JP4986358B2 - ミスマッチエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子およびその使用方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
米国特許法第２０２条（ｃ）は、国立衛生研究所、交付番号、ＮＩＨ ＣＡ７１４２６からの基金を用いて一部なされた、本明細書に記載の発明において米国政府が一の権利を有することを承認するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は標的とする核酸中の変異を検出するための物質および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼをコードする核酸分子および遺伝的疾患および癌の遺伝的スクリーニングを容易にする該酵素の使用方法を提供する。この方法はまた、遺伝的多形態の検出にも有用である。
【０００３】
（従来技術）
本発明の属する分野における現状をより十分に記載するために、数冊の刊行物をカッコ内の数字によって本願において引用する。これらの文献の完全な書誌的事項は、本明細書の終わりに見出される。これらの各刊行物の内容を出典明示することで本明細書の一部とみなす。
遺伝子内のヌクレオチドの配列は、その最も頻繁なものが、塩基対置換、フレームシフト変異および欠失または挿入である、数種類の方法のうちのいずれかで変異的に改変させるか、または「ミスマッチ」させることができる。これらの変異は放射線照射および変異誘発性化学物質などの環境因子によって誘発することができ；複製の間にＤＮＡポリメラーゼによって偶発的にエラーに付される。ＤＮＡ複製の信頼性は維持されないため、多数のヒト病態が起る。嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血およびある種の癌がＤＮＡ中の１個の塩基の変化により惹起され、異常的または非機能的蛋白の合成がもたらされる。
【０００４】
植物の高成長速度および植物中のＤＮＡインターカレーターの存在量はミスマッチおよびフレームシフト障害の傾向の増大を示唆する。植物および真菌は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者を攻撃する豊富な一本鎖特異的ヌクレアーゼを有することが知られている（９−１４）。これらのうちいくらかは、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）のヌクレアーゼαと同様に、ＤＮＡ組換えの間の遺伝子変換の一部を形成することが示唆されている（１５、１６）。これらのヌクレアーゼのうち、アスペルギルス・オリズエ（Aspergillus oryzue）から由来のＳ１ヌクレアーゼ（１７）、およびペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）から由来のＰ１ヌクレアーゼ（１８）、およびビグナ・ラジアタ（Vigna radiata）の子孫から由来のマン・ビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼ（１９−２２）が最も特徴付けられている。Ｓ１、Ｐ１およびマン・ビーン・ヌクレアーゼは主にｐＨ５.０付近で活性なＺｎ蛋白であるのに対して、ヌクレアーゼαはｐＨ８.０で活性である。バルキーな付加物の修復の場合、ＤＮＡ障害の一本鎖性特性が、植物酵素、ＳＰヌクレアーゼによって使用されていたようである。ホウレン草から精製されたヌクレアーゼＳＰは一本鎖ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅであって、中性のｐＨにてＴＣ６−４二量体およびシスプラチン障害のＤＮＡを切断できる（２３、２４）。
【０００５】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）における、塩基置換および不対合ＤＮＡループの障害は、メチル化指向性ロングパッチ修復システムによって修復される。このマルチ酵素システムにおける蛋白は、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳを含む（１、２）。このシステムは効果的であるが、Ｃ／Ｃ障害および４個よりも長いヌクレオチドのＤＮＡループは修復されない。ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬ蛋白は、細菌からヒトに至るまで保存されており、高等生物で同様の修復作用を遂行できるようである。ＭｕｔＳ／ＭｕｔＬシステムによって十分に修復されないいくらかの障害、およびショートパッチ修復システムがより望ましい遺伝子変換について、新規な能力を有する他のミスマッチ修復システムが必要である。
【０００６】
現在、変異分析に関する最も直接的な方法はＤＮＡ配列決定法であるが、それは最も骨が折れかつ費用もかかる。あらゆる実験試料で関連している可能性のある領域を配列決定するのは、通常、実用的ではない。それよりも、ある型の予備的スクリーニング法を用いて、変異を含有する試料のみを配列決定するために同定して標的とすることが一般的である。一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）は、天然ポリアクリルアミドゲルでの一本鎖野生型および変異体の配列間の移動度の差に基づいて、広範に使用されるスクリーニング法である。他の方法は天然ゲル（ヘテロ二本鎖分析）または変性ゲル（変性勾配ゲル電気泳動）での野生型／変異体ヘテロ二本鎖（対照ホモ二本鎖と比較）における移動度の相違に基づいている。試料調製は、これらのアッセイにおいて、比較的容易なわけであるが、電気泳動では、変異を含有する標的を同定するための基礎を形成する微妙であることが多い移動度の相違を生じさせるために、極めて正確な条件が必要とされる。もう一つ別の臨界的パラメーターは、スクリーニングすべき標的領域の大きさである。一般に、ＳＳＣＰを使用して、約２００−３００塩基より長くない標的領域がスクリーニングされる。単一塩基の変異を検出するＳＳＣＰの信頼性は多少不確実であるが、２００より小さい塩基の標的では恐らく７０〜９０％の範囲であろう。標的領域の大きさが増加するほど、検出率は減少し、例えば、長さが１８３ｂｐの標的についての８７％から３０７ｂｐの標的についての５７％までという一つの研究がある（３５）。一工程でより長い領域をスクリーニングする能力は、いずれの変異スクリーニング法の有用性をも高めるであろう。
【０００７】
現在用いられているスクリーニング技術のもう一つの型は、点変異を含有する実験用標的とハイブリッド形成する野生型プローブの間で形成されたヘテロ二本鎖中の不対合塩基の切断に基づいている。また、ミスマッチにおいてプローブの切断によって得られるサブフラグメントは、全長の切断されていないプローブと大きさが一般的に有意に異なり、しかも標準ゲルシステムで容易に検出されるので、切断生成物はゲル電気泳動によっても分析される。ミスマッチ切断は、化学的に（四酸化オスミウム、ヒドロキシルアミン）またはＲＮａｓｅＡを用いる毒性の小さな酵素代替物にて遂行されてきた。頻度はあまり大きくないが、内因的ｍＲＮＡ標的中の変異についてスクリーニングするために、またはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ標的中の変異を検出するために、ＲＮａｓｅＡ切断アッセイも用いられた。５０％を超える変異検出率が最初のＲＮａｓｅスクリーニング法について報告されている（３６）。
ＤＮＡ中の変異を検出するより新しい方法は、相補的標的核酸にハイブリダイズする２つの隣接するオリゴヌクレオチドを共有結合させるＤＮＡリガーゼに依存する。ミスマッチはライゲーションの部位で起きなければならない。オリゴヌクレオチドに依存する他の方法に関しては、ハイブリダイゼーションでの塩濃度および温度が非常に重要である。もう一つの考慮すべき事項は、ＤＮＡ濃度に対する添加される酵素の量である。
【０００８】
前記した方法は、正常配列または野生型配列などの、８０％を超えるバックグラウンド核酸で汚染されている核酸中の塩基変化を信頼性をもっては検出できない。汚染問題は、例えば、循環中で悪性細胞が極少量存在する場合の癌検出において重要である。今日用いられている方法は、臨床的状況において実際上適用されるべき十分な感度に欠ける。
ミスマッチ修復酵素を用いた遺伝子変異の検出法は、ＬｕＣｈａｎｇおよびＨｓｕによって記載されている。ＷＯ９３／２０２３３を参照のこと。誤対合Ａ／Ｇ残基を認識するＭｕｔＹ遺伝子の産物は、全ての塩基対ミスマッチにおいてニックを入れることができる「あらゆる型の酵素」として文献中に記載されたもう一つ別の酵素と組み合わせて使用されている。酵素は挿入および欠失を検出しない。また、あらゆる型の酵素は異なるミスマッチを異なる効率にて認識し、その活性はフランキングＤＮＡ配列によって悪影響を受け得る。従って、この方法は、所定のＤＮＡ分子中で生じ得る種々の変異を検出するための、ミスマッチ修復酵素および／またはＤＮＡグリコシラーゼの組み合わせのカクテルに依存する。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は標的とされるポリヌクレオチド鎖中の変異またはミスマッチを検出するための物質および方法を提供する。ミスマッチエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子およびその使用方法を開示する。本発明の核酸分子によりコードされるエンドヌクレアーゼを、標的とされる核酸鎖中の対合している塩基の改変をスクリーニングし、同定することを促進するゲルアッセイ系と組み合わせて用いて検出を行う。配列番号：１の配列を有する核酸の利用能は、かかるアッセイに用いるための多量の精製されたＣＥＬ Ｉ酵素の調製を容易にする。
本発明の好ましい具体例において、約４３ｋＤａで、長さが３０９個のアミノ酸のセルリから由来のエンドヌクレアーゼ蛋白をコードする、配列番号：１の配列を有する単離された核酸分子が提供される。このエンドヌクレアーゼ蛋白は複数のへリックスドメインおよびフレキシブルなカルボキシ末端領域を含む。核酸はＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれであってもよい。
【００１０】
本発明のゲノムクローンを単離するためのＤＮＡ分子もまた提供される。かかる配列はイントロンおよびエキソンを含むＣＥＬ Ｉ遺伝子の同定およびクローン化を促進し、そのエキソンがＣＥＬ Ｉ蛋白をコードし、配列番号：１の核酸と特異的にハイブリッド形成する。配列番号：１の核酸より転写される単離されたＲＮＡ分子もまた本発明の範囲内にある。
本発明のもう一つ別の態様において、ａ）配列番号：２の蛋白またはポリペプチドをコードする配列；ｂ）ａ）の相補的配列をコードする配列；ｂ）図２に示されるヌクレオチドの配列；およびｃ）ａ）またはｂ）の配列のいずれかのフラグメントを含む、ポリヌクレオチドが開示されている。
本発明の好ましい具体例において、約１０個および約２００個の間の長さのヌクレオチドの、配列番号：１と特異的にハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチドが提供される。
もう一つ別の具体例において、単離されたＣＥＬ Ｉ蛋白に対して免疫学的に特異的な抗体が提供される。該抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。
【００１１】
配列番号：１を含むプラスミドおよびベクターもまた本発明の範囲内にある。一の具体例において、ベクターはレトロウイルスベクターとすることができる。
本発明の好ましい具体例において、上記したプラスミドまたはベクターを宿主細胞中に導入することができる。この目的に適する宿主細胞は、限定されるものではなく、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、原核生物細胞、真菌細胞および哺乳動物細胞を包含する。
配列番号：１を含むトランスジェニック動物は本発明の中に含まれており、哺乳動物環境中でＣＥＬ Ｉ活性を評価するにおいて有用性を有する。
本発明の核酸を用いる方法も提供される。一の具体例において、ＣＥＬ Ｉ調節活性について試験化合物をスクリーニングする方法が提供される。ＣＥＬ Ｉをコードする核酸を発現する宿主細胞が提供される。その場合、宿主細胞をＣＥＬ Ｉ活性を調節すると思われる化合物と接触させ；ＣＥＬ Ｉ調節活性をＣＥＬ Ｉのエンドヌクレアーゼ活性における変化により評価される。
【００１２】
本発明の特に好ましい具体例において、一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列を含むポリヌクレオチドとハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドの変異していない配列との関係で、一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列中の変異を測定する方法が開示されている。該配列を増幅させ、検出可能なマーカーで標識化し、相互にハイブリッド形成させ、配列番号：１の配列を有する核酸に対して＞６０％の同一性を有する核酸分子によりコードされる植物エンドヌクレアーゼに曝し、変異の存在について分析する。もう一つ別の具体例において、エンドヌクレアーゼはＣＥＬ Ｉであり、配列番号：１によりコードされる。配列番号：１の配列を有する核酸の利用能は、上記した方法において用いるための、多量のＣＥＬ Ｉエンドヌクレアーゼの産生を促進することである。ＣＥＬ Ｉに対して６０％より大きな配列同一性を有する具体的なエンドヌクレアーゼは、ジンニア（Zinnia）からのＺＥＮ１、アラビドピス（Arabidopis）からのＢＦＮ１およびデイリリーからのＤＳＡ６によりコードされる。
【００１３】
ＣＥＬ Ｉに対応するミスマッチ特異的ヌクレオチドが１４種以上の植物種で検出されている。したがって、さらに多くの植物が配列番号：２と高いパーセンテージの同一性を有する蛋白を産生するヌクレアーゼ遺伝子を含有すると考えられる。このようにＣＥＬ Ｉ様活性を生成するためにこれらのオルトログヌクレアーゼ配列を使用することは本発明に関連すると考えられる。コード化されたＣＥＬ Ｉヌクレアーゼおよびそのオルトログは以下の活性：ｉ）ハイブリッド形成された配列の間のすべてのミスマッチの検出；ｉｉ）約１００ｂｐと約３ｋｂの間の長さのポリヌクレオチド鎖における配列の違いの認識；およびｉｉｉ）隣接するポリヌクレオチド配列により惹起される実質的な副作用のない標的ポリヌクレオチド配列中の変異の認識；を有する。
ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子は上記した方法にて評価することができる。該方法を用いて、遺伝的疾患および癌の素因に関連するＤＮＡ中の変化を同定するためのスクリーニングアッセイに供することができる。
本発明のもう一つ別の具体例において、エンドヌクレアーゼ活性有するＣＥＬ Ｉのイソ酵素が提供される。そのＣＥＬ Ｉイソ酵素は３９ｋｄの分子量を有し、セルリから単離される。
【００１４】
本発明のパラメーターをより明瞭に述べるために、以下の定義を用いる：
「エンドヌクレアーゼ」なる語はＤＮＡを内部で切断できる酵素をいう。
「塩基対ミスマッチ」なる語は、ワトソンおよびクリック塩基対合規則に従って核酸中で通常は形成されない塩基対の組合せを示す。例えば、ＤＮＡ中に一般的に見られる塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンおよびチミジンで扱う場合、塩基対ミスマッチとは、ＤＮＡ中に通常見られるＡ−ＴおよびＧ−Ｃ対以外の塩基組合せである。本明細書に記載されるように、ミスマッチは、例えば、シトシン残基が本来の対合パートナーであるグアニンに対抗するように向かいのもう一つ別のシトシンに見られる、Ｃ／Ｃを意味するように示すことができる。
「ＤＮＡ挿入または欠失」なる語は、挿入および欠失した塩基の領域にわたり相補性が維持されないような、ＤＮＡの２つの鎖間における「マッチした」塩基の存在または不存在をいう。
【００１５】
「相補的」なる語は、実質的に正常な塩基対合特性を示す２つのＤＮＡ鎖をいう。しかしながら、相補的ＤＮＡは１以上のミスマッチを含有していてもよい。
「隣接する核酸配列」なる語は、エンドヌクレアーゼ切断部位に対して５’側および３’側にある隣接する核酸配列をいう。
「多重分析」なる語は、前記の方法によるプールされたＤＮＡ試料の同時アッセイをいう。
Ｃ＞Ｔは、ミスマッチを生じさせるシトシン残基の代わりにチミジン残基を用いることを示す。ミスマッチまたは多型を生じさせるもう一つ別の塩基の代わりにいずれかの塩基を不適当に用いることもこのように示すことができる。
Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-6-カルボキシルローダミン（ＴＡＭＲＡ）は、ＤＮＡ分子量標準を標識するのに用いる蛍光染料であり、該標準は、順次、自動ＤＮＡ配列決定によって分析されるＤＮＡについての内部標準として利用される。
プライマーは、６-カルボキシフルオレセイン（６-ＦＡＭ）で蛍光標識することができる。別法として、プライマーは、４,７,２',７'-テトラクロロ-６-カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）で標識することもできる。他の代替ＤＮＡ標識法は、当該技術分野で知られており、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００１６】
本明細書中で用いる「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいい、一本鎖とした場合、その相補的配列の分子は線状または環状形態のいずれであってもよい。核酸分子について述べる場合、個々の核酸の配列または構造はその配列を５’から３’の方向にて示す通常の取り決めに従って記載する。本発明の核酸に関して、時に「単離された核酸」なる語を使用する。この語が、ＤＮＡに用いられる場合、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中でそれが直ぐ隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子をいう。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターのようにベクターに挿入されたＤＮＡ分子、あるいは原核生物もしくは真核生物細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに取り込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。
ＲＮＡに用いられる場合、「単離された核酸」なる語は、主に、上記した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子をいう。また、この語はそれがその自然な状態（すなわち、細胞または組織中の状態）にて結合している他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子をいう。単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに生物学的手段または合成手段により直接産生され、その生成の間に存在する他の成分から分離されている分子をいう。
【００１７】
核酸の特定の配列の「自然対立遺伝子変種」、「変異体」および「誘導体」とは、自然にまたは設計のいずれかにより、配列または構造において変化を有していてもよいが、個々の配列に密接に関係付けられる核酸配列をいう。密接に関係付けられるとは、ヌクレオチドの配列の少なくとも６０％、多くの場合で８５％より多くが、個々の配列番号を用いて言及される核酸配列の所定の長さにわたって対合していることを意味する。密接に関係付けられる核酸配列間のヌクレオチド配列における変化または違いとは、個々の核酸配列の自然における正常な複製または重複の過程の間に起る配列中のヌクレオチド変化として表すことができる。核酸の調節領域におけるアミノ酸コドンまたは配列を変化させるなどの、特定の目的のために、別の変形を具体的に設計し、その配列中に導入してもよい。このような個々の変形は種々の変異誘発技法を用いてインビトロにて行ってもよく、あるいは変形を誘発または選択する個々の選択条件下に置かれた宿主生物において生じさせることができる。このように具体的に生成された配列の変種を原配列の「変異体」または「誘導体」ということができる。
【００１８】
個々の配列に言及する際の「％類似性」、「％同一性」および「％相同性」なる語は、ウィスコンシン大学のＧＣＧソフトウェアプログラムに示されるように用い、以下にさらに詳述する。
本発明はまた、本発明のＣＥＬ Ｉポリペプチドまたは蛋白の活性部分、フラグメント、誘導体および機能的もしくは非機能的模倣体を包含する。ＣＥＬ Ｉポリペプチドの「活性部分」とは、全長のＣＥＬ Ｉポリペプチドよりも短いが、測定可能な生物学的活性を保持するペプチドを意味する。
ＣＥＬ Ｉポリペプチドの「フラグメント」または「部分」とは、少なくとも約５個ないし７個の連続したアミノ酸の、少なくとも約７個ないし９個の連続したアミノ酸であることも多い、典型的には少なくとも約９個ないし１３個の連続したアミノ酸の、最も好ましくは少なくとも約２０個ないし３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸のアミノ酸残基の鎖を意味する。ＣＥＬ Ｉポリペプチドの「誘導体」またはそのフラグメントとは、蛋白のアミノ酸配列を変えることにより、例えば、蛋白をコードする核酸を操作するか、または蛋白それ自体を改変することにより修飾されたポリペプチドを意味する。このような天然アミノ酸配列の誘導体は、１個またはそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を含んでいてもよく、原型のＣＥＬ Ｉポリペプチドの本質的活性を改変していてもいなくてもよい。
【００１９】
ＣＥＬ Ｉポリペプチドの異なる「変種」が自然に存在する。これらの変種は蛋白をコードする遺伝子のヌクレオチド配列における違いにより特徴付けられる対立遺伝子であってもよく、あるいは異なるＲＮＡプロセッシングまたは翻訳後修飾を含んでいてもよい。当業者は単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または変換を有する変種を産生することができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸で置換された変種、（ｂ）１個またはそれ以上のアミノ酸がＣＥＬ Ｉポリペプチドに付加された変種、（ｃ）１個またはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ＣＥＬ Ｉポリペプチドが、例えば、抗体についてのエピトープ、ポリヒスチジン、ビオチン部分などの、ＣＥＬ Ｉポリペプチドに有用な特性を付与することのできる、融合パートナー、蛋白タグまたは他の化学的部分などのもうひとつ別のペプチドまたはポリペプチドと融合している変種を包含することができる。本発明の他のＣＥＬ Ｉポリペプチドは、保存または非保存位置のいずれかで、ある種から由来のアミノ酸残基が他の種の対応する残基と置き換えられている変種を包含する。もう一つ別の具体例において、非保存位置にあるアミノ酸残基は保存または非保存残基と置換されている。遺伝的（抑圧、欠失、変異など）、化学的および酵素的技法を含む、これら変種を得るための技法は当業者に知られている。
【００２０】
別の核酸プロセッシング形態および別の翻訳後修飾形態を含むかかる対立遺伝子変種、アナログ、フラグメント、誘導体、変異体および修飾体がＣＥＬ Ｉポリペプチドのいずれかの生物学的特性を保持しているＣＥＬ Ｉポリペプチドの誘導体をもたらす範囲にまで、それらは本発明の範囲に含まれる。
本明細書で用いる「オルトログ」なる語は、ポリペプチド産物がＣＥＬ Ｉをコードする配列と６０％より大きな同一性を有し、遺伝子産物がＣＥＬ Ｉと類似する三次元構造および生化学活性を有する、核酸配列によりコードされるヌクレアーゼをいう。本発明の方法におけるかかるオルトログによりコードされるヌクレアーゼの使用を本発明では意図するものである。代表的なオルトログはＺＥＮ１、ＢＦＮ１およびＤＳＡ６を包含するが、限定されるものではない。
本明細書で用いる「機能的」なる語は、核酸またはアミノ酸配列が上記したアッセイまたは目的について機能的であることを意味する。
【００２１】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に言及する際の「本質的に…からなる」という語は、所定の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸は配列に言及して用いる場合、この語はその配列それ自体を含み、該配列の基本的および新規な特徴に影響を及ぼさない修飾分子を含む。
「レプリコン」はいずれかの遺伝的因子、例えば、それ自身の制御下で大きく複製することのできる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスである。レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。
「ベクター」はプラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどのレプリコンであり、結合した配列または因子の複製が起るように別の遺伝的配列または因子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの）が結合していてもよい。
【００２２】
「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳調節配列を有し、宿主細胞または生物にてポリペプチドをコードする配列の発現を促進することのできる核酸セグメントをいう。
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、本発明のプライマーおよびプローブをいい、２個またはそれ以上の、好ましくは３個以上のリボ−またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、種々の因子に、およびオリゴヌクレオチドの個々の用途および使用によるであろう。
【００２３】
本明細書で用いる「プローブ」なる語は、該プローブに対して相補的な配列を有する核酸とアニーリングする能力を有するか、あるいは該核酸と特異的にハイブリダイズする能力を有する、精製された制限酵素消化物にあるように天然に存在するか、または合成的に産生されるかの、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸をいう。プローブは一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源およびその方法の用途を含む、多くの因子に依存する。例えば、標的配列の複合性に依存する診断的用途の場合、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、１５−２５またはそれ以上のヌクレオチドを有するが、ヌクレオチドの数はより少なくてもよい。本発明におけるプローブは、個々の標的核酸配列の異なる鎖と「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、所定の一連の条件下で、プローブがその各々の標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」かまたはアニールしなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、プローブ配列の残りを標的鎖に対して相補的としながら、非相補的ヌクレオチドフラグメントをプローブの５’または３’末端に付着させてもよい。別法として、非相補的塩基またはより長い配列をプローブ中に散在させることができるが、そのプローブ配列は標的とする核酸の配列と十分な相補性を有し、それと特異的にアニールすることを条件とする。
【００２４】
「特異的にハイブリダイズする」なる語は、当該分野にて一般に使用される所定の条件下で、特異的なハイブリダイゼーションを可能とするように十分に相補的な（時に、「実質的に相補的な」という）配列の２つの一本鎖核酸分子間の結合をいう。とりわけ、この語はオリゴヌクレオチドと本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションをいう。ただし、オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸の非相補的配列とのハイブリダイゼーションを除く。
【００２５】
本明細書にて用いる「プライマー」なる語は、適当な環境下に置かれた場合に、鋳型依存的核酸合成のイニシエーターとして機能的に作用しうる、生物学的システムに由来するか、制限酵素の消化により生成されるか、または合成的に生成される、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの、一本鎖または二本鎖のいずれかの、オリゴヌクレオチドをいう。適当な核酸鋳型、核酸の適当なヌクレオシド三リン酸先駆体、ポリメラーゼ酵素、適当なコファクターおよび適当な温度およびｐＨなどの条件に付されると、該プライマーはヌクレオチドの付加によってその３’末端から伸長し、ポリメラーゼの作用または類似する活性により、プライマー伸長産物を生成することができる。プライマーの長さは個々の条件および適用要件に応じて変化させることができる。例えば、診断に用いる場合、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、典型的には、ヌクレオチドが１５−２５個またはそれ以上である。プライマーは、所望の伸長産物の合成を作動させるのに、すなわちポリメラーゼまたは類似酵素による合成の開始における使用のために適宜並列してプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な方法にて所望の鋳型鎖とアニールできるように、所望の鋳型に対して十分に相補的でなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な相補体である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列を別の相補的プライマーの５’末端に結合させてもよい。別法として、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させることもできる；ただし、そのプライマー配列は伸長産物を合成するための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供するために所望の鋳型鎖の配列との十分な相補性を有することを条件とする。
【００２６】
本明細書中では、時に、「単離された蛋白」または「単離かつ精製された蛋白」なる語を用いる。この語は主として本発明の単離された核酸分子の発現により産生される蛋白をいう。この語はまた、「実質的に純粋な」形態にて存在するように、それと自然に結合した他の蛋白から十分に分離されている蛋白をいう。「単離された」とは、他の化合物または物質との人工的または合成的混合物、あるいは基本的な活性を干渉しない不純物の存在を排除することを意味するものではなく、例えば、精製が不完全なため、安定化剤を添加したため、または、例えば免疫原性調製物もしくは医薬上許容される調製物と化合させたことを利用として、それらの物質が存在してもよい。
「実質的に純粋な」なる語は、所定の物質（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、蛋白など）を少なくとも５０−６０重量％で含む調製物をいう。該調製物は、より好ましくは少なくとも７５重量％の、最も好ましくは９０−９５重量％の所定の化合物を含む。純度は所定の化合物に適する方法（例えば、クロマトグラフィー、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定する。
【００２７】
「成熟蛋白」または「成熟ポリペプチド」とは、ポリ蛋白先駆体からの蛋白分解工程などのその発生の過程の間にポリペプチドに対して通常発生するいずれかのプロセッシング事象の後に、ポリペプチドの配列を有する一のポリペプチドを意味する。成熟蛋白の配列または境界を示すにおいて、成熟蛋白の配列の第１のアミノ酸をアミノ酸残基１と称する。
【００２８】
「タグ」、「タグ配列」または「蛋白タグ」なる語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸、ペプチドもしくは蛋白のいずれかの化学的部分、あるいは別の配列に付加した場合に、特に検出または単離においてその配列に対して付加的な有用性を提供するかまたは有用な特性を付与する他の化学的部分をいう。このように、例えば、ホモポリマー核酸配列または捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列をプライマーまたはプローブ配列に付加し、その後の伸長産物またはハイブリッド形成した産物の単離を容易にすることができる。蛋白タグの場合、ヒスチジン残基（例えば、４ないし８個の連続的ヒスチジン残基）を蛋白のアミノ−またはカルボキシ−末端のいずれかに付加し、キレート金属クロマトグラフィーによる蛋白の単離を容易にすることができる。また、特異的抗体分子と反応するエピトープまたは結合決定因子を提示するアミノ酸配列、ペプチド、蛋白または融合パートナーまたは他の分子（例えば、フラッグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスの膜貫通蛋白、ヘマグルチニン蛋白、蛋白Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモデュリン結合蛋白、マルトース結合蛋白、キチン結合ドメイン、グルタチノンＳ−トランスフェラーゼなど）を蛋白に付加し、アフィニティーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーなどの操作により蛋白の単離を容易にすることができる。化学タグ部分はビオチンのような分子を包含し、それを核酸または蛋白のいずれかに付加し、アビジン試薬などとの相互作用により単離または検出を容易にすることができる。多くの他のタグ部分が知られており、当業者であれば想定することができ、それらも本発明の範囲内にあると考えられる。
【００２９】
「トランスフォーム」、「トランスフェクト」、「トランスデュース」なる語は、核酸を細胞または宿主生物中に導入するいずれかの方法または手段をいい、同じ意味を伝えるのに互換的に用いることができる。かかる方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合などを包含するが、これに限定されるものではない。
導入された核酸は、被験者の細胞または組織体の核酸中に組み込まれても（共有結合しても）組み込まれなくてもよい。細菌、酵母、植物および動物細胞においては、例えば、導入された核酸をエピソーム因子または独立的レプリコン、例えばプラスミドとして維持することができる。また、導入された核酸は被験者の細胞または組織体の核酸中に組み込まれるようになり、かかる細胞または組織体中で安定して維持され、さらに被験者の細胞または組織体の子孫細胞または組織体に継代または受け継がれる。別の意味で、導入された核酸は被験者の細胞または宿主の組織体中に単に一時的に存在してもよい。
【００３０】
「クローン」または「クローン細胞集団」は単細胞または有糸分裂により共通の祖先から由来の細胞の集団である。
「細胞系」は数代にわたってインビトロにて安定した成長能を有する一次細胞または細胞集団のクローンである。
「免疫応答」は、機能性免疫系を有する宿主にて、蛋白抗原などの抗原により生成されるいずれかの反応を意味する。免疫応答は、自然における体液性、すなわち、イムノグロブリンまたは抗体の産生に関与するか、または種々のＢ型およびＴ型リンパ球、樹状突起細胞、マクロファージ、抗原提示細胞などに関与する、自然での細胞性のいずれかの応答、あるいはその両方である。免疫応答はまた、サイトカイン、リンホカインなどの種々のエフェクター分子の産生または合成を包含する。免疫応答は、インビトロおよび種々の細胞または動物系の両方にて測定することができる。
「抗体」または「抗体分子」は、固有の抗原に結合する、抗体およびそのフラグメントを含む、いずれかのイムノグロブリンである。この語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラおよび二重特異性抗体を包含する。本明細書で用いる場合、抗体または抗体分子は、無傷のイムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）のような当該分野にて知られている部分の両方を意図するものである。
【００３１】
（図面の簡単な記載）
図１Ａ−１Ｄは精製されたＣＥＬ ＩおよいＣＥＬ ＩＩのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を示す。図１Ａ：レーン１、片側にＫＤａで示される分子量標準。レーン２、１μｇの同種ＣＥＬ Ｉ酵素。パネルＢおよびＣはＥｎｄｏ Ｈｆ処理によるＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ蛋白バンドの移動性の変化を試験する。パネルＢの試料は単にＣＥＬ Ｌだけを含有する。パネルＣの試料はＣＥＬ ＩとＣＥＬ ＩＩの混合物を含有する。パネルＤはスルフヒドリル還元した後の同種ＣＥＬ Ｉの移動性の変化を示す。図１Ｂ：レーン１、Ｅｎｄｏ Ｈｆ。レーン２、分子量標準。レーン３、同種ＣＥＬ Ｉ、約３０ｎｇ。レーン４、Ｅｎｄｏ Ｈｆで消化されたＣＥＬ Ｉ。図１Ｃ：レーン１、Ｅｎｄｏ Ｈｆ。レーン２、分子量標準。レーン３、少量のＣＥＬ ＩＩを含む精製されたＣＥＬ Ｉ。レーン４、Ｅｎｄｏ Ｈｆで消化されたＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ。図１Ｄ：精製されたＣＥＬ Ｉを、ＳＤＳ試料バッファー中、１％β−メルカプトエタノールの存在（レーン２）または不存在（レーン３）下で２分間煮沸した。レーン１、分子量標準。Ｈ＝Ｅｎｄｏ Ｈｆ。Ｉ＝ＣＥＬ Ｉ、ＩＩ＝ＣＥＬ ＩＩ。
【００３２】
図２はＣＥＬ ＩのｃＤＮＡ（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列便号：２）を示す。エドマン分解法により測定されたアミノ酸配列を太文字で示す。それらはＮ−末端配列：ＷＳＫＥＧＨＶＭＴＣＱＩＡＱＤＬＬＥＰＥＡＡＨＡＶＫＭＬＬＰＤＹＡＮＧＸＬＳＳＬＸＶＷＰ；ＧｌｕＣ消化物からの内部ペプチド：ＸＳＷＬＱＤＶＥ；トリプシン消化物からの内部ペプチド：ＣＤＤＩＳＴＣＡＮＫＹＡＫＥおよびＬＡＣＮＷＧＹＫからなる。ＤＳＡ６、ＢＦＮ１およびＺＥＮ１と同じ残基に下線を付す。保存されているｃｙｓ残基の下に＃を付す。Ｐ１ヌクレアーゼの３つのＺｎ原子についてのリガンドであることがわかった９個の保存されている残基の下に＋を付す。
【００３３】
図３はジンスキャンプログラムで起動するパーキンエルマー自動ＤＮＡシーケンサーを用いた変異検出分析物の、ＣＥＬ Ｉ変異検出についてのＭｇ＋＋およびｐＨの効果を示す、ゲル影像の写真である。基材はＴ−Ｇ多形性を含有するＢＲＣＡ１遺伝子エキソン５の２３５ｂｐＰＣＲ産物である。それを５’末端でトップストランドにて６−ＦＡＭ（ブルー）で標識し、ボトムストランドをＴＥＴ（グリーン）で標識する。基材を０．５ユニットのＣＥＬ Ｉと一緒に４５℃で３０分間インキュベートし、ついで図６に記載されるように分析した。レーン５における１５６ｎｔでのバンド（標識「ブルーカット」）は６−ＦＡＭ−標識ストランド上のＣＥＬ Ｉミスマッチ特異的カッティングに対応し、８０ヌクレオチドでのバンド（標識「グリーンカット」）はＴＥＴ−標識ストランド上のそのミスマッチ特異的カッティングに相当する。各レーンにてゲル影像の底部にあるバンドは内部サイズ標準を示す。
【００３４】
図４Ａ−４ＦはＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＦ−Ｉ ＤＮＡのニッキングを示す。アッセイは３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下（充実記号）または不存在下（中空記号）にある。パネルＡ、ＣおよびＥはｐＨ５．５でのアッセイである。パネルＢ、ＤおよびＦはｐＨ７．５でのアッセイである。
【００３５】
図５Ａ−５ＣはＣＥＬ Ｉおよびヤエナリヌクレアーゼによる変性仔ウシ胸腺ＤＮＡの可溶化を示す。アッセイは３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下（充実記号）または不存在下（中空記号）にある。丸はｐＨ５．５でのアッセイである。四角はｐＨ７．５でのアッセイである。パネルＡ、ＢおよびＣで試験した酵素は、各々、ＭＢＮ−Ａ、ＭＢＮ−ＢおよびＣＥＬ Ｉである。ＣＥＬ Ｉの一本鎖ヌクレアーゼ活性の一単位は同種ＣＥＬ Ｉの３２ｎｇに等しい（パネルＣにおける２０分までの初速度から明らかなように、３．１ｘ１０４単位の一本鎖ヌクレアーゼ／酵素１ｍｇ）。
【００３６】
図６Ａ−６ＩはＣＥＬ ＩおよびＭＢＮにより媒介されるミスマッチ検出を含む電気泳動図である。ＰＥ−バイオシステム自動ＤＮＡシーケンサーにおけるジンスキャンフラグメント分析の電気泳動図を示す。ＢＲＣＡ１遺伝子のＰＣＲ産物の２色蛍光性へテロ二本鎖を実験操作に記載されているように調製した。縦軸、蛍光単位；横軸、ヌクレオチドのＤＮＡ長。パネルＡ、ＤおよびＧにおいては、ＤＮＡを７ｎｇのＭＢＮ−Ａと一緒にインキュベートした。パネルＢ、ＥおよびＨにおいては、ＤＮＡを１１ｎｇのＭＢＮ−Ｂと一緒にインキュベートした。パネルＣ、ＦおよびＩにおいては、ＤＮＡを１０ｐｇのＣＥＬ Ｉと一緒にインキュベートした。これらの反応を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むバッファーＩ中、３７℃で３０分間行った。パネルＡ、ＢおよびＣにおいて、基材は４ｎｔ欠失を含有する３８７ｂｐへテロ二本鎖であった。パネルＤ、ＥおよびＦにおいて、基材はＣ−Ｔ塩基置換ミスマッチを含有する３２３ｂｐ産物であった。パネルＧ、ＨおよびＩにおいて、基材は一方のストランドにおいてＣ挿入を含有する４０２ｂｐヘテロ二本鎖であった。パネルＡ、ＢおよびＣの各々のパネルにおいて、１２９ｎｔでのピークは６−ＦＡＭ−標識したストランド上の４塩基挿入でのカッティングに相当し；２５８ｎｔでのピークはＴＥＴ−標識したストランド上の４塩基挿入でのカッティングに相当する。パネルＤ、Ｅ、ＧおよびＨにおいて、２種のＭＢＮによるミスマッチ特異的カッティングは見られない。パネルＦにおいて、１８３ｎｔでのピークは６−ＦＡＭ−標識したストランド上のＣＥＬ Ｉ−ミスマッチ特異的カッティングに相当し、１４２ｎｔでのピークはＴＥＴ−標識したストランド上のミスマッチ−特異的カッティングに相当する。パネルＩにおいて、２５２ｎｔでのピークはＴＥＴ−標識したストランド上のエクストラヘリカルＧでのＣＥＬ Ｉ特異的カッティングに相当する。
【００３７】
図７はＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＮＡの可溶化を示す。トルラ酵母を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ５．５（Ａ）およびｐＨ７．５（Ｂ）で、０．７ｎｇのＭＢＮ−１（充実記号）と一緒に、または１６ｎｇのＣＥＬ Ｉ（中空記号）と一緒にインキュベートする。
【００３８】
図８はＣＥＬ Ｉ精製フラクションのポリアクリルアミドゲル分析を示すゲルである。酵素を精製する各工程からの略等量のＣＥＬ Ｉ活性を有するＣＥＬ Ｉのアリコートを、還元剤の不存在の下で、ＳＤＳゲルバッファー中で煮沸し、実験的操作にて詳説されるようにＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に溶かした。再生後、ヌクレアーゼはゲル中に埋め込んだ変性ＤＮＡを消化した。消化されないＤＮＡをトルイジンブルー０で染色し、ヌクレアーゼの位置についての負の影像を得た。レーン１：分子量マーカー；レーン２：緩衝化されたセルリジュース；レーン３：２５％硫酸アンモニウム分別上澄；レーン４：８０％硫酸アンモニウム分別ペレット；レーン５：ＣｏｎＡセファロースカラムに入れる試料；レーン６：ＣｏｎＡセファロースカラムからの溶出液；レーン８：ホスホセルロースＰ−１１カラムからの溶出液；レーン９：フェノールセファロースカラムからの溶出液；レーン１０：ＭｏｎｏＱカラムからのフラクション１１および１２のプール。
【００３９】
図９Ａおよび９Ｂは、一対のゲルであって、炭水化物部分を除去する前後で、ＳＤＳゲルから再生されたＣＥＬ Ｉ、ＣＥＬＩＩ蛋白によるミスマッチ基材での切断を示す。ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ蛋白バンドをＳＤＳゲルから削除し、実験操作にて記載されるように再生した。その再生した酵素を用いて、ＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン２０の４０２ｂｐの蛍光標識したＰＣＲ産物を消化した。レーン１−６はエキソン２０にミスマッチのない野生型ＤＮＡ試料から調製されたホモ二本鎖である。レーン７−１２においては、試料中にあるこの配列の異型接合的特性のため、ＰＣＲ産物は１つのストランドがＧ残基挿入体を含有するヘテロ二本鎖である。エクストラヘリカルＧ残基の３’側でＣＥＬ Ｉを削除して、「挿入されたＧの削除」として図示される、グリーンバンドを生成する。レーン１および７：ＣＥＬ Ｉ処理を施していない基材；レーン２および８：精製された未変性のＣＥＬ Ｉによる基材の削除；レーン３および９：４３ｋＤａＣＥＬ ＩバンドのＥｎｄｏＨｆ消化によって始められる再生された２９ｋＤａＣＥＬ Ｉポリペプチドバンドによる基材の削除；レーン４および１０：３９ｋＤａＣＥＬ ＩＩバンドのＥｎｄｏＨｆ消化によって始められる再生された３７ｋＤａＣＥＬ ＩＩポリペプチドバンドによる基材の削除；レーン５、６、１１および１２：再生された４３ｋＤａＣＥＬ Ｉバンドによる基材の削除。
【００４０】
図１０はＣＥＬ Ｉアミノ酸配列の同種配列とのクルスタル・ダブリュ・アライメントを示す。同種配列のジンバンク受入番号を括弧内に示す。１：（Ｐ２４０２１）アスペルギルス・オリザエのヌクレアーゼＰ１；２：（Ｐ２４２８９）ペニシリウム・シトリナムのヌクレアーゼＰ１；３：ＣＥＬ ＩｃＤＮＡアミノ酸配列；４：（ＡＢ００３１３１）ジンニア・エレガンスからのＺＥＮ１エンドヌクレアーゼ；５：（ＡＦ０８２０３１）ヘルモカルリス雑種品種のデイリリー老化関連蛋白（ＤＳＡ６）；６：（Ｕ９０２６４）アラビドピス・タリアナの二機能性ヌクレアーゼＢＦＮ１。Clustal Ｗ Multiple Sequence Alignement Kim C. Worley, Human Genome Centoer- Baylor College of Medcine（http://dot. imgen. bcm. tmc. edu: 9331/cqi-bin/multi-align/multi-algin.p1.）。Ｐ１ヌクレアーゼの別の構造（Volbeda,A., Lahm,A., Sakiyama,F.およびSuck,D. ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９１）１０：１６０７−１６１８およびRomier,C., Dominguez,R., Lahm,A., Dahl,O., およびSuck, D.（１９９８）Proteins: Structure, Function and Genetics ３２：４１４−４２４）が示されている。３つのＺｎ原子と結合する９個の残基を太文字で示す。これらの残基に対応するＺｎ原子をアライメントの下に示す。
【００４１】
（発明を実施するための最良の形態）
ＤＮＡ複製の間の正しい塩基配列の維持についての酵素的基礎は、イー・コリ（E.coli.）で広範に研究されてきた。この生物は４ヌクレオチド長までの挿入／欠失と同様にヘミメチル化ＤＮＡ中の種々のＤＮＡ塩基対ミスマッチを訂正するミスマッチ修復経路を進化させてきた。この経路を欠く細胞はより頻繁に変異し、それゆえに、当該遺伝子は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨ等と呼ばれる。ＭｕｔＳ蛋白はミスマッチに結合し、ＭｕｔＨはＡ残基がメチル化されていない鎖上のＧＡＴＣ部位でＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。ＭｕｔＬは、修復の間にＭｕｔＨおよびＭｕｔＳとの複合体を形成する。ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬの相同物は多くの系で存在するが、ＭｕｔＨは存在しない。酵母において、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ相同物）はそれ自体がミスマッチに結合できるが、２つのＭｕｔＬ相同物（ＭＬＨおよびＰＭＳ１）とＭＳＨ２の複合体が観察されている。ヒト相同物ｈＭＳＨ２は、長さが１４個までのヌクレオチドのより大きなＤＮＡ挿入体に結合するように進化し、そのことはヒトのマイクロサテライト繰返し単位でのミスアライメントなどの機構により頻繁に生じている。これらのヒト相同物のいずれか１つにおける変異は非ポリープ性結腸癌の遺伝的形式に関与していることがわかった（２７、２８）。
【００４２】
セルリは、光感作性インターカレーターであるソラレンを組織グラム当たり４０μｇを超えて含有する（３）。必然的に、セルリは挿入、欠失および他のソラレン・フォトアダクツ（photoadduct）の障害の修復について高い能力を有する可能性がある。障害部位における一本鎖性は、塩基置換およびＤＮＡループ障害に共通する。以下の例におけるデータは、セルリがこれらの潜在的な変異誘発性の事象に対処するために豊富なミスマッチ−特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を有することを示す。
【００４３】
セルリから単離したＣＥＬ Ｉは、塩基置換ミスマッチおよびＤＮＡ変形の部位で極めて特異的にＤＮＡを切断する、既知の最初の真核生物性ヌクレアーゼである。該酵素は、活性のためにＭｇ＋＋およびＺｎ＋＋を必要とし、ｐＨ最適値を中性ｐＨとする。本発明者らはＣＥＬ Ｉを見かけの等質性に対して３３０００倍精製した。重要な改良点は、精製バッファー中にα−メチルマンノシドを用いて糖蛋白の内因的レクチンとの凝集を克服したことである。同種ＣＥＬ ＩについてのＳＤＳゲル電気泳動バンドを、その炭水化物部分を除去しまたは除去することなく、抽出し、再生し、ミスマッチ切断特異性を有することを明らかにした。ＣＥＬ Ｉポリペプチドの２８％のアミノ酸配列を決定した後、そのＣＥＬ ＩｃＤＮＡをクローンした。潜在的オルトログはアラビドプシスのＢＦＮ１、ジンニアのＺＥＮ１およびデイリリーのＤＳＡ６の遺伝子によりコードされると推定されるヌクレアーゼである。ＣＥＬ ＩのＳ１およびＰ１ヌクレアーゼとの相同性は極めて低い。ＣＥＬ Ｉのヌクレアーゼ活性を、Ｓ１ヌクレアーゼの最も近い植物オルトログである、ヤエナリヌクレアーゼと比較して特徴付け、これらの酵素が触媒的に異なることを確立した。ミスマッチ基材における一本鎖性はＣＥＬ Ｉにより認識される主たる特徴ではないようである。ＣＥＬ Ｉを中性ｐＨ最適値の、マグネシウムを刺激し、ミスマッチ二本鎖を認識するヌクレアーゼの新規なファミリーとして示し、Ｓ１スーパーファミリーの範囲内にあることを提案する。
【００４４】
Ｉ．ＣＥＬ Ｉコード化核酸分子、ＣＥＬ Ｉ蛋白およびそれに対する抗体の調製
Ａ．核酸分子
本発明のＣＥＬ Ｉエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子は、２つの一般的方法：（１）適当なヌクレオチドトリホスフェートから合成；または（２）生物学的な供給源から単離する方法により調製することができる。両方共、当該分野にてよく知られたプロトコルを利用する。
配列番号：１の配列を有する略全長のｃＤＮＡなどのヌクレオチド配列情報の有効性は本発明の単離された核酸分子のオリゴヌクレオチド合成による調製を可能とする。合成によるオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ・３８０Ａ ＤＮＡ シンセサイザーまたは同様の装置を用いるホスホルアミダイト法により調製することができる。得られた構築物は当該分野にて公知の方法、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現行のオリゴヌクレオチド合成方法に特有のサイズ制限から、段階中に合成しなければならない。かくして、例えば、２．４ｋｂの二本鎖分子は適当な相補性の数個のより小さなセグメントとして合成してもよい。こうして得られた相補的セグメントを、各セグメントが隣接するセグメントで結合するのに適する粘着末端を有するようにして、アニールすることができる。ＤＮＡリガーゼの存在下で粘着末端をアニールすることにより隣接するセグメントをライゲートし、完全な２．４ｋｂの二本鎖分子を構築することができる。こうして構築された合成によるＤＮＡ分子をついでクローンし、適当なベクターにて増幅させてもよい。ＣＥＬ Ｉをコードする核酸配列は当該分野にて公知の方法を用いて適当な生物学的供給源から単離することができる。好ましい具体例において、ｃＤＮＡクローンはセルリ起源のｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離される。もう一つ別の具体例において、ｃＤＮＡ配列により提供される配列情報を用いて、ＣＥＬ Ｉをコードするゲノムクローンを単離してもよい。別法として、ＣＥＬ Ｉ遺伝子中にある所定の配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用い、ＣＥＬ Ｉと相同性を有するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを他の植物種から単離することもできる。
【００４５】
本発明によれば、配列番号：１の蛋白コード化領域と適当なレベルの配列相同性を有する核酸は、適当なストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて同定することができる。例えば、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハート試薬、０．５−１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性した分画サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび０．５０％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて行ってもよい。３７−４２℃で少なくとも６時間ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションに付した後、フィルターを以下の条件：（１）２ｘＳＳＣおよび０．５−１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間；（３）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分ないし1時間；（４）３０分毎に溶液を変えながら、１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、４２−６５℃で２時間；で洗浄する。
特定の配列相同性の核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェントな条件を算定するための一の共通の式は（サムブロックら、１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二本鎖中の＃ｂｐ
で示される。
【００４６】
上記した式の一例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを用い、ＧＣ含量が４２％で、プローブの塩基の大きさが平均２００である場合、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは相同性が１％減少する毎に１−１．５℃減少する。かくして、約７５％よりも大きな配列同一性を有する標的は４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。このような配列は本発明の核酸配列と実質的に相同であると考えられる。
上記したように、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、２つの核酸分子のアニーリング速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションを、通常、そのハイブリッドの計算されたＴｍよりも２０−２５℃低い塩および温度の条件で行う。洗浄条件は標的についてのプローブの同一性の程度についてできる限りストリンジェントでなければならない。一般に、洗浄条件はそのハイブリッドのＴｍよりも約１２−２０℃低いように選択される。本発明の核酸について、中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを、４２℃での、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションおよび２ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、５５℃で１５分間の洗浄として定義する。高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを、４２℃での、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションおよび１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間の洗浄として定義する。非常に高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを、４２℃での、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションおよび０．１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間の洗浄として定義する。
【００４７】
本発明の核酸はいずれか都合のよいクローニングベクター中のＤＮＡとして維持することができる。好ましい具体例においては、クローンを、適当なイー・コリ宿主細胞に遺伝されている、プラスミドクローニング／発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に維持する。ＣＥＬ Ｉ遺伝子をコードする本発明のゲノムクローンはラムダファージＦＩＸ ＩＩ（ストラタジーン）中に維持することができる。
本発明のＣＥＬ Ｉコード化核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびそのフラグメントを包含し、それらは一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。かくして、本発明は、配列番号：１の配列を有するｃＤＮＡの選択されたセグメントなどの、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリッド形成することのできる配列を有する、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンスストランド）を提供する。かかるオリゴヌクレオチドはＣＥＬ Ｉ遺伝子を検出または単離するためのプローブとして有用である。
【００４８】
これらの配列の変種（例えば、対立遺伝子変種）がセルリ集団に存在し、本発明のオリゴを設計および／または利用する場合にそれらを考慮しなければならないことが理解されるであろう。したがって、本明細書に開示されているＣＥＬ Ｉ配列または各遺伝子またはＲＮＡ転写物上の特定の位置を標的とするオリゴについてのそのような変種を包含することも本発明の範囲内にある。かかる変種を含めることに関して、本明細書では、「天然の対立遺伝子変種」なる語を、所定のＤＮＡ集団中に存在するであろう、種々の特異的ヌクレオチド配列およびその変種をいうのに用いる。コードされた蛋白中に同類または中立アミノ酸置換を生じさせる遺伝的多形態がかかる変種の例である。加えて、「実質的に相補的」なる語は、標的配列と完全に対合することができないが、そのミスマッチが記載されている条件下でオリゴのその標的配列とのハイブリッド形成能に著しく影響を与えない、オリゴ配列をいう。
かくして、そのコード化配列は配列番号：１で示されるものであってもよく、あるいはこの配列の変異体、変種、誘導体または対立遺伝子であってもよい。該配列は、図示されている配列の１個またはそれ以上のヌクレオチドが１回またはそれ以上の付加、挿入、欠失および置換の変化により図示されている配列と異なるものであってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化は、遺伝的コードによって測定されるように、蛋白レベルでアミノ酸変化をもたらしてもよく、もたらさなくてもよい。
【００４９】
かくして、本発明の核酸は、アミノ酸配列が同じポリペプチドをコードする、配列番号：１に示される配列と異なる配列を包含する。
他方において、そのコードされるポリペプチドは配列番号：２に示されるアミノ酸配列と１またはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むことができる。さらには、配列番号：２に示される配列のアミノ酸配列変異体、変種、誘導体または対立遺伝子である、ポリペプチドをコードする核酸が本発明によって提供される。かかるポリペプチドをコードする核酸は配列番号：１に示されるコード化配列と６０％以上の同一性、約７０％以上の同一性、約８０％以上の同一性、約９０％以上の同一性または約９５％以上の同一性を示す可能性がある。
本発明は目的とする核酸を得る方法であって、配列番号：１に示される配列の一部または全部あるいは相補的配列を有するプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含む方法を提供する。一般に、ハイブリダイゼーションを行い、続いて連続的なハイブリダイゼーションの同定および該プローブとハイブリッド形成した核酸の単離を行う。その操作はＰＣＲの１またはそれ以上の工程を含んでいてもよい。
【００５０】
そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびにその全長配列（および変異体、対立遺伝子、変種および誘導体）は、核酸を含有する試験化合物をＣＥＬ Ｉの対立遺伝子、変異体または変種の存在についてスクリーニングするのに有用であり、一の植物から得られた試料からの標的配列とハイブリッド形成するプローブを試験する。ハイブリダイゼーションの条件は非特異的結合を最小限とするように調節することができるが、ストリンジェントないし中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることが好ましい。当業者であれば、サムブロックら（１９８９）およびアウスベルら（１９９２）などのテキストブックで助成されるように、かかるプローブを容易に設計し、それらを標識し、ハイブリダイゼーション反応に適する条件を工夫することができる。
【００５１】
ある好ましい具体例において、配列番号：１に示される配列のフラグメント、またはエンドヌクレアーゼ活性と関連するいずれかの対立遺伝子である本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さである。かかるフラグメントそれ自身も、個々に、本発明の態様を示す。フラグメントおよび他のオリゴヌクレオチドを検討されているようにプライマーまたはプローブとして用いてもよいが、試験試料中でのＣＥＬ Ｉヌクレアーゼの相同体をコードする配列の存在を測定することと関連する方法にて（例えば、ＰＣＲにより）生成することもできる。
【００５２】
Ｂ．蛋白
ＣＥＬ Ｉは塩基置換ミスマッチおよびＤＮＡ変形の部位で高特異的にＤＮＡを切断する最初に同定された真核生物性ヌクレアーゼである。本発明の全長ＣＥＬ Ｉ蛋白は、既知の方法に従い、種々の方法にて調製することができる。該蛋白は、全内容を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５８６９２４５号に記載されるように、適当な供給源、例えばセルリから精製することができる。しかしながら、この方法は少量の蛋白がいつでも所定の細胞型にて存在する可能性があるため好ましい方法ではない。ＣＥＬ Ｉをコードする核酸分子を利用し、当該分野にて公知の方法をインビトロ発現方法を用いて蛋白を産生することができる。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子を適当なインビトロ転写ベクター、例えばインビトロ転写用のｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５にクローンし、つづいて適当な無細胞翻訳系、例えば小麦胚芽またはウサギ網状赤血球溶菌物中の無細胞翻訳に付してもよい。インビトロ転写および翻訳系は、例えば、プロメガ・バイオテック、マジソン、ウィスコンシン州、またはＢＲＬ、ロックビル、メリーランド州から入手可能である。
【００５３】
また、好ましい具体例によれば、適当な原核生物または真核生物系にて発現させることにより、より多量のＣＥＬ Ｉを産生することができる。例えば、配列番号：１を有するｃＤＮＡなどのＤＮＡの一部または全部をイー・コリなどの細菌細胞中での発現に適合するプラスミドベクター中に挿入することができる。かかるベクターは、宿主細胞（例えば、イー・コリ）でのＤＮＡの発現に不可欠な調節因子を含み、それをＤＮＡの発現を可能とするように位置付ける。このような発現に必要な調節因子は、プロモーター配列、転写開始配列および、所望によりエンハンサー配列を含む。
【００５４】
組換え原核生物または真核生物系での遺伝子発現により産生されるＣＥＬ Ｉは当該分野にて知られた方法に従って精製することができる。好ましい具体例においては、市販されている発現／分泌系を用い、それにより組換え蛋白を発現させ、その後に宿主細胞から分泌させて周辺培地から容易に精製することができる。発現／分泌ベクターを使用しないならば、別の方法は、組換え蛋白にあるいはＮ−末端またはＣ−末端に６−８個のヒスチジン残基のタグを付した組換え蛋白を単離するためのニッケルカラムに特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用によるなどの、アフィニティー分離により組換え蛋白を精製することを包含する。別のタグはＦＬＡＧエピトープまたはヘマトグルチニンエピトープを含んでいてもよい。このような方法は、一般に、技術者により用いられている。
【００５５】
上記した方法により調製された、本発明のＣＥＬ Ｉ蛋白は標準的方法により分析することができる。例えば、かかる蛋白を既知の方法に従ってアミノ酸配列分析に付してもよい。
アミノ酸配列の変種、対立遺伝子、誘導体または変異体であるポリペプチドもまた本発明により提供される。一の変種、対立遺伝子、誘導体または変異体であるポリペプチドは、１個またはそれ以上のアミノ酸の１回またはそれ以上の付加、置換、欠失および挿入により配列番号：２に示されるアミノ酸配列と異なる配列を有していてもよい。このような好ましいポリペプチドはＣＥＬ Ｉ機能を有し、すなわち、１またはそれ以上の次の特性：誤対合したヘテロ二本鎖ＤＮＡを切断する特性；その配列が配列番号：２に示されているポリペプチドと反応性を有する抗体との免疫学的交差反応特性；その配列が配列番号：２に示されるポリペプチドとエピトープを共有する特性（例えば、２つのポリペプチドの間の免疫学的交差反応性により決定されるような特性）を有する。
【００５６】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列のその変種、対立遺伝子、誘導体または変種であるポリペプチドは、その図示されている配列と約３５％以上の、約４０％以上の、約５０％以上の、約６０％以上の、約７０％以上の、約８０％以上の、約９０％以上の、または約９５％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。個々のアミノ酸配列の変種は、１個、２個、３個、４個、５−１０個、１０−２０個、２０−３０個、３０−４０個、４０−５０個、５０−１００個、１００−１５０個または１５０個より多くのアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と異なっていてもよい。アミノ酸の「相同性」の場合、この相同性は（例えば、アルゴリズムＧＡＰ（ジェネティっク・コンピューター・グループ、マディソン、ＷＩ）を用いて測定されるような、アミノ酸類似性の確立された原理に従って）同一性または類似性であると理解することができる。ＧＡＰは、２つの完全な配列を整列させるために、対合の数を最大にし、ギャップの数を最小とする、ニードルマンおよびウォンシュのアルゴリズムを用いる。一般に、ギャップ創製ペナルティ＝１２およびギャップ排除ペナルティ＝４のデフォルトパラメーターが用いられる。ＧＡＰの使用が好ましいが、ＢＬＡＳＴ（アルツチェルら（１９９０）J.Mol.Biol. ２１５：４０５−４１０）；ＦＡＳＴＡ（ピアーソンおよびリプマン（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８）またはスミス・ウォーターマンアルゴリズム（スミスおよびウォーターマン（１９８１）J.Mol.Biol. １４７：１９５−１９７）を含むが、これらに限定されるものではない、通常、デフォルトパラメーターを利用する、他のアルゴリズムを用いてもよい。本明細書における「相同性」および「相同的」なる語の使用は、比較された配列間の必然的な進化論的関係を含むものではない。これらの語は「相同的組換え」なる句中にあるように用いられ、すなわち、該用語は単に２つのヌクレオチド配列が適当な条件下で組み換えるのに十分に類似していることを要求しているにすぎない。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、その活性または機能に影響を及ぼす、あるいは調節する分子についてスクリーニングするのに用いることができる。かかる分子は検索の目的に有用である。
本発明はまた、本発明の蛋白に免疫特異的に結合する能力を有する抗体を提供する。ＣＥＬ Ｉに定方向性のポリクローナル抗体は標準的方法に従って調製することができる。好ましい具体例においては、ＣＥＬ Ｉの種々のエピトープと免疫特異的に反応する、モノクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体は標準的プロトコルを倣うケラーおよびミルスタインの一般的方法により調製することができる。ＣＥＬ Ｉと免疫特異的に相互作用するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、かかる蛋白を同定し、精製するのに利用することができる。例えば、抗体が免疫特異的に相互作用する蛋白のアフィニティ分離のために該抗体を利用することができる。また、抗体を用いて、蛋白および他の生物学的分子の混合物を含有する試料から蛋白を免疫沈降させることもできる。抗−ＣＥＬ Ｉの別の使用を以下に記載する。
【００５８】
本発明に係る抗体は多くの方法にて修飾することができる。実際、「抗体」なる語は要求される特異性のある結合ドメインを有する結合物質を含むものとして解釈されるべきである。かくして、本発明は、合成分子およびその形状が分子を抗原またはエピトープに結合させることのできる抗体の形状を模倣する分子を含め、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価体および相同体を含む。
抗原または他の結合パートナーとの結合能を有する代表的な抗体フラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインを含むＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント；抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖフラグメント；ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域にてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである。一本鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
【００５９】
ＩＩ．ＣＥＬ Ｉコード化核酸、ＣＥＬ Ｉ蛋白およびそれに対する抗体の使用 ＣＥＬ Ｉが変異体スクリーニングアッセイに役立つように用いることができるＤＮＡエンドヌクレアーゼであるのは明らかである。具体的には、本発明のＣＥＬ Ｉ分子を遺伝的スクリーニングアッセイに役立つように用いて特定の遺伝的障害の危険性があるかもしれない患者を同定することができる。かかる障害は、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、リソソーム貯蔵性疾患および患者を癌に罹患しやすくする遺伝的変異を包含するが、これらに限定されるものではない。
加えて、本発明のＣＥＬ Ｉ核酸、蛋白およびそれに対する抗体を検索手段として用いてもよく、ＤＮＡ認識および修復反応に親密に関与する他の蛋白を同定することができる。ＣＥＬ ＩのＤＮＡ認識および修復能力を生物学的に解明することで、患者の癌および遺伝的疾患への傾向を評価するこれら新規なスクリーニングアッセイを開発することが容易になるであろう。
【００６０】
Ａ．ＣＥＬ Ｉコード化核酸
本発明に係る種々の目的のためにＣＥＬコード化核酸を用いてもよい。ＣＥＬ Ｉコード化ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのフラグメントをＣＥＬ Ｉ様蛋白をコードする遺伝子の存在および／または発現を検出するためのプローブとして用いてもよい。ＣＥＬ Ｉコード化核酸をかかるアッセイのためにプローブとして利用することができる方法は、（１）インサイチューハイブリダイゼーション；（２）サザーンハイブリダイゼーション；（３）ノーザンハイブリダイゼーション；および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの雑多な増幅反応、を包含するが、これらに限定されるものではない。
また、本発明のＣＥＬ Ｉコード化核酸を、他の植物および動物種から由来の関連する遺伝子を同定するためのプローブとして利用することもできる。当該分野にてよく知られているように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調節して核酸プローブと相同性が種々の程度の相補的配列をハイブリダイズさせることができる。すなわち、ＣＥＬ Ｉコード化核酸を用いてＣＥＬ Ｉとの関連性が種々の程度である他の遺伝子を同定かつ特徴付けるのに役立て、それによりＤＮＡミスマッチ認識系をさらに特徴付けることができる。加えて、上記した核酸を用いてＣＥＬ Ｉと相互作用する蛋白をコードする遺伝子を（例えば、「相互作用トラップ」技法により）同定することもでき、それによりＤＮＡミスマッチ認識に関与する化合物の同定がさらに促進されるはずである。
【００６１】
また、ＣＥＬ Ｉをコードする核酸分子またはそのフラグメントを用いてＣＥＬ Ｉの産生を制御し、それによりＤＮＡミスマッチ認識反応に関与させるのに利用可能な蛋白の量を調節することもできる。ＣＥＬ Ｉ蛋白の生理学的な量における変化は、ＤＮＡミスマッチ認識に関与する他の蛋白因子の活性に劇的に影響を及ぼすかもしれない。
ＣＥＬ Ｉをコードする核酸の利用可能性は、ＣＥＬ Ｉ遺伝子またはその変異した配列の一部または全部を有する実験室用マウスの系統の生成を可能とする。かかるマウスは哺乳動物環境においてＣＥＬ Ｉ活性を評価するためのインビボモデルを提供することができる。実験室用マウスにてトランス遺伝子を導入する方法は当業者に周知である。３通りの一般的方法は：１．レトロウイルスベクターをコードする目的とする外来遺伝子を初期胚子に組み入れる方法；２．ＤＮＡを新たに受精させた卵子の生殖核中に注入する方法；３．遺伝的に操作された胚子幹細胞を初期胚子に組み込む方法、を包含する。上記したトランスジェニックマウスの生成はＣＥＬ ＩがＤＮＡミスマッチ認識にて果たす役割を分子的に解明することを容易にするであろう。
【００６２】
「動物」なる語は、本明細書にて、ヒトを除く、あらゆる脊椎動物を含むのに用いる。該用語はまた、胚子および胎児段階を含め、発達のあらゆる段階における個々の動物を包含する。「トランスジェニック動物」は、標的化組み換えまたは組換えウイルスのマイクロ注入もしくは感染によるような、細胞下レベルで計画的な遺伝的操作により、直接的または間接的に、改変されているかまたは受理した遺伝的情報を有する１またはそれ以上の細胞を含有するいずれかの動物をいう。「トランスジェニック動物」なる語は伝統的な雑種形成またはインビトロ受精を含めることを意味するものではなく、むしろ１またはそれ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子により改変されているか、または受理している動物を含むことを意味するものである。この分子は具体的に染色体中にランダムに組み入れられた一定の遺伝子座を標的としてもよく、あるいは染色体外にＤＮＡを複製してもよい。「生殖細胞系トランスジェニック動物」なる語は、遺伝的改変または遺伝的情報が生殖細胞系に導入されており、それにより遺伝的情報を子孫に伝達する能力が付与されているトランスジェニック動物をいう。実際、かかる子孫がそのような改変または遺伝的情報のいくらかまたは全てを有するならば、それら子孫もまたトランスジェニック動物である。
【００６３】
Ｂ．ＣＥＬ Ｉ蛋白および抗体
本発明のＣＥＬ Ｉをコードする核酸の発現を通して産生される、精製されたＣＥＬ Ｉ蛋白またはそのフラグメントを用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生することができ、それらはまた植物細胞におけるＣＥＬ Ｉ（またはＣＥＬ Ｉを含有する複合体）の存在および蓄積についての敏感な検出試薬として供することもできる。組換え技法により、ＣＥＬ Ｉ蛋白の一部または全部を含有する融合蛋白を発現させることができる。この全長蛋白または該蛋白のフラグメントを用いて、該蛋白の種々のエピトープに特異的なモノクローナル抗体のアレイの生成に供することができる。それによって、細胞における該蛋白の検出により一層の感受性を提供することができる。
【００６４】
ＣＥＬ Ｉに免疫学的に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を該蛋白の検出または定量のために設計された種々のアッセイにて用いることができる。かかるアッセイは、（１）フローサイトメトリック分析；（２）植物細胞におけるＣＥＬ Ｉの免疫化学的位置測定；および（３）種々の細胞からの抽出物のイムノブロット分析（例えば、ドットブロット、ウェスタンブロット）を包含する。加えて、上記したように、抗−ＣＥＬ ＩをＣＥＬ Ｉおよびそのオルトログの精製（例えば、アフィニティカラム精製、免疫沈降）に用いることもできる。
ＣＥＬ Ｉ蛋白はまた、上記した遺伝的スクリーニングアッセイに供するように用いることができる。
上述した記載から、本発明のＣＥＬ Ｉコード化核酸、ＣＥＬ Ｉ発現ベクターおよび抗−ＣＥＬ Ｉ抗体が、多量のＣＥＬ Ｉ蛋白を産生し、ＣＥＬ Ｉ遺伝子発現を検出し、ＤＮＡ損傷の認識に関与する遺伝子と蛋白の相互作用を評価することを目的としてＣＥＬ Ｉ蛋白の蓄積を変えるために用いることができることが理解できる。
【００６５】
以下のプロトコルは本発明の実施を容易にするために提供される。
プラスミドＤＮＡｐＵＣ１９を、製造業者の指示に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いてＤＨ５宿主細胞から単離した。仔ウシ胸腺ＤＮＡをシグマより入手し、プロテイナーゼＫ消化とフェノール抽出のサイクルを繰り返すことにより精製した（９）。クロマトグラフィー樹脂およびカラムをファルマシア・バイオテックより購入した。トルイジンブルーＯおよびポンキュウ（Ponceau）Ｓをシグマから入手した。ＥｎｄｏＨｆはニューイングランド・バイオラボから入手した。ホスホセルロースＰ１１をホワットマンから入手した。
【００６６】
ＣＥＬ Ｉの精製
工程はすべて４℃で行った。ヌクレアーゼ活性をＲＦ−１（複製型Ｉ）ニッキングアッセイ（１０）を用いてモニター観察した。
工程１：粗抽出物の調製−
１０５キログラムのセルリの茎をジュースエキストラクターを用いて均質にした。その汁を集めて（合計７９．３４Ｌ）バッファーＡ（１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．７、１００μＭ ＰＭＳＦ）の組成物中に適合させた。固体（ＮＨ４）２ＳＯ４をゆっくりと、穏やかに攪拌して、最終濃度が２５％飽和となるまで該汁に加えた。３０分後、その懸濁液を２７０００ｘｇで１．５時間遠心分離に付した。上澄（合計７０．５６Ｌ）をプールし、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を８０％飽和に調整した。３０分間攪拌した後、その混合物を２７０００ｘｇで２時間遠心分離に付した。ペレットをバッファーＢ（０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．７、０．５Ｍ ＫＣｌ、１００μＭ ＰＭＳＦ）中に再び懸濁させ、バッファーＢに対して完全に透析させた。
【００６７】
工程２：コンカナバリンＡ−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー−
１００ｍｌの（ジメチルスベリミダート架橋した）ＣｏｎＡ樹脂をボトル中の７．７１ｍＬの試料に加え、それを緩やかに一夜回転させた。その樹脂を２．５ｃｍ径のカラムに充填した。ＣＥＬ Ｉ活性を含まないフロースルーフラクションを捨てた。ＣＥＬ Ｉを０．３Ｍ α−メチルマンノシドを含有する２００ｍｌのバッファーＢで４℃で溶出させた。ヌクレオチド活性がもはや溶出されなくなるまで、溶出工程を１０回以上繰り返した。溶出液を合し、バッファーＣ（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００６８】
工程３：ＤＥＡＥ−セファセルクロマトグラフィー−
工程２の透析した試料（合計２．５Ｌ）を、バッファーＣで予め平衡にした５ｃｍ径の４００ｍｌのＢＥＡＥ−セファセルカラムに加えた。その後の工程をＦＰＬＣを用いて行った。該カラムを４００ｍｌのバッファーＣで洗浄した。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の１０ｍＭから１ＭまでのＫＣｌの線状勾配の１ＬのバッファーＣを用いて５ｍｌ／分の流速で溶出させ、つづいて１Ｍ ＫＣｌおよび５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の４００ｍｌのバッファーＣを用いて８ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性が最大のＣＥＬ Ｉフラクションをプールし、バッファーＤ（２５ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００６９】
工程４：ホスホセルロースＰ−１１クロマトグラフィー−
工程３の透析したＣＥＬ Ｉプール（１２０ｍｌ）を、５ｃｍ径の４００ｍｌのＰ−１１樹脂を充填したカラムに加えた。該カラムは５ｍｌ／分の流速のバッファーＤで予め平衡にした。試料を負荷した後、該カラムを５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の６２５ｍｌのバッファーＤを用いて５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の２０ｍＭから１ＭまでのＫＣｌの線状勾配の８００ｍｌのバッファーＤを用いて５ｍｌ／分の流速で溶出させた。該カラムをさらに１Ｍ ＫＣｌおよび５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の４００ｍｌのバッファーＤを用いて８ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性が最大のフラクションをプールし、１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４含有のバッファーＥ（５０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００７０】
工程５：フェニルセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー−
工程４の透析したＣＥＬ Ｉプール（４８０ｍｌ）を、５ｃｍ径の４００ｍｌのフェニルセファロースＣＬ−４Ｂを充填したカラムに加えた。該カラムは５ｍｌ／分の流速の１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４含有のバッファーＥで予め平衡にした。試料を添加した後、該カラムを１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４および５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の４００ｍｌのバッファーＥを用いて５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の１．５Ｍから０Ｍまでの（ＮＨ４）２ＳＯ４の塩の線状逆勾配の５００ｍｌのバッファーＥを用いて５ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性が最大のフラクションをプールし、バッファーＦ（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００ｍＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００７１】
工程６：モノＱアニオン−交換クロマトグラフィー−
ファルマシアの予め充填されているモノＱＨＲ１６／１０カラムをバッファーＦで完全に洗浄して平衡状態にした。工程５からの透析したＣＥＬ Ｉプール（３３６ｍｌ）を５ｍｌ／分の流速で加え、つづいて１００ｍｌの５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有のバッファーＦを１０ｍｌ／分の流速で加えた。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の０から１ＭまでのＫＣｌの線状勾配の２５０ｍｌのバッファーＦを用いて２ｍｌ／分で溶出させた。
【００７２】
工程７：ＳＭＡＲＴシステムを用いるスーパーデックス７５サイズ排除クロマトグラフィー−
工程６の活性なフラクション、フラクション１１および１２を合し、セントリコン（Centricon）３の遠心分離性濃縮装置を用いて濃縮した。濃縮した酵素のアリコートを、５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有のバッファーＧ（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）で平衡にした予め充填されているスーパーデックス７５ＰＣ３．２／３０カラムに加えた。５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の５ｍｌのバッファーＧを用いてＣＥＬ Ｉを０．０５ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックした。付加的な蛋白バンドがある場合、フラクションをプールし、濃縮し、ＣＥＬ Ｉが見かけ上均一になるまで、同じサイズ排除クロマトグラフィーを用いて再び精製した。
【００７３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳでのポリアクリルアミドゲル電気泳動を以前に記載されているように実施した（１１）。ゲルコードブルー染色試薬（ピアーズ）を用いることで蛋白バンドを検出した。蛋白バンドの分子量を蛋白標準の分子量に対するその相対的電気泳動移動度を半対数プロットを用いることで決定した。活性ゲルアッセイは本質的に記載どおりに行った（１２−１３）。
【００７４】
Ｎ−結合したオリゴヌクレオチドのＣＥＬ ＬからのＥｎｄｏＨｆ除去
ＣＥＬ Ｉを０．５％ＳＤＳ中で１００℃で１０分間変性させた。適量のＥｎｄｏＨｆを加え、反応物をＧ５バッファー（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中３７℃で一夜インキュベートした。
【００７５】
ＣＥＬ ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥからの再生
この方法は以前に報告されている方法（１３−１４）の変形である。ＣＥＬ Ｉフラクションを２本の並行するレーンのＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填した。電気泳動に付した後、ゲルが２本のレーンに間に分けられた。ゲルの半分をゲルコードブルースタイン試薬（ピアース）で染色し、ついで染色されていない他の半分と整列させた。染色されていないゲル中のＣＥＬ Ｉバンドに対応するゲルスライスを取りだし、溶出バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を用い、試料当たり２０ｍＡで２時間、アミコンモデル５７００５電気溶出装置を用いて溶出した。溶出後、試料をセントリコン３ユニットを用いることで濃縮した。遠心分離を７０００ｘｇで一夜行った。試料の体積を測定し、４倍容量の蒸留アセトン（−２０℃）を加えた。試料をドライアイス−エタノール浴中で３０分間インキュベートし、ついで１４０００ｘｇで１０分間遠心分離した。沈降した蛋白を２０％の希釈および再生溶液（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍｌのＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２μＭ ＺｎＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）および８０％のアセトンからなる、バッファーで洗浄した。試料を１４０００ｘｇで１０分間再び沈殿させた。上澄を捨てた。遠心管を１０分間逆さにすることにより残りのアセトンをデカント処理した。ペレットを少なくとも１０分間風乾させた。ついで、２０μｌの再生溶液（６Ｍ グアニジン−塩酸、５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍｌのＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２μＭ ＺｎＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を用いてそのペレットを溶かした。室温で２０分間インキュベートした後、１ｍｌの希釈および再生溶液を加え、室温で１２時間蛋白をさらに再生させた。
【００７６】
ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイ
以前に報告されているようにミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイを行った（８）。簡単に言えば、一方が野生型であり、他方がＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン２０にＣ挿入するための異型接合型である２つの個体、からのゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ産物を増幅させた。順方向プライマーを６−ＦＡＭ（ブルー）で５’−標識し、逆方向プライマーをＴＥＴ（グリーン）で５’−標識した。ＢＲＣＡ１遺伝子における挿入体の位置は５３８２ｎｔ位置である。得られたヘテロ二本鎖はエクストラヘリカルＣまたはエクストラヘリカルＧを含有する４０２ｂｐのＰＣＲ産物を提供する。５０ｎｇの蛍光標識された基材を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の２０μｌの反応体積にて、ＣＥＬ Ｉと共に４５℃で３０分間インキュベートした。反応を報告されているように処理し（８）し、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー上の変性３４ｃｍウェル−ツー−リードの６％ポリアクリルアミドゲルに充填し、ジンスキャン３．１ソフトウェア（パーキン−エルマー）を用いて分析した。結果をゲルイメージとして表示する。
【００７７】
配列決定するためのＣＥＬ Ｉ試料の調製
精製したＣＥＬ Ｉ試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。電気泳動に付すと、ゲル中にある蛋白は、ウェスタン移動装置（ノベックス）を用いることによりイモビロン−ＰＳＱ ＰＶＤＦ膜に電気泳動的に移動する。トランスファーバッファーは１２ｍＭ トリズマベース、９６ｍＭ グリシンおよび２０％メタノールを含有した。トランスファー条件は２５Ｖ（定常電圧）で１時間であった。次に、膜を水で徹底的に洗浄し、ポンキュウＳで染色した。ＣＥＬ Ｉバンドを取りだし、水で脱染色し、自動式エドマン分解反応によりＮ−末端および内部ペプチドをマイクロ配列決定するためにロックフェラー大学の蛋白／ＤＮＡテクノロジーセンターに送った。まずＮ−末端配列が決定された（１５）。残りの蛋白フラクションをトリプシンまたはＧｌｕＣのいずれかで消化した。消化したペプチドをＨＰＬＣで精製し、エドマン分解法を用いて配列決定した（１６）。
【００７８】
ＣＥＬ ＩｍＲＮＡのｃＤＮＡのクローニング
植物ＲＮＡ調製についてのフェノールＳＤＳ法（１７）を用いて、全ＲＮＡを新鮮なセルリから調製した。ストラタジン製のプロスターファーストストランドＲＴ−ＰＣＲキットを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。変性ＰＣＲプライマーを純粋なＣＥＬ Ｉ蛋白のエドマン分解分析により決定されたアミノ酸配列から選択し、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼを利用してＣＥＬ ＩｃＤＮＡを２つのセグメントに増幅するのに用い、ＤＮＡを配列決定するためにイー・コリ中にてクローンした。その２つのフラグメントがＣＥＬ Ｉ蛋白の読み枠の大部分を提供した。５’および３’ＲＡＣＥ法（クローンテック・マラトン・ｃＤＮＡ増幅キット）を用い、ＣＥＬ ＩｃＤＮＡの５’および３’コード化領域および非翻訳領域（ＵＴＲ）を得た。そのｃＤＮＡの真正を確認するために、５’ＵＴＲにおけるプライマーと、３’ＵＴＲにおけるプライマー、２つのＰＣＲプライマーを設計した。増幅のための高復元性ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用い、セルリＲＮＡの新たな調製物から由来のＣＥＬ ＩｃＤＮＡを一のフラグメントとして増幅させるためにこれらの２つのプライマーを利用した。新たな配列をイー・コリにてクローンさせた。そのＤＮＡ配列から、同じアミノ酸について別のコドンを付与する１個のヌクレオチドが違うことを除いて、以前のｃＤＮＡ配列の真正を確認した。
【００７９】
ヤエナリ・ヌクレアーゼの供給源
ヤエナリ・ヌクレアーゼ（ＭＢＮ）を、ファルマシア・バイオテック、＃２７−０９１２より購入する（本明細書中、「ＭＢＮ−Ａ」と称する）か、または以前に報告されている（１８）ように精製した（本明細書中、「ＭＢＮ−Ｂ」と称する）。ＭＢＮアッセイ条件および蛋白濃度は種々の実験室で異なり、この実験における定量にいくらか影響するかもしれない。製造者のアッセイ条件では１．６４ｘ１０６ユニット／ｍｇの比活性を有するが、我々のアッセイ条件では１．４２ｘ１０６ユニット／ｍｇである、均質なＭＢＮ−ＡをＦＰＬＣ精製した。該酵素はＳＤＳ ＰＡＧＥにて単一バンドを示す。ＭＢＮ−Ｂはコワルスキーによる最初のＭＢＮの古い調製物であり、本明細書に記載のアッセイ条件にて４ｘ１０５ユニット／ｍｇの比活性を有する。該酵素は、非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにて約３９ｋＤａの単一バンドとして現れた（データを示していない）。一単位のＭＢＮ−Ａ一本鎖ＤＮａｓｅ活性は我々のアッセイにおいて酵素０．７ｎｇに等しい。
【００８０】
ＲＦ−Ｉニッキングアッセイ
１．１μｇのｐＰＫ２０１／ネコ（ｐＵＣ１９プラスミド誘導体、ｐＰＣ１９についてのデータは示されておらず、同様である）を、所定の量のＭＢＮまたはＣＥＬ Ｉと一緒に３７℃で３０分間、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下または不存在下、３０μｌの容量のバッファーＨ（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＫＣｌ）またはバッファーＩ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ）中にてインキュベートした。反応を停止させるために、５μｌの停止溶液（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．８、３％ ＳＤＳ、４．５％β−メルカプトエタノール、３０％グリセロールおよび０．００１％ブロモフェノールブルー）を加えた。２４μｌの最終混合物を０．８％アガロースゲルに負荷した。電気泳動および臭化エチジウムで染色した後、そのゲルの写真を撮影し、ＩＳ−１０００デジタルイメージングシステム（アルファ・インノテック・コーポレイション）を用いて原板をスキャンした。ＩＳ−１０００ｖ２．０２ソフトウェアを用いてＲＦ−Ｉバンドを定量した。
【００８１】
一本鎖ＤＮａｓｅアッセイ
ＤＮＡの可溶化アッセイは以前に報告されているアッセイと同様であった（１９）。５０μｇの熱変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ（カルバイオケム＃２６１８、プロナーゼ処理、フェノール抽出および透析を繰り返して精製した）を、１００μｌのバッファーＨまたはバッファーＩ中、３ｍＭ ＭｇＣｌ２と共にまたは無しで、０．７ｎｇのＭＢＮ−Ａまたは１．９ｎｇのＭＢＮ−Ｂ、あるいは１６ｎｇのＣＥＬ Ｉと共にインキュベートした。指定される時間に、０．２Ｎ塩酸中の１００μｌの冷たい２０ｍＭ ＬａＣｌ３を加えて反応を停止させた。遠心分離（２１０００ｘｇ、４０分）に付した後、分光光度計を用いて上澄の２６０ｎｍでの吸光度を測定し、酸−可溶性となったＤＮＡの量を測定した。
【００８２】
ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイ
ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイを以前に報告されているように行った（８）。簡単に言えば、ＢＲＣＡ１遺伝子中の３つの異なるエキソンにおける特定の変化について異型接合的である、個体のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ産物を増幅させた。順方向プライマーを６−ＦＡＭ（ブルー）で５’−標識し、逆方向プライマーをＴＥＴ（グリーン）で５’−標識した。ＢＲＣＡ１遺伝子におけるミスマッチの位置は、３００ｎｔ、４１８４ｎｔ、４４２１ｎｔおよび５３８２ｎｔ位置である。それらは、各々、エキソン５におけるＴからＧへの塩基置換、エキソン１１における４個の塩基の欠失、エキソン１３におけるＣ−Ｔの多型およびエキソン２０におけるＣ挿入に相当する。４個の得られたヘテロ二本鎖はＴ／ＣまたはＧ／Ａ塩基置換ミスマッチを含有する２３５ｂｐのＰＣＲ産物、４個の塩基ループを含有する３８７ｂｐのＰＣＲ産物、Ｃ／ＡまたはＴ／Ｇ塩基置換ミスマッチのいずれかを含有する３２３ｂｐの生成物、およびエクストラヘリカルＣまたはエキストラヘリカルＧを含有する４０２ｂｐの産物を提供する。５０ｎｇの蛍光標識されたヘテロ二本鎖を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下または不存在下でバッファーＩの２０μｌの反応体積にて、７ｎｇのＭＢＮ−Ａ、または１１ｎｇのＭＢＮ−Ｂ、または１０ｐｇのＣＥＬ Ｉ（０．３ユニット）と共に３７℃または４５℃で３０分間インキュベートした。反応を報告されているように処理し（８）し、ＡＢＩ３７７シーケンサー上の変性３４ｃｍウェル−ツー−リードの６％ポリアクリルアミドゲルに充填し、ジンスキャン３．１ソフトウェア（パーキン−エルマー）を用いて分析した。結果をゲルイメージの各レーンのピーク特性として表示する（図６）。
【００８３】
一本鎖ＲＮａｓｅアッセイ
５０μｇの精製したトルラ酵母ＲＮＡ（アミコン＃７１２０）を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む、１００μｌのバッファーＨまたはバッファーＩ中、０．７ｎｇのＭＢＮ−Ａまたは１６ｎｇのＣＥＬ Ｉと共に３７℃でインキュベートした。指定された時間に、１３μｌの冷たい３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２８２μｌのエタノールを添加した。該混合物を−２０℃に一夜置いた。遠心分離（２１０００ｘｇ、４５分）に付してＲＮＡを沈殿させた後、分光光度計を用いて上澄の２６０ｎｍでの吸光度を測定し、可溶性となったＲＮＡの量を測定した。
以下の実施例は本発明をさらに詳しく記載するために提供される。これらの実施例は本発明を実施するために現時点で考えられる最良の形態を示すものであり、それらは本発明を説明するが、何ら発明を限定するものではない。
【００８４】
実施例Ｉ
ＣＥＬ Ｉの精製
ＣＥＬ Ｉを、緩衝セルリ汁におけるその比活性よりも３３,０００倍を超えて均質に精製した。表１は、セルリの茎１０５ｋｇからのＣＥＬ Ｉの精製の概要を示す。ＣＥＬ Ｉの活性バンドは、活性ゲルアッセイによって判定されるように精製の全体にわたって同一サイズのものである。図８を参照のこと。全ての精製工程の間に同時精製する２つのヌクレアーゼバンドがある。本発明者らは、副バンドが主バンドに由来しないことを以下に示す。ＣＥＬ Ｉと命名された主ヌクレアーゼ活性は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で４３ＫＤａで移動する（図１Ａ）。３９ＫＤａでの副活性は、本発明者らがＣＥＬ ＩＩと命名した推定イソ酵素であり（図１Ｃ、レーン３）、ミスマッチで切断可能でもある。
【００８５】
【表１】
【００８６】
実施例２
ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩの等電点
少量のＣＥＬ ＩＩを含有するＣＥＬ Ｉの試料を等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜１０、ノベックス（Novex）から）上に負荷した。ゲルを染色した後、標準（ビオ−ラド（Bio-Rad））との比較によりＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩのｐＩを得た。ＣＥＬ ＩバンドのｐＩは６.０〜６.５であり、ＣＥＬ ＩＩバンドのｐＩは６.５〜６.８であった（データは示さない）。Ｅｎｄｏ ＨｆによってＮ結合オリゴ糖を最小限度にした後、４３ＫＤａ主セルリヌクレアーゼバンドは２９ＫＤａ位置にシフトし（図１ＢおよびＣ、レーン４）、３９ＫＤａ副セルリヌクレアーゼバンドは３７ＫＤａ位置にシフトした（図１Ｃ、レーン４）。ＣＥＬ ＩＩがＣＥＬ Ｉの分解産物であるならば、ｅｎｄｏ Ｈｆ処理後、そのポリペプチド長さは、２９ＫＤａと等しいかまたはそれ未満であろう。
【００８７】
実施例３
還元剤のＣＥＬ Ｉに対する効果
ＣＥＬ ＩバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために試料バッファーにおいて１％メルカプトエタノールを用いると、ＣＥＬ Ｉは上方にシフトした（図１Ｄ、レーン２）が、無傷であった。また、ＤＴＴを試験し、同様の結果を得た（データは示さない）。最も簡単な解釈は、ＣＥＬ Ｉポリペプチドが主鎖中に破損を含まないということである。代わりに、ジスルフィド結合が分解され、結果として、還元状態で酵素がより伸長され、故に、電気泳動移動度が遅くなった。
【００８８】
実施例４
均質なＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩの再生
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥから個々のセルリヌクレアーゼバンドを切除し、上記のとおり溶離した。これらのバンドは、４３ＫＤａバンド、３９ＫＤａバンド、およびＥｎｄｏ Ｈｆ消化後のそれらの対応するバンドを包含した。溶離した酵素フラクションを濃縮し、再生した。プラスミドニッキングアッセイを行って、再生試料が全ての活性ヌクレアーゼであることが示された。図９を参照のこと。Ｅｎｄｏ Ｈｆ消化の前または後の再生ＣＥＬ ＩおよびＥｎｄｏ Ｈｆ消化後のＣＥＬ ＩＩは、ミスマッチ基質でＤＮＡを切開することができた。この実験では、切開されたミスマッチはＧ残基挿入である。この実験は、ゲル溶離および再生工程におけるタンパク質の回収率および活性の不確定性のために、必ず定性的である。しかしながら、データは、ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩが均質であり、各々がＤＮＡミスマッチで切開することができ、ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ上のほとんどの炭水化物が活性に対して必須ではないという結論を増強する。
【００８９】
実施例５
ＣＥＬ Ｉ ｃＤＮＡのクローニング
プロテイン／ディエヌエー・テクノロジー・センター・オブ・ザ・ロックフェラー・ユニバーシティ（Protein/DNA Technology Center of the Rockefeller University）により実施されたＥｄｍａｎ分解によって同定されたＣＥＬ ＩのＮ末端のアミノ酸配列および３つの他の内部タンパク質溶解ペプチドを太文字で図２に示す。同定された７２アミノ酸はＣＥＬ Ｉポリペプチドの約２８％であり、ｃＤＮＡ配列において完全に明らかにされた。リーダー配列を有しないＣＥＬ Ｉは、２７４アミノ酸残基からなる、計算された分子量が３１,４４０.２であるタンパク質である。ＳＤＳ ＰＡＧＥで測定された４３ＫＤａの見掛けの分子量と比較して、ＣＥＬ Ｉは、炭水化物２７重量％である。
【００９０】
ＣＥＬ Ｉ ｃＤＮＡアミノ酸配列の、ＮＣＢＩ（２０）でのＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムによるジェンバンク（Genbank）におけるホモログとのアラインメントにより、ＣＥＬ Ｉがアスペルギルス（Aspergillus）Ｓ１ヌクレアーゼ（受入番号Ｐ２４０２１、２７３アミノ酸の２７％）およびＰ１ヌクレアーゼ（受入番号Ｐ２４２８９、２７７アミノ酸の３０％）に対して比較的低い同一性を有することが明らかになった。図１０を参照のこと。しかしながら、植物におけるＣＥＬ Ｉの全てのホモログのうち３つは非常に高度の同一性を有することが明白である。すなわち、ＺＥＮ１（受入番号ＡＢ００３１３１、２６９アミノ酸の８０％同一性）、ＤＳＡ６（受入番号ＡＦ０８２０３１、２７１アミノ酸の７３％同一性）、ＢＦＮ１（受入番号Ｕ９０２６４、２７４アミノ酸の７２％同一性）。本発明者らは、残りのホモログが全て４５％同一性またはそれ以下の範囲であるので、これらの３つのタンパク質がおそらくＣＥＬ Ｉのオルソログであると考える。さらにまた、ＣＥＬ Ｉおよびこれらの３つのオルソログの配列をＰ１ヌクレアーゼの二次構造に重ね合わせると、これらの４つの推定オルソログの間の配列差異のほとんどが連続したヘリックスを連結する可動性ループ領域（図１０）および可動性ＣＯＯＨ末端領域にある。かくして、これらのオルソログがＣＥＬ Ｉの酵素特性を有し、Ｓ１ヌクレアーゼの触媒特性および基質特異性を有しないと考えられる。
【００９１】
実施例６
ＣＥＬ ＩのＭｇ＋＋およびｐＨ依存性
【化１】
塩基置換のミスマッチでのＣＥＬ Ｉ切開の自動ＤＮＡシークエンサー分析のゲル画像を図３に示す。レーン１−４は、ＣＥＬ Ｉを用いないモック反応である。全長２３５ｎｔのＰＣＲ産物が画像の上部に見られ、不完全ＰＣＲ産物が下方に分散されたバンドとして見られる。レーン５において、ＣＥＬ Ｉ、Ｍｇ＋＋およびｐＨ７.５の存在下、１５６ｎｔのブルー切開バンドおよび８０ｎｔのグリーン切開バンドが表示したとおりに観察される。Ｍｇ＋＋の不在下またはｐＨ５.５では（レーン６−８）、ミスマッチ特異的切開は有意ではない。この実験はまた、レーン１−４において見られる不完全ＰＣＲ副産物が、レーン５−８において、特に、レーン５の条件下で、ＣＥＬ Ｉによって排除される程度を例示している。
【００９２】
実施例７
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮのＲＦ−Ｉニッキング活性
超コイルプラスミド複製型Ｉ（ＲＦ−Ｉ）ＤＮＡは、ヌクレアーゼによって攻撃され得る二重ヘリックスにおいて不安定性を有する局所領域を示す。第１ニックによって超ヘリックス応力が除去され、ＤＮＡは、もはや、ほとんどの一本鎖ヌクレアーゼに対する基質ではない。ｐＨ７.５に対するｐＨ５.５でのＭＢＮおよびＣＥＬ ＩのＲＦ−Ｉニッキング活性を図４に示す。パネルＡおよびＢは、Ｍｇ＋＋の存在下および不在下における２種類のｐＨでのＭＢＮ−ＡによるＲＦ−Ｉのニッキングを比較する。パネルＡにおいて、初期キネティクスの条件下で、３ｍＭ Ｍｇ＋＋によるＭＢＮの阻害は約９０％である。ＲＦ−Ｉの約７０％が、ｐＨ５.５で３０分間、ＭＢＮ−Ａ ７ｐｇによりニック処理される。パネルＢにおいて、ＭＢＮ−Ａ ７ｎｇは、ｐＨ７.５で３０分間、ＲＦ−Ｉの約２０％をニック処理することができるだけである。パネルＣおよびＤにおいてＭＢＮ−Ｂについて同様の結果が得られた。ｐＨ５.５についてはパネルＥにおいて、およびｐＨ７.５についてはパネルＦにおいて、ＣＥＬ Ｉ ＲＦ−Ｉニッキング活性の同様の比較が示される。該データは、ＣＥＬ ＩのＲＦ−Ｉニッキングが、Ｍｇ＋＋の存在下ではＭｇ＋＋の不在下におけるよりも約２倍活性であることを示している。５ｐｇデータ点を比較すると、ＣＥＬ Ｉは、ｐＨ７.５ではｐＨ５.５におけるよりも２倍活性である。
【００９３】
実施例８
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮの一本鎖ＤＮａｓｅ活性
変性精製子牛胸腺ＤＮＡのＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉによる消化を図５に示す。比較を容易にするために、アッセイが類似範囲の総活性で行われるような種々の量のＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉを用いた。ＭＢＮ−Ａ、ＭＢＮ−Ｂ、およびＣＥＬ Ｉに用いた酵素の量は、各々、０.７ｎｇ、１.９ｎｇおよび１６ｎｇであった。ｐＨ７.５でのＭＢＮによる活性の喪失はパネルＡおよびＢにおいて明白である。一本鎖ＤＮＡに対する活性についてのＭＢＮのＭｇ＋＋阻害もまた観察される。対照的に、ＣＥＬ Ｉは、Ｍｇ＋＋の存在下では不在下におけるよりも活性である。重要なことには、各酵素の最高活性条件についてパネルＡおよびＣにおける初期キネティクスを比較すると、ｐＨ５.５でＭｇ＋＋の不在下におけるＭＢＮ−Ａの一本鎖ヌクレアーゼ比活性は、ｐＨ５.５でＭｇ＋＋の存在下におけるＣＥＬ Ｉについてよりも約３２倍高いと考えられる（タンパク質１ｍｇ当たり可溶化ＤＮＡ ４.４６×１０４ｇに対してタンパク質１ｍｇ当たり可溶化ＤＮＡ １.４２×１０６ｇ／分）。
【００９４】
実施例９
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮのミスマッチエンドヌクレアーゼ活性
ミスマッチを含有するＤＮＡ二重鎖のＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉによるニッキングを図６に示す。四塩基ループを有するミスマッチをｐＨ７.５でＣＥＬ ＩおよびＭＢＮの両方の調製物によってニック処理する（Ａ、Ｂ、Ｃ）。この反応では、より多量のＭＢＮが必要であったことに注目する。しかしながら、ＣＥＬ Ｉよりも１０００倍多い酵素でさえ、ＭＢＮは一塩基ミスマッチでの塩基置換で特異的にニック処理することができない（Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨ）。ｐＨ７.５におけると同一の量のＭＢＮタンパク質をｐＨ５.５でＤＮＡ基質と一緒にインキュベートすると、基質はほとんど完全に消化される（データは示さない）。より少ない、より適当な量のＭＢＮをｐＨ５.５でＤＮＡ基質と一緒にインキュベートすると、ミスマッチ特異的ニッキングは全く見られない（データは示さない）。ＣＥＬ Ｉは、塩基置換ミスマッチ（パネルＦ）およびヘリックス外ヌクレオチド（パネルＩ）でニック処理する。パネルＦにおいて、位置１８３ｎｔでのブルーピークはヘテロ二重鎖の６−ＦＡＭ標識鎖上のミスマッチの３'側のニックに対応し、位置１４２ｎｔでのグリーンピークはＴＥＴ標識鎖上のミスマッチの３'側のニックに対応する。他のブルーピークのいくつかは、ＣＥＬ Ｉによる非特異的切断である；長時間、またはより多くのＣＥＬ Ｉ酵素と一緒に、該反応をインキュベートすると、これらのミスマッチ非特異的ピークはほとんどが除去されるが、ミスマッチ特異的ピークは残っている（図３）ということに注目するのは重要である。理由は、これらのバックグランドバンドが、しばしば、２本のＤＮＡ鎖が適正に塩基対形成しないＰＣＲ産物の非特異的ヘテロ二重鎖であるということである。これらの二重鎖は非特異的位置でＣＥＬ Ｉによってニック処理され、それらのシグナルは拡散される。パネルＩにおいて、２５２ｎｔでのグリーンピークは、ＰＣＲ産物のＴＥＴ標識鎖上のヘリックス外Ｇの３'側のニックに対応する。６−ＦＡＭ標識鎖上のヘリックス外Ｃのニックに対応するブルーピークは、位置１５１ｎｔであると予想されるが、示されていない。ＣＥＬ Ｉは、その５'末端付近の６−ＦＡＭ標識鎖をニック処理し、色素を除去し、それにより該アッセイにおいてブルーピークを評価することができなくなる。別法として、挿入体Ｃ基質を挿入体Ｇ基質によってより競争させることができた。
【００９５】
実施例１０
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮのＲＮａｓｅ活性
Ｓ１およびＣＥＬ Ｉに共通の性質は、文献において「糖非特異的」または「二機能性」と称される特徴であるＲＮＡおよびＤＮＡの両方を消化する能力である。本発明者らは、ＲＮＡ上でのＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉの比活性を、それらのＤＮａｓｅ活性に匹敵する条件を用いて比較した。ここで取り組む特定の問題は、ＲＮａｓｅ活性がｐＨ依存性であるか否か、および、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの比活性が各酵素について類似しているか否かということである。本発明者らのアッセイは、ＲＮＡの可溶性ヌクレオチドおよび短いＲＮＡフラグメントへの消化を測定する。ＭＢＮ−ＡのＲＮａｓｅ活性の比活性（図７Ａ）は、その一本鎖ＤＮａｓｅ活性（図５Ａ）に匹敵する。ＣＥＬ Ｉの比活性は、ｐＨ５.５においてＴｏｒｕｌａ Ｙｅａｓｔ ＲＮＡ上でＭＢＮ−Ａの５０分の１である。この値は、基質として変性子牛胸腺ＤＮＡを用いて、ＣＥＬ Ｉが比活性においてＭＢＮ−Ａの約３２分の１であるという本発明者らの発見と一致する。ＲＮａｓｅとしてのＣＥＬ Ｉは、ｐＨ７.５ではｐＨ５.５よりも僅かに活性である。これは、ＣＥＬ Ｉの一本鎖ＤＮａｓｅ活性についての観察結果と反対であるが、差異は小さい。かくして、ｐＨ５.５でのＭＢＮ、ならびにｐＨ５.５およびｐＨ７.５でのＣＥＬ Ｉは、ＤＮＡよりもＲＮＡを優先することを示さなかった。ＭＢＮ−Ａは、ｐＨ５.５におけると同一の比活性をもってｐＨ７.５でＲＮＡを消化した（図７）。これは、ＭＢＮ−ＡがｐＨ７.５で一本鎖ＤＮＡを消化する能力がほとんどないことと著しく対照的である（図５Ａ）。ＭＢＮ−ＢのＲＮａｓｅ活性について同様の結果が得られた（データは示さない）。
【００９６】
検討
糖タンパク質の精製
本発明者らは、非常に豊富なＣＥＬ Ｉを産生する精製プロトコールを従前に記載したが、該酵素は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で単一バンドであると考えられなかった（８）。汚染源を同定するために、本発明者らは、アラビドプシスシ・カルス（Arabidopsis callus）での精製を繰返し、同一の凝集の課題を観察した。本発明者らは、最も純粋なフラクションに対するマウス抗体を調製し、アラビドプシスｃＤＮＡ発現ライブラリー（２１）からの２種類の遺伝子（受入番号ＡＣ００１６４５、遺伝子ＰＩＤ：ｇ２０６２１５７およびＰＩＤ：ｇ２０６２１５９）の同定されたクローンに対する該抗血清を用いた（未発表データ）。これらのクローンは、ＣｏｎＡ様レクチンとして機能することが知られているブラッシカ・ナプス（Brassica napus）の２つのジャスモネート誘発性タンパク質に対して非常に相同であることが判明した（受入番号ＣＡＡ７２２７１、４７５アミノ酸において６２％の同一性）（２２）。かかるレクチンは、アラビドプシスにおける３０を超える遺伝子によってコードされ、精製されるべき糖タンパク質がレクチンよりも豊富でない場合に問題となり得る。本発明のプロトコールにおけるバッファー中のマンノースの存在は、この障害を克服し、ＣＥＬ Ｉの均質な調製物を提供した。
【００９７】
ＣＥＬ Ｉアミノ酸配列のアラインメント
ＣＥＬ Ｉアミノ酸配列のジェンバンクにおける全てのＳ１ホモログとのアラインメント（図１０）において、普遍的に保存された残基は、ポリペプチドの種々の領域に位置する、Ｎ末端トリプトファン残基、５個のヒスチジン残基、および３個のアスパルテート残基である（図２）。Ｐ１ヌクレアーゼのＸ線結晶構造によって明らかにされるように、これらの９個の残基は一緒に３個のＺｎ＋＋原子を結合する（２３−２４）。触媒活性部位の保存は、これらのヌクレアーゼがホスホジエステル結合の開裂について同一のメカニズムを有することを示唆しており、触媒ドメインを形成するために酵素構造の保存を必要とする。基質優先度の差異は基質認識のメカニズムにあり、触媒作用とは区別されていて、Ｓ１ファミリーヌクレアーゼは一本鎖核酸に対して特異的であるが、ＣＥＬ Ｉはミスマッチヘテロ二重鎖に対して高い特異性を示す。種々の基質の認識を可能にする配列は、あまり保存されないアミノ酸配列に存する。ＣＥＬ ＩおよびＳ１型ヌクレアーゼの触媒的差異を良好に定義するために、本発明者らは、植物において最もよく特徴付けられたＳ１ヌクレアーゼのオルソログであるＣＥＬ ＩとＭＢＮとを注意深く対照した。
【００９８】
ＣＥＬ Ｉおよびマングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼのｐＨ依存性
プラスミドｐＵＣ１９のＲＦ−Ｉにおいて、超コイル化は、ヌクレアーゼに対する基質となり得る一本鎖化領域を誘発する。さらにまた、複製起点のような領域はステム−ループ構造を形成することが知られている。超コイルプラスミドには不安定化配列があることも示された（２５）。図４のデータにより、ＭＢＮはｐＨ５.５ではｐＨ７.５におけるよりも１０００倍を超えて素早くＲＦ−Ｉをニックするが、ＣＥＬ ＩはｐＨ７.５ではｐＨ５.５におけるよりも活性であることが証明された。
【００９９】
酸性ｐＨでのＭＢＮのＲＦ−Ｉ切断に対する＞１０００倍高い活性は、酵素の触媒メカニズムの作用である。酸性ｐＨでのＲＦ−Ｉニッキングの速度をより速くする別の因子は、酸性ｐＨでのプラスミドの部分巻き戻しであり、それによって、より大きい一本鎖化性向を生じる。中性ｐＨでプラスミドＲＦ−Ｉに対して活性なＣＥＬ Ｉの場合、ＲＦ−Ｉの部分巻き戻しがＣＥＬ Ｉの結合により生じることが推測される。また、ＣＥＬ Ｉはプラスミドにおける一本鎖化を認識していない。理由は、ＣＥＬ Ｉの一本鎖ＤＮＡの消化がｐＨ５.５ではｐＨ７.５におけるよりも活性である（図５）にもかかわらず、ＣＥＬ ＩのＲＦ−ＩニッキングがｐＨ５.５ではｐＨ７.５ほど活性ではない（図４）ということである。
【０１００】
ＣＥＬ Ｉが基質として変性ＤＮＡを用いると、ＣＥＬ Ｉの比活性は酸性ｐＨでＭＢＮ−Ａの２０分の１であり（図５Ｃ）、Ｍｇ＋＋の存在下におけるｐＨ７.５では非常に僅かに改善されるだけである。不安定化ヘリックスの認識を反映するＲＦ−Ｉニッキングにおいて、ＣＥＬ Ｉ比活性は、ｐＨ５.５ではＭＢＮ−Ａの２分の１に過ぎないが、ＣＥＬ Ｉは、ｐＨ７.５では１０００倍活性である（図４）。さらにまた、ＣＥＬ Ｉは、ＭＢＮ−Ａよりも７００倍高い比活性で４個のヘリックス外塩基を含有するミスマッチヘテロ二重鎖をニック処理する（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。最後に、ＣＥＬ Ｉだけは塩基置換でＤＮＡをニックすることができる。したがって、ＣＥＬ Ｉが主として一本鎖ＤＮａｓｅではないことが明らかである。さらにまた、一本鎖化自体は、ＣＥＬ Ｉがミスマッチ基質において認識するものではない。
【０１０１】
活性ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮにおけるＭｇ＋＋の役割
ｐＨ５.５でのＭＢＮによるＲＦ−Ｉニッキングの初期速度は、Ｍｇ＋＋によって約１０〜２０倍抑制される。対照的に、ＣＥＬ Ｉは、全てアッセイ条件下でＭｇ＋＋によって刺激される。ＲＦ−ＩのＣＥＬ Ｉニッキングは、両方のｐＨにおいてＭｇ＋＋の存在下で有意に増大する。ＲＦ−Ｉニッキングアッセイ自体によって、Ｍｇ＋＋の効果がプラスミドＤＮＡ構造に対するものであるかまたは酵素に対するものであるかを区別することは可能ではない。基質としての一本鎖ＤＮＡに関して、基質超ヘリックス性に対するＭｇ＋＋の効果は含まれないので、酵素に対するＭｇ＋＋の効果はおそらく低かった。変異検出アッセイに関して、Ｍｇ＋＋が二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチでの最適なＣＥＬ Ｉ切開に必要とされることが明らかである（図３）。ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮがホスホジエステル結合開裂のために同一の触媒メカニズムを用いるとすれば、それらの差異は基質が認識される程度にある。Ｍｇ＋＋の役割は、基質認識のための構造的役割にあるが、ＤＮＡ加水分解にはない（２６）。最後に、ＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉは、共に、ＲＮａｓｅであることが観察される。意外にも、ＭＢＮは、主として、中性ｐＨでは、ＤＮａｓｅ活性よりも少なくとも１０００倍大きいＲＮａｓｅ活性を有するＲＮａｓｅである。
【０１０２】
かくして、ＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉが、構造的に関連するヌクレアーゼのＳ１スーパーファミリーの範囲内の２つの異なる酵素ファミリーを表すことが明らかである。Ｐ１ヌクレアーゼの高分解能Ｘ線構造は、二本鎖ヘリックスがＰ１ ＤＮＡ結合グローブに適合し得ないことを示した（２１−２２）。
【０１０３】
すなわち、ＣＥＬ Ｉは、ミスマッチ認識ヌクレアーゼの固有のファミリーの例であると考えられる。加えて、著しい配列類似性に基づいて、ＣＥＬ Ｉオルソログ配列は、ＣＥＬ Ｉについて本明細書で記載した変異検出のためのアッセイ方法において有利に用いられると考えられる。
【０１０４】
参考文献
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【０１０５】
本発明のある好ましい実施態様を上記にて記載し、具体的に例示したが、本発明はかかる実施態様に限定されるものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく種々の変更を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 精製されたＣＥＬ ＩおよいＣＥＬ ＩＩのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図２】 ＣＥＬ ＩのｃＤＮＡ（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列便号：２）を示す。
【図３】 ゲルイメージの写真であって、変異検出分析物のＣＥＬ Ｉ変異検出についてのＭｇ＋＋およびｐＨの効果を示す。
【図４】 ＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＦ−Ｉ ＤＮＡのニッキングを示す。
【図５】 ＣＥＬ Ｉおよびヤエナリヌクレアーゼによる変性仔ウシ胸腺ＤＮＡの可溶化を示す。
【図６】 ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮにより媒介されるミスマッチ検出を含む電気泳動図を示す。
【図７】 ＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＮＡの可溶化を示す。
【図８】 ＣＥＬ Ｉ精製フラクションのポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図９】 一対のゲルであって、炭水化物部分を除去する前後で、ＳＤＳゲルから再生されたＣＥＬ Ｉ、ＣＥＬＩＩ蛋白によるミスマッチ基材での切断を示す。
【図１０】 ＣＥＬ Ｉアミノ酸配列の同種配列とのクルスタル・ダブリュ・アライメントを示す。
【配列表】
米国特許法第２０２条（ｃ）は、国立衛生研究所、交付番号、ＮＩＨ ＣＡ７１４２６からの基金を用いて一部なされた、本明細書に記載の発明において米国政府が一の権利を有することを承認するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は標的とする核酸中の変異を検出するための物質および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼをコードする核酸分子および遺伝的疾患および癌の遺伝的スクリーニングを容易にする該酵素の使用方法を提供する。この方法はまた、遺伝的多形態の検出にも有用である。
【０００３】
（従来技術）
本発明の属する分野における現状をより十分に記載するために、数冊の刊行物をカッコ内の数字によって本願において引用する。これらの文献の完全な書誌的事項は、本明細書の終わりに見出される。これらの各刊行物の内容を出典明示することで本明細書の一部とみなす。
遺伝子内のヌクレオチドの配列は、その最も頻繁なものが、塩基対置換、フレームシフト変異および欠失または挿入である、数種類の方法のうちのいずれかで変異的に改変させるか、または「ミスマッチ」させることができる。これらの変異は放射線照射および変異誘発性化学物質などの環境因子によって誘発することができ；複製の間にＤＮＡポリメラーゼによって偶発的にエラーに付される。ＤＮＡ複製の信頼性は維持されないため、多数のヒト病態が起る。嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血およびある種の癌がＤＮＡ中の１個の塩基の変化により惹起され、異常的または非機能的蛋白の合成がもたらされる。
【０００４】
植物の高成長速度および植物中のＤＮＡインターカレーターの存在量はミスマッチおよびフレームシフト障害の傾向の増大を示唆する。植物および真菌は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者を攻撃する豊富な一本鎖特異的ヌクレアーゼを有することが知られている（９−１４）。これらのうちいくらかは、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）のヌクレアーゼαと同様に、ＤＮＡ組換えの間の遺伝子変換の一部を形成することが示唆されている（１５、１６）。これらのヌクレアーゼのうち、アスペルギルス・オリズエ（Aspergillus oryzue）から由来のＳ１ヌクレアーゼ（１７）、およびペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）から由来のＰ１ヌクレアーゼ（１８）、およびビグナ・ラジアタ（Vigna radiata）の子孫から由来のマン・ビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼ（１９−２２）が最も特徴付けられている。Ｓ１、Ｐ１およびマン・ビーン・ヌクレアーゼは主にｐＨ５.０付近で活性なＺｎ蛋白であるのに対して、ヌクレアーゼαはｐＨ８.０で活性である。バルキーな付加物の修復の場合、ＤＮＡ障害の一本鎖性特性が、植物酵素、ＳＰヌクレアーゼによって使用されていたようである。ホウレン草から精製されたヌクレアーゼＳＰは一本鎖ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅであって、中性のｐＨにてＴＣ６−４二量体およびシスプラチン障害のＤＮＡを切断できる（２３、２４）。
【０００５】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）における、塩基置換および不対合ＤＮＡループの障害は、メチル化指向性ロングパッチ修復システムによって修復される。このマルチ酵素システムにおける蛋白は、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳを含む（１、２）。このシステムは効果的であるが、Ｃ／Ｃ障害および４個よりも長いヌクレオチドのＤＮＡループは修復されない。ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬ蛋白は、細菌からヒトに至るまで保存されており、高等生物で同様の修復作用を遂行できるようである。ＭｕｔＳ／ＭｕｔＬシステムによって十分に修復されないいくらかの障害、およびショートパッチ修復システムがより望ましい遺伝子変換について、新規な能力を有する他のミスマッチ修復システムが必要である。
【０００６】
現在、変異分析に関する最も直接的な方法はＤＮＡ配列決定法であるが、それは最も骨が折れかつ費用もかかる。あらゆる実験試料で関連している可能性のある領域を配列決定するのは、通常、実用的ではない。それよりも、ある型の予備的スクリーニング法を用いて、変異を含有する試料のみを配列決定するために同定して標的とすることが一般的である。一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）は、天然ポリアクリルアミドゲルでの一本鎖野生型および変異体の配列間の移動度の差に基づいて、広範に使用されるスクリーニング法である。他の方法は天然ゲル（ヘテロ二本鎖分析）または変性ゲル（変性勾配ゲル電気泳動）での野生型／変異体ヘテロ二本鎖（対照ホモ二本鎖と比較）における移動度の相違に基づいている。試料調製は、これらのアッセイにおいて、比較的容易なわけであるが、電気泳動では、変異を含有する標的を同定するための基礎を形成する微妙であることが多い移動度の相違を生じさせるために、極めて正確な条件が必要とされる。もう一つ別の臨界的パラメーターは、スクリーニングすべき標的領域の大きさである。一般に、ＳＳＣＰを使用して、約２００−３００塩基より長くない標的領域がスクリーニングされる。単一塩基の変異を検出するＳＳＣＰの信頼性は多少不確実であるが、２００より小さい塩基の標的では恐らく７０〜９０％の範囲であろう。標的領域の大きさが増加するほど、検出率は減少し、例えば、長さが１８３ｂｐの標的についての８７％から３０７ｂｐの標的についての５７％までという一つの研究がある（３５）。一工程でより長い領域をスクリーニングする能力は、いずれの変異スクリーニング法の有用性をも高めるであろう。
【０００７】
現在用いられているスクリーニング技術のもう一つの型は、点変異を含有する実験用標的とハイブリッド形成する野生型プローブの間で形成されたヘテロ二本鎖中の不対合塩基の切断に基づいている。また、ミスマッチにおいてプローブの切断によって得られるサブフラグメントは、全長の切断されていないプローブと大きさが一般的に有意に異なり、しかも標準ゲルシステムで容易に検出されるので、切断生成物はゲル電気泳動によっても分析される。ミスマッチ切断は、化学的に（四酸化オスミウム、ヒドロキシルアミン）またはＲＮａｓｅＡを用いる毒性の小さな酵素代替物にて遂行されてきた。頻度はあまり大きくないが、内因的ｍＲＮＡ標的中の変異についてスクリーニングするために、またはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ標的中の変異を検出するために、ＲＮａｓｅＡ切断アッセイも用いられた。５０％を超える変異検出率が最初のＲＮａｓｅスクリーニング法について報告されている（３６）。
ＤＮＡ中の変異を検出するより新しい方法は、相補的標的核酸にハイブリダイズする２つの隣接するオリゴヌクレオチドを共有結合させるＤＮＡリガーゼに依存する。ミスマッチはライゲーションの部位で起きなければならない。オリゴヌクレオチドに依存する他の方法に関しては、ハイブリダイゼーションでの塩濃度および温度が非常に重要である。もう一つの考慮すべき事項は、ＤＮＡ濃度に対する添加される酵素の量である。
【０００８】
前記した方法は、正常配列または野生型配列などの、８０％を超えるバックグラウンド核酸で汚染されている核酸中の塩基変化を信頼性をもっては検出できない。汚染問題は、例えば、循環中で悪性細胞が極少量存在する場合の癌検出において重要である。今日用いられている方法は、臨床的状況において実際上適用されるべき十分な感度に欠ける。
ミスマッチ修復酵素を用いた遺伝子変異の検出法は、ＬｕＣｈａｎｇおよびＨｓｕによって記載されている。ＷＯ９３／２０２３３を参照のこと。誤対合Ａ／Ｇ残基を認識するＭｕｔＹ遺伝子の産物は、全ての塩基対ミスマッチにおいてニックを入れることができる「あらゆる型の酵素」として文献中に記載されたもう一つ別の酵素と組み合わせて使用されている。酵素は挿入および欠失を検出しない。また、あらゆる型の酵素は異なるミスマッチを異なる効率にて認識し、その活性はフランキングＤＮＡ配列によって悪影響を受け得る。従って、この方法は、所定のＤＮＡ分子中で生じ得る種々の変異を検出するための、ミスマッチ修復酵素および／またはＤＮＡグリコシラーゼの組み合わせのカクテルに依存する。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は標的とされるポリヌクレオチド鎖中の変異またはミスマッチを検出するための物質および方法を提供する。ミスマッチエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子およびその使用方法を開示する。本発明の核酸分子によりコードされるエンドヌクレアーゼを、標的とされる核酸鎖中の対合している塩基の改変をスクリーニングし、同定することを促進するゲルアッセイ系と組み合わせて用いて検出を行う。配列番号：１の配列を有する核酸の利用能は、かかるアッセイに用いるための多量の精製されたＣＥＬ Ｉ酵素の調製を容易にする。
本発明の好ましい具体例において、約４３ｋＤａで、長さが３０９個のアミノ酸のセルリから由来のエンドヌクレアーゼ蛋白をコードする、配列番号：１の配列を有する単離された核酸分子が提供される。このエンドヌクレアーゼ蛋白は複数のへリックスドメインおよびフレキシブルなカルボキシ末端領域を含む。核酸はＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれであってもよい。
【００１０】
本発明のゲノムクローンを単離するためのＤＮＡ分子もまた提供される。かかる配列はイントロンおよびエキソンを含むＣＥＬ Ｉ遺伝子の同定およびクローン化を促進し、そのエキソンがＣＥＬ Ｉ蛋白をコードし、配列番号：１の核酸と特異的にハイブリッド形成する。配列番号：１の核酸より転写される単離されたＲＮＡ分子もまた本発明の範囲内にある。
本発明のもう一つ別の態様において、ａ）配列番号：２の蛋白またはポリペプチドをコードする配列；ｂ）ａ）の相補的配列をコードする配列；ｂ）図２に示されるヌクレオチドの配列；およびｃ）ａ）またはｂ）の配列のいずれかのフラグメントを含む、ポリヌクレオチドが開示されている。
本発明の好ましい具体例において、約１０個および約２００個の間の長さのヌクレオチドの、配列番号：１と特異的にハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチドが提供される。
もう一つ別の具体例において、単離されたＣＥＬ Ｉ蛋白に対して免疫学的に特異的な抗体が提供される。該抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。
【００１１】
配列番号：１を含むプラスミドおよびベクターもまた本発明の範囲内にある。一の具体例において、ベクターはレトロウイルスベクターとすることができる。
本発明の好ましい具体例において、上記したプラスミドまたはベクターを宿主細胞中に導入することができる。この目的に適する宿主細胞は、限定されるものではなく、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、原核生物細胞、真菌細胞および哺乳動物細胞を包含する。
配列番号：１を含むトランスジェニック動物は本発明の中に含まれており、哺乳動物環境中でＣＥＬ Ｉ活性を評価するにおいて有用性を有する。
本発明の核酸を用いる方法も提供される。一の具体例において、ＣＥＬ Ｉ調節活性について試験化合物をスクリーニングする方法が提供される。ＣＥＬ Ｉをコードする核酸を発現する宿主細胞が提供される。その場合、宿主細胞をＣＥＬ Ｉ活性を調節すると思われる化合物と接触させ；ＣＥＬ Ｉ調節活性をＣＥＬ Ｉのエンドヌクレアーゼ活性における変化により評価される。
【００１２】
本発明の特に好ましい具体例において、一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列を含むポリヌクレオチドとハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドの変異していない配列との関係で、一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列中の変異を測定する方法が開示されている。該配列を増幅させ、検出可能なマーカーで標識化し、相互にハイブリッド形成させ、配列番号：１の配列を有する核酸に対して＞６０％の同一性を有する核酸分子によりコードされる植物エンドヌクレアーゼに曝し、変異の存在について分析する。もう一つ別の具体例において、エンドヌクレアーゼはＣＥＬ Ｉであり、配列番号：１によりコードされる。配列番号：１の配列を有する核酸の利用能は、上記した方法において用いるための、多量のＣＥＬ Ｉエンドヌクレアーゼの産生を促進することである。ＣＥＬ Ｉに対して６０％より大きな配列同一性を有する具体的なエンドヌクレアーゼは、ジンニア（Zinnia）からのＺＥＮ１、アラビドピス（Arabidopis）からのＢＦＮ１およびデイリリーからのＤＳＡ６によりコードされる。
【００１３】
ＣＥＬ Ｉに対応するミスマッチ特異的ヌクレオチドが１４種以上の植物種で検出されている。したがって、さらに多くの植物が配列番号：２と高いパーセンテージの同一性を有する蛋白を産生するヌクレアーゼ遺伝子を含有すると考えられる。このようにＣＥＬ Ｉ様活性を生成するためにこれらのオルトログヌクレアーゼ配列を使用することは本発明に関連すると考えられる。コード化されたＣＥＬ Ｉヌクレアーゼおよびそのオルトログは以下の活性：ｉ）ハイブリッド形成された配列の間のすべてのミスマッチの検出；ｉｉ）約１００ｂｐと約３ｋｂの間の長さのポリヌクレオチド鎖における配列の違いの認識；およびｉｉｉ）隣接するポリヌクレオチド配列により惹起される実質的な副作用のない標的ポリヌクレオチド配列中の変異の認識；を有する。
ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子は上記した方法にて評価することができる。該方法を用いて、遺伝的疾患および癌の素因に関連するＤＮＡ中の変化を同定するためのスクリーニングアッセイに供することができる。
本発明のもう一つ別の具体例において、エンドヌクレアーゼ活性有するＣＥＬ Ｉのイソ酵素が提供される。そのＣＥＬ Ｉイソ酵素は３９ｋｄの分子量を有し、セルリから単離される。
【００１４】
本発明のパラメーターをより明瞭に述べるために、以下の定義を用いる：
「エンドヌクレアーゼ」なる語はＤＮＡを内部で切断できる酵素をいう。
「塩基対ミスマッチ」なる語は、ワトソンおよびクリック塩基対合規則に従って核酸中で通常は形成されない塩基対の組合せを示す。例えば、ＤＮＡ中に一般的に見られる塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンおよびチミジンで扱う場合、塩基対ミスマッチとは、ＤＮＡ中に通常見られるＡ−ＴおよびＧ−Ｃ対以外の塩基組合せである。本明細書に記載されるように、ミスマッチは、例えば、シトシン残基が本来の対合パートナーであるグアニンに対抗するように向かいのもう一つ別のシトシンに見られる、Ｃ／Ｃを意味するように示すことができる。
「ＤＮＡ挿入または欠失」なる語は、挿入および欠失した塩基の領域にわたり相補性が維持されないような、ＤＮＡの２つの鎖間における「マッチした」塩基の存在または不存在をいう。
【００１５】
「相補的」なる語は、実質的に正常な塩基対合特性を示す２つのＤＮＡ鎖をいう。しかしながら、相補的ＤＮＡは１以上のミスマッチを含有していてもよい。
「隣接する核酸配列」なる語は、エンドヌクレアーゼ切断部位に対して５’側および３’側にある隣接する核酸配列をいう。
「多重分析」なる語は、前記の方法によるプールされたＤＮＡ試料の同時アッセイをいう。
Ｃ＞Ｔは、ミスマッチを生じさせるシトシン残基の代わりにチミジン残基を用いることを示す。ミスマッチまたは多型を生じさせるもう一つ別の塩基の代わりにいずれかの塩基を不適当に用いることもこのように示すことができる。
Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-6-カルボキシルローダミン（ＴＡＭＲＡ）は、ＤＮＡ分子量標準を標識するのに用いる蛍光染料であり、該標準は、順次、自動ＤＮＡ配列決定によって分析されるＤＮＡについての内部標準として利用される。
プライマーは、６-カルボキシフルオレセイン（６-ＦＡＭ）で蛍光標識することができる。別法として、プライマーは、４,７,２',７'-テトラクロロ-６-カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）で標識することもできる。他の代替ＤＮＡ標識法は、当該技術分野で知られており、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００１６】
本明細書中で用いる「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいい、一本鎖とした場合、その相補的配列の分子は線状または環状形態のいずれであってもよい。核酸分子について述べる場合、個々の核酸の配列または構造はその配列を５’から３’の方向にて示す通常の取り決めに従って記載する。本発明の核酸に関して、時に「単離された核酸」なる語を使用する。この語が、ＤＮＡに用いられる場合、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中でそれが直ぐ隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子をいう。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターのようにベクターに挿入されたＤＮＡ分子、あるいは原核生物もしくは真核生物細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに取り込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。
ＲＮＡに用いられる場合、「単離された核酸」なる語は、主に、上記した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子をいう。また、この語はそれがその自然な状態（すなわち、細胞または組織中の状態）にて結合している他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子をいう。単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに生物学的手段または合成手段により直接産生され、その生成の間に存在する他の成分から分離されている分子をいう。
【００１７】
核酸の特定の配列の「自然対立遺伝子変種」、「変異体」および「誘導体」とは、自然にまたは設計のいずれかにより、配列または構造において変化を有していてもよいが、個々の配列に密接に関係付けられる核酸配列をいう。密接に関係付けられるとは、ヌクレオチドの配列の少なくとも６０％、多くの場合で８５％より多くが、個々の配列番号を用いて言及される核酸配列の所定の長さにわたって対合していることを意味する。密接に関係付けられる核酸配列間のヌクレオチド配列における変化または違いとは、個々の核酸配列の自然における正常な複製または重複の過程の間に起る配列中のヌクレオチド変化として表すことができる。核酸の調節領域におけるアミノ酸コドンまたは配列を変化させるなどの、特定の目的のために、別の変形を具体的に設計し、その配列中に導入してもよい。このような個々の変形は種々の変異誘発技法を用いてインビトロにて行ってもよく、あるいは変形を誘発または選択する個々の選択条件下に置かれた宿主生物において生じさせることができる。このように具体的に生成された配列の変種を原配列の「変異体」または「誘導体」ということができる。
【００１８】
個々の配列に言及する際の「％類似性」、「％同一性」および「％相同性」なる語は、ウィスコンシン大学のＧＣＧソフトウェアプログラムに示されるように用い、以下にさらに詳述する。
本発明はまた、本発明のＣＥＬ Ｉポリペプチドまたは蛋白の活性部分、フラグメント、誘導体および機能的もしくは非機能的模倣体を包含する。ＣＥＬ Ｉポリペプチドの「活性部分」とは、全長のＣＥＬ Ｉポリペプチドよりも短いが、測定可能な生物学的活性を保持するペプチドを意味する。
ＣＥＬ Ｉポリペプチドの「フラグメント」または「部分」とは、少なくとも約５個ないし７個の連続したアミノ酸の、少なくとも約７個ないし９個の連続したアミノ酸であることも多い、典型的には少なくとも約９個ないし１３個の連続したアミノ酸の、最も好ましくは少なくとも約２０個ないし３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸のアミノ酸残基の鎖を意味する。ＣＥＬ Ｉポリペプチドの「誘導体」またはそのフラグメントとは、蛋白のアミノ酸配列を変えることにより、例えば、蛋白をコードする核酸を操作するか、または蛋白それ自体を改変することにより修飾されたポリペプチドを意味する。このような天然アミノ酸配列の誘導体は、１個またはそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を含んでいてもよく、原型のＣＥＬ Ｉポリペプチドの本質的活性を改変していてもいなくてもよい。
【００１９】
ＣＥＬ Ｉポリペプチドの異なる「変種」が自然に存在する。これらの変種は蛋白をコードする遺伝子のヌクレオチド配列における違いにより特徴付けられる対立遺伝子であってもよく、あるいは異なるＲＮＡプロセッシングまたは翻訳後修飾を含んでいてもよい。当業者は単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または変換を有する変種を産生することができる。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸で置換された変種、（ｂ）１個またはそれ以上のアミノ酸がＣＥＬ Ｉポリペプチドに付加された変種、（ｃ）１個またはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変種、および（ｄ）ＣＥＬ Ｉポリペプチドが、例えば、抗体についてのエピトープ、ポリヒスチジン、ビオチン部分などの、ＣＥＬ Ｉポリペプチドに有用な特性を付与することのできる、融合パートナー、蛋白タグまたは他の化学的部分などのもうひとつ別のペプチドまたはポリペプチドと融合している変種を包含することができる。本発明の他のＣＥＬ Ｉポリペプチドは、保存または非保存位置のいずれかで、ある種から由来のアミノ酸残基が他の種の対応する残基と置き換えられている変種を包含する。もう一つ別の具体例において、非保存位置にあるアミノ酸残基は保存または非保存残基と置換されている。遺伝的（抑圧、欠失、変異など）、化学的および酵素的技法を含む、これら変種を得るための技法は当業者に知られている。
【００２０】
別の核酸プロセッシング形態および別の翻訳後修飾形態を含むかかる対立遺伝子変種、アナログ、フラグメント、誘導体、変異体および修飾体がＣＥＬ Ｉポリペプチドのいずれかの生物学的特性を保持しているＣＥＬ Ｉポリペプチドの誘導体をもたらす範囲にまで、それらは本発明の範囲に含まれる。
本明細書で用いる「オルトログ」なる語は、ポリペプチド産物がＣＥＬ Ｉをコードする配列と６０％より大きな同一性を有し、遺伝子産物がＣＥＬ Ｉと類似する三次元構造および生化学活性を有する、核酸配列によりコードされるヌクレアーゼをいう。本発明の方法におけるかかるオルトログによりコードされるヌクレアーゼの使用を本発明では意図するものである。代表的なオルトログはＺＥＮ１、ＢＦＮ１およびＤＳＡ６を包含するが、限定されるものではない。
本明細書で用いる「機能的」なる語は、核酸またはアミノ酸配列が上記したアッセイまたは目的について機能的であることを意味する。
【００２１】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に言及する際の「本質的に…からなる」という語は、所定の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸は配列に言及して用いる場合、この語はその配列それ自体を含み、該配列の基本的および新規な特徴に影響を及ぼさない修飾分子を含む。
「レプリコン」はいずれかの遺伝的因子、例えば、それ自身の制御下で大きく複製することのできる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスである。レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。
「ベクター」はプラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどのレプリコンであり、結合した配列または因子の複製が起るように別の遺伝的配列または因子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの）が結合していてもよい。
【００２２】
「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳調節配列を有し、宿主細胞または生物にてポリペプチドをコードする配列の発現を促進することのできる核酸セグメントをいう。
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、本発明のプライマーおよびプローブをいい、２個またはそれ以上の、好ましくは３個以上のリボ−またはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、種々の因子に、およびオリゴヌクレオチドの個々の用途および使用によるであろう。
【００２３】
本明細書で用いる「プローブ」なる語は、該プローブに対して相補的な配列を有する核酸とアニーリングする能力を有するか、あるいは該核酸と特異的にハイブリダイズする能力を有する、精製された制限酵素消化物にあるように天然に存在するか、または合成的に産生されるかの、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸をいう。プローブは一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源およびその方法の用途を含む、多くの因子に依存する。例えば、標的配列の複合性に依存する診断的用途の場合、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、１５−２５またはそれ以上のヌクレオチドを有するが、ヌクレオチドの数はより少なくてもよい。本発明におけるプローブは、個々の標的核酸配列の異なる鎖と「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、所定の一連の条件下で、プローブがその各々の標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」かまたはアニールしなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、プローブ配列の残りを標的鎖に対して相補的としながら、非相補的ヌクレオチドフラグメントをプローブの５’または３’末端に付着させてもよい。別法として、非相補的塩基またはより長い配列をプローブ中に散在させることができるが、そのプローブ配列は標的とする核酸の配列と十分な相補性を有し、それと特異的にアニールすることを条件とする。
【００２４】
「特異的にハイブリダイズする」なる語は、当該分野にて一般に使用される所定の条件下で、特異的なハイブリダイゼーションを可能とするように十分に相補的な（時に、「実質的に相補的な」という）配列の２つの一本鎖核酸分子間の結合をいう。とりわけ、この語はオリゴヌクレオチドと本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションをいう。ただし、オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸の非相補的配列とのハイブリダイゼーションを除く。
【００２５】
本明細書にて用いる「プライマー」なる語は、適当な環境下に置かれた場合に、鋳型依存的核酸合成のイニシエーターとして機能的に作用しうる、生物学的システムに由来するか、制限酵素の消化により生成されるか、または合成的に生成される、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの、一本鎖または二本鎖のいずれかの、オリゴヌクレオチドをいう。適当な核酸鋳型、核酸の適当なヌクレオシド三リン酸先駆体、ポリメラーゼ酵素、適当なコファクターおよび適当な温度およびｐＨなどの条件に付されると、該プライマーはヌクレオチドの付加によってその３’末端から伸長し、ポリメラーゼの作用または類似する活性により、プライマー伸長産物を生成することができる。プライマーの長さは個々の条件および適用要件に応じて変化させることができる。例えば、診断に用いる場合、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、典型的には、ヌクレオチドが１５−２５個またはそれ以上である。プライマーは、所望の伸長産物の合成を作動させるのに、すなわちポリメラーゼまたは類似酵素による合成の開始における使用のために適宜並列してプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な方法にて所望の鋳型鎖とアニールできるように、所望の鋳型に対して十分に相補的でなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な相補体である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列を別の相補的プライマーの５’末端に結合させてもよい。別法として、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させることもできる；ただし、そのプライマー配列は伸長産物を合成するための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供するために所望の鋳型鎖の配列との十分な相補性を有することを条件とする。
【００２６】
本明細書中では、時に、「単離された蛋白」または「単離かつ精製された蛋白」なる語を用いる。この語は主として本発明の単離された核酸分子の発現により産生される蛋白をいう。この語はまた、「実質的に純粋な」形態にて存在するように、それと自然に結合した他の蛋白から十分に分離されている蛋白をいう。「単離された」とは、他の化合物または物質との人工的または合成的混合物、あるいは基本的な活性を干渉しない不純物の存在を排除することを意味するものではなく、例えば、精製が不完全なため、安定化剤を添加したため、または、例えば免疫原性調製物もしくは医薬上許容される調製物と化合させたことを利用として、それらの物質が存在してもよい。
「実質的に純粋な」なる語は、所定の物質（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、蛋白など）を少なくとも５０−６０重量％で含む調製物をいう。該調製物は、より好ましくは少なくとも７５重量％の、最も好ましくは９０−９５重量％の所定の化合物を含む。純度は所定の化合物に適する方法（例えば、クロマトグラフィー、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定する。
【００２７】
「成熟蛋白」または「成熟ポリペプチド」とは、ポリ蛋白先駆体からの蛋白分解工程などのその発生の過程の間にポリペプチドに対して通常発生するいずれかのプロセッシング事象の後に、ポリペプチドの配列を有する一のポリペプチドを意味する。成熟蛋白の配列または境界を示すにおいて、成熟蛋白の配列の第１のアミノ酸をアミノ酸残基１と称する。
【００２８】
「タグ」、「タグ配列」または「蛋白タグ」なる語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸、ペプチドもしくは蛋白のいずれかの化学的部分、あるいは別の配列に付加した場合に、特に検出または単離においてその配列に対して付加的な有用性を提供するかまたは有用な特性を付与する他の化学的部分をいう。このように、例えば、ホモポリマー核酸配列または捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列をプライマーまたはプローブ配列に付加し、その後の伸長産物またはハイブリッド形成した産物の単離を容易にすることができる。蛋白タグの場合、ヒスチジン残基（例えば、４ないし８個の連続的ヒスチジン残基）を蛋白のアミノ−またはカルボキシ−末端のいずれかに付加し、キレート金属クロマトグラフィーによる蛋白の単離を容易にすることができる。また、特異的抗体分子と反応するエピトープまたは結合決定因子を提示するアミノ酸配列、ペプチド、蛋白または融合パートナーまたは他の分子（例えば、フラッグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスの膜貫通蛋白、ヘマグルチニン蛋白、蛋白Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモデュリン結合蛋白、マルトース結合蛋白、キチン結合ドメイン、グルタチノンＳ−トランスフェラーゼなど）を蛋白に付加し、アフィニティーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーなどの操作により蛋白の単離を容易にすることができる。化学タグ部分はビオチンのような分子を包含し、それを核酸または蛋白のいずれかに付加し、アビジン試薬などとの相互作用により単離または検出を容易にすることができる。多くの他のタグ部分が知られており、当業者であれば想定することができ、それらも本発明の範囲内にあると考えられる。
【００２９】
「トランスフォーム」、「トランスフェクト」、「トランスデュース」なる語は、核酸を細胞または宿主生物中に導入するいずれかの方法または手段をいい、同じ意味を伝えるのに互換的に用いることができる。かかる方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合などを包含するが、これに限定されるものではない。
導入された核酸は、被験者の細胞または組織体の核酸中に組み込まれても（共有結合しても）組み込まれなくてもよい。細菌、酵母、植物および動物細胞においては、例えば、導入された核酸をエピソーム因子または独立的レプリコン、例えばプラスミドとして維持することができる。また、導入された核酸は被験者の細胞または組織体の核酸中に組み込まれるようになり、かかる細胞または組織体中で安定して維持され、さらに被験者の細胞または組織体の子孫細胞または組織体に継代または受け継がれる。別の意味で、導入された核酸は被験者の細胞または宿主の組織体中に単に一時的に存在してもよい。
【００３０】
「クローン」または「クローン細胞集団」は単細胞または有糸分裂により共通の祖先から由来の細胞の集団である。
「細胞系」は数代にわたってインビトロにて安定した成長能を有する一次細胞または細胞集団のクローンである。
「免疫応答」は、機能性免疫系を有する宿主にて、蛋白抗原などの抗原により生成されるいずれかの反応を意味する。免疫応答は、自然における体液性、すなわち、イムノグロブリンまたは抗体の産生に関与するか、または種々のＢ型およびＴ型リンパ球、樹状突起細胞、マクロファージ、抗原提示細胞などに関与する、自然での細胞性のいずれかの応答、あるいはその両方である。免疫応答はまた、サイトカイン、リンホカインなどの種々のエフェクター分子の産生または合成を包含する。免疫応答は、インビトロおよび種々の細胞または動物系の両方にて測定することができる。
「抗体」または「抗体分子」は、固有の抗原に結合する、抗体およびそのフラグメントを含む、いずれかのイムノグロブリンである。この語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラおよび二重特異性抗体を包含する。本明細書で用いる場合、抗体または抗体分子は、無傷のイムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）のような当該分野にて知られている部分の両方を意図するものである。
【００３１】
（図面の簡単な記載）
図１Ａ−１Ｄは精製されたＣＥＬ ＩおよいＣＥＬ ＩＩのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を示す。図１Ａ：レーン１、片側にＫＤａで示される分子量標準。レーン２、１μｇの同種ＣＥＬ Ｉ酵素。パネルＢおよびＣはＥｎｄｏ Ｈｆ処理によるＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ蛋白バンドの移動性の変化を試験する。パネルＢの試料は単にＣＥＬ Ｌだけを含有する。パネルＣの試料はＣＥＬ ＩとＣＥＬ ＩＩの混合物を含有する。パネルＤはスルフヒドリル還元した後の同種ＣＥＬ Ｉの移動性の変化を示す。図１Ｂ：レーン１、Ｅｎｄｏ Ｈｆ。レーン２、分子量標準。レーン３、同種ＣＥＬ Ｉ、約３０ｎｇ。レーン４、Ｅｎｄｏ Ｈｆで消化されたＣＥＬ Ｉ。図１Ｃ：レーン１、Ｅｎｄｏ Ｈｆ。レーン２、分子量標準。レーン３、少量のＣＥＬ ＩＩを含む精製されたＣＥＬ Ｉ。レーン４、Ｅｎｄｏ Ｈｆで消化されたＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ。図１Ｄ：精製されたＣＥＬ Ｉを、ＳＤＳ試料バッファー中、１％β−メルカプトエタノールの存在（レーン２）または不存在（レーン３）下で２分間煮沸した。レーン１、分子量標準。Ｈ＝Ｅｎｄｏ Ｈｆ。Ｉ＝ＣＥＬ Ｉ、ＩＩ＝ＣＥＬ ＩＩ。
【００３２】
図２はＣＥＬ ＩのｃＤＮＡ（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列便号：２）を示す。エドマン分解法により測定されたアミノ酸配列を太文字で示す。それらはＮ−末端配列：ＷＳＫＥＧＨＶＭＴＣＱＩＡＱＤＬＬＥＰＥＡＡＨＡＶＫＭＬＬＰＤＹＡＮＧＸＬＳＳＬＸＶＷＰ；ＧｌｕＣ消化物からの内部ペプチド：ＸＳＷＬＱＤＶＥ；トリプシン消化物からの内部ペプチド：ＣＤＤＩＳＴＣＡＮＫＹＡＫＥおよびＬＡＣＮＷＧＹＫからなる。ＤＳＡ６、ＢＦＮ１およびＺＥＮ１と同じ残基に下線を付す。保存されているｃｙｓ残基の下に＃を付す。Ｐ１ヌクレアーゼの３つのＺｎ原子についてのリガンドであることがわかった９個の保存されている残基の下に＋を付す。
【００３３】
図３はジンスキャンプログラムで起動するパーキンエルマー自動ＤＮＡシーケンサーを用いた変異検出分析物の、ＣＥＬ Ｉ変異検出についてのＭｇ＋＋およびｐＨの効果を示す、ゲル影像の写真である。基材はＴ−Ｇ多形性を含有するＢＲＣＡ１遺伝子エキソン５の２３５ｂｐＰＣＲ産物である。それを５’末端でトップストランドにて６−ＦＡＭ（ブルー）で標識し、ボトムストランドをＴＥＴ（グリーン）で標識する。基材を０．５ユニットのＣＥＬ Ｉと一緒に４５℃で３０分間インキュベートし、ついで図６に記載されるように分析した。レーン５における１５６ｎｔでのバンド（標識「ブルーカット」）は６−ＦＡＭ−標識ストランド上のＣＥＬ Ｉミスマッチ特異的カッティングに対応し、８０ヌクレオチドでのバンド（標識「グリーンカット」）はＴＥＴ−標識ストランド上のそのミスマッチ特異的カッティングに相当する。各レーンにてゲル影像の底部にあるバンドは内部サイズ標準を示す。
【００３４】
図４Ａ−４ＦはＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＦ−Ｉ ＤＮＡのニッキングを示す。アッセイは３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下（充実記号）または不存在下（中空記号）にある。パネルＡ、ＣおよびＥはｐＨ５．５でのアッセイである。パネルＢ、ＤおよびＦはｐＨ７．５でのアッセイである。
【００３５】
図５Ａ−５ＣはＣＥＬ Ｉおよびヤエナリヌクレアーゼによる変性仔ウシ胸腺ＤＮＡの可溶化を示す。アッセイは３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下（充実記号）または不存在下（中空記号）にある。丸はｐＨ５．５でのアッセイである。四角はｐＨ７．５でのアッセイである。パネルＡ、ＢおよびＣで試験した酵素は、各々、ＭＢＮ−Ａ、ＭＢＮ−ＢおよびＣＥＬ Ｉである。ＣＥＬ Ｉの一本鎖ヌクレアーゼ活性の一単位は同種ＣＥＬ Ｉの３２ｎｇに等しい（パネルＣにおける２０分までの初速度から明らかなように、３．１ｘ１０４単位の一本鎖ヌクレアーゼ／酵素１ｍｇ）。
【００３６】
図６Ａ−６ＩはＣＥＬ ＩおよびＭＢＮにより媒介されるミスマッチ検出を含む電気泳動図である。ＰＥ−バイオシステム自動ＤＮＡシーケンサーにおけるジンスキャンフラグメント分析の電気泳動図を示す。ＢＲＣＡ１遺伝子のＰＣＲ産物の２色蛍光性へテロ二本鎖を実験操作に記載されているように調製した。縦軸、蛍光単位；横軸、ヌクレオチドのＤＮＡ長。パネルＡ、ＤおよびＧにおいては、ＤＮＡを７ｎｇのＭＢＮ−Ａと一緒にインキュベートした。パネルＢ、ＥおよびＨにおいては、ＤＮＡを１１ｎｇのＭＢＮ−Ｂと一緒にインキュベートした。パネルＣ、ＦおよびＩにおいては、ＤＮＡを１０ｐｇのＣＥＬ Ｉと一緒にインキュベートした。これらの反応を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むバッファーＩ中、３７℃で３０分間行った。パネルＡ、ＢおよびＣにおいて、基材は４ｎｔ欠失を含有する３８７ｂｐへテロ二本鎖であった。パネルＤ、ＥおよびＦにおいて、基材はＣ−Ｔ塩基置換ミスマッチを含有する３２３ｂｐ産物であった。パネルＧ、ＨおよびＩにおいて、基材は一方のストランドにおいてＣ挿入を含有する４０２ｂｐヘテロ二本鎖であった。パネルＡ、ＢおよびＣの各々のパネルにおいて、１２９ｎｔでのピークは６−ＦＡＭ−標識したストランド上の４塩基挿入でのカッティングに相当し；２５８ｎｔでのピークはＴＥＴ−標識したストランド上の４塩基挿入でのカッティングに相当する。パネルＤ、Ｅ、ＧおよびＨにおいて、２種のＭＢＮによるミスマッチ特異的カッティングは見られない。パネルＦにおいて、１８３ｎｔでのピークは６−ＦＡＭ−標識したストランド上のＣＥＬ Ｉ−ミスマッチ特異的カッティングに相当し、１４２ｎｔでのピークはＴＥＴ−標識したストランド上のミスマッチ−特異的カッティングに相当する。パネルＩにおいて、２５２ｎｔでのピークはＴＥＴ−標識したストランド上のエクストラヘリカルＧでのＣＥＬ Ｉ特異的カッティングに相当する。
【００３７】
図７はＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＮＡの可溶化を示す。トルラ酵母を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ５．５（Ａ）およびｐＨ７．５（Ｂ）で、０．７ｎｇのＭＢＮ−１（充実記号）と一緒に、または１６ｎｇのＣＥＬ Ｉ（中空記号）と一緒にインキュベートする。
【００３８】
図８はＣＥＬ Ｉ精製フラクションのポリアクリルアミドゲル分析を示すゲルである。酵素を精製する各工程からの略等量のＣＥＬ Ｉ活性を有するＣＥＬ Ｉのアリコートを、還元剤の不存在の下で、ＳＤＳゲルバッファー中で煮沸し、実験的操作にて詳説されるようにＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に溶かした。再生後、ヌクレアーゼはゲル中に埋め込んだ変性ＤＮＡを消化した。消化されないＤＮＡをトルイジンブルー０で染色し、ヌクレアーゼの位置についての負の影像を得た。レーン１：分子量マーカー；レーン２：緩衝化されたセルリジュース；レーン３：２５％硫酸アンモニウム分別上澄；レーン４：８０％硫酸アンモニウム分別ペレット；レーン５：ＣｏｎＡセファロースカラムに入れる試料；レーン６：ＣｏｎＡセファロースカラムからの溶出液；レーン８：ホスホセルロースＰ−１１カラムからの溶出液；レーン９：フェノールセファロースカラムからの溶出液；レーン１０：ＭｏｎｏＱカラムからのフラクション１１および１２のプール。
【００３９】
図９Ａおよび９Ｂは、一対のゲルであって、炭水化物部分を除去する前後で、ＳＤＳゲルから再生されたＣＥＬ Ｉ、ＣＥＬＩＩ蛋白によるミスマッチ基材での切断を示す。ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ蛋白バンドをＳＤＳゲルから削除し、実験操作にて記載されるように再生した。その再生した酵素を用いて、ＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン２０の４０２ｂｐの蛍光標識したＰＣＲ産物を消化した。レーン１−６はエキソン２０にミスマッチのない野生型ＤＮＡ試料から調製されたホモ二本鎖である。レーン７−１２においては、試料中にあるこの配列の異型接合的特性のため、ＰＣＲ産物は１つのストランドがＧ残基挿入体を含有するヘテロ二本鎖である。エクストラヘリカルＧ残基の３’側でＣＥＬ Ｉを削除して、「挿入されたＧの削除」として図示される、グリーンバンドを生成する。レーン１および７：ＣＥＬ Ｉ処理を施していない基材；レーン２および８：精製された未変性のＣＥＬ Ｉによる基材の削除；レーン３および９：４３ｋＤａＣＥＬ ＩバンドのＥｎｄｏＨｆ消化によって始められる再生された２９ｋＤａＣＥＬ Ｉポリペプチドバンドによる基材の削除；レーン４および１０：３９ｋＤａＣＥＬ ＩＩバンドのＥｎｄｏＨｆ消化によって始められる再生された３７ｋＤａＣＥＬ ＩＩポリペプチドバンドによる基材の削除；レーン５、６、１１および１２：再生された４３ｋＤａＣＥＬ Ｉバンドによる基材の削除。
【００４０】
図１０はＣＥＬ Ｉアミノ酸配列の同種配列とのクルスタル・ダブリュ・アライメントを示す。同種配列のジンバンク受入番号を括弧内に示す。１：（Ｐ２４０２１）アスペルギルス・オリザエのヌクレアーゼＰ１；２：（Ｐ２４２８９）ペニシリウム・シトリナムのヌクレアーゼＰ１；３：ＣＥＬ ＩｃＤＮＡアミノ酸配列；４：（ＡＢ００３１３１）ジンニア・エレガンスからのＺＥＮ１エンドヌクレアーゼ；５：（ＡＦ０８２０３１）ヘルモカルリス雑種品種のデイリリー老化関連蛋白（ＤＳＡ６）；６：（Ｕ９０２６４）アラビドピス・タリアナの二機能性ヌクレアーゼＢＦＮ１。Clustal Ｗ Multiple Sequence Alignement Kim C. Worley, Human Genome Centoer- Baylor College of Medcine（http://dot. imgen. bcm. tmc. edu: 9331/cqi-bin/multi-align/multi-algin.p1.）。Ｐ１ヌクレアーゼの別の構造（Volbeda,A., Lahm,A., Sakiyama,F.およびSuck,D. ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９１）１０：１６０７−１６１８およびRomier,C., Dominguez,R., Lahm,A., Dahl,O., およびSuck, D.（１９９８）Proteins: Structure, Function and Genetics ３２：４１４−４２４）が示されている。３つのＺｎ原子と結合する９個の残基を太文字で示す。これらの残基に対応するＺｎ原子をアライメントの下に示す。
【００４１】
（発明を実施するための最良の形態）
ＤＮＡ複製の間の正しい塩基配列の維持についての酵素的基礎は、イー・コリ（E.coli.）で広範に研究されてきた。この生物は４ヌクレオチド長までの挿入／欠失と同様にヘミメチル化ＤＮＡ中の種々のＤＮＡ塩基対ミスマッチを訂正するミスマッチ修復経路を進化させてきた。この経路を欠く細胞はより頻繁に変異し、それゆえに、当該遺伝子は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨ等と呼ばれる。ＭｕｔＳ蛋白はミスマッチに結合し、ＭｕｔＨはＡ残基がメチル化されていない鎖上のＧＡＴＣ部位でＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。ＭｕｔＬは、修復の間にＭｕｔＨおよびＭｕｔＳとの複合体を形成する。ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬの相同物は多くの系で存在するが、ＭｕｔＨは存在しない。酵母において、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ相同物）はそれ自体がミスマッチに結合できるが、２つのＭｕｔＬ相同物（ＭＬＨおよびＰＭＳ１）とＭＳＨ２の複合体が観察されている。ヒト相同物ｈＭＳＨ２は、長さが１４個までのヌクレオチドのより大きなＤＮＡ挿入体に結合するように進化し、そのことはヒトのマイクロサテライト繰返し単位でのミスアライメントなどの機構により頻繁に生じている。これらのヒト相同物のいずれか１つにおける変異は非ポリープ性結腸癌の遺伝的形式に関与していることがわかった（２７、２８）。
【００４２】
セルリは、光感作性インターカレーターであるソラレンを組織グラム当たり４０μｇを超えて含有する（３）。必然的に、セルリは挿入、欠失および他のソラレン・フォトアダクツ（photoadduct）の障害の修復について高い能力を有する可能性がある。障害部位における一本鎖性は、塩基置換およびＤＮＡループ障害に共通する。以下の例におけるデータは、セルリがこれらの潜在的な変異誘発性の事象に対処するために豊富なミスマッチ−特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を有することを示す。
【００４３】
セルリから単離したＣＥＬ Ｉは、塩基置換ミスマッチおよびＤＮＡ変形の部位で極めて特異的にＤＮＡを切断する、既知の最初の真核生物性ヌクレアーゼである。該酵素は、活性のためにＭｇ＋＋およびＺｎ＋＋を必要とし、ｐＨ最適値を中性ｐＨとする。本発明者らはＣＥＬ Ｉを見かけの等質性に対して３３０００倍精製した。重要な改良点は、精製バッファー中にα−メチルマンノシドを用いて糖蛋白の内因的レクチンとの凝集を克服したことである。同種ＣＥＬ ＩについてのＳＤＳゲル電気泳動バンドを、その炭水化物部分を除去しまたは除去することなく、抽出し、再生し、ミスマッチ切断特異性を有することを明らかにした。ＣＥＬ Ｉポリペプチドの２８％のアミノ酸配列を決定した後、そのＣＥＬ ＩｃＤＮＡをクローンした。潜在的オルトログはアラビドプシスのＢＦＮ１、ジンニアのＺＥＮ１およびデイリリーのＤＳＡ６の遺伝子によりコードされると推定されるヌクレアーゼである。ＣＥＬ ＩのＳ１およびＰ１ヌクレアーゼとの相同性は極めて低い。ＣＥＬ Ｉのヌクレアーゼ活性を、Ｓ１ヌクレアーゼの最も近い植物オルトログである、ヤエナリヌクレアーゼと比較して特徴付け、これらの酵素が触媒的に異なることを確立した。ミスマッチ基材における一本鎖性はＣＥＬ Ｉにより認識される主たる特徴ではないようである。ＣＥＬ Ｉを中性ｐＨ最適値の、マグネシウムを刺激し、ミスマッチ二本鎖を認識するヌクレアーゼの新規なファミリーとして示し、Ｓ１スーパーファミリーの範囲内にあることを提案する。
【００４４】
Ｉ．ＣＥＬ Ｉコード化核酸分子、ＣＥＬ Ｉ蛋白およびそれに対する抗体の調製
Ａ．核酸分子
本発明のＣＥＬ Ｉエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子は、２つの一般的方法：（１）適当なヌクレオチドトリホスフェートから合成；または（２）生物学的な供給源から単離する方法により調製することができる。両方共、当該分野にてよく知られたプロトコルを利用する。
配列番号：１の配列を有する略全長のｃＤＮＡなどのヌクレオチド配列情報の有効性は本発明の単離された核酸分子のオリゴヌクレオチド合成による調製を可能とする。合成によるオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ・３８０Ａ ＤＮＡ シンセサイザーまたは同様の装置を用いるホスホルアミダイト法により調製することができる。得られた構築物は当該分野にて公知の方法、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現行のオリゴヌクレオチド合成方法に特有のサイズ制限から、段階中に合成しなければならない。かくして、例えば、２．４ｋｂの二本鎖分子は適当な相補性の数個のより小さなセグメントとして合成してもよい。こうして得られた相補的セグメントを、各セグメントが隣接するセグメントで結合するのに適する粘着末端を有するようにして、アニールすることができる。ＤＮＡリガーゼの存在下で粘着末端をアニールすることにより隣接するセグメントをライゲートし、完全な２．４ｋｂの二本鎖分子を構築することができる。こうして構築された合成によるＤＮＡ分子をついでクローンし、適当なベクターにて増幅させてもよい。ＣＥＬ Ｉをコードする核酸配列は当該分野にて公知の方法を用いて適当な生物学的供給源から単離することができる。好ましい具体例において、ｃＤＮＡクローンはセルリ起源のｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離される。もう一つ別の具体例において、ｃＤＮＡ配列により提供される配列情報を用いて、ＣＥＬ Ｉをコードするゲノムクローンを単離してもよい。別法として、ＣＥＬ Ｉ遺伝子中にある所定の配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用い、ＣＥＬ Ｉと相同性を有するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを他の植物種から単離することもできる。
【００４５】
本発明によれば、配列番号：１の蛋白コード化領域と適当なレベルの配列相同性を有する核酸は、適当なストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて同定することができる。例えば、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハート試薬、０．５−１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性した分画サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび０．５０％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて行ってもよい。３７−４２℃で少なくとも６時間ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションに付した後、フィルターを以下の条件：（１）２ｘＳＳＣおよび０．５−１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間；（３）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分ないし1時間；（４）３０分毎に溶液を変えながら、１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、４２−６５℃で２時間；で洗浄する。
特定の配列相同性の核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェントな条件を算定するための一の共通の式は（サムブロックら、１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二本鎖中の＃ｂｐ
で示される。
【００４６】
上記した式の一例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを用い、ＧＣ含量が４２％で、プローブの塩基の大きさが平均２００である場合、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは相同性が１％減少する毎に１−１．５℃減少する。かくして、約７５％よりも大きな配列同一性を有する標的は４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。このような配列は本発明の核酸配列と実質的に相同であると考えられる。
上記したように、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、２つの核酸分子のアニーリング速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションを、通常、そのハイブリッドの計算されたＴｍよりも２０−２５℃低い塩および温度の条件で行う。洗浄条件は標的についてのプローブの同一性の程度についてできる限りストリンジェントでなければならない。一般に、洗浄条件はそのハイブリッドのＴｍよりも約１２−２０℃低いように選択される。本発明の核酸について、中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを、４２℃での、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションおよび２ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、５５℃で１５分間の洗浄として定義する。高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを、４２℃での、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションおよび１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間の洗浄として定義する。非常に高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを、４２℃での、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーションおよび０．１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間の洗浄として定義する。
【００４７】
本発明の核酸はいずれか都合のよいクローニングベクター中のＤＮＡとして維持することができる。好ましい具体例においては、クローンを、適当なイー・コリ宿主細胞に遺伝されている、プラスミドクローニング／発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に維持する。ＣＥＬ Ｉ遺伝子をコードする本発明のゲノムクローンはラムダファージＦＩＸ ＩＩ（ストラタジーン）中に維持することができる。
本発明のＣＥＬ Ｉコード化核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびそのフラグメントを包含し、それらは一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。かくして、本発明は、配列番号：１の配列を有するｃＤＮＡの選択されたセグメントなどの、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリッド形成することのできる配列を有する、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンスストランド）を提供する。かかるオリゴヌクレオチドはＣＥＬ Ｉ遺伝子を検出または単離するためのプローブとして有用である。
【００４８】
これらの配列の変種（例えば、対立遺伝子変種）がセルリ集団に存在し、本発明のオリゴを設計および／または利用する場合にそれらを考慮しなければならないことが理解されるであろう。したがって、本明細書に開示されているＣＥＬ Ｉ配列または各遺伝子またはＲＮＡ転写物上の特定の位置を標的とするオリゴについてのそのような変種を包含することも本発明の範囲内にある。かかる変種を含めることに関して、本明細書では、「天然の対立遺伝子変種」なる語を、所定のＤＮＡ集団中に存在するであろう、種々の特異的ヌクレオチド配列およびその変種をいうのに用いる。コードされた蛋白中に同類または中立アミノ酸置換を生じさせる遺伝的多形態がかかる変種の例である。加えて、「実質的に相補的」なる語は、標的配列と完全に対合することができないが、そのミスマッチが記載されている条件下でオリゴのその標的配列とのハイブリッド形成能に著しく影響を与えない、オリゴ配列をいう。
かくして、そのコード化配列は配列番号：１で示されるものであってもよく、あるいはこの配列の変異体、変種、誘導体または対立遺伝子であってもよい。該配列は、図示されている配列の１個またはそれ以上のヌクレオチドが１回またはそれ以上の付加、挿入、欠失および置換の変化により図示されている配列と異なるものであってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化は、遺伝的コードによって測定されるように、蛋白レベルでアミノ酸変化をもたらしてもよく、もたらさなくてもよい。
【００４９】
かくして、本発明の核酸は、アミノ酸配列が同じポリペプチドをコードする、配列番号：１に示される配列と異なる配列を包含する。
他方において、そのコードされるポリペプチドは配列番号：２に示されるアミノ酸配列と１またはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むことができる。さらには、配列番号：２に示される配列のアミノ酸配列変異体、変種、誘導体または対立遺伝子である、ポリペプチドをコードする核酸が本発明によって提供される。かかるポリペプチドをコードする核酸は配列番号：１に示されるコード化配列と６０％以上の同一性、約７０％以上の同一性、約８０％以上の同一性、約９０％以上の同一性または約９５％以上の同一性を示す可能性がある。
本発明は目的とする核酸を得る方法であって、配列番号：１に示される配列の一部または全部あるいは相補的配列を有するプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含む方法を提供する。一般に、ハイブリダイゼーションを行い、続いて連続的なハイブリダイゼーションの同定および該プローブとハイブリッド形成した核酸の単離を行う。その操作はＰＣＲの１またはそれ以上の工程を含んでいてもよい。
【００５０】
そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびにその全長配列（および変異体、対立遺伝子、変種および誘導体）は、核酸を含有する試験化合物をＣＥＬ Ｉの対立遺伝子、変異体または変種の存在についてスクリーニングするのに有用であり、一の植物から得られた試料からの標的配列とハイブリッド形成するプローブを試験する。ハイブリダイゼーションの条件は非特異的結合を最小限とするように調節することができるが、ストリンジェントないし中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることが好ましい。当業者であれば、サムブロックら（１９８９）およびアウスベルら（１９９２）などのテキストブックで助成されるように、かかるプローブを容易に設計し、それらを標識し、ハイブリダイゼーション反応に適する条件を工夫することができる。
【００５１】
ある好ましい具体例において、配列番号：１に示される配列のフラグメント、またはエンドヌクレアーゼ活性と関連するいずれかの対立遺伝子である本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さである。かかるフラグメントそれ自身も、個々に、本発明の態様を示す。フラグメントおよび他のオリゴヌクレオチドを検討されているようにプライマーまたはプローブとして用いてもよいが、試験試料中でのＣＥＬ Ｉヌクレアーゼの相同体をコードする配列の存在を測定することと関連する方法にて（例えば、ＰＣＲにより）生成することもできる。
【００５２】
Ｂ．蛋白
ＣＥＬ Ｉは塩基置換ミスマッチおよびＤＮＡ変形の部位で高特異的にＤＮＡを切断する最初に同定された真核生物性ヌクレアーゼである。本発明の全長ＣＥＬ Ｉ蛋白は、既知の方法に従い、種々の方法にて調製することができる。該蛋白は、全内容を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５８６９２４５号に記載されるように、適当な供給源、例えばセルリから精製することができる。しかしながら、この方法は少量の蛋白がいつでも所定の細胞型にて存在する可能性があるため好ましい方法ではない。ＣＥＬ Ｉをコードする核酸分子を利用し、当該分野にて公知の方法をインビトロ発現方法を用いて蛋白を産生することができる。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子を適当なインビトロ転写ベクター、例えばインビトロ転写用のｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５にクローンし、つづいて適当な無細胞翻訳系、例えば小麦胚芽またはウサギ網状赤血球溶菌物中の無細胞翻訳に付してもよい。インビトロ転写および翻訳系は、例えば、プロメガ・バイオテック、マジソン、ウィスコンシン州、またはＢＲＬ、ロックビル、メリーランド州から入手可能である。
【００５３】
また、好ましい具体例によれば、適当な原核生物または真核生物系にて発現させることにより、より多量のＣＥＬ Ｉを産生することができる。例えば、配列番号：１を有するｃＤＮＡなどのＤＮＡの一部または全部をイー・コリなどの細菌細胞中での発現に適合するプラスミドベクター中に挿入することができる。かかるベクターは、宿主細胞（例えば、イー・コリ）でのＤＮＡの発現に不可欠な調節因子を含み、それをＤＮＡの発現を可能とするように位置付ける。このような発現に必要な調節因子は、プロモーター配列、転写開始配列および、所望によりエンハンサー配列を含む。
【００５４】
組換え原核生物または真核生物系での遺伝子発現により産生されるＣＥＬ Ｉは当該分野にて知られた方法に従って精製することができる。好ましい具体例においては、市販されている発現／分泌系を用い、それにより組換え蛋白を発現させ、その後に宿主細胞から分泌させて周辺培地から容易に精製することができる。発現／分泌ベクターを使用しないならば、別の方法は、組換え蛋白にあるいはＮ−末端またはＣ−末端に６−８個のヒスチジン残基のタグを付した組換え蛋白を単離するためのニッケルカラムに特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用によるなどの、アフィニティー分離により組換え蛋白を精製することを包含する。別のタグはＦＬＡＧエピトープまたはヘマトグルチニンエピトープを含んでいてもよい。このような方法は、一般に、技術者により用いられている。
【００５５】
上記した方法により調製された、本発明のＣＥＬ Ｉ蛋白は標準的方法により分析することができる。例えば、かかる蛋白を既知の方法に従ってアミノ酸配列分析に付してもよい。
アミノ酸配列の変種、対立遺伝子、誘導体または変異体であるポリペプチドもまた本発明により提供される。一の変種、対立遺伝子、誘導体または変異体であるポリペプチドは、１個またはそれ以上のアミノ酸の１回またはそれ以上の付加、置換、欠失および挿入により配列番号：２に示されるアミノ酸配列と異なる配列を有していてもよい。このような好ましいポリペプチドはＣＥＬ Ｉ機能を有し、すなわち、１またはそれ以上の次の特性：誤対合したヘテロ二本鎖ＤＮＡを切断する特性；その配列が配列番号：２に示されているポリペプチドと反応性を有する抗体との免疫学的交差反応特性；その配列が配列番号：２に示されるポリペプチドとエピトープを共有する特性（例えば、２つのポリペプチドの間の免疫学的交差反応性により決定されるような特性）を有する。
【００５６】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列のその変種、対立遺伝子、誘導体または変種であるポリペプチドは、その図示されている配列と約３５％以上の、約４０％以上の、約５０％以上の、約６０％以上の、約７０％以上の、約８０％以上の、約９０％以上の、または約９５％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。個々のアミノ酸配列の変種は、１個、２個、３個、４個、５−１０個、１０−２０個、２０−３０個、３０−４０個、４０−５０個、５０−１００個、１００−１５０個または１５０個より多くのアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と異なっていてもよい。アミノ酸の「相同性」の場合、この相同性は（例えば、アルゴリズムＧＡＰ（ジェネティっク・コンピューター・グループ、マディソン、ＷＩ）を用いて測定されるような、アミノ酸類似性の確立された原理に従って）同一性または類似性であると理解することができる。ＧＡＰは、２つの完全な配列を整列させるために、対合の数を最大にし、ギャップの数を最小とする、ニードルマンおよびウォンシュのアルゴリズムを用いる。一般に、ギャップ創製ペナルティ＝１２およびギャップ排除ペナルティ＝４のデフォルトパラメーターが用いられる。ＧＡＰの使用が好ましいが、ＢＬＡＳＴ（アルツチェルら（１９９０）J.Mol.Biol. ２１５：４０５−４１０）；ＦＡＳＴＡ（ピアーソンおよびリプマン（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８）またはスミス・ウォーターマンアルゴリズム（スミスおよびウォーターマン（１９８１）J.Mol.Biol. １４７：１９５−１９７）を含むが、これらに限定されるものではない、通常、デフォルトパラメーターを利用する、他のアルゴリズムを用いてもよい。本明細書における「相同性」および「相同的」なる語の使用は、比較された配列間の必然的な進化論的関係を含むものではない。これらの語は「相同的組換え」なる句中にあるように用いられ、すなわち、該用語は単に２つのヌクレオチド配列が適当な条件下で組み換えるのに十分に類似していることを要求しているにすぎない。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、その活性または機能に影響を及ぼす、あるいは調節する分子についてスクリーニングするのに用いることができる。かかる分子は検索の目的に有用である。
本発明はまた、本発明の蛋白に免疫特異的に結合する能力を有する抗体を提供する。ＣＥＬ Ｉに定方向性のポリクローナル抗体は標準的方法に従って調製することができる。好ましい具体例においては、ＣＥＬ Ｉの種々のエピトープと免疫特異的に反応する、モノクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体は標準的プロトコルを倣うケラーおよびミルスタインの一般的方法により調製することができる。ＣＥＬ Ｉと免疫特異的に相互作用するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、かかる蛋白を同定し、精製するのに利用することができる。例えば、抗体が免疫特異的に相互作用する蛋白のアフィニティ分離のために該抗体を利用することができる。また、抗体を用いて、蛋白および他の生物学的分子の混合物を含有する試料から蛋白を免疫沈降させることもできる。抗−ＣＥＬ Ｉの別の使用を以下に記載する。
【００５８】
本発明に係る抗体は多くの方法にて修飾することができる。実際、「抗体」なる語は要求される特異性のある結合ドメインを有する結合物質を含むものとして解釈されるべきである。かくして、本発明は、合成分子およびその形状が分子を抗原またはエピトープに結合させることのできる抗体の形状を模倣する分子を含め、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価体および相同体を含む。
抗原または他の結合パートナーとの結合能を有する代表的な抗体フラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインを含むＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント；抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖフラグメント；ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域にてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである。一本鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
【００５９】
ＩＩ．ＣＥＬ Ｉコード化核酸、ＣＥＬ Ｉ蛋白およびそれに対する抗体の使用 ＣＥＬ Ｉが変異体スクリーニングアッセイに役立つように用いることができるＤＮＡエンドヌクレアーゼであるのは明らかである。具体的には、本発明のＣＥＬ Ｉ分子を遺伝的スクリーニングアッセイに役立つように用いて特定の遺伝的障害の危険性があるかもしれない患者を同定することができる。かかる障害は、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、リソソーム貯蔵性疾患および患者を癌に罹患しやすくする遺伝的変異を包含するが、これらに限定されるものではない。
加えて、本発明のＣＥＬ Ｉ核酸、蛋白およびそれに対する抗体を検索手段として用いてもよく、ＤＮＡ認識および修復反応に親密に関与する他の蛋白を同定することができる。ＣＥＬ ＩのＤＮＡ認識および修復能力を生物学的に解明することで、患者の癌および遺伝的疾患への傾向を評価するこれら新規なスクリーニングアッセイを開発することが容易になるであろう。
【００６０】
Ａ．ＣＥＬ Ｉコード化核酸
本発明に係る種々の目的のためにＣＥＬコード化核酸を用いてもよい。ＣＥＬ Ｉコード化ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのフラグメントをＣＥＬ Ｉ様蛋白をコードする遺伝子の存在および／または発現を検出するためのプローブとして用いてもよい。ＣＥＬ Ｉコード化核酸をかかるアッセイのためにプローブとして利用することができる方法は、（１）インサイチューハイブリダイゼーション；（２）サザーンハイブリダイゼーション；（３）ノーザンハイブリダイゼーション；および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの雑多な増幅反応、を包含するが、これらに限定されるものではない。
また、本発明のＣＥＬ Ｉコード化核酸を、他の植物および動物種から由来の関連する遺伝子を同定するためのプローブとして利用することもできる。当該分野にてよく知られているように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調節して核酸プローブと相同性が種々の程度の相補的配列をハイブリダイズさせることができる。すなわち、ＣＥＬ Ｉコード化核酸を用いてＣＥＬ Ｉとの関連性が種々の程度である他の遺伝子を同定かつ特徴付けるのに役立て、それによりＤＮＡミスマッチ認識系をさらに特徴付けることができる。加えて、上記した核酸を用いてＣＥＬ Ｉと相互作用する蛋白をコードする遺伝子を（例えば、「相互作用トラップ」技法により）同定することもでき、それによりＤＮＡミスマッチ認識に関与する化合物の同定がさらに促進されるはずである。
【００６１】
また、ＣＥＬ Ｉをコードする核酸分子またはそのフラグメントを用いてＣＥＬ Ｉの産生を制御し、それによりＤＮＡミスマッチ認識反応に関与させるのに利用可能な蛋白の量を調節することもできる。ＣＥＬ Ｉ蛋白の生理学的な量における変化は、ＤＮＡミスマッチ認識に関与する他の蛋白因子の活性に劇的に影響を及ぼすかもしれない。
ＣＥＬ Ｉをコードする核酸の利用可能性は、ＣＥＬ Ｉ遺伝子またはその変異した配列の一部または全部を有する実験室用マウスの系統の生成を可能とする。かかるマウスは哺乳動物環境においてＣＥＬ Ｉ活性を評価するためのインビボモデルを提供することができる。実験室用マウスにてトランス遺伝子を導入する方法は当業者に周知である。３通りの一般的方法は：１．レトロウイルスベクターをコードする目的とする外来遺伝子を初期胚子に組み入れる方法；２．ＤＮＡを新たに受精させた卵子の生殖核中に注入する方法；３．遺伝的に操作された胚子幹細胞を初期胚子に組み込む方法、を包含する。上記したトランスジェニックマウスの生成はＣＥＬ ＩがＤＮＡミスマッチ認識にて果たす役割を分子的に解明することを容易にするであろう。
【００６２】
「動物」なる語は、本明細書にて、ヒトを除く、あらゆる脊椎動物を含むのに用いる。該用語はまた、胚子および胎児段階を含め、発達のあらゆる段階における個々の動物を包含する。「トランスジェニック動物」は、標的化組み換えまたは組換えウイルスのマイクロ注入もしくは感染によるような、細胞下レベルで計画的な遺伝的操作により、直接的または間接的に、改変されているかまたは受理した遺伝的情報を有する１またはそれ以上の細胞を含有するいずれかの動物をいう。「トランスジェニック動物」なる語は伝統的な雑種形成またはインビトロ受精を含めることを意味するものではなく、むしろ１またはそれ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子により改変されているか、または受理している動物を含むことを意味するものである。この分子は具体的に染色体中にランダムに組み入れられた一定の遺伝子座を標的としてもよく、あるいは染色体外にＤＮＡを複製してもよい。「生殖細胞系トランスジェニック動物」なる語は、遺伝的改変または遺伝的情報が生殖細胞系に導入されており、それにより遺伝的情報を子孫に伝達する能力が付与されているトランスジェニック動物をいう。実際、かかる子孫がそのような改変または遺伝的情報のいくらかまたは全てを有するならば、それら子孫もまたトランスジェニック動物である。
【００６３】
Ｂ．ＣＥＬ Ｉ蛋白および抗体
本発明のＣＥＬ Ｉをコードする核酸の発現を通して産生される、精製されたＣＥＬ Ｉ蛋白またはそのフラグメントを用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生することができ、それらはまた植物細胞におけるＣＥＬ Ｉ（またはＣＥＬ Ｉを含有する複合体）の存在および蓄積についての敏感な検出試薬として供することもできる。組換え技法により、ＣＥＬ Ｉ蛋白の一部または全部を含有する融合蛋白を発現させることができる。この全長蛋白または該蛋白のフラグメントを用いて、該蛋白の種々のエピトープに特異的なモノクローナル抗体のアレイの生成に供することができる。それによって、細胞における該蛋白の検出により一層の感受性を提供することができる。
【００６４】
ＣＥＬ Ｉに免疫学的に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を該蛋白の検出または定量のために設計された種々のアッセイにて用いることができる。かかるアッセイは、（１）フローサイトメトリック分析；（２）植物細胞におけるＣＥＬ Ｉの免疫化学的位置測定；および（３）種々の細胞からの抽出物のイムノブロット分析（例えば、ドットブロット、ウェスタンブロット）を包含する。加えて、上記したように、抗−ＣＥＬ ＩをＣＥＬ Ｉおよびそのオルトログの精製（例えば、アフィニティカラム精製、免疫沈降）に用いることもできる。
ＣＥＬ Ｉ蛋白はまた、上記した遺伝的スクリーニングアッセイに供するように用いることができる。
上述した記載から、本発明のＣＥＬ Ｉコード化核酸、ＣＥＬ Ｉ発現ベクターおよび抗−ＣＥＬ Ｉ抗体が、多量のＣＥＬ Ｉ蛋白を産生し、ＣＥＬ Ｉ遺伝子発現を検出し、ＤＮＡ損傷の認識に関与する遺伝子と蛋白の相互作用を評価することを目的としてＣＥＬ Ｉ蛋白の蓄積を変えるために用いることができることが理解できる。
【００６５】
以下のプロトコルは本発明の実施を容易にするために提供される。
プラスミドＤＮＡｐＵＣ１９を、製造業者の指示に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いてＤＨ５宿主細胞から単離した。仔ウシ胸腺ＤＮＡをシグマより入手し、プロテイナーゼＫ消化とフェノール抽出のサイクルを繰り返すことにより精製した（９）。クロマトグラフィー樹脂およびカラムをファルマシア・バイオテックより購入した。トルイジンブルーＯおよびポンキュウ（Ponceau）Ｓをシグマから入手した。ＥｎｄｏＨｆはニューイングランド・バイオラボから入手した。ホスホセルロースＰ１１をホワットマンから入手した。
【００６６】
ＣＥＬ Ｉの精製
工程はすべて４℃で行った。ヌクレアーゼ活性をＲＦ−１（複製型Ｉ）ニッキングアッセイ（１０）を用いてモニター観察した。
工程１：粗抽出物の調製−
１０５キログラムのセルリの茎をジュースエキストラクターを用いて均質にした。その汁を集めて（合計７９．３４Ｌ）バッファーＡ（１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．７、１００μＭ ＰＭＳＦ）の組成物中に適合させた。固体（ＮＨ４）２ＳＯ４をゆっくりと、穏やかに攪拌して、最終濃度が２５％飽和となるまで該汁に加えた。３０分後、その懸濁液を２７０００ｘｇで１．５時間遠心分離に付した。上澄（合計７０．５６Ｌ）をプールし、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を８０％飽和に調整した。３０分間攪拌した後、その混合物を２７０００ｘｇで２時間遠心分離に付した。ペレットをバッファーＢ（０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．７、０．５Ｍ ＫＣｌ、１００μＭ ＰＭＳＦ）中に再び懸濁させ、バッファーＢに対して完全に透析させた。
【００６７】
工程２：コンカナバリンＡ−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー−
１００ｍｌの（ジメチルスベリミダート架橋した）ＣｏｎＡ樹脂をボトル中の７．７１ｍＬの試料に加え、それを緩やかに一夜回転させた。その樹脂を２．５ｃｍ径のカラムに充填した。ＣＥＬ Ｉ活性を含まないフロースルーフラクションを捨てた。ＣＥＬ Ｉを０．３Ｍ α−メチルマンノシドを含有する２００ｍｌのバッファーＢで４℃で溶出させた。ヌクレオチド活性がもはや溶出されなくなるまで、溶出工程を１０回以上繰り返した。溶出液を合し、バッファーＣ（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００６８】
工程３：ＤＥＡＥ−セファセルクロマトグラフィー−
工程２の透析した試料（合計２．５Ｌ）を、バッファーＣで予め平衡にした５ｃｍ径の４００ｍｌのＢＥＡＥ−セファセルカラムに加えた。その後の工程をＦＰＬＣを用いて行った。該カラムを４００ｍｌのバッファーＣで洗浄した。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の１０ｍＭから１ＭまでのＫＣｌの線状勾配の１ＬのバッファーＣを用いて５ｍｌ／分の流速で溶出させ、つづいて１Ｍ ＫＣｌおよび５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の４００ｍｌのバッファーＣを用いて８ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性が最大のＣＥＬ Ｉフラクションをプールし、バッファーＤ（２５ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００６９】
工程４：ホスホセルロースＰ−１１クロマトグラフィー−
工程３の透析したＣＥＬ Ｉプール（１２０ｍｌ）を、５ｃｍ径の４００ｍｌのＰ−１１樹脂を充填したカラムに加えた。該カラムは５ｍｌ／分の流速のバッファーＤで予め平衡にした。試料を負荷した後、該カラムを５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の６２５ｍｌのバッファーＤを用いて５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の２０ｍＭから１ＭまでのＫＣｌの線状勾配の８００ｍｌのバッファーＤを用いて５ｍｌ／分の流速で溶出させた。該カラムをさらに１Ｍ ＫＣｌおよび５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の４００ｍｌのバッファーＤを用いて８ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性が最大のフラクションをプールし、１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４含有のバッファーＥ（５０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００７０】
工程５：フェニルセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー−
工程４の透析したＣＥＬ Ｉプール（４８０ｍｌ）を、５ｃｍ径の４００ｍｌのフェニルセファロースＣＬ−４Ｂを充填したカラムに加えた。該カラムは５ｍｌ／分の流速の１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４含有のバッファーＥで予め平衡にした。試料を添加した後、該カラムを１．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４および５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の４００ｍｌのバッファーＥを用いて５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の１．５Ｍから０Ｍまでの（ＮＨ４）２ＳＯ４の塩の線状逆勾配の５００ｍｌのバッファーＥを用いて５ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性が最大のフラクションをプールし、バッファーＦ（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、５ｍＭ α−メチルマンノシド、０．０１％トリトンＸ−１００および１００ｍＭ ＰＭＳＦ）に対して透析させた。
【００７１】
工程６：モノＱアニオン−交換クロマトグラフィー−
ファルマシアの予め充填されているモノＱＨＲ１６／１０カラムをバッファーＦで完全に洗浄して平衡状態にした。工程５からの透析したＣＥＬ Ｉプール（３３６ｍｌ）を５ｍｌ／分の流速で加え、つづいて１００ｍｌの５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有のバッファーＦを１０ｍｌ／分の流速で加えた。ＣＥＬ Ｉを５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有の０から１ＭまでのＫＣｌの線状勾配の２５０ｍｌのバッファーＦを用いて２ｍｌ／分で溶出させた。
【００７２】
工程７：ＳＭＡＲＴシステムを用いるスーパーデックス７５サイズ排除クロマトグラフィー−
工程６の活性なフラクション、フラクション１１および１２を合し、セントリコン（Centricon）３の遠心分離性濃縮装置を用いて濃縮した。濃縮した酵素のアリコートを、５０ｍＭ α−メチルマンノシド含有のバッファーＧ（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０１％トリトンＸ−１００および１００μＭ ＰＭＳＦ）で平衡にした予め充填されているスーパーデックス７５ＰＣ３．２／３０カラムに加えた。５０ｍＭ α−メチル−マンノシド含有の５ｍｌのバッファーＧを用いてＣＥＬ Ｉを０．０５ｍｌ／分の流速で溶出させた。活性フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックした。付加的な蛋白バンドがある場合、フラクションをプールし、濃縮し、ＣＥＬ Ｉが見かけ上均一になるまで、同じサイズ排除クロマトグラフィーを用いて再び精製した。
【００７３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳでのポリアクリルアミドゲル電気泳動を以前に記載されているように実施した（１１）。ゲルコードブルー染色試薬（ピアーズ）を用いることで蛋白バンドを検出した。蛋白バンドの分子量を蛋白標準の分子量に対するその相対的電気泳動移動度を半対数プロットを用いることで決定した。活性ゲルアッセイは本質的に記載どおりに行った（１２−１３）。
【００７４】
Ｎ−結合したオリゴヌクレオチドのＣＥＬ ＬからのＥｎｄｏＨｆ除去
ＣＥＬ Ｉを０．５％ＳＤＳ中で１００℃で１０分間変性させた。適量のＥｎｄｏＨｆを加え、反応物をＧ５バッファー（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中３７℃で一夜インキュベートした。
【００７５】
ＣＥＬ ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥからの再生
この方法は以前に報告されている方法（１３−１４）の変形である。ＣＥＬ Ｉフラクションを２本の並行するレーンのＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填した。電気泳動に付した後、ゲルが２本のレーンに間に分けられた。ゲルの半分をゲルコードブルースタイン試薬（ピアース）で染色し、ついで染色されていない他の半分と整列させた。染色されていないゲル中のＣＥＬ Ｉバンドに対応するゲルスライスを取りだし、溶出バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を用い、試料当たり２０ｍＡで２時間、アミコンモデル５７００５電気溶出装置を用いて溶出した。溶出後、試料をセントリコン３ユニットを用いることで濃縮した。遠心分離を７０００ｘｇで一夜行った。試料の体積を測定し、４倍容量の蒸留アセトン（−２０℃）を加えた。試料をドライアイス−エタノール浴中で３０分間インキュベートし、ついで１４０００ｘｇで１０分間遠心分離した。沈降した蛋白を２０％の希釈および再生溶液（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍｌのＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２μＭ ＺｎＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）および８０％のアセトンからなる、バッファーで洗浄した。試料を１４０００ｘｇで１０分間再び沈殿させた。上澄を捨てた。遠心管を１０分間逆さにすることにより残りのアセトンをデカント処理した。ペレットを少なくとも１０分間風乾させた。ついで、２０μｌの再生溶液（６Ｍ グアニジン−塩酸、５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍｌのＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２μＭ ＺｎＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を用いてそのペレットを溶かした。室温で２０分間インキュベートした後、１ｍｌの希釈および再生溶液を加え、室温で１２時間蛋白をさらに再生させた。
【００７６】
ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイ
以前に報告されているようにミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイを行った（８）。簡単に言えば、一方が野生型であり、他方がＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン２０にＣ挿入するための異型接合型である２つの個体、からのゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ産物を増幅させた。順方向プライマーを６−ＦＡＭ（ブルー）で５’−標識し、逆方向プライマーをＴＥＴ（グリーン）で５’−標識した。ＢＲＣＡ１遺伝子における挿入体の位置は５３８２ｎｔ位置である。得られたヘテロ二本鎖はエクストラヘリカルＣまたはエクストラヘリカルＧを含有する４０２ｂｐのＰＣＲ産物を提供する。５０ｎｇの蛍光標識された基材を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の２０μｌの反応体積にて、ＣＥＬ Ｉと共に４５℃で３０分間インキュベートした。反応を報告されているように処理し（８）し、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー上の変性３４ｃｍウェル−ツー−リードの６％ポリアクリルアミドゲルに充填し、ジンスキャン３．１ソフトウェア（パーキン−エルマー）を用いて分析した。結果をゲルイメージとして表示する。
【００７７】
配列決定するためのＣＥＬ Ｉ試料の調製
精製したＣＥＬ Ｉ試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。電気泳動に付すと、ゲル中にある蛋白は、ウェスタン移動装置（ノベックス）を用いることによりイモビロン−ＰＳＱ ＰＶＤＦ膜に電気泳動的に移動する。トランスファーバッファーは１２ｍＭ トリズマベース、９６ｍＭ グリシンおよび２０％メタノールを含有した。トランスファー条件は２５Ｖ（定常電圧）で１時間であった。次に、膜を水で徹底的に洗浄し、ポンキュウＳで染色した。ＣＥＬ Ｉバンドを取りだし、水で脱染色し、自動式エドマン分解反応によりＮ−末端および内部ペプチドをマイクロ配列決定するためにロックフェラー大学の蛋白／ＤＮＡテクノロジーセンターに送った。まずＮ−末端配列が決定された（１５）。残りの蛋白フラクションをトリプシンまたはＧｌｕＣのいずれかで消化した。消化したペプチドをＨＰＬＣで精製し、エドマン分解法を用いて配列決定した（１６）。
【００７８】
ＣＥＬ ＩｍＲＮＡのｃＤＮＡのクローニング
植物ＲＮＡ調製についてのフェノールＳＤＳ法（１７）を用いて、全ＲＮＡを新鮮なセルリから調製した。ストラタジン製のプロスターファーストストランドＲＴ−ＰＣＲキットを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。変性ＰＣＲプライマーを純粋なＣＥＬ Ｉ蛋白のエドマン分解分析により決定されたアミノ酸配列から選択し、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼを利用してＣＥＬ ＩｃＤＮＡを２つのセグメントに増幅するのに用い、ＤＮＡを配列決定するためにイー・コリ中にてクローンした。その２つのフラグメントがＣＥＬ Ｉ蛋白の読み枠の大部分を提供した。５’および３’ＲＡＣＥ法（クローンテック・マラトン・ｃＤＮＡ増幅キット）を用い、ＣＥＬ ＩｃＤＮＡの５’および３’コード化領域および非翻訳領域（ＵＴＲ）を得た。そのｃＤＮＡの真正を確認するために、５’ＵＴＲにおけるプライマーと、３’ＵＴＲにおけるプライマー、２つのＰＣＲプライマーを設計した。増幅のための高復元性ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用い、セルリＲＮＡの新たな調製物から由来のＣＥＬ ＩｃＤＮＡを一のフラグメントとして増幅させるためにこれらの２つのプライマーを利用した。新たな配列をイー・コリにてクローンさせた。そのＤＮＡ配列から、同じアミノ酸について別のコドンを付与する１個のヌクレオチドが違うことを除いて、以前のｃＤＮＡ配列の真正を確認した。
【００７９】
ヤエナリ・ヌクレアーゼの供給源
ヤエナリ・ヌクレアーゼ（ＭＢＮ）を、ファルマシア・バイオテック、＃２７−０９１２より購入する（本明細書中、「ＭＢＮ−Ａ」と称する）か、または以前に報告されている（１８）ように精製した（本明細書中、「ＭＢＮ−Ｂ」と称する）。ＭＢＮアッセイ条件および蛋白濃度は種々の実験室で異なり、この実験における定量にいくらか影響するかもしれない。製造者のアッセイ条件では１．６４ｘ１０６ユニット／ｍｇの比活性を有するが、我々のアッセイ条件では１．４２ｘ１０６ユニット／ｍｇである、均質なＭＢＮ−ＡをＦＰＬＣ精製した。該酵素はＳＤＳ ＰＡＧＥにて単一バンドを示す。ＭＢＮ−Ｂはコワルスキーによる最初のＭＢＮの古い調製物であり、本明細書に記載のアッセイ条件にて４ｘ１０５ユニット／ｍｇの比活性を有する。該酵素は、非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにて約３９ｋＤａの単一バンドとして現れた（データを示していない）。一単位のＭＢＮ−Ａ一本鎖ＤＮａｓｅ活性は我々のアッセイにおいて酵素０．７ｎｇに等しい。
【００８０】
ＲＦ−Ｉニッキングアッセイ
１．１μｇのｐＰＫ２０１／ネコ（ｐＵＣ１９プラスミド誘導体、ｐＰＣ１９についてのデータは示されておらず、同様である）を、所定の量のＭＢＮまたはＣＥＬ Ｉと一緒に３７℃で３０分間、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下または不存在下、３０μｌの容量のバッファーＨ（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＫＣｌ）またはバッファーＩ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ）中にてインキュベートした。反応を停止させるために、５μｌの停止溶液（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．８、３％ ＳＤＳ、４．５％β−メルカプトエタノール、３０％グリセロールおよび０．００１％ブロモフェノールブルー）を加えた。２４μｌの最終混合物を０．８％アガロースゲルに負荷した。電気泳動および臭化エチジウムで染色した後、そのゲルの写真を撮影し、ＩＳ−１０００デジタルイメージングシステム（アルファ・インノテック・コーポレイション）を用いて原板をスキャンした。ＩＳ−１０００ｖ２．０２ソフトウェアを用いてＲＦ−Ｉバンドを定量した。
【００８１】
一本鎖ＤＮａｓｅアッセイ
ＤＮＡの可溶化アッセイは以前に報告されているアッセイと同様であった（１９）。５０μｇの熱変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ（カルバイオケム＃２６１８、プロナーゼ処理、フェノール抽出および透析を繰り返して精製した）を、１００μｌのバッファーＨまたはバッファーＩ中、３ｍＭ ＭｇＣｌ２と共にまたは無しで、０．７ｎｇのＭＢＮ−Ａまたは１．９ｎｇのＭＢＮ−Ｂ、あるいは１６ｎｇのＣＥＬ Ｉと共にインキュベートした。指定される時間に、０．２Ｎ塩酸中の１００μｌの冷たい２０ｍＭ ＬａＣｌ３を加えて反応を停止させた。遠心分離（２１０００ｘｇ、４０分）に付した後、分光光度計を用いて上澄の２６０ｎｍでの吸光度を測定し、酸−可溶性となったＤＮＡの量を測定した。
【００８２】
ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイ
ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイを以前に報告されているように行った（８）。簡単に言えば、ＢＲＣＡ１遺伝子中の３つの異なるエキソンにおける特定の変化について異型接合的である、個体のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ産物を増幅させた。順方向プライマーを６−ＦＡＭ（ブルー）で５’−標識し、逆方向プライマーをＴＥＴ（グリーン）で５’−標識した。ＢＲＣＡ１遺伝子におけるミスマッチの位置は、３００ｎｔ、４１８４ｎｔ、４４２１ｎｔおよび５３８２ｎｔ位置である。それらは、各々、エキソン５におけるＴからＧへの塩基置換、エキソン１１における４個の塩基の欠失、エキソン１３におけるＣ−Ｔの多型およびエキソン２０におけるＣ挿入に相当する。４個の得られたヘテロ二本鎖はＴ／ＣまたはＧ／Ａ塩基置換ミスマッチを含有する２３５ｂｐのＰＣＲ産物、４個の塩基ループを含有する３８７ｂｐのＰＣＲ産物、Ｃ／ＡまたはＴ／Ｇ塩基置換ミスマッチのいずれかを含有する３２３ｂｐの生成物、およびエクストラヘリカルＣまたはエキストラヘリカルＧを含有する４０２ｂｐの産物を提供する。５０ｎｇの蛍光標識されたヘテロ二本鎖を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下または不存在下でバッファーＩの２０μｌの反応体積にて、７ｎｇのＭＢＮ−Ａ、または１１ｎｇのＭＢＮ−Ｂ、または１０ｐｇのＣＥＬ Ｉ（０．３ユニット）と共に３７℃または４５℃で３０分間インキュベートした。反応を報告されているように処理し（８）し、ＡＢＩ３７７シーケンサー上の変性３４ｃｍウェル−ツー−リードの６％ポリアクリルアミドゲルに充填し、ジンスキャン３．１ソフトウェア（パーキン−エルマー）を用いて分析した。結果をゲルイメージの各レーンのピーク特性として表示する（図６）。
【００８３】
一本鎖ＲＮａｓｅアッセイ
５０μｇの精製したトルラ酵母ＲＮＡ（アミコン＃７１２０）を、３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む、１００μｌのバッファーＨまたはバッファーＩ中、０．７ｎｇのＭＢＮ−Ａまたは１６ｎｇのＣＥＬ Ｉと共に３７℃でインキュベートした。指定された時間に、１３μｌの冷たい３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２８２μｌのエタノールを添加した。該混合物を−２０℃に一夜置いた。遠心分離（２１０００ｘｇ、４５分）に付してＲＮＡを沈殿させた後、分光光度計を用いて上澄の２６０ｎｍでの吸光度を測定し、可溶性となったＲＮＡの量を測定した。
以下の実施例は本発明をさらに詳しく記載するために提供される。これらの実施例は本発明を実施するために現時点で考えられる最良の形態を示すものであり、それらは本発明を説明するが、何ら発明を限定するものではない。
【００８４】
実施例Ｉ
ＣＥＬ Ｉの精製
ＣＥＬ Ｉを、緩衝セルリ汁におけるその比活性よりも３３,０００倍を超えて均質に精製した。表１は、セルリの茎１０５ｋｇからのＣＥＬ Ｉの精製の概要を示す。ＣＥＬ Ｉの活性バンドは、活性ゲルアッセイによって判定されるように精製の全体にわたって同一サイズのものである。図８を参照のこと。全ての精製工程の間に同時精製する２つのヌクレアーゼバンドがある。本発明者らは、副バンドが主バンドに由来しないことを以下に示す。ＣＥＬ Ｉと命名された主ヌクレアーゼ活性は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で４３ＫＤａで移動する（図１Ａ）。３９ＫＤａでの副活性は、本発明者らがＣＥＬ ＩＩと命名した推定イソ酵素であり（図１Ｃ、レーン３）、ミスマッチで切断可能でもある。
【００８５】
【表１】
実施例２
ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩの等電点
少量のＣＥＬ ＩＩを含有するＣＥＬ Ｉの試料を等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜１０、ノベックス（Novex）から）上に負荷した。ゲルを染色した後、標準（ビオ−ラド（Bio-Rad））との比較によりＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩのｐＩを得た。ＣＥＬ ＩバンドのｐＩは６.０〜６.５であり、ＣＥＬ ＩＩバンドのｐＩは６.５〜６.８であった（データは示さない）。Ｅｎｄｏ ＨｆによってＮ結合オリゴ糖を最小限度にした後、４３ＫＤａ主セルリヌクレアーゼバンドは２９ＫＤａ位置にシフトし（図１ＢおよびＣ、レーン４）、３９ＫＤａ副セルリヌクレアーゼバンドは３７ＫＤａ位置にシフトした（図１Ｃ、レーン４）。ＣＥＬ ＩＩがＣＥＬ Ｉの分解産物であるならば、ｅｎｄｏ Ｈｆ処理後、そのポリペプチド長さは、２９ＫＤａと等しいかまたはそれ未満であろう。
【００８７】
実施例３
還元剤のＣＥＬ Ｉに対する効果
ＣＥＬ ＩバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために試料バッファーにおいて１％メルカプトエタノールを用いると、ＣＥＬ Ｉは上方にシフトした（図１Ｄ、レーン２）が、無傷であった。また、ＤＴＴを試験し、同様の結果を得た（データは示さない）。最も簡単な解釈は、ＣＥＬ Ｉポリペプチドが主鎖中に破損を含まないということである。代わりに、ジスルフィド結合が分解され、結果として、還元状態で酵素がより伸長され、故に、電気泳動移動度が遅くなった。
【００８８】
実施例４
均質なＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩの再生
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥから個々のセルリヌクレアーゼバンドを切除し、上記のとおり溶離した。これらのバンドは、４３ＫＤａバンド、３９ＫＤａバンド、およびＥｎｄｏ Ｈｆ消化後のそれらの対応するバンドを包含した。溶離した酵素フラクションを濃縮し、再生した。プラスミドニッキングアッセイを行って、再生試料が全ての活性ヌクレアーゼであることが示された。図９を参照のこと。Ｅｎｄｏ Ｈｆ消化の前または後の再生ＣＥＬ ＩおよびＥｎｄｏ Ｈｆ消化後のＣＥＬ ＩＩは、ミスマッチ基質でＤＮＡを切開することができた。この実験では、切開されたミスマッチはＧ残基挿入である。この実験は、ゲル溶離および再生工程におけるタンパク質の回収率および活性の不確定性のために、必ず定性的である。しかしながら、データは、ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩが均質であり、各々がＤＮＡミスマッチで切開することができ、ＣＥＬ ＩおよびＣＥＬ ＩＩ上のほとんどの炭水化物が活性に対して必須ではないという結論を増強する。
【００８９】
実施例５
ＣＥＬ Ｉ ｃＤＮＡのクローニング
プロテイン／ディエヌエー・テクノロジー・センター・オブ・ザ・ロックフェラー・ユニバーシティ（Protein/DNA Technology Center of the Rockefeller University）により実施されたＥｄｍａｎ分解によって同定されたＣＥＬ ＩのＮ末端のアミノ酸配列および３つの他の内部タンパク質溶解ペプチドを太文字で図２に示す。同定された７２アミノ酸はＣＥＬ Ｉポリペプチドの約２８％であり、ｃＤＮＡ配列において完全に明らかにされた。リーダー配列を有しないＣＥＬ Ｉは、２７４アミノ酸残基からなる、計算された分子量が３１,４４０.２であるタンパク質である。ＳＤＳ ＰＡＧＥで測定された４３ＫＤａの見掛けの分子量と比較して、ＣＥＬ Ｉは、炭水化物２７重量％である。
【００９０】
ＣＥＬ Ｉ ｃＤＮＡアミノ酸配列の、ＮＣＢＩ（２０）でのＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムによるジェンバンク（Genbank）におけるホモログとのアラインメントにより、ＣＥＬ Ｉがアスペルギルス（Aspergillus）Ｓ１ヌクレアーゼ（受入番号Ｐ２４０２１、２７３アミノ酸の２７％）およびＰ１ヌクレアーゼ（受入番号Ｐ２４２８９、２７７アミノ酸の３０％）に対して比較的低い同一性を有することが明らかになった。図１０を参照のこと。しかしながら、植物におけるＣＥＬ Ｉの全てのホモログのうち３つは非常に高度の同一性を有することが明白である。すなわち、ＺＥＮ１（受入番号ＡＢ００３１３１、２６９アミノ酸の８０％同一性）、ＤＳＡ６（受入番号ＡＦ０８２０３１、２７１アミノ酸の７３％同一性）、ＢＦＮ１（受入番号Ｕ９０２６４、２７４アミノ酸の７２％同一性）。本発明者らは、残りのホモログが全て４５％同一性またはそれ以下の範囲であるので、これらの３つのタンパク質がおそらくＣＥＬ Ｉのオルソログであると考える。さらにまた、ＣＥＬ Ｉおよびこれらの３つのオルソログの配列をＰ１ヌクレアーゼの二次構造に重ね合わせると、これらの４つの推定オルソログの間の配列差異のほとんどが連続したヘリックスを連結する可動性ループ領域（図１０）および可動性ＣＯＯＨ末端領域にある。かくして、これらのオルソログがＣＥＬ Ｉの酵素特性を有し、Ｓ１ヌクレアーゼの触媒特性および基質特異性を有しないと考えられる。
【００９１】
実施例６
ＣＥＬ ＩのＭｇ＋＋およびｐＨ依存性
【化１】
【００９２】
実施例７
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮのＲＦ−Ｉニッキング活性
超コイルプラスミド複製型Ｉ（ＲＦ−Ｉ）ＤＮＡは、ヌクレアーゼによって攻撃され得る二重ヘリックスにおいて不安定性を有する局所領域を示す。第１ニックによって超ヘリックス応力が除去され、ＤＮＡは、もはや、ほとんどの一本鎖ヌクレアーゼに対する基質ではない。ｐＨ７.５に対するｐＨ５.５でのＭＢＮおよびＣＥＬ ＩのＲＦ−Ｉニッキング活性を図４に示す。パネルＡおよびＢは、Ｍｇ＋＋の存在下および不在下における２種類のｐＨでのＭＢＮ−ＡによるＲＦ−Ｉのニッキングを比較する。パネルＡにおいて、初期キネティクスの条件下で、３ｍＭ Ｍｇ＋＋によるＭＢＮの阻害は約９０％である。ＲＦ−Ｉの約７０％が、ｐＨ５.５で３０分間、ＭＢＮ−Ａ ７ｐｇによりニック処理される。パネルＢにおいて、ＭＢＮ−Ａ ７ｎｇは、ｐＨ７.５で３０分間、ＲＦ−Ｉの約２０％をニック処理することができるだけである。パネルＣおよびＤにおいてＭＢＮ−Ｂについて同様の結果が得られた。ｐＨ５.５についてはパネルＥにおいて、およびｐＨ７.５についてはパネルＦにおいて、ＣＥＬ Ｉ ＲＦ−Ｉニッキング活性の同様の比較が示される。該データは、ＣＥＬ ＩのＲＦ−Ｉニッキングが、Ｍｇ＋＋の存在下ではＭｇ＋＋の不在下におけるよりも約２倍活性であることを示している。５ｐｇデータ点を比較すると、ＣＥＬ Ｉは、ｐＨ７.５ではｐＨ５.５におけるよりも２倍活性である。
【００９３】
実施例８
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮの一本鎖ＤＮａｓｅ活性
変性精製子牛胸腺ＤＮＡのＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉによる消化を図５に示す。比較を容易にするために、アッセイが類似範囲の総活性で行われるような種々の量のＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉを用いた。ＭＢＮ−Ａ、ＭＢＮ−Ｂ、およびＣＥＬ Ｉに用いた酵素の量は、各々、０.７ｎｇ、１.９ｎｇおよび１６ｎｇであった。ｐＨ７.５でのＭＢＮによる活性の喪失はパネルＡおよびＢにおいて明白である。一本鎖ＤＮＡに対する活性についてのＭＢＮのＭｇ＋＋阻害もまた観察される。対照的に、ＣＥＬ Ｉは、Ｍｇ＋＋の存在下では不在下におけるよりも活性である。重要なことには、各酵素の最高活性条件についてパネルＡおよびＣにおける初期キネティクスを比較すると、ｐＨ５.５でＭｇ＋＋の不在下におけるＭＢＮ−Ａの一本鎖ヌクレアーゼ比活性は、ｐＨ５.５でＭｇ＋＋の存在下におけるＣＥＬ Ｉについてよりも約３２倍高いと考えられる（タンパク質１ｍｇ当たり可溶化ＤＮＡ ４.４６×１０４ｇに対してタンパク質１ｍｇ当たり可溶化ＤＮＡ １.４２×１０６ｇ／分）。
【００９４】
実施例９
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮのミスマッチエンドヌクレアーゼ活性
ミスマッチを含有するＤＮＡ二重鎖のＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉによるニッキングを図６に示す。四塩基ループを有するミスマッチをｐＨ７.５でＣＥＬ ＩおよびＭＢＮの両方の調製物によってニック処理する（Ａ、Ｂ、Ｃ）。この反応では、より多量のＭＢＮが必要であったことに注目する。しかしながら、ＣＥＬ Ｉよりも１０００倍多い酵素でさえ、ＭＢＮは一塩基ミスマッチでの塩基置換で特異的にニック処理することができない（Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨ）。ｐＨ７.５におけると同一の量のＭＢＮタンパク質をｐＨ５.５でＤＮＡ基質と一緒にインキュベートすると、基質はほとんど完全に消化される（データは示さない）。より少ない、より適当な量のＭＢＮをｐＨ５.５でＤＮＡ基質と一緒にインキュベートすると、ミスマッチ特異的ニッキングは全く見られない（データは示さない）。ＣＥＬ Ｉは、塩基置換ミスマッチ（パネルＦ）およびヘリックス外ヌクレオチド（パネルＩ）でニック処理する。パネルＦにおいて、位置１８３ｎｔでのブルーピークはヘテロ二重鎖の６−ＦＡＭ標識鎖上のミスマッチの３'側のニックに対応し、位置１４２ｎｔでのグリーンピークはＴＥＴ標識鎖上のミスマッチの３'側のニックに対応する。他のブルーピークのいくつかは、ＣＥＬ Ｉによる非特異的切断である；長時間、またはより多くのＣＥＬ Ｉ酵素と一緒に、該反応をインキュベートすると、これらのミスマッチ非特異的ピークはほとんどが除去されるが、ミスマッチ特異的ピークは残っている（図３）ということに注目するのは重要である。理由は、これらのバックグランドバンドが、しばしば、２本のＤＮＡ鎖が適正に塩基対形成しないＰＣＲ産物の非特異的ヘテロ二重鎖であるということである。これらの二重鎖は非特異的位置でＣＥＬ Ｉによってニック処理され、それらのシグナルは拡散される。パネルＩにおいて、２５２ｎｔでのグリーンピークは、ＰＣＲ産物のＴＥＴ標識鎖上のヘリックス外Ｇの３'側のニックに対応する。６−ＦＡＭ標識鎖上のヘリックス外Ｃのニックに対応するブルーピークは、位置１５１ｎｔであると予想されるが、示されていない。ＣＥＬ Ｉは、その５'末端付近の６−ＦＡＭ標識鎖をニック処理し、色素を除去し、それにより該アッセイにおいてブルーピークを評価することができなくなる。別法として、挿入体Ｃ基質を挿入体Ｇ基質によってより競争させることができた。
【００９５】
実施例１０
ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮのＲＮａｓｅ活性
Ｓ１およびＣＥＬ Ｉに共通の性質は、文献において「糖非特異的」または「二機能性」と称される特徴であるＲＮＡおよびＤＮＡの両方を消化する能力である。本発明者らは、ＲＮＡ上でのＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉの比活性を、それらのＤＮａｓｅ活性に匹敵する条件を用いて比較した。ここで取り組む特定の問題は、ＲＮａｓｅ活性がｐＨ依存性であるか否か、および、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの比活性が各酵素について類似しているか否かということである。本発明者らのアッセイは、ＲＮＡの可溶性ヌクレオチドおよび短いＲＮＡフラグメントへの消化を測定する。ＭＢＮ−ＡのＲＮａｓｅ活性の比活性（図７Ａ）は、その一本鎖ＤＮａｓｅ活性（図５Ａ）に匹敵する。ＣＥＬ Ｉの比活性は、ｐＨ５.５においてＴｏｒｕｌａ Ｙｅａｓｔ ＲＮＡ上でＭＢＮ−Ａの５０分の１である。この値は、基質として変性子牛胸腺ＤＮＡを用いて、ＣＥＬ Ｉが比活性においてＭＢＮ−Ａの約３２分の１であるという本発明者らの発見と一致する。ＲＮａｓｅとしてのＣＥＬ Ｉは、ｐＨ７.５ではｐＨ５.５よりも僅かに活性である。これは、ＣＥＬ Ｉの一本鎖ＤＮａｓｅ活性についての観察結果と反対であるが、差異は小さい。かくして、ｐＨ５.５でのＭＢＮ、ならびにｐＨ５.５およびｐＨ７.５でのＣＥＬ Ｉは、ＤＮＡよりもＲＮＡを優先することを示さなかった。ＭＢＮ−Ａは、ｐＨ５.５におけると同一の比活性をもってｐＨ７.５でＲＮＡを消化した（図７）。これは、ＭＢＮ−ＡがｐＨ７.５で一本鎖ＤＮＡを消化する能力がほとんどないことと著しく対照的である（図５Ａ）。ＭＢＮ−ＢのＲＮａｓｅ活性について同様の結果が得られた（データは示さない）。
【００９６】
検討
糖タンパク質の精製
本発明者らは、非常に豊富なＣＥＬ Ｉを産生する精製プロトコールを従前に記載したが、該酵素は、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で単一バンドであると考えられなかった（８）。汚染源を同定するために、本発明者らは、アラビドプシスシ・カルス（Arabidopsis callus）での精製を繰返し、同一の凝集の課題を観察した。本発明者らは、最も純粋なフラクションに対するマウス抗体を調製し、アラビドプシスｃＤＮＡ発現ライブラリー（２１）からの２種類の遺伝子（受入番号ＡＣ００１６４５、遺伝子ＰＩＤ：ｇ２０６２１５７およびＰＩＤ：ｇ２０６２１５９）の同定されたクローンに対する該抗血清を用いた（未発表データ）。これらのクローンは、ＣｏｎＡ様レクチンとして機能することが知られているブラッシカ・ナプス（Brassica napus）の２つのジャスモネート誘発性タンパク質に対して非常に相同であることが判明した（受入番号ＣＡＡ７２２７１、４７５アミノ酸において６２％の同一性）（２２）。かかるレクチンは、アラビドプシスにおける３０を超える遺伝子によってコードされ、精製されるべき糖タンパク質がレクチンよりも豊富でない場合に問題となり得る。本発明のプロトコールにおけるバッファー中のマンノースの存在は、この障害を克服し、ＣＥＬ Ｉの均質な調製物を提供した。
【００９７】
ＣＥＬ Ｉアミノ酸配列のアラインメント
ＣＥＬ Ｉアミノ酸配列のジェンバンクにおける全てのＳ１ホモログとのアラインメント（図１０）において、普遍的に保存された残基は、ポリペプチドの種々の領域に位置する、Ｎ末端トリプトファン残基、５個のヒスチジン残基、および３個のアスパルテート残基である（図２）。Ｐ１ヌクレアーゼのＸ線結晶構造によって明らかにされるように、これらの９個の残基は一緒に３個のＺｎ＋＋原子を結合する（２３−２４）。触媒活性部位の保存は、これらのヌクレアーゼがホスホジエステル結合の開裂について同一のメカニズムを有することを示唆しており、触媒ドメインを形成するために酵素構造の保存を必要とする。基質優先度の差異は基質認識のメカニズムにあり、触媒作用とは区別されていて、Ｓ１ファミリーヌクレアーゼは一本鎖核酸に対して特異的であるが、ＣＥＬ Ｉはミスマッチヘテロ二重鎖に対して高い特異性を示す。種々の基質の認識を可能にする配列は、あまり保存されないアミノ酸配列に存する。ＣＥＬ ＩおよびＳ１型ヌクレアーゼの触媒的差異を良好に定義するために、本発明者らは、植物において最もよく特徴付けられたＳ１ヌクレアーゼのオルソログであるＣＥＬ ＩとＭＢＮとを注意深く対照した。
【００９８】
ＣＥＬ Ｉおよびマングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼのｐＨ依存性
プラスミドｐＵＣ１９のＲＦ−Ｉにおいて、超コイル化は、ヌクレアーゼに対する基質となり得る一本鎖化領域を誘発する。さらにまた、複製起点のような領域はステム−ループ構造を形成することが知られている。超コイルプラスミドには不安定化配列があることも示された（２５）。図４のデータにより、ＭＢＮはｐＨ５.５ではｐＨ７.５におけるよりも１０００倍を超えて素早くＲＦ−Ｉをニックするが、ＣＥＬ ＩはｐＨ７.５ではｐＨ５.５におけるよりも活性であることが証明された。
【００９９】
酸性ｐＨでのＭＢＮのＲＦ−Ｉ切断に対する＞１０００倍高い活性は、酵素の触媒メカニズムの作用である。酸性ｐＨでのＲＦ−Ｉニッキングの速度をより速くする別の因子は、酸性ｐＨでのプラスミドの部分巻き戻しであり、それによって、より大きい一本鎖化性向を生じる。中性ｐＨでプラスミドＲＦ−Ｉに対して活性なＣＥＬ Ｉの場合、ＲＦ−Ｉの部分巻き戻しがＣＥＬ Ｉの結合により生じることが推測される。また、ＣＥＬ Ｉはプラスミドにおける一本鎖化を認識していない。理由は、ＣＥＬ Ｉの一本鎖ＤＮＡの消化がｐＨ５.５ではｐＨ７.５におけるよりも活性である（図５）にもかかわらず、ＣＥＬ ＩのＲＦ−ＩニッキングがｐＨ５.５ではｐＨ７.５ほど活性ではない（図４）ということである。
【０１００】
ＣＥＬ Ｉが基質として変性ＤＮＡを用いると、ＣＥＬ Ｉの比活性は酸性ｐＨでＭＢＮ−Ａの２０分の１であり（図５Ｃ）、Ｍｇ＋＋の存在下におけるｐＨ７.５では非常に僅かに改善されるだけである。不安定化ヘリックスの認識を反映するＲＦ−Ｉニッキングにおいて、ＣＥＬ Ｉ比活性は、ｐＨ５.５ではＭＢＮ−Ａの２分の１に過ぎないが、ＣＥＬ Ｉは、ｐＨ７.５では１０００倍活性である（図４）。さらにまた、ＣＥＬ Ｉは、ＭＢＮ−Ａよりも７００倍高い比活性で４個のヘリックス外塩基を含有するミスマッチヘテロ二重鎖をニック処理する（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。最後に、ＣＥＬ Ｉだけは塩基置換でＤＮＡをニックすることができる。したがって、ＣＥＬ Ｉが主として一本鎖ＤＮａｓｅではないことが明らかである。さらにまた、一本鎖化自体は、ＣＥＬ Ｉがミスマッチ基質において認識するものではない。
【０１０１】
活性ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮにおけるＭｇ＋＋の役割
ｐＨ５.５でのＭＢＮによるＲＦ−Ｉニッキングの初期速度は、Ｍｇ＋＋によって約１０〜２０倍抑制される。対照的に、ＣＥＬ Ｉは、全てアッセイ条件下でＭｇ＋＋によって刺激される。ＲＦ−ＩのＣＥＬ Ｉニッキングは、両方のｐＨにおいてＭｇ＋＋の存在下で有意に増大する。ＲＦ−Ｉニッキングアッセイ自体によって、Ｍｇ＋＋の効果がプラスミドＤＮＡ構造に対するものであるかまたは酵素に対するものであるかを区別することは可能ではない。基質としての一本鎖ＤＮＡに関して、基質超ヘリックス性に対するＭｇ＋＋の効果は含まれないので、酵素に対するＭｇ＋＋の効果はおそらく低かった。変異検出アッセイに関して、Ｍｇ＋＋が二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチでの最適なＣＥＬ Ｉ切開に必要とされることが明らかである（図３）。ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮがホスホジエステル結合開裂のために同一の触媒メカニズムを用いるとすれば、それらの差異は基質が認識される程度にある。Ｍｇ＋＋の役割は、基質認識のための構造的役割にあるが、ＤＮＡ加水分解にはない（２６）。最後に、ＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉは、共に、ＲＮａｓｅであることが観察される。意外にも、ＭＢＮは、主として、中性ｐＨでは、ＤＮａｓｅ活性よりも少なくとも１０００倍大きいＲＮａｓｅ活性を有するＲＮａｓｅである。
【０１０２】
かくして、ＭＢＮおよびＣＥＬ Ｉが、構造的に関連するヌクレアーゼのＳ１スーパーファミリーの範囲内の２つの異なる酵素ファミリーを表すことが明らかである。Ｐ１ヌクレアーゼの高分解能Ｘ線構造は、二本鎖ヘリックスがＰ１ ＤＮＡ結合グローブに適合し得ないことを示した（２１−２２）。
【０１０３】
すなわち、ＣＥＬ Ｉは、ミスマッチ認識ヌクレアーゼの固有のファミリーの例であると考えられる。加えて、著しい配列類似性に基づいて、ＣＥＬ Ｉオルソログ配列は、ＣＥＬ Ｉについて本明細書で記載した変異検出のためのアッセイ方法において有利に用いられると考えられる。
【０１０４】
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【０１０５】
本発明のある好ましい実施態様を上記にて記載し、具体的に例示したが、本発明はかかる実施態様に限定されるものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく種々の変更を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 精製されたＣＥＬ ＩおよいＣＥＬ ＩＩのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図２】 ＣＥＬ ＩのｃＤＮＡ（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列便号：２）を示す。
【図３】 ゲルイメージの写真であって、変異検出分析物のＣＥＬ Ｉ変異検出についてのＭｇ＋＋およびｐＨの効果を示す。
【図４】 ＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＦ−Ｉ ＤＮＡのニッキングを示す。
【図５】 ＣＥＬ Ｉおよびヤエナリヌクレアーゼによる変性仔ウシ胸腺ＤＮＡの可溶化を示す。
【図６】 ＣＥＬ ＩおよびＭＢＮにより媒介されるミスマッチ検出を含む電気泳動図を示す。
【図７】 ＣＥＬ ＩおよびヤエナリヌクレアーゼによるＲＮＡの可溶化を示す。
【図８】 ＣＥＬ Ｉ精製フラクションのポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図９】 一対のゲルであって、炭水化物部分を除去する前後で、ＳＤＳゲルから再生されたＣＥＬ Ｉ、ＣＥＬＩＩ蛋白によるミスマッチ基材での切断を示す。
【図１０】 ＣＥＬ Ｉアミノ酸配列の同種配列とのクルスタル・ダブリュ・アライメントを示す。
【配列表】
Claims (23)
- 配列番号：１の配列を含む核酸分子であって、その核酸分子がセルリ由来のエンドヌクレアーゼ蛋白をコードし、そのコードされた蛋白が複数のα−へリックスドメインおよびフレキシブルなカルボキシ末端領域を含む、単離された核酸分子。
- ＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
- ｃＤＮＡである、請求項２記載のＤＮＡ分子。
- 請求項１記載の核酸分子より転写される単離されたＲＮＡ分子。
- ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むエンドヌクレアーゼをコードする配列；または
ｂ）配列番号：１と９０％以上の同一性を有する配列であって、エンドヌクレアーゼをコードする配列
を含む、核酸分子。 - 配列番号：１の配列である、請求項１記載の核酸分子。
- 長さが１５個ないし２００個のオリゴヌクレオチドであって、配列番号：１で示される核酸分子を検出するためのプローブまたはプライマーであり、配列番号：１で示される核酸分子と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
- 配列番号：２の配列を有するエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子。
- 請求項８記載の核酸分子によりコードされる単離された蛋白に対して免疫学的に特異的な抗体。
- モノクローナルである、請求項９記載の抗体。
- ポリクローナルである、請求項９記載の抗体。
- 配列番号：１の配列を含むプラスミド。
- 配列番号：１の配列を含むベクター。
- 配列番号：１の配列を含むレトロウイルスベクター。
- 配列番号：１の配列を有する核酸分子を含む宿主細胞。
- 細菌、真菌、哺乳動物、昆虫および植物細胞からなる群より選択される、請求項１５記載の宿主細胞。
- 配列番号：１の配列を有する核酸分子を含むトランスジェニック動物。
- ＣＥＬ Ｉ調節活性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）配列番号：２の配列を含む、ＣＥＬ Ｉエンドヌクレアーゼを発現する宿主細胞を得；
ｂ）該宿主細胞をＣＥＬ Ｉ活性を調節すると思われる化合物と接触させ；および
ｃ）ＣＥＬ Ｉのエンドヌクレアーゼ活性における変化により評価されるようなＣＥＬ Ｉ調節活性を測定すること
を含む、方法。 - 一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの変異していない配列を基準にして、該標的配列中の変異を測定する方法であって、該配列を増幅させ、検出可能なマーカーで標識化し、相互にハイブリダイズさせ、配列番号：２のアミノ酸配列を含む、エンドヌクレアーゼに曝し、変異の存在を分析する方法。
- エンドヌクレアーゼがセルリ由来である、請求項１９記載の方法。
- ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１９記載の方法。
- ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１９記載の方法。
- 配列番号：２のアミノ酸配列を有する、単離されたＣＥＬ Ｉエンドヌクレアーゼ。
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