DE69434765T2

DE69434765T2 - Zusammensetzung und methoden bezogen auf dna fehlpaarungsreparaturgene

Info

Publication number: DE69434765T2
Application number: DE69434765T
Authority: DE
Inventors: Sean M. Portland BAKER; Roni J. Martinez BOLLAG; Richard D. Jamaica Plain KOLODNER; C. Eric Portland BRONNER; Robert M. Lake Oswego LISKAY
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Oregon Health Science University
Current assignee: Oregon Health & Science University Portland Us; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2014-12-17
Also published as: US6538108B1; JPH09512702A; CA2179285A1; US20030224463A1; US6191268B1; AU1442495A; US6165713A; ES2270424T3; ATE330009T1; EP0760867A4; DK0760867T3; JP4101285B2; EP0760867A1; EP0760867B1; WO1995016793A1; DE69434765D1

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter der Vereinbarung Nr. GM 32741 und der Vereinbarung Nr. HG00395/GM50006 gemacht, welche vom National Institute of Health in der Abteilung Allgemeine Wissenschaften zuerkannt wird. Die Regierung hat an der Erfindung gewisse Rechte.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet DNA-Fehlpaarungsreparaturgene. Insbesondere betrifft die Erfindung die Identifizierung von Mutationen und Polymorphismen in DNA-Fehlpaarungsreparaturgenen, die Identifizierung und Charakterisierung von Tumoren mit einem DNA-Fehlpaarungsreparaturdefekt und den Nachweis der genetischen Suszeptibilität für Krebs.
Hintergrund
In den letzten Jahren ist es mit der Entwicklung von wirksamen Klonierungs- und Amplifikationstechniken wie beispielsweise der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in Kombination mit einer sich rasch ansammelnden Fülle von Informationen in Bezug auf die Struktur und Lage von zahlreichen menschlichen Genen und Markern, praktizierbar und ratsam geworden, Proben von DNA und RNA aus Individuen zu sammeln und zu analysieren, die Mitglieder von Familien sind, welche als eine hohe Häufigkeit an gewissen genetisch übertragenen Störungen aufweisend identifiziert wurden. Beispielsweise werden Screening-Verfahren routinemäßig verwendet, um auf Gene zu screenen, die an Sichelzellenanämie, Mukoviszidose, dem fragilen X-Chromosom-Syndrom und multipler Sklerose beteiligt sind. Bei einigen Typen von Störungen kann eine frühe Diagnose die Langzeitprognose der Person deutlich verbessern, indem beispielsweise eine aggressive diagnostische Routine gewählt wird und/oder indem der Lebensstil verändert wird, wenn dieses geeignet ist, um entweder ein voraussichtliches Problem zu verhindern oder sich darauf vorzubereiten.
Wenn eine bestimmte Mutation eines menschlichen Gens einmal identifiziert ist und mit einer Krankheit verknüpft wurde, kann die Entwicklung von Screening-Verfahren, um Individuen mit hohem Risiko zu identifizieren, relativ unkompliziert sein. Nachdem beispiels weise die Struktur und die anomale phänotypische Rolle des Mutantengens verstanden wurden, ist es möglich, Primer zur Verwendung in einer PCR zu entwerfen, um amplifizierte Mengen des Gens aus Individuen zum Testen zu erhalten. Jedoch erfordert die anfängliche Entdeckung eines Mutantengens, d.h. seiner Struktur, Lage und Verknüpfung mit einem bekannten vererbten Gesundheitsproblem, wesentliche experimentelle Anstrengungen und kreative Forschungsstrategien.
Ein Ansatz zur Aufdeckung der Rolle eines Mutantengens bei der Verursachung einer Krankheit beginnt mit klinischen Studien an Individuen, die aus Familien kommen, welche eine hohe Häufigkeit der Krankheit zeigen. Bei diesen Studien wird die ungefähre Lage des die Krankheit verursachenden Genortes (Iocus) indirekt bestimmt, indem nach einem Chromosomenmarker gesucht wird, der dazu neigt, sich zusammen mit dem Genort zu segregieren. Eine Hauptbeschränkung dieses Ansatzes ist es, dass, auch wenn die ungefähre genomische Lage des Gens bestimmt werden kann, dieser nicht allgemein eine tatsächliche Isolierung oder Sequenzierung des Gens erlaubt. Beispielsweise berichteten Lindblom et al.³ Ergebnisse von Verknüpfungsanalysestudien, welche mit SSLP (einfacher Sequenzlängenpolymorphismus)-Markern an Individuen aus einer Familie durchgeführt wurden, von der bekannt war, dass diese eine hohes Vorkommen eines erblichen Non-Polyposis Darmkrebses (HNPCC) zeigte. Lindbom et al. fanden eine „enge Verknüpfung" zwischen einem polymorphen Marker auf dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 3 (3p21-23) und einem Krankheits-Genort, der anscheinend für das Ansteigen des Risikos eines Individuums für die Entwicklung von Darmkrebs verantwortlich war. Selbst wenn 3p21-23 eine recht spezifische Lage in Bezug auf das gesamte Genom ist, stellt dieses einen riesigen DNA-Bereich in Bezug auf die vermutliche Größe des Mutantengens dar. Das Mutantengen könnte von den Markern, welche den Genort identifizieren, durch Millionen von Basen getrennt sein. Bestenfalls haben solche Verknüpfungsstudien nur einen beschränkten Nutzen zu Screeningzwecken, da, um das Risiko einer Person vorherzusagen, eine genetische Analyse mit eng verknüpften genetischen Markern mit einer Anzahl von verwandten Individuen in der Familie durchgeführt werden muss. Es ist oft unmöglich, eine solche Information zu erhalten, insbesondere wenn betroffene Familienmitglieder verschieden sind. Ebenso können informative Marker in der Familie, die analysiert wird, nicht existieren. Ohne die Struktur des Gens zu kennen, ist es nicht möglich, Proben zu nehmen, zu amplifizieren, zu sequenzieren und direkt zu bestimmen, ob ein Individuum das Mutantengen trägt.
Ein anderer Ansatz, um ein krankheitsverursachendes Mutantengen zu entdecken, beginnt mit der Planung und dem Test von PCR-Primern auf der Basis der bekannten Information über die Krankheit, beispielsweise Theorien für Mechanismen des Krankheitszustands, verwandte Proteinstrukturen und Funktion, mögliche analoge Gene in Menschen oder anderen Spezies usw. Das Ziel ist es, normale Kandidatengene zu isolieren und sequenzieren, von denen angenommen wird, dass diese manchmal in Mutantenformen auftreten, die für eine individuelle Krankheit anfällig machen. Dieser Ansatz ist in hohem Maße abhängig davon, wie viel über die Krankheit auf dem molekularen Niveau bekannt ist, und von der Fähigkeit des Forschers, Strategien und Methoden zum Auffinden von Kandidatengenen zu ersinnen. Die Verbindung einer Mutation in einem Kandidatengen mit einer Krankheit muss schließlich gezeigt werden, indem Tests mit Mitgliedern einer Familie durchgeführt werden, welche ein hohes Vorkommen der Krankheit zeigt. Der direkteste und definitivste Weg, eine solche Verknüpfung in Familienstudien zu bestätigen, ist es, PCR-Primer zu verwenden, die so entworfen sind, dass diese Bereiche des Kandidatengens in Proben, die von Familienmitgliedern gesammelt wurden, amplifizieren. Die amplifizierten Genprodukte werden dann sequenziert und mit der normalen Genstruktur zu dem Zweck verglichen, Mutationen zu finden und zu charakterisieren. Eine gegebene Mutation wird schließlich impliziert, indem gezeigt wird, dass betroffene Individuen diese aufweisen, während nicht betroffene Individuen diese nicht aufweisen, und dass die Mutation eine Veränderung bei der Proteinfunktion verursacht, welche nicht einfach ein Polymorphismus ist.
Ein weiterer Weg, eine hohe Wahrscheinlichkeit der Verknüpfung zwischen einer Mutation eines Kandidatengens und einer Krankheit zu zeigen, erfolgt durch die Bestimmung der Lage des Gens auf einem Chromosom, dann Vergleichen der Lage des Gens in der Karte mit bekannten Bereichen von mit der Krankheit verknüpften Genorten wie z.B. dem, der von Lindblom et al. identifiziert wurde. Eine übereinstimmende Lage in der Karte eines Kandidatengens in dem Bereich eines vorher identifizierten mit der Krankheit verknüpften Genortes kann eine Verbindung zwischen einer Mutation in dem Kandidatengen und der Krankheit nachdrücklich implizieren.
Es gibt andere Wege, um zu zeigen, dass Mutationen in einem Genkandidaten mit der Krankheit verknüpft sein können. Beispielsweise können künstlich erzeugte Mutantenformen des Gens in Tiere eingeführt werden. Das Auftreten der Krankheit in Tieren, welche das Mutantengen tragen, kann dann mit Tieren mit dem normalen Genotyp verglichen werden. Ein signifikant erhöhtes Auftreten der Krankheit in Tieren mit dem Mutantengenotyp, in Bezug auf Tiere mit dem Wildtyp-Gen, kann die Theorie unterstützen, dass Mutationen in dem Kandidatengen manchmal für das Auftreten der Krankheit verantwortlich sind.
Ein Typ einer Krankheit, der in letzter Zeit aufgrund der Entdeckung von krankheitsverknüpften Genmutationen viel Aufmerksamkeit erfahren hat, ist der Erbliche Non-Polyposis Darmkrebs (HNPCC).^1,2 Mitglieder von HNPCC-Familien zeigen ebenfalls eine erhöhte Suszeptibilität für andere Krebsarten einschließlich endometrialen, ovariellen gastralen und die Brust betreffenden. Von ungefähr 10% der kolorektalen Krebsfälle wird angenommen, dass diese HNPCC sind. Tumore von HNPCC-Patienten zeigen einen ungewöhnlichen genetischen Defekt, bei welchem kurze, wiederholte DNA-Sequenzen wie z.B. die Dinukleotid-Wiederholungssequenzen, die in menschlicher chromosomaler DNA gefunden werden („Mikrosatelliten-DNA"), instabil zu sein scheinen. Diese genomische Instabilität von kurzen, wiederholten DNA-Sequenzen, die manchmal der „RER+"-Phänotyp genannt wird, wird ebenfalls bei einem signifikanten Anteil einer großen Vielzahl von sporadischen Tumoren beobachtet, was nahe legt, dass viele sporadische Tumore Mutationen erfahren haben können, die ähnlich (oder identisch) zu Mutationen sind, die bei HNPCC vererbt werden.
Genetische Verknüpfungsstudien haben zwei HNPCC-Genorte identifiziert, von denen angenommen wird, dass diese für soviel wie 90% des HNPCC verantwortlich sind. Die Genorte wurden auf dem menschlichen Chromosom 2p15-16 (2p21) und 3p21-23 kartiert. Nachfolgende Studien haben das menschliche DNA-Fehlpaarungsreparaturgen hMSH2 als das Gen auf dem Chromosom 2p21 identifiziert, bei welchem Mutationen für einen signifikanten Anteil der HNPCC-Krebsfälle verantwortlich sind.^1,2,12 hMSH2 ist eines von mehreren Genen, deren normale Funktion es ist, DNA-Fehlpaarungen einschließlich jenen, die auf jede Runde der Chromosomenreplikation folgen, zu identifizieren und korrigieren.
Der am besten definierte Fehlpaarungsreparaturweg ist der E. coli MutHLS-Weg, welcher eine Reparaturreaktion unter Herausschneiden eines langen Stücks (ungefähr 3 Kb) fördert, welche von den Genprodukten von mutH, mutL, mutS und mutU (uvrD) abhängt. Der MutHLS-Weg scheint der aktivste Fehlpaarungsreparaturweg in E. coli zu sein, und es ist bekannt, dass dieser sowohl die Genauigkeit der DNA-Replikation steigert als auch an Rekombinationszwischenprodukten, die fehlgepaarte Basen enthalten, wirkt. Das System wurde in vitro rekonstituiert und erfordert die mutH-, mutL-, mutS- und uvrD (Helicase II)-Proteine zusammen mit DNA-Polymerase III Holoenzym, DNA-Ligase, Einzelstrang-DNA-Bindungsprotein (SSB) und einer der Einzelstrang-DNA-Exonucleasen Exo I, Exo VII oder RecJ. hMSH2 ist homolog zu dem bakteriellen mutS-Gen. Ein ähnlicher Weg in Hefe umfasst das Hefe-MSH2-Gen und zwei mutL-ähnliche Gene, die als PMS1 und MLH1 bezeichnet werden.
Mit der Kenntnis, dass Mutationen in dem menschlichen Gen vom mutS-Typ (hMSH2) manchmal Krebs hervorrufen, und der Entdeckung, dass HNPCC-Tumore eine Instabilität der Mikrosatelliten-DNA zeigen, wurde das Interesse an anderen DNA-Fehlpaarungsreparaturgenen und Genprodukten und deren möglichen Rollen bei HNPCC und/oder anderen Krebsarten verstärkt. Es wird geschätzt, dass so viele wie 1 von 200 Individuen eine Mutation bei entweder dem hMSH2-Gen oder anderen verwandten Genen, welche für andere Proteine in demselben DNA-Fehlpaarungsreparaturweg codieren, tragen.
Ein wichtiges Ziel unserer Arbeit war es, menschliche Gene zu identifizieren, die zum Screenen und Identifizieren von Individuen nützlich sind, die einem erhöhten Risiko unterliegen, Krebs zu entwickeln. Andere Aufgaben sind: die Sequenzen von Exons und flankierenden Intronstrukturen in solchen Genen zu bestimmen; die Strukturinformation zu verwenden, um Testverfahren zu entwerfen, zu dem Zweck, Mutationen zu finden und zu charakterisieren, welche zu einem Fehlen von oder einem Defekt in einem Genprodukt führen, was eine Suszeptibilität für Krebs verleiht; und solche Mutationen von „harmlosen" polymorphen Variationen zu unterscheiden. Eine weitere Aufgabe ist es, die Strukturinformation in Bezug auf Exon- und flankierende Intronsequenzen eines mit Krebs verknüpften Gens zu verwenden, um Tumortypen zu diagnostizieren und eine geeignete Therapie zu verschreiben. Eine weitere Aufgabe ist es, die Strukturinformation in Bezug auf ein mit dem Krebs verknüpftes Gen zu verwenden, um andere verwandte Kandidaten menschlicher Gene zur Untersuchung zu identifizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Auf der Basis unserer Kenntnis von DNA-Fehlpaarungsreparaturmechanismen in Bakterien und Hefe, einschließlich der Konservierung von Fehlpaarungsreparaturgenen, haben wir gefolgert, dass menschliche DNA-Fehlpaarungsreparatur-Homologe existieren sollten, und dass es wahrscheinlich wäre, dass Mutationen bei solchen Homologen, welche die Proteinfunktion beeinträchtigen, eine genetische Instabilität verursachen werden, was möglicherweise zu einem erhöhten Risiko für die Entwicklung gewisser Formen von menschlichem Krebs führt.
Wir haben zwei menschliche Gene, hPMS1 und hMLH1, isoliert und sequenziert, welche jeweils für ein Protein codieren, das an der DNA-Fehlpaarungsreparatur beteiligt ist. hPMS1 und hMLH1 sind homolog zu mutL-Genen, die in E. coli gefunden werden. Unsere Studien unterstützen nachdrücklich eine Verbindung zwischen Mutationen bei DNA-Fehlpaarungsreparaturgenen und einer Suszeptibilität für HNPCC. Somit macht die Information über die Sequenz des DNA-Fehlpaarungsreparaturgens, nämlich die cDNA und genomische Strukturen in Bezug auf hMLH1 und hPMS1, eine Anzahl nützlicher Methoden bezüglich der Feststellung des Krebsrisikos und der Diagnose möglich. Eine große Zahl von Nukleotid- und Proteinstrukturen sind bei solchen Methoden nützlich.
Wir haben die Lage von hMLH1 auf dem menschlichen Chromosom 3p21-23 kartiert. Dieses ist ein Bereich des menschlichen Genoms, welcher basierend auf Familienstudien einen Genort beherbergt, der Individuen für HNPCC anfällig macht. Zusätzlich haben wir eine Mutation in einem konservierten Bereich der hMLH1-cDNA bei von HNPCC betroffenen Individuen aus einer schwedischen Familie gefunden. Die Mutation wird bei nicht betroffenen Individuen aus derselben Familie nicht gefunden, noch ist diese ein einfacher Polymorphismus. Wir haben ebenfalls gefunden, dass eine homologe Mutation in Hefe zu einem defekten DNA-Fehlpaarungsreparaturprotein führt. Wir haben ebenfalls eine Rasterverschiebungsmutation in hMLH1 von betroffenen Individuen aus einer englischen Familie gefunden. Unsere Entdeckung von mit Krebs verknüpften Mutationen in hMLH1, kombiniert mit der Kartenposition des Gens, welche mit einem vorher identifizierten mit HNPCC verknüpften Genort übereinstimmt, plus der wahrscheinlichen Rolle des hMLH1-Gens bei der Umgehung von Mutationen, macht aus dem hMLH1-Gen einen wichtigen Kandidaten, um einer Form von häufigem vererbtem menschlichen Krebs zugrunde zu liegen, und einen wichtigen Kandidaten, um Individuen zu screenen und zu identifizieren, die ein erhöhtes Risiko aufweisen, Krebs zu entwickeln.
hMLH1 hat 19 Exons und 18 Introns. Wir haben die Lage von jedem der 18 Introns in Bezug auf hMLH1-cDNA bestimmt. Wir haben ebenfalls die Struktur von allen Intron/-Exon-Grenzbereichen von hMLH1 bestimmt. Die Kenntnis der Intron/Exon-Grenzstruktu ren macht effiziente Screeningsysteme möglich, um Mutationen zu lokalisieren, welche die Struktur und Funktion von Genprodukten negativ beeinflussen. Weiterhin haben wird vollständige Sätze von Oligonukleotidprimerpaaren entworfen, welche in einer PCR verwendet werden können, um individuelle vollständige Exons zusammen mit umgebenden Introngrenzstrukturen zu amplifizieren.
Wir haben die Lage von hPMS1 auf dem menschlichen Chromosom 7 kartiert. Nachfolgende Studien von anderen³⁹ haben unsere Vorhersage bestätigt, dass Mutationen in diesem Gen mit HNPCC verknüpft sind.
Die unmittelbarste Anwendung der vorliegenden Erfindung werden Screeningtests an menschlichen Individuen sein, die Mitglieder von Familien sind, welche eine ungewöhnlich hohe Häufigkeit von früh ausbrechendem Krebs, z.B. HNPCC, zeigen. Dementsprechend umfasst ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der Suszeptibilität eines Patienten für Darmkrebs durch Detektieren einer Mutation in einer hMLH1-Nukleinsäure, wie sie in Anspruch 1 angegeben wird, oder einer hPMS1-Nukleinsäure, wie sie in Anspruch 3 angegeben wird, in einem Gewebe aus dem Patienten, wobei die Mutation ein Hinweis auf die Suszeptibilität des Patienten für Darmkrebs ist.
Das Verfahren zur Diagnose umfasst vorzugsweise die Schritte: 1) Amplifizieren eines Segments eines Fehlpaarungsreparaturgens oder Genprodukts aus einer isolierten Nukleinsäure; 2) Vergleichen des amplifizierten Segments mit einem analogen Segment eines Wildtyp-Allels des Fehlpaarungsreparaturgens oder Genprodukts; und 3) Detektieren eines Unterschieds zwischen dem amplifizierten Segment und dem analogen Segment, wobei der Unterschied ein Hinweis auf eine Mutation in dem Fehlpaarungsreparaturgen oder Genprodukt ist, welche eine Suszeptibilität für Darmkrebs verleiht.
Ein Verfahren kann die Bestimmung umfassen, ob der Unterschied zwischen dem amplifizierten Segment und dem analogen Wildtyp-Segment einen betroffenen Phänotyp hervorruft, d.h. ob die Veränderung der Sequenz die Fähigkeit des Individuums, DNA-Fehlpaarungen zu reparieren, beeinflusst.
Das Verfahren zur Diagnose kann die folgenden Schritte beinhalten: 1) Reverse Transkription des gesamten oder eines Teils einer RNA-Kopie eines DNA-Fehlpaarungsreparaturgens; und 2) Amplifizieren eines Segments der DNA, die durch reverse Transkription erzeugt wurde. Ein Amplifizierungsschritt kann umfassen: Auswählen eines Paares von Oligonukleotidprimern, welche an entgegengesetzte Stränge des Fehlpaarungsreparaturgens in einer entgegengesetzten Orientierung hybridisieren können; und Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion, welche die Oligonukleotidprimer benutzt, so dass die Nukleinsäure der Fehlpaarungsreparaturkette, die zwischen den Primern liegt, amplifiziert wird, um das amplifizierte Segment zu werden.
Das DNA-Fehlpaarungsreparaturgen ist hMLH1 oder hPMS1. Das Segment der DNA entspricht einem einzigartigen Abschnitt einer Nukleotidsequenz, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOS: 6-24. Oligonukleotidprimer der „ersten Stufe", die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOS: 44-82, werden bei der PCR verwendet, um das DNA-Segment zu amplifizieren. Verschachtelte (nested) Primer der „zweiten Stufe" (SEQ ID NOS: 83-122) können zusammen mit den Primern der ersten Stufe verwendet werden, um eine spezifischere Amplifikation und Konservierung der Matrizen-DNA zu erlauben.
Ein Verfahren der Identifizierung und Klassifizierung eines Tumors mit einem DNA-Fehlpaarungsreparaturdefekt kann das Detektieren in einem Tumor einer Mutation in einem Fehlpaarungsreparaturgen oder Genprodukt, vorzugsweise einem mutL-Homologen (hMLH1 oder hPMS1) umfassen, wobei die Mutation ein Hinweis auf einen Defekt in einem Fehlpaarungsreparatursystem des Tumors ist.
Eine isolierte Nukleotid- oder Proteinstruktur kann ein Segment einschließen, das in der Sequenz einem einzigartigen Abschnitt eines menschlichen mutL-homologen Gens oder Genprodukts entspricht, welches vorzugsweise entweder von hMLH1 oder hPMS1 abgeleitet ist.
Oligonukleotidprimer können zusammen in einer Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, um spezifisch ein einzigartiges Segment eines menschlichen mutL-homolgen Gens, vorzugsweise hMLH1 oder hPMS1, zu amplifizieren.
Eine Sonde kann eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, spezifisch durch Watson/Crick-Paarbildung an komplementäre Basen in einem Abschnitt eines menschlichen mutL-homologen Gens zu binden; und eine Markergruppe, welche an der Sequenz befes tigt ist, einschließen, wobei die Markergruppe eine Eigenschaft hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Fluoreszenz, Radioaktivität und Chemilumineszenz.
Wir haben ebenfalls MLH1 (mMLH1)- und PMS1 (mPMS1)-Gene aus Mäusen isoliert und sequenziert. Wir haben unsere Kenntnis der Fehlpaarungsreparaturgene von Mäusen verwendet, um Tiermodelle zur Untersuchung von Krebs zu konstruieren. Die Modelle werden nützlich sein, um zusätzliche Onkogene zu identifizieren und um Umwelteinflüsse auf die Mutagenese zu studieren.
Wir haben polyklonale Antikörper erzeugt, die gegen einen Teil des Proteins, das durch die mPMS1-cDNA codiert wurde, gerichtet waren. Die Antikörper reagieren ebenfalls mit hPMS1-Protein und sind nützlich, um das Vorliegen des Proteins, das durch ein normales hPMS1-Gen codiert wird, nachzuweisen. Wir erzeugen ebenfalls monoklonale Antikörper, die gegen hMLH1 und hPMS1 gerichtet sind.
Zusätzlich zu diagnostischen und therapeutischen Anwendungen für die Gene kann unsere Kenntnis von hMLH1 und hPMS1 verwendet werden, um andere Gene mit verwandter Funktion zu suchen, welche Kandidaten dafür sind, bei gewissen Formen von menschlichem Krebs eine Rolle zu spielen.
Beschreibung der Figuren
1 ist ein Flussdiagramm, welches einen Überblick über die Abfolge von experimentellen Schritten zeigt, die wir verwendet haben, um PMS1- und MLH1-Gene von Menschen und Mäusen zu isolieren, zu charakterisieren und zu verwenden.
2 ist eine Ausrichtung (alignment) von Proteinsequenzen für mutL-Homologe (SEQ ID NOS: 1-3), welche zwei in hohem Maße konservierte Bereiche (unterstrichen) zeigt, welche wir verwendet haben, um degenerierte PCR-Oligonukleotide zur Isolierung weiterer mutL-Homologer zu schaffen.
3 zeigt die gesamte cDNA-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 4) für das menschliche MLH1-Gen und die entsprechende vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5) für das menschliche MLH1-Protein. Die unterstrichenen DNA-Sequenzen sind die Bereiche der cDNA, die den degenerierten PCR-Primern entsprechen, die ursprünglich ver wendet wurden, um einen Teil des MLH1-Gens zu amplifizieren (Nukleotide 118-135 und 343-359).
4A zeigt die Nukleotidsequenzen der 19 Exons, welche zusammen der gesamten hMLH1-cDNA-Struktur entsprechen. Die Exons sind von Intron-Grenzstrukturen flankiert. Primerstellen sind unterstrichen. Die Exons mit deren flankierenden Intronstrukturen entsprechen den SEQ ID NOS: 6-24. Die Exons, die in nicht unterstrichenen kleinen Buchstaben gezeigt sind, entsprechen den SEQ ID NOS: 25-43.
4B zeigt Nukleotidsequenzen von Primerpaaren, welche bei der PCR verwendet wurden, um die einzelnen Exons zu amplifizieren. Die Amplifikationsprimer der „zweiten Stufe" (SEQ ID NOS: 83-122) sind „verschachtelte" Primer, die verwendet werden, um Zielexons aus dem Amplifikationsprodukt, das mit den entsprechenden Amplifikationsprimern der „ersten Stufe" (SEQ ID NOS: 44-82) erhalten wurde, zu amplifizieren. Die Strukturen in 4B entsprechen den Strukturen in den Tabellen 2 und 3.
5 ist eine Ausrichtung der vorhergesagten Aminosäuresequenzen für MLH1-Proteine von Menschen und Hefe (SEQ ID NOS: 5 bzw. 123). Aminosäureidentitäten sind durch Kästchen angegeben und Lücken sind durch Striche angegeben.
6 ist ein phylogenetischer Baum von MutL-verwandten Proteinen.
7 ist eine Photographie mit zwei Feldern. Das erste Feld (A) ist eine Metaphase-Verteilung (spread), welche eine Hybridisierung des hMLH1-Gens von Chromosom 3 zeigt. Das zweite Feld (B) ist eine Zusammensetzung von Chromosom 3 aus mehreren Metaphase-Verteilungen, ausgerichtet mit einem Ideogramm des menschlichen Chromosoms 3. Der Bereich der Hybridisierung wird in dem Ideogramm durch einen vertikalen Balken angezeigt.
8 ist ein Vergleich von Sequenzchromatogrammen von betroffenen und nicht betroffenen Individuen, welcher die Identifizierung einer Übergangsmutation von C nach T zeigt, welche eine nicht konservative Aminosäuresubstitution an Position 44 des hMLH1-Proteins erzeugt.
9 ist eine Aminosäuresequenz-Ausrichtung (SEQ ID NOS: 124-131) des in hohem Maße konservierten Bereichs der MLH-Familie von Proteinen, welcher die Stelle der vorhergesagten Aminosäuresubstitution umgibt. Das fett Gedruckte zeigt die Position der vorhergesagten Aminosäuresubstitution von Serin zu Phenylalanin bei betroffenen Individuen. Ebenso hervorgehoben sind die Serin- oder Alaninreste, die an dieser Position bei MutL-ähnlichen Proteinen konserviert sind. Punkte zeigen Positionen mit höchster Aminosäurekonservierung. Für das MLH1-Protein zeigen die Punkte, dass die Sequenz nicht erhalten wurde. Die Sequenzen wurden wie nachstehend in Bezug auf den phylogenetischen Baum von 6 beschrieben ausgerichtet.
10 zeigt die gesamte Nukleotidsequenz für hPMS1 (SEQ ID NO: 132).
11 ist eine Ausrichtung der vorhergesagten Aminosäuresequenzen für menschliche und Hefe-PMS1-Proteine (SEQ ID NOS: 133 bzw. 134). Aminosäureidentitäten sind durch Kästchen angezeigt, und Lücken sind durch Striche angezeigt.
12 ist eine partielle Nukleotidsequenz der MLH1 (mMLH1)-cDNA von Mäusen (SEQ ID NO: 135).
13 ist ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz für mMLH1- und hMLH1-Proteine (SEQ ID NOS: 136 bzw. 5).
14 zeigt die cDNA-Nukleotidsequenz für PMS1 (mPMS1) von Mäusen (SEQ ID NO: 137).
15 ist ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen für mPMS1- und hPMS1-Proteine (SEQ ID NOS: 138 bzw. 133).
Definitionen
Gen – „Gen" bedeutet eine Nukleotidsequenz, die eine vollständige codierende Sequenz enthält. (m Allgemeinen umfassen „Gene" ebenfalls Nukleotidsequenzen, die stromaufwärts (z.B. Promotorsequenzen, Verstärker (enhancer) usw.) oder stromabwärts (z.B. Transkriptionsterminationssignale, Polyadenylierungsstellen usw.) der codierenden Sequenz gefunden werden, welche die Expression des codierten Polypeptids beeinflussen.
Genprodukt – Ein „Genprodukt" ist entweder eine DNA- oder RNA (mRNA)-Kopie eines Teils eines Gens oder eine entsprechende Aminosäuresequenz, die von der mRNA translatiert wurde.
Wildtyp – Der Ausdruck „Wildtyp" bedeutet, wenn er auf Nukleinsäuren und Proteine angewendet wird, eine Version einer Nukleinsäure oder eines Proteins, die in einer Weise funktioniert, die von der natürlich vorkommenden, normalen Version dieser Nukleinsäure oder dieses Proteins (d.h. einer Nukleinsäure oder einem Protein mit Wildtyp-Aktivität) nicht unterschieden werden kann. Beispielsweise ist ein „Wildtyp"-Allel eines Fehlpaarungsreparaturgens in der Lage, eine normale, endogene Kopie desselben Gens innerhalb einer Wirtszelle funktionell zu ersetzen, ohne die Fehlpaarungsreparatur in dieser Zelle nachweisbar zu verändern. Verschiedene Wildtyp-Versionen derselben Nukleinsäure oder des Proteins können sich strukturell voneinander unterscheiden oder nicht.
Nicht Wildtyp – Der Ausdruck „nicht Wildtyp" bedeutet, wenn er auf Nukleinsäuren und Proteine angewendet wird, eine Version einer Nukleinsäure oder eines Proteins, die in einer Weise funktioniert, die von der natürlich vorkommenden, normalen Version dieser Nukleinsäure oder dieses Proteins unterscheidbar ist. Nicht Wildtyp-Allele einer Nukleinsäure können sich strukturell von Wildtyp-Allelen derselben Nukleinsäure in irgendeiner von einer Vielzahl von Weisen unterscheiden, einschließlich Unterschieden bei der Aminosäuresequenz eines codierten Polypeptids und/oder Unterschieden bei den Expressionsspiegeln eines codierten Nukleotidtranskriptes des Polypeptidprodukts, aber nicht darauf beschränkt.
Beispielsweise kann sich die Nukleotidsequenz eines nicht Wildtyp-Allels einer Nukleinsäure von der eines Wildtyp-Allels z.B. durch Addition, Deletion, Substitution und/oder Umordnung von Nukleotiden unterscheiden. In ähnlicher Weise kann sich die Aminosäuresequenz eines nicht Wildtyp-Fehlpaarungsreparaturproteins von der eines Wildtyp-Fehlpaarungsreparaturproteins z.B. durch Addition, Substitution und/oder Umordnung von Aminosäuren unterscheiden.
Besondere nicht Wildtyp-Nukleinsäuren oder Proteine, die, wenn sie in eine normale Wirtszelle eingeführt werden, den endogenen Fehlpaarungsreparaturweg stören, werden „dominant negative" Nukleinsäuren oder Proteine genannt.
homolog – Der Ausdruck „homolog" bezieht sich auf Nukleinsäuren oder Polypeptide, die in hohem Maße auf dem Niveau der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz verwandt sind. Nukleinsäuren oder Polypeptide, die zueinander homolog sind, werden „Homologe" genannt.
Der Ausdruck „homolog" bezieht sich notwendigerweise auf einen Vergleich zwischen zwei Sequenzen. Zwei Nukleotidsequenzen werden als homolog betrachtet, wenn die Polypeptide, welche diese codieren, für wenigstens eine Strecke von wenigstens 20 Aminosäuren zu wenigstens ca. 50-60% identisch, vorzugsweise ca. 70% identisch sind. Vorzugsweise sind homologe Nukleotidsequenzen ebenfalls durch die Fähigkeit gekennzeichnet, eine Strecke von wenigstens 4-5 einzigartig aufgeführten Aminosäuren zu codieren. Sowohl die Identität als auch der ungefähre Abstand dieser Aminosäuren in Bezug auf einander muss in Betracht gezogen werden, damit Nukleotidsequenzen als homolog betrachtet werden. Für Nukleotidsequenzen von weniger als 60 Nukleotiden in der Länge wird die Homologie durch die Fähigkeit bestimmt, eine Strecke von wenigstens 4-5 einzigartig aufgeführten Aminosäuren zu codieren.
stromaufwärts/stromabwärts – Die Ausdrücke „stromaufwärts" und „stromabwärts" sind auf dem Gebiet der Technik verstandene Ausdrücke, welche sich auf die Position eines Elements der Nukleotidsequenz beziehen. „Stromaufwärts" bedeutet ein Element, das mehr zu 5' hin liegt als das Bezugselement. „Stromabwärts" bezieht sich auf ein Element, das mehr zu 3' hin liegt als ein Bezugselement.
Intron/Exon – Die Ausdrücke „Exon" und „Intron" sind auf dem Gebiet der Technik verstandene Ausdrücke, welche sich auf verschiedene Abschnitte von genomischen Gensequenzen beziehen. „Exons" sind jene Abschnitte einer genomischen Gensequenz, die ein Protein codieren. „Introns" sind Sequenzen von Nukleotiden, die zwischen Exons in genomischen Gensequenzen gefunden werden.
betroffen – Der Ausdruck „betroffen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jene Mitglieder einer Verwandtschaft, die entweder einen charakteristischen Krebs entwickelt haben (z.B. Darmkrebs bei einem HNPCC-Stammbaum) und/oder für die z.B. auf der Basis von genetischen Studien vorausgesagt wurde, dass diese eine ererbte Mutation tragen, welche eine Suszeptibilität für Krebs verleiht.
einzigartig – Ein „einzigartiges" Segment, Fragment oder ein Abschnitt eines Gens oder Proteins bedeutet einen Abschnitt eines Gens oder Proteins, welcher in der Sequenz von jedem anderen Gen- oder Proteinsegment in dem Genom eines Individuums verschieden ist. In der Praxis wird ein einzigartiges Segment oder Fragment eines Gens typischerweise ein Nukleotid von wenigstens ca. 13 Basen in der Länge sein und wird hinreichend verschieden sein von anderen Gensegmenten, so dass Oligonukleotidprimer entworfen und verwendet werden können, um das Segment selektiv und spezifisch zu amplifizieren. Ein einzigartiges Segment eines Proteins ist typischerweise eine Aminosäuresequenz, welche von einem einzigartigen Segment eines Gens translatiert werden kann.
Referenzen
Auf die folgenden Veröffentlichungen wird in dem Text der Anmeldung durch die Ziffern Bezug genommen. Auf jede der Veröffentlichungen wird hier vollinhaltlich Bezug genommen.

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Beschreibung der Erfindung
Wir haben Säugetiergene entdeckt, welche an der Reparatur von DNA-Fehlpaarungen beteiligt sind. Eines der Gene, hPMS1, codiert ein Protein, das zu dem DNA-Fehlpaarungsreparaturprotein PMS1 von Hefe homolog ist. Wir haben die Lage von hPMS1 auf dem menschlichen Chromosom 7 und des Maus-PMS1-Gens auf dem Mauschromosom 5, Bande G, kartiert. Ein weiteres Gen, hMLH1 (MutL-Homologes), codiert ein Protein, das zu dem DNA-Fehlpaarungsreparaturprotein MLH1 von Hefe homolog ist. Wir haben die Lage von hMLH1 auf dem menschlichen Chromosom 3p21.3-23 und dem Mauschromosom 5, Bande E, kartiert.
Studien^1,2 haben die Beteiligung eines menschlichen DNA-Fehlpaarungsreparaturgen-Homologen, hMSH2, auf dem Chromosom 2p bei HNPCC gezeigt. Auf der Basis von Verknüpfungsdaten wurde ein zweiter HNPCC-Genort dem Chromosom 3p21-23 zugeordnet.³ Die Untersuchung von Tumor-DNA aus den Chromosom 3-verknüpften Verwandtschaften zeigte eine Dinukleotidwiederholungsinstabilität ähnlich zu der, die für andere HNPCC-Familien⁶ und mehrere Typen von sporadischen Tumoren beobachtet wurde.^7-10 Da die Dinukleotidwiederholungsinstabilität ein charakteristisches Merkmal für einen Defekt bei der DNA-Fehlpaarungsreparatur ist,^5,11,12 haben wir gefolgert, dass ein mit dem Chromosom 3p21-23 verknüpfter HBPCC aus einer Mutation in einem zweiten DNA-Fehlpaarungsreparaturgen resultieren könnte.
Die Reparatur von fehlgepaarter DNA in Escherichia coli erfordert eine Anzahl von Genen, einschließlich mutS, mutL und mutH, wobei Defekte bei irgendeinem von diesen zu erhöhten spontanen Mutationsraten führen.¹³ Eine genetische Analyse bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae hat drei DNA-Fehlpaarungsgene identifiziert: ein mutS-Homologes, MSH2,¹⁴ und zwei mutL-Homologe, PMS1¹⁶ und MLH1.⁴ Jedes dieser drei Gene spielt eine unverzichtbare Rolle bei der DNA-Replikationsgenauigkeit, einschließlich der Stabilisierung von Dinukleotidwiederholungen.⁵
Wir glauben, dass hMLH1 das HNPCC-Gen ist, das vorher mit dem Chromosom 3p verknüpft wurde, auf der Basis der Ähnlichkeit des hMLH1-Genprodukts mit dem DNA-Fehlpaarungsreparaturprotein von Hefe, MLH1,⁴ der übereinstimmenden Lage des hMLH1-Gens und des HNPCC-Genortes auf dem Chromosom 3 und der hMLH1-Missense-Mutationen, welche wir in betroffenen Individuen aus Chromosom 3-verknüpften HNPCC-Familien gefunden haben.
Unsere Kenntnis der MLH1- und PMS1-Genstrukturen von Mensch und Maus hat viele wichtige Anwendungen. Die Gensequenzinformation kann verwendet werden, um Individuen auf ein Krebsrisiko hin zu screenen. Die Kenntnis der Genstrukturen macht es möglich, leicht PCR-Primer zu entwerfen, welche verwendet werden können, um Abschnitte der hMLH1- und hPMS1-Gene für einen nachfolgenden Vergleich mit der normalen Sequenz und eine Analyse des Krebsrisikos selektiv zu amplifizieren. Dieser Typ Test macht es ebenfalls möglich, mit Krebs verknüpfte Mutationen von hMLH1 und hPMS1 zu suchen und zu charakterisieren, zu dem Zweck, die Anstrengungen des Krebsscreenings eventuell auf spezifische Genorte zu fokussieren. Eine spezifische Charakterisierung von mit Krebs verknüpften Mutationen in hMLH1 und hPMS1 macht die Produktion von anderen wertvollen diagnostischen Werkzeugen wie z.B. allelspezifischen Sonden möglich, welche in Screeningtests verwendet werden können, um das Vorliegen oder Fehlen von spezifischen Genmutationen festzustellen.
Zusätzlich kann die Gensequenzinformation für hMLH1 und/oder hPMS1 z.B. in einem Zweihybridsystem verwendet werden, um nach anderen Genen mit verwandter Funktion zu suchen, welche Kandidaten für eine Beteiligung an Krebs sind.
Die hMLH1- und hPMS1-Genstrukturen sind nützlich, um Proteine zu erzeugen, welche verwendet werden, um Antikörper zu entwickeln, die gegen spezifische Abschnitte oder die vollständigen hMLH1- und hPMS1-Proteine gerichtet sind. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das entsprechende Protein und möglicherweise verwandte Proteine zur Forschung und für diagnostische Zwecke zu isolieren.
Die Maus-MLH1- und PMS1-Gensequenzen sind nützlich, um Mäuse zu erzeugen, die Mutationen in dem entsprechenden Gen aufweisen. Die Mutantenmäuse sind nützlich, um die Funktion des Gens, insbesondere seine Beziehung zu Krebs, zu untersuchen.
Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Säugetier-MLH1- und PMS1-Genen
Wir haben vier Säugetiergene, d.h. menschliches MLH1 (hMLH1), menschliches PMS1 (hPMS1), Maus-MLH1 (mPMS1) und Maus-PMS1 (mPMS1) isoliert und charakterisiert. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zwischen diesen Genen sind die Methoden, die wir eingesetzt haben, um diese zu isolieren und charakterisieren, im Allgemeinen dieselben. 1 zeigt in allgemeinen Ausdrücken den experimentellen Ansatz, den wir verwendet haben, um die vier Gene zu isolieren und charakterisieren. Die folgende Diskussion bezieht sich auf das schrittweise Verfahren, das in 1 gezeigt ist.
Schritt 1 Planung von degenerierten Oligonukleotidpools zur PCR
Frühere Berichte haben gezeigt, dass Teile der drei MutL-ähnlichen Proteine, zwei aus Bakterien, MutL und HexB, und eines aus Hefe, PMS1, in hohem Maße konserviert sind.^16,18,19 Nach Durchsicht der Aminosäuresequenzen der HexB-, MutL- und PMS1-Proteine haben wir, wie in 2 gezeigt ist, Pools von degenerierten Oligonukleotidpaaren, welche zwei in hohem Maße konservierten Bereichen, KELVEN und GFRGEA der MutL-ähnlichen Proteine entsprachen, entworfen. Die Sequenzen (SEQ ID NOS: 139 bzw. 140) der degenerierten Oligonukleotide, welche wir verwendet haben, um die vier Gene zu isolieren, sind:
5'-CTTGATTCTAGAGC(T/C)TCNCCNC(T/G)(A/G)AANCC-3' und
5'-AGGTCGGAGCTCAA(A/G)GA(A/G)(T/C)TNGTNGANAA-3'.
Die unterstrichenen Sequenzen innerhalb der Primer sind XbaI- bzw. SacI-Restriktionsendonukleasestellen. Sie wurden eingeführt, um die Klonierung der PCR-amplifizierten Fragmente zu erleichtern. Bei der Planung der Oligonukleotide haben wir die Tatsache berücksichtigt, dass eine gegebene Aminosäure durch mehr als ein DNA-Triplett (Codon) codiert werden kann. Die Degeneriertheit innerhalb dieser Sequenzen ist durch mehrfache Nukleotide in Klammern oder N für das Vorliegen einer beliebigen Base an dieser Position angegeben.
Schritt 2 Reverse Transkription und PCR an mit poly A + selektierter mRNA, die aus menschlichen Zellen isoliert wurde
Wir haben Boten (poly A + angereichert)-RNA aus kultivierten menschlichen Zellen isoliert, doppelsträngige cDNA aus der mRNA synthetisiert, und eine PCR mit den degenerierten Oligonukleotiden durchgeführt.⁴ Nach dem Ausprobieren einer Anzahl von verschiedenen PCR-Bedingungen, beispielsweise dem Einstellen der Annealing-Temperatur, haben wir erfolgreich eine DNA der für ein MutL-Protein vorhergesagten Größe (~210 bp) amplifiziert.
Schritt 3 Klonieren und Sequenzieren von mittels PCR erzeugten Fragmenten; Identifizierung von zwei Genfragmenten, welches menschliches PMS1 und MLH1 repräsentieren
Wir haben das PCR-amplifizierte Material (~210 bp) aus einem Agarosegel isoliert und dieses Material in ein Plasmid (pUC19) kloniert. Wir haben die DNA-Sequenz von mehreren verschiedenen Klonen bestimmt. Die Aminosäuresequenz, die aus der DNA-Sequenz von zwei Klonen abgeleitet wurde, zeigte eine starke Ähnlichkeit mit anderen bekannten MutL-ähnlichen Proteinen.^4,16,18,19 Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für einen der Klone war am ähnlichsten zu dem Hefe-PMS1-Protein. Daher haben wir diesen hPMS1, für menschliches (humanes) PMS1, genannt. Bei dem zweiten Klon wurde gefunden, dass dieser ein Polypeptid codiert, das am meisten dem Hefe-MLH1-Protein gleicht, und dieser wurde hMLH1, für menschliches MLH1, genannt.
Schritt 4 Isolierung von vollständigen PMS1- und MLH1-cDNA-Klonen von Mensch und Maus unter Verwendung der PCR-Fragmente als Sonden
Wir haben die mittels PCR erzeugten 210 bp-Fragmente der hMLH1- und hPMS1-cDNAs als Sonden verwendet, um cDNA-Bibliotheken von sowohl Mensch als auch Maus (von Stratagene, oder wie in Referenz 30 beschrieben) zu screenen. Eine Anzahl von cDNAs wurde isoliert, welche diesen zwei Genen entsprach. Viele der cDNAs waren an dem 5'-Ende trunkiert. Wenn es nötig war, wurden zusätzlich zu einem weiterem Screenen von cDNA-Bibliotheken PCR-Techniken³¹ verwendet, um das 5'-Ende des Gens zu erhalten. Vollständige zusammengesetzte cDNA-Sequenzen wurden verwendet, um die Aminosäuresequenz der MLH1- und PMS1-Proteine von Mensch und Maus vorherzusagen.
Schritt 5 Isolierung von genomischen PMS1- und MLH1-Klonen von Mensch und Maus
Informationen über die genomische und die cDNA-Struktur der menschlichen MLH1- und PMS1-Gene sind notwendig, um in für Krebs anfälligen Familien gründlich nach Mutationen zu screenen. Wir haben menschliche cDNA-Sequenzen als Sonden verwendet, um die genomischen Sequenzen von menschlichem PMS1 und MLH1 zu isolieren. Wir haben vier Cosmide und zwei P1-Klone für hPMS1 isoliert, die zusammen wahrscheinlich das Meiste der, wenn nicht die gesamte cDNA (Exon)-Sequenz enthalten. Für hMLH1 haben wir vier überlappende λ-Phagen-Klone, welche genomische 5'-MLH1-Sequenzen enthielten, und vier P1-Klone isoliert (zwei Klone mit voller Länge und zwei, welche das codierende 5'-Ende plus Teile der Promotorregion beinhalten) P1-Klon. Eine PCR-Analyse unter Verwendung von Paaren von Oligonukleotiden, die für die 5'- und 3'-Enden der hMLH1-cDNA spezifisch sind, zeigten klar, dass der P1-Klon die vollständige hMLH1- cDNA-Information enthält. In ähnlicher Weise sind genomische Klone für Maus-PMS1- und MLH1-Gene isoliert und teilweise charakterisiert worden (beschrieben in Schritt 8).
Schritt 6 Chromosomenpositionskartierung der PMS1- und MLH1-Gene von Mensch und Maus durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
Wir haben genomische Klone, die aus PMS1 und MLH1 von Mensch und Maus isoliert wurden, zur chromosomalen Lokalisierung durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) verwendet.^20,21 Wir haben das menschliche MLH1-Gen auf dem Chromosom 3p21.3-23, das in 7 gezeigt ist, kartiert, wie nachstehend detaillierter diskutiert wird. Wir haben das Maus-MLH1-Gen auf dem Chromosom 9, Bande E, einem Bereich mit Syntenie zwischen Maus und Mensch, kartiert.²² Zusätzlich zu FISH-Techniken haben wir eine PCR mit einem Paar von hMLH1-spezifischen Oligonukleotiden verwendet, um DNA aus einer somatischen Nagetier/Mensch-Zellhybrid-Kartierungsgruppe (Coriell Institute for Medical Research, Camden, N.J.) zu analysieren. Unsere PCR-Ergebnisse mit der Gruppe zeigen klar, dass hMLH1 auf dem Chromosom 3 kartiert wird. Die Position von hMLH1 3p21.3-23 stimmt mit einer Region überein, von der auf der Basis von Verknüpfungsdaten bekannt ist, dass diese einen zweiten Genort für HNPCC beherbergt.
Wir haben das hPMS1-Gen, wie in 12 gezeigt, auf dem langen (q) Arm von Chromosom 7 (entweder 7q11 oder 7q22) und das Maus-PMS1 auf Chromosom 5, Bande G, kartiert, zwei Bereichen mit Syntenie zwischen dem Menschen und der Maus.²² Wir haben eine PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, die für hPMS1 spezifisch waren, mit DNA aus einer Nagetier/Mensch-Zellgruppe durchgeführt. In Übereinstimmung mit den FISH-Daten wurde bestätigt, dass die Lage von hPMS1 auf dem Chromosom 7 war. Diese Beobachtungen versichern uns, dass unsere Position für hPMS1 auf der menschlichen Karte auf Chromosom 7 korrekt ist. Die physikalische Lokalisierung von hPMS1 ist zu dem Zweck nützlich, Familien zu identifizieren, die möglicherweise eine mit Krebs verknüpfte Mutation in hPMS1 aufweisen.
Schritt 7 Verwendung von genomischen und cDNA-Sequenzen, um Mutationen in den hPMS1- und hMLH1-Genen aus HNPCC-Familien zu identifizieren
Wir haben Proben, die von Individuen aus HNPCC-Familien gesammelt wurden, zu dem Zweck, Mutationen in den hPMS1- oder hMLH1-Genen zu identifizieren, analysiert. Unser Ansatz ist es, auf der Basis unserer Kenntnis der Genstrukturen PCR-Primer zu entwerfen, um Exon/Intron-Segmente zu erhalten, welche wir mit den bekannten normalen Sequenzen vergleichen können. Wir bezeichnen diesen Ansatz als ein „Exon-Screening".
Unter Verwendung der cDNA-Sequenzinformation haben wir hPMS1- und hMLH1-spezifische Oligonukleotide entworfen und fahren fort, diese zu entwerfen, um Exon/Intron-Grenzen innerhalb genomischer Sequenzen darzustellen. Die hPMS1- und hMLH1-spezifischen Oligonukleotide wurden verwendet, um genomische Klone auf das Vorliegen von Exons, welche diese Sequenz enthielten, hin zu sondieren. Oligonukleotide, die hybridisierten, wurde als Primer für eine DNA-Sequenzierung ausgehend von den genomischen Klonen verwendet. Exon-Intron-Verbindungsstellen wurden identifiziert, indem genomische mit cDNA-Sequenzen verglichen wurden.
Eine Amplifikation von spezifischen Exons ausgehend von genomischer DNA durch PCR und eine Sequenzierung der Produkte ist eine Methode, um HNPCC-Familien auf Mutationen hin zu screenen.^1,2 Wir haben genomische Klone, die hMLH1-cDNA-Information enthielten, identifiziert und haben die Strukturen von allen Intron/Exon-Grenzbereichen, welche die 19 Exons von hMCH1 flankieren, bestimmt.
Wir haben den Exon-Screening-Ansatz verwendet, um das MLH1-Gen von Individuen aus HNPCC-Familien, die eine Verknüpfung mit Chromosom 3 zeigten, zu untersuchen.³ Wie nachstehend detaillierter diskutiert werden wird, haben wir eine Mutation in dem MLH1-Gen einer solchen Familie identifiziert, welche in einer Substitution von C durch T bestand. Wir sagen vorher, dass die Mutation von C nach T eine Substitution von Serin durch Phenylalanin in einem in hohem Maße konservierten Bereich des Proteins verursacht. Wir fahren fort, HNPCC-Familien zu identifizieren, von welchen wir Proben erhalten können, um zusätzliche Mutationen in den hMLH1- und hPMS1-Genen zu finden.
Wir verwenden ebenfalls einen zweiten Ansatz, um Mutationen in hPMS1 und hMLH1 zu identifizieren. Der Ansatz ist, hPMS1- oder hMLH1-spezifische Oligonukleotidprimer zu entwerfen, um cDNA des ersten Strangs durch reverse Transkription von RNA zu erhalten. Eine PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern wird uns erlauben, spezifische Bereiche von diesen Genen zu amplifizieren. Eine DNA-Sequenzierung der amplifizierten Fragmente wird uns erlauben, Mutationen zu detektieren.
Schritt 8 Planung von Zielvektoren, um Maus-PMS1- und MLH1-Gene in ES-Zellen aufzubrechen; Untersuchung von Mäusen, die einen Mangel bei der Reparatur von Fehlpaarungen aufweisen.
Wir haben einen auf ein Gen abzielenden Vektor auf der Grundlage unserer Kenntnis der genomischen Maus-PMS1-DNA-Struktur konstruiert. Wir haben den Vektor verwendet, um das PMS1-Gen in embryonalen Stammzellen von Mäusen aufzubrechen.³⁶ Die Zellen wurden in Mausblastozysten injiziert, welche sich zu Mäusen entwickelten, die chimär (Mischungen) im Hinblick auf Zellen sind, welche die PMS1-Mutation tragen. Die chimären Tiere werden verwendet, um Mäuse zu züchten, die im Hinblick auf die PMS1-Mutation heterozygot und homozygot sind. Diese Mäuse werden nützlich sein, um die Rolle des PMS1-Gens im gesamten Organismus zu untersuchen.
Menschliches MLH1
Die folgende Diskussion ist eine detailliertere Erklärung unserer experimentellen Arbeit in Bezug auf hMLH1. Wie oben erwähnt wurde, haben wir, um Säugetier-MLH-Gene zu klonieren, PCR-Techniken wie jene verwendet, die benutzt wurde, um die MSH1-, MSH2- und MLH1-Gene von Hefe und das menschliche MSH2-Gen zu identifizieren.^1,2,4,14 Als Matrize bei der PCR haben wir doppelsträngige cDNA verwendet, die aus poly (A +)-angereicherter RNA synthetisiert wurde, welche aus kultivierten primären menschlichen Fibroblasten präpariert wurde. Die degenerierten Oligonukleotide zielten auf die N-terminalen Aminosäuresequenzen KELVEN und GFRGEA (siehe 3), zwei der am meisten konservierten Bereiche der MutL-Proteinfamilie, die vorher für Bakterien und Hefe beschrieben wurden.^16,18,19 Zwei PCR-Produkte mit der vorhergesagten Größe wurden identifiziert, kloniert und es wurde von ihnen gezeigt, dass diese eine vorhergesagte Aminosäuresequenz mit Homologie zu MutL-Proteinen codierten. Diese zwei Fragmente, die durch PCR erzeugt wurden, wurden verwendet, um menschliche cDNA und genomische DNA-Klone zu isolieren.
Die Oligonukleotidprimer, die wir verwendet haben, um menschliche mit MutL verwandte Sequenzen zu amplifizieren, waren 5'-CTTGATTCTAGAGC(T/C)TCNCCNC(T/G)(A/G)-AANCC-3' (SEQ. ID NO: 139) und 5'-AGGTCGGAGCTCAA(A/G)GA(A/G)(T/C)TNGTNG-ANAA-3' (SEQ. ID NO: 140). Eine PCR wurde in 50 μl-Reaktionen durchgeführt, die cDNA-Matrize, 1,0 μM jedes Primers, 5 IU Taq-Polymerase (C) 50 mM KCl, 10 mM Tris- Puffer pH 7,5 und 1,5 mM MgCl enthielten. Die PCR wurde für 35 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 43°C und 1,5 Minuten bei 62°C durchgeführt. Fragmente mit der erwarteten Größe, ungefähr 212 bp, wurden in pUC19 kloniert und sequenziert. Die klonierten MLH1-PCR-Produkte wurden mit einem Zufallsprimermarkierungskit (RadPrime, Gibco BRL) markiert und verwendet, um menschliche cDNA und genomische Cosmid-Bibliotheken durch Standardverfahren zu sondieren. Die DNA-Sequenzierung von doppelsträngigen Plasmid-DNAs wurde wie früher beschrieben durchgeführt.¹
Die hMLH1-cDNA-Nukleotidsequenz, wie sie in 3 gezeigt ist, codiert ein offenes Leseraster von 2268 bp. Ebenfalls gezeigt in 3 ist die vorhergesagte Proteinsequenz, die durch die hMLH1-cDNA codiert wird. Die unterstrichenen DNA-Sequenzen sind die Bereiche der cDNA, welche den degenerierten PCR-Primern entsprechen, die ursprünglich verwendet wurden, um einen Teil des MLH1-Gens (Nukleotide 118-135 und 343-359) zu amplifizieren.
4A zeigt 19 Nukleotidsequenzen, welche Teilen von hMLH1 entsprechen. Jede Sequenz beinhaltet eines der 19 Exons in seiner Gesamtheit, umgeben von flankierenden Intronsequenzen. Die Ziel-PCR-Primerstellen sind unterstrichen. Mehr Details in Bezug auf die Ableitung und die Verwendungen der in 4A gezeigten Sequenzen sind nachstehend angegeben.
Wie in 5 gezeigt wird, ist das hMLH1-Protein aus 756 Aminosäuren zusammengesetzt und ist zu 41 % mit dem Proteinprodukt des Hefe-DNA-Fehlpaarungsreparaturgens, MLH1, identisch.⁴ Die Regionen, des hMLH1-Proteins, die am ähnlichsten sind zu Hefe-MLH1, entsprechen den Aminosäuren 11 bis 317, welche 55% Identität zeigen, und den letzten 13 Aminosäuren, welche bei den zwei Proteinen identisch sind. 5 zeigt eine Ausrichtung des vorhergesagten menschlichen MLH1 und von S. cerevisiae MLH1-Proteinsequenzen. Aminosäureidentitäten sind durch Kästchen angegeben, und Lücken sind durch Striche angegeben. Die paarweise Proteinsequenzausrichtung wurde mit DNAStar MegAlign, welches die Clustal-Methode verwendet, durchgeführt.²⁷ Paarweise Ausrichtungsparameter waren ein Ktuple von 1, eine Gap penalty von 3, ein Fenster von 5 und Diagonalen von 5. Weiterhin zeigen, wie in 13 gezeigt ist, die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der MLH1-Proteine von Mensch und Maus wenigstens 74% Identität.
6 zeigt einen phylogenetischen Baum von MutL-verwandten Proteinen. Der phylogenetische Baum wurde konstruiert, indem die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von 7 MutL-verwandten Proteinen verwendet wurden: menschliches MLH1; Maus-MLH1; S. cerevisiae MLH1; S. cerevisiae PMS1; E. coli MutL; S. typhimurium MutL und S. pneumoniae HexB. Benötigte Sequenzen wurden aus der GenBank, Release 7.3, erhalten. Der phylogenetische Baum wurde mit dem PILEUP-Programm der Software der Genetics Computer Group erzeugt, welche eine Gap penalty von 3 und eine Length penalty von 0,1 verwendet. Die aufgezeichneten DNA-Sequenzen von hMLH1 und hPMS1 wurden bei der GenBank eingereicht.
Lage von hMLH1-Introns und Intron/Exon-Grenzstrukturen
In unserer früheren U.S.-Patentanmeldung Nr. 08/209,521 haben wir die Nukleotidsequenz eines komplementären DNA (cDNA)-Klons eines menschlichen Gens, hMLH1, beschrieben. Die cDNA-Sequenz von hMLH1 (SEQ ID NO: 4) ist in dieser Anmeldung in 3 dargestellt. Wir merken an, dass es eine gewisse Variabilität zwischen individuellen hMLH1-cDNA-Strukturen geben kann, die aus Polymorphismen innerhalb der menschlichen Bevölkerung und der Degeneriertheit des genetischen Codes resultiert.
In der vorliegenden Anmeldung berichten wir die Ergebnisse unserer genomischen Sequenzierungsstudien. Insbesondere haben wir die menschliche genomische Region, welche das hMLH1-Gen einschließt, mit speziellem Fokus auf die einzelnen Exons und umgebende Intron/Exon-Grenzstrukturen kloniert. Auf dem Weg zu dem letzten Ziel, einen umfassenden und effizienten Ansatz zu entwerfen, um Mutationen zu identifizieren und charakterisieren, welche eine Suszeptibilität für Krebs verleihen, glauben wir, dass es wichtig ist, die Wildtyp-Sequenzen von Intronstrukturen zu kennen, welche Exons in dem hMLH1-Gen flankieren. Ein Vorteil, die Sequenz von Introns nahe der Exongrenzen zu kennen, ist, dass dieses ermöglicht, Primerpaare zum selektiven Amplifizieren von vollständigen individuellen Exons zu entwerfen. Was noch wichtiger ist, so ist es ebenfalls möglich, dass eine Mutation in einem Intronbereich, welche beispielsweise einen mRNA-Spleißfehler verursachen kann, zu einem defekten Genprodukt, d.h. einer Suszeptibilität für Krebs führen könnte, ohne irgendeine Anomalie in einem Exonbereich des Gens zu zeigen. Wir glauben, dass ein umfassender Screening-Ansatz die Suche nach Mutationen nicht nur im Exon oder der cDNA sondern ebenfalls in den Intronstrukturen, welche die Exongrenzen flankieren, erfordert.
Wir haben den menschlichen genomischen Bereich, der hMLH1 einschließt, unter Verwendung von Ansätzen kloniert, welche im Stand der Technik bekannt sind, und andere bekannte Ansätze hätten verwendet werden können. Wir haben eine PCR verwendet, um eine menschliche genomische P1-Bibliothek auf das hMLH1-Gen zu screenen. Wir haben vier Klone erhalten, zwei, die das gesamte Gen enthielten, und zwei, denen der C-Terminus fehlte. Wir haben einen der Klone in voller Länge durch zyklisches Sequenzieren charakterisiert, was zu unserer Definition von allen Intron/Exon-Verbindungssequenzen für beide Seiten der 19 hMLH1-Exons führte. Wir haben dann mehrere Sätze von PCR-Primern entworfen, um jedes einzelne Exon zu amplifizieren (Primer der ersten Stufe), und haben die Sequenz von jedem Exon und flankierender Intronsequenz durch Amplifizieren von mehreren unterschiedlichen genomischen DNA-Proben und Sequenzieren der resultierenden Fragmente unter Verwendung eines ABI 373 Sequenziergerätes verifiziert. Zusätzlich haben wir die Größen von jedem hMLH1-Exon unter Verwendung von PCR-Methoden bestimmt. Schließlich haben wir einen Satz von verschachtelten PCR-Primern (Primern der zweiten Stufe) zur Reamplifikation von individuellen Exons konstruiert. Wir haben die Primer der zweiten Stufe in einem Multiplex-Verfahren zur Analysierung von HNPCC-Familien und Tumoren auf hMLH1-Mutationen hin verwendet. Im Allgemeinen führen wir bei dem Ansatz mit den verschachtelten PCR-Primern eine erste Multiplex-Amplifikation mit vier bis acht Sätzen von Primern der „ersten Stufe" durch, die jeweils auf ein verschiedenes Exon gerichtet sind. Wir reamplifizieren dann individuelle Exons aus dem Produkt des ersten Amplifikationsschrittes unter Verwendung eines einzelnen Satzes von Primern der zweiten Stufe. Beispiele und weitere Details in Bezug auf unsere Verwendung der Primer der ersten und zweiten Stufe sind nachstehend angegeben.
Durch unsere genomischen Sequenzierungsstudien haben wir alle neunzehn Exons innerhalb des hMLH1-Gens identifiziert und haben die Intron/Exon-Grenzen kartiert. Tabelle 1 stellt die Nukleotid-Koordinaten (d.h. den Punkt der Einfügung jedes Introns innerhalb des codierenden Bereiches des Gens) der hMLH1-Exons (SEQ ID NOS: 25-43) dar. Die dargestellten Koordinaten basieren auf der hMLH1-cDNA-Sequenz, wobei Position „1" dem „A" des Starts „ATG" zugeordnet wird (wobei das A das Nukleotid 1 in SEQ ID NO: 4 ist).
Tabelle 1
Wir haben ebenfalls die Nukleotidsequenz von Intronbereichen, welche Exons des hMLH1-Gens flankieren, bestimmt. SEQ ID NOS: 6-24 sind individuelle Exonsequenzen, welche durch ihre entsprechenden stromaufwärts und stromabwärts liegenden Intronsequenzen begrenzt sind. Dieselben Nukleotidstrukturen sind in 4A gezeigt, wo die Exons von dem N-Terminus bis zu dem C-Terminus, bezogen auf den chromosomalen Genort, nummeriert sind. Die 5-stelligen Zahlen zeigen die Primer an, welche verwendet wurden, um das Exon zu amplifizieren. Alle Sequenzen sind nummeriert, unter der Annahme, dass das A des ATG-Codons das Nukleotid 1 ist. Die Zahlen in () sind die Nukleotidkoordinaten der codierenden Sequenz, die in dem angegeben Exon gefunden wurde. Großbuchstaben sind ein Intron. Kleine Buchstaben sind ein Exon oder nicht translatierte Sequenzen, die in dem mRNA/c-DNA-Klon gefunden werden. Kleine Buchstaben und unterstrichene Sequenzen entsprechen den Primern. Das Stopp-Codon bei 2269-2271 ist kursiv und unterstrichen.
Tabelle 2 stellt die Sequenzen von Primerpaaren (Primer der „ersten Stufe") dar, welche wir verwendet haben, um individuelle Exons zusammen mit flankierenden Intronstrukturen zu amplifizieren.
Tabelle 2
Zusätzlich haben wird einen Satz von Amplifikationsprimern der „zweiten Stufe" entworfen, deren Strukturen nachstehend in Tabelle 3 gezeigt werden. Wir haben die Primer der zweiten Stufe in Verbindung mit den Primern der ersten Stufe in einem verschachtelten Amplifikationsprotokoll, wie es nachstehend beschrieben wird, verwendet.
Tabelle 3
In Tabelle 3 zeigt ein Stern (*) an, dass das 5'-Nukleotid biotinyliert ist. Die Exons 1-7, 10, 13 und 16-19 können spezifisch in PCR-Reaktionen amplifiziert werden, welche entweder 1,5 mM oder 3 mM MgCl₂ enthalten. Die Exons 11 und 14 können nur spezifisch in PCR-Reaktionen amplifiziert werden, welche 1,5 mM MgCl₂ enthalten, und die Exons 8, 9, 12 und 15 können nur spezifisch in PCR-Reaktionen amplifiziert werden, welche 3 mM MgCl₂-enthalten. In Bezug auf das Exon 12 sind die Amplifikationsprimer der zweiten Stufe so entworfen worden, dass das Exon 12 in zwei Hälften reamplifiziert wird. Der Primersatz 20546 und 20002 amplifiziert die N-terminale Hälfte. Der Primersatz 19829 und 19835 amplifiziert die C-terminate Hälfte. Ein alternativer Primer für 18178 ist 19070.
Die hMLH1-Sequenzinformation, die von unseren Studien geliefert wird und in dieser Anmeldung und vorausgegangenen verwandten Anmeldungen offenbart wird, kann verwendet werden, um eine große Anzahl von unterschiedlichen Oligonukleotidprimern zur Verwendung bei der Identifizierung von hMLH1-Mutationen, die mit der Suszeptibilität für Krebs und/oder mit der Entwicklung eines Tumors in einem Individuum korrelieren, zu entwerfen, einschließlich solcher Primer, die mehr als ein Exon (und/oder flankierende Intronsequenzen) in einer einzigen Produktbande amplifizieren.
Ein Durchschnittsfachmann wäre mit Erwägungen vertraut, die wichtig sind, um PCR-Primer zur Verwendung, um das gewünschte Fragment oder Gen zu amplifizieren, zu entwerfen.³⁷ Diese Erwägungen können ähnlich, wenn auch nicht notwendigerweise identisch zu jenen sein, die an der Planung von Sequenzierprimern wie oben diskutiert beteiligt sind. Im Allgemeinen ist es wichtig, dass Primer relativ spezifisch hybridisieren (d.h. eine T_m von größer als ca. 55 Grad C und vorzugsweise um 60 Grad C herum aufweisen). Für die meisten Fälle arbeiten Primer zwischen ca. 17 und 25 Nukleotiden in der Länge gut. Längere Primer können nützlich sein, um längere Fragmente zu amplifizieren. In allen Fällen ist es wünschenswert, die Verwendung von Primern zu vermeiden, die zu mehr als einer Sequenz in dem menschlichen Genom komplementär sind, so dass jedes Paar von PCR-Primern nur ein einziges, korrektes Fragment amplifiziert. Nichtsdestotrotz ist es nur absolut notwendig, dass die korrekte Bande von anderen Produktbanden in der PCR-Reaktion unterscheidbar ist.
Die genauen PCR-Bedingungen (z.B. Salzkonzentration, Anzahl von Zyklen, Typ der DNA-Polymerase usw.) können wie in Stand der Technik bekannt variiert werden, um beispielsweise Ausbeute oder Spezifität der Reaktion zu verbessern. Insbesondere haben wir gefunden, dass es nützlich ist, verschachtelte Primer in PCR-Reaktionen zu verwenden, um die Menge des benötigten DNA-Substrats zu verringern und die Amplifikationsspezifität zu verbessern.
Es folgen zwei Beispiele. Das erste Beispiel stellt die Verwendung eines Primerpaars der ersten Stufe dar (SEQ ID NOS: 69 und 70), um ein Intron/Exon-Segment (SEQ ID NO: 18) zu amplifizieren. Das zweite Beispiel stellt die Verwendung von Primern der zweiten Stufe dar, um ein Ziel-Intron/Exon-Segment aus dem Produkt eines ersten PCR-Amplifikationsschrittes, welcher Primer der ersten Stufe einsetzt, zu amplifizieren.
BEISPIEL 1: Amplifikation von genomischen hMLH1-Klonen aus einer P1-Phagen-Bibliothek
25 ng genomische DNA (oder 1 ng eines P1-Phagen kann verwendet werden) wurden in PCR-Reaktionen verwendet, welche umfassten:
0,05 mM dNTPs
50 mM KCl
3 mM Mg
10 mM Tris-HCl pH 8,5
0,01 % Gelatine
5 μM Primer
Die Reaktionen wurden auf einem Thermozykler Perkin-Elmer Cetus Modell 9600 durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 95 Grad C für 5 Minuten inkubiert, worauf 35 Zyklen (30 Zyklen bei einem P1-Phagen) folgten mit:
94 Grad C für 30 Sekunden
55 Grad C für 30 Sekunden
72 Grad C für 1 Minute.
Eine abschließende Verlängerungsreaktion für 7 Minuten wurde dann bei 72 Grad C durchgeführt. Erwünschte P1-Klone waren jene, aus welchen eine Produktbande mit den ungefähren bp erzeugt wurde.
BEISPIEL 2: Amplifikation von hMLH1-Sequenzen aus genomischer DNA unter Verwendung von verschachtelten PCR-Primern
Wir haben eine PCR-Amplifikation in zwei Schritten von hMLH1-Sequenzen aus genomischer DNA wie folgt durchgeführt. Typischerweise wurde die erste Amplifikation in einer 25 Mikroliter-Reaktion durchgeführt, umfassend:
25 ng chromosomale DNA
Perkin-Elmer-PCR-Puffer II (jeder geeignete Puffer könnte verwendet werden)
3 mM MgCl₂
50 μM von jedem dNTP
Taq-DNA-Polymerase
5 μl Primer (SEQ ID NOS: 69, 70)
und bei 95 Grad C für 5 Minuten inkubiert, gefolgt von 20 Zyklen mit:
94 Grad C für 30 Sekunden
55 Grad C für 30 Sekunden.
Die Produktbande war typischerweise klein genug (weniger als ungefähr 500 bp), dass separate Verlängerungsschritte nicht als Teil eines jeden Zyklus durchgeführt wurden. Stattdessen wurde ein einziger Verlängerungsschritt bei 72 Grad C für 7 Minuten durchgeführt, nachdem die 20 Zyklen abgeschlossen waren. Die Reaktionsprodukte wurden bei 4 Grad C gelagert.
Die zweite Amplifikationsreaktion mit gewöhnlich 25 oder 50 Mikrolitern im Volumen umfasste:
1 oder 2 Mikroliter (abhängig von dem Volumen der Reaktion) des ersten Amplifikationsreaktionsprodukts
Perkin-Elmer-PCR-Puffer II (jeder geeignete Puffer könnte verwendet werden)
3 mM MgCl₂
50 μM von jedem dNTP
Taq-DNA-Polymerase
5 μl verschachtelte Primer (SEQ ID NOS: 109, 110)
und wurde bei 95 Grad C für 5 Minuten inkubiert, worauf 20-25 Zyklen folgten mit:
94 Grad C für 30 Sekunden
55 Grad C für 30 Sekunden.
Ein einziger Verlängerungsschritt wurde bei 72 Grad C für 7 Minuten durchgeführt, nachdem die Zyklen abgeschlossen waren. Die Reaktionsprodukte wurden bei 4 Grad C gelagert.
Jeder Satz von Primern, der in der Lage ist, eine Ziel-hMLH1-Sequenz zu amplifizieren, kann in der ersten Amplifikationsreaktion verwendet werden. Wir haben jeden der Primersätze, die in Tabelle 2 dargestellt sind, verwendet, um ein individuelles hMLH1-Exon in der ersten Amplifikationsreaktion zu amplifizieren. Wir haben ebenfalls Kombinationen von jenen Primersätzen verwendet, wodurch mehrfache individuelle hMLH1-Exons in der ersten Amplifikationsreaktion amplifiziert wurden.
Die verschachtelten Primer, die in dem ersten Amplifikationsschritt verwendet wurden, wurden in Bezug auf die Primer entworfen, die in der ersten Amplifikationsreaktion verwendet wurden. Das bedeutet, wo ein einziger Satz an Primern in der ersten Amplifikationsreaktion verwendet wird, sollten die Primer, die in der zweiten Amplifikationsreaktion verwendet werden, identisch zu den Primern sein, die in der ersten Reaktion verwendet werden, außer dass die Primer, die in der zweiten Reaktion verwendet werden, die am meisten 5' liegenden Nukleotide der ersten Amplifikationsreaktionsprimer nicht beinhalten sollten und sich hinreichend mehr am 3'-Ende erstrecken sollten, so dass die T_m der zweiten Amplifikationsprimer ungefähr dieselbe ist wie die T_m der ersten Amplifikationsreaktionsprimer. Unseren zweiten Reaktionsprimern fehlten typischerweise die 3 am meisten 5' liegenden Nukleotide der ersten Amplifikationsreaktionsprimer und sie erstreckten sich am 3'-Ende ungefähr 3-6 Nukleotide weiter. SEQ ID NOS: 109, 110 sind Beispiele von verschachtelten Primerpaaren, die in einer zweiten Amplifikationsreaktion verwendet werden könnten, wenn SEQ ID NOS: 69 und 70 in der ersten Amplifikationsreaktion verwendet wurden.
Wir haben ebenfalls gefunden, dass es nützlich sein kann, eine Standardsequenz an dem 5'-Ende von einem der zweiten Amplifikationsreaktionsprimer aufzunehmen, um Sequenzierungsreaktionen zu primen. Zusätzlich haben wir gefunden, dass es nützlich ist, das letzte Nukleotid von einem oder beiden der zweiten Amplifikationsreaktionsprimer zu biotinylieren, so dass die Produktbande unter Verwendung von magnetischen Kügelchen⁴⁰ leicht gereinigt werden kann und dann Sequenzierungsreaktionen direkt mit den mit den Kügelchen assoziierten Produkten durchgeführt werden können.^41-45
Für eine zusätzliche Diskussion von Multiplex-Amplifikations- und Sequenzierungsmethoden siehe die Referenzen von Zu et al. und Espelund et al.^46,47
Verknüpfung von hMLH1 mit Krebs
Als einen ersten Schritt, um festzustellen, ob hMLH1 ein Kandidat für den HNPCC-Genort auf dem menschlichen Chromosom 3p21-23 war,³ haben wir hMLH1 durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) kartiert.^20,21 Wir haben zwei separate genomische Fragmente (Daten nicht gezeigt) des hMLH1-Gens bei der FISH-Analyse verwendet. Die Untersuchung von mehreren Metaphase-Chromosomenverteilungen lokalisierte hMLH1 auf dem Chromosom 3p21.3-23.
Feld A von 7 zeigt die Hybridisierung von hMLH1-Sonden in einer Metaphase-Verteilung. Biotinylierte genomische hMLH1-Sonden wurden wie früher beschrieben mit gebänderten menschlichen Metaphase-Chromosomen hybridisiert.^20,21 Der Nachweis wurde mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Avidin durchgeführt (grünes Signal); Chromosomen, in blau gezeigt, wurden mit 4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera erhalten, vergrößert, pseudokoloriert und mit den folgenden Programmen verarbeitet (merged): CCD Image Capture; NIH Image 1.4; Adobe Photoshop bzw. Genejoin Maxpix. Feld B von 7 zeigt eine Zusammensetzung von Chromosom 3 aus mehreren Metaphase-Verteilungen, ausgerichtet mit dem Ideogramm des menschlichen Chromosoms 3. Der Bereich der Hybridisierung (distaler Bereich von 3p21.3-23) ist in dem Ideogramm durch einen vertikalen Balken gezeigt.
Als unabhängige Bestätigung der Lage von hMLH1 auf dem Chromosom 3 haben wir sowohl eine PCR mit einem Paar von hMLH1-spezifischen Oligonukleotiden als auch ein Southern Blotting mit einer hMLH1-spezifischen Sonde verwendet, um DNA aus der NIGMS2 Nagetier/Mensch-Zellgruppe (Coriell Inst. for Med. Res., Camden, N.J., USA) zu analysieren. Die Ergebnisse beider Techniken zeigten eine Verknüpfung mit Chromosom 3. Wir haben ebenfalls das Maus-MLH1-Gen durch FISH auf Chromosom 9, Bande E, kartiert. Dieses ist eine Position mit Syntenie zu dem menschlichen Chromosom 3p.²² Daher liegt das hMLH1-Gen bei 3p21.3-23, innerhalb des genomischen Bereichs, der bei Chromosom 3-verknüpften HNPCC-Familien beteiligt ist.³
Als nächstes haben wir Blutproben von betroffenen und nicht betroffenen Individuen aus zwei Chromosom 3-Kandidaten-HNPCC-Familien³ auf Mutationen hin analysiert. Eine Familie, Familie 1, zeigte eine signifikante Verknüpfung (Iod-Score = 3,01 bei einer Rekombinationsfraktion von 0) zwischen HNPCC und einem Marker auf 3p. Für die zweite Familie, Familie 2, lag die berichtete Iod-Score (1,02) unterhalb des allgemein akzeptierten Signifikanzniveaus und legte somit nur eine Verknüpfung mit demselben Marker auf 3p nahe. Eine nachfolgende Verknüpfungsanalyse der Familie 2 mit dem Mikrosatelliten-Marker D3S1298 auf 3p21.3 ergab eine signifikantere Iod-Score von 1,88 bei einer Rekombinationsfraktion von 0. Anfangs haben wir bei zwei PCR-amplifizierten Exons des hMLH1-Gens durch direkte DNA-Sequenzierung nach Mutationen gescreent (4). Wir untersuchten diese zwei Exons von drei betroffenen Individuen der Familie 1 und haben keinerlei Unterschiede von der erwarteten Sequenz detektiert. Bei Familie 2 haben wir beobachtet, dass vier Individuen, die von Darmkrebs betroffen waren, heterozygot sind für eine Substitution von C nach T in einem Exon, welches die Aminosäuren 41-69 codiert, welches einem in hohem Maße konservierten Bereich des Proteins entspricht (9). Für ein betroffenes Individuum haben wir PCR-amplifizierte cDNA im Hinblick auf zusätzliche Sequenzunterschiede gescreent. Die kombinierte Sequenzinformation, die von den zwei Exons und der cDNA dieses einen betroffenen Individuums erhalten wurde, stellt 95% (d.h. Alles bis auf die ersten 116 bp) des offenen Leserasters dar. Wir haben keine Nukleotidveränderungen außer der Substitution von C durch T beobachtet. Zusätzlich haben wir gefunden, dass vier Individuen aus Familie 2, bei welchen auf der Basis der Verknüpfungsdaten vorhergesagt wurde, dass diese Träger sind, und welche bisher nicht von Darmkrebs betroffen waren, heterozygot für dieselbe Substitution von C durch T waren. Zwei dieser vorhergesagten Träger waren unter und zwei waren über dem mittleren Alter des Einsetzens (50 Jahre) bei dieser bestimmten Familie. Zwei nicht betroffene Individuen, die aus dieser selben Familie untersucht wurden, von welchen beiden durch Verknüpfungsdaten vorhergesagt wurde, dass diese keine Träger sind, zeigten an dieser Position die erwartete normale Sequenz. Eine Verknüpfungsanalyse, welche die Substitution von C durch T bei Familie 2 einschließt, ergibt eine Iod-Score von 2,23 bei einer Rekombinationsfraktion von 0. Unter Verwendung von Kriterien zur Krebsdiagnose mit niedriger Stringenz haben wir eine Iod-Score von 2,53 berechnet. Diese Daten zeigen, dass die Substitution von C durch T eine signifikante Verknüpfung mit dem HNPCC in Familie 2 zeigt.
8 zeigt Sequenzchromatogramme, welche eine Übergangsmutation von C nach T anzeigen, welche eine nicht konservative Aminosäuresubstitution an Position 44 des hMLH1-Proteins erzeugt. Die Sequenzanalyse eines nicht betroffenen (obere Felder, plus- und minus-Strang) und eines betroffenen Individuums (untere Felder, plus- und minus-Strang) wird dargestellt. Die Position des heterozygoten Nukleotids ist durch einen Pfeil angezeigt. Eine Analyse der Sequenzchromatographen zeigt, dass es ein ausreichendes T-Signal in dem C-Peak und genügend A-Signal in dem G-Peak gibt, damit die betroffenen Individuen an dieser Stelle heterozygot sind.
Um zu bestimmen, ob diese Substitution von C durch T ein Polymorphismus war, haben wir dieses selbe Exon, das aus der genomischen DNA von 48 nicht verwandten Individuen amplifiziert wurde, sequenziert und nur die normale Sequenz beobachtet. Wir haben zusätzliche 26 nicht verwandte Individuen unter Verwendung der allelspezifischen Oligonukleotid (ASO)-Hybridisierungsanalyse untersucht.³³ Die ASO-Sequenzen (SEQ ID NOS: 141 bzw. 142), welche wir verwendet haben, sind:
5'-ACTTGTGGATTTTGC-3' und
5'-ACTTGTGAATTTTGC-3'.
Auf der Basis der direkten DNA-Sequenzierung und der ASO-Analyse trägt keines dieser 74 nicht verwandten Individuen die Substitution von C durch T. Daher ist es nicht wahrscheinlich, dass die bei Individuen der Familie 2 beobachtete Substitution von C durch T ein Polymorphismus ist. Wie oben erwähnt wurde, haben wir diese selbe Substitution von C durch T bei betroffenen Individuen aus einer zweiten Chromosom 3-verknüpften Familie, Familie 1, nicht detektiert.³ Wir fahren damit fort, Individuen der Familie 1 im Hinblick auf Mutationen in hMLH1 zu untersuchen.
Tabelle 4 unten fasst unsere experimentelle Analyse von Blutproben von betroffenen und nicht betroffenen Individuen aus Familie 2 und nicht verwandten Individuen zusammen.
Tabelle 4
Auf der Basis von mehreren Kriterien schlagen wir vor, dass die beobachtete Substitution von C durch T in dem Codierungsbereich von hMLH1 die Mutation darstellt, welche die Basis für HNPCC in Familie 2 ist.³ Zuerst haben eine DNA-Sequenz- und ASO-Analyse die Substitution von C durch T bei 74 nicht verwandten Individuen nicht detektiert. Somit ist die Substitution von C durch T nicht einfach ein Polymorphismus. Als zweites wird erwartet, dass die beobachtete Substitution von C durch T eine Änderung von Serin nach Phenylalanin an Position 44 erzeugt (siehe 9). Diese Aminosäuresubstitution ist eine nicht konservative Änderung in einem konservierten Bereich des Proteins (3 und 9). Sekundärstruktur-Vorhersagen unter Verwendung von Chou-Fasman-Parametern legen eine Helix-Schlaufe-Betablatt-Struktur nahe, wobei Position 44 in der Schlaufe (turn) lokalisiert ist. Die beobachtete Substitution von Ser durch Phe an Position 44 erniedrigt die Vorhersage für diese Schlaufe beträchtlich, was nahe legt, dass die vorhergesagte Aminosäuresubstitution die Konformation des hMLH1-Proteins verändert. Der Vorschlag, dass die Substitution von Ser durch Phe eine Mutation ist, welche eine Suszeptibilität für Krebs verleiht, wird weiterhin durch unsere Experimente unterstützt, die zeigen, dass eine analoge Substitution (Alanin zu Phenylalanin) in einem Hefe-MLH1-Gen zu einem nicht funktionsfähigen Fehlpaarungsreparaturprotein führt. Bei Bakterien und Hefe verursacht eine Mutation, welche die DNA-Fehlpaarungsreparatur beeinträchtigt, vergleichbare Zunahmen bei der Rate von spontanen Mutationen, einschließlich Additionen und Deletionen innerhalb von Dinukleotidwiederholungen.^{4,5,11,13,14,15,16} Bei Menschen ist eine Mutation von hMSH2 die Basis für Chromosom 2-HNPCC,^1,2 Tumore, die eine Mikrosatelliteninstabilität und einen offenbaren Defekt bei der Fehlpaarungsreparatur zeigen.¹² Chromosom 3-verknüpfter HNPCC ist ebenfalls mit einer Instabilität von Dinukleotidwiederholungen verbunden.³ Kombiniert mit diesen Beobachtungen legt der hohe Grad an Konservierung zwischen dem menschlichen MLH1-Protein und dem Hefe-DNA-Fehlpaarungsreparaturprotein MLH1 nahe, dass es wahrscheinlich ist, dass hMLH1 in der DNA-Fehlpaarungsreparatur wirkt. Während der Isolierung des hMLH1-Gens haben wir das hPMS1-Gen identifiziert. Diese Beobachtung legt nahe, dass die DNA-Fehlpaarungsreparatur in Säugetieren wie die in Hefe⁴ wenigstens zwei MutL-ähnliche Proteine erfordern könnte.
Es sollte beachtet werden, dass es scheint, dass unterschiedliche HNPCC-Familien unterschiedliche Mutationen in dem MLH1-Gen zeigen. Wie oben erklärt wurde, zeigten betroffene Individuen der Familie 1 eine „enge Verknüpfung" zwischen HNPCC und einem Genort in dem Bereich von 3p21-23. Jedoch weisen betroffene Individuen in Familie 1 nicht die Mutation von C nach T auf, die in Familie 2 gefunden wird. Es scheint, dass die betroffenen Individuen in Familie 1 eine andere Mutation in ihrem MLH1-Gen aufweisen. Weiterhin haben wir die Strukturinformation und die Methoden, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, verwendet, um eine weitere hMLH1-Mutation zu finden und zu charakterisieren, welche anscheinend bei heterozygoten Trägern des Mutantengens in einer großen englischen HNPCC-Familie eine Suszeptibilität für Krebs verleiht. Die hMLH1-Mutation in der englischen Familie ist eine a + 1 T Rasterverschiebung, von welcher vor hergesagt wird, dass diese zu der Synthese eines trunkierten hMLH1-Proteins führt. Anders als beispielsweise bei der Sichelzellenanämie, bei welcher im Wesentlichen alle bekannten betroffenen Individuen dieselbe Mutation aufweisen, wurden mehrfache hMLH1-Mutationen entdeckt und mit Krebs verknüpft. Daher ist die Kenntnis der gesamten cDNA-Sequenz für hMLH1 (und möglicherweise hPMS1) wie auch von genomischen Sequenzen, insbesondere jenen, welche die Exons umgeben, nützlich und wichtig, um Mutationen in Familien zu charakterisieren, die als eine hohe Häufigkeit von Krebs zeigend identifiziert wurden.
Anschließend an unsere Entdeckung einer Krebs verleihenden Mutation in hMLH1, haben Untersuchungen von Anderen zu der Charakterisierung von wenigstens 5 zusätzlichen Mutationen in hMLH1 geführt, von denen jede eine Suszeptibilität für Krebs bei Individuen in wenigstens einer HNPCC-Familie verliehen zu haben scheint. Beispielsweise haben Papadopoulos et al. eine solche als eine Mutation identifiziert, welche durch eine Deletion im Raster von 165 Basenpaaren zwischen den Codons 578 und 632 gekennzeichnet ist. In einer anderen Familie haben Papadopoulos et al. eine hMLH1-Mutation beobachtet, die durch eine Rasterverschiebung und Substitution von neuen Aminosäuren, nämlich eine 4 Basen-Deletion zwischen den Codons 727 und 728, gekennzeichnet war. Papadopoulos et al. berichten ebenfalls eine mit Krebs verknüpfte hMLH1-Mutation, welche durch eine Verlängerung des COOH-Terminus, nämlich eine Insertion von 4 Basenpaaren zwischen den Codons 755 und 756, gekennzeichnet war.³⁸
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass das DNA-Fehlpaarungsreparaturgen hMLH1 wahrscheinlich das Gen für erblichen Non-Polyposis-Darmkrebs ist, welches vorher durch Verknüpfungsanalyse auf dem Chromosom 3p21-23 lokalisiert wurde.³ Die Verfügbarkeit der hMLH1-Gensequenz wird das Screenen von HNPCC-Familien auf Krebs-verknüpfte Mutationen erleichtern. Zusätzlich wurde, auch wenn der Verlust an Heterozygotie (LOH) von verknüpften Markern kein Merkmal von weder der 2p- noch der 3p-Form von HNPCC ist,^3, ⁶ ein LOH unter Beteiligung des Bereichs 3p21.3-23 bei mehreren Krebsfällen bei Menschen beobachtet.^24-26 Dieses legt die Möglichkeit nahe, dass eine hMLH1-Mutation eine gewisse Rolle bei diesen Tumoren spielen könnte.
Menschliches PMS1
Menschliches PMS1 wurde isoliert, indem die Verfahren verwendet wurden, die in Bezug auf 1 diskutiert wurden. 10 zeigt die gesamte Nukleotidsequenz der hPMS1-cDNA. 11 zeigt eine Ausrichtung der vorhergesagten Proteinsequenzen von PMS1 von Mensch und Hefe. Wir haben durch FISH-Analyse bestimmt, dass menschliches PMS1 auf dem Chromosom 7 lokalisiert ist. Anschließend an unsere Entdeckung von hPMS1 haben Andere Mutationen in dem Gen identifiziert, welche eine Suszeptibilität für HNPCC zu verleihen scheinen.³⁹
Maus-MLH1
Unter Verwendung des Verfahrens, das oben in Bezug auf 1 skizziert wurde, haben wir eine partielle Nukleotidsequenz der Maus-MLH1-cDNA, wie sie in 12 gezeigt ist (SEQ ID NO: 135), bestimmt. 13 zeigt die entsprechende vorhergesagte Aminosäuresequenz für das mMLH1-Protein (SEQ ID NO: 136) im Vergleich zu der vorhergesagten hMLH1-Proteinsequenz (SEQ ID NO: 5). Der Vergleich der MLH1-Proteine von Maus und Mensch wie auch der Vergleich von hMLH1 mit Hefe-MLH1-Proteinen, wie sie in 9 gezeigt werden, zeigt einen hohen Grad an Konservierung.
Maus-PMS1
Unter Verwendung der Verfahren, die oben in Bezug auf 1 diskutiert wurden, haben wir das Maus-PMS1-Gen, wie es in 14 gezeigt ist (SEQ ID NO: 137), isoliert und sequenziert. Diese cDNA-Sequenz codiert ein vorhergesagtes Protein von 864 Aminosäuren (SEQ ID NO: 138), wie es in 15 gezeigt ist, wo es mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz für hPMS1 (SEQ ID NO: 133) verglichen wird. Das Ausmaß der Identität zwischen den vorhergesagten PMS1-Proteinen von Maus und Mensch ist hoch, wie man bei zwei Säugern erwarten würde. In ähnlicher Weise gibt es, wie oben angemerkt wurde, eine starke Ähnlichkeit zwischen dem menschlichen PMS1-Protein und dem Hefe-DNA-Fehlpaarungsreparaturprotein PMS1, wie in 11 gezeigt wird. Die Tatsache, dass Hefe-PMS1 und MLH1 in Hefe wirken, um DNA-Fehlpaarungen zu reparieren, legt nachdrücklich nahe, dass PMS1 und MLH1 von Mensch und Maus ebenfalls Fehlpaarungsreparaturproteine sind.
Anwendungen für Maus-MLH1 und -PMS1
Wir glauben, dass unsere Isolierung und Charakterisierung von mMLH1- und mPMS1-Genen viele Anwendungen in der Forschung haben werden. Beispielsweise haben wir, wie bereits oben diskutiert wurde, unsere Kenntnis des mPMS1-Gens verwendet, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch mit hPMS1 reagieren. Wir haben bereits erklärt, dass Antikörper, die gegen die menschlichen Proteine, MLH1 oder PMS1, gerichtet sind, sowohl für Forschungszwecke als auch für diagnostische Zwecke verwendet werden können.
Wir glauben ebenfalls, dass unsere Kenntnis von mPMS1 und mMLH1 nützlich sein wird, um Mausmodelle zu konstruieren, um die Folgen von DNA-Fehlpaarungsreparaturdefekten zu untersuchen. Wir erwarten, dass Mäuse mit einem Defekt bei mPMS1 oder mMLH1 in hohem Maße anfällig für Krebs sein werden, da ein Chromosom 2p- und 3p-assoziierter HNPCC jeweils auf einem Defekt in einem Fehlpaarungsreparaturgen beruht.^1,2 Wie oben angemerkt wurde, haben wir bereits chimäre Mäuse erzeugt, welche ein defektes mPMS1-Gen tragen. Wir konstruieren derzeit Mäuse, die im Hinblick auf eine mPMS1- oder mMLH1-Mutation heterozygot sind. Diese heterozygoten Mäuse sollten nützliche Tiermodelle liefern, um menschlichen Krebs, insbesondere HNPCC, zu untersuchen. Die Mäuse werden zur Analyse sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Faktoren nützlich sein, welche das Krebsrisiko und den Verlauf bestimmen. Ebenso können Krebsarten, die mit einem Mangel bei der Fehlpaarungsreparatur verbunden sind, im Vergleich zu anderen Krebsarten anders auf eine herkömmliche Therapie reagieren. Solche Tiermodelle werden nützlich sein, um festzustellen, ob Unterschiede bestehen, und die Entwicklung von Regimes zur effektiven Behandlung dieser Typen von Tumoren ermöglichen. Solche Tiermodelle können ebenfalls verwendet werden, um die Beziehung zwischen erblichen gegenüber ernährungsbedingten Faktoren bei der Entstehung von Krebs zu untersuchen.
Unterscheiden der Mutationen von Polymorphismen
Für Untersuchungen der Suszeptibilität für Krebs und für die Identifizierung und Charakterisierung eines Tumors ist es wichtig, „Mutationen" von „Polymorphismen" zu unterscheiden. Eine „Mutation" erzeugt ein „nicht-Wildtyp-Allel" eines Gens. Ein nicht-Wildtyp-Allel eines Gens erzeugt ein Transkript und/oder ein Proteinprodukt, das innerhalb einer Zelle nicht normal funktioniert. „Mutationen" können irgendeine Veränderung in der Nukleotidsequenz, einschließlich Insertionen, Deletionen, Substitutionen und Umordnungen sein.
„Polymorphismen" sind andererseits Sequenzunterschiede, die innerhalb der Population von normal funktionierenden (d.h. „Wildtyp")-Genen gefunden werden. Einige Polymorphismen resultieren aus der Degeneriertheit des Nukleinsäurecodes. Das bedeutet, dass in Anbetracht dessen, dass die meisten Aminosäuren durch mehr als ein Triplett-Codon codiert werden, viele verschiedene Nukleotidsequenzen dasselbe Polypeptid codieren können. Andere Polymorphismen sind einfache Sequenzunterschiede, die keine signifikante Auswirkung auf die Funktion des Gens oder des codierten Polypeptids aufweisen. Beispielsweise können Polypeptide oft kleine Insertionen oder Deletionen oder „konservative" Substitutionen in deren Aminosäuresequenz tolerieren, ohne die Funktion des Polypeptids signifikant zu verändern.
„Konservative" Substitutionen sind jene, bei welchen eine bestimmte Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen chemischen Eigenschaften ersetzt wird. Beispielsweise werden die Aminosäuren oft als „nichtpolar (hydrophob)", was Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin einschließt, "polar neutral", was Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin einschließt, "positiv geladen (basisch)", was Arginin, Lysin and Histidin einschließt, und "negativ geladen (sauer)", was Asparaginsäure und Glutaminsäure einschließt, charakterisiert. Eine Substitution von einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure in derselben Gruppe wird im Allgemeinen als „konservativ" betrachtet, insbesondere wenn die Seitengruppen der zwei betreffenden Aminosäuren eine ähnliche Größe aufweisen.
Der erste Schritt beim Identifizieren einer Mutation oder eines Polymorphismus in einer Sequenz eines Fehlpaarungsreparaturgens beinhaltet die Identifizierung, unter Verwendung von verfügbaren Techniken einschließlich jener, die hierin beschrieben werden, einer Sequenz eines Fehlpaarungsreparaturgens (oder Genfragments), welche sich von einer bekannten, normalen (z.B. Wildtyp)-Sequenz desselben Fehlpaarungsreparaturgens (oder Genfragments) unterscheidet. Beispielsweise könnte eine Sequenz eines hMLH1-Gens (oder Genfragments) identifiziert werden, die in wenigstens einer Nukleotidposition von einer bekannten normalen (z.B. Wildtyp)-hMLH1-Sequenz wie z.B. irgendeiner der SEQ ID NOS: 6-24 verschieden ist.
Mutationen können von Polymorphismen unterschieden werden, indem irgendeine einer Vielzahl von Methoden verwendet wird, von denen vielleicht die direkteste eine Datensammlung und Korrelation mit der Entwicklung eines Tumors ist. Das bedeutet, es könnte beispielsweise eine Person identifiziert werden, deren hMLH1-Gensequenz von einer Sequenz, die in SEQ ID NOS: 6-24 berichtet wird, verschieden ist, die aber keinen Krebs hat und keine Familiengeschichte mit Krebs aufweist. Insbesondere wenn andere, vorzugsweise ältere Mitglieder von der Familie dieser Person hMLH1-Gensequenzen aufweisen, die von den SEQ ID NOS: 6-24 in derselben Weise(n) verschieden sind, ist es wahrscheinlich, dass die hMLH1-Gensequenz der Person als ein „Polymorphismus" kategorisiert werden könnte. Wenn andere, nicht verwandte Individuen mit derselben hMLH1-Gensequenz und ohne eine Familiengeschichte mit Krebs identifiziert werden, kann die Kategorisierung bestätigt werden.
Mutationen, die zur Verleihung einer genetischen Suszeptibilität für Krebs verantwortlich sind, können identifiziert werden, da es unter anderem wahrscheinlich ist, dass solche Mutationen in allen Geweben von betroffenen Individuen und in der Keimbahn von wenigstens einem der Eltern dieses Individuums vorliegen, und es nicht wahrscheinlich ist, dass diese in nicht verwandten Familien ohne eine Krebsgeschichte gefunden werden.
Wenn Mutationen von Polymorphismen unterschieden werden, kann es manchmal nützlich sein, einen bestimmten Sequenzunterschied in der Gegenwart von wenigstens einer bekannten Fehlpaarungsreparaturgenmutation auszuwerten. In einigen Fällen wird eine bestimmte Sequenzänderung keine nachweisbare Wirkung haben (d.h. wird als ein Polymorphismus erscheinen), wenn sie allein getestet wird, wird aber beispielsweise die Durchschlagkraft einer bekannten Mutation erhöhen, so dass Individuen, die sowohl den scheinbaren Polymorphismus-Unterschied als auch eine bekannte Mutation tragen, eine höhere Wahrscheinlichkeit aufweisen, Krebs zu entwickeln, als Individuen, welche nur die Mutation tragen. Sequenzunterschiede, die eine solche Wirkung haben, werden richtig als Mutationen, wenn auch schwache, betrachtet.
Wie oben und früher diskutiert (U.S.-Patentanmeldungen Nr. 08/168,877 und 08/209,521) erzeugten Mutationen in Fehlpaarungsreparaturgenen oder Genprodukten nicht-Wildtyp-Versionen dieser Gene oder Genprodukte. Einige Mutationen können daher von Polymorphismen durch ihre funktionalen Charakteristika in in vivo- oder in vitro-Fehlpaarungsreparaturtests unterschieden werden. Jeder verfügbare Fehlpaarungsreparaturtest kann verwendet werden, um diese Charakteristika zu analysieren.^49-63 Es ist im Allgemeinen wünschenswert, mehr als einen Fehlpaarungsreparaturtest zu verwenden, bevor eine Sequenzänderung als ein Polymorphismus klassifiziert wird, da einige Mutationen Wirkungen haben, die nicht in allen Tests beobachtet werden.
Beispielsweise würde nicht erwartet, dass ein Fehlpaarungsreparaturgen, das eine Mutation enthält, in der Lage ist, eine endogene Kopie desselben Gens in einer Wirtszelle zu ersetzen, ohne die Fehlpaarungsreparatur in dieser Zelle nachweisbar zu beeinträchtigen; dagegen würde erwartet, dass ein Fehlpaarungsreparaturgen, welches einen Sequenzpolymorphismus enthält, in der Lage wäre, eine endogene Kopie desselben Gens in einer Wirtszelle zu ersetzen, ohne die Fehlpaarungsreparatur in dieser Zelle nachweisbar zu beeinträchtigen. Wir merken an, dass es für solche „Austausch"-Studien im Allgemeinen wünschenswert ist, das Gen, das getestet werden soll, in eine Wirtszelle derselben (oder wenigstens einer eng verwandten) Spezies einzuführen wie die Zelle, aus welcher das Testgen abgeleitet wurde, um Komplikationen zu vermeiden, die beispielsweise auf der Unfähigkeit eines Genprodukts von einer Spezies, mit anderen Fehlpaarungsreparaturgenprodukten von einer anderen Spezies zu interagieren, beruhen. In ähnlicher Weise würde von einem Mutanten-Fehlpaarungsreparaturprotein nicht erwartet, dass es in einem in vitro-Fehlpaarungsreparatursystem (vorzugsweise von einem verwandten Organismus) normal funktioniert; wogegen von einem polymorphen Fehlpaarungsreparaturprotein erwartet werden würde, dass es normal funktioniert.
Die hierin und früher beschriebenen Methoden erlauben die Identifizierung von verschiedenen Arten von Fehlpaarungsreparaturgenmutationen. Die folgenden Beispiele stellen Protokolle dar, um Mutationen von Polymorphismen in DNA-Fehlpaarungsreparaturgenen zu unterscheiden.
BEISPIEL 3:
Wir haben ein System entwickelt, um in Hefe, S. cerevisiae, die funktionale Bedeutung von Mutationen zu testen, die entweder in den hMLH1- oder hPMS1-Genen gefunden werden. Das System wird in dieser Anmeldung beschrieben, indem als ein Beispiel die Serin (SER) zu Phenylalanin (PHE) verursachende Mutation in hMLH1 verwendet wird, die wir wie oben beschrieben in einer Familie mit HNPCC gefunden haben. Wir haben einen Hefestamm entwickelt, bei dem sein MLH1-Gen im Wesentlichen deletiert ist und welcher somit ein starker Mutator ist (d.h. 1000-fach über der normalen Rate in einem einfachen genetischen Markertest, welcher eine Umkehr von der Abhängigkeit des Wachstums von einer vorgegebenen Aminosäure zur Unabhängigkeit beinhaltet (Umkehr des hom3-10-Allels, Prolla, Christie und Liskay, Mol Cell Biol, 14: 407-415, 1994). Wenn wir das normale Hefe-MLH1-Gen (vollständig mit allen bekannten Kontrollbereichen) auf einem Hefeplasma, das stabil gehalten wird, als eine einfache Kopie in den MLH1-deletierten Stamm gaben, wird der Mutator-Phänotyp vollständig korrigiert, wobei der Test der Umkehr zu einer Aminosäureunabhängigkeit verwendet wurde. Wenn wir jedoch eine deletierte Kopie des Hefe-MLH1 einführen, gibt es keine Korrektur. Wir haben als Nächstes die Mutation getestet, die in der HNPCC-Familie eine Veränderung von SER zu PHE bewirkte. Wir haben gefunden, dass das resultierende Mutanten-Hefeprotein den Mutator-Phänotyp nicht korrigieren kann, was nachdrücklich nahe legt, dass die Veränderung von der Wildtyp-Gensequenz möglicherweise eine Suszeptibilität für Krebs verleiht und daher als eine Mutation, nicht als ein Polymorphismus, klassifiziert wird. Wir haben anschließend Proteine getestet, die gentechnisch verändert wurden, um andere Aminosäuren an der „Serin"-Position zu enthalten, und haben gefunden, dass die meisten Änderungen zu einem vollständigen Mutanten- oder wenigstens zu einem partiellen Mutanten-Phänotyp führen.
Wenn andere „Punkt"-Mutationen in MLH1- und PMS1-Genen in Krebsfamilien gefunden werden, können diese gentechnisch in das geeignete homologe Hefegen eingeführt werden und deren Folgen für die Proteinfunktion untersucht werden. Zusätzlich haben wir eine Anzahl von in hohem Maße konservierten Aminosäuren in sowohl dem MLH1- als auch dem PMS1-Gen identifiziert. Wir haben ebenfalls einen Beweis, dass hMLH1 mit Hefe-PMS1 interagiert. Dieser Fund erhöht die Möglichkeit, dass Mutationen, die in dem hMLH1-Gen beobachtet werden, direkter in dem Hefesystem getestet werden können. Wir planen, systematisch Mutationen zu erzeugen, welche die Aminosäure an diesen konservierten Positionen ändern, und zu bestimmen, welche Aminosäuresubstitutionen toleriert werden und welche nicht. Durch das Sammeln von Mutationsinformation in Bezug auf hMLH1 und hPMS1, sowohl durch ein Bestimmen als auch Dokumentieren von tatsächlich gefundenen Mutationen in HNPCC-Familien, und durch ein künstliches Synthetisieren von Mutanten zum Testen in experimentellen Systemen kann es eventuell möglich sein, ein Testprotokoll für eine Suszeptibilität für Krebs zu praktizieren, welches, wenn die individuellen hMLH1- oder hPMS1-Strukturen bestimmt sind, nur einen Vergleich dieser Struktur mit bekannten Mutations- gegenüber Polymorphismus-Daten erfordert.
BEISPIEL 4:
Eine weitere Methode, welche wir eingesetzt haben, um physikalische Interaktionen zwischen hMLH1 und hPMS1 zu untersuchen, kann ebenfalls verwendet werden, um zu untersuchen, ob eine bestimmte Veränderung in einem Genprodukt zu einer Änderung in dem Ausmaß der Protein-Protein-Interaktion führt. Informationen in Bezug auf Änderungen bei der Protein-Protein-Interaktion können zeigen oder bestätigen, ob eine bestimmte genomische Variation eine Mutation oder ein Polymorphismus ist. In der Folge zu den Funden unserer Labors über die Interaktion zwischen Hefe-MLH1- und PMS1-Proteinen in vitro und in vivo (U.S.-Patentanmeldung, Aktenzeichen Nr. 08/168,877) wurde die Interaktion zwischen den menschlichen Gegenstücken dieser zwei DNA-Fehlpaarungsreparaturproteine getestet. Das menschliche MLH1- und das menschliche PMS1-Protein wurden in Hinblick auf eine in vitro-Interaktion unter Verwendung der Maltosebindungsprotein (MBP)-Affinitätschromatographie getestet. hMLH1-Protein wurde als ein MBP-Fusionsprotein präpariert, über das MBP an einer Amyloseharzsäule immobilisiert und auf die Bindung an hPMS1, das in vitro synthetisiert wurde, getestet. Das hPMS1-Protein band an die MBP-hMLH1-Matrix, wogegen Kontrollproteine keine Affinität für die Matrix zeigten. Wenn das hMLH1-Protein, das in vitro translatiert wurde, über eine MBP-hPMS1-Fusionsproteinmatrix geleitet wurde, band das hMLH1-Protein an die MBP-hPMS1-Matrix, wogegen Kontrollproteine dieses nicht taten.
Potentielle in vivo Interaktionen zwischen hMLH1 und hPMS1 wurden getestet, indem das „zwei Hybrid"-Hefe-System verwendet wurde.²⁸ Unsere anfänglichen Ergebnisse zeigen, dass hMLH1 und hPMS1 in Hefe in vivo interagieren. Dasselbe System kann ebenfalls verwendet werden, um Änderungen bei der Protein-Protein-Interaktion zu detektieren, welche aus Änderungen in der Struktur des Gens oder Genprodukts resultieren und welche noch als entweder ein Polymorphismus oder eine Mutation, welche eine Suszeptibilität für Krebs verleiht, klassifiziert werden müssen.
Detektion von HNPCC-Familien und deren Mutation(en)
Es wurde geschätzt, dass ungefähr 1.000.000 Individuen in den Vereinigten Staaten ein HNPCC-Mutantengen tragen (in Bezug auf dieses heterozygot sind).²⁹ Weiterhin legen Schätzungen nahe, dass 50-60% der HNPCC-Familien Mutationen in dem MSH2-Gen, das auf dem Chromosom 2p liegt, segregieren.^1,2 Ein weiterer signifikanter Anteil scheint mit dem HNPCC-Gen assoziiert zu sein, das auf dem Chromosom 3p21-22 kartiert wird, möglicherweise aufgrund von hMLH1-Mutationen wie z.B. dem oben diskutierten Über gang von C nach T. Die Identifizierung von Familien, die Mutantenallele von entweder dem hMSH2- oder dem hMLH1-Gen segregieren, und die Bestimmung davon, welche Individuen in diesen Familien tatsächlich die Mutation aufweisen, wird bei dem frühen Eingreifen in die Krankheit von großem Nutzen sein. Ein solcher früher Eingriff wird voraussichtlich einen frühen Nachweis durch Screening und eine aggressive Folgebehandlung von betroffenen Individuen beinhalten. Zusätzlich könnte die Bestimmung der genetischen Basis für sowohl familiäre als auch sporadische Tumore die Therapiemethode bei dem primären Tumor oder bei erneut auftretenden lenken.
Anfangs werden HNPCC-Kandidatenfamilien teilweise durch die Untersuchung der Familiengeschichte, höchstwahrscheinlich auf der lokalen Ebene, z.B. durch Krankenhausonkologen, diagnostiziert. Ein Kriterium für HNPCC ist die Beobachtung einer Mikrosatelliteninstabilität bei den Tumoren des Individuums.^3,6 Der sich einfindende Patient würde auf Mutationen in hMSH2, hMLH1, hPMS1 und anderen Genen, die an der DNA-Fehlpaarungsreparatur beteiligt sind, getestet, sowie diese identifiziert werden. Dieses wird sehr einfach durchgeführt, indem Blut von dem Individuum als Probe entnommen wird. Ebenfalls in hohem Maße nützlich wäre frisch eingefrorenes Tumorgewebe. Es ist wichtig, bei dem Screeningvorgang zu beachten, dass betroffene Individuen in ihren normalen Geweben heterozygot für die störende Mutation sind.
Die verfügbaren Gewebe, z.B. Blut und Tumor, werden für eine auf einer PCR basierenden Mutationsanalyse unter Verwendung von einem oder beiden der folgenden Verfahren aufgearbeitet:
1) Verknüpfungsanalyse mit einem Mikrosatellitenmarker, der eng mit dem hMLH1-Gen verknüpft ist.
Ein Ansatz, um für Krebs anfällige Familien mit einer hMLH1-Mutation zu identifizieren, ist, eine Verknüpfungsanalyse mit einem in hohem Maße polymorphen Marker durchzuführen, der innerhalb von oder eng verknüpft mit hMLH1 lokalisiert ist. Mikrosatelliten sind in hohem Maße polymorph und daher als Marker in einer Verknüpfungsanalyse sehr nützlich. Da wir das hMLH1-Gen auf einem einzigen großen genomischen Fragment in einem P1-Phagen-Klon (~100 kbp) besitzen, ist es sehr wahrscheinlich, dass einer oder mehrere Mikrosatelliten, z.B. Stränge von Dinukleotidwiederholungen, innerhalb eines oder sehr nah an dem hMLH1-Gen existieren. Von wenigstens einem solchen Mikrosatelliten wurde berichtet.³⁸ Wenn solche Marker einmal identifiziert wurden, werden PCR-Primer entworfen, um die DNA-Strecken, welche die Mikrosatelliten enthalten, zu amplifizieren. DNA von betroffenen und nicht betroffenen Individuen aus einer Familie mit einer hohen Krebshäufigkeit werden gescreent, um die Segregation der MLH1-Marker und das Vorliegen von Krebs zu bestimmen. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um eine Iod-Score zu berechnen und damit die Wahrscheinlichkeit einer Verknüpfung zwischen hMLH1 und dem Auftreten von Krebs zu bestimmen. Wenn einmal eine Verknüpfung in einer vorgegebenen Familie festgestellt wurde, kann derselbe polymorphe Marker verwendet werden, um andere Mitglieder der Verwandtschaft auf die Wahrscheinlichkeit hin, dass diese die hMLH1-Mutation tragen, zu testen.
2) Sequenzieren von revers transkribierter cDNA

a) RNA von betroffenen Individuen, nicht betroffenen und nicht verwandten Individuen wird revers transkribiert (RT'd), gefolgt von einer PCR, um die cDNA in 4-5 überlappenden Teilen zu amplifizieren.^34, ³⁷ Man sollte beachten, dass zu den Zwecken der PCR viele verschiedene Oligonukleotidprimerpaarsequenzen potentiell verwendet werden können, um relevante Teile eines hMLH1- oder hPMS1-Gens eines Individuums zu Zwecken des genetischen Screenings zu amplifizieren. Mit der Kenntnis der cDNA-Strukturen für die Gene ist es eine unkomplizierte Übung, Primerpaare zu konstruieren, die wahrscheinlich wirksam sind, um ausgewählte Teile des Gens spezifisch zu amplifizieren. Während Primersequenzen typischerweise zwischen 20 bis 30 Basen lang sind, kann es möglich sein, kürzere Primer zu verwenden, die eventuell so klein wie ungefähr 13 Basen sind, um spezifisch ausgewählte Gensegmente zu amplifizieren. Die hauptsächliche Beschränkung dafür, wie klein eine Primersequenz sein kann, ist, dass sie lang genug sein muss, um spezifisch mit dem Zielgensegment zu hybridisieren. Die Spezifität der PCR wird im Allgemeinen durch ein Verlängern der Primer und/oder das Einsetzen von verschachtelten Paaren von Primern verbessert. Die PCR-Produkte, welche insgesamt die gesamte cDNA darstellen, werden dann sequenziert und mit bekannten Wildtyp-Sequenzen verglichen. In den meisten Fällen wird bei dem betroffenen Individuum eine Mutation beobachtet. Idealerweise wird die Art der Mutation anzeigen, dass es wahrscheinlich ist, dass diese das Genprodukt inaktivieren wird. Andernfalls muss die Möglichkeit, dass die Veränderung nicht einfach ein Polymorphismus ist, bestimmt werden. b) Gewisse Mutationen, z.B. jene, die das Spleißen beeinträchtigen oder zu Translations-Stopp-Codons führen, können die Boten-RNA, die von dem Mutantengen erzeugt wurde, destabilisieren und somit das normale RT-basierte Mutationsdetektionsverfahren umfassen. Eine vor kurzem berichtete Technik kann dieses Problem umgehen, indem getestet wird, ob die Mutanten-cDNA die Synthese eines Proteins mit normaler Länge in einem gekoppelten in vitro Transkriptions/Translations-System lenken kann.³²

3) Direkte Sequenzierung der genomischen DNA
Ein zweiter Weg, um Mutationen zu detektieren, beruht auf einer Untersuchung der Exons und der Intron/Exon-Grenzen durch PCR-Zyklus-Sequenzierung direkt ausgehend von einer DNA-Matrize.^1,2 Diese Methode erfordert die Verwendung von Oligonukleotidpaaren wie z.B. jenen, die in den Tabellen 2 und 3 oben beschrieben werden, die einzelne Exons amplifizieren, für eine direkte PCR-Zyklus-Sequenzierung. Die Methode hängt von der genomischen DNA-Sequenzinformation an jeder Intron/Exon-Grenze ab (50 bp oder mehr für jede Grenze). Der Vorteil der Technik ist zweifach. Zuerst ist, da DNA stabiler ist als RNA, der Zustand des Materials, das zur PCR verwendet wird, nicht so wichtig wie es für auf RNA basierende Protokolle ist. Zweitens wird fast jede Mutation innerhalb des tatsächlich transkribierten Bereichs des Gens, einschließlich jenen bei einem die Introns beeinflussenden Spleißen, nachweisbar sein.
Für jedes Kandidatengen kann die Detektion der Mutation eine Kenntnis von sowohl der gesamten cDNA-Struktur als auch allen Intron/Exon-Grenzen der genomischen Struktur erfordern. Mit einer solchen Information kann der Typ der ursächlichen Mutation in einer bestimmten Familie festgestellt werden. Dann wieder kann ein spezifischeres und effizientes Mutationsdetektionsschema für die bestimmte Familie angepasst werden. Das Screenen auf die Krankheit (HNPCC) ist komplex, da diese eine genetisch heterogene Grundlage in dem Sinne hat, dass mehr als ein Gen beteiligt ist und für jedes Gen mehrere Typen von Mutationen beteiligt sind.² Es ist in hohem Maße wahrscheinlich, dass jede vorgegebene Familie eine bestimmte Mutation segregiert. Wenn jedoch die Art der Mutation in mehreren Familien bestimmt wird, wird das Spektrum der am weitesten verbreiteten Mutationen in der Bevölkerung bestimmt. Im Allgemeinen wird die Bestimmung der häufigsten Mutationen die Detektion von Mutationen lenken und rationalisieren.
Da HNPCC in der menschlichen Bevölkerung so weit verbreitet ist, könnte ein Nachweis der Trägerschaft bei der Geburt ein Teil des standardisierten Testens von Neugeborenen werden. Familien mit einem Risiko können identifiziert werden und alle Mitglieder, die nicht früher getestet wurden, können getestet werden. Eventuell könnten alle betroffenen Verwandtschaften bestimmt werden.
Modus des Screenens und Testens von Mutationen
Auf DNA basierende Tests
Das anfängliche Testen, einschließlich des Identifizierens von voraussichtlichen HNPCC-Familien durch Standarddiagnose und Untersuchung der Familiengeschichte, wird voraussichtlich in lokalen und kleineren DNA-Diagnoselaboratorien durchgeführt. Jedoch wird ein Testen in großem Maßstab von mehreren Familienmitgliedern und sicherlich ein bevölkerungsweites Testen letztendlich große effiziente zentralisierte kommerzielle Einrichtungen erfordern.
Tests werden auf der Basis der Bestimmung der häufigsten Mutationen für die Hauptgene, die HNPCC zugrunde liegen, welche wenigstens das hMSH2-Gen auf dem Chromosom 2p und das MLH1-Gen auf dem Chromosom 3p einschließen, entwickelt. Es ist wahrscheinlich, dass eine Vielzahl von Tests entwickelt werden wird. Eine Möglichkeit ist beispielsweise ein Satz von Tests, die Oligonukleotidhybridisierungen einsetzen, welche die normalen gegenüber Mutanten-Allelen unterscheiden.³³ Wie bereits angemerkt macht unsere Kenntnis der Nukleotidstrukturen für die hMLH1-, hPMS1- und hMSH2-Gene die Planung von zahlreichen Oligonukleotidprimerpaaren möglich, welche verwendet werden können, um spezifische Teile eines Fehlpaarungsreparaturgens eines Individuums für ein genetisches Screenen und eine Krebsrisikoanalyse zu amplifizieren. Unsere Kenntnis der Strukturen der Gene macht ebenfalls die Planung von markierten Sonden möglich, welche schnell verwendet werden können, um das Vorliegen oder Fehlen von allen oder einem Teil von einem der DNA-Fehlpaarungsreparaturgene festzustellen. Beispielsweise können allelspezifische Oligomersonden (ASO) entworfen werden, um zwischen Allelen zu unterscheiden. ASOs sind kurze DNA-Segmente, die in der Sequenz identisch sind, außer einem Unterschied bei einer einzelnen Base, welcher den Unterschied zwischen normalen und Mutanten-Allelen widerspiegelt. Unter den geeigneten DNA-Hybridisierungsbedingungen können diese Sonden einen Unterschied in einer einzelnen Base zwischen zwei ansonsten identischen DNA-Sequenzen erkennen. Sonden können radioaktiv oder mit einer Vielzahl von nicht radioaktiven Reportermolekülen, z.B. fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Anteilen, markiert werden. Markierte Sonden werden dann verwendet, um die PCR-Probe auf das Vorliegen des krankheitsverursachenden Allels zu analysieren. Das Vorliegen oder Fehlen von mehreren verschiedenen krankheitsverursachenden Genen kann leicht in einer einzigen Probe bestimmt werden. Die Länge der Sonde muss lang genug sein, um eine nichtspezifische Bindung an Nukleotidsequenzen, die von dem Ziel verschieden sind, zu vermeiden. Alle Tests werden letztlich von einer genauen und vollständigen strukturellen Information in Bezug auf hMLH1, hMSH2, hPMS1 und andere DNA-Fehlpaarungsreparaturgene, die an HNPCC beteiligt sind, abhängen.
Auf einem Proteinnachweis basierendes Screening
Test auf der Basis der Funktionalität des Proteinprodukts per se können ebenfalls verwendet werden. Die Protein-untersuchenden Tests werden höchstwahrscheinlich Antikörperreagenzien benutzen, die entweder für die hMLH1-, hPMS1- oder hMSH2-Proteine oder andere verwandte „Krebs"-Genprodukte, soweit diese identifiziert werden, spezifisch sind.
Beispielsweise kann eine eingefrorene Tumorprobe quergeschnitten werden und zur Antikörperfärbung unter Verwendung indirekter Fluoreszenztechniken vorbereitet werden. Von gewissen Genmutationen wird erwartet, dass diese die Proteinstruktur hinreichend verändern oder destabilisieren, so dass diese nach der Antikörperfärbung ein verändertes oder verkleinertes Signal ergeben. Es ist wahrscheinlich, dass solche Tests in Fällen durchgeführt werden, wo die Beteiligung eines Gens bei dem Krebs einer Familie noch festgestellt werden muss. Wir sind dabei, diagnostische monoklonale Antikörper gegen die menschlichen MLH1- und PMS1-Proteine zu entwickeln. Wir überexprimieren menschliche MLH1- und PMS1-Proteine in Bakterien. Wir werden die Proteine reinigen, diese in Mäuse injizieren und proteinspezifische monoklonale Antikörper gewinnen, welche zu diagnostischen und Forschungszwecken verwendet werden können.
Identifizierung und Charakterisierung von DNA-Fehlpaarungsreparatur-Tumoren
Zusätzlich zu ihrem Nutzen beim Diagnostizieren der Suszeptibilität für Krebs in einem Patienten können Nukleotidsequenzen, die zu einem bakteriellen Fehlpaarungsreparaturgen homolog sind, unter anderem wertvoll für die Verwendung bei der Identifizierung und Charakterisierung von Tumoren mit defekter Fehlpaarungsreparatur sein. Eine solche Identifizierung und Charakterisierung ist wertvoll, da Tumore mit defekter Fehlpaarungsreparatur besser auf besondere Therapieregime ansprechen können. Beispielsweise können Tumore mit defekter Fehlpaarungsreparatur für DNA-schädigende Mittel empfindlich sein, insbesondere wenn diese in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden.
Defekte bei den Fehlpaarungsreparaturgenen müssen nicht in den gesamten Geweben eines Individuums vorliegen, um zu der Tumorbildung in diesem Individuum beizutragen. Eine spontane Mutation eines Fehlpaarungsreparaturgens in einer bestimmten Zelle oder einem Gewebe kann zu der Tumorbildung in diesem Gewebe beitragen. Tatsächlich ist wenigstens in einigen Fällen eine einzelne Mutation in einem Fehlpaarungsreparaturgen nicht ausreichend für eine Tumorentwicklung. In solchen Fällen ist ein Individuum mit einer einzelnen Mutation in einem Fehlpaarungsreparaturgen anfällig für Krebs, wird aber keinen Tumor entwickeln bis eine sekundäre Mutation auftritt. Zusätzlich wird in einigen Fällen dieselbe Fehlpaarungsreparaturgenmutation, die in einem Individuum strikt mit einem Tumor assoziiert ist, dafür verantwortlich sein, in einer Familie mit einer erblichen Prädisposition für eine Entwicklung von Krebs eine Suszeptibilität für Krebs zu verleihen.
Die Sequenzinformation, welche wir bereit gestellt haben, kann mit Methoden verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind, um Tumore (oder Tumorzelllinien) zu analysieren und Tumor-assoziierte Mutationen in Fehlpaarungsreparaturgenen zu identifizieren. Vorzugsweise ist es möglich, zu zeigen, dass diese Tumor-assoziierten Mutationen in nicht-Tumorgeweben aus demselben Individuum nicht vorliegen. Die in dieser Anmeldung beschriebene Information ist besonders nützlich zur Identifizierung von Fehlpaarungsreparaturgenmutationen innerhalb von Tumoren (oder Tumorzelllinien), die eine genomische Instabilität von kurzen wiederholten DNA-Elementen zeigen.
Die Sequenzinformation und Testprotokolle können ebenfalls verwendet werden, um zu bestimmen, ob zwei Tumore verwandt sind, d.h. ob ein zweiter Tumor das Ergebnis einer Metastase von einem früher gefundenen ersten Tumor ist, welcher eine bestimmte DNA-Fehlpaarungsreparaturgenmutation zeigt.
Isolieren von zusätzlichen Genen mit verwandter Funktion
Proteine, die physikalisch entweder mit hMLH1 und/oder hPMS1 interagieren, sind wahrscheinlich an der DNA-Fehlpaarungsreparatur beteiligt. In Analogie zu hMLH1 und hMSH2 wären Mutationen in den Genen, welche für solche Proteine codieren, starke Kandidaten für eine mögliche Verknüpfung mit Krebs. Ein wirkungsvoller molekulargenetischer Ansatz unter Verwendung von Hefe, welcher als ein „Zwei-Hybrid-System" bezeichnet wird, erlaubt die relativ schnelle Detektion und die Isolierung von Genen, die Proteine codieren, die mit einem interessierenden Genprodukt, z.B. hMLH1, interagieren.²⁸
Das Zwei-Hybrid-System beinhaltet zwei Plasmidvektoren, welche jeweils ein Fusionsprotein codieren sollen. Jeder der zwei Vektoren enthält einen Teil oder eine Domäne eines Transkriptionsaktivators. Die Hefezelle, welche in dem Detektionsschema verwendet wird, enthält ein „Reporter"-Gen. Der Aktivator allein kann die Transkription nicht aktivieren. Wenn jedoch die zwei Domänen in eine enge Nähe gebracht werden, dann kann eine Transkription stattfinden. Die cDNA für das Protein von Interesse, z.B. hMLH1, wird innerhalb eines Leserasters in einen der Vektoren eingeführt. Dieses wird der „Köder" genannt. Eine Bibliothek menschlicher cDNAs, die in einen zweiten Plasmidvektor eingeführt werden, um so Fusionen mit der anderen Domäne des Transkriptionsaktivators zu erzeugen, wird in die Hefezellen, welche den „Köder"-Vektor beherbergen, eingeführt. Wenn eine bestimmte Hefezelle ein Mitglied der Bibliothek empfängt, das eine menschliche cDNA enthält, die ein Protein codiert, das mit dem hMLH1-Protein interagiert, wird diese Interaktion die zwei Domänen des Transkriptionsaktivators in enge Nähe bringen, die Transkription des Reportergens aktivieren, und die Hefezelle wird blau werden. Als nächstes wird das Insert sequenziert, um festzustellen, ob es mit irgendeiner Sequenz in der Datenbank verwandt ist. Dieselbe Prozedur kann verwendet werden, um Hefeproteine bei der DNA-Fehlpaarungsreparatur oder einem verwandten Prozess zu identifizieren. Das Durchführen der „Jagd" parallel in Bezug auf Hefe und den Menschen hat gewisse Vorteile. Die Funktion von neuen Hefehomologen kann in Hefe durch Aufbrechen des Gens und anschließende Untersuchung der genetischen Folgen des Defekts in dem neu gefundenen Gen schnell bestimmt werden. Diese Untersuchungen an Hefe werden dabei helfen, die Analyse von neuen menschlichen mit „hMLH1 oder hPMS1 interagierenden" Proteinen größtenteils in derselben Weise zu führen, in der die Untersuchungen mit Hefe hinsichtlich PMS1 und MLH1 unsere Untersuchungen der menschlichen MLH1- und PMS1-Gene beeinflusst haben.
Herstellung von Antikörpern
Durch die Verwendung unserer Kenntnis der DNA-Sequenzen für hMLH1 und hPMS1 können wir die gesamten oder Teile der vorhergesagten Proteinstrukturen zu dem Zweck, Antikörper herzustellen, synthetisieren. Eine wichtige Anwendung für Antikörper, die gegen hMLH1- und hPMS1-Proteine gerichtet sind, wird sein, andere Proteine einzufangen, welche an der DNA-Fehlpaarungsreparatur beteiligt sein könnten. Beispielsweise können Antikörper, die entweder gegen hMLH1 oder hPMS1 gerichtet sind, durch Einsetzen von Coimmunpräzipitationstechniken zusammen mit anderen assoziierten Proteinen, die funktional und/oder physisch verwandt sind, ausgefällt werden. Eine weitere wichtige Anwendung für Antikörper wird zu dem Zweck sein, hMLH1- und hPMS1-Proteine aus Tumorgewebe zu isolieren. Die hMLH1- und hPMS1-Proteine aus Tumoren können dann zu dem Zweck, geeignete Behandlungsstrategien zu bestimmen, charakterisiert werden.
Wir sind dabei, monoklonale Antikörper zu entwickeln, die gegen die hMLH1- und hPMS1-Proteine gerichtet sind.
BEISPIEL 5:
Wir haben ebenfalls das folgende Verfahren verwendet, um polyklonale Antikörper zu erzeugen, die gegen die menschliche und die Maus-Form des PMS1-Proteins gerichtet sind.
Wir haben ein 3'-Fragment der Maus-PMS1-cDNA in den bakteriellen Expressionsplasmidvektor pET (Novagen, Madison, WI) eingefügt. Der erwartete exprimierte Teil des Maus-PMS1-Proteins entspricht einem Bereich von ungefähr 200 Aminosäuren am Ende des PMS1-Proteins. Dieser Teil des mPMS1 ist im Verhältnis zu Hefe-PMS1 konserviert, ist aber weder im Verhältnis zu dem menschlichen noch dem Maus-MLH1-Protein konserviert. Ein Grund, warum wir diesen Bereich des PMS1-Proteins zur Erzeugung von Antikörpern ausgewählt haben, ist, dass wir nicht wollten, dass die resultierenden Antikörper mit MLH1 kreuzreagieren. Das Maus-PMS1-Proteinfragment wurde in E. coli hoch exprimiert, aus einem Polyacrylamidgel gereinigt, und das eluierte Protein wurde dann zur Injektion in Tiere vorbereitet. Ungefähr 2 mg des PMS1-Proteinfragments wurden zur Injektion in Kaninchen zu der Pocono Rabbit Farm (Kaninchenfarm) (PA) geschickt. Seren aus Kaninchen wurden mehrere Male unter Verwendung von Standard-ELISA-Techniken gegen das PMS1-Antigen titriert (tittered). Kaninchen-Antikörper, die für das Maus-PMS1-Protein spezifisch waren, wurden affinitätsgereinigt, indem Säulen verwendet wurden, die immobilisiertes Maus-PMS1-Protein enthielten. Die affinitätsgereinigte polyklonale Antikörperpräparation wurde weiterhin unter Verwendung von Western Blotting und Punkt-Blotting getestet. Wir fanden, dass die polyklonalen Antikörper nicht nur das Maus-PMS1-Protein sondern ebenfalls das menschliche PMS1-Protein, welches sehr ähnlich ist, erkannten. Auf der Basis von Western Blots gibt es keinen Hinweis, dass andere Proteine, einschließlich sowohl der menschlichen als auch der Maus-MLH1-Proteine, in stärkerem Ausmaß durch unseren Antikörper erkannt wurden.
Mäuse mit Defekt bei der DNA-Fehlpaarungsreparatur
BEISPIEL 6:
Um ein experimentelles Modellsystem für die Untersuchung von DNA-Fehlpaarungsreparaturdefekten und resultierendem Krebs in einem Systems eines ganzen Tieres zu schaffen, haben wir Mäuse mit einem Defekt bei der DNA-Fehlpaarungsreparatur unter Verwendung der embryonalen Stamm (ES)-Zellen-Technologie entwickelt. Unter Verwendung von genomischer DNA, die einen Teil des mPMS1-Gens enthielt, haben wir einen Vektor konstruiert, der bei homologer Rekombination ein Aufbrechen des chromosomalen mPMS1-Gens verursacht. Es wurde bestätigt, dass Maus-ES-Zellen aus dem Mausstamm 129 ein aufgebrochenes mPMS1-Allel enthielten. Die ES-Zellen wurden in C57/BL6-Wirtsblastozysten injiziert, um Tiere zu erzeugen, die chimär oder eine Mischung von 129- und C57/BL6-Zellen waren. Der Einbau der ES-Zellen wurde durch das Vorliegen von Flecken einer Agouti-Fell-Färbung (welche einen Beitrag von ES-Zellen anzeigt) bestimmt. Alle männlichen Chimären wurden mit weiblichen C57/BL6-Mäusen gepaart.
Anschließend wurden zwölf Nachkommen (F₂) geboren, bei welchen die Agouti-Fell-Farbe nachgewiesen wurde, was die Keimbahnübertragung des genetischen Materials aus den ES-Zellen anzeigte. Eine Analyse von DNA, welche aus der Schwanzspitze der zwölf Nachkommen extrahiert wurde, zeigte an, dass sechs der Tiere für die mPMS1-Mutation heterozygot waren (ein Wildtyp- und ein Mutanten-Allel enthielten). Von den sechs heterozygoten Tieren waren drei weiblich (die Tiere F₂-8, F₂-11 und F₂-12), und drei waren männlich (F₂, F₂-10 und F₂-13). Vier Zuchtställe (breeding pens) wurden eingerichtet, um Mäuse, die im Hinblick auf die mPMS1-Mutation heterozygot waren, und zusätzliche heterozygote Mäuse zu erhalten. Zuchtstall #1, welcher die Tiere F₂-11 und F₂-10 enthielt, ergab eine Gesamtanzahl von dreizehn Mäusen in drei Würfen, von denen vier genotypisiert wurden. Zuchtstall #2 (Tiere F₂-8 und F₂-13) ergab zweiundzwanzig Tiere und drei Würfe, von denen drei genotypisiert wurden. Von den sieben genotypisierten Tieren sind drei homozygote weibliche Tiere identifiziert worden. Ein Tier starb im Alter von sechs Wochen aus unbekannten Gründen. Die verbleibenden homozygoten Weibchen leben im Alter von zwölf Wochen und sind gesund. Die Ergebnisse zeigen, dass Mäuse mit einem homozygoten Defekt bei mPMS1 lebensfähig sind.
Die Zuchtställe #3 und #4 wurden verwendet, um die mPMS1-Mutation in den C57/BL6-Hintergrund zurück zu kreuzen. Zuchtstall #3 (Tier F₂-12 gekreuzt mit einer C57/BL6-Maus) erzeugte einundzwanzig Tiere in zwei Würfen, von denen neuen genotypisiert wurden. Zuchtstall #4 (Tier F₂-6 gekreuzt mit einer C57/BL6-Maus) ergab acht Mäuse. Zusätzlich hat die ursprüngliche männliche Chimäre (Zuchtstall #5) einunddreißig zusätzliche Nachkommen erzeugt.
Um die Tiere zu genotypisieren wurde eine Serie von PCR-Primern entwickelt, die verwendet werden, um Mutanten- und Wildtyp-mPMS1-Gene zu identifizieren. Diese sind (SEQ ID NOS: 143-148, in dieser Reihenfolge):

Primer 1: 5'TTCGGTGACAGATTTGTAAATG-3'
Primer 2: 5'TTTACGGAGCCCTGGC-3'
Primer 3: 5'TCACCATAAAAATAGTTTCCCG-3'
Primer 4: 5'TCCTGGATCATATTTTCTGAGC-3'
Primer 5: 5'TTTCAGGTATGTCCTGTTACCC-3'
Primer 6: 5'TGAGGCAGCTTTTAAGAAACTC-3'

Primer 1 + 2 (auf 5' abzielend)
Primer 1 + 3 (nicht auf 5' abzielend)
Primer 4 + 5 (auf 3' abzielend)
Primer 4 + 6 (nicht auf 3' abzielend)

Die Mäuse, welche wir entwickelt haben, liefern ein Tiermodellsystem zur Untersuchung der Folgen von Defekten bei der DNA-Fehlpaarungsreparatur und resultierendem HNPCC. Das langfristige Überleben von Mäusen, die für die mPMS1-Mutation homozygot und heterozygot waren, und die Typen und der zeitliche Verlauf von Tumoren in diesen Mäusen werden bestimmt. Die Mäuse werden täglich auf irgendeinen Hinweis auf den Ausbruch von Krebs, wie dieser von einem trübsinnigen Erscheinungsbild in Kombination mit einer Verschlechterung bei dem Zustand des Fells angezeigt wird, gescreent. Diese Mäuse, welche eine mPMS1-Mutation tragen, werden verwendet, um die Auswirkungen von anderen Faktoren, umweltbedingten und genetischen, auf die Tumorbildung zu testen. Beispielsweise kann die Auswirkung der Ernährung auf einen Darm- und anderen Typen von Tumoren für normale Mäuse gegenüber jenen, welche eine mPMS1-Mutation entweder in dem heterozygoten oder homozygoten Genotyp tragen, verglichen werden. Zusätzlich kann die mPMS1-Mutation in verschiedene genetische Hintergründe gestellt werden, um etwas über Interaktionen zwischen Genen des Fehlpaarungsreparaturwegs und anderen Genen, die an menschlichem Krebs beteiligt sind, z.B. p53, zu lernen. Mäuse, die mPMS1-Mutationen tragen, werden ebenfalls nützlich sein, um die Wirksamkeit einer somatischen Gentherapie auf die Krebsfälle, die in Mäusen entstehen, beispielsweise die erwarteten Darmkrebsfälle, zu testen. Weiterhin können isogene Fibroblastenzelllinien aus den homozygoten und heterozygoten mPMS1-Mäusen zur Verwendung in verschiedenen Zellstudien, einschließlich der Bestimmung von spontanen Mutationsraten, geschaffen werden.
Wir konstruieren derzeit einen Vektor zum Aufbrechen des Maus-mMLH1-Gens, um Mäuse zu entwickeln, welche eine Mutation in mMLH1 tragen. Wir werden Mäuse, die Defekte in mPMS1 tragen, mit Mäusen, welche Defekte in mMLH1 tragen, vergleichen. Zusätzlich werden wir Mäuse konstruieren, die Mutationen in beiden Genen tragen, um zu sehen, ob es eine synergistische Wirkung gibt, wenn Mutationen in zwei HNPCC-Genen vorliegen. Andere Studien über die mMLH1-Mutantenmäuse werden so sein, wie oben für die mPMS1-Mutantenmäuse beschrieben wurde.
Sequenzprotokoll
Die in dem Sequenzprotokoll verwendeten englischen Begriffe haben folgende deutsche Bedeutung:

Claims

Verfahren zur Diagnose der Suszeptibilität eines Individuums für Darmkrebs, aufweisend: Detektieren des Vorhandenseins einer Mutation in einer hMLH1 Nukleinsäuresequenz, welche erhältlich ist durch: i) Bereitstellen eines ersten degenerierten Primers, welcher der Aminosäuresequenz GERGEA entspricht, und eines zweiten degenerierten Primers mit der Sequenz von SEQ ID NO: 140. ii) Durchführen einer PCR unter Verwendung der Primer mit einer cDNA, welche von in Kultur gehaltenen primären humanen Fibroblasten erhalten wurde, um ein PCR Produkt zu erzeugen, und; iii) Isolieren der vollständigen hMlh1 Sequenz aus einer humanen cDNA Bibliothek unter Verwendung des Produkts als Sonde, wobei die Mutation nachgewiesen wird durch Vergleichen einer hMLH1 Sequenz, welche aus einem Gewebe des Individuums isoliert wurde, mit einer Wildtyp hMLH1 Sequenz, wobei das Vorhandensein einer Mutation ein Hinweis auf die Suszeptibilität des Individuums für Darmkrebs ist, und wobei die Mutation gekennzeichnet ist durch eine C zu T Transitionsmutation, welche eine nicht-konservative Aminosäuresubstitution bei Position 44 des hMLH1 Proteins (SEQ ID NO:5) erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hMLH1 Nukleinsäuresequenz die Sequenz von SEQ ID NO:4 hat.
Verfahren zur Diagnose der Suszeptibilität eines Individuums für Darmkrebs, aufweisend: Detektieren des Vorhandenseins einer Mutation in einer hPMS1 Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO:132, wobei die Mutation detektiert wird durch Vergleichen einer hPMS1 Nukleinsäuresequenz, welche von einem Gewebe des Individuums isoliert wurde, mit einer Wildtyp hPMS1 Sequenz, wobei das Vorhandensein einer Mutation ein Hinweis auf die Suszeptibilität des Individuums für Darmkrebs ist.
Verfahren zur Diagnose der Suszeptibilität eines Individuums für Darmkrebs, aufweisend: Detektieren der Bildung eines Antikörpers, welcher spezifisch an ein hMLH1 Polypeptid mit der Sequenz von SEQ ID NO:5 oder eines hPMS1 Polypeptids mit der Sequenz von SEQ ID NO: 133 bei einer von dem Individuum erhaltenen Probe bindet, wobei das Ausmaß der Bindung des Antikörpers ein Hinweis auf die Suszeptibilität des Individuums für Darmkrebs ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Detektierens aufweist: Amplifizieren eines Segments der isolierten hMLH1 Sequenz; Vergleichen des amplifizierten Segments mit einem analogen Segment der Wildtyp hMLH1 Sequenz; und Detektieren eines Unterschieds zwischen dem amplifizierten Segment und dem analogen Segment, wobei der Unterschied ein Hinweis auf die C zu Transitionsmutation in der hMLH1 Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des Detektierens aufweist: Amplifizieren eines Segments der isolierten hPMSH1 Sequenz; Vergleichen des amplifizierten Segments mit einem analogen Segment der Wildtyp-hPMS1 Sequenz; und Detektieren eines Unterschieds zwischen dem amplifizierten Segment und dem analogen Segment, wobei der Unterschied ein Hinweis auf eine Mutation in der hPMS1 Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Unterschied in der Nukleotidsequenz aus der Gruppe gewählt ist, die aus Deletionen von mindestens einem Nukleotid, Insertionen von mindestens einem Nukleotid, Substitutionen von mindestens einem Nukleotid und Nukleotidumlagerungen besteht.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Schritt des Amplifizierens aufweist: Reverse Transkription eines gesamten oder eines Teils eines RNA- Genprodukts zu DNA; und Amplifizieren eines Segments der durch reverse Transkription erzeugten DNA.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt des Amplifizierens aufweist: Auswählen eines Paares von Oligonukleotid-Primern, welche an entgegengesetzten Strängen des DNA-Segments und in entgegengesetzter Orientierung hybridisieren können; und Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion, welche die Oligonukleotid-Primer verwendet, so dass die Nukleinsäure zwischen den Primern amplifiziert wird, um das amplifizierte Segment zu werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Detektierens einer Mutation das Bestimmen aufweist, ob der Unterschied zwischen dem amplifizierten Segment und dem analogen Segment einen betroffenen Phänotyp bewirkt.
Isoliertes Polynukleotid, welches ein DNA mismatch repair Protein kodiert und die Sequenz von SEQ ID NO: 132 aufweist.
Isoliertes DNA mismatch repair Polypeptid, welches durch das isolierte Polynukleotid von Anspruch 11 kodiert wird.
Isoliertes DNA mismatch repair Polypeptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 133.
Aufgereinigter Antikörper, welcher spezifisch an ein Polypeptid gemäß Anspruch 12 oder Anspruch 13 bindet.
Antikörper nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Eine Sonde, aufweisend: Eine Nukleotidsequenz von weniger als 500 bp, welche spezifisch durch Watson/Crick-Paarbildung mit einer Tm von > 55°C an komplementäre Basen von SEQ ID NO: 4 binden kann und eine Markergruppe, welche an die Sequenz angehängt ist, wobei die Markergruppe eine Eigenschaft hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz, Radioaktivität und Chemielumineszenz.
Eine Sonde, aufweisend: eine Nukleotidsequenz, welche spezifisch durch Watson/Crick-Paarbildung mit einer Tm von > 55° an komplementäre Basen von SEQ ID NO: 132 binden kann, und eine Markergruppe, welche an die Sequenz angehängt ist, wobei die Markergruppe eine Eigenschaft hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz, Radioaktivität und Chemielumineszenz.