CN1898396A - 通过定量测定正常组织中的表观突变评价疾病的风险 - Google Patents

通过定量测定正常组织中的表观突变评价疾病的风险 Download PDF

Info

Publication number
CN1898396A
CN1898396A CNA2004800380823A CN200480038082A CN1898396A CN 1898396 A CN1898396 A CN 1898396A CN A2004800380823 A CNA2004800380823 A CN A2004800380823A CN 200480038082 A CN200480038082 A CN 200480038082A CN 1898396 A CN1898396 A CN 1898396A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
mensuration
disease
epigenetic
mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800380823A
Other languages
English (en)
Inventor
R·L·沃德
D·I·K·马丁
C·M·萨特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Victor Chang Cardiac Research Institute Ltd
St Vincents Hospital Sydney Ltd
Original Assignee
Victor Chang Cardiac Research Institute Ltd
St Vincents Hospital Sydney Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2003905747A external-priority patent/AU2003905747A0/en
Application filed by Victor Chang Cardiac Research Institute Ltd, St Vincents Hospital Sydney Ltd filed Critical Victor Chang Cardiac Research Institute Ltd
Publication of CN1898396A publication Critical patent/CN1898396A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在个体中评估疾病风险的测定，其中所述测定包括如下步骤，从所述个体的正常组织中分离细胞群体，以及在所述细胞群体中定量测定特定基因的表观突变频率，其中所述基因的表观突变与所述疾病有关，并且所述基因是不同于进行正常来源亲本特异性表达的基因。优选地，表观突变是肿瘤抑制基因，如hMLH1、hMSH2、APC1A、APC1B和p16的DNA甲基化。

Description

通过定量测定正常组织中的表观突变评价疾病的风险
发明领域
本发明涉及用于在个体中评估疾病(例如癌症)风险的测定。具体地是，本发明涉及评价疾病风险的测定，包括在来自个体的正常组织的细胞群体中定量测定特定基因中表观突变(epimutation)的频率，其中基因的表观突变与一种或多种疾病相关。
发明背景
表观遗传(epigenetic)修饰和基因表达
表观遗传修饰是导致基因功能改变的分子事件，其由因子而不是DNA序列的改变来介导。对基因功能的表观遗传效应通常导致基因的转录沉默，其可能通过有丝分裂维持，从而产生转录沉默的克隆模式。沉默可能发生的概率介于0和1之间，从而在一个多细胞生物中产生基因表达(或沉默)的嵌合模式。尽管所有细胞都具有相同的遗传组成，但是也发生该嵌合表达。在一些情况中，在种系中维持表观遗传修饰，从而产生可遗传的效应(“表观遗传”)。表观遗传效应的分子基础比DNA中简单的4碱基密码还要更复杂，且由于这个原因，表观遗传以与孟德尔式遗传的简单模式非常不同的模式发生。
最熟知的表观遗传修饰之一是胞嘧啶甲基化(“DNA甲基化”)，其对于正常人的发育是不可缺少的并且参与亲本印记、转座因子的抑制以及雌性动物中X失活的正常生理过程(在Jones和Takai 2001，以及Bird 2002中的综述)。在所有哺乳动物中，基本上在二核苷酸CpG内发生胞嘧啶甲基化。在人基因组中，CpG二核苷酸内的大多数胞嘧啶残基是甲基化的，但是在某些称作“CpG岛”的富含CpG区中小部分保持非甲基化(Antequera和Bird 1993)。CpG岛常常与细胞基因的调控区相关，且人类基因的大部分在其5’端都包括CpG岛。
组蛋白和染色质结构变化是影响基因表达的另一种表观遗传修饰。的确，已经发现这两种类型的表观遗传修饰对与(虽然不只是)CpG岛内的DNA甲基化有关的基因表达具有极大的影响(Jenuwein和Allis 2001)。例如，转录活性的基因通常与组蛋白亚基3的第四个赖氨酸(K4)(H3K4)的乙酰化有关，而沉默的和甲基化的基因与脱乙酰化的H3K4、H3K9的甲基化以及HP1色结构域(chromodomain)的募集有关(Kouzarides 2002)。事实上，最近的证据表明在对主要通过对这些关键组蛋白亚基的修饰所导致的染色质结构改变的反应中发生DNA甲基化(Tamaru和Selker 2001)，并表明DNA甲基化的作用是巩固已沉默的状态。因此，可认为DNA甲基化是稳定沉默的遗传基因座的“特征”。
然而，由于许多没有CpG甲基化的非人物种仍然显示表观遗传沉默现象，所以DNA甲基化不是基因沉默的绝对必要条件或“特征”。因此，在人基因组中，大概有许多基因没有CpG岛启动子，其将仍然易受由组蛋白和染色质结构改变所介导的表观遗传修饰，而不是DNA甲基化的影响。然而，可很容易和低成本地测定DNA甲基化，使得其成为研究人类表观遗传修饰的有吸引力的靶。
检测表观遗传改变的方法
如上所述，测定表观遗传改变的最简单的方法是检验CpG甲基化。传统地，通过DNA印迹杂交进行CpG甲基化分析，其评价已知基因的CpG岛内的甲基化敏感的限制酶位点，然而，最近，已可利用测定CpG甲基化的更复杂的方法，如COBRA(组合亚硫酸氢盐限制分析；Xiong和Laird 1997)、亚硫酸氢盐等位基因测序(Frommer等1992)以及MSP(甲基化特异性PCR)，并且所述方法允许在整个目标CpG岛更详细地分析CpG甲基化。
具体地是，DNA的亚硫酸氢盐修饰现在允许鉴别甲基化的CpG和非甲基化的CpG，这是由于亚硫酸氢盐处理使非甲基化的胞嘧啶通过脱氨基作用转化成尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶被保护起来避免脱氨基作用，因而仍然没有改变。用亚硫酸氢盐处理后，该方法要求用链特异性引物通过PCR扩增亚硫酸氢盐修饰的序列，以产生尿嘧啶残基被扩增为胸腺嘧啶，以及仅5-甲基胞嘧啶残基被扩增为胞嘧啶的产物。然后该PCR产物可很容易地被限制酶消化以区别甲基化的和非甲基化的等位基因(COBRA)，或者被克隆并被测序以提供单个DNA链的甲基化图。
MSP，另一种广泛使用的甲基化测定方法，可评估CpG岛内CpG位点的甲基化状态，其不依赖于甲基化敏感的限制酶的使用。在该方法中，亚硫酸氢盐修饰后用仅对甲基化的DNA特异的引物进行扩增，并导致给定序列内任何超甲基化的(hypermethylated)等位基因的扩增(美国专利No 5,786,146)。
此外，检测表观遗传修饰的方法不限于CpG甲基化的分析。即，也可通过各种方法检测表观遗传修饰，其测定结合到DNA的转录活性区或沉默区上的特异性蛋白，或者与活性或沉默状态相关的蛋白修饰(例如，检测组蛋白的特异性修饰，以及检测其它蛋白如HP1的同系物)。目前，通常通过与抗体的免疫沉淀以及随后对所沉淀的材料中存在的DNA序列的分析，对这些蛋白修饰进行测定。
疾病的遗传基础
预测疾病，如癌症的素因的努力到目前为止一直主要基于年龄、个人史或家族史，或者偶尔通过遗传异常(即种系突变)的遗传。例如，在所有具有明显乳腺癌家族史的个体中大约一半人都存在BRCA基因中的突变。然而，这只占全部乳腺癌的小于1％，在绝大多数剩余病例中没有与单基因中的缺陷一致的家族模式。大量其它疾病也存在类似的情况。的确，表1提供了60种以上已与某种基因有联系的疾病的列表，但是其中仅有相对较小部分的病例可通过单一素因遗传改变来解释。
对于具有表现出遗传，但是没有单一素因遗传改变证据的某些家族模式的疾病的共同解释是，该病是由多基因的相互作用所导致。与此相符，可通过几个基因的组合作用产生性状(其可表现为疾病)，但是那些基因中仅有某些等位基因将有助于形成该性状。这种性状被称作“数量性状”、“复杂性状”和“多基因性状”，且由这种机理所导致的疾病通常被称作“多因子的”或“多基因的”疾病(综述见Risch 2000，以及Botstein和Risch 2003)。
因此在大多数情况中遗传研究不能预测疾病的素因。然而，在显示明显的疾病史，如乳腺癌的家族中仅少数患者可能显示单一素因遗传改变的事实提示，许多个体对癌症有先天的素因，而其基础当前还是未知的。
表观突变
基因可能通过表观遗传修饰而失活。术语“表观突变”首先由Holliday(Holliday 1987)定义为“基因甲基化中的可通过有丝分裂遗传的改变”，然而该术语后来被延伸，也指其它类型的表观遗传修饰。如这里所使用的，术语“表观突变”指在不存在DNA序列改变时，基因表达的任何异常沉默。该定义特别地排除了正常进行亲本印记(也称作“基因组印记”或简单地称作“印记”)的基因的异常沉默。亲本印记是一种正常过程，涉及由等位基因的亲本来源所决定的基因的一种等位基因转录状态的改变(即，正常地进行来源亲本(parentof origin)特异性表达的基因的一种等位基因转录状态的改变)。该过程有时是异常的，从而导致丧失单等位基因表达，因此表达是双等位基因的或者完全不表达。
现有技术
迄今为止，种系表观突变的唯一清楚的实例来自于有花植物柳穿鱼(toadflax)(Linaria vulgaris)的天然存在的变体(Cubas等1999)。在这个实例中，发现了控制对称的基因Lcyc的双等位基因的甲基化和转录沉默是花表型改变的原因。发现该表型有些不稳定，有回复的倾向(即，突变体植株上的一些花显示野生型外观，这与Lcyc甲基化丧失有关)。显示突变体表型的植株能够通过种系将表观突变传递到它们的子代。在植株中不能很好地分离种系和躯体，然而这可能解释该表观突变在至少250年期间相对不稳定存在的原因。
表观突变在肿瘤细胞中常见。现在有大量文献记载许多类型肿瘤中的表观突变，以及它们与受影响基因活性的反比关系(综述见Jones和Laird 1999，Wolffe和Matzke 1999，以及Baylin和Herman2000)。在一些情况中，肿瘤抑制基因的表观遗传沉默引起不同的肿瘤表型。例如，在散发的结肠直肠癌中，大约15％的肿瘤显示微卫星不稳定性(MSI)。MSI是有缺陷的错配修复的特征，但是这些癌症中仅有很少的部分将通过错配修复基因中的遗传改变来解释。现在已知hMLH1基因启动子的双等位基因的甲基化在大多数情况中是造成MSI肿瘤的原因(Herman等1998，以及Wheeler等1999)。MSI结肠直肠癌也显示IGF2处的印迹丧失(LOI)(Cui等1998)，其可能也有表观遗传基础(Cui等2002)。也已经证明不仅在MSI肿瘤中可检测到LOI，而且在这些患者的正常组织也检测到，包括它们的外周血(Cui等2003)。在少数正常对照以及在高百分比的结肠直肠癌患者的外周血中发现LOI，导致外周血中的LOI是结肠直肠癌风险的指标的假说(美国专利No 6,235,474)。
一直没有在人类中描述种系表观突变，尽管可在近交小鼠的特定品系agouti可存活黄色(Avy)中观察到相关的现象。这些小鼠携带Avy等位基因，其中将脑池内A颗粒(IAP)反转录转座子插入到agouti(A)基因的5’端(Duhl等1994)。当IAP是表观遗传活性的时，agouti转录是从IAP的5′LTR内的隐蔽性的启动子开始的。通过IAP取消agouti的紧密的组织特异性表达，其LTR在许多或所有组织中有活性，且结果agouti可能在Avy小鼠中泛细胞地(pancellularly)表达。已发现该IAP的CpG甲基化与异位agouti表达反向相关，并且这种表观遗传修饰似乎在Avy小鼠中引起表型的变化，其不仅包括黄色皮毛颜色，而且包括肥胖、II型糖尿病以及肿瘤易感性。显著地，这种表型以克隆的模式在许多个体中是嵌合的，表明IAP在一些细胞中是活性的，而在其它细胞中是沉默的。此外，最近的数据表明存在世代之间Avy IAP甲基化的不完全删除，导致表观基因型(epigenotype)的部分母体遗传(Morgan等1999)。这提示表观遗传修饰的种系传递在哺乳动物中是可能的。
需要评估疾病风险的方法
期望在个体中评估疾病风险的新的和改良的方法(即，预测疾病的素因)。即，疾病风险的知识可能允许采纳预防性治疗和避免疾病危险因素，而且在疾病或症状开始后可进一步有助于鉴定优选的治疗。优选地，评估风险的方法相对简单而且是非侵害的或者仅使个体感到最小的不适。
本申请已在患有显示丧失hMLH1蛋白的肿瘤的癌症患者的正常组织(例如，外周血)中，检测到了肿瘤抑制基因hMLH1启动子中的表观突变(即CpG甲基化)，并且已令人惊奇地发现，在这种正常组织的细胞中所检测到的表观突变的频率预示着癌症风险的水平。
发明概述
因此，本发明提供在个体中评估疾病风险的测定，其中所述测定包括下列步骤：
(i)从所述个体的正常组织中分离细胞群体，和
(ii)在所述细胞群体中定量测定特定基因的表观突变的频率，其中所述基因的表观突变与所述疾病有关，并且所述基因是不同于进行正常来源亲本特异性表达的基因。
附图简述
图1显示实施例1中外周血中的hMLH1 COBRA甲基化分析。
(A)该照片显示COBRA筛选测定的实例。具体地是，显示44名癌症患者外周血DNA中C区COBRA的结果。在这个亚群中，一名患者显示C区中hMLH1的甲基化，其通过PCR产物(上面的条带)的消化产生两个更小的片段得到证明，它们似乎是一个带(箭标所示)。(B)这些照片显示个体VT和TT的外周血的A、B和C区COBRA结果。在左边显示每个区相对于转录起始位点的位置。对于每个区，PCR产物(上面的条带)的消化产生更小的片段表明在该区域中有甲基化。+，RKO细胞系；-，健康对照的血液DNA。
图2显示在来自实施例1中的两个个体的有代表性的癌症中hMLH1表达的免疫组织化学分析。上面图片中的癌来自VT(左边是乳房，中间是子宫内膜，右边是结肠)，下面图片中的癌来自TT(左边是结肠，中间是肝胰管壶腹，右边是十二指肠)。所有癌显示完全丧失hMLH1表达。对于所有肿瘤，插图显示相同肿瘤对hMSH2的阳性染色。用苏木精对免疫过氧化物酶复染；条(左下)代表100μm。
图3显示实施例1中的VT和TT躯体组织的亚硫酸氢盐测序分析。(A)显示A、B和C区相对于所测序区域(点线)的位置的hMLH1基因座的示意图示。(B)在(A)中所定义的带点区内的hMLH1的序列。用于扩增该区域的引物用下划线标注。用粗体突出显示该结构域内的CpG双联体并从1编号到17。也以更大文本显示的G和A突出显示单核苷酸多态性。(C)该图显示在TT和VT的各种躯体组织中亚硫酸氢盐等位基因测序的结果。黑色和白色正方形代表单个CpG，并根据它们在(B)中所示序列中的位置进行编号。灰色或白色圆圈分别代表A或G基因型。每个水平的正方形行代表单个等位基因的结果。在TT和VT患者中，超甲基化的等位基因总是G基因型，而A等位基因仅显示块状甲基化并且从来不被超甲基化。镶嵌现象在TT的毛囊中以及在VT的所有组织中很明显，正如通过偶然的G等位基因的甲基化不足所证明的。
图4显示实施例1中TT精子的亚硫酸氢盐测序分析的结果。(A)该照片显示用于从患者TT的纯化的精子中扩增甲基化的等位基因的杂种MSP-COBRA PCR的结果。注意到与阳性对照细胞系(+)相比，精子的扩增较弱。在阴性对照(健康供体的外周血)中没有见到扩增。(B)该图显示来自(A)中所示精子的片段的亚硫酸氢盐等位基因测序的结果。黑色和白色正方形代表单个CpG，并根据它们在图3(B)所示序列中的位置编号。灰色或白色圆圈分别代表A或G基因型。每个水平的正方形行代表单个等位基因的结果。在精子中，仅G等位基因被超甲基化，而A等位基因甲基化不足。在16个G等位基因中有10个镶嵌现象明显，证明甲基化不足。
图5提供在来自实施例1的癌症患者的正常肠组织中hMLH1甲基化的分析结果。(A)该照片显示在14名癌症患者的正常肠组织中，COBRA筛选测定的实例。显示于hMLH1C区COBRA的结果。在该亚群中，一名患者显示在正常肠组织在C区中hMLH1的甲基化，其通过消化PCR产物(上面的条带)产生两个更小的片段得到证明，其似乎是一个条带(箭标所示)。(B)该图显示来自(A)中所示正常肠的片段的亚硫酸氢盐等位基因测序的结果。黑色和白色正方形代表单个CpG，并根据它们在图3B中所示的序列中的位置进行编号。白色圆圈代表G基因型。每个水平的正方形行代表单个等位基因的结果。清楚地存在超甲基化的等位基因，并且总是G基因型。该患者是hMLH1 SNP的GG纯合子，因此不能测定镶嵌现象。
图6提供来自实施例2中所测定的健康个体的MSP产物的有代表性的亚硫酸氢盐测序。每个水平的正方形行代表单个等位基因的结果。黑色和白色正方形分别代表甲基化的或非甲基化的单个CpG。在健康个体中hMLH1(A)和p16(B)基因中都清楚地存在超甲基化的等位基因。
发明详述
本发明提供了在个体中评估疾病风险的测定，其中所述测定包括下列步骤：
(i)从所述个体的正常组织中分离细胞群体，和
(ii)在所述细胞群体中定量测定特定基因的表观突变的频率，其中所述基因的表观突变与所述疾病有关，所述基因是不同于进行正常来源亲本特异性表达的基因。
在细胞群体中所测定的表观突变的频率预示着所述个体中疾病的风险(即，预示着所述疾病的素因)。例如，可通过在1×106细胞中至少出现一次，或更优选地在1×103细胞中至少出现一次，或最优选地，在5×102细胞中至少出现一次的确定的表观突变频率，来预测疾病的阳性风险(即，疾病的素因)。表观突变的预测频率可根据所测定细胞的来源而变。即，在测定中所使用的细胞可来自正常组织如，例如，正常外周血、正常毛囊以及口腔的正常组织，且所确定的预示疾病风险的频率可跨过那些不同正常组织的类型而变。
如这里所使用的，术语“正常组织”指基本上是健康的并且不显示疾病的任何显著症状或病征的任何组织(例如，该组织不是癌性的)，且包括所有正常的躯体组织。如上所示，在测定中所使用的细胞可来自正常的外周血、正常的毛囊和口腔的正常组织。除了这些，适于测定的细胞可来自其它正常的躯体组织，包括正常的结肠粘膜。优选地，在测定中所使用的细胞来自正常的外周血。
所测定的表观突变可以是任何已知表观遗传修饰，包括DNA甲基化(或DNA的其它共价修饰)、组蛋白和染色质结构改变(例如，组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化或遍在蛋白化)，或者复合体中其它蛋白与所影响的基因座(例如HP1和同系物)DNA的结合。
所测定的表观突变是一种与将要评估素因的疾病有关的表观突变。例如，表观突变存在于包括了在疾病的表现或发展中所涉及的基因的染色体基因座中。表1提供在60种以上疾病中所涉及的基因的列表，且表观突变可能因此是一种存在于包括至少一种被列举的所涉及基因的染色体基因座中的表观突变，所述测定因而用于评估与该基因相关的疾病。所测定的表观突变可存在于基因的启动子或基因的其它调控区中，并且与基因的转录沉默有关。
优选地，所测定的表观突变是一种与癌症有关的表观突变。更优选地，所测定的表观突变存在于肿瘤抑制基因中，如hMLH1、hMSH2、APC 1A、APC 1B和p16。
更优选地，所测定的表观突变存在于hMLH1中。
可通过直接测定单个DNA链上的甲基化的胞嘧啶(或者其它修饰)或者通过另外测定所汇集的DNA/染色质，而不检查单个DNA链，在所测定的细胞群体中确定表观突变的频率。
为了本发明的性质可被更清楚地理解，因而现在参考下列非限制性的实施例描述优选的方式。
实施例2
材料和方法
患者样品
在本研究中包括来自St Vincent′s Hospital(悉尼，NSW，澳大利亚)的188名有癌症个人史的个体和来自Victorian Clinical GeneticsService(墨尔本，VIC，澳大利亚)的另外50名个体。在这些个体中，65名在筛选hMSH2、hMLH1或APC中的有害种系改变后是突变阴性的，而18名患有增生性息肉病，剩余的155名仅有结肠直肠癌的个人史。
使用标准酚氯仿法(Sambrook等1989)从外周血、组织学上正常的结肠粘膜、颊膜涂片、毛囊和精子中提取DNA。为了排除在精子中污染的体细胞的可能性，在DNA提取前将精液在FACSVantageDiVa(Becton Dickinson，Lexington，KY，美国)上进行分选。根据所描述的方法(Schoell等1999)进行碘化丙锭染色后，根据DNA的含量鉴定精子。通过FACS和显微镜术证实所分选的精子的纯度。
MSI分析
在从石蜡包埋的组织中提取DNA前，用组织学方法检查邻近的切片以确保其含有60％以上的肿瘤组织。如果事实并不是这样，那么对肿瘤的病灶进行显微解剖。根据前述方法测定每个肿瘤的微卫星状态，其中使用下列引物组：Bat 25、Bat 26、Bat 40、D5S346、D2S123和D17S250(Ward等2001)。认为具有在两个或更多标记上不稳定的肿瘤是微卫星不稳定的，而将所有的其它肿瘤称作微卫星稳定的(MSS)。
hMSH2和hMLH1的免疫组织化学染色
在DAKO自动染色器(autostainer)中在脱蜡的4μm石蜡切片(DAKO Corporation，Carpinteria，CA，美国)上进行免疫组织化学分析。根据前述方法进行hMLH1和hMSH2染色，其中使用单克隆抗人hMLH1抗体(1∶200，Becton Dickinson，Lexington，KY，美国)和单克隆抗人hMSH2抗体(1∶400，Pharmingen，San Diego，CA，美国)。在存在核染色时，在附近的生发型滤泡淋巴细胞或者在相邻的非肿瘤隐窝底部的上皮细胞中没有肿瘤细胞的染色时，认为不存在hMLH1或hMSH2的表达。在没有MSI的结果、种系或CpG甲基化结果的知识时，报告了免疫染色的分析。
甲基化筛选测定
接着将每种样品的基因组DNA(2μg)进行亚硫酸氢盐修饰(Frommer等1992)。使用COBRA(组合亚硫酸氢盐和限制分析；Xiong和Laird 1997)作为所有基因的筛选试验。在一组10个候选基因启动子中，即在CDKN2A、hMLH1、HPP1、HIC1、RASSF1A、BRCA1、APC14和1B、Blm以及O6MGMT中筛选DNA的表观突变。在表2中显示相关测定的PCR引物、反应条件和PCR后分析信息。在每个反应中最多使用100ng亚硫酸氢盐处理过的DNA。在每个PCR中，包括阳性和阴性对照，且这些分别是细胞系RKO(M Brattain馈赠)和健康供体的外周血DNA。
hMLH1启动子的等位基因型分析
通过未修饰的基因组DNA的RFLP分析，测定相对于hMLH1转录起始位点-33位上的单核苷酸多态性(SNP)。在表2中显示引物、反应条件和限制酶切消化细节。
亚硫酸氢盐等位基因测序
使用亚硫酸氢盐测序更详细地检查在COBRA筛选测定中证明为阳性结果的样品。对于hMLH1，这包括设计简并PCR，以扩增非甲基化的和甲基化的等位基因，随后用BigDyes系统(ABI)进行单个等位基因的克隆(pGEM-T，Promega)和测序。在表2中显示用于扩增该片段的引物和PCR条件。设计该片段以包括上述G/A SNP。
用杂交PCR策略分析亚硫酸氢盐修饰的精子DNA，其中使用甲基化特异性5’引物和甲基化简并的3’引物以富集甲基化的序列(表2)。
结果和讨论
在两个个体的所有成年组织中都存在hMLH1的甲基化
在所筛选的94名个体中，在两名个体的外周血细胞的DNA中检测到了hMLH1处的甲基化(图1A)。甲基化延伸到整个hMLH1启动子，其包括在称为A、B和C的区域中(图1B)。当将A、B和C筛选测定应用到来自这些患者的毛囊和颊粘膜的DNA时，发现了类似的结果。这些不相关的个体TT(男性)和VT(女性)年龄为64和65岁，且两者都有已只通过手术成功地治疗的多种原发恶性肿瘤的个人史。在表3中显示这些个体的临床详细资料，以及错配修复蛋白的免疫染色和他们的肿瘤的微卫星检验的结果。所有所检验的肿瘤都显示微卫星不稳定性(MSI)，这是错配修复缺乏的特征。在存在hMSH2的正常染色时，通过免疫组织化学方法证实了在每个肿瘤中都丧失了hMLH1蛋白(图2)。虽然TT和VT先前检验了种系在错配修复基因中的突变，但是尽管用许多不同的方法进行了广泛的筛选，仍然没有鉴定到有害的突变。
为了测定TT和VT的组织内CpG甲基化的分布以及构建详细的甲基化图谱，进行亚硫酸氢盐等位基因测序。通过RFLP分析，发现TT和VT两者在hMLH1中相对于转录起始位点的-33位上的G/A单核苷酸多态性上都是杂合的。亚硫酸氢盐测序证实了杂合性，而且也揭示在所检验的所有组织中甲基化限于一个亲本等位基因(图3)。在两个个体中，受影响的等位基因都是G基因型。在任何组织中从来没有发现A等位基因超甲基化，尽管某些CpG位点在某些等位基因上偶尔被甲基化。这种块状甲基化的意义还不知道，但是其不可能与hMLH1沉默有关。
在两名患者的某些组织中观察到嵌合的甲基化(图3)。发现患者VT在她的外周血(1/15)、毛囊(2/12)以及颊粘膜(1/11)中具有一些甲基化不足的G等位基因。在躯体组织中，患者TT仅在毛囊中显示镶嵌现象，在15个G等位基因中有一个甲基化不足。镶嵌现象在TT的精子中最明显。尽管COBRA测定产生不定的弱的和阴性结果(数据没有显示)，但是当使用MSP-COBRA杂交PCR检验精子时清楚地存在甲基化的等位基因(图4)。在所扩增的等位基因中，仅G等位基因(6/16)显示超甲基化。不过由于杂交PCR的偏倚性质，所以这不是频率的指示。然而，基于测定灵敏度的界限，估计在患者TT的精子中1/500-1/1000的等位基因是甲基化的。
在患癌症个体的结肠粘膜中hMLH1的甲基化
也筛选来自患结肠直肠癌的个体的正常结肠组织(n＝133)，所述结肠直肠癌散发性地或在增生性息肉病背景中发生。鉴定了一名在正常结肠组织中具有hMLH1的CpG甲基化的个体(图5A)。对该个体(NB1，一名65岁的老年男性)用亚硫酸氢盐测序进行更详细地评估(图5B)，并发现hMLH1中-33位的G SNP是纯合的，因此使得镶嵌现象水平的测定变得不可能。然而，序列测定的确证实在他的正常结肠中NB1具有相当大百分比的超甲基化的hMLH1等位基因(即，14％；3/21等位基因)。也可能通过COBRA评估NB1的外周血、毛发和颊粘膜中的hMLH1甲基化，尽管所有测定都是阴性的。患者NB1在57岁时患肾细胞癌，在63岁时在增生性息肉病的背景中同时在盲肠(微卫星不稳定)和乙状结肠(微卫星稳定)中患结肠直肠癌。
其它基因的甲基化
所检验的所有患者在CDKN2A、hMLH2、HPP1、HIC1、RASSF1A、BRCA1、APC1A和1B、Blm以及O6MGMT中的甲基化都是阴性的。
实施例2
方法和材料
血液样品
从22名健康的血液供体中采集外周血。
根据实施例1中的所述方法从外周血中提取DNA。
甲基化筛选测定
根据实施例1中所描述的方法，将每个外周血样品的基因组DNA(2μg)进行亚硫酸氢盐修饰。然后用hMLH1基因座和p16基因座(肿瘤抑制基因)的甲基化特异性引物(即，与其中引物结合位点内的CpGs是甲基化的DNA杂交的引物)对亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR。在表4中列举了所用引物的详细资料。
结果和讨论
在22名健康的血液供体中，如通过用甲基化特异性引物的PCR后存在特异性产物得到证明的，12名供体具有少许可检测水平的超甲基化的hMLH1。对于p16基因，29名健康的血液供体中有18名显示可检测水平的超甲基化的等位基因。对于这两个基因，通过亚硫酸氢盐测序证实PCR产物是超甲基化的。在图6中显示有代表性的测序。
该实施例的结果表明健康的个体通常携带可检测水平的hMLH1或p16基因被表观突变的细胞。已知hMLH1或p16中的一个等位基因以及实际上许多其它肿瘤抑制基因的失活，使细胞易于通过第二个等位基因的丧失或失活而变成恶性的。在实施例1中，描述了两名在所有或者几乎所有他们的体细胞中都携带表观突变的癌症患者(即，VT和TT)；因此在该实施例中所研究的正常个体大概仅在一小部分他们的体细胞中携带表观突变。然而，认为这些细胞具有通过第二个等位基因的丧失或失活而变成恶性的风险，并且这种风险高于不携带表观突变的细胞。因此断定，在个体中携带表观突变的细胞越多，该个体患癌症的风险就越高；其类似于由遗传突变的镶嵌携带所导致的疾病。因此，可通过测量携带特定表观突变的体细胞的比例来评价患癌症的风险。同样地，类似地应当通过测量携带特定表观突变的体细胞的比例来评估患由种系表观突变(特别地，如果在仅有一个等位基因失活，即单倍不足(haploinsufficiency)，或者仅有一部分体细胞受该损失的影响，即镶嵌现象时，疾病发生)所导致的其它疾病的风险。
表1  人类疾病和与这些疾病表型有关的基因的列表
  系统分类   疾病   所涉及的基因(来自人在线孟德尔式遗传(OMIM)的参考文献)
  血液疾病   Gaucher病血友病A血友病BNiemann Pick病阵发性睡眠性血红蛋白尿血色素沉着病von Willebrand病   酸性-β葡糖苷酶；HEMA(因子VIII)；因子IX；鞘磷脂磷酸二酯酶；PIG-A；SLC11A3；TFR2；HLA-H
  癌症   包括乳腺癌和卵巢癌、恶性黑素瘤、多发性内分泌腺瘤形成、神经纤维瘤病、胰癌、多囊性肾病、前列原癌、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、结节性硬化症、von Hipple-Lindau综合征、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、神经节细胞瘤、嗜铬细胞癌；基底细胞癌；软组织肉瘤；脑瘤；睾丸癌；妇科恶性肿瘤；   BRCA1；BRCA2；BRCA3；APC；hMLH1；hMSH2；hMSH6；hPMS1；hPMS2；CDKN2；MEN1；NF1；NF2；DPC4；PKD1；HPC1基因座；Rb；E钙粘着蛋白；hamartin；马铃薯球蛋白；VHL；PRKARIA；PTEN；MMAC1；TEP1；CDK4；MET；SDHB；SDHC；SDHD；BMPR1A；p53；RET；PTC；WT；LKB1
  消化系统   溃疡性结肠炎；Crohn氏病青少年糖尿病Wilson氏病   CD19；涎福林蛋白；CD11；IL-4受体IDDM1；IDDM2；IDDM3，-4，-5，-6，-7，-10，-12，-13，15，-18；GCK；INSR；AVPR2；ATP7B
  眼、耳、鼻和喉   聋症；Pendred综合征；Best病；青光眼；脉络膜和视网膜回旋形萎缩   连接蛋白26；pendrin；VMD2；GLC1A鸟氨酸酮酸转氨酶
  内分泌  肾上腺脑白质营养不良自身免疫性多腺体综合征Cockayne综合征II形糖尿病  ABCD1AIRECSA；CSBHNF-4α；葡糖激酶；HNF-1α；IPF-1；HNF-1β；NUEROD1；IRF-1；IPF1
  心血管  共济失调-毛细血管扩张症长QT间期综合征扩张性心肌症肥大性心肌症Tangier病特发性高血压惊厥动脉粥样硬化  ATMKCNQ1肌营养不良蛋白，核纤层蛋白A/C；心肌动蛋白β肌球蛋白重链；α原肌球蛋白；心肌钙蛋白T和I；肌球蛋白结合蛋白C；肌球蛋白轻链；钙调磷酸酶；ABC1；血管紧张素原；β2上腺素能受体；α内收蛋白；血管紧张肽转化酶；血清对氧磷酶；内皮氧化氮合酶；PAI-1；纤维蛋白原B；MTHFR；盐皮质素受体apoE；LDL受体；肝脂酶；
免疫系统 DiGeorge综合征具有高IgM的免疫缺陷IgA缺陷重度联合免疫缺陷自身免疫病包括SLE、Sjogren综合征、硬皮病、I型糖尿病、腹部疾病、炎性肠病、自身免疫性溶血性贫血   DGSTNFSF56p21.3(基因座)IL2RG；JAK3；ADAMHC II类基因CTLA-4；IL-2；AIRE
  肌肉和骨  肌萎缩性侧索硬化CharcotMarieTooth综合征杜兴肌营养不良Marfan综合征骨关节炎   SOD1CMT基因座肌营养不良蛋白FBN1
  神经系统  阿尔茨海默病肌萎缩性侧索硬化Angelman综合征癫痫帕金森病苯丙酮尿症Prader-Willi综合征Refsum病Rett综合征精神分裂症脊髓性肌萎缩Tay-Sachs病   PS1；PS2SOD1；CNTFUBE3AEPM2Aalpha-synuclein；UCHL1parkinPAHSNRPNPAHXMeCP2神经调节蛋白；reelinSMN1HEXA
表2  各种hMLH1基因座的扩增方法
*所有反应都用FastStart Taq聚合酶、每种引物1uM、2mM MgCl2和0.25mM dNTPs进行。
  测定类型   基因座   引物和5′-3′序列   PCR循环*   产物大小  PCR后的分析
COBRA MLH1-A-691至-442   MLH1 AFTTAYGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA(SEQ IDNO：1)MLH1 ARCCTATACCTAATCTATCRCCRCCTCA(SEQ IDNO：2) 1x  94℃5分钟10x 94℃/30秒 65℃/60秒(-1°/循环)25x 94℃/30秒 55℃/45秒 155bp 用2U TaiI消化产物。如果是甲基化的，产物将消化产生108和48bp片段。
MLH1-B-444至-103   MLH1 BFAAATTTTTTAATTTTGTGGGTTG(SEQ ID NO：3)MLH1 BRACTTCCATCTTACTTCTTTTAAAC(SEQ ID NO：4) 1x  94℃5分钟10x 94℃/30秒；60℃/60秒(-1°/循环)25x 94℃/30秒；50℃/45秒 344bp  用2U Hinf I消化产物。如果是甲基化的，产物将消化产生178和164bp片段。
MLH1-C-291至-42   MLH1 CFGGTTGGATATTTYGTATTTTTYGAG(SEQ ID NO：5)MLH1 CRAATTACTAAATCTCTTCRTCCCTCC(SEQ ID NO：6) 1x  94℃5分钟10x 94℃/30秒；65℃/60秒(-1°/循环)25x 94℃/30秒；55℃/45秒 140bp   用2U Bst U1消化产物。如果是甲基化的，产物将消化产生74和69pb片段。
等位基因型分析 G/A SNP在-33 MLH1 SNP5GCATCTCTGCTCCTATTGGCTGGATA(SEQ IDNO：7)MLH1 SNP3AGTGCCTTCAGCCAATCACCTCAGTG(SEQ IDNO：8) 1x  94℃5分钟10x 94℃/30秒；65℃/60秒(-1°/循环)20x 94℃/30秒；55℃/45秒 296bP   用Pvu II消化产物。A/A基因型将不消化，A/G将部分消化产生296，247和40bp片段。G/G将完全消化成247和40bp。
等位基因测序 MLH1-372至-52   MLH1 DEG5TATTTTAGTAGAGGTATATAAGTTYGG(SEQ IDNO：9)MLH1 DEG3CCTTCAACCAATCACCTCAATACC(SEQ ID NO：10) 1x  94℃5分钟10x 94℃/30秒；62℃/60秒(-1°/循环)26x 94℃/30秒；52℃/45秒 324bp 将产物克隆到PGEM-T载体中并对单个克隆进行测序。
杂交PCR MLH1-326至-52   MLH1 MSP5ATTGGTTGGATATTTCGTATTTTTC((SEQ ID NO：11)MLH1 DEG3CCTTCAACCAATCACCTCAATACC(SEQ ID NO：12) 1x  94℃5分钟10x 94℃/30秒；62℃/60秒(-1°/循环)27x 94℃/30秒；52℃/45秒 276bp   将产物克隆到PGEM-T载体中并对单个克隆进行测序。
表3对来自具有实施例1的hMLH1甲基化的两个个体(VT和TT)的肿瘤进行微卫星检验和免疫染色的结果。显示患每种肿瘤时的年龄。H＝微卫星不稳定性，ND是由于DNA不足或者不能获得肿瘤而没有做。免疫染色显示为有(Pos)、无(Neg)或者没有做(ND)。
  癌   年龄   MLH1IHC   MSH2IHC   MSI
TT   结肠直肠-盲肠结肠直肠-降结肠十二指肠-3种同时发生的肿瘤肝胰管壶腹   43445159   NegNDNegNeg   PosNDPosPos   HNDHH
VT   结肠直肠-盲肠子宫内膜黑素瘤乳房-浸润导管   46535763   NegNegNDNeg   PosPosNDPos   HHNDH
表4在实施例2中的甲基化特异性PCR中所使用的引物
基因座 引物序列5′-3′ PCR循环   产物大小
hMLH1-162至+40   正向：TAGTAGTCGTTTTAGGGAGGGAC(SEQ ID NC：13)反向：AAAAAACGTCTAAATACTCAACGAA(SEQ ID NC：14) 1x 94℃5分钟10x 94℃/30秒；62℃/60秒(-1°/循环)30x 94℃/30秒；52℃/45秒 202
p16+256至+352   正向：GTTGGTTACGGTCGCGGTTC(SEQIDNC：15)反向：CCGACCGTAACTATTCGATACG(SEQ ID NO：16) 1x 94℃5分钟10x 94℃/30秒；65℃/60秒(-1°/循环)30x 94℃/30秒；55℃/45秒 96
在整个说明书中，词“包括(comprise)”或者变形如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将被理解为意味着包括所述要素、整体或步骤，或者要素、整体或步骤的组，但是不除外任何其它要素、整体或步骤，或者要素、整体或步骤的组。
在本说明书中所提及的所有出版物都在此引入作为参考。在本说明书中所包括的文献、法令、材料、设备、文章等的任何讨论仅用于提供本发明的背景的目的。由于其在本申请每个权利要求的优先权日前存在于澳大利亚或者别处，因此不应当被认为是承认这些材料中的任何一种或者全部形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关领域中的常规普通知识。
本领域技术人员将会意识到在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可对如在具体实施方案中所示的本发明作出多种改变和/或修改。因此，在所有方面都认为本发明的实施方案是说明性的而不是限制性的。
参考文献
1.Antequera，F.and A.Bird.1993.CpG islands.Exs 64：169-85.
2.Baylin，S.B.and J.G.Herman.2000.DNA hypermethylation in tumorigenesis：epigeneticsjoins genetics.Trends Genet 16：168-74.
3.Bird，A.2002.DNA methylation patterns and epigenetic memory.Genes Dev 16：6-21.
4.Botstein，D.and N.Risch.2003.Discovering genotypes underlying human phenotypes：past successes for mendelian disease，future approaches for complex disease.Nat Genet 33：228-37.
5.Cubas，P.，C.Vincent，and E.Coen.1999.An epigenetic mutation responsible for naturalvariation in floral symmetry.Nature 401：157-61.
6.Cui，H.，M.Cruz-Correa，F.M.Giardiello，D.F.Hutcheon，D.R.Kafonek，S.Brandenburg，Y.Wu，X.He，N.R.Powe，and A.P.Feinberg.2003.Loss of IGF2 imprinting：a potential marker ofcolorectal cancer risk.Science 299：1753-5.
7.Cui，H.，I.L.Horon，R.Ohlsson，S.R.Hamilton，and A.P.Feinberg.1998.Loss of imprintingin normal tissue of colorectal cancer patients with microsatellite instability.Nat Med 4：1276-80.
8.Cui，H.，P.Onyango，S.Brandenburg，Y.Wu，C.L.Hsieh，and A.P.Feinberg.2002.Loss ofimprinting in colorectal cancer linked to hypomethylation of H19 and IGF2.Cancer Res 62：6442-6.
9.Duhl，D.M.，H.Vrieling，K.A.Miller，G.L.Wolff，and G.S.Barsh.1994.Neomorphic agoutimutations in obese yellow mice.Nat Genet 8：59-65.
10.Frommer，M.，L.E.McDonald，D.S.Millar，C.M.Collis，F.Watt，G.W.Grigg，P.L.Molloy，and C.L.Paul.1992.A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.Proc Natl Acad Sci USA 89：1827-31.
11.Herman，J.G.，A.Umar，K.Polyak，J.R.Graff，N.Ahuja，J.P.Issa，S.Markowitz，J.K.Willson，S.R.Hamilton，K.W.Kinzler，M.F.Kane，R.D.Kolodner，B.Vogelstein，T.A.Kunkel，andS.B.Baylin.1998.Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylationin colorectal carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA 95：6870-5.
12.Holliday，R.1987.The inheritance of epigenetic defects.Science 238：163-70.
13.Jenuwein，T.and C.D.Allis.2001.Translating the histone code.Science 293：1074-80.
14.Jones，P.A.and P.W.Laird.1999.Cancer epigenetics comes of age.Nat Genet21：163-7.
15.Jones，P.A.and D.Takai.2001.The role of DNA methylation in mammalian epigenetics.Science 293：1068-70.
16.Kouzarides，T.2002.Histone methylation in transcriptional control.Curr Opin Genet Dev12：198-209.
17.Morgan，H.D.，H.G.Sutherland，D.I.Martin，and E.Whitelaw.1999.Epigenetic inheritanceat the agouti locus in the mouse.Nat Genet23：314-8.
18.Risch，N.J.2000.Searching for genetic determinants in the new millennium.Nature 405：847-56.
19.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989.Molecular cloning.A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.
20.Schoell，W.M.，M.Klintschar，R.Mirhashemi，and B.Pertl.1999.Separation of sperm andvaginal cells with flow cytometry for DNA typing after sexual assault.Obstet Gynecol 94：623-7.
21.Tamaru，H.and E.U.Selker.2001.A histone H3 methyltransferase controls DNAmethylation in Neurospora crassa.Nature 414：277-83.
22.Ward，R.，A.Meagher，I.Tomlinson，T.O′Connor，M.Norrie，R.Wu，and N.Hawkins.2001.Microsatellite instability and the clinicopathological features of sporadic colorectal cancer.Gut48：821-9.
23.Wheeler，J.M.，N.E.Beck，H.C.Kim，I.P.Tomlinson，N.J.Mortensen，and W.F.Bodmer.1999.Mechanisms of inactivation of mismatch repair genes in human colorectal cancer cell lines：the predominant role of hMLH1.Proc Natl Acad Sci USA 96：10296-301.
24.Wolffe，A.P.and M.A.Matzke.1999.Epigenetics：regulation through repression.Science286：481-6.
25.Xiong，Z.and P.W.Laird.1997.COBRA：a sensitive and quantitative DNA methylationassay.Nucleic A cids Res 25：2532-4.
                          序列表
序列表
<110>St Vincent′s Hospital(Sydney)Limited and Victor ChangCardiac Research Institute
<120>通过测定基因表观突变的频率评价疾病风险
<130>03 1373 9247
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 AF
<400>1
ttaygggtaa gtygttttga ygtaga
26
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 AR
<400>2
cctataccta atctatcrcc rcctca
26
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 BF
<400>3
aaatttttta attttgtggg ttg
23
<210>4
141693021
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 BR
<400>4
acttccatct tacttctttt aaac
24
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 CF
<400>5
ggttggatat ttygtatttt tygag
25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 CR
<400>6
aattactaaa tctcttcrtc cctcc
25
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 SNP 5
<400>7
gcatctctgc tcctattggc tggata
26
<210>8
141693021
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 SNP 3
<400>8
agtgccttca gccaatcacc tcagtg
26
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 DEG 5
<400>9
tattttagta gaggtatata agttygg
27
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 DEG 3
<400>10
ccttcaacca atcacctcaa tacc
24
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 MSP 5
<400>11
attggttgga tatttcgtat ttttc
25
<210>12
<211>24
141693021
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列MLH1 DEG 3
<400>12
ccttcaacca atcacctcaa tacc
24
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>hMLH1正向引物
<400>13
tagtagtcgt tttagggagg gac
23
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>hMLH1反向引物
<400>14
aaaaaacgtc taaatactca acgaa
25
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>p16正向引物
<400>15
gttggttacg gtcgcggttc
20
<210>16
<211>22
141693021
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>p16反向引物
<400>16
ccgaccgtaa ctattcgata cg
22

Claims (9)

1、一种在个体中评估疾病风险的测定，其中所述的测定包括下列步骤：
(i)从所述个体的正常组织中分离细胞群体，和
(ii)在所述细胞群体中定量测定特定基因的表观突变的频率，其中所述基因的表观突变与所述疾病有关，并且所述基因是不同于进行正常来源亲本特异性表达的基因。
2、权利要求1的测定，其中所述正常组织选自正常外周血、正常毛囊组织和口腔的正常组织。
3、权利要求1的测定，其中所述正常组织是正常外周血。
4、权利要求1-3中任何一项的测定，其中所述表现突变是DNA甲基化。
5、权利要求1-4中任何一项的测定，其中所述表现突变存在于基因的启动子或其它调控区，并且与所述基因的转录沉默有关。
6、权利要求1-5中任何一项的测定，其中所述表现突变与癌症有关。
7、权利要求1-6中任何一项的测定，其中所述表现突变存在于肿瘤抑制基因中。
8、权利要求7的测定，其中所述表现突变存在于选自hMLH1、hMSH2、APC 1A、APC 1B和p16的基因中。
9、权利要求8的测定，其中所述表现突变存在于hMLH1中。
CNA2004800380823A 2003-10-20 2004-10-20 通过定量测定正常组织中的表观突变评价疾病的风险 Pending CN1898396A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51309703P 2003-10-20 2003-10-20
AU2003905747A AU2003905747A0 (en) 2003-10-20 Assessment of disease risk
AU2003905747 2003-10-20
US60/513,097 2003-10-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1898396A true CN1898396A (zh) 2007-01-17

Family

ID=34465839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800380823A Pending CN1898396A (zh) 2003-10-20 2004-10-20 通过定量测定正常组织中的表观突变评价疾病的风险

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090142749A1 (zh)
EP (1) EP1689885B1 (zh)
CN (1) CN1898396A (zh)
AU (1) AU2004281299B2 (zh)
WO (1) WO2005038047A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010127499A1 (zh) * 2009-05-08 2010-11-11 Gui Yaoting 利用人体甲基化信息测定泌尿结石的装置及方法
CN102296105A (zh) * 2010-06-25 2011-12-28 复旦大学 一种检测mlh1基因突变的方法及其试剂盒
CN102787174A (zh) * 2012-09-06 2012-11-21 南京大学 胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途
CN108676889A (zh) * 2018-07-12 2018-10-19 吉林大学 一种胃腺癌易感性预测试剂盒及系统

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471951A1 (en) * 2006-05-02 2012-07-04 University of Southhampton Predicting cognitive development by gene methylation analysis
KR101283629B1 (ko) * 2010-12-29 2013-07-08 서울대학교산학협력단 Ｃｄ３ｚ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 자가면역질환 진단방법
EP4385524A1 (en) * 2021-08-09 2024-06-19 Neornat Composition for preventing or treating cancer comprising msh2 or msh6 inhibitor as active ingredient

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6235474B1 (en) * 1996-12-30 2001-05-22 The Johns Hopkins University Methods and kits for diagnosing and determination of the predisposition for diseases
US7700324B1 (en) * 1998-11-03 2010-04-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methylated CpG island amplification (MCA)
US6596488B2 (en) * 2000-03-30 2003-07-22 City Of Hope Tumor suppressor gene
AU2001253088A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-15 University Of Southern California Epigenetic sequences for esophageal adenocarcinoma
AU2001278420A1 (en) * 2000-04-06 2001-11-07 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with dna repair
US6756200B2 (en) * 2001-01-26 2004-06-29 The Johns Hopkins University School Of Medicine Aberrantly methylated genes as markers of breast malignancy
US20030013099A1 (en) * 2001-03-19 2003-01-16 Lasek Amy K. W. Genes regulated by DNA methylation in colon tumors
DE60226271T2 (de) * 2001-11-16 2009-07-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Verfahren zum nachweis von prostatakrebs
WO2005001141A2 (en) * 2003-06-23 2005-01-06 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for analyses of colorectal cell proliferative disorders

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010127499A1 (zh) * 2009-05-08 2010-11-11 Gui Yaoting 利用人体甲基化信息测定泌尿结石的装置及方法
CN102296105A (zh) * 2010-06-25 2011-12-28 复旦大学 一种检测mlh1基因突变的方法及其试剂盒
CN102787174A (zh) * 2012-09-06 2012-11-21 南京大学 胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途
CN102787174B (zh) * 2012-09-06 2013-08-07 南京大学 胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途
CN108676889A (zh) * 2018-07-12 2018-10-19 吉林大学 一种胃腺癌易感性预测试剂盒及系统

Also Published As

Publication number Publication date
US20090142749A1 (en) 2009-06-04
EP1689885A1 (en) 2006-08-16
EP1689885B1 (en) 2012-10-17
EP1689885A4 (en) 2007-08-01
AU2004281299B2 (en) 2010-11-18
AU2004281299A1 (en) 2005-04-28
WO2005038047A1 (en) 2005-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100347314C (zh) 探测胞嘧啶甲基化模式的高灵敏度方法
CN1896284A (zh) 一种鉴别等位基因类型的方法
CN1816276A (zh) 生产具有良好农业经济价值的甘蓝型油菜双低恢复系的方法
CN1200112C (zh) 肝癌相关基因启动子CpG岛的甲基化状态及其应用
CN1309721A (zh) 异源双链突变载体及其在细菌中的应用
CN1665937A (zh) 测定甲基化图谱的方法和组合物
CN1946285A (zh) 番茄抗性等位基因的偶联方法
CN1898396A (zh) 通过定量测定正常组织中的表观突变评价疾病的风险
CN1303216C (zh) 用于扩增人的葡糖激酶基因的多重pcr引物
CN1436237A (zh) 与提高或降低哺乳动物排卵率有关的核苷酸序列
Choi et al. No excessive mutations in transcription activator-like effector nuclease-mediated α-1, 3-galactosyltransferase knockout Yucatan miniature pigs
CN1891822A (zh) 具有特定单核苷酸多态性的th基因及其检测方法和用途
CN114196775A (zh) 提高油菜油酸含量的分子标记引物、引物组及其在育种中的应用
CN1306041C (zh) 抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物与应用
CN1203633A (zh) 对癌症的易感性诊断及其治疗
CN1297661C (zh) 一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白与应用
CN1295340C (zh) 一种建立多形性腺瘤小鼠模型的方法
CN1928083A (zh) 人类异源物质代谢酶基因的单核苷酸多态性及其在诊断和治疗大肠癌方面之应用
CN101076605A (zh) 基因的甲基化检测方法以及通过甲基化检测进行的瘤形成的检测方法
CN1165628C (zh) 冠痉挛相关性疾病的诊断
CN1928118A (zh) 无需核酸标记的基因芯片及其应用
CN101033487A (zh) 检测与原发性高血压相关的KLK1基因rs5517多态的方法
Laubreton et al. Generation of a C57BL/6J mouse strain expressing the CD45. 1 epitope to improve hematopoietic stem cell engraftment and adoptive cell transfer experiments
Wang et al. Clonal seeds in hybrid rice using CRISPR/Cas9
CN1795269A (zh) 用于将需要的性状迅速赋予生物的方法和系统

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1101599

Country of ref document: HK

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Open date: 20070117

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1101599

Country of ref document: HK