JP4101285B2 - Dnaミスマッチ修復遺伝子に関する組成物および方法 - Google Patents
Dnaミスマッチ修復遺伝子に関する組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4101285B2 JP4101285B2 JP51702495A JP51702495A JP4101285B2 JP 4101285 B2 JP4101285 B2 JP 4101285B2 JP 51702495 A JP51702495 A JP 51702495A JP 51702495 A JP51702495 A JP 51702495A JP 4101285 B2 JP4101285 B2 JP 4101285B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- information
- gene
- hmlh1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
本願は、1994年3月8日に出願された出願米国特許出願第08/209521号、名称:ほ乳類DNAミスマッチ修復遺伝子PMS1およびMLH1(MAMMALIAN DNA MISMATCH REPAIR GENES PMS1 AND MLH1)の一部継続出願であって、この出願は、1993年12月17日に出願された米国特許出願第08/168887号の一部継続出願である。上述の全ての特許出願を参照として取り込む。
発明の分野
本発明は、DNAミスマッチ修復遺伝子に関連する。特に、本発明は、DNAミスマッチ修復遺伝子における変異および多型性の検出、DNAミスマッチ修復不完全腫瘍(mismatch-repair-defective-tumors)の同定および特徴付け、並びにガンの遺伝的な罹りやすさ(susceptibility)の検出に関連する。
背景
近年、ポリメラーゼチェーン反応(PCR)等の強力なクローニングおよび増幅技術の進展に伴い、多数のヒト遺伝子とマーカーの構造および局在箇所に係る情報の急速な蓄積と組み合わせて、高頻度である種の遺伝的疾患を示すと同定されたファミリーのメンバーである個人のDNAまたはRNAのサンプルを回収し分析することが実用かつ利用できるようになってきた。例えば、スクリーニング工程は、鎌状赤血球貧血、嚢胞性繊維症、ぜい弱Xクロモソーム症候群および多発性硬化症を含む遺伝子のスクリーニングに決まって使用される。ある種の疾患では、早期の診断により、例えば、積極的な診断方法の採用および/または、予期された問題の予防または準備に適切であればライフスタイルを変えることによって、ヒトの長期の予後を大幅に改良することができる。
ある特定のヒト遺伝子変異が同定され、ある病気と関連づけられれば、危険性の高い個人を同定するスクリーニング工程の改良は比較的直ぐになされる。例えば、変異遺伝子の構造および正常でない表現型の役割がわかった後で、試験のために個人から遺伝子の増幅量を得るための、PCR用プライマーを設計することができる。しかしながら、変異遺伝子の最初の発見、すなわちその構造、局在箇所および既知の遺伝的な健康上の問題との結合は、実質的な実験の努力を必要とし、調査手段を生じる。
ある疾患を引き起こす変異遺伝子の役割を発見する一つの試みは、高頻度にその疾患を示すファミリーの個人に係る診療研究から始まる。これらの研究では、疾患誘発座(locus)の適切な位置は、その座で隔離しがちなクロモソームを調査することによって間接的に決定される。この試みの原理的な制限は、その遺伝子の適切な遺伝子位置を決めることはできるが、一般的にその遺伝子を実際に単離または配列決定できないことである。例えば、Lindblomら3は、高い発生率の遺伝的非ポリポシス大腸ガン(HNPCC)を示すことが知られているファミリーの個人におけるSSLP(単純配列長さ多型性(simple sequence length polymorphism))マーカーを用いて行われた結合分析研究の結果を報告している。Lindblomらは、ヒトクロモソーム3(3p21−23)の短い腕の多型性マーカーと、大腸ガンを進展する個人の危険性を増加する原因となるであろう疾患座との間の“堅固な結合”を見出した。3p21−23は、全体的な遺伝子に対してかなり特異的な位置ではあるが、問題の大きさの変異遺伝子に対する巨大なDNA領域を示す。この変異遺伝子は、多数の塩基で、その座を同定するマーカーから分けることができる。ある人の危険性を予測するために、遺伝的分析は、そのファミリーにおける多数の関連した個人にしっかり結合した遺伝マーカーで行われなければならないため、このような結合研究は、せいぜいスクリーニング目的に利用性を限定してしまう。特に病気に冒されたファミリーのメンバーが死亡してしまう場合には、このような情報を得ることは多くの場合不可能である。また、情報マーカーは、分析下でファミリーに存在しないかもしれない。遺伝子構造を知ることなくして、サンプリング、増幅、配列決定および個人が変異遺伝子を有するか否かを直接的に決定することは不可能である。
疾患誘発変異遺伝子を見出す別の試みは、疾患に係る既知の情報、例えば病状のメカニズムの理論、関連するタンパクの構造および機能、ヒトまたは他の種における可能な類似遺伝子等に基づいて、PCRプライマーを設計することおよび試みることから始まる。その目的は、個人に疾患の傾向を与える変異体に起こると信じられている候補の正常遺伝子を単離および配列決定することである。この試みは、その疾患について分子レベルでどれくらい多くのことが知られているか、並びに候補の遺伝子を見出す戦術および方法を組み立てるための研究者の力量に高度に依存する。候補の遺伝子の変異と疾患との関係は、疾患の高い発生率を示すファミリーのメンバーにおける試験を行うことによって究極的に調べられなければならない。ファミリーの研究におけるそのような結合を確かめる最も直接的かつ決定的な方法は、そのファミリーのメンバーから回収されたサンプルの候補となる遺伝子の部分を増幅するように設計されたPCRプライマーを用いることである。次いで、変異を探して特徴付けるために、増幅遺伝子産物を配列決定し、正常な遺伝子構造と比較する。所定の変異は、病気にかかっていない個人はそれを持っていないが、病気にかかった個人はそれを有していることを示すことによって、並びに、その変異が、簡単な多重性ではないタンパク機能における変化を引き起こすことを示すことによって、最終的に関係付けられる。
候補の遺伝子変異と疾患との間の結合の高い見込みを示す別の方法は、遺伝子のクロモソームの位置を決定し、次いで遺伝子地図の位置をLindblomらによって同定されたもの等の疾患関連座の既知の領域と比較することによる。以前に同定された疾患関連座の領域の候補遺伝子の完全に一致するマップ位置は、候補遺伝子における変異と疾患との間の関係を強力に関連づけるであろう。
遺伝子候補における変異が疾患に係るかもしれないことを示す別の方法がある。例えば、人工的に産生された遺伝子の変異形態を動物に導入することができる。次いで、変異遺伝子を有する動物における疾患の発生率を、正常な遺伝子型を有する動物と比較することができる。野生型の遺伝子を備えた動物と比べて、変異遺伝子型を有する動物において疾患の発生率が顕著に高められたことは、候補の遺伝子内の変異が、時に疾患の発生の原因であるという理論を支持しうる。
疾患関連遺伝子変異により最近多くの注目を集めたある種の疾患は、遺伝的非ポリポシス大腸ガン(Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer)(HNPCC)1,2である。また、HNPCCファミリーのメンバーは、子宮内膜、卵巣、胃および胸を含む別のガンへの罹りやすさを増加することも示す。大腸ガンの約10%は、HNPCCであると信じられている。HNPCC患者の腫瘍は、ヒトクロモソームDNA(“ミクロサテライトDNA”)に見られるジヌクレオチド(二つのヌクレオチド)の繰り返し配列のような、短い、繰り返しDNA配列が不安定と思われる、異常な遺伝的欠陥を示す。この短い、繰り返しDNA配列の遺伝子の不安定性は、“RER+”発現型と称されることがあるが、多くの種類の散在性の腫瘍にかなりの割合で観察され、多くの散在性の腫瘍がHNPCCにおける遺伝した変異に類似(または同一)の変異を得ることが仮定される。
遺伝的結合の研究は、90%程度のHNPCCを説明すると考えられる二つのHNPCC座を同定した。この座は、ヒトクロモソーム2p15−16(2p21)および3p21−23に位置づけられる。後の研究により、ヒトDNAミスマッチ修復遺伝子hMSH2が、クロモソーム2p21上の遺伝子であることを同定し、変異がHNPCCガンの重要な画分であることを説明した1,2,12。hMSH2は、その正常な機能は、クロモソーム複製の各段階に流れるミスペアを含むDNAのミスペアを同定して正すいくつかの遺伝子の一つである。
最もよく調べられたミスマッチ修復経路は、mutH、mutL、mutSおよびmutU(uvrD)遺伝子産物に依存したロングパッチ(約3Kb)切除修復反応を起こすE.coliのMutHLS経路である。このMutHLS経路は、E.coliにおける最も活性の高いミスマッチ修復経路と考えられており、DNA複製の正確さを増加し、ミスペアの塩基を含む中間物の組換えに作用することが知られている。このシステムはin vitroで再構築され、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素、DNAリガーゼ、一本鎖DNA結合タンパク(SSB)およびExo I、Exo VIIまたはRecJ等の一本鎖DNAエキソヌクレアーゼの一つと一緒に、mutH、mutL、mutSおよびuvrD(ヘリカーゼII)タンパクを必要とする。hMSH2は、細菌性mutS遺伝子に相同である。イーストにおける類似経路は、イーストMSH2遺伝子およびPMS1およびMLH1と称される二つのmutL様遺伝子を含む。
ヒトmutS型遺伝子(hMSH2)の変異が時にガンを引き起こすという知識、およびHNPCC腫瘍がミクロサテライトDNAの不安定性を表すという発見に基づいて、他のDNAミスマッチ修復遺伝子および遺伝子産物における関心、およびHNPCCおよび/または他のガンにおけるその可能な役割がいっそう強烈になった。200人中1人が、hMSH2遺伝子または同じDNAミスマッチ修復経路における別のタンパクをコードする他の関連遺伝子に変異を起こすと概算される。
我々の研究の重要な目的は、ガンを引き起こす危険性の高い個人をスクリーニングおよび同定するのに使用できるヒト遺伝子を同定することである。他の目的は:このような遺伝子のエキソンおよび隣接するイントロンの構造の配列を決定すること;ガンの罹りやすさを与える遺伝子産物の欠損または欠陥をもたらす変異を見出し特徴付ける目的の試験方法を設計するために構造的な情報使用すること;このような変異を“無害な”多型性の種類と区別することである。他の目的は、腫瘍のタイプを診断し適切な治療を処方するために、ガン関連遺伝子のエキソンおよび隣接するイントロン配列に係る構造情報を用いることである。他の目的は、研究用の他の関連候補ヒト遺伝子を同定するために、ガン関連遺伝子に係る構造情報を用いることである。
発明の要旨
ミスマッチ修復遺伝子の保存を含む細菌およびイーストにおけるDNAミスマッチ修復メカニズムに関する我々の知識に基づいて、ヒトDNAミスマッチ修復同族体が存在すべきであること、およびタンパク機能に影響するこのような同族体における変異が、ことによるとヒトのガンのある形態を引き起こす危険性を増す遺伝学的な不安定性を引き起こすであろうことを理由付けた。
それぞれDNAミスマッチ修復に係る一つのタンパクをコードする二つのヒト遺伝子、hPMS1およびhMLH1を単離して配列決定した。hPMS1およびhMLH1は、E.coliで見出されたmutL遺伝子に相同である。我々の研究は、DNAミスマッチ修復遺伝子における変異とHNPCCへの罹りやすさとの間の関係を強力に支持する。しかして、本発明のDNAミスマッチ修復遺伝子配列情報、すなわちhMLH1とhPMS1に係るcDNAおよび遺伝子構造は、ガンの危険性の決定および診断に関連する多数の使用可能な方法を可能にする。また、本発明は、このような方法に使用できる多数のヌクレオチドおよびタンパクの構造を含む。
我々は、hMLH1の位置をヒトクロモソーム3p21−23にマップした。これは、ファミリーの研究に基づいた、個人をHNPCCに罹りやすくする座を保有するヒトゲノムの領域である。さらに、我々は、スウェーデンのファミリーのHNPCCに冒された個人におけるhMLH1 cDNAの保存された領域に変異を見出した。この変異は、同じファミリーの病気に罹っていない個人からは見出されず、単なる多型性ではなかった。また、イーストにおける相同な変異が、欠陥のあるDNAミスマッチ修復タンパク質をもたらすことを見出した。また、英国のファミリーの病気に冒された個人のhMLH1にフレームシフト変異を見出した。hMLH1のガン関連変異の我々の発見は、以前に同定されたHNPCC関連座と完全に一致する遺伝子マップの位置、さらにはhMLH1遺伝子の変異防止における役割を組み合わせて、hMLH1遺伝子を共通に遺伝したヒトのガンの一つの形態の基礎となる主な候補、および癌の発生の危険の高い個人をスクリーニングして同定するための主な候補とする。
hMLH1は、19のエキソンと18のイントロンを備えている。我々は、それぞれの18のイントロンの位置を、hMLH1 cDNAに対して決定した。hMLH1のイントロン/エキソン境界領域の構造も決定した。イントロン/エキソン境界領域の構造の知識は、遺伝子産物の構造および機能を負に影響する変異を突き止める効率的なスクリーニングを可能にする。さらに、周りを取り囲むイントロンの境界構造と共に、個人の完全なエキソンを増幅するためのPCRに使用することができる完全なセットのオリゴヌクレオチドプライマーのペアを設計した。
我々は、hPMS1の位置をヒトクロモソーム7にマップした。他者39による後の研究は、この遺伝子における変異がHNPCCに関連するという我々の予想を確かめた。
最も直接的な本発明の使用は、例えばHNPCCのような非常に高頻度の早期開始ガンを示すファミリーのメンバーのヒト個人におけるスクリーニング試験である。従って、本発明の一つの態様は、患者の組織のミスマッチ修復遺伝子または遺伝子産物における変異を検出することにより、患者のガンへの罹りやすさの診断方法を含み、ここでは変異が患者のガンへの罹りやすさの指標である。本発明の好ましい態様では、検出工程は、ヒトmutL同族体遺伝子、例えばhMLH1またはhPMS1における変異を検出することを含む。
診断方法は、好ましくは以下の工程を含む:1)ミスマッチ修復遺伝子のセグメントまたは単離された核酸から遺伝子産物を増幅する;2)増幅されたセグメントと、ミスマッチ修復遺伝子の野生型対立遺伝子の類似セグメントまたは遺伝子産物とを比較する;および3)増幅セグメントと類似セグメントとの間の差異を検出する、この差異は、ミスマッチ修復遺伝子における変異、あるいはガンへの罹りやすさを与える遺伝子産物の指標である。
本発明の別の態様は、増幅されたセグメントと類似の野生型セグメントとの間の差異が病気に冒された表現型を引き起こすか否か、すなわち、配列の変化がDNAミスペアを修復する個人の能力に影響するか否かを決定する方法を提供する。
診断方法は以下の工程を含んでもよい:1)DNAミスマッチ修復遺伝子のRNAコピーの全部または一部を逆転写する;および2)逆転写によって産生されたDNAのセグメントを増幅する。本発明の増幅段階は、ミスマッチ修復遺伝子の反対の鎖に、反対の方向でハイブリダイズし得る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを選択すること、並びに、プライマー間に介入しているミスマッチ修復鎖の核酸が増幅されて増幅セグメントとなるようなオリゴヌクレオチドプライマーを利用したポリメラーゼチェーン反応を行うことを含んでもよい。
上述の方法の好ましい実施態様において、DNAミスマッチ修復遺伝子は、hMLH1またはhPMS1である。DNAのセグメントは、SEQ ID NOS:6−24からなる群から選択されたヌクレオチド配列の独特の部位に対応する。SEQ ID NOS:44−82からなる群から選択された“第一段階の”オリゴヌクレオチドプライマーは、DNAセグメントを増幅するPCRで用いられる。また、本発明は、鋳型DNAのより特異的な増幅および保存のために第一段階のプライマーと使用するための、“第二段階の”ネスティドプライマー(nested primers)(SEQ ID NOS:83−122)を用いる方法を提供する。
“本発明の他の態様は、ミスマッチ修復遺伝子または遺伝子産物、好ましくはmutL同族体(hMLH1またはhPMS1)における変異を腫瘍中に検出することを含むDNAミスマッチ修復欠陥腫瘍を同定および分類する方法を提供するものであり、この変異は、腫瘍のミスマッチ修復システムにおける欠陥の指標である。
また、本発明は、使用できるヌクレオチドおよびタンパク組成物を提供する。このような組成物の一つは、好ましくはhMLH1またはhPMS1のいずれかから誘導された、ヒトmutL同族体遺伝子または遺伝子産物の独特の部分に続いて対応するセグメントを含む、単離されたヌクレオチドまたはタンパク質構造である。
本発明の他の組成物の態様は、ヒトmutL同族体遺伝子、好ましくはhMLH1またはhPMS1の独特のセグメントを特異的に増幅するポリメラーゼチェーン反応において共に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
本発明の他の態様は、ヒトmutL同族体遺伝子の一部の相補的な塩基に対するワトソン/クリック対形成によって特異的に結合しうるヌクレオチド配列;並びにこの配列に取り付けられたラベル分子を含むプローブを提供するものであって、ここでラベル分子は、蛍光、放射活性および化学発光からなる群から選択された特徴を備えている。
また、マウスのMLH1(mMLH1)およびPMS1(mPMS1)遺伝子を単離および配列決定した。マウスミスマッチ修復遺伝子に関する我々の知識を用いて、ガン研究用の動物モデルを作製した。このモデルは、さらなるガン遺伝子の同定、および変異誘発に対する環境の影響を研究するのに使用できる。
mPMS1 cDNAによってコードされたタンパクの一部に向けられたポリクローナル抗体を産生した。また、この抗体はhPMS1タンパクと反応し、正常のhPMS1遺伝子によってコードされたタンパクの存在を検出するのに使用できる。また、hMLH1とhPMS1に向けられたモノクローナル抗体を生成している。
遺伝子の診断および治療の使用に加えて、hMLH1とhPMS1に関する我々の知識は、ヒトのガンのある形態において役割を演じるための候補である関連した機能の他の遺伝子を調査するために用いることができる。
図の説明
図1は、ヒトおよびマウスのPMS1およびMLH1遺伝子を単離、特徴決定および使用するために使用した実験工程の順序の概要を示すフローチャートである。
図2は、さらなるmutL同族体を単離するための縮重(degenerate)PCRオリゴヌクレオチドを作製するために用いた二つの高度に保存された領域(下線が引かれている)を示すmutL同族体のタンパク配列の並び(SEQ ID NOS:1−3)である。
図3は、ヒトMLH1遺伝子の完全なcDNAヌクレオチド配列(SEQ ID NO:4)、およびヒトMLH1タンパクの対応する推測されるアミノ酸配列(SEQ ID NO:5)を示す。下線が引かれたDNA配列は、MLH1遺伝子の一部を増幅するために独創的に用いられた縮重PCRプライマーに対応するcDNAの領域である(ヌクレオチド118−135および343−359)。
図4Aは、完全なhMLH1 cDNA構造に集団で対応する19のエキソンのヌクレオチド配列を示す。このエキソンは、イントロン境界構造が隣接している。プライマー部位には、下線が引かれている。隣接するイントロン構造を伴ったエキソンは、SEQ ID NOS:6−24に対応する。下線が引かれていない小文字で表されたエキソンは、SEQ ID NOS:25−43に対応する。
図4Bは、個々のエキソンを増幅するためにPCRで用いられたプライマーペアのヌクレオチド配列を示す。“第二段階”増幅プライマー(SEQ ID NOS:83−122)は、対応する“第一段階”増幅プライマー(SEQ ID NOS:44−82)で得られた増幅産物の標的エキソンを増幅するために用いられる“ネスティド”プライマーである。図4Bにおける構造は、表2および3における構造に対応する。
図5は、ヒトおよびイースト(それぞれ、SEQ ID NOS:5および123)MLH1タンパクの推測されたアミノ酸配列の並びである。
図6は、mutL関連タンパクの系統樹である。
図7は、二つの写真である。最初のパネル(A)は、クロモソーム3のhMLH1遺伝子のハイブリダイゼーションを示す中期拡散(metaphase spread)である。第二のパネル(B)は、ヒトクロモソーム3表意文字と並べられた多重中期拡散のクロモソーム3の構成物である。
図8は、hMLH1タンパクの44位で非保存的アミノ酸置換を生じるCからTへの転写変異の同定を示す、病気に冒された個人と病気に罹っていない個人からの配列クロマトグラムの比較である。
図9は、推測されるアミノ酸置換の部位を囲むタンパクのMLHファミリーの高度に保存された領域のアミノ酸配列の並び(SEQ ID NOS:124−131)である。太文字は、病気に冒された個人におけるセリンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換の位置を示す。また、強調されているのは、MutL様タンパクのこの位置において保存されたセリンまたはアラニン残基である。点は、高度のアミノ酸の保存の位置を示す。MLH1タンパクでは、点は、配列が得られていないことを示す。配列は、図6の系統樹を参照して、下に記載されるように並べられた。
図10は、hPMS1の完全なヌクレオチド配列を示す(SEQ ID NO:132)。
図11は、ヒトおよびイーストPMS1タンパク(それぞれ、SEQ ID NOS:133および134)の推測されたアミノ酸配列の並びである。アミノ酸の同一は囲みで示され、ギャップはダッシュで示されている。
図12は、マウスMLH1(mMLH1)cDNA(SEQ ID NO:135)の一部のヌクレオチド配列である。
図13は、mMLH1とhMLH1タンパク(それぞれ、SEQ ID NOS:136および5)の推測されたアミノ酸配列の比較である。
図14は、マウスPMS1(mPMS1)(SEQ ID NO:137)のcDNAヌクレオチド配列を示す。
図15は、mPMS1およびhPMS1タンパク(それぞれ、SEQ ID NOS:138および133)の推測されたアミノ酸配列の比較である。
定義
遺伝子 − “遺伝子”完全なコード配列を含むヌクレオチド配列を意味する。一般的に、“遺伝子”は、コードされたポリペプチドの発現に影響するコード配列の上流(例えば、プロモーター配列、エンハンサー等)または下流(例えば、転写終結シグナル、ポリアデニレーション等)に見られるヌクレオチド配列をも含む。
遺伝子産物 − “遺伝子産物”は、遺伝子の一部のDNAまたはRNA(mRNA)コピーのいずれか、あるいは、mRNAから翻訳された対応するアミノ酸配列である。
野生型 − “野生型”という用語は、本発明の核酸およびタンパクに適用された場合には、天然に生じる、正常な核酸またはタンパク(すなわち、野生型の活性を備えた核酸またはタンパク)から区別できないように機能する核酸またはタンパクの形式を意味する。例えば、ミスマッチ修復遺伝子の“野生型”対立遺伝子は、細胞におけるミスマッチ修復を検出可能に変えることなく、宿主細胞内で同一の遺伝子の正常な内因性コピーを機能的に置換することができる。同じ核酸またはタンパクの別の野生型は、構造的に互いに違っても違わなくてもよい。
非野生型 − “非野生型”という用語は、本発明の核酸およびタンパクに適用された場合には、天然に生じる、正常な核酸またはタンパクから区別できるように機能する核酸またはタンパクの形式を意味する。本発明の核酸の非野生型対立遺伝子は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列における差異および/またはポリペプチド産物のコードされたヌクレオチドの転写の発現レベルでの差異に限定されないが、これらを含む種々の点で同じ核酸の野生型対立遺伝子から構造的に区別できる。
例えば、本発明の核酸の非野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、ヌクレオチドの付加、欠失、置換および/または転移によって、野生型対立遺伝子のヌクレオチド配列と異なってもよい。同様に、非野生型ミスマッチ修復タンパクのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸の付加、置換および/または転移によって野生型ミスマッチ修復タンパクのアミノ酸配列と異なってもよい。
正常な宿主細胞に導入された場合に、内因性ミスマッチ修復経路を妨げる特定の非野生型の核酸またはタンパクは、“優性陰性(dominant negative)”核酸またはタンパクと称する。
相同 − “相同”という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルで高度に関連する核酸またはポリペプチドを指す。互いに相同である核酸またはポリペプチドは、“同族体”と称する。
“相同”という用語は、必須的に二つの配列間の比較を指す。本発明によれば、二つのヌクレオチド配列は、コードするポリペプチドが、少なくとも20アミノ酸の一続きに対して、少なくとも約50−60%同一、好ましくは約70%同一であれば相同であると見なされる。また好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも4−5の独特に指定されたアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。お互いにこれらのアミノ酸の同一性およびおよその間隔(the approximate spacing)は、ヌクレオチド配列が相同であると見なされるように考えられる必要がある。長さにして60ヌクレオチドより短いヌクレオチド配列では、相同性は、少なくとも4−5の独特に指定されたアミノ酸の一続きをコードする能力によって決定される。
上流/下流 − “上流”および“下流”という用語は、ヌクレオチド配列の部位の位置を指す技術用語である。“上流”は、参照部位より5’側の部位を意味する。“下流”は、参照部位より3’側の部位を示す。
イントロン/エキソン − “エキソン”および“イントロン”という用語は、ゲノム遺伝子配列の種々の部位を指す技術用語である。“エキソン”は、タンパクをコードするゲノム遺伝子配列の部位である。“イントロン”は、ゲノム遺伝子配列のエキソン間に見られるヌクレオチドの配列である。
病気に冒された − “病気に冒された”という用語は、ここで用いられるように、特有のガン(例えば、HNPCC血統における大腸ガン)が発生した、および/または、例えば遺伝学的研究に基づいて、癌にかかりやすくなる遺伝した変異を有することが予告された血縁のメンバーを指す。
独特の − 遺伝子またはタンパクの“独特の”セグメント、フラグメントまたは部位は、個々のゲノムの他の遺伝子またはタンパクのセグメントと連続して異なる遺伝子またはタンパクの一部を意味する。実際には、遺伝子の独特のセグメントまたはフラグメントは、典型的には、長さにして少なくとも約13塩基のヌクレオチドであろうし、オリゴヌクレオチドプライマーが選択的かつ特異的にセグメントを増幅するように設計および使用されるべく、他の遺伝子セグメントとは十分に異なるであろう。タンパクの独特のセグメントは、典型的に、遺伝子の独特のセグメントから翻訳されうるアミノ酸配列である。
参考文献
以下の刊行物は、本出願の文章に番号で示される。各刊行物は、参照としてここに取り込まれる。
発明の説明
我々は、DNAミスマッチ修復に係る哺乳類の遺伝子を見出した。その遺伝子の一つhPMS1は、イーストDNAミスマッチ修復タンパクPMS1に相同であるタンパクをコードしている。hPMS1の位置をヒトクロモソーム7にマップし、マウスPMS1遺伝子をマウスクロモソーム5、バンドGにマップした。他の遺伝子、hMLH1(MutL Homolog(MutL同族体))は、イーストDNAミスマッチ修復タンパクmlH1に相同なタンパクをコードする。我々は、hMLH1の位置をヒトクロモソーム3p21.3−23およびマウスクロモソーム9、バンドEにマップした。
研究1,2は、HNPCCのクロモソーム2pのヒトDNAミスマッチ修復遺伝子同族体の関係を証明した。結合データに基づいて、第二のHNPCC座は、クロモソーム3p21−233に割り当てられた。クロモソーム3関連血族の腫瘍DNAの調査が、他のHNPCCファミリー6に観察されるものおよび数種の散発性の腫瘍7-10と似たジヌクレオチド繰り返し不安定性を示した。ジヌクレオチド繰り返し不安定性は、DNAミスマッチ修復における欠陥の特徴であるため5,11,12、クロモソーム3p21−23に関連したHNPCCが、第二のDNAミスマッチ修復遺伝子における変異から来るものであると推論した。
大腸菌(Escherichia coli)におけるミスマッチしたDNAの修復は、mutS、mutLおよびmutHを含むいくつかの遺伝子を必要とし、そのいずれかにおける欠陥は、自発的な変異速度を上昇させる13。イースト サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)における遺伝的研究により、3つのDNAミスマッチ修復遺伝子:mutS同族体、MSH214、および二つのmutL同族体、PMS116とMLH14が同定された。これら3つの遺伝子はいずれも、ジヌクレオチドの繰り返しの安定化を含む正確なDNA複製という点において不可欠な役割を演じる5。
hMLH1遺伝子産物とイーストDNAミスマッチ修復タンパク、MLH1との類似性4、hMLH1遺伝子とクロモソーム3のHNPCC座が同一場所にあること、およびクロモソーム3関連HNPCCファミリーの病気に冒された個人に見出されたミスセンス変異に基づいて、hMLH1が、以前にクロモソーム3pに関連付けされたHNPCC遺伝子であると信じた。
ヒトおよびマウスのMLH1およびPMS1遺伝子構造に関する我々の知識は、多くの重要な使用を備えている。遺伝子配列情報は、ガンの危険性について個人をスクリーニングするために使用することができる。遺伝子構造の知識は、正常な配列との比較およびガンの危険性の分析のために、hMLH1とhPMS1遺伝子の部位を選択的に増幅するのに用いられるPCRプライマーを容易に設計することを可能にする。また、この種の試験は、ガンのスクリーニングに関する労力を特異的な遺伝子座に最後に集中するために、hMLH1およびhPMS1ガン関連変異を調査および特徴付けることも可能にする。hMLH1およびhPMS1におけるガン関連変異の特異的な特徴付けは、特異的な遺伝子の変異が存在するか否かを決定するスクリーニング試験に用いられる対立遺伝子特異的プローブ等の、別の価値ある診断の道具を作製することを可能にする。
さらに、hMLH1および/またはhPMS1の遺伝子配列情報は、例えば、ガンに関連する候補である関連した機能を有する別の遺伝子を調査するために、二つのハイブリッドシステムで使用することもできる。
hMLH1およびhPMS1遺伝子構造は、特定の部位または完全なhMLH1およびhPMS1タンパクに向けられた抗体を生成するのに使用されるタンパクを調製するのに使用できる。このような抗体は、調査および診断の目的で、対応するタンパクおよび関連しうるタンパクを単離するために用いられる。
マウスMLH1およびPMS1遺伝子配列は、それぞれの遺伝子に変異を備えたマウスを作製するのに使用できる。変異マウスは、遺伝子の機能、特にそれとガンとの関係を研究するのに使用できる。
哺乳類MLH1およびPMS1遺伝子の単離および特徴付けの方法
4つの哺乳類の遺伝子、すなわちヒトMLH1(hMLH1)、ヒトPMS1(hPMS1)、マウスMLH1(mPMS1)およびマウスPMS1(mPMS1)を単離および特徴付けした。これらの遺伝子間の構造の類似性により、単離および特徴付けに用いた方法は、一般的に同じである。図1は、広い意味で、4つの遺伝子を単離および特徴付けるために用いた実験の試みを示す。以下の議論は、図1に示された段階的な工程を示す。
段階1 PCR用の縮重オリゴヌクレオチドプールの設計
初期のレポートは、3つのMutL様タンパクの部位、すなわち細菌から二つ、MutLおよびHexB、およびイーストから一つ、PMS1は、高度に保存されていることを示唆した16,18,19。図2に示すように、HexB、MutLおよびPMS1タンパクのアミノ酸配列の調査後、MutL様タンパクの二つの高度に保存された領域、KELVENおよびGFRGEAに対応する縮重オリゴヌクレオチドペアのプールを設計した。4つの遺伝子を単離するのに使用した縮重オリゴヌクレオチドの配列(それぞれ、SEQ ID NOS:139および140)は、以下に示すものである。
プライマー内の下線を引いた配列は、それぞれXbaIおよびSacI制限エンドヌクレアーゼ部位である。これらは、PCR増幅フラグメントのクローニングを容易にするために導入された。オリゴヌクレオチドの設計において、所定のアミノ酸は一つ以上のDNAトリプレット(コドン)によってコードされることを考慮した。これらの配列内の縮重は、()内の複数のヌクレオチドによって、もしくはその位置にどの塩基が存在してもよいものとしてNで示されている。
段階2 ヒトの細胞から単離されたポリA+選択mRNAの逆転写およびPCR
培養したヒトの細胞からメッセンジャー(ポリA+に富んだ)RNAを単離し、そのmRNAから二重鎖cDNAを合成し、縮重オリゴヌクレオチドでPCRを行った4。アニーリング温度を調製するなどして、いくつかの異なるPCR条件を試した後、MutL様タンパクに予想される大きさのDNA(〜210bp)を増幅することに成功した。
段階3 PCR生成フラグメントのクローニングおよび配列決定;ヒトPMS1およびMLH1を表す二つの遺伝子フラグメントの単離
アガロースゲルからPCR増幅物(〜210bp)を単離し、これをプラスミド(pUC19)にクローン化した。いくつかの異なるクローンのDNA配列を決定した。二つのクローンのDNA配列から推量されるアミノ酸配列は、他の既知のMutL様タンパクに強い類似性を示した4,16,18,19。クローンの一つに予想されるアミノ酸配列は、イーストのPMS1タンパクに非常に類似していた。それゆえ、それにヒトPMS1、hPMS1という名前を付けた。第二のクローンは、イーストのMLH1タンパクに非常に近接に類似したポリペプチドをコードすることがわかり、ヒトMLH1、hMLH1という名前を付けた。
段階4 プローブとしてPCRフラグメントを用いた完全なヒトおよびマウスPMS1およびMLH1のcDNAクローンの単離
ヒトおよびマウスcDNAライブラリー(Stratagene社、あるいは参考文献30の記載による)の両方をスクリーニングするためのプローブとして、hMLH1およびhPMS1のcDNAの210pbのPCR生成フラグメントを使用した。これらの二つの遺伝子に対応するいくつかのcDNAを単離した。このcDNAの多くは、5’末端で切りつめられていた。必要であれば、cDNAライブラリーのさらなるスクリーニングに加えて、PCR技術31を遺伝子の5’末端を得るために用いる。完全な構造のcDNA配列を、ヒトおよびマウスのアミノ酸配列、mlH1およびPMS1タンパクの推測に用いた。
段階5 ヒトおよびマウス、PMS1およびmlH1ゲノムクローンの単離
ヒトMLH1およびPMS1遺伝子のゲノムおよびcDNA構造の情報は、ガンの傾向のあるファミリーで変異を完全にスクリーニングするのに必要である。ヒトPMS1およびMLH1のゲノム配列を単離するプローブとしてヒトcDNA配列を用いた。全てではないが、ほとんどのcDNA(エキソン)配列を含有すると思われる、hPMS1の4つのコスミドと二つのP1クローンを単離した。hMLH1に関して、5’-MLH1ゲノム配列を含有する4つのオーバーラップするλファージクローンと4つのP1クローン(二つの完全な長さのクローンとプロモーター領域の5’コード末端プラス部位を含む二つ)P1クローンを単離した。hMLH1のcDNAの5’および3’末端に特異的なオリゴヌクレオチドの組を用いたPCR分析は、P1クローンが完全なhMLH1のcDNAの情報を含むことをはっきりと示した。同様に、マウスPMS1およびMLH1遺伝子のゲノムクローンが、(段階8に記載するようにして)単離および部分的に特徴付けされた。
段階6 蛍光in situハイブリダイゼーションによる、ヒトおよびマウス、PMS1およびMLH1遺伝子のクロモソーム位置マッピング
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)20,21によって、クロモソームの位置決めをするためにヒトおよびマウスのPMS1およびMLH1から単離したゲノムクローンを用いた。ヒトのMLH1遺伝子を、以下により詳細に記載するようにして、図7に示されたクロモソーム3p21.3−23にマップした。マウスMLH1遺伝子をクロモソーム9バンドEにマップし、この領域は、マウスとヒトの間のシンテニー(synteny)である22。FISH技術に加えて、げっ歯類/ヒト体細胞ハイブリッドマッピングパネル(Coriell Institute for Medical Research, Camden, N.J.)からのDNAを分析するために、一対のhMLH1特異的オリゴヌクレオチドを用いたPCRを行った。このパネルを用いたPCRの結果は、hMLH1がクロモソーム3に位置することを明確に示唆する。hMLH1 3p21.3−23の位置は、関連データに基づいたHNPCCの第二座を保有することが知られている領域と一致する。
図12に示すように、hPMS1遺伝子をクロモソーム7の長い腕(q)(それぞれ7q11または7q22)、マウスPMS1をクロモソーム5バンドGにマップした。これら二つの領域は、ヒトとマウスの間のシンテニーである22。hPMS1に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、げっ歯類/ヒト細胞パネルのDNAにPCRを行った。FISHのデータと一致して、hPMS1の位置は、クロモソーム7上にあることが確認された。これらの観察は、hPMS1がクロモソーム7に位置するという我々のヒトのマップ位置が正しいことを確信させるものであった。hPMS1の物理的な位置は、潜在的にhPMS1にガンに関連した変異を有するファミリーを同定する目的に使用できる。
段階7 HNPCCファミリーのhPMS1およびhMLH1遺伝子における変異を同定するためのゲノムおよびcDNA配列の利用
hPMS1またはhMLH1遺伝子における変異を同定する目的のためにHNPCCファミリーの個人から回収したサンプルを分析した。我々の試みは、既知の正常な配列と比較することができるエキソン/イントロンセグメントを得るために、遺伝子構造に関する我々の知識に基づいてPCRプライマーを設計することである。この試みを“エキソン-スクリーニング”と称する。
cDNA配列情報を用いて、ゲノム配列内のエキソン/イントロンの境界を描写するためにhPMS1およびhMLH1特異的オリゴヌクレオチドを設計し、現在も続けている。hPMS1およびhMLH1特異的オリゴヌクレオチドは、その配列を含むエキソンの存在についてゲノムクローンを調べるために用いられた。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、ゲノムクローンからDNAの配列決定のためのプライマーとして用いられた。エキソン-イントロン接合は、ゲノム配列とcDNA配列を比較することによって同定された。
PCRによるゲノムDNAの特異的エキソンの増幅およびその産物の配列決定は、変異についてHNPCCファミリーをスクリーニングする一つの方法である1,2。hMLH1のcDNA情報を含むゲノムクローンを同定し、hMCH1の19のエキソンが隣接する全てのイントロン/エキソン境界領域の構造を決定した。
クロモソーム3に関連を示すHNPCCファミリーの個人のMLH1遺伝子を調べるためにエキソン−スクリーニング手段を用いた3。以下により詳細に記載するように、CをTに置換することからなる、このようなファミリーの一つのMLH1遺伝子に変異を同定した。CをTに置換することが、このタンパクの高度に保存された領域において、セリンをフェニルアラニンに置換すると推論した。hMLH1とhPMS1遺伝子におけるさらなる変異を見出すために、サンプルを得たHNPCCファミリーを同定し続けている。
また、hPMS1とhMLH1における変異を同定するための第二の試みを用いている。この試みは、逆転写オフRNA(reverse transcription off RNA)によって第一鎖cDNAを作製するためにhPMS1またはhMLH1特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計することである。遺伝子特異的プライマーを用いたPCRにより、これらの遺伝子から特異的領域を増幅することができるであろう。増幅されたフラグメントのDNA配列により、変異を検出することができるであろう。
段階8 ES細胞におけるマウスPMS1およびMLH1遺伝子を崩壊するためのターゲッティングベクターの設計;ミスマッチ修復に欠陥のあるマウスの研究
ゲノムマウスPMS1 DNA構造に関する知識を基に、遺伝子ターゲッティングベクターを作製した。マウス胎児性幹細胞のPMS1遺伝子を崩壊するためにこのベクターを用いた36。この細胞を、PMS1変異を有する細胞にキメリック(混合)であるマウスに発達したマウス胚盤胞に注入した。このキメリックな動物は、PMS1変異にヘテロ接合およびホモ接合であるマウスを生むために使用される。これらのマウスは、生物体全体におけるPMS1遺伝子の役割を研究するために用いられる。
ヒトMLH1
以下の記載は、hMLH1に関する我々の実験的研究の説明をより詳細にするものである。上述したように、哺乳動物のMLH遺伝子をクローン化するために、イーストのMSH1、MSH2およびMLH1遺伝子、並びにヒトMSH2遺伝子を同定するのに用いられたものと同様のPCR技術を用いた1,2,4,14。PCRの鋳型として、培養された一次ヒト繊維芽細胞から調製されたポリ(A+)に富んだRNAから合成された二本差cDNAを用いた。縮重したオリゴヌクレオチドは、N末端アミノ酸配列KELVENおよびGFRGEA(図3参照)に向けられており、これら二つは、細菌およびイーストについて以前に記載されたタンパクのMutLファミリーの最も保存された領域である16,18,19。推定された大きさの二つのPCR産物を同定し、クローン化し、MutL様タンパクに対する相同性を備えた推定されたアミノ酸配列をコードすることを示した。PCRによって生成されたこれら二つのフラグメントは、ヒトcDNAおよびゲノムDNAクローンを単離するために用いられた。
ヒトMutL関連配列を増幅するために用いたこのオリゴヌクレオチドプライマーは、5’-
である。PCRは、cDNA鋳型、1.0μMの各プライマー、5IUのTaqポリメラーゼ(C)50mM KCl、10mMのTrisバッファーpH7.5および1.5mM MgClを含む50μL反応系で行われた。PCRは、1分間94℃、1分間43℃および1.5分間62℃の35サイクルで行われた。予想された大きさのフラグメント、約212bpは、pUC19にクローン化され配列決定された。クローン化MLH1 PCR産物は、ランダムプライマーラベリングキット(RadPrime、Gibco BRL)でラベルされ、標準的な方法でヒトcDNAおよびゲノムコスミドライブラリーをプローブするために用いられた。二本鎖プラスミドDNAのDNA配列決定は、以前に記載されたようにして行われた1。
図3に示されているhMLH1 cDNAヌクレオチド配列は、2268bpのオープンリーディングフレームをコードする。また、hMLH1 cDNAにコードされた予想されるタンパク配列も図3に示されている。下線を引いたDNA配列は、MLH1遺伝子の一部(ヌクレオチド118−135および343−359)を増幅するために最初に用いられた縮重PCRプライマーに対応するcDNAの領域である。
図4Aは、hMLH1の部位に対応する19ヌクレオチド配列を示す。各配列は、その全体の中に、隣接するイントロン配列で囲まれた19のエキソンの一つを含む。標的PCRプライマー部位に下線が引かれている。図4Aに示された配列の誘導および使用に関するさらなる詳細については、後述する。
図5に示すように、hMLH1タンパクは756アミノ酸からなり、イーストDNAミスマッチ修復遺伝子、MLH1のタンパク産物と41%の同一性を備えている4。イーストMLH1に非常に類似したhMLH1タンパクの領域は、55%の同一性を示すアミノ酸11から317、および二つのタンパク間で同一な少なくとも13アミノ酸に対応する。図5は、予想されるヒトMLH1およびS.cerevisiaeのMLH1タンパク配列の並びを示す。アミノ酸の同一は四角で囲まれ、ギャップはダッシュで示されている。ペアワイズ(pair wise)タンパク配列の並びは、クラスタル方法(the clustal method)を用いたDNAStar MegAlignで行われた27。ペアワイズ配列のパラメーターは、クプツル(ktuple)が1、ギャップペナルティー(gap penalty)が3、ウィンドウが5並びに対角線が5であった。さらに、図13に示すように、ヒトおよびマウスMLH1タンパクの予想されるアミノ酸配列は、少なくとも74%の同一性を示す。
図6は、MutL関連タンパクの系統樹を示す。この系統樹は、7つのMutL関連タンパク、すなわちヒトMLH1;マウスMLH1;S.cerevisiaeのMLH1;S.cerevisiaeのPMS1;E.coli;MutL;S.typhimuriumのMutLおよびS.pneumoniaeのHexBの推定されるアミノ酸配列を用いて構成された。必要な配列は、GenBankリリース7.3から得られた。この系統樹は、ギャプペナルティー3および長さペナルティー0.1を用いて、Genetics Computer GroupのソフトウェアのPILEUPプログラムで作られた。hMLH1およびhPMS1の記録されたDNA配列は、GenBankに寄託されている。
hMLH1イントロンの位置およびイントロン/エキソン境界構造
我々の先の米国特許出願第08/209521号において、ヒト遺伝子、hMLH1の相補DNA(cDNA)クローンのヌクレオチド配列を記載した。hMLH1のcDNA配列(SEQ ID NO:4)は、本発明の図3に提示されている。ヒトの集団内の多型性および遺伝コードの縮重に由来して、個々のhMLH1 cDNA構造の間にいくつかの可変性があるのかもしれないことに言及している。
本出願において、我々の遺伝配列の研究結果を報告する。特に、個々のエキソンおよびその周りのイントロン/エキソン境界構造に特に焦点を当てて、hMLH1遺伝子を含むヒトゲノム領域をクローン化した。ガンにかかりやすくなる変異を同定および特徴付ける包括的および効率的な試みを設計するという究極の目的に向けて、hMLH1遺伝子のエキソンに隣接するイントロン構造の野生型の配列を知ることは重要であると信じている。エキソン境界の近くのイントロンの配列を知ることの一つの利点は、完全な個々のエキソンを選択的に増幅するプライマーペアを設計することを可能にすることである。さらに重要なことに、mRNAスプライシングエラーを引き起こすようなイントロン領域における変異により、遺伝子のエキソン領域に何の異常も示すことなく、欠陥のある遺伝子産物を生ずる、すなわちガンに罹りやすくなる可能性がある。包括的なスクリーニングの試みは、エキソンまたはcDNAだけでなく、エキソン境界に隣接するイントロン構造における変異を調べる必要があると信じている。
当該技術で知られた手段を用いてhMLH1を含むヒトゲノム領域をクローン化たが、他の既知の手段を用いてもよい。PCRを用いてhMLH1遺伝子のP1ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。4つのクローンを得たが、二つは全体の遺伝子を含み、二つはC末端を欠くものであった。全長のクローンの一つをサイクルシークエンシングにより特徴付けたが、これは、19のhMLH1エキソンの両側に全てのイントロン/エキソン接合配列の我々の定義をもたらした。次ぎに、個々のエキソンを増幅するためのPCRプライマーの多数のセット(第一段階プライマー)を設計し、いくつかの異なるゲノムDNAサンプルを増幅することおよびABI373シークエンサーを用いて得られたフラグメントを配列決定することにより各エキソンと隣接するイントロン配列の配列を確かめた。さらに、PCR法を用いて各hMLH1エキソンの大きさを決定した。最後に、個々のエキソンを再増幅するために、一組のネスティドPCRプライマー(第二段階のプライマー)を工夫した。hMLH1変異に係るHNPCCファミリーおよび腫瘍を分析するために複式の方法(a multi-plex method)で第二段階のプライマーを用いた。一般的に、ネスティドPCRプライマーの手法では、それぞれ別のエキソンに向けられた4〜8組の“第一段階”のプライマーで最初の複式増幅を行った。次いで、1組の第二段階のプライマーを用いて、最初の増幅段階の産物から各エキソンを再増幅した。
ゲノム配列の研究を通して、hMLH1遺伝子内の19のエキソンの全てを同定し、イントロン/エキソン境界をマップした。それゆえ、本発明の一つの態様は、hMLH1遺伝子の個々のエキソンである。表1は、hMLH1エキソン(SEQ ID NO:25−43)のヌクレオチドの相関(すなわち、遺伝子のコード領域内の各イントロンの挿入箇所)を示す。示された相関は、hMLH1 cDNA配列に基づき、位置“1”は、始まりの“ATG”の“A”を示す(Aは、SEQ ID NO:4のヌクレオチド1である)。
hMLH1遺伝子のエキソンに隣接するイントロン領域の核酸も決定した。SEQ ID NOS:6−24は、それぞれの上流および下流のイントロン配列が結合した個々のエキソン配列である。同じヌクレオチド構造が、図4Aに示されており、ここでエキソンは、クロモソーム座位に関してN末端からC末端の方向に番号付けされている。5の番号は、エキソンを増幅するのに用いられたプライマーを示す。全ての配列は、ATGコドンのAがヌクレオチド1になるように番号が付されている。()内の番号は、示されたエキソンに見られるコード配列のヌクレオチドの相関である。大文字はイントロンである。小文字はエキソンまたはmRNA/cDNAクローンに見られる翻訳されない配列である。小文字かつ下線が引かれた配列は、プライマーに対応する。2269−2271における停止コドンは、イタリックで表され、下線が付されている。
表2は、隣接するイントロン構造と共に各エキソンを増幅するのに使用される最初のペア(“第一段階”プライマー)の配列を示す。
さらに、一組の“第二段階”の増幅プライマーを設計し、その構造は、下の表3に示されている。以下に記載するように、第二段階のプライマーは、ネスティド増幅プロトコルで第一段階のプライマーと組み合わせて使用する。
表3で、アスタリスク(*)は、5’ヌクレオチドが、ビオチニル化されていることを示す。エキソン1−7,10,13および16−19を、1.5mMまたは3mM MgCl2のいずれかを含有するPCR反応において特異的に増幅することができる。エキソン11および14は、1.5mM MgCl2を含むPCR反応で唯一特異的に増幅され、エキソン8,9,12および15は、3mM MgCl2を含むPCR反応で唯一特異的に増幅される。エキソン12に関して、第二段階の増幅プライマーは、エキソン12が二つの半片で再増幅されるように設計されている。20546および20002のプライマーセットは、N末端半分を増幅する。プライマーセット19829および19835は、C末端半分を増幅する。18178に代わるプライマーは、19070である。
我々の研究により提供され、本出願および先の関連出願に開示されたhMLH1配列の情報は、単一産物バンドにおける一つ以上のエキソン(および/または隣接するイントロン配列)を増幅するプライマーを含む、個人のガンの罹りやすさおよび/または腫瘍の発達に関連するhMLH1変異を同定することに使用される多数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに使用することができる。
当業者であれば、所望のフラグメントまたは遺伝子を増幅するのに使用されるPCRプライマーの設計に重要な考慮を熟知しているであろう3。上述したように、配列決定プライマーの設計に関するものと同じである必要はないが、これらの考慮は類似していてもよい。一般的に、プライマーが比較的特異的にハイブリダイズすることが重要である(すなわち、約55℃以上、好ましくは60℃程度のTmを有する)。ほとんどの場合、長さが約17〜25ヌクレオチドの間のプライマーが、良く機能する。長いプライマーは、長いフラグメントを増幅するのに使用できる。各ペアのPCRプライマーが、唯一、正しいフラグメントを増幅するように、どの場合にもヒトゲノムの一つ以上の配列に相補的なプライマーの使用を避けるのが好ましい。それでも、正しいバンドが、PCR反応における他の産物のバンドから区別できることが、唯一絶対に必要である。
正確なPCR条件(例えば、塩濃度、サイクル数、DNAポリメラーゼの種類等)は、当該技術で知られているように変形して、反応の収率または特異性等を改良することができる。特に、必要なDNA基質の量を減少し、増幅特異性を改善するために、PCR反応でネスティドプライマーを使用することが有益であることを見出した。
二つの実施例を以下に記載する。第一の実施例は、第一段階のプライマーペア(SEQ ID NOS:69と70)を使用してイントロン/エキソンセグメント(SEQ ID NO:18)を増幅することを例証するものである。第二の実施例は、第二段階のプライマーを使用して、第一段階のプライマーを用いた第一PCR増幅工程の産物から標的イントロン/エキソンセグメントを増幅することを例証したものである。
実施例1:P1ファージライブラリーのhMLH1ゲノムクローンの増幅
25ngのゲノムDNA(もしくは1ngのP1ファージを用いることができる)を、
0.05mM dNTP
50mM KCl
3mM Mg
10mM Tris−HCl pH8.5
0.01% ゼラチン
5μM プライマー
を含むPCR反応に使用した。
反応は、Perkin−Elmer Cetusモデル9600温度循環装置で行った。
反応系を95℃で5分間インキュベートした後に、
94℃で30秒
55℃で30秒
72℃で1分間
のサイクルを35サイクル(P1ファージでは30サイクル)行った。
次いで、最後の7分の延長反応を72℃で行った。望ましいP1クローンは、正確に近いbp産物バンドが生成されるもののクローンである。
実施例2:ネスティドPCRプライマーを用いたゲノムDNAのhMLH1配列の増幅
以下のようにして、ゲノムDNAのhMLH1配列の二段階PCR増幅を行った。典型的に、第一の増幅は、
25ngのクロモソームDNA
Perkin−Elmer PCRバッファーII(あらゆる適切なバッファーを用いることが可能)
3mM MgCl2
50μM 各dNTP
Taq DNAポリメラーゼ
5μM プライマー(SEQ ID NOS:69,70)
を含む25マイクロリットルの反応系で行い、95℃で5分間インキュベートした後に、
94℃で30秒
55℃で30秒
のサイクルを20サイクル行った。産物のバンドは、典型的にあまりに小さいので(約500bp未満)、別の延長段階は、各サイクルの一部として行われない。むしろ、20サイクルが完了した後、一回の延長段階を72℃で7分間行った。反応産物を4℃で保存した。
第二増幅反応は、
1または2マイクロリットル(反応の体積に依存)の第一増幅反応産物
Perkin−Elmer PCRバッファーII(あらゆる適切なバッファーを用いることが可能)
3mM MgCl2
50μM 各dNTP
Taq DNAポリメラーゼ
5μM ネスティドプライマー(SEQ ID NOS:109,110)
を25または50マイクロリットルの反応系に含み、95℃で5分間インキュベートした後に、
94℃で30秒
55℃で30秒
のサイクルを20−25サイクル行い、このサイクルが完了した後に、一回の延長反応を72℃で7分間行った。反応産物は4℃に貯蔵した。
標的hMLH1配列を増幅することができるあらゆる組み合わせのプライマーを、最初の増幅反応で用いることができる。最初の増幅反応で各hMLH1エキソンを増幅するために、表2に示された各プライマーセット用いた。また、最初の増幅反応で複数の個々のhMLH1エキソンを増幅する、これらのプライマーセットの組み合わせを用いた。
最初の増幅段階で用いられたネスティドプライマーは、最初の増幅反応で用いられたプライマーに関して設計された。すなわち、第二の反応で用いられるプライマーは、第一の増幅反応プライマーの最も5’側のヌクレオチドを含むべきでないこと、並びに、第二の増幅プライマーのTmが第一の増幅反応プライマーのTmとほぼ同じであるように3’末端がより十分に伸びていることを除いて、一組のプライマーが最初の増幅反応に用いられれば、第二増幅反応に用いられるプライマーは最初の反応で用いられたプライマーと同じであるべきである。我々の第二の反応のプライマーは、典型的に、最初の増幅反応プライマーの最も5’側の3つのヌクレオチドを欠き、約3−6ヌクレオチド3’末端で伸びている。SEQ ID NOS:69および70が第一増幅反応で用いられた場合に、SEQ ID NOS:109,110は、第二増幅反応で用いられるネスティドプライマーペアの例である。
また、配列決定反応を準備する第二の増幅反応プライマーの一方の5’末端に標準的な配列を含むことが有益であることも見出した。さらに、産物のバンドがマグネチックビーズを用いて容易に精製され40、配列決定反応がビーズ結合産物に直接的に行われるように、第二増幅反応プライマーの一方または両方の最後のヌクレオチドをビオチニル化することが有益であることを見出した41-45。
複式の増幅および配列決定方法のさらなる議論として、ZuらおよびEspelundら46,47による参考文献を参照されたい。
ガンとhMLH1との関係
hMLH1がヒトクロモソーム3p21−23のHNPCC座の候補であるか否かを調べる最初の段階として3、hMLH1を蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)でマップした20,21。FISH分析にhMLH1遺伝子の二つに分かれたゲノムフラグメント(データ示さず)を用いた。いくつかの中期クロモソーム拡散の試験により、hMLH1をクロモソーム3p21.3−23に位置づけた。
図7のパネルAは、中期拡散におけるhMLH1プローブのハイブリダイゼーションを示す。以前に記載されたように20,21、ビオチニル化hMLH1ゲノムプローブを、縞のヒト中期クロモソームにハイブリダイズした。検出を、蛍光イソチオシアナート(FITC)結合アビジン(緑色のシグナル)で行った;青で示されたクロモソームは、4’6−ジアミノ−2−フェニルインドール(DAPI)で染色された。それぞれ、CCD Image Capture;NIH Image 1.4;Adobe PhotoshopおよびGenejoin Maxpixというプログラムに沿って、冷却したCCDカメラで画像を撮影し、増幅し、偽色を施し(pseudocoloured)、組み合わせた。図7のパネルBは、ヒトクロモソーム3の表意とともに並べられた多数の中期拡散からクロモソーム3の構成物を示している。ハイブリダイゼーションの領域(3p21.3−23の端部)は、この表意に垂直の線で示されている。
クロモソーム3上のhMLH1の位置の独立した確認として、一組のhMLH1特異的オリゴヌクレオチドを用いたPCRとhMLH1特異的プローブを用いたサザンブロッティングの両方を用いてNIGMS2げっ歯類/ヒト細胞パネル(Coriell Inst. for Med. Res., Camden, NJ, USA)のDNAを分析した。両方の技術の結果は、クロモソーム3関連を示した。また、FISHにより、クロモソーム9バンドEにマウスMLH1遺伝子をマップした。これは、ヒトクロモソーム3pにシンテニーの位置である22。それゆえ、hMLH1遺伝子は、クロモソーム3−関連HNPCCファミリーに係わる遺伝子領域内の3p21.3−23に位置づけられる3。
次いで、二つのクロモソーム−3候補HNPCCファミリー3の病気に冒された個人および病気に冒されていない個人の血液サンプルを、変異について分析した。一つのファミリー、ファミリー1は、HNPCCと3p上のマーカーとの間に重要な関連(組換えフラクション0でロッドスコア(lod score)=3.01)を示した。第二のファミリー、ファミリー2では、報告されたロッドスコア(1.02)は、一般的な許容レベルの重要性より低く、3pの同一マーカーへの関連が示唆されたに過ぎなかった。3p21.3のミクロサテライトマーカーD3S1298を用いたファミリー2の次なる関連分析は、組換えフラクション0でより重要なロッドスコア1.88を与えた。最初に、直接的なDNA配列決定によってhMLH1遺伝子の二つのPCR増幅エキソンの変異をスクリーニングした(図4)。ファミリー1の病気に冒された3人のこれら二つのエキソンを調べたが、予想された配列との差異をなにも検出しなかった。ファミリー2では、大腸ガンに冒された4人が、エキソンがコードするアミノ酸41−69におけるCからTへの置換のヘテロ接合(heterozygous)であることが観察され、これは、このタンパクの高度に保存された領域に対応している(図9)。一人の病気に冒されたヒトについて、PCR増幅cDNAを付加的な配列の差異についてスクリーニングした。この病気に冒された個人の二つのエキソンとcDNAから得られた組み合わせられた配列情報は、オープンリーディングフレームの95%(すなわち最初の116bp以外の全て)を示した。CからTへの置換以外のヌクレオチドの変化は全く観察されなかった。さらに、関連データに基づいてキャリアーであると推定されているが、まだ大腸ガンに冒されていないファミリー2の4人の個人は、同じCからTへの置換によりヘテロ接合であることが見出された。これらの推定されたキャリアーの二人は、この特定のファミリーにおける平均の開始期(50年)よりも低く、二人はこれより上である。この同一のファミリーから調べられた病気に冒されていない二人の個人であって、両方とも関連データからキャリアーでないことが推定される個人は、この位置に予想される正常な配列を示した。ファミリー2におけるCからTへの置換を含む関連分析は、組換えフラクション0でロッドスコア2.23を与えた。厳密性の低いガン診断基準を用いて、ロッドスコア2.53を計算した。これらのデータは、CからTへの置換がファミリー2におけるHNPCCへの重要な関連を示すことを示唆している。
図8は、hMLH1タンパクの44位における非保存アミノ酸置換を生成するCからTへの転移変異を示す配列クロマトグラムを表している。一人の病気に冒されていない個人(上のパネル、プラスおよびマイナス鎖)と一人の病気に冒された個人(下のパネル、プラスおよびマイナス鎖)の配列分析が示されている。ヘテロ接合ヌクレオチドの位置が、矢印で示されている。配列クロマトグラフの分析により、病気に冒された個人がこの部位でヘテロ接合であるのに十分なCピークにおけるTシグナル、およびGピークにおけるAシグナルが存在することが示された。
このCからTへの置換が多型性であるか否かを決めるために、無関係の48人のゲノムDNAから増幅されたこれと同じエキソンを配列決定したが、正常な配列のみが観察された。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)ハイブリダイゼーション分析を用いてさらに26人の無関係の個人を調べた33。用いたASO配列(それぞれ、SEQ ID NOS:141および142)は、
直接的なDNA配列およびASO分析によれば、これらの74人の無関係の個人の誰もCからTへの置換を有していなかった。それゆえ、ファミリー2の個人に見られるCからTへの置換は、多型性ではないようである。上述したように、第二クロモソーム3関連ファミリー、ファミリー1の病気に冒された個人にはこれと同じCからTへの置換を検出しなかった3。我々は、hMLH1の変異について、ファミリー1の個人の研究を続けている。
以下の表4は、ファミリー2の病気に冒されたおよび病気に冒されていない個人、並びに無関係の個人の血液サンプルの実験的分析をまとめたものである。
いくつかの基準に基づいて、hMLH1のコード領域に観察されるCからTへの置換が、ファミリー2におけるHNPCCの根拠となる変異を示すと考えられる3。先ず、DNA配列およびASO分析は、無関係の74人の個人にCからTへの置換を検出しなかった。しかして、CからTへの置換は、単なる多型性ではない。第二に、観察されたCからTへの置換は、44位におけるセリンからフェニルアラニンへの変化を生じると推定される(図9参照)。このアミノ酸置換は、このタンパクの保存された領域における非保存的変化である(図3および9)。Chou−Fasmanパラメーターを用いた二次的な構造の推定は、ターンに位置する44位を備えたヘリックスターンβシート構造を示唆する。44位におけるSerからPheへの置換は、このターンの推定を顕著に低め、推定されたアミノ酸の置換が、hMLH1タンパクの高次構造を変えることを示唆する。SerからPheへの置換が、ガンに罹りやすくなる変異であるという示唆は、イーストMLH1遺伝子におけるアナログ置換(アラニンからフェニルアラニン)が、機能しないミスマッチ修復タンパクを生じるということを示す実験によってさらに支持される。細菌およびイーストにおいて、DNAミスマッチ修復に影響する変異が、二つのヌクレオチドの繰り返し内の付加および欠失を含む自発的な変異の速度を顕著に増加する4,5,11,13,14,15,16。ヒトでは、hMSH2の変異は、クロモソーム−2HNPCC1,2、ミクロサテライト不安定性およびミスマッチ修復における明らかな欠陥を示す腫瘍の根拠である12。クロモソーム3関連HNPCCは、二つのヌクレオチドの繰り返しの不安定性に関係する3。これらの観察と組み合わせて、ヒトMLH1タンパクとイーストDNAミスマッチ修復タンパクMLH1との間の高度の保存は、hMLH1がDNAミスマッチ修復において機能することを示唆する。hMLH1遺伝子の単離の間に、hPMS1遺伝子を同定した。この観察は、イーストのように4、哺乳動物のDNAミスマッチ修復が少なくとも二つのMutL様タンパクを必要とするかもしれないことを示唆する。異なるHNPCCファミリーは、MLH1遺伝子において異なる変異を示すらしいことに注目すべきである。上述したように、ファミリー1の病気に冒された個人は、HNPCCと3p21−23の領域の座位との間に“堅固な関連”を示した。しかしながら、ファミリー1の病気に冒された個人は、ファミリー2に見られたCからTへの変異を備えていない。ファミリー1の病気に冒された個人は、MLH1遺伝子に別の変異を備えているらしい。さらに、本出願に記載された構造情報および方法を使用して、イギリスの大きなHNPCCファミリーの変異遺伝子のヘテロ接合キャリアーにガンに罹りやすくなる別のhMLH1変異を見出し、かつ特徴付けを行った。イギリスのファミリーにおけるhMLH1変異は、切りつめられたhMLH1タンパクの合成を導くと思われる+1Tフレームシフトである。必須に全ての既知の病気に冒された個人が同じ変異を有する鎌状赤血球貧血等と違って、多数のhMLH1変異が見出されガンに結びつけられている。それゆえ、hMLH1(並びに、おそらくhPMS1)の完全なcDNA配列、並びに特にエキソンを取り囲むゲノム配列に関する知識は、高頻度のガンを示すと同定されたファミリーの変異を特徴付けるのに使用できるとともに重要である。
hMLH1に変異を起こすガンに関する我々の発見に続いて、他者による研究は、hMLH1における少なくともさらに5つの変異の特徴付けをもたらし、これらはそれぞれ、少なくとも一つのHNPCCファミリーの個人をガンに罹りやすくするようである。例えば、Papadopoulosらは、コドン578から632の間の165塩基対のインフレーム欠失(in-frame deletion)によって特徴付けされた、前記変異を同定した。別のファミリーでは、Papadopoulosらは、フレームシフトと新しいアミノ酸の置換、すなわちコドン727と728の間の4塩基対の欠失に特徴を有するhMLH1変異を観察した。また、Papadopoulosらは、COOH末端の延長、すなわちコドン755と756の間に4塩基対の挿入に特徴を有するhMLH1ガン関連変異を報告している38。
要約すると、遺伝性ポリポシス大腸ガン遺伝子であるらしいDNAミスマッチ修復遺伝子hMLH1が、クロモソーム3p21−23に関連分析によって先に位置づけられたことを示した。hMLH1遺伝子配列の有用性は、ガン関連変異に関するHNPCCファミリーのスクリーニングを容易にするであろう。さらに、関連マーカーのヘテロ接合性の損失(LOH)は、HNPCCの2pまたは3p形態のいずれかの特徴ではないが3,6、3p21.3−23領域を含むLOHは、いくつかのヒトのガンに観察されている24-26。このことは、hMLH1変異がこのような腫瘍において何らかの役割を演じ得る可能性を示唆している。
ヒトPMS1
ヒトPMS1を、図1を参照して記載された方法を用いて単離した。図10は、完全なhPMS1 cDNAヌクレオチド配列を示す。図11は、推定されるヒトおよびイーストのPMS1タンパク配列の並びを示す。FISH分析によって、ヒトPMS1がクロモソーム7に位置することを調べた。hPMS1に関する我々の発見に続いて、他者がHNPCCに罹りやすくなると考えられる遺伝子の変異を同定した。
マウスMLH1
図1を参照して上記された方法を用いて、図12に示すようなマウスMLH1のcDNAの部分的なヌクレオチド配列を決定した(SEQ ID NO:135)。図13は、対応して推定されるmMLH1タンパクのアミノ酸配列(SEQ ID NO:136)を、推定されるhMLH1タンパク配列(SEQ ID NO:5)と比較して示している。マウスとヒトのMLH1タンパクとの比較、並びにhMLH1とイーストMLH1タンパクとの比較により、図9に示すような高度の保存が示された。
マウスPMS1
図1に示す上記の方法を用いて、図14に示すように、マウスPMS1遺伝子を単離および配列決定した(SEQ ID NO:137)。このcDNA配列は、図15に示すように、864アミノ酸の推定されるタンパク(SEQ ID NO:138)をコードし、図15では、推定されたアミノ酸配列とhPMS1(SEQ ID NO:133)との比較がされている。推定されたマウスとヒトのPMS1タンパク間の同一性の度合いは高く、これは二つの哺乳動物間に予想される通りである。同様に、上述したように、図11に示すように、ヒトPMS1タンパクとイーストのDNAミスマッチ修復タンパクPMS1との間に強力な類似性がある。イーストのPMS1とMLH1が、イーストにおいてDNAミスマッチを修復するように機能するという事実は、ヒトとマウスのPMS1とMLH1もミスマッチ修復タンパクであるということを強力に示唆する。
マウスMLH1とPMS1の使用
mMLH1およびmPMS1遺伝子に関する我々の単離および特徴付けは、多くの調査手段を有すると確信している。例えば、上述した様に、特にhPMS1と反応する抗体を産生するのにmPMS1遺伝子の知識を用いた。ヒトのタンパク、MLH1またはPMS1に向けられた抗体は、調査目的はもちろん診断目的にも使用できることを既に説明した。
また、mPMS1およびmMLH1に関する知識が、DNAミスマッチ修復欠陥の結果を研究するためにマウスモデルを構築するのに使用できると確信している。クロモソーム2pおよび3p関連HNPCCが、ミスマッチ修復遺伝子にそれぞれ欠陥を有することから、mPMS1またはmMLH1欠陥マウスが、ガンに高い傾向を示すことを予想した1,2。上述したように、mPMS1に欠陥のある遺伝子を有するキメリックマウスを既に作製した。現在、mPMS1またはmMLH1変異に関してヘテロ接合性のマウスを作製中である。これらのヘテロ接合性マウスは、ヒトのガン、特にHNPCCを研究するために使用できる動物モデルを提供すべきものである。このマウスは、ガンの危険性および進行を決定する内因性および外因性の両方の分析に使用される。また、ミスマッチ修復欠陥に関係するガンは、他のガンと比較して従来の治療に別に反応する。このような動物モデルは差異があるか否かを決定するのに使用され、この種の腫瘍の効果的な治療の療法を開発することができる。また、このような動物モデルは、遺伝と発ガン性物質における食事の要素との間の関係を研究するためにも使用される。
多型性と変異との区別
ガンの罹りやすさの研究、並びに腫瘍の同定および特徴付けのために、“変異”と“多型性”とを区別することは重要である。“変異”は、遺伝子の“非野生型対立遺伝子”を生成する。遺伝子の非野生型対立遺伝子は、細胞内で正常に機能しない転写体および/またはタンパク生成物を生成する。“変異”は、挿入、欠失、置換および転移を含むヌクレオチド配列内のあらゆる変化とすることができる。
一方、“多型性”は、正常に機能する(すなわち“野生型”)遺伝子の集団内に見られる配列の差異である。ある多型性は、核酸コードの縮重による。すなわち、ほとんどのアミノ酸が一つ以上のトリプレットコドンによってコードされていると仮定すると、多くの異なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードすることができる。他の多型性は、遺伝子またはコードされたポリペプチドの機能に重要な影響を与えない単なる配列の相違である。例えば、ポリペプチドは、多くの場合、小さい挿入または欠失、あるいはポリペプチドの機能を顕著に変えることのないそのアミノ酸配列における“保存的な”置換に対して寛容的である。
“保守的な”置換とは、ある特定のアミノ酸が、化学的特徴が類似した別のアミノ酸で置換されることである。例えば、アミノ酸は、しばしば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む“非極性(疎水性)”;グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む“極性中性(polar neutral)”;アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む“陽性帯電性(塩基性)”;並びにアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む“陰性帯電性(酸性)”として特徴付けされる。あるアミノ酸を同一グループ内の他のアミノ酸で置換することは、特に、二つの関連のあるアミノ酸の側鎖が類似する大きさのアミノ酸である場合には、一般的に“保存的”であると見なされる。
ミスマッチ修復遺伝子配列における変異または多型性を同定する第一段階は、ここで記載した技術を含めた利用できる技術を用いて、ミスマッチ修復遺伝子、(または遺伝子断片)、すなわち同じミスマッチ修復遺伝子(または遺伝子断片)の既知の正常な(例えば野生型)配列とは異なる配列の同定を含む。例えば、hMLH1遺伝子(または遺伝子断片)配列は、SEQ ID NOS:6−24のいずれかのような既知の正常な(例えば野生型)hMLH1配列とは、少なくとも一つのヌクレオチドの位置で異なることが同定される。
変異は、種々の方法のいずれかを用いて多型性から区別することができ、おそらく最も直接的な方法は、データ収集および腫瘍の発達との相関である。すなわち、例えば、患者は、そのhMLH1遺伝子配列がSEQ ID NOS:6−24に報告された配列とは異なると同定されるが、その患者はガンではなく、その家族もガンに罹ったことがない人である。もし、他の、好ましくはその患者の家族の年長者が、SEQ ID NOS:6−24とは異なるhMLH1遺伝子配列を同様に有するならば、患者のhMLH1遺伝子配列は、“多型性”として区分することができるであろう。もし、別の無関係の個人が、同じhMLH1遺伝子配列で同定され、その家族にもガンの経歴がないならば、その区分は確実なものとされる。
中でもこのような変異は、病気に冒された個人の全ての組織およびその患者の親の少なくとも一方の生殖系にはおそらく存在し、ガンの経歴のない病気に冒されていないファミリーにはおそらく見られないことから、遺伝的にガンに冒されやすくなることに対応する変異を同定することができる。
多型性と変異を区別する場合に、少なくとも一つの既知のミスマッチ修復遺伝子変異の存在下において、特定の配列の差異を評価することは時に価値がある。ある場合には、特定の配列の変化は、単独でアッセイした場合には、顕著な効果を持たない(すなわち、多型性と見られる)が、例えば、変異のみを有する個人よりも、明らかな多型性の差異と既知の変異の両方を有する個人は、より高い確率でガンになるというように、既知の変異の浸透度を増加する。このような効果を有する配列の差異は、弱いが適切に変異であると考えられる。
上述および以前に記載したように(米国特許出願第08/168877および08/209521)、ミスマッチ修復遺伝子または遺伝子産物における変異は、その遺伝子または遺伝子産物の非野生型を生成する。それ故、ある変異は、In vivoまたはin vitroにおけるミスマッチ修復アッセイにおけるその機能的特徴によって、多型性と区別される。利用できる全てのミスマッチ修復アッセイを、これらの特徴を分析するために用いることができる49-63。ある変異はどのアッセイでも観察されない効果を有するため、配列の変化を多型性として区分する前に、一つ以上のミスマッチ修復アッセイを利用することが一般的には好ましい。
例えば、変異を有するミスマッチ修復遺伝子は、宿主細胞のミスマッチ修復に検出可能に影響せずに、宿主細胞中の同じ遺伝子の内在性コピーを置換することは不可能と考えられる;しかしながら配列多型性を有するミスマッチ修復遺伝子は、宿主細胞のミスマッチ修復に検出可能に影響することなく、宿主細胞中の同じ遺伝子の内在性コピーを置換することができると期待される。このような“置換”の研究では、例えばある種の遺伝子産物が、他の種の別のミスマッチ修復遺伝子産物と相互作用できないことによる複雑さを避けるために、試験遺伝子が得られた細胞と同種(もしくは少なくとも近い関係)の宿主細胞中に試験されるべき遺伝子を導入することが一般的に好ましい。同様に、変異ミスマッチ修復タンパクは、in vitroミスマッチ修復システム(好ましくは関係する生物体由来)において正常に機能するとは考えられないが、多型性ミスマッチ修復タンパクは、正常に機能すると考えられる。
ここおよび以前に記載した方法は、異なる種類のミスマッチ修復遺伝子変異を同定する。以下の実施例は、DNAミスマッチ修復遺伝子における多型性から変異を区別するためのプロトコルを例証するものである。
実施例3:イースト、S. cerevisiaeにおける、hMLH1またはhPMS1遺伝子に見られる変異の機能的重要性を試験するためのシステムを開発した。このシステムは、本出願では、例えば、上述したように、HNPCCのファミリーに見られた、セリン(SER)からフェニルアラニン(PHE)によるhMLH1における変異を用いて記載する。必須にそのMLH1遺伝子を欠き、このために強力なミューテーターであるイースト株を誘導した(すなわち、個々に対する所定のアミノ酸に成長依存からの復帰を含む簡単な遺伝的マーカーアッセイにおいて、正常の割合より1000倍高い(hom3−10対立遺伝子の復帰、Prolla, ChristieとLiskay, Mol Cell Biol. 14:407-415, 1994)。正常のイーストMLH1遺伝子(既知の全てのコントロール領域を備えた完全なもの)を、MLH1を欠く株に単一コピーとして安定に維持されたイーストプラズマに入れた場合に、腫瘍表現型は、アミノ酸独立アッセイに対する復帰を用いて十分に訂正される。しかしながら、イーストMLH1の欠失コピーを導入すると、全く訂正されない。次いで、HNPCCファミリーにおいてSERからPHEへの変化を誘発する変異を試験した。結果的な変異イーストタンパクが腫瘍の表現型を訂正しないということから、おそらく野生型の遺伝子配列からの変化によってガンに罹りやすくなり、それゆえ多型性ではなく変異として区分されるということが、強力に示唆されることを見いだした。次いで、“セレン(serene)”の位置に別のアミノ酸を含むようにされたタンパクを試験して、ほとんどの変化が完全な変異体、もしくは少なくとも部分的な変異の表現型をもたらすことを見いだした。
MLH1およびPMS1遺伝子における他の“ポイント”変異が、ガンのファミリーに見いだされるので、適切なイースト同族体遺伝子および研究されたタンパク機能に基づくそれらの共通配列中に設計することができる。さらに、MLH1とPMS1遺伝子の両方においていくつかの高度に保存されたアミノ酸を同定した。また、hMLH1がイーストPMS1と相互作用するという証拠がある。この知見は、hMLH1遺伝子に観察された変異を、イーストシステムにおいてより直接的に試験することができるという可能性を高めた。これらの保存された位置のアミノ酸を変える変異を組織的に作成し、アミノ酸の置換が慣用されるか否かを調べる。hMLH1とhPMS1に係る変異情報を回収し、HNPCCファミリーに実際に見られた変異を決定および文書で証明し、実験システムで試験するために人工的に変異を合成することにより、結局、個人のhMLH1またはhPMS1の構造が決定されれば、その構造と既知のデータに対する多型性とを比較するだけのガンに罹りやすさを試験するプロトコールを実行することができる。
実施例4:hMLH1とhPMS1との間の物理的相互作用を研究するために用いた別の方法を、遺伝子産物中の特定の変化がタンパク−タンパク相互作用の度合いに変化をもたらすか否かを研究するために用いることができる。タンパク−タンパク相互作用における変化に係る情報は、特定の遺伝子変化が変異または多型性であるかを調べあるいは確かめる。in vitroとin vivoにおけるイーストMLH1とPMS1タンパク間の相互作用に関する我々の研究室の発見に続いて(米国特許出願第08/168877)、これらの二つのDNAミスマッチ修復タンパクのヒトの対応物間の相互作用を調べた。ヒトのMLH1とヒトのPMS1タンパクを、マルトース結合タンパク(MBP)親和クロマトグラフィーを用いたin vitro相互作用に関して試験した。hMLH1タンパクをMBP融合タンパクとして調製し、MBPを介してアミロース樹脂カラムに固定化し、in vitroで合成されたhPMS1への結合を試験した。hPMS1タンパクはMBP−hMLH1マトリックスに結合したが、コントロールのタンパクはマトリックスへの親和性を全く示さなかった。in vitroで翻訳されたhMLH1タンパクをMBP−hPMS1融合タンパクマトリックスを通すと、hMLH1タンパクがMBP−hPMSマトリックスに結合したが、コントロールは結合しなかった。
hMLH1とhPMS1との潜在的なin vivo相互作用は、イースト“2ハイブリッド”システムを用いて試験された28。最初の結果は、hMLH1とhPMS1はin vivoでイースト中で相互作用することを示した。また、同じシステムを、遺伝子または遺伝子産物構造における変化から得られ、多型性またはガンに罹りやすくい変異として区別されなければならない、タンパク−タンパク相互作用における変化を検出するために用いることができる。
HNPCCファミリーの検出およびそれらの変異
米国の約1000000人がHNPCC変異遺伝子を有する(またはヘテロ接合)と概算されている29。さらに、50−60%のHNPCCファミリーが、クロモソーム2p上にあるMSH2遺伝子の変異を分離すると考えられる1,2。別の重要なフラクションは、上述したCからTへの転換のような、おそらくはhMLH1変異のために、クロモソーム3p21−22にマップするHNPCC遺伝子と関係しているようである。hMSH2またはhMLH1遺伝子のいずれかの変異対立遺伝子を分離するファミリーの同定すること、およびこれらのファミリーの個人が実際に変異を有することを調べることは、この疾患に早くから干渉するのに非常に有効である。このような早期の干渉は、病気に冒された個人のスクリーニングによる早期検出および攻勢的な追求処置を含むであろう。さらに、家族的および散在性の腫瘍の両方の遺伝子の塩基を調べることにより、治療方法を根本の腫瘍、あるいは再発に向けることができた。
最初に、HNPCCの候補のファミリーは、家系の研究を通して、例えば、病院の腫瘍学者により、局地的なレベルで部分的に診断される。HNPCCのある基準は、患者の腫瘍のミクロサテライト不安定性の観察である3,6。患者は、hMSH2、hMLH1、hPMS1およびこれらが同定されたようにDNAミスマッチ修復に係る他の遺伝子における変異が試験される。これは、個人の血液をサンプリングすることにより最も容易になされる。また、新鮮に冷凍された腫瘍組織は、より高度に使用できる。スクリーニングの工程で、病気に冒された個人は、正常組織における変異にヘテロ接合であることに注意することが重要である。
血液および腫瘍等の利用できる組織は、以下の工程の一つまたは両方を用いてPCRに基づく変異分析が行われる。
1)hMLH1遺伝子にしっかりと結合したミクロサテライトマーカーを用いた結合分析
ガンの傾向があるファミリーをhMLH1変異に関して同定する一つの試みは、hMLH1内に位置する、あるいはこれにしっかりと結合した高度に多型性のマーカーで結合分析を行うことである。ミクロサテライトは、高度に多型性であり、それ故結合分析におけるマーカーとして非常に有益である。P1ファージクローン(〜100kbp)の単一の巨大なゲノムフラグメント上にhMLH1遺伝子を有しているので、二つのヌクレオチドの繰り返しの管(tracts)等の一つ以上のミクロサテライトが、hMLH1遺伝子内、あるいは非常に近くに存在するらしい。少なくとも一つのこのようなミクロサテライトが報告されている38。このようなマーカーが同定されれば、PCRプライマーは、このミクロサテライトを含むDNAの伸長を増幅するように設計することができる。高頻度のガンを有するファミリーから病気に冒されたおよび病気に冒されていない個人のDNAをスクリーニングして、MLH1マーカーの分離とガンの存在を調べる。結果のデータは、ロッドスコアを計算するために用いることができ、このためhMLH1とガンの発生との間の関係の見込みを調べる。一度所定のファミリーにおける関係が確立されれば、hMLH1変異を有する見込みの血縁の他のヒトを調べるのに同じ多型性マーカーを用いることができる。
逆転写されたcDNAの配列決定
a)病気に冒された個人、病気に冒されていない個人、および無関係の個人のRNAを逆転写し(RT’d)、PCRを行って4−5重複部位におけるcDNAを増幅した34,37。PCRの目的のために、多くの異なるオリゴヌクレオチドプライマーの組の配列が、遺伝的スクリーニングの目的のために個人のhMLH1またはPMS1遺伝子の関連部分を増幅するのに潜在的に用いられることに注目するべきである。遺伝子のcDNA構造の知識を用いて、遺伝子の選択された部分を特異的に増幅するのに効果的であると思われるプライマー対を作製することは、率直な行動である。プライマー配列は典型的には20〜30塩基の長さであるが、特異的に選択された遺伝子セグメントを増幅するために、約13塩基程度の短いプライマーを使用することができる。どのくらい短いプライマー配列が許容されるかの原理的な限定は、特異的に標的の遺伝子セグメントにハイブリダイズするのに十分な長さでなければならないことである。PCRの特異性は、一般的にプライマーの伸長および/またはネスティドペアのプライマーを用いることによって改良される。
完全なcDNAを全体的に示すPCR産物を、配列決定し、既知の野生型配列と比較した。多くの場合、変異は、病気に冒された個人に見られる。理想的には、変異の性質は、遺伝子産物を不活性化しそうであることを示す。そうでなければ、変化が単なる多型性ではないという可能性が、決定されなければならない。
b)スプライシングまたは停止コドンの翻訳に影響する様な、ある種の変異は、変異遺伝子から生じたメッセンジャーRNAを不安定化するため、正常なRTに基づく変異検出方法を含む。最近報告された技術は、変異cDNAが、正常な長さのタンパクの合成を、組み合わされたin vitro転写/翻訳システムに向けることができるか否かを調べることによって、この問題を回避することができる32。
3)ゲノムDNAの直接的な配列決定
変異を検出するための第二の経路は、直接的にDNAの鋳型を欠いたPCRサイクル配列決定によるエキソンおよびイントロン/エキソン境界を調べることに基づく1,2。この方法は、直接的なPCRサイクル配列決定用に個々のエキソンを増幅する、上記表2および3に記載されたオリゴヌクレオチドペアの使用を必要とする。この方法は、各イントロン/エキソン境界におけるゲノムDNA配列情報に基づく(各境界で50bp、またはそれ以上)。この技術の利点は、二つである。第一に、DNAがRNAより安定であるため、PCRで用いられる物質の条件は、RNAに基づくプロトコルほど重要ではない。第二に、スプライシングに影響するイントロンの変異を含めた、遺伝子の実際に転写される領域内におけるほとんどの変異は、検知可能である。
それぞれの候補の遺伝子にとって、変異検出は、完全なcDNA構造と、ゲノム構造の全てのイントロン/エキソン境界の両方の知識を必要としてもよい。このような情報に基づいて、特定のファミリーにおける原因の変異の種類を調べることができる。代わって、より特異的で効率的な変異検出機構を特定のファミリーに適用することができる。一つ以上の遺伝子が関係し、互いの遺伝子に対して複数の種類の変異が関係するという意味で、遺伝的に不均一な塩基を有するため、疾患(HNPCC)をスクリーニングすることは複雑である2。所定のファミリーは、一つの特定の変異を高度に分離するようである。しかしながら、複数のファミリーにおいて腫瘍の性質が調べられるので、集団の最も一般的な変異のスペクトルが決定される。一般的に、最も高頻度の変異の決定は、直接的かつ合理的な変異検出である。
HNPCCが人類に普及しているので、誕生時にキャリアーを検出することは、標準的な新生児の試験の一部となりうる。危険性のあるファミリーを同定することができ、以前に試験されていない全てのメンバーを調べることができる。最終的には、病気に冒された全ての親族を決定することができる。
変異スクリーニングおよび試験の方式
DNAに基づく試験
標準的な診断および家系の研究によりHNPCCファミリーであろうと同定することを含む最初の試験は、局地的かつより小さいDNA診断研究所でなされるであろう。しかしながら、多数のファミリーのメンバーの巨大なスケールの試験、並びにある程度の集団の広い試験は、究極的には、非常に効率的な集中した商業的施設を必要とするであろう。
少なくともクロモソーム2p上のhMSH2遺伝子およびクロモソーム3p上のMLH1遺伝子を含む、HNPCCの基礎になる主要な遺伝子の最も一般的な変異の決定に基づいて試験が開発されるであろう。種々の試験が開発される。一つの可能性は、例えば、正常なvs.変異対立遺伝子を区別するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション用いる一組の試験である33。既に述べたように、hMLH1、hPMS1およびhMSH2遺伝子のヌクレオチド構造に関する知識により、遺伝子スクリーニングおよびガンの危険性の分析に関する個人のミスマッチ修復遺伝子の特異的部分を増幅するために使用することができる多数のオリゴヌクレオチドプライマーペアを設計することができる。遺伝子の構造に関する知識も、DNAミスマッチ修復遺伝子の一つの全てまたは一部の存在または欠失を決定するために素早く用いることができる標識されたプローブの設計を可能にする。例えば、対立遺伝子特異的オリゴマープローブ(ASO)は、対立遺伝子間で区別されるように設計することができる。ASOは、正常および変異対立遺伝子間の差異を反映する単一の塩基の違いを除いては配列において同じである短いDNAセグメントである。適切なDNAハイブリダイゼーション条件下で、これらのプローブは、二つの他の点で同じDNA配列間の単一塩基の差異を認識することができる。プローブは、放射活性、あるいは種々の非放射活性レポーター分子、例えば、蛍光または化学的発光分子等で標識することができる。標識されたプローブは、疾患誘発対立遺伝子の存在について、PCRサンプルを分析するために用いられる。いくつかの種々の疾患誘発遺伝子が存在するか否かは、単一のサンプルで容易に調べられる。プローブの長さは、標的以外のヌクレオチド配列に非特異的に結合することを避けるのに十分な長さでなければならない。どの試験も、hMLH1、hMSH2、hPMS1およびHNPCCに関係している他のDNAミスマッチ修復遺伝子に関する正確かつ完全な構造情報に究極的に依存するであろう。
タンパク検出に基づくスクリーニング
タンパク産物自身の機能に基づいた試験を用いることもできる。タンパクを調べる試験は、hMLH1、hPMS1およびhMSH2タンパク、またはこれらが同定されるように別の関連する“ガン”遺伝子産物のいずれかに特異的な抗体試薬を利用することができる。
例えば、冷凍された腫瘍試験片を切断して、間接的な蛍光技術を用いて抗体染色に調製することができる。ある遺伝子変異は、抗体染色後、変化または減少したシグナルを与えるようにタンパクの構造を十分に変化または不安定化すると予想される。このような試験は、ファミリーのガンにおける遺伝子の関係が確立される必要がある場合に行われるだろう。ヒトMLH1およびPMS1タンパクに対する診断モノクローナル抗体を開発中である。我々は、細菌においてMLH1およびPMS1ヒトタンパクを発現(overexpressing)させている。このタンパクを精製し、マウスに注入して、診断および調査の目的に使用するタンパク特異的モノクローナル抗体を誘導する。
DNAミスマッチ修復腫瘍の同定および特徴付け
患者がガンに罹りやすいかを診断することに加えて、細菌のミスマッチ修復遺伝子に相同な核酸配列は、中でも、ミスマッチ修復欠陥腫瘍の同定および特徴付けにおける使用に利用することができる。ミスマッチ修復欠陥腫瘍が特定の治療の多くによりよく反応するので、このような同定および特徴付けを利用することができる。例えば、ミスマッチ修復欠陥腫瘍は、特に他の治療剤と組み合わせて投与された場合に、DNA損傷剤に敏感である。
ミスマッチ修復遺伝子における欠陥は、個人の腫瘍形成に寄与するように個人の組織を通して存在する必要はない。特定の細胞または組織におけるミスマッチ修復遺伝子の自発的変異は、その組織における腫瘍形成に寄与する。実際に、少なくともいくつかの場合には、ミスマッチ修復遺伝子の単一の変異は、腫瘍の発達に重要ではない。そのような場合には、ミスマッチ修復遺伝子に単一の腫瘍を備えた個人は、ガンになりやすいが、第二の変異が発生するまで腫瘍を発達しないだろう。さらに、ある場合には、個人の厳密に腫瘍と係わる同じミスマッチ修復遺伝子変異は、遺伝的にガンに罹りやすいファミリーにおいては、ガンに罹りやすくすることの原因となる。
本発明の他の態様では、腫瘍(または腫瘍細胞ライン)を分析するため、並びにミスマッチ修復遺伝子における腫瘍関連変異を同定するために、我々が提供した配列情報を当該技術で知られた方法で使用することができる。好ましくは、これらの腫瘍関連変異が、同じ個人の非腫瘍組織に存在しないことを調べることができる。本願に記載された情報は、短い繰り返しDNA部材の遺伝的不安定性を示す腫瘍(または腫瘍細胞ライン)内のミスマッチ修復遺伝子変異の同定に特に使用できる。
本発明の配列情報および試験プロトコルも、二つの腫瘍が関連するか否か、すなわち第二の腫瘍が、特定のDNAミスマッチ修復遺伝子変異を示す先に見出された第一の腫瘍から転移したものか否かを調べるのに使用できる。
関連した機能のさらなる遺伝子の単離
物理的にhMLH1および/またはhPMS1と相互作用するタンパクは、DNAミスマッチ修復に関連するであろう。hMLH1およびhMSH2に対する類似性により、このようなタンパクをコードする遺伝子の変異は、潜在的にガンと関連する強力な候補であろう。“2ハイブリッドシステム”と称されるイーストを使用する強力な分子遺伝試験は、hMLH1等の関心のある遺伝子産物と相互作用するタンパクをコードする遺伝子を比較的急速に検出および単離する28。
2ハイブリッドシステムは、融合タンパクをコードする二つのプラスミドベクターを含む。二つのベクターはそれぞれ、転写活性因子の一部またはドメインを含む。活性因子のみでは、転写を活性化することはできない。しかしながら、二つのドメインが近づけられれば、転写が起こる。hMLH1等の関心のタンパクのcDNAを、一方のベクターの読み枠内に挿入する。これは、“ベイト(bait)”と呼ばれる。転写活性の別のドメインと融合を作るように第二プラスミドベクターに挿入されたヒトcDNAのライブラリーを、“ベイト”ベクターを有するイースト細胞に導入する。特定のイースト細胞が、hMLH1タンパクと相互作用するタンパクをコードするヒトcDNAを含有するライブラリーメンバーを受ける場合には、この相互作用は、転写活性化因子の二つのドメインを近づけ、レポーター遺伝子の転写を活性化し、イースト細胞を青色にする。次いで、挿入物を、データベースの配列に関連するか否かを調べるために配列決定した。同じ方法または関連する方法を、DNAミスマッチ修復のイーストタンパクを同定するために用いることができる。イーストおよびヒトの平行した“捜索(hunts)”を行うことは、ある利点を有する。新規イースト同族体の機能は、遺伝子の分離、および新規に見出された遺伝子において欠陥のある遺伝的共通配列の試験によってイーストで早く調べられる。これらのイーストの研究は、PMS1およびMLH1に関するイーストの研究が、ヒトMLH1およびPMS1遺伝子に関する我々の研究に影響したのと同様に、新規のヒトの“hMLH1-もしくはhPMS1-相互作用”タンパク分析の誘導を助けるだろう。
抗体の産生
hMLH1およびhPMS1のDNA配列に関する我々の知識を用いて、抗体を産生するために予想されるタンパク構造の全部または一部を合成することができる。hMLH1およびhPMS1タンパクに向けられた抗体の一つの重要な使用は、DNAミスマッチ修復に係る他のタンパクを捕獲するためである。例えば、共同免疫沈降(coimmunoprecipitation)技術を用いることによって、hMLH1またはhPMS1のいずれかに向けられた抗体は、機能的および/または物理的に関連した他の結合したタンパクと共に沈降することができる。抗体の別の重要な使用は、腫瘍組織からhMLH1とhPMS1タンパクを単離する目的のためである。腫瘍からのhMLH1およびhPMS1タンパクは、適切な治療手段を調べるために特徴付けすることができる。
hMLH1およびhPMS1タンパクに向けられたモノクローナル抗体を開発中である。
実施例5:ヒトおよびマウスのPMS1タンパクに向けられたポリクローナル抗体を産生するために以下の工程を用いた。
細菌性発現プラスミドベクター,pET(Novagen, Madison, WI)にマウスPMS1のcDNAの3’フラグメントを挿入した。予想されたマウスPMS1タンパクの発現部位は、PMS1タンパクの末端の約200アミノ酸の領域に対応する。mPMS1のこの部分は、イーストPMS1で保存されるが、ヒトまたはマウスのMLH1タンパクで保存されない。抗体を産生するためのPMS1タンパクのこの部位を選択した一つの理由は、MLH1と交差反応する抗体を得たくなかったことである。マウスPMS1タンパクフラグメントを、E.coliで高度に発現し、ポリアクリルアミドゲルから精製し、溶出されたタンパクを動物注射用に調製した。約2mgのPMS1タンパクフラグメントを、ウサギに注入するためにPocono Rabbit Farm(PA)に送った。複数回のウサギの血清を、標準的なELISA技術を用いてPMS1抗原に対して滴定した。マウスPMS1タンパクに特異的なウサギ抗体を、固定されたマウスPMS1タンパクを含むカラムを用いて親和精製した。親和精製されたポリクローナル抗体調製物を、さらにウエスタンブロッティングおよびドットブロッティングを用いて試験した。ポリクローナル抗体が、マウスPMS1タンパクだけでなく非常に類似するヒトPMS1タンパクをも認識することを見出した。ウエスタンブロットに基づいて、ヒトまたはマウスのMLH1タンパクのいずれかを含む、別のタンパクが我々の抗体によって強く認識されるという示唆はなかった。
DNAミスマッチ修復欠陥マウス
実施例6:全体的な動物系におけるDNAミスマッチ修復欠陥および結果的なガンを研究するための実験モデル系を作製するために、真核性ステム(ES)細胞技術を用いてDNAミスマッチ修復欠陥マウスを誘導した。mPMS1遺伝子の一部を含むゲノムDNAを用いて、相同的組換えに基づいてクロモソームmPMS1遺伝子の分離を引き起こすベクターを作製した。129マウス株のマウスES細胞が、崩壊したmPMS1対立遺伝子を含むことを確かめた。ES細胞をC57/BL6宿主胚盤胞に導入して、129とC57/BL6細胞のキメラすなわち混合の動物を作製した。ES細胞の取り込みを、アグーチ・コート・カラーリング(agouti coat coloring)(ES細胞の寄与の指標)のパッチの存在によって同定した。全てのオスのキメラは、C57/BL6のメスのマウスと交配した。
次いで、ES細胞の遺伝物質の生殖系(germline)伝達の示唆する、アグーチ・コート・カラーが検出された12匹の子孫(F2)が誕生した。12匹の子孫の尾の先から抽出したDNAの分析は、6匹の動物がmPMS1変異にヘテロ接合(1匹の野生型と1匹の変異対立遺伝子を含む)であることを示した。6匹のヘテロ接合の動物の、3匹はメス(動物F2−8、F2−11およびF2−12)であり、3匹はオス(F2、F2−10およびF2−13)であった。mPMS1変異にホモ接合であるマウスを得るために、またさらにヘテロ接合のマウスを得るために4つの交配のための囲いを設定した。動物F2−11とF2−10を含む交配のための囲い#1は、3回で全体で13匹産み、その内4匹が遺伝子型(genotyped)がわかった。交配のための囲い#2(動物F2−8およびF2−13)は、3回で22匹産み、その3匹の遺伝子型がわかった。7匹の遺伝子型がわかった動物の、3匹のホモ接合のメスの動物が同定された。未知の原因で、1匹の動物が6週間で死亡した。残りのホモ接合のメスは、12週でも生存しており、健康であった。結果は、mPMS1ホモ接合欠陥マウスが生存できることを示している。
交配のための囲い#3および#4は、C57/BL6バックグラウンドにmPMS1変異を戻し交配するために用いた。交配のための囲い#3(C57/BL6マウスに交配した動物F2−12)は、2回で21匹の動物を産み、9匹の遺伝子型がわかった。交配のための囲い#4(C57/BL6マウスに交配した動物F2−6)は、8匹のマウスを産んだ。さらに、元のオスのキメラ(交配のための囲い#5)は、31匹のさらなる子孫を産んだ。
動物の遺伝子型を決定するために、変異および野生型mPMS1遺伝子を同定するために用いられる一連のPCRプライマーを開発した。これらは、以下のものである(それぞれ、SEQ ID NOS:143−148)。
我々が開発したマウスは、DNAミスマッチ修復における欠陥の結果および結果的なHNPCCを研究するための動物モデル系を提供する。mPMS1変異およびその種類にホモ接合およびヘテロ接合のマウスの長期の生存、並びにこれらのマウスにおける腫瘍のタイミングを決定することができる。このマウスは、皮の状態の悪化と組み合わせて、背を丸める外観によって同定されるガンの示唆の開始について日々スクリーニングされる。mPMS1変異を有するこれらのマウスを用いて、環境的および遺伝的な腫瘍形成に係る他の因子の効果を調べることができる。例えば、結腸および他の種の腫瘍への食事の影響は、正常なマウスとヘテロ接合またはホモ接合の遺伝型のいずれかのmPMS1変異を有するマウスとを比較することができる。さらに、mPMS1変異は、ミスマッチ修復経路の遺伝子と、例えばp53等のヒトのガンに係る他の遺伝子との相互作用について調べるために別の遺伝的バックグラウンドに挿入することができる。mPMS1変異を有するマウスは、予想される結腸癌等の、マウスに発生する癌の体細胞遺伝子治療の効果を調べるためにも使用できる。さらに、ホモ接合およびヘテロ接合mPMS1マウスの同質の繊維芽細胞細胞ラインが、自発的変異率の調査を含む種々の細胞研究における使用のために確立される。
mMLH1における変異を有するマウスを誘導するためにマウスmMLH1遺伝子を崩壊するためのベクターを現在作成中である。mPMS1に欠陥を有するマウスとmMLH1に欠陥を有するマウスとを比較するつもりである。さらに、二つのHNPCC遺伝子に変異を有する相乗効果があるか否かを調べるために、両方の遺伝子に変異を有するマウスを作製する。mMLH1変異マウスに関する他の研究は、mPMS1変異マウスについて上述した通りであろう。
【配列表】
(1)一般情報
(i)出願人:Liskay,Robert M.
Bronner,C.Eric
Baker,Sean M.
Bollag,Roni J.
Kolodner,Richard D.
(ii)発明の名称:DNAミスマッチ修復遺伝子に関する組成物および方法
(iii)配列の数:148
(iv)連絡の住所:
(A)住所:Kolisch,Hartwell,Dickinson,McCormack & Heuser
(B)通り:520 S.W.Yamhill Street,Suite200
(C)都市名:Portland
(D)州名:オレゴン
(E)国名:米国
(F)郵便番号(ZIP):97204
(v)コンピューターが読み込むことのできる形態:
(A)媒体種:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン(PatentIn) リリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)本出願の情報:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人の情報:
(A)名称:Van Rysselberghe,Pierre C.
(B)登録番号:33557
(C)参照/事件整理番号:OHSU 306B
(ix)通信情報:
(A)電話:(503)224−6655
(B)ファックス:(503)295−6679
(C)テレックス:360619
(2)配列番号(SEQ ID NO):1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:361アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:1:
(2)配列番号(SEQ ID NO):2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:538アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:2:
(2)配列番号(SEQ ID NO):3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:607アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:3:
(2)配列番号(SEQ ID NO):4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2484塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:4:
(2)配列番号(SEQ ID NO):5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:756アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:5:
(2)配列番号(SEQ ID NO):6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:397塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:6:
(2)配列番号(SEQ ID NO):7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:393塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:7:
(2)配列番号(SEQ ID NO):8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:352塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:8:
(2)配列番号(SEQ ID NO):9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:287塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:9:
(2)配列番号(SEQ ID NO):10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:336塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:10:
(2)配列番号(SEQ ID NO):11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:257塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:11:
(2)配列番号(SEQ ID NO):12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:389塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:12:
(2)配列番号(SEQ ID NO):13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:381塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:13:
(2)配列番号(SEQ ID NO):14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:526塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:14:
(2)配列番号(SEQ ID NO):15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:434塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:15:
(2)配列番号(SEQ ID NO):16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:458塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:16:
(2)配列番号(SEQ ID NO):17の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:618塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:17:
(2)配列番号(SEQ ID NO):18の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:478塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:18:
(2)配列番号(SEQ ID NO):19の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:377塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:19:
(2)配列番号(SEQ ID NO):20の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:325塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:20:
(2)配列番号(SEQ ID NO):21の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:341塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:21:
(2)配列番号(SEQ ID NO):22の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:260塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:22:
(2)配列番号(SEQ ID NO):23の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:340塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:23:
(2)配列番号(SEQ ID NO):24の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:563塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:SEQ ID NO:24:
(2)配列番号(SEQ ID NO):25の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:137塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:25:
(2)配列番号(SEQ ID NO):26の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:91塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:26:
(2)配列番号(SEQ ID NO):27の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:99塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:27:
(2)配列番号(SEQ ID NO):28の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:28:
(2)配列番号(SEQ ID NO):29の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:29:
(2)配列番号(SEQ ID NO):30の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:92塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:30:
(2)配列番号(SEQ ID NO):31の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:31:
(2)配列番号(SEQ ID NO):32の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:89塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:32:
(2)配列番号(SEQ ID NO):33の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:113塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:33:
(2)配列番号(SEQ ID NO):34の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:34:
(2)配列番号(SEQ ID NO):35の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:154塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:35:
(2)配列番号(SEQ ID NO):36の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:371塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:36:
(2)配列番号(SEQ ID NO):37の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:149塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:37:
(2)配列番号(SEQ ID NO):38の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:109塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:38:
(2)配列番号(SEQ ID NO):39の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:39:
(2)配列番号(SEQ ID NO):40の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:165塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:40:
(2)配列番号(SEQ ID NO):41の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:41:
(2)配列番号(SEQ ID NO):42の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:114塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:42:
(2)配列番号(SEQ ID NO):43の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:360塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列:SEQ ID NO:43:
(2)配列番号(SEQ ID NO):44の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:44:
(2)配列番号(SEQ ID NO):45の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:45:
(2)配列番号(SEQ ID NO):46の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:46:
(2)配列番号(SEQ ID NO):47の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:47:
(2)配列番号(SEQ ID NO):48の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:48:
(2)配列番号(SEQ ID NO):49の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:49:
(2)配列番号(SEQ ID NO):50の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:50:
(2)配列番号(SEQ ID NO):51の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:51:
(2)配列番号(SEQ ID NO):52の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:52:
(2)配列番号(SEQ ID NO):53の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:53:
(2)配列番号(SEQ ID NO):54の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:54:
(2)配列番号(SEQ ID NO):55の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:55:
(2)配列番号(SEQ ID NO):56の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:56:
(2)配列番号(SEQ ID NO):57の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:57:
(2)配列番号(SEQ ID NO):58の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:58:
(2)配列番号(SEQ ID NO):59の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:21塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:59:
(2)配列番号(SEQ ID NO):60の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:60:
(2)配列番号(SEQ ID NO):61の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:61:
(2)配列番号(SEQ ID NO):62の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:62:
(2)配列番号(SEQ ID NO):63の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:63:
(2)配列番号(SEQ ID NO):64の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:64:
(2)配列番号(SEQ ID NO):65の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:65:
(2)配列番号(SEQ ID NO):66の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:66:
(2)配列番号(SEQ ID NO):67の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:67:
(2)配列番号(SEQ ID NO):68の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:68:
(2)配列番号(SEQ ID NO):69の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:69:
(2)配列番号(SEQ ID NO):70の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:70:
(2)配列番号(SEQ ID NO):71の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:71:
(2)配列番号(SEQ ID NO):72の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:72:
(2)配列番号(SEQ ID NO):73の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:73:
(2)配列番号(SEQ ID NO):74の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:74:
(2)配列番号(SEQ ID NO):75の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:75:
(2)配列番号(SEQ ID NO):76の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:76:
(2)配列番号(SEQ ID NO):77の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:77:
(2)配列番号(SEQ ID NO):78の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:25塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:78:
(2)配列番号(SEQ ID NO):79の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:79:
(2)配列番号(SEQ ID NO):80の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:80:
(2)配列番号(SEQ ID NO):81の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:81:
(2)配列番号(SEQ ID NO):82の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:82:
(2)配列番号(SEQ ID NO):83の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:83:
(2)配列番号(SEQ ID NO):84の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:84:
(2)配列番号(SEQ ID NO):85の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:85:
(2)配列番号(SEQ ID NO):86の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:86:
(2)配列番号(SEQ ID NO):87の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:87:
(2)配列番号(SEQ ID NO):88の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:88:
(2)配列番号(SEQ ID NO):89の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:89:
(2)配列番号(SEQ ID NO):90の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:90:
(2)配列番号(SEQ ID NO):91の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:91:
(2)配列番号(SEQ ID NO):92の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:92:
(2)配列番号(SEQ ID NO):93の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:46塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:93:
(2)配列番号(SEQ ID NO):94の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:94:
(2)配列番号(SEQ ID NO):95の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:95:
(2)配列番号(SEQ ID NO):96の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:96:
(2)配列番号(SEQ ID NO):97の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:97:
(2)配列番号(SEQ ID NO):98の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:98:
(2)配列番号(SEQ ID NO):99の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:99:
(2)配列番号(SEQ ID NO):100の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:100:
(2)配列番号(SEQ ID NO):101の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:101:
(2)配列番号(SEQ ID NO):102の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:102:
(2)配列番号(SEQ ID NO):103の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:103:
(2)配列番号(SEQ ID NO):104の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:17塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:104:
(2)配列番号(SEQ ID NO):105の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:105:
(2)配列番号(SEQ ID NO):106の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:106:
(2)配列番号(SEQ ID NO):107の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:21塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:107:
(2)配列番号(SEQ ID NO):108の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:108:
(2)配列番号(SEQ ID NO):109の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:109:
(2)配列番号(SEQ ID NO):110の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:110:
(2)配列番号(SEQ ID NO):111の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:111:
(2)配列番号(SEQ ID NO):112の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:112:
(2)配列番号(SEQ ID NO):113の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:113:
(2)配列番号(SEQ ID NO):114の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:114:
(2)配列番号(SEQ ID NO):115の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:18塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:115:
(2)配列番号(SEQ ID NO):116の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:116:
(2)配列番号(SEQ ID NO):117の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:117:
(2)配列番号(SEQ ID NO):118の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:118:
(2)配列番号(SEQ ID NO):119の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:119:
(2)配列番号(SEQ ID NO):120の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:120:
(2)配列番号(SEQ ID NO):121の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:121:
(2)配列番号(SEQ ID NO):122の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix)特徴:
(A)名称/記号:misc_feature
(B)存在位置:1
(D)その他の情報:/note=“ゲノムイントロンDNAに向けられたプライマー”
(xi)配列:SEQ ID NO:122:
(2)配列番号(SEQ ID NO):123の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:770アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:123:
(2)配列番号(SEQ ID NO):124の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:124:
(2)配列番号(SEQ ID NO):125の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:125:
(2)配列番号(SEQ ID NO):126の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:52アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:126:
(2)配列番号(SEQ ID NO):127の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:127:
(2)配列番号(SEQ ID NO):128の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:128:
(2)配列番号(SEQ ID NO):129の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:129:
(2)配列番号(SEQ ID NO):130の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:130:
(2)配列番号(SEQ ID NO):131の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:64アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:131:
(2)配列番号(SEQ ID NO):132の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2687塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(viii)ゲノム内での位置:
(B)染色体上の位置:7q
(xi)配列:SEQ ID NO:132:
(2)配列番号(SEQ ID NO):133の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:862アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:133:
(2)配列番号(SEQ ID NO):134の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:903アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:134:
(2)配列番号(SEQ ID NO):135の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2577塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:135:
(2)配列番号(SEQ ID NO):136の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:728アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:136:
(2)配列番号(SEQ ID NO):137の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:3065塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:137:
(2)配列番号(SEQ ID NO):138の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:864アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO:138:
(2)配列番号(SEQ ID NO):139の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:29塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:139:
(2)配列番号(SEQ ID NO):140の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:29塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:140:
(2)配列番号(SEQ ID NO):141の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:141:
(2)配列番号(SEQ ID NO):142の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:15塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:142:
(2)配列番号(SEQ ID NO):143の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:143:
(2)配列番号(SEQ ID NO):144の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:16塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:144:
(2)配列番号(SEQ ID NO):145の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:145:
(2)配列番号(SEQ ID NO):146の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:146:
(2)配列番号(SEQ ID NO):147の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:147:
(2)配列番号(SEQ ID NO):148の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:22塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列:SEQ ID NO:148:
Claims (7)
- 患者から単離された核酸を増幅することを含み、SEQ ID NO:5のhMLH1タンパクの44位における非保存的アミノ酸置換を生じるCからTへの転位型突然変異により特徴付けされるhMLH1変異を検出することを含む、患者の遺伝的非ポリポシス大腸ガン(HNPCC)に対する罹りやすさを調べる方法。
- 前記単離された核酸がRNAである場合、前記単離された核酸の逆転写を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出工程が、
−MLH1遺伝子を欠いた酵母株に患者から単離された核酸を導入する工程;および
−DNAミスペアを修正する酵母株の能力をアッセイする工程
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記遺伝子産物と野生型hMLH1タンパクとの間の相互作用の程度を測定することをさらに含む、請求項1ないし3のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1ないし4のいずれか一項に記載の方法においてhMLH1ゲノム配列を増幅することができる、SEQ ID NO:44−122からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項1ないし5のいずれか一項に記載の方法の検出工程においてhMLH1遺伝子とハイブリダイズすることができる、SEQ ID NO:142によって表されるプローブ。
- 前記検出工程が、SEQ ID NO:4のヌクレオチド部位118−135および343−359に対応する二つのプライマーのセットによって増幅される、患者のhMLH1遺伝子のDNA配列における変異を検出することを含む、請求項1ないし4のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US16887793A | 1993-12-17 | 1993-12-17 | |
US08/168,877 | 1993-12-17 | ||
US08/209,521 US5922855A (en) | 1993-12-17 | 1994-03-08 | Mammalian DNA mismatch repair genes MLH1 and PMS1 |
US08/209,521 | 1994-03-08 | ||
US08/352,902 US6191268B1 (en) | 1993-12-17 | 1994-12-09 | Compositions and methods relating to DNA mismatch repair genes |
US08/352,902 | 1994-12-09 | ||
PCT/US1994/014746 WO1995016793A1 (en) | 1993-12-17 | 1994-12-16 | Compositions and methods relating to dna mismatch repair genes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09512702A JPH09512702A (ja) | 1997-12-22 |
JP4101285B2 true JP4101285B2 (ja) | 2008-06-18 |
Family
ID=27389577
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51702495A Expired - Lifetime JP4101285B2 (ja) | 1993-12-17 | 1994-12-16 | Dnaミスマッチ修復遺伝子に関する組成物および方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US6191268B1 (ja) |
EP (1) | EP0760867B1 (ja) |
JP (1) | JP4101285B2 (ja) |
AT (1) | ATE330009T1 (ja) |
AU (1) | AU1442495A (ja) |
CA (1) | CA2179285A1 (ja) |
DE (1) | DE69434765T2 (ja) |
DK (1) | DK0760867T3 (ja) |
ES (1) | ES2270424T3 (ja) |
WO (1) | WO1995016793A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0847247A (ja) * | 1994-08-05 | 1996-02-16 | Fuji Denki Kogyo Kk | Dc/dcコンバータ回路 |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6191268B1 (en) * | 1993-12-17 | 2001-02-20 | Dana-Farber Cancer Institute | Compositions and methods relating to DNA mismatch repair genes |
US6482606B1 (en) * | 1994-01-27 | 2002-11-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human DNA mismatch repair polynucleotides |
EP0749496A4 (en) | 1994-01-27 | 1999-03-03 | Human Genome Sciences Inc | HUMAN DNA MALFUNCTION REPAIR PROTEINS |
US6380369B1 (en) * | 1994-01-27 | 2002-04-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Human DNA mismatch repair proteins |
AUPM612494A0 (en) * | 1994-06-08 | 1994-06-30 | Csl Limited | Treatment or prevention of helicobacter infection |
CA2223971A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Marilee Burrell | Antibody detection of mismatch repair proteins |
US6294325B1 (en) * | 1996-07-05 | 2001-09-25 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of thermostable multi genes and proteins and uses thereof |
WO1999001550A1 (en) | 1997-07-03 | 1999-01-14 | Dana-Farber Cancer Institute | A method for detection of alterations in msh5 |
DE19739611A1 (de) * | 1997-09-09 | 1999-03-11 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäure-Sequenzen und Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Pseudomonas |
DE19747748A1 (de) * | 1997-10-29 | 1999-05-06 | Manfred Dr Dr Gross | Testverfahren zur Identifizierung von Personen mit defektem Mismatch-Reparatursystem |
US6146894A (en) * | 1998-04-14 | 2000-11-14 | The Johns Hopkins University | Method for generating hypermutable organisms |
US7148016B1 (en) * | 1999-01-14 | 2006-12-12 | Ca*Tx Inc. | Immunoassays to detect diseases or disease susceptibility traits |
EP1268765B1 (en) | 2000-02-11 | 2008-08-13 | The Johns Hopkins University | Methods for generating hypermutable bacteria |
US6900370B2 (en) * | 2000-02-18 | 2005-05-31 | John Hopkins University | Method for generating hypermutable plants |
ATE351914T1 (de) * | 2000-02-23 | 2007-02-15 | Univ Johns Hopkins | Verfahren zur erzeugung von schnell mutierender hefe |
US6677146B1 (en) * | 2000-03-28 | 2004-01-13 | Replidyne, Inc. | Thermophilic polymerase III holoenzyme |
CA2408826C (en) * | 2000-05-12 | 2012-08-14 | The Johns Hopkins University | A method for generating hypermutable organisms |
NZ524366A (en) * | 2000-07-27 | 2005-12-23 | Univ Delaware | Methods for enhancing targeted gene alteration using oligonucleotides |
US7223598B2 (en) * | 2000-11-07 | 2007-05-29 | Morphotek, Inc. | Methods for isolating novel antimicrobial agents from hypermutable mammalian cells |
US6808894B1 (en) | 2000-11-07 | 2004-10-26 | Morphotek, Inc. | Methods for generating genetically altered antibody producing cell lines with improved antibody characteristics |
US7235643B2 (en) * | 2000-11-07 | 2007-06-26 | Morphotek, Inc. | Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with high affinity |
US6576468B1 (en) | 2000-11-07 | 2003-06-10 | Morphotek, Inc. | Methods for obtaining microbe-resistant mammalian cells from hypermutable mammalian cells |
US6737268B1 (en) * | 2000-11-14 | 2004-05-18 | Morphotek, Inc. | Method for generating genetically altered antigens |
US6982169B2 (en) | 2001-01-15 | 2006-01-03 | Morphotek, Inc. | Chemical inhibitors of mismatch repair |
CA2434926C (en) * | 2001-01-15 | 2014-04-01 | Morphotek, Inc. | Chemical inhibitors of mismatch repair |
US20030068808A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-04-10 | Nicolaides Nicholas C. | Methods for generating antibiotic resistant microbes and novel antibiotics |
US20030165940A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-09-04 | The Johns Hopkins University | Disease detection by digital protein truncation assays |
ATE489474T1 (de) * | 2002-07-19 | 2010-12-15 | Morphotek Inc | Verfahren zur erzeugung verbesserter antikörper produzierender zellinien mit verbesserten wachstumseigenschaften |
US7316903B2 (en) * | 2003-03-28 | 2008-01-08 | United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of nucleic acid sequence variations using phase Mu transposase |
EP1626991A2 (en) * | 2003-05-23 | 2006-02-22 | Morphotek, Inc. | Anti alpha-folate-receptor-tetramer antibodies |
CA2548813A1 (en) * | 2003-12-08 | 2005-06-23 | Morphotek, Inc. | Antibodies that specifically bind pms2 |
EP3101034A1 (en) | 2004-02-12 | 2016-12-07 | Morphotek, Inc. | Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha |
ES2429340T3 (es) * | 2005-03-10 | 2013-11-14 | Morphotek, Inc. | Anticuerpos anti-mesotelina |
EP1879922A2 (en) | 2005-04-22 | 2008-01-23 | Morphotek, Inc. | Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells |
CN102296105A (zh) * | 2010-06-25 | 2011-12-28 | 复旦大学 | 一种检测mlh1基因突变的方法及其试剂盒 |
US11773449B2 (en) | 2017-09-01 | 2023-10-03 | The Hospital For Sick Children | Profiling and treatment of hypermutant cancer |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US5043272A (en) * | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
WO1993022457A1 (en) * | 1992-04-24 | 1993-11-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Screening for genetic variation |
US7229755B1 (en) * | 1993-11-17 | 2007-06-12 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Method for detection of alterations in the DNA mismatch repair pathway |
DE69433940T2 (de) * | 1993-12-02 | 2005-07-28 | The Johns Hopkins University | Menschliches mutator-gen nmsh2 und seine verbindung zum hereditaren, nichtpolypösen kolorrektalen karzinom |
US6191268B1 (en) * | 1993-12-17 | 2001-02-20 | Dana-Farber Cancer Institute | Compositions and methods relating to DNA mismatch repair genes |
EP0749496A4 (en) * | 1994-01-27 | 1999-03-03 | Human Genome Sciences Inc | HUMAN DNA MALFUNCTION REPAIR PROTEINS |
-
1994
- 1994-12-09 US US08/352,902 patent/US6191268B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-16 JP JP51702495A patent/JP4101285B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-16 EP EP95906061A patent/EP0760867B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-16 WO PCT/US1994/014746 patent/WO1995016793A1/en active IP Right Grant
- 1994-12-16 DK DK95906061T patent/DK0760867T3/da active
- 1994-12-16 AU AU14424/95A patent/AU1442495A/en not_active Abandoned
- 1994-12-16 CA CA002179285A patent/CA2179285A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-16 DE DE69434765T patent/DE69434765T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-16 AT AT95906061T patent/ATE330009T1/de active
- 1994-12-16 ES ES95906061T patent/ES2270424T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-10-31 US US08/961,810 patent/US6165713A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-03-10 US US09/265,503 patent/US6538108B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-22 US US10/349,607 patent/US20030224463A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0847247A (ja) * | 1994-08-05 | 1996-02-16 | Fuji Denki Kogyo Kk | Dc/dcコンバータ回路 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2270424T3 (es) | 2007-04-01 |
DE69434765T2 (de) | 2007-05-24 |
JPH09512702A (ja) | 1997-12-22 |
US20030224463A1 (en) | 2003-12-04 |
US6538108B1 (en) | 2003-03-25 |
DE69434765D1 (de) | 2006-07-27 |
WO1995016793A1 (en) | 1995-06-22 |
US6191268B1 (en) | 2001-02-20 |
EP0760867B1 (en) | 2006-06-14 |
DK0760867T3 (da) | 2006-10-23 |
ATE330009T1 (de) | 2006-07-15 |
EP0760867A4 (en) | 1998-11-25 |
AU1442495A (en) | 1995-07-03 |
EP0760867A1 (en) | 1997-03-12 |
US6165713A (en) | 2000-12-26 |
CA2179285A1 (en) | 1995-06-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4101285B2 (ja) | Dnaミスマッチ修復遺伝子に関する組成物および方法 | |
US7118869B2 (en) | Genomic sequence of the 5-Lipoxygenase-activating protein (FLAP), polymorphic markers thereof and methods for detection of asthma | |
US5922855A (en) | Mammalian DNA mismatch repair genes MLH1 and PMS1 | |
US5945522A (en) | Prostate cancer gene | |
JP4312827B2 (ja) | ヒトのミューテーター遺伝子hMSH2及び遺伝性非ポリープ性大腸ガン | |
US7829671B2 (en) | Gene encoding a DNA repair enzyme and methods of use thereof | |
US20120009648A1 (en) | DNA polymerase lambda and uses thereof | |
AU2567000A (en) | Biallelic markers derived from genomic regions carrying genes involved in arachidonic acid metabolism | |
JPH05211897A (ja) | ヌクレオチド配列 | |
KR101720555B1 (ko) | 이상 미토콘드리아 디엔에이, 관련된 융합 전사물 및 번역 산물 및 이에 대한 하이브리드화 탐침 | |
US7189833B2 (en) | Prostate cancer gene | |
CN106957907B (zh) | 用于狗中的肝铜积累的遗传检测 | |
JP5897704B2 (ja) | ブラキスパイナ突然変異の検出 | |
AU743457B2 (en) | Compositions and methods relating to DNA mismatch repair genes | |
Skarsfjord | Hereditary breast and ovarian cancer. Diversity of genetic causes of HBOC in a Norwegian breast and ovarian cancer patient cohort, BRCA2 c. 8331+ 2C> T-a Norwegian founder mutation | |
Bailey et al. | Method for screening for a tobiano coat color genotype | |
Hampton | Molecular genetic analysis of the adenomatous polyposis coli gene region | |
WO1997001634A2 (en) | Polypeptide for repairing genetic information, nucleotidic sequence which codes for it and process for the preparation thereof (guanine thymine binding protein - gtbp) | |
JP2001204476A (ja) | ヒト糖尿病の遺伝子診断法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040629 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040924 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041222 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070626 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071025 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20080110 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080219 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080319 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110328 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120328 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130328 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140328 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |