CN102296105A

CN102296105A - 一种检测mlh1基因突变的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN102296105A
Application number: CN2010102120480A
Authority: CN
Inventors: 南蓬; 徐烨; 韦雯倩; 刘方奇; 刘雷
Original assignee: Fudan University; Fudan University Shanghai Cancer Center
Current assignee: Fudan University; Fudan University Shanghai Cancer Center
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2011-12-28

Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域。本发明提供了一种检测MLH1基因突变的方法：首先，获得样品中MLH1基因的启动区或者编码区的DNA序列或者氨基酸序列，然后与正常MLH1基因的相应序列对比确定样品中MLH1基因是否存在基因突变情况；所述的编码区是MLH1基因的第1号、第2号或者第19号外显子。本发明还提供了相应的检测MLH1基因突变的试剂盒以及该方法在确定遗传性非息肉性结直肠癌致病患者方面的应用。本发明的检测方法简便易行，成本低廉，高效快速，结果明了。可以大大减轻患者的负担，尽早排除非HNPCC患者，为结直肠癌患者的用药方案提供了参考。

Description

一种检测MLH1基因突变的方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学和医学领域。涉及人MLH1基因的突变及其用途。具体涉及人MLH1基因(MLH1gene)的突变(Mutations)及其与遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)相关性的检测。

背景技术

″结直肠癌″(CRC)在肿瘤中向来有″富贵病″之称，表明其与人们的生活习惯有着密切的联系。在上海，随着生活水平的提高，结直肠癌的发病率已跃居常见恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌。据复旦大学附属肿瘤医院资料统计，近几年结直肠癌手术量连年攀升，2007年该院结直肠癌手术量近900例，2008年已突破千例，达到了1027例。遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)，又称为林奇综合症，是一种常染色体显性遗传性疾病，约占结直肠癌的5％[Umar A，RisingerJI，Hawk ET，Barrett JC.Testing guidelines for hereditary non-polyposis colorectalcancer[J].Nat Rev Cancer 2004；4：153-8]，外显率高达80％-90％。HNPCC是由DNA错配修复基因(MMR)突变引起的，主要发生在MLH1，MSH2和MSH6，比较少的发生在PMS1和PMS2中[Peltomaki P，Vasen HF.Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectalcancer：Database and results of a collaborative study-The InternationalCollaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer[J].Gastroenterology 113：1146-1158，1997]。目前，用于筛选HNPCC的方法尽管较多，但只有检测出胚系(germline)的MMR基因病理性突变才能确诊为HNPCC患者[Cai Q，Sun MH，Fu G，et al.Mutation investigation of h MLH1 and hMSH2 genes in hereditary nonpolyposis coloncancer families from China[J].J Chin Pathol，2003，32：323-328.]。

HNPCC无论是在治疗措施上还是在随访方案上均与散发性结直肠癌者不同，Syngal S等研究发现，HNPCC肿瘤对常用化疗药如5-氟尿嘧啶(5-FU)等有耐药反应[De Vos Tot NederveenCappel WH，Meulenbeld HJ，Kleibeuker JH et al.Survival after adjuvant 5-FU treatmentfor stage III colon cancer in hereditary nonpolyposis colorectal cancer[J].InternalJ Cancer 2004：109：468-471.]。因此HNPCC患者的确诊对于选择合适的治疗方案、确定随访时间及间隔、判断预后，以及对家族成员进行二级预防等具有重要意义[Liu SR，Zhao B，Wang Z J，et al.Cl inical features and mismatch repair gene mutation screening inChinese patients with hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma.World JGastroenterol，2004，10：2647-2651.]。对于已发现存在遗传性错配修复基因突变的患者，可以密切监测异时多原发癌和其他HNPCC相关肿瘤的发生，并对其家族中的其他成员，特别是尚未出现肿瘤的年轻成员进行相应检测，确认突变基因携带者，不但有助于对癌症易感个体重点进行临床监测和临床症状出现前的早期诊断，也可为遗传咨询和基因治疗提供依据，并可使非突变携带者免除不必要的精神和经济负担，对基因突变携带者，可以进行密切随访，以做到早期诊断，早期治疗。

与HNPCC致病密切相关的错配修复基因中，MLH1基因位于3p21-23，其突变率是所有相关基因中最高的。全球范围内对于MMR突变的研究很多，可是中国对此的研究很少。在所有的突变研究中，迄今为止，尚没有与本发明内容相似的报道。

发明内容

本发明的目的是提供检测HNPCC易感基因突变情况的方法、试剂盒及其用途。尤其是人MLH1基因(c.-64G＞T，c.157_160delGAGG，c.2159insG)在检测HNPCC及早期诊断HNPCC家系中的用途。

本发明中，MLH1基因c.157_160delGAGG(蛋白质氨基酸位置52Glu/Ala并在一个氨基酸之后终止)，c.2159insG(蛋白质氨基酸位置720Vla/Gly并在两个氨基酸之后终止)均为移码突变，为病理性突变可导致HNPCC的发生。c.-64G＞T处于MLH1基因的启动区域，为HNPCC易感位点。

本发明所述的MLH1基因的详细信息可参见OMIM号为*120436的基因(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，该基因的详细序列可参见GenBank号为27805154的基因(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全长是60250bp。

本发明对MLH1基因中的全19个外显子及其接合位点，还有部分启动区域进行了测序。图1显示了MLH1c.-64G＞T的测序结果，图2显示MLH1c.157_160delGAGG的测序结果，图3显示MLH1c.2159insG的测序结果。

本发明提供了检测样品中是否存在MLH1基因突变方法，其思路为：

(a)用MLH1基因特异性引物扩增样品的MLH119个外显子及其接合位点，还有部分启动区域；

(b)检测扩增产物中是否存在突变，包括碱基改变，插入及缺失。以及突变的类型和致病性分析。

本发明提出了一种检测MLH1基因突变的方法，首先，获得样品中MLH1基因的启动区或者编码区的DNA序列或者氨基酸序列，然后与正常MLH1基因的相应序列对比确定样品中MLH1基因是否存在基因突变情况。所述的编码区包括MLH1基因的第1号、第2号或者第19号外显子。

所述的突变即样品MLH1基因与正常MLH1基因的相应序列不同。所述的突变包括MLH1c.-64G＞T、c.157_160delGAGG或者c.2159insG。所述的突变可以是MLH1c.-64G＞T、c.157_160delGAGG或者c.2159insG。所述的突变可以是p.Glu53AlafsX1或者p.Val720GlyfsX2。

本发明中，所述的c.-64G＞T是指MLH1基因64位G→T，所述的c.157_160delGAGG是指157_160位的GAGG缺失4bp，所述的c.2159insG是指2159位插入1个G；所述的p.Glu53AlafsX1是指蛋白质氨基酸位置52Glu/Ala并在一个氨基酸之后终止，所述的p.Val720GlyfsX2是指蛋白质氨基酸位置720/ValGly并在两个氨基酸之后终止。

检测时通常需要先获得样品的DNA。例如抽取待检测者的血样，提取DNA，然后，通过PCR(聚合酶链反应)大量扩增，再进行相应检测。

相应的，本发明还提供了一种检测MLH1基因突变的试剂盒，该试剂盒含有下列三对引物序列中的一对或者几对：

(1)扩增MLH1基因的第1号外显子区的DNA序列的引物；

(2)扩增MLH1基因的第2号外显子区的DNA序列的引物；

(3)扩增MLH1基因的第19号外显子区的DNA序列的引物。

扩增方法可以采用PCR(聚合酶链反应)。除非特别提出，可采用常规的试剂、设备和操作方法进行扩增。通过测序可以明确扩增产物的DNA序列，即样品中MLH1基因相应位置的DNA序列。

具体而言，该试剂盒含有如SEQ ID NO 1-6中任意一条或者几条的引物。其中，SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2可用于扩增含有MLH1基因的第1号外显子区的DNA序列；SEQ ID NO 3和SEQID NO 4可用于扩增含有MLH1基因的第2号外显子区的DNA序列；SEQ ID NO 5和SEQID NO 6可用于扩增含有MLH1基因的第19号外显子区的DNA序列。

例如，该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 5和6所示的引物；或者该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 3和4所示的引物；或者该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 1和2所示的引物。

除了上述引物外，试剂盒中通常还可以含有缓冲液、PCR所需试剂、标准对照和说明书等。

本发明还提供了上述检测MLH1基因突变的方法的应用，即将该方法用于遗传性非息肉性结直肠癌致病性分析，将该方法用于确定遗传性非息肉性结直肠癌的患病风险。

本发明中，检测MLH1基因的三个突变的基因型也可用于诊断HNPCC。检测针对基因组DNA。MLH1基因的以上三种基因型可用已有的技术如DNA序列分析、PCR、变性高效液相色谱分析(DHPLC)等检测突变。

本发明提供的检测样品中是否存在MLH1基因突变的方法，可用于对个体的HNPCC易感性进行诊断，它包括步骤：检测该个体的MLH1基因编码区、接合位点和部分启动区域是否与普通人群存有差异，以此判断该个体患HNPCC的风险是否高于普通人群，发生突变基因型的个体患HNPCC的风险显著高于普通人群，应当进一步对其真个家族进行检测以及保持随访监测。

本发明MLH1基因的突变可用于结直肠癌的个性化治疗时的参考。使用本发明发现的携带基因突变患者，即被判定为HNPCC患者，治疗方案及用药均与散发性结直肠癌患者不同。在使用本发明MLH1基因突变位点的同时，还可参考使用其他治疗结直肠癌症的药剂。本发明的检测方法简便易行，成本低廉，高效快速，结果明了。可以大大减轻患者的负担，尽早排除非HNPCC患者，为结直肠癌患者的用药方案提供了参考。

附图说明

图1显示了MLH1基因启动区域-64为G/T基因型的检测结果。

图2显示了MLH1基因第2号外显子157_160为缺失GAGG基因型的检测结果。

图3显示了MLH1基因第19号外显子2159插入1个G的基因型的检测结果。

具体实施方式

实施例1MLH1基因突变检测

一、实验材料：

(一).主要试剂

PCR相关试剂：TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司高效，包括PCR扩增用Taq DNAPolymerase，TaKaRa Code：DRR001A，TaKaRa Ex Taq(5U/μl)，10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Plus)，dNTP Mixture(各2.5mM)。引物：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Marker：天根生化科技有限公司(Marker I)。纯化试剂盒：北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒(100次)。

(二).重要仪器：

1.PCR仪：Eppendorf AG 22331Hamburg

eppendorf Mastercycler epgradient S

220-240V 50-60Hz 800W

2.离心机：Eppendorf AG 22331Hamburg

eppendorf Centrifuge 5415D

230V 0.8A 50-60Hz 180W

Max speed：13200min^-1Kinetic energy：3100Nm Max density of liquid：1.2kg/dm³

3.漩涡振荡混匀器：其林贝尔仪器制造公司QL-901Vortex

4.掌式离心机：其林贝尔仪器制造公司LX-200

5.微量加样器：eppendorf Research(0.1-2.5，1-10，2-20，10-100，20-200，50-1000μl)

6.电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司TE212-L Max 210g d＝0.01g

7.电泳仪：上海申能博彩生物科技有限公司PowerBC 300H1A

二、引物设计与合成：

以MLH1基因19个外显子全序列为模板，使用Primer Permier 5.0软件分析引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物信息见表1。

表1

基因	外显子	片段大小	上游引物序列	下游引物序列
					hMLH1	1	226	5’-M13-cactgaggtgattggctgaa	5’-tcgtagcccttaagtgagc
	2	207	5’-M13-tacattagagtagttgcaga	5’-cagagaaaggtcctgactc
						19	267	5’-gacaccagtgtatgttgg	5’-M13-gaaagaagaacacatcccaca

三、样本检测：

抽取待检测者血样，分离基因组DNA。

(一).PCR扩增和产物鉴定：

1.PCR反应体系：反应总体积为50μl。模板为外周血基因组DNA。

10*PCR缓冲液 5μl

2.5mMdNTP 4μl

上游引物(5μm) 3.5μl

下游引物(5μm) 3.5μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.4μl

DNA模板 1.5μl

补足去离子水至终体积 50μl

PCR反应条件：

MLH1基因：

1号外显子：94℃预变性5min，之后按94℃45sec、55℃45sec、72℃60sec进行35个循环，然后72℃延伸10min，至10℃结束。

2号外显子：94℃预变性5min，之后按94℃45sec、54℃45sec、72℃60sec进行35个循环，然后72℃延伸10min，至10℃结束。

19号外显子：94℃预变性5min，之后按94℃45sec、51℃开始，每一循环升高0.1℃45sec、72℃60sec进行35个循环，然后72℃延伸10min，至10℃结束。

(二).PCR产物纯化

采用BioDev公司Gel Extraction System B(B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒)对PCR产物进行纯化(以下为试剂盒中使用手册步骤)。

1.估算胶块体积(可以按胶块密度为1g/ml将胶块在EP管中称重后计算)，按100μl胶块加500μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，或55℃-65℃溶胶约为10min，其间偶尔摇动至胶块完全溶解。或按100μl胶块加300μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，55℃-65℃溶胶约10min，其间偶尔摇动，再按照100μl胶块加入150μl的比例加入异丙醇，混匀。

2.胶块完全溶解后将溶胶液转移至吸附柱中，室温12,000rpm离心30s；去掉废液。

3.向吸附柱中加入500μl漂洗液(Wash buffer)，12,000rpm离心30s。倒掉废液。

4.重复步骤3，倒掉废液后空管12,000rpm离心2min以完全去除漂洗液。

必要时可将吸附柱开盖置于洁净空气放置5min，否则残存的乙醇会影响后续酶促反应。

5.将吸附柱移至一个干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央加入适当体积的洗脱缓冲液(Elution buffer，通常用30μl-50μl)或去离子水，室温放置1-2min，12,000rpm离心2min洗脱DNA。

最后将纯化产物进行DNA测序，由上海桑尼生物科技有限公司进行。

实施例2 突变类型及致病性分析结果

样本源于复旦大学附属肿瘤医院结直肠癌门诊。在10位愿意接受MLH1基因检测的结直肠癌患者中，有编号如下的病人有MLH1基因突变，具体检测结果如下。这三位病人均为遗传性非息肉性结直肠癌患者。

表2

病人编号	基因	突变位点	蛋白质改变
				H86	MLH1	c.-64G＞T
H76	MLH1	c.157_160delGAGG	p.Glu53Al afsX1
				H224	MLH1	c.2159insG	p.Val 720Gl yfsX2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测MLH1基因突变的方法，其特征在于，该方法是获得样品中MLH1基因的启动区或者第2号或者第19号外显子的DNA序列或者氨基酸序列，然后与正常MLH1基因的相应序列对比确定样品中MLH1基因是否存在基因突变情况。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变是样品MLH1基因与正常MLH1基因的DNA序列中64、157-160或者2159位不同。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的突变是c.15716_0delGAGG或者c.2159insG。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变是样品MLH1基因与正常MLH1基因的相应氨基酸序列中53或者720位不同。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的突变是p.Glu53AlafsX1或者p.Val720GlyfsX2。

6.一种检测检测MLH1基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有下列三对引物序列中的一对或者几对：

(1)扩增MLH1基因的第1号外显子区的DNA序列的引物；

(2)扩增MLH1基因的第2号外显子区的DNA序列的引物；

(3)扩增MLH1基因的第19号外显子区的DNA序列的引物。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 5和6所示的引物。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有序列如SEQ ID NO 3和4所示的引物。

9.权利要求1所述的方法的应用，其特征在于，将该方法用于遗传性非息肉性结直肠癌的致病性分析。

10.权利要求1所述的方法的应用，其特征在于，将该方法用于确定遗传性非息肉性结直肠癌的患病风险。