッチ塩基対に対する切断活性を調べることも可能である。
したがって、本発明はさらに、下記(a)〜(d)を含む核酸増幅反応用組成物を提供する:
(a)特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に1個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド;
(b)DNAポリメラーゼ;
(c)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(d)下記(i)〜(xii)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド:
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、または75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、またさらに好ましくは95%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(iv)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(v)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、77番目のフェニルアラニンを除く1〜10個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(vi)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、または75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、またさらに好ましくは95%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(vii)配列表の配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(viii)配列表の配列番号7に記載のアミノ酸配列において1〜10個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(ix)配列表の配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、または75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、またさらに好ましくは95%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(x)配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(xi)配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列において1〜10個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(xii)配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列に対して50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、または75%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、またさらに好ましくは95%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。上記の組成物は、さらに反応緩衝剤、2価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、及びインターカレーティング色素から選択される少なくとも1種を含んでもよい。また、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいてもよい。
Pyrococcus furiosusのゲノムDNAの調製は、日本特許第3742659号公報の実施例1に記載の方法に従い行った。Thermococcus barophilus、およびMethanocaldococcus jannaschiiのゲノムDNAの調製は、菌株としてThermococcus litoralisの代わりにThermococcus barophilus、又はMethanocaldococcus jannaschiiを使用する以外は国際公開第02/22831号パンフレットの実施例8に記載の方法に従って行った。なお、これらの菌株は、ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンGmbH(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)より購入可能である。
(1)PF0012の発現用プラスミド pET−PF12の作製
PF0012タンパク質の機能解析を行うため、大腸菌での強制発現系を構築した。Genbank Acc.NC_003413で公開されているPyrococcus furiosus PF0012遺伝子のタンパク質翻訳領域(塩基番号11810−12610)をIn―Fusion(登録商標) HD Cloning Kit(タカラバイオ社)を用いてクローニングするため、2種のプライマー、PF12FとPF12Rを設計した。PF0012のアミノ酸配列を配列番号1に、プライマーPF12FとPF12Rの塩基配列をそれぞれ配列番号3、4に示す。Pyrococcus furiosusのゲノムDNAを鋳型として、これらのプライマーを用いてPrimeSTAR(登録商標) HS DNA Polymerase(タカラバイオ社)を使用して当該領域を増幅した。この増幅領域の塩基配列を配列番号5に示す。この増幅断片をIn―Fusion(登録商標) HD Cloning Kitを用いてプラスミドpET15b(メルクミリポア社)のNdeI、BamHI切断サイト間に挿入した。このIn−Fusion反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性となったクローンから、PF0012発現プラスミド pET−PF12を分離した。このプラスミドを保持する大腸菌の粗抽出液から、後述の実施例2記載の方法によりミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が検出できた。しかしこのプラスミドは非常に安定性が悪く、内部欠失を高頻度で起こすため、タンパク質生産には不適だった。
pET−PF12を用いたPF0012タンパク質の発現が安定しなかったため、PF0012のアミノ酸配列を大腸菌型のコドンでコードする塩基配列を設計し、この配列を含むDNAを人工合成した。このDNAの塩基配列を配列番号6に示す。このDNAを制限酵素NdeI、BamHIで切断した後、精製を行い、得られたDNA断片をプラスミドpET15bの同制限酵素部位間にDNA Ligation Kit <Mighty Mix>(タカラバイオ社)を用いて挿入した。このLigation反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン耐性となったクローンを選択した。このクローンから最適化PF0012発現プラスミドpET−optPF12を得た。
プラスミドpET−optPF12で大腸菌BL21 DE3株を形質転換しアンピシリン耐性となったクローンを分離した。得られた新鮮な単一コロニーをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地(以下LB−AP培地と称する)2mlに接種し37℃で終夜培養を行った。終夜培養液500μlを50mlのLB−AP培地に加えて37℃で3時間培養した後、培養液に終濃度1mMのIPTGを加えてさらに37℃で3時間培養した。培養終了後、6000×g 10分の遠心分離を行って培養液より菌体を採取した。
上記で得られた菌体を3mlの50mM Tris・HCl pH7.5、100mM NaCl溶液(以下Buffer Aと称する)に懸濁し、VP―5S Ultras. Homogenizer(TAITEC社)を用いて超音波破砕を行った。30秒間の超音波処理を3回繰り返す操作を行い、懸濁液が透明になることを確認した。
超音波破砕後の懸濁液を95℃ 10分加温し易熱性タンパク質を変性させ、17000×g 10分遠心し上清を回収した。こうして得た粗抽出液に対して500μlのNi−NTA Agarose(Qiagen社)を添加して4℃で2時間緩やかに撹拌した。この樹脂をエコノパック(登録商標)カラム(Bio−rad社)に充てんし、5mMイミダゾールを含むBuffer A 20mlで洗浄した。洗浄後1mlの300mMイミダゾールを含むBuffer AでPF0012タンパク質を溶出した。溶出液を4℃、Buffer Aで2回透析し、さらに50%Glycerolを含むBuffer Aで4℃終夜透析し、PF0012タンパク質溶液を得た。
(1)PF0012相同タンパク質の発現用プラスミドpET−TBA、pET−MJAの作製
古細菌に属するThermococcus barophilus、Methanocaldococcus jannaschiiの2つの菌株からPF0012相同タンパク質の分離を目指して、これらをコードする領域のクローニングを行った。この2つの株由来のPF0012相同タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号7、8に示す。
それぞれ、Genbank Acc.CP002372.1、Genbank Acc.NC_000909.1にて公開されている塩基配列情報より、各々のPF0012相同タンパク質の翻訳領域に相当する配列情報(TERMP_01877:塩基番号1674836−1675591、MJ_0225:塩基番号215449−216240)を取得し、対応遺伝子をクローニングするためのプライマーの設計及び作製を行った。TERMP_01877遺伝子のクローニングにはTBA1877F、TBA1877Rのプライマー対、MJ_0225遺伝子のクローニングにはMJ255F、MJ255Rのプライマー対を使用した。それぞれのプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号9、10、11、12に示す。
Thermococcus barophilus、Methanocaldococcus jannaschiiのゲノムDNAを鋳型として、前記のプライマー対とPrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(タカラバイオ社)を使用して当該領域を増幅した。増幅されたDNAの配列を塩基配列13、14に示す。上述のpET−PF12の作製と同様に、この増幅DNAをそれぞれプラスミドpET15bへ挿入し、プラスミドpET−TBA、プラスミドpET−MJAを作製した。
PF0012相同タンパク質の発現、精製は、使用するプラスミドをpET−TBA、pET−MJAに変更し、菌体破砕後の易熱性タンパク質を沈殿させるための高温処理を75℃ 10分に変更する以外は、上述のPF0012タンパク質の発現の場合と同様に行い、PF0012相同タンパク質であるTERMP_01877タンパク質、MJ_0225タンパク質を得た。
(1)変異型PF0012の発現用プラスミド pET−optPF12−W77Fの作製
PF0012タンパク質の相同タンパク質NucSの解析(The EMBO Journal、2009年、第28巻、p.2479−2489)より、ssDNA結合領域と考えられたPF0012タンパク質(配列番号1)の77番目のアミノ酸トリプトファン(コドンTGG)をフェニルアラニン(コドンTTT)に変換した変異型PF0012をコードする遺伝子を作製した。この変異型PF0012タンパク質(以下、W77F変異体と記載する)のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
変異導入用のプライマーとして配列番号15、16に示されるmutF1、mutR1を作製した。pET−optPF12を鋳型として、前記のプライマーとPrimeSTAR(登録商標) Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ社)を用いてPCRを行った。この増幅反応液を用いて大腸菌JM109を形質転換し、アンピシリン耐性となったクローンから、W77F変異体発現プラスミドpET−optPF12−W77Fを得た。
W77F変異体の発現、精製は、使用するプラスミドをpET−optPF12−W77Fに変更した以外は、上述の野生型PF0012タンパク質の場合と同様に行った。
(1)切断活性測定用基質の作製1
PF0012タンパク質のミスマッチ切断活性を確認するため、活性検出用の基質を作製した。
FAMおよびROXでそれぞれ5’末端を標識した2本の合成DNAを混合、アニールしたものを基質として使用した。ROX標識DNAはROX−probe−G、ROX−probe−A、ROX−probe−T、ROX−probe−Cの4種を合成した。これら4種それぞれの塩基配列を配列番号17、18、19、20に示す。ROX−probe−G、ROX−probe−A、ROX−probe−T、ROX−probe−Cは5’末端から11番目の塩基以外は同じ塩基配列をしており、11番目にはそれぞれG、A、T、Cの塩基が挿入されている。FAM標識DNAはFAM−probe−G、FAM−probe−A、FAM−probe−T、FAM−probe−Cの4種を合成した。それぞれの塩基配列を配列番号21、22、23、24に示す。FAM−probe−G、FAM−probe−A、FAM−probe−T、FAM−probe−Cも、同じく5’末端から15番目の塩基(それぞれG、A、T、C)以外は同じ配列である。これらのうちROX標識DNAとFAM標識DNAをそれぞれ1種選んで混合してハイブリダイズさせ、ミスマッチ切断活性を検出するための基質とした。これらの基質はROXで標識された塩基から数えて11番目の塩基以外で塩基対を形成し、11番目の塩基に1か所のミスマッチ塩基対を保有する二本鎖DNAである。
5μM ROX標識DNA1種 1μl、5μM FAM標識DNA1種 1μl、10×Ex taq Buffer(タカラバイオ社 TaKaRa Ex Taq(登録商標)に付属)1μl、PF0012タンパク質とH2Oを加えることで最終反応液量10μlとした。この反応液を60℃で1時間保温した後、反応を停止させて、10%ポリアクリルアミド変性ゲルで電気泳動を行った。泳動後、ゲル中の蛍光シグナルをFMBIO(登録商標)(日立ソリューションズ社)で検出した。
両方の検出系において、G−G、G−T、T−G、T−Tのミスマッチの存在する基質を使用した場合のみ、低分子領域に切断断片と思われるDNA由来の蛍光シグナルが観察された。このことはPF0012タンパク質がG−G、G−T、T−G、T−Tのミスマッチ部位を認識し、その付近でDNAの両鎖を切断する活性を持つことを示している。
また、切断断片によるシグナルがスメアパターンを示さないことから、PF0012タンパク質はエキソヌクレアーゼ活性を有しないと考えられた。さらに、単一の蛍光標識DNAのみを使用した場合にも低分子領域に蛍光シグナルは観察されないことから、PF0012タンパク質は一本鎖のDNAに対する切断活性もほぼ有しないことが明らかになった。
PF0012タンパク質は切断できるミスマッチの塩基に選択性を持つものの、ミスマッチに対する特異性が高く、通常の塩基対を形成する二本鎖DNA、および一本鎖のDNAに対しては反応性が低いことが明らかとなった。本タンパク質の高いミスマッチへの特異性は核酸増幅反応への添加という点で、反応阻害を起こしにくく有利である。
PF0012によるミスマッチ切断活性を継時的に観察するため、切断により蛍光シグナルを発する基質を作製した。
5’末端に消光物質であるeclipse、3’末端にFAMを結合させた配列番号25、26、27、28で示される塩基配列のDNA、DD−probe−G、DD−probe−A、DD−probe−T、DD−probe−Cを合成した。さらに相補鎖側のtemplate DNAとして配列番号29、30で示されるtemplate−G、template−Tを作製した。蛍光標識されたDNAとtemplate DNAを混合することで、5’末端の塩基から5番目にミスマッチ塩基対を保有する二本鎖DNA基質を作製した。
5μMの蛍光標識されたDNA(DD−probe−G、DD−probe−A、DD−probe−T、DD−probe−Cのいずれか1つ)1.5μl、25μM template−G 1μl、10×Ex taq Buffer 2.5μl、PF0012タンパク質とH2Oを加えることで25μlとした。この反応液を55℃で1時間反応させ、1分ごとに蛍光強度の変化を観察した。反応および蛍光シグナルの測定にはThermal Cycler Dice(登録商標)Real Time System(タカラバイオ社)を使用した。
実際にG−G、G−Tミスマッチの存在する基質を使用した場合のみ蛍光強度の上昇が観察でき、G−AミスマッチやG−C塩基結合を保持する基質では蛍光強度の上昇は観察できなかった。この実験においてもPF0012タンパク質はG、Tの介在するミスマッチを切断する活性を持つことが示された。また、個々のミスマッチ塩基対に対する切断活性は、反応開始時点の初速度、つまり、直線性を保持している区間の傾きにそれぞれの基質の蛍光強度の補正を加えた値で表される。図2の曲線から算出される反応の初速度の比較からは、PF0012タンパク質のG−Gミスマッチに対する切断活性は、G−Tミスマッチに対するより2倍程度高いことが分かった。
(1)PF0012相同タンパク質によるミスマッチ切断反応
Thermococcus barophilus、Methanocaldococcus jannaschii由来のPF0012相同タンパク質についても、ミスマッチ切断活性およびその塩基特異性について検証した。
酵素タンパク質をPF0012相同タンパク質(TERMP_01877タンパク質、MJ_0225タンパク質)に変更した以外は、PF0012タンパク質によるミスマッチ切断反応の継時的観察と同様に行い、ミスマッチ切断活性を蛍光強度の増加を指標に観察した。
その結果、図3に示す通り、Thermococcus barophilus、Methanocaldococcus jannaschii由来のタンパク質についても、PF0012タンパク質と同様にG、Tの介在するミスマッチ部位を切断する活性を持つことが示された。
PF0012タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を認識してその両鎖を切断することができる。またこのタンパク質は耐熱性であるため、PCRのような高温の反応系に直接添加することが可能である。PCR中に生じたミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸を特異的に切断することで、増幅反応で生じるエラーを抑制することが期待できる。
PCRの反応液にPF0012タンパク質を添加し、Thermus thermophilus HB8のゲノムDNAを鋳型に4個のプライマー対を用いてPCRを行った。使用したプライマー対はTth1F(配列番号31)とTth1R(配列番号32)、Tth2F(配列番号33)とTth2R(配列番号34)、Tth3F(配列番号35)とTth3R(配列番号36)、Tth4F(配列番号37)とTth4R(配列番号38)である。Thermus thermophilus HB8 Genomic DNA Solution(タカラバイオ社)を鋳型として、上記プライマー対とPF0012タンパク質を添加し、TaKaRa Taq(登録商標) Hot Start Version(タカラバイオ社)を用いて、98℃10秒、55℃30秒、72℃1分の条件で30サイクル行うPCRを行った。
上記で増幅したDNA断片をNucleoSpin(登録商標)Gel and PCR Clean―up(タカラバイオ社)を用いて精製し、そのDNA断片をpMD19(simple)プラスミド(タカラバイオ社)にTAクローニングを行った。各増幅DNA断片につき96個、合わせて384個のクローンのプラスミドについて増幅領域の塩基配列決定を行った。
目的DNAを含まないものや塩基配列解析操作時に生じた誤りと考えられる配列情報を取り除いたのち、増幅領域の塩基配列を元のゲノムDNA配列と比較し、異なった塩基数を解析された総塩基数で割ってエラー率とした。
PF0012タンパク質を含まないPCRから増幅されたDNA中には、128826bp中71bpの間違いが見いだされエラー率は0.055%であった。PF0012タンパク質を添加したPCRでは97112bp中28bpの間違いが見いだされ、エラー率は0.029%であった。
このように、PCRの反応液にPF0012タンパク質を添加するだけで、核酸増幅によって生じるエラーを減らすことが可能であった。
PF0012タンパク質はもともとG、Tを含むミスマッチ塩基対に対して選択性を持っている。このタンパク質に変異を導入することで、認識するミスマッチ塩基対をさらに限定させた酵素タンパク質を作製することを試みた。
実施例1で作製されたW77F変異体のミスマッチ切断活性、およびその塩基特異性を前述の蛍光DNA基質を用いて観察した。PF0012タンパク質に変えて、W77F変異体を使用し、DD−probe−G、DD−probe−Tとtemplate−G、template−Tを組み合わせて実験を行った。そのほかの反応条件は実施例2(4)の継時的ミスマッチ切断活性の測定と同様に行った。
(1)鋳型プラスミドの調製
変異遺伝子増幅試験のため、鋳型となるプラスミドを調製した。
Genbank Acc.NG_017013で公開されているhuman TP53遺伝子領域の配列情報から配列番号39、40でそれぞれ示される2種のプライマー、TP53CloneFとTP53CloneRを設計、合成した。これらのプライマーを用いてhuman genomic DNA(Clontech社)を鋳型として、PrimeSTAR(登録商標) HS DNA Polymeraseを使用して当該領域を増幅した。増幅した領域の塩基配列情報は配列番号41に示す。この増幅したDNA断片をプラスミドpMD19(simple)(タカラバイオ社)にTAクローニングを行った。得られたプラスミドをpTP53(G)とした。このpTP53(G)を鋳型にTP53遺伝子の増幅領域の99番目の塩基GをAに変換するため、変異導入用プライマーとして配列番号42、43に示されるTP53AF、TP53ARを設計、作製した。プラスミドpTP53(G)を鋳型にこの変異導入用プライマー対とPrimeSTAR(登録商標) Mutagenesis Basal Kitを用いて目的部位のGをAに変換した変異体プラスミドpTP53(A)を作製した。
特異的変異型遺伝子切断用オリゴヌクレオチドとして、pTP53(G)上の変異を導入した部位の5´側に8塩基、3´側に7塩基伸ばした領域の相補鎖の配列を持ち、変異部位に対応するCをGに変換したオリゴヌクレオチドを設計した。本オリゴヌクレオチドはpTP53(G)にハイブリダイズするとG−Gのミスマッチを生じる。また、このオリゴヌクレオチドからの伸長反応が起こらないように、オリゴヌクレオチドの3’末端のヒドロキシ基はアミノ基に置換されている。このオリゴヌクレオチドを特異的SNP切断用オリゴヌクレオチド、TP53degと命名した。TP53degの塩基配列を配列番号44に示す。
プラスミドpTP53(G)単独、プラスミドpTP53(A)単独、ならびに両プラスミドを混合したもののそれぞれを鋳型として、W77F変異体とTP53degを添加しPCRを行った。プラスミドの混合比はpTP53(G) 100ngに対し、pTP53(A) 100ng(1/1)、10ng(1/10)、1ng(1/100)、100pg(1/1000)、10pg(1/10000)を混合したものをそれぞれ準備した。反応液はRoche社のLightCycler(登録商標) 480 High Resolution Melting Masterに従って調製した。増幅用プライマーとして配列番号45、46でそれぞれ示されるプライマー TP53AmpF、TP53AmpRを終濃度3μM、特異的変異型遺伝子切断用オリゴヌクレオチドとしてTP53degを終濃度で3μM添加し、W77F変異体を加えて最終容量を20μlとした。PCRおよび蛍光検出はRosch社のLC480で行った。PCRの反応条件は、95℃ 5分の予温の後、95℃ 10秒、95℃ 20秒、72℃ 20秒の3step反応を40cycle行い、最後に解離反応として95℃ 1分、40℃ 1分の後、50℃から95℃まで継時的に温度を上昇させ、各温度の蛍光強度を観察した。また、W77F変異体を添加しない反応液で同様の測定を行った。
このPCRの増幅曲線を示したのが図5となる。また、この測定結果から計算されるCt値を表1に示す。反応液にW77F変異体を含まない場合には、鋳型の混合比によるCt値の変化はほとんど観察されなかった。一方、W77F変異体を添加してPCRを実施した場合は、プラスミドpTP53(G)を単独で鋳型に用いる反応は抑制を受けて、Ct値で10以上の遅れとなった。このことはこのプラスミドからのDNAの増幅がW77F変異体によって1000倍以上抑制されていることを示している。一方、プラスミドpTP53(A)を単独で鋳型に用いる増幅についてはW77F変異体を加えた場合でも、Ct値はほぼ変化せず、ほとんど抑制を受けなかった。また、プラスミド混合物を鋳型とした場合には、pTP53(A)の量に応じた増幅が観察できた。このことは、W77F変異体はPCRの反応液中にpTP53(G)とTP53degが形成するG−Gのミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸は切断するにもかかわらず、pTP53(G)とTP53degが形成するG−Aのミスマッチ塩基対に対してはほとんど切断活性を示さないことを示している。また、ミスマッチを持たない核酸に対しては、W77F変異体は増幅阻害効果を示さないことが分かった。さらに、pTP53(G)に対して1/10000のコピー数のpTP53(A)が含まれている場合にもCt値はpTP53(G)プラスミド単独の場合より小さく、W77F変異体によって1/10000の混入比率の鋳型からも変異型(A)の遺伝子領域が特異的に増幅されていることを示唆している。
W77F変異体を添加しPCRを行った場合は、図6b)にあるようにプラスミドpTP53(A)の混合比率が1/100以上の場合にはpTP53(A)を単独で鋳型に用いた場合の波形とほぼ同じとなり、pTP53(A)のみを鋳型とした増幅のみが起こっていることが示された。1/1000、1/10000の混合比率の場合にもpTP53(A)に由来すると思われる89.6℃のピークが観察でき、同時にヘテロ2重鎖に由来すると思われる88.5℃付近の幅の広いピークもみられた。このことは、これらの混入率の場合にもpTP53(A)由来の断片が優先的に増幅されていることを示している。
SEQ ID NO:2 ; The amino acid sequence of PF0012 Y77F mutant
SEQ ID NO:3-4 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:5 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning PF0012 gene.
SEQ ID NO:6 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning a designed sequence deduced from PF0012 amino acid sequence.
SEQ ID NO:7 ; The amino acid sequence of TERMP_01877 from Thermococcus barophilus
SEQ ID NO:8 ; The amino acid sequence of MJ_0225 from Methanocaldococcus jannaschii
SEQ ID NO:9-12 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:13 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning TERMP_01877 gene.
SEQ ID NO:14 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning MJ_0225 gene.
SEQ ID NO:15-16 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:17-30 ; A designed oligonucleotide DNA for assay of a mismatch nuclease activity.
SEQ ID NO:31-40 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:41 ; The nucleic acid sequence of inserted DNA in the circular double stranded DNA for cloning partial TP53 gene.
SEQ ID NO:42-43 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
SEQ ID NO:44 ; A designed oligonucleotide DNA for suppression of amplification of specific TP53 fragment
SEQ ID NO:45-46 ; A designed oligonucleotide primer for PCR
このPCRの増幅曲線を示したのが図5となる。また、この測定結果から計算されるCt値を表1に示す。反応液にW77F変異体を含まない場合には、鋳型の混合比によるCt値の変化はほとんど観察されなかった。一方、W77F変異体を添加してPCRを実施した場合は、プラスミドpTP53(G)を単独で鋳型に用いる反応は抑制を受けて、Ct値で10以上の遅れとなった。このことはこのプラスミドからのDNAの増幅がW77F変異体によって1000倍以上抑制されていることを示している。一方、プラスミドpTP53(A)を単独で鋳型に用いる増幅についてはW77F変異体を加えた場合でも、Ct値はほぼ変化せず、ほとんど抑制を受けなかった。また、プラスミド混合物を鋳型とした場合には、pTP53(A)の量に応じた増幅が観察できた。このことは、W77F変異体はPCRの反応液中にpTP53(G)とTP53degが形成するG−Gのミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸は切断するにもかかわらず、pTP53(A)とTP53degが形成するG−Aのミスマッチ塩基対に対してはほとんど切断活性を示さないことを示している。また、ミスマッチを持たない核酸に対しては、W77F変異体は増幅阻害効果を示さないことが分かった。さらに、pTP53(G)に対して1/10000のコピー数のpTP53(A)が含まれている場合にもCt値はpTP53(G)プラスミド単独の場合より小さく、W77F変異体によって1/10000の混入比率の鋳型からも変異型(A)の遺伝子領域が特異的に増幅されていることを示唆している。
Claims (14)
- 二本鎖核酸の切断方法であって、下記(i)〜(iii)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドをミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用させ、当該二本鎖核酸の両鎖をミスマッチ塩基対部位で切断することを特徴とする、方法:
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。 - ミスマッチ塩基対が、二本鎖核酸上、通常の塩基対合を行う2個の塩基対の間に存在する、連続して1以上8以下のミスマッチ塩基対である、請求項1に記載の方法。
- 下記(a)〜(c)を含む組成物:
(a)DNAポリメラーゼ;
(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(c)下記(i)〜(iii)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド:
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。 - 核酸の増幅方法であって、下記(a)〜(b)の工程を含む方法:
(a)請求項3に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程;及び
(b)工程(a)により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程。 - 核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、等温核酸増幅法、又はMDA(multiple displacement amplification)法で実施される請求項4に記載の方法。
- 下記(A)〜(C)からなる群より選択されるポリペプチド:
(A)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において、77番目のトリプトファンが他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性するポリペプチド;
(B)前記(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、77番目のアミノ酸残基を除く1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(C)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。 - 下記(A)〜(C)からなる群より選択される、請求項6記載のポリペプチド:
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、77番目のフェニルアラニンを除く1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(C)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。 - 核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法であって、下記の(a)〜(d)の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む方法:
(a)前記特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に1個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド;
(b)DNAポリメラーゼ;
(c)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(d)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。 - 核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、又は等温核酸増幅法である、請求項8に記載の方法。
- ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、下記(i)〜(vi)からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドである、請求項8に記載の方法;
(i)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(iii)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;
(iv)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(v)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、77番目のフェニルアラニンを除く1〜10個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(vi)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して50%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列における77番目のトリプトファンに対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。 - 標的DNAを優先的に増幅する方法であって、当該標的DNAと1個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列のDNAの増幅を請求項8記載の方法で抑制することを特徴とする方法。
- 野生型塩基配列のDNAと、当該DNAに一塩基多型変異が生じたDNAとを区別して増幅する目的に使用される請求項11に記載の方法。
- 一塩基多型変異が、癌化、又は癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異である、請求項12に記載の方法。
- DNA増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、又は等温核酸増幅法で実施される請求項11に記載の方法。
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