CN1200112C - 肝癌相关基因启动子CpG岛的甲基化状态及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与原发性肝癌发生相关的肿瘤发生相关基因的启动子区CpG岛区的甲基化状态信息及其应用，还提供了检测原发性肝癌的方法和试剂盒。该试剂盒含有：(a)甲基化特异性限制性内切酶以及针对肝癌相关基因的启动子CpG岛特异性引物对；或(b)使甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂和针对肝癌相关基因的启动子CpG岛引物包括甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对，所述基因包括APC、BRCA1、Caspase 8、DAPK1、E-钙粘蛋白、GST-pi、CDH13、hMLH1、MGMT、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN。

Description

肝癌相关基因启动子CpG岛的甲基化状态及其应用
技术领域
本发明涉及医学领域，更具体地涉及与原发性肝癌发生相关的肿瘤发生相关基因的启动子区CpG岛区的甲基化状态信息及其应用。本发明还涉及检测原发性肝癌的方法和试剂盒。
背景技术
长期以来，人们对生命体遗传的观点是用DNA语言(即以4个碱基核苷酸，腺苷酸(G)，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)为语符的)来描述的。生命体表型的维持及异化均归结于携带决定这些表型的基因的携带者DNA(在某些情况下，以RNA的形式)的忠实或突变后的代间传递。双倍体生物的表型多样性亦可由父本及母本的基因组的组合而大大地提高。然而，越来越多的证据表明，不涉及到基因组一级结构变化的表观遗传学的机制，也参与了高等生物体的遗传和变异。
DNA甲基化是表观遗传学现象的核心机制。在高等生命体中，组成DNA的4个碱基核苷酸，仅胞嘧啶的5’碳原子可被甲基化。这也只发生在其3’端毗邻的碱基核苷酸为鸟苷的胞嘧啶5’碳原子上，即5’CpG 3’的二连体中的胞嘧啶。这些GpG二连体在高等生命体基因组中的出现的频率仅为0.6％左右，远远低于二连体均态出现的预期值：8.35％。这一分布的非随机性偏移是与甲基化的C很易经脱氨等反应过程而转变为(尿嘧啶U，胸腺嘧啶T)，即，与胞嘧啶甲基化可促进C向T的点突变的现象相关。在高等生命体中，大部分CpG二连体散在于象Alu I和Line等类高度重复序列中，且甲基化程度高。CpG的甲基化将抑制重复序列的转录活性从而负调该类DNA的片段转座和重排，以确保基因组的稳定。剩余的CpG则富集在所谓的CpG岛区(长度为200-1000bp左右，CpG的频率在8.33％左右)。CpG岛的分布有着高度的选择性，尤以见之于核糖体RNA基因和50％左右编码蛋白质的基因的启动子区而令人瞩目。在多数情况下，这类CpG岛的甲基化程度很低，是这类基因得以转录所必需。全丰度的甲基化仅见于完全静息化了的常染色体的遗传印记基因或女性个体失活了的X染色体上的多个基因的CpG岛。
CpG二连体的甲基化是一由甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体和DNA为模板的反应过程。在高等生命体发现了三种以DNA为模板的甲基转移酶，分别为DNMTS1，3a和3b[Bestor，2000(1)]。DNMTS1在对单链性CpG甲基化的DNA模板上的酶活性，较在全无甲基化的模板的为高。该基因剃除小鼠原代培养的胚胎细胞，仍有以全无甲基化DNA为模板，向CpG转上甲基的活性(从头开始的甲基化的能力)。这表明DNMTS1仅起着维持DNA的甲基化样式不因遗传物质代间传递而丢失的作用。DNA复制后时，此酶根据母链上CpG的C的甲基化的状态向新生链互补的CpG的C上加或不加甲基。DNMTS3a和3b可有效地向全未甲基化的双链DNA模板上CpG中C上加甲基。它们的表达及其酶活性均仅在高等生命体胚胎发育早期一个短暂的时期为高，这与全基因组水平上的去甲基化后，重新甲基化在时相上吻合。因此，这两个酶被认为是主要参予对无甲基化的DNA模板进行从头全甲基化的酶，在高等生物的早期发育中起着重要的作用。
CpG二连体的C甲基化虽不影响C与G之间的碱基配对，但可明显地改变的DNA高级结构。对其高级结构的精细分析表明甲基基团外伸在DNA双螺旋原先空置的大沟区中，这直接影响DNA与蛋白质相互的作用。参与基因转录调控过程中的很多转录调控因子所识别的DNA序列中含有CpG序列。由此这类CpG的甲基化会使其与相应蛋白的结合能力减弱，从而引起有关的下游基因转录受抑以至失活。甲基化的CpG也会促进蛋白与DNA之间的相互作用。甲基转移酶I和甲基化DNA的结合蛋白家族的成员均对甲基化CpG有显著为高的亲和力。后一类结合可直接或间接地调动组蛋白去乙酰化酶复合体到富含甲基化DNA的区段，引起该区与相邻区的核心组蛋白的去乙酰基化，进而导致该区的染色质结构的紧缩，丧失转录的活性。
长期在以来癌被认为是一种涉及到多个关键基因的量或质发生改变的遗传性的疾病。癌相关的染色质数目和结构的宏观水平改变，早在上世纪初已有报道。近代癌症分子遗传学研究在核苷酸序列的水平上已精确地描述了众多正或负地影响正常细胞向癌变细胞恶化过程的基因的变化(点突变、缺失重排等等)。另外，在肿瘤细胞中抑癌基因的去表达似乎也可因其启动子CpG岛的甲基化程度提高所致[Baylin，2000(2)；Esteller，2002(3)]。同样，癌基因启动子的去甲基化和该基因的活化亦同见之于某些肿瘤细胞中。另外一个有意义的现象是，在从正常向癌细胞演变过程中，有着一个在全基因组水平的去甲基化的过程[Lin，2001(4)；Narayan，1998(5)]和抑癌基因的启动子区CpG岛的甲基化的步骤。现已表明基因组整体水平的去甲基化程度的提高可能与高等生物中的转座子的活性的增加有关，基因组的突变率提高，基因组稳定性降低[Chen，1998(6)]，这与癌细胞的基因组的高度失稳的特征相吻合。与此同时，CpG岛区选择性的甲基化也可导致抑癌基因的失活。确有报道，癌细胞中甲基化转移酶I的表达较正常细胞的为高[Hattori，2001(7)][Roberson，1999(8)]。
随着人们对DNA的甲基化在肿瘤发生相关基因的表达的影响的重视程度的提高，对各类肿瘤的DNA甲基化的分析已成为当前种肿瘤分子生物些研究的一个热点。肝癌是一预后凶险，早期诊断困难的危及中国人健康的重大疾病。然而对肝癌，包括中国在内的东南亚地区高发的恶性肿瘤这一方面的研究还很局限，所研究的基因仅有抑癌基因p16与p15这两种。
因此，本领域迫切需要研究各种肿瘤相关基因在DNA甲基化状态与肝癌的相关性，并在此基础上开发更为敏感和有效的早期诊断的方法和发展新的包括基因治疗在内的抗肿瘤治疗的途径。
发明内容
本发明的目的就是提供新的更敏感和更有效的检测肝癌或肝癌易感性的方法和试剂盒。
本发明的另一目的是提供新的治疗肝癌的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有：
(a)甲基化敏感性限制性内切酶，以及针对选自下组基因的启动子CpG岛特异性引物对：
APC、BRCA1、Caspase8、DAPK1、E-钙粘蛋白(E-CAD)、GST-pi、H-钙粘蛋白(CDH13)、hMLH1、O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL、Survivin、和PTEN：
或含有(b)使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，以及针对选自下组基因的启动子CpG岛的甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对：
APC、BRCA1、Caspase8、DAPK1、E-钙粘蛋白(E-CAD)、GST-pi、H-钙粘蛋白(CDH13)、hMLH1、O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL、Survivin、和PTEN。
在一优选例中，所述的试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
在另一优选例中，所述的基因选自：P16、H-钙粘蛋白CDH13、RASSF1a和c、Caspase8、Survivin。
在另一优选例中，所述的启动子CpG岛特异性引物对(包括启动子CpG岛甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对)的长度为15-35bp，所扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp或更长，例如3000bp。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有甲基化敏感性限制性内切酶，且所述的启动子CpG岛特异性引物对选自下组：
靶基因      有义引物      SEQ ID        反义引物      SEQ ID
                                           NO：                            NO：
APAF       gagtccggcattggtgggaac           81  agactccccacctctggttctatcc   82
APC        gacctcccccgactctttac            83  atacagccacatgtcggtca        84
ARF        tgggtcccagtctgcagttaagg         85  atcagcacgagggccacagc        86
BRCA1      gtccctcccatcctctgatt            87  gcccagttatctgagaaacccc      88
Caspase-8  cacgtggagttaggcaggtt            89  aacggctcagagagaaacca        90
CDH13      ccaaagaagcaaatgggatg            91  agttctcggctgcattttgt        92
DPAK       ggaggacag ccggaccgag ccaacgcc   93  ccgg cgcctgggag ggatctg     94
E-钙粘蛋白 agaccctagcaactccaggctagag       95  cgggctggagtctgaactgacttc    96
hMLH1      ccctgacgcagacgctccaccagggccgc   97  cgcgggtagctacgatgaggcggc    98
p15        ccccactctgccagagcgag            99  cgtcgtccttctgcggcttg        100
p16        accggaggaagaaagaggag            101 ggcctccgaccgtaactatt        102
pten       cggtcttccgaggcgcccg             103 agttgagccgctgtgaggcg        104
RAR-B      gaagtgagctgttcagaggcagg         105 ctggtgctctgtgtttcaattgc     106
RASSF1a    caaagccagcgaagcac               107 cggtagtggcaggtgaactt        108
RASSF1c    cggcacagagaggctaattc            109 acagaccccacctaccacag        110
RB1        ccagtttaattcctcatgacttagc       111 gtcaagttgaagccgagacc        112
Survivin   gactacaactcccggcacac            113 tgtagagatgcggtggtcct        114
TERT       ggtagtcgaggtgaaccgcgtc          115 aggcccaccctccgcaac          116
TIMP3      ggcggcattattccctataa            117 aggagcaagaggaggaggag        118
VHL        gcctccgttacaacagccta            119 tcttcagggccgtactcttc        120。
更佳地，所述的甲基化敏感性限制性内切酶选自：Hpa II、BstuI和HhaI。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有使非甲基化胞嘧啶选择性地转化为尿嘧啶的试剂；且所述的启动子CpG岛的甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对选自下组：
名称                                              SEQ ID NO：
VHL
M-上游引物：TGGAGGATTTTTTTGCGTACGC                1
M-下游引物：GAACCGAACGCCGCGAA                     2
U-上游引物：GTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGT              3
U-下游引物：CCCAAACCAAACACCACAAA                  4
APC
M-上游引物：TATTGCGGAGTGCGGGTC                    5
M-下游引物：TCGACGAACTCCCGACGA                    6
U-上游引物：GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT              7
U-下游引物：CCAATCAACAAACTCCCAACAA                8
DAPK
M-上游引物：GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC              9
M-下游引物：CCCTCCCAAACGCCGA                      10
U-上游引物：CAAATCCCTCCCAAACACCAA                 11
U-下游引物：CAAATCCCTCCCAAACACCAA                 12
RB1
M-上游引物：GGGAGTTTCGCGGACGTGAC                  13
M-下游引物：ACGTCGAAACACGCCCCG                    14
U-上游引物：GGGAGTTTTGTGGATGTGAT                  15
U-下游引物：ACATCAAAACACACCCCA                    16
APAF1
M-上游引物：AGGTTTAGTTACGTTTCGTTCG                17
M-下游引物：CGTCCACTCGCTACCTCTTC                  18
U-上游引物：GAGGTTTAGTTATGTTTTGTTTGTGG            19
U-下游引物  CCACTCACTACCTCTTCTTCTCC               20
ARF
M-上游引物：GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC                  21
M-下游引物：AAAACCCTCACTCGCGACGA                  22
U-上游引物：TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT            23
U-下游引物：CACAAAAACCCTCACTCACAACAA              24
P16INK4A
M-上游引物：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC              25
M-下游引物：ACCCCGAACCGCGACCGTAA                  26
U-上游引物：TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT              27
U-下游引物：CAACCCCAAACCACAACCATAA                28
Brcal
M-上游引物：GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG             29
M-下游引物：TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG             30
U-上游引物：GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG             31
M-下游引物：TCAACAAACTCACACCACACAATCA             32
CDH13
M-上游引物：TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC                  33
M-下游引物：GACGTTTTCATTCATACACGCG                34
U-上游引物：TTGTGGGGTTGTTTTTTGT                   35
U-下游引物：AACTTTTCATTCATACACACA                 36
E-钙粘蛋白
M-上游引物：GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC                  37
M-下游引物：CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG            38
U-上游引物：GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT               39
U-下游引物：AACTCACAAATCTTTACAATTCCAACA           40
P15-ink4b
M-上游引物：GCGTTCGTATTTTGCGGTT                   41
M-下游引物：CGTACAATAACCGAACGACCGA                42
U-上游引物：TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT             43
U-下游引物：CCATACAATAACCAAACAACCAA               44
PTEN
M-上游引物：GGTTTTTCGAGGCGTTCG                    45
M-下游引物：CGCCTCACAACGACTCAACT                  46
U-上游引物：TGGTTTTTTGAGGTGTTTG                   47
U-下游引物：TTCCATCATAACTACAACTTCCA               48
Rar-beta
M-上游引物：TCGAGAACGCGAGCGATTCG                  49
M-下游引物  GACCAATCCAACCGAAACGA                  50
U-上游引物  TTGAGAATGTGAGTGATTTGA                 51
U-下游引物  AACCAATCCAACCAAAACAA                  52
HTERT
M-上游引物：GACGTAAAGTTTTTTTCGGACG                53
M-下游引物：ACCCGATACGCTACCGAACG                  54
U-上游引物：GTAAAGATGTAAAGTTTTTTTTGGATG           55
U-下游引物：CCACAACCCAATACACTACCA                 56
TIMP3
M-上游引物：CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC          57
M-下游引物  CCGAAAACCCCGCCTCG                     58
U-上游引物  TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT       59
U-下游引物  CCCCCAAAAACCCCACCTCA                  60
Rassf1a
M-上游引物：GTGTTAACGCGTTGCGTATC                  61
M-下游引物：AACCCCGCGAACTAAAAACGA                 62
U-上游引物：TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG               63
U-下游引物：CAAACCCCACAAACTAAAAACAA               64
Rassf1c
M-上游引物：AGTTTGGATTGTCGGTTTCG                  65
M-下游引物：TCACAAACCCCACCTACCAC                  66
U-上游引物：GGAGTTTGGATTGTTGGTTTTG                67
U-下游引物：CACCCCCAAAAATAACCTCAT                 68
SURVIVIN
M-上游引物：GGCGGGAGGATTATAATTTTCG                69
M-下游引物：CCGCCACCTCTACCAACG                    70
U-上游引物：GGTGGGAGGATTATAATTTTTG                71
U-下游引物：CCACCACCACCACCTCTAC                   72
Caspase-8
M-上游引物：TAGGGGATTCGGACATTGCGA                 73
M-下游引物：CGTATATCTACATTCGAAACG                 74
U-上游引物：TAGGGGATTTGGAGATTGTGA                 75
U-下游引物：CCATATATATCTACATTCAAAACAA             76
hMLh1
M-上游引物：TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT         77
M-下游引物：ACCACCTCATCATAACTACCCACA              78
U-上游引物：ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC              79
U-下游引物：CCTCATCGTAACTACCCGCG                  80。
更佳地，所述的使甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂包括亚硫酸氢盐，联苯二酚和氢氧化钠。
在本发明的第二方面，提供了一种检测肝癌的方法，它包括步骤：检测样品中基因的启动子CpG岛的甲基化状态，与正常对照相比甲基化状态不同就表示个体患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群，所述的基因选自下组：
APC、BRCA1、Caspase8、DAPK1、E-钙粘蛋白(ECAD)、GST-pi、H-钙粘蛋白(CDH13)、hMLH1、O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL、Survivin、和PTEN。
更佳地，所述的检测步骤是通过(a)亚硫酸氢盐处理DNA+甲基化和非甲基化胞嘧啶特异性PCR法，或(b)甲基化敏感性限制性内切酶+PCR法进行。
在本发明的第三方面，提供了一种治疗肝癌的方法，它包括步骤：改变肝癌细胞中所述基因的启动子CpG岛的甲基化状态。
附图说明
图1显示了各基因用启动子CpG岛特异性引物扩增的结果。
图2显示了各基因的RT-PCR扩增结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，对许多例肝癌患者的癌及其癌旁组织，中性粒细胞以及外周血清的DNA的各种基因的启动子的CpG岛区的情况进行了分析，发现了下列数种基因的启动子CpG岛的甲基化状态与肝癌之间存在密切相关性，即APC、BRCA1、Caspase8(CASPASE8)、DAPK1、ECAD(E-钙粘蛋白)、GST-pi、H-钙粘蛋白(CDH13)、hMLH1、MGMT(O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶)、P14/ARF、P15(CDKN2B)、P16(CDKN2A)、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL(Von-Hippell Lindau)、Survivin、PTEN。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，“启动子CpG岛特异性引物”指与模板DNA基本上完全匹配且与模板的结合位点中包括启动子CpG岛或其一部分的引物。例如，用甲基化敏感性限制性内切酶处理样品DNA后，未甲基化的CpG岛被切割开，而甲基化的CpG岛未被切割。使用特异性结合于该启动子CpG岛的引物(即启动子CpG岛特异性引物)时，前者不会产生PCR产物，而后者则会产生PCR产物。
又例如，如果采用使胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂(包括亚硫酸氢钠，联苯二酚和氢氧化钠)使胞嘧啶转化为尿嘧啶，这可以使用二对引物，一对引物针对甲基化情况，另一对引物针对未甲基化情况，它们会因该CpG岛的甲基化或非甲基化以否而特异地结合于含启动子CpG岛的区域，从而引发甲基化或非甲基化特异性的PCR扩增。
在本发明提供的肝癌相关基因中，分为二大类。第一类是抑癌基因。当抑癌基因的启动子CpG岛发生甲基化后，导致抑癌基因不表达或表达水平下降，从而导致癌症。第二类是原癌基因。当原癌基因的启动子CpG岛发生去甲基化后，导致原癌基因的表达被激活，从而发生表达或表达水平上升。这两者的后果均促进癌细胞形成和增殖，从而导致癌症。
因此，在本发明的检测方法中，检测抑癌基因的启动子CpG岛是否发生了甲基化，以及检测原癌基因的启动子CpG岛是否发生了去甲基化。如果存在上述情况，就表明被检测对象患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群。
分析DNA甲基化的常见方法有以下二种：(1)使用对甲基化敏感的限制性内切酶；(2)甲基化胞嘧啶核苷酸特异性的PCR。
第一种方法(使用对甲基化敏感的限制性内切酶)方便简单，但受限于限制性内切酶的DNA识别序列的有限性。目前可供使用的酶仅有三种：Hpa II(CCGG)(注：MspI是可以切动甲基化的CCGG序列的酶)、BstuI(CGCG)和HhaI(GCGC)。这些酶无法切动其中CpG二连体中C甲基化了的识别序列。基因组DNA经这些酶分别充分消化后，作为模板用相应的引物对有关的区段进行PCR分析。PCR结果阳性意味着相应CpG没有被甲基化，否则即甲基化。显然这种方法受到“并非所有CpG二连体会位于限制性内切酶的识别序列之中”这一事实的限制，且只能提供存在上述核苷酸序列中CpG中的C的甲基化的状态的信息，对其它CpG的甲基化状态的评估毫无价值。
第二种方法(甲基化胞嘧啶核苷酸特异性的PCR)，可以对任一对象片段中的每个CpG二联体中的C是否甲基化进行测定。由于亚硫酸氢盐处理单链的DNA中，所有的未甲基化的胞嘧啶脱氨后均变为尿嘧啶，其配对由C:G变为T:A，而甲基化C不会被脱氨而仍保持C:G配对。结果是前者(未甲基化)的二连体序列变为CpGTpG，而后者(甲基化的)则仍为CpG。通过对PCR扩增的片段进行测序，人们可以研究该研究区域中的每个CpG的甲基化的状态[Herman，1996(9)]。
CpG岛的长度可达1kb之长，为了研究上的方便而又不失去所研究区域的信息量，以及二磺酸盐处理DNA的方法学上要求(DNA片段不易大于200bp)，本发明人在每个基因启动子的CpG岛区仅取了部分DNA序列。
本发明人采用甲基化专一性PCR反应对多位肝癌患者的癌与癌旁组织(表1)的DNA中的多个靶点基因进行了分析，另外取了4位人正常人的肝组织DNA作为对照。本发明人发现了13个靶基因的启动子区的CpG岛区的甲基化的状态，在这些患者的正常肝及肝癌组织的DNA与取自正常人的肝组织的DNA完全相同。这似乎提示对这些基因的表达而言所述区域的甲基化状态并无必要的关联。在其余的靶点中，不同的病例表现为明显不同的甲基化状态，且这种甲基化状态与肝癌的发生密切相关。
抑癌基因p16是Rb/p16 G1期检测控制(check-point)上游的抑癌基因，因基因结构的改变和启动子甲基化所至的失活见之于很多的恶性肿瘤。在本发明人研究中，p16启动子的甲基化见之于17例肝癌组织(其中两例为杂合，即甲基化与非甲基化并存)，但仅见之于6例癌旁正常组织(其中3例为杂合)。而正常肝组织DNA中p16启动子呈非甲基化。这一结果表明p16启动子CpG岛的甲基化最为肝癌特异，并提示甲基化介导的p16的失活是一个肝癌发生最为晚期的事件。
RASSF1基因是新近发现的与Ras信号传导系统有关的抑癌基因，它可以GTP依赖的方式和Ras结合[Agathanggelou，2001(10)；Dammann，2001(11)；Lo，2001(12)]。人为的RASSF1的过度表达可引起细胞凋亡。在启动子使用及RNA剪切上的差异性选择该基因的表达可产生两种亚型，A和C。本发明人对这两个启动子相关的CpG岛进行了甲基化状态的检测。在正常肝中这两个启动子均处于非甲基化状态，在癌与癌旁组织DNA分析中RASSF1c启动子区的CpG岛均为非甲基化，仅一例的癌及癌旁组织表现为杂合现象。RASSF1a启动子CpG岛的甲基化形式则截然不同，癌旁组织的有23例为甲基化(其中2例为纯和性甲基化)，而癌组织DNA均为甲基化(其中15例为杂合性甲基化)。
CDH13是编码细胞表面粘附因子的一个基因(H-钙依粘连蛋白(H-cadherin))，它是一种抑癌基因。在30例肝癌患者的病例材料的研究中，癌旁正常组织的DNA中仅5例呈甲基化(均为杂合)，而在癌组织DNA中6例呈甲基化(其中4例为杂合)。这一观察提示仅在某些肝癌病例中甲基化使该基因去表达。
Survivin是一个在肿瘤细胞高度表达表现为G2期转录的抗凋亡的基因。它的启动子在迅速进入细胞周期的细胞中活性为高。有报道表明，该基因在正常细胞的表达低或无表达是由于其启动子中的CpG岛的甲基化有关。本发明人的研究表明，在整体水平上正常肝中该基因的启动子还处于非甲基化的状态，然而在核苷酸水平上该区中位于Sp1/Ap2转录因子的结合顺序的一个CpG甲基化。这可能会使该转录因子失去与该位点结合而导致Survivin在正常细胞中的不表达或极低表达。在肝癌病例中该区均处于非甲基化状态且表达增高。
抑癌基因p15是与p16相关的抑癌基因，Rb是它们下游的抑癌基因。本发明人研究了p15处于非甲基化状态。一项先前有关p15甲基化在肝癌中的作用表明，只有这一部分肝癌的p15基因的启动子可表现为甲基化。而本发明人的结果表明，若非全部，绝大多数的肝癌病例会发生p15的启动子区的去甲基化。而Rb基因启动子的CpG岛均为非甲基化状态，这表明Rb基因的功能失活与其启动子的CpG岛甲基化可能有关。
在这项研究中，本发明人还对10例正常人的白细胞和4例正常肝细胞的DNA作了同样的比较性结果的讨论研究。
为了避免PCR所产生的人为影响，多数甲基化特异性的PCR产物均克隆到T载体中(Promega.USA)后送去测序，以验证结果。
另外，本发明人也采用半定量的RT-PCR对以下一些基因在正常肝和数例癌和癌旁肝组织中的水平作了一个评估(见图2)。本发明人还对癌，癌旁正常组织及正常肝甲基转移酶I表达进行了半定量的RT-PCR分析，结果表明DMTS1在癌旁组织为高。
最后，本发明人也通过HpaII，Hha I，或Bst UI(甲基化敏感的限制性内切酶)酶切与PCR反应联合使用的方法，对几例正常肝、癌、癌旁、白细胞以及外周上清的DNA中的部分靶基因点的启动子的CpG岛状态进行了分析，结果与甲基化特征性的PCR方法所获得结果基本符合。
此外，本发明人采用甲基化C敏感性限制性内切酶与PCR联合使用的方法进行直接分析，发现血清DNA的所研究的基因之启动子甲基化的状态与癌组织DNA的状态相吻合(数据未示出)。这表明，是有可能直接通过检测血清或血浆或血液中DNA，来进行肝癌诊断。
本发明所提供的肿瘤发生的重要基因的甲基化状态信息，在肝癌的基因诊断和治疗上有极为重大的指导性意义。
在诊断方面，由于所研究的对象是DNA，它较蛋白质及RNA材料的稳定性明显为高，对发展简单易用检验方法是有利的。诊断新方法的准确、快速以及方便上的程度都是影响其的应用前景的关键因素。以血清或血浆为对象的诊断方法可广泛地应用于对包括肝癌在内的多种疾病的临床生化及免疫学功能检测。现已确认，肿瘤患者的血清或血浆中含有高达每毫升300ng以上的DNA，而正常人的血清中DNA含量仅为10-20ng左右。这些DNA的来源有以下几种，肿瘤细胞及相邻细胞死亡所释放出的DNA，和潜逃到血循环中的活的肿瘤细胞。利用血清中的DNA对于肝癌发病相关的靶基因的启动子甲基化状态的分析并用其作为将来临床诊断试剂盒的基础是很有价值的尝试。鉴于患者血清中DNA的甲基化样式与癌组织的极为相似，从而用患者血清DNA为检验样品使所发展起来检验更容易为临床所接受。上面所提到两种检测甲基化的方法都用于检测，即，使用对甲基化敏感的限制性内切酶酶切方法以及亚硫酸氢钠处理DNA的方法，再分别结合PCR反应的程序。另外，DNA芯片技术也可以用于将来的临床检验的方法。此外，还可通过对检测样品直接进行测序，而进行检测。
就肝癌基因治疗而言，本发明所获得的信息将有助于发展以改变DNA甲基化样式为基础的技术。对于抑癌基因，这种技术在肿瘤细胞对因其启动子CpG甲基化而丧失了转录活性的抑癌基因选择性地去甲基化，从而将其激活；对于原癌基因，还可以研发能选择性对活动的癌基因的启动子CpG区选择性的甲基化而抑制该基因的活性和/或表达。Survivin以及IGF-2的启动子就是很有潜力的靶点。
可选择性的改变启动子去甲基化的途径是，利用与有关的基因启动子区序列上互补的单链核酸分子，选择性将甲基转移酶的抑制剂或活化剂带到肿瘤细胞中的靶基因的位点去，而专一性地改变表达该区甲基化状态，进而改变该基因的表达状态，抑制或杀死肿瘤细胞，而达到临床扫除肿瘤的治疗效果。
另外，鉴于任一靶点基因启动子CpG岛区的甲基化的状态在肿瘤细胞有极高的选择性，呈基因特异性，因此，可以在试管内甲基化下述一类启动子来控制治疗基因作为基因治疗的药物。这类启动子的选择标准是，它在正常细胞中处于甲基化的状态，而在肿瘤细胞中非甲基化。鉴于这类基因的甲基化状态完全是由所处的细胞的内在环境所决定，一个导入同源片段会受到类似的机制的调控。本发明人提议用在肝癌细胞非甲基化的，而在正常细胞中甲基化的启动子(如Survivin或Igf-2基因的)来控制任何一种或几种治疗基因(包括前体药物活化基因，免疫调节基因抑制细胞增殖式诱发细胞凋亡的基因等)。该类DNA将经过试管内MSss I甲基化酶的处理，或者该质粒DNA在表达MSssI甲基化酶的细菌中制备而使该质粒DNA中CpG的C的5’位C全部甲基化，然后用这类DNA作为基因治疗的药物来导入到动物或患者体内。因在肿瘤细胞中与其同源的内源性的DNA片段处于非甲基化的状态，该机制会使导入的DNA的甲基逐步去掉，使该启动子得以活化，使治疗基因可有效地表达其产物，直接或间接地杀死受体肿瘤细胞。相反，在正常细胞中同源基因启动子仍以甲基化状态存在，导入的DNA仍维持在甲基化的状态而难以被转录，治疗基因不表达正常细胞即能存活。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
收集肝癌病例
收集了30例肝癌病例，情况如下。分别取得各病例的肝癌组织、癌旁组织、中性粒细胞和外周血清。并按以下方法获得DNA样品。
(a).组织DNA的抽提
取组织大约1g→碾碎(液氮中)→放入内有5ml裂解缓冲液(100mM NaCl，10mM Tris(PH7.5)，25mM EDTA(PH8)，0.5％SDS)的管子→加100ul(终浓度200ug/ml)蛋白酶K→37℃过夜(或50℃2小时)。
次日：用苯酚抽提两次→氯仿/苯酚抽提一次→氯仿抽提一次→上清+1/37.5M NH4Ac+3倍体积乙醇→沉淀+用500ul TE(10mM Tris HCl，1mMEDTA)溶解DNA的沉淀。
向溶解DNA的溶液中加入200ug/ml RNAse A→37℃45’+200ug/ml蛋白酶K→37℃2小时→氯仿/苯酚X 1→1/10 7.5M NH4Ac+2.5倍体积乙醇→-20℃过夜→12000rpm 3’→获得沉淀→70％酒精洗→室温下晾干→加TE溶解。
(b).白细胞基因组DNA的抽提
抗凝血离心2000rpm 10分钟，血清转移到另一个管子后→向细胞沉淀加入等体积缓冲液I(10mM Tris PH7.6，10mM KCl，10mM MgCl2，2mM EDTA-2Na)/125ul NP-40，混合至溶液为透明→离心2000rpm 10分钟后去上清→加入缓冲液I混合，离心去上清直至沉淀为白色→1.2ml缓冲液II(10mM Tris PH7.6，10mMKCl，10mM MgCl2，2mM EDTA-2Na，0.4mM NaCl)去悬浮沉淀，加40ul 20％SDS 50℃10’→20ul 20mg/ml蛋白酶K(0.5％)37℃3小时或过夜→加入540ul NaCl混合→13000rpm 5’→弃沉淀将上清移入一个干净的1.5ml试管中→加3倍体积的酒精→将沉淀70％酒精。
(c)血清DNA的制备
1、准备好血清样品，以及提取所需的试剂，旋转离心柱，2ml离心管，1.5ml离心管和接液管等。
2、把1ml血清加入2ml离心管中，再加入等体积1×CLB溶液，盖好盖子，振荡(300rpm)混匀20s，离心(10,000rpm)2min。弃去上清，保留离心管底部的淡红色或白色的沉淀。
3、加入200μl 1×CLB试剂，在漩涡振荡器上混匀30s，使沉淀重悬浮。
4、加入20μl蛋白酶并振荡混匀。
5、将上述样品在振荡中加入200μl H1试剂，在漩涡振荡器上混匀30s，充分
6、混匀直至沉淀完全溶解。
7、将加过H1试剂的样品置于70℃水浴10min。取出离心(5,000rpm，30s)，取上清400μl于另一干净离心管中。
8、加H2试剂：将上清液在振荡中加入200μl H2试剂，并继续振荡10s以上，充分混匀。
9、上柱离心：将混合液转移到套有干净接液管的星普旋转离心柱中，离心(13,000rpm，60s)。
10、H3洗涤：将星普旋转离心柱转移到干净接液管中，加入400μl H3试剂，离心(13,000rpm，60s)。重复一次。
11、空柱离心：将星普旋转离心柱转移到干净接液管中，离心(13,000rpm，60s)。
12、H4溶液洗脱：将星普旋转离心柱转移到干净的1.5ml离心管中，加入100μl H4试剂(70℃预热)，在漩涡振荡器上混匀8～10s，再在室温下静置3～5min，离心(13,000rpm，60s)。
                                          表1病例情况
  No.   病例   年龄   型别   肝硬化   HBV     AFP   肿瘤大小(CM) 淋巴结转移   吸烟者/饮酒着 肝硬化家族史 肝癌家族史
    1     D1     56     男     -     +   10.9ug/l     2.5-3.5   -     +     -   -
    2     D14     33     女     -     +   1000ug/l     9.7-8   -     -     +   +
    3     D15     65     女     +     +   183.ug/l     6-5   -     -     -   -
    4     D16     51     男     +     -   2590ug/l     5-4   -     -     -   -
    5     D17     37     男     +     +   1000ug/l     12-9   -     -     -   -
    6     D18     61     男     -     -   2.5ug/l     4-4   -     +     -   -
    7     D24     36     男     +     +   10.6ug/l     13-11   -     -     -   -
    8     D59     70     男     +     +   27.6/ug/1     3.5-3   -     -     -   -
    9     Z82     55     女     +     +   385ug/l     3.5-3.5-3.5   -     -     -   -
    10     Z85     57     男     +     +   415ug/l   -     -     -   -
    11     Z89     42     男     +     +   10ug/l     13   -     -     -   -
    12     Z90     67     男     +     +   141ug/l     9.5-9-8   -     -     -   -
    13     Z92     44     男     +     +   1208ug/l     6-6-6   -     -     -   -
    14     G33     36     女     +     +   400ug/l     9-8-8   -     -     -   -
    15     G35     38     男     +     +   12ug/l     6-6-4.5   -     -     -   -
    16     G36     72     男     +     +   1416ug/l     4.5-3.5-3   -     -     -   -
    17     G41     56     男     +     +   10ug/l     2-2-2   -     -     -   -
    18     G44     62     男     +     -   10ug/l     6-5.5-5   -     -     -   -
    19     G47     44     男     -     +   346ug/l     4.8-4.3-3.8   -     -     -   -
    20     G62     46     男     -     +   16ug/l     16-13-3.5   -     -     -   -
    21     G63     42     男     -     +   3.7ug/l     13-11-10   -     -     -   -
    22     G64     42     男     -     +   4000ug/l     9-7.5-7   -     +     -   -
    23     G65     35     女   -   +     400ug/l     11-10-4.5 - - - -
    24     Q45     61     男   -   -     400ug/l     10-80-7 - - - -
    25     Q46     50     女   -   +     400ug/l     10-9-7 - - - -
26 Q47 52 男 - + 30ug/l 9-5-6 - - - -
    27     Q48     48     男   -   -     38ug/l     3-3-3 - - - -
    28     Q49     42     男   -   +     400ug/l     8.5-6-6 - - - -
    29     X63     37     男   +   -     7-6-6 - - - -
    30     E17
实施例2
被研究的基因的信息
选取了几十种候选基因，部分经本发明证实与肝癌相关的基因的信息列于下表：
                                            表2基因相关序信息
  基因 染色体定位     甲基化情况   文献编号   基因登录号
  APC     5q21 结肠、胃和食管癌     [13-15]     NM_000038
  BRCA1     17q21 10-20％乳房癌，某些卵巢癌     [16-19]     AF274503
  Caspase 8(CASPASE 8)     2q33-34 神经母细胞瘤     [20]     NM_001228
  DAPK1     [21，22]     XM_005442
  ECAD(E-钙粘蛋白)     16q22.1 20-70％乳房癌，胃癌，甲状腺癌，SCC，白血病和肝癌。     [23-25]     D49685
  GST-pi     11q13 80-100％前列腺，肝癌。30-60％结肠癌，乳房癌，肾癌     [26，27]     M37065
  H-钙粘蛋白(CDH13)     16q24.1-24.2 45％肺癌，某些卵巢癌     [28，29]     AB001090
  hMLH1     2p22 10-20％结肠，子宫内膜和胃癌，0％肺，乳房癌，GBM，液态瘤(liquid tumors)     [30]     AB017806
  MGMT(O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶)     10q26 25-50％脑，结肠，肺，乳房，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)等     [31，32]     M29971
  P14/ARF     9p21 结肠癌细胞系(罕见)     [33，34]     AK024826
  P15(CDKN2B)     9p21 80％急性髓细胞性白血病(AML)急性淋巴细胞性白血病(ALL)2-20％成胶质细胞瘤(GBM)，0％结肠/肺/乳房     [35，36]     AF058758
  P16(CDKN2A)     9p21 20-30％肺(NSCLC)，25-35％结肠5-25％淋巴瘤，0-5％膀胱，许多其他组织(食管，胃等) [35，37-40]   NM_000077
  RAR-Beta2     3p24 结肠、乳房和肺癌 [41，42]   X56849
  RASSF1a和b     3p21.3 肺癌 [10，12，43]   AF291719
  RB1     13q14 10-20％视网膜母细胞瘤，0％肺/白血病/结肠，某些脑垂体腺瘤 [44，45]   NM_000321
  TERT     5p15.33 [46，47]   AB018788
  TIMP3     22q12.1-13.2 [21，48，49]   NM_000362
  VHL(Von-HippellLindau)     3p25-25 10-20％肾细胞癌，0％常见的实体瘤和液态瘤 [50]   NM_000551
  Survivn     17p25 [7，51，52]   U75285
  PTEN     10q22-23 [53，54]   NM_000314
实施例3
甲基化胞嘧啶特异性PCR法检测各基因启动子CpG岛的甲基化状态
(a)亚硫酸氢钠处理
取10ug DNA，加入3M NaOH至终浓度0.3M，37℃15分钟→加入新鲜配制的对苯二酚至终浓度5mM→加入新鲜配制的亚硫酸氢钠(sodium bisulfite，pH5.0)至终浓度3.1M→加矿物油，50℃16小时。
将1％的琼脂糖加入2ml的试管，插入200ul的管尖。待琼脂糖凝固后拔出tip，在孔中加入上述处理样品。室温下静置45分钟。重复以上操作3次。吸出以上样品加入3M NaOH至终浓度0.3M，37℃15分钟。加入1ug/1ul糖原，加入10M NH4Ac至终浓度3M，加入3倍体积无水乙醇。沉淀DNA(-20℃过夜，离心30分钟)，70％乙醇洗涤，干燥，溶解于20ul的水中。保存在-20℃。
(b)甲基化胞嘧啶特异性PCR法
分别用甲基化特异性或非甲基化特异性引物对(表3)对处理过的DNA进行PCR。反应体系是在PCR管中加入15ug石蜡油.和1ul消化过的DNA，1ul引物(4pmole)
10X缓冲液 1.5ul
dNTP 1.5ul
Taq酶(5u/ul) 0.2ul
模板(约10-20ng) 1ul
H2O 7ul
15ul
PCR反应条件如下：先94℃2分钟，然后是90℃15秒，55-60℃15秒，72℃15秒，共30个循环，最后是72℃延伸10分钟。PCR产物经2％琼脂糖(0.5X TBE)电泳后分析。
                        表3靶基因与寡核苷酸引物
            (注：M：针对甲基化的引物  U：针对非甲基化的引物。)
名称        基因登录号/引物序列(5’至3’方向)  结合位置产物长度SEQ ID NO：
VHL         GeneBank NO.AF010238
M-上游引物：TGGAGGATTTTTTTGCGTACGC      532-689        157bp      1
M-下游引物：GAACCGAACGCCGCGAA                                     2
U-上游引物：GTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGT                              3
U-下游引物：CCCAAACCAAACACCACAAA                                  4
APC         GeneBank NO.U02509
M-上游引物：TATTGCGGAGTGCGGGTC          702-799        97bp       5
M-下游引物：TCGACGAACTCCCGACGA                                    6
U-上游引物：GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT    695-803        108bp      7
U-下游引物：CCAATCAACAAACTCCCAACAA                                8
DAPK        GeneGank NO.NM_004938.
M-上游引物：GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC    2-102          101bp      9
M-下游引物：CCCTCCCAAACGCCGA                                      10
U-上游引物：CAAATCCCTCCCAAACACCAA       5-107          103bp      11
U-下游引物：CAAATCCCTCCCAAACACCAA                                 12
RB1         GeneBank NO.L11910
M-上游引物：GGGAGTTTCGCGGACGTGAC        1833-1983      149bp      13
M-下游引物：ACGTCGAAACACGCCCCG                                    14
U-上游引物：GGGAGTTTTGTGGATGTGAT                                  15
U-下游引物：ACATCAAAACACACCCCA                                    16
APAF1       GeneBank NO.AB070829
M-上游引物：AGGTTTAGTTACGTTTCGTTCG           946-1162      217bp             17
M-下游引物：CGTCCACTCGCTACCTCTTC                                             18
U-上游引物：GAGGTTTAGTTATGTTTTGTTTGTGG       945-1159      215bp             19
U-下游引物  CCACTCACTACCTCTTCTTCTCC                                          20
ARF         GeneBank NO.L41934
M-上游引物：GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC             201-322                         21
M-下游引物：AAAACCCTCACTCGCGACGA                                             22
U-上游引物：TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT                                       23
U-下游引物：CACAAAAACCCTCACTCACAACAA                                         24
P16INK4A    GeneBank NO.NM_000077
M-上游引物：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC         192-340                         25
M-下游引物：ACCCCGAACCGCGACCGTAA                                             26
U-上游引物：TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT         192-342                         27
U-下游引物：CAACCCCAAACCACAACCATAA                                           28
Brcal       GeneBank NO.L78833
M-上游引物：GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG        3183-3365     182bp             29
M-下游引物：TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG                                        30
U-上游引物：GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG                                        31
M-下游引物：TCAACAAACTCACACCACACAATCA                                        32
CDH13       GeneBank NO.AB001090
M-上游引物：TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC             1402-1644     243bp             33
M-下游引物：GACGTTTTCATTCATACACGCG                                           34
U-上游引物：TTGTGGGGTTGTTTTTTGT                                              35
U-下游引物：AACTTTTCATTCATACACACA                                            36
E-cadherin  GeneBank NO.L34545
M-上游引物：GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC             881-1053      172bp             37
M-下游引物：CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG                                       38
U-上游引物：GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT          881-1055      175bp             39
U-下游引物：AACTCACAAATCTTTACAATTCCAACA                                      40
P15-ink4b   GeneBank NO.NM_004936
M-上游引物：GCGTTCGTATTTTGCGGTT                   145-292               41
M-下游引物：CGTACAATAACCGAACGACCGA                                      42
U-上游引物：TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT             130-293               43
U-下游引物：CCATACAATAACCAAACAACCAA                                     44
PTEN        GeneBank NO.NM_000314
M-上游引物：GGTTTTTCGAGGCGTTCG                    57-249                45
M-下游引物：CGCCTCACAACGACTCAACT                                        46
U-上游引物：TGGTTTTTTGAGGTGTTTG                                         47
U-下游引物：TTCCATCATAACTACAACTTCCA               56-222                48
Rar-beta    GeneBank NO.NM_016152
M-上游引物：TCGAGAACGCGAGCGATTCG                  105-250      149bp    49
M-下游引物  GACCAATCCAACCGAAACGA                                        50
U-上游引物  TTGAGAATGTGAGTGATTTGA                                       51
U-下游引物  AACCAATCCAACCAAAACAA                                        52
HTERT       GeneBank NO.AF047386
M-上游引物：GACGTAAAGTTTTTTTCGGACG                605-821               53
M-下游引物：ACCCGATACGCTACCGAACG                                        54
U-上游引物：GTAAAGATGTAAAGTTTTTTTTGGATG           601-827               55
U-下游引物：CCACAACCCAATACACTACCA                                       56
TIMP3       GeneBank NO.NM_000362
M-上游引物：CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC          733-848      118bp    57
M-下游引物  CCGAAAACCCCGCCTCG                                           58
U-上游引物  TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT                             59
U-下游引物  CCCCCAAAAACCCCACCTCA                                        60
Rassf1a     GeneBank NO.XM_040961
M-上游引物：GTGTTAACGCGTTGCGTATC                  119-202               61
M-下游引物：AACCCCGCGAACTAAAAACGA                                       62
U-上游引物：TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG               107-204               63
U-下游引物：CAAACCCCACAAACTAAAAACAA                                     64
Rassf1c     GeneBank
            NO.ref|NT_006014.7|Hs3_6171
M-上游引物：AGTTTGGATTGTCGGTTTCG                  682182-           65
                                                  682369
M-下游引物：TCACAAACCCCACCTACCAC                                    66
U-上游引物：GGAGTTTGGATTGTTGGTTTTG                                  67
U-下游引物：CACCCCCAAAAATAACCTCAT                                   68
SURVIVIN    GeneBank NO.U75285
M-上游引物：GGCGGGAGGATTATAATTTTCG                2640-2803         69
M-下游引物：CCGCCACCTCTACCAACG                                      70
U-上游引物：GGTGGGAGGATTATAATTTTTG                                  71
U-下游引物：CCACCACCACCACCTCTAC                                     72
Caspase-8   GeneBank NO.AF210257
M-上游引物：TAGGGGATTCGGACATTGCGA                 536-857           73
M-下游引物：CGTATATCTACATTCGAAACG                                   74
U-上游引物：TAGGGGATTTGGAGATTGTGA                                   75
U-下游引物：CCATATATATCTACATTCAAAACAA                               76
hMLh1       GeneBank NO.AB017806
M-上游引物：TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT         1067-1191         77
M-下游引物：ACCACCTCATCATAACTACCCACA                                78
U-上游引物：ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC              1073-1190         79
U-下游引物：CCTCATCGTAACTACCCGCG                                    80
扩增结果如图1和表4所示。结果表明，上述各基因启动子CpG岛的甲基化状态与肝癌存在密切的相关性。
                     表4  各基因启动子CpG岛甲基化情况汇总表
注：各基因名称如下：
    1            CDH13
    2            p16
    3            caspase-8
    4            ARF
    5            E-钙粘蛋白
    6            APAF-1
    7            hMLH1
    8            Brcal
    9            HTERT
    10           VHL
    11           Rassf1c
    12           Rassf1a
    13           RAR-β2
    14           TIMP3
    15           MGMT
    16           DAPK
    17           P15
    18           RB1
    19           APC
    20           Survivin
    21           PTEN
实施例4
甲基化特异性限制性内切酶+PCR法检测各基因启动子CpG岛的甲基化状态
实验方法如下：
(a)用甲基化敏感的限制性内切酶处理DNA样品.
1.在一个离心管内加入下列体系消化DNA样品：
DNA 1ug/ul
10X酶切缓冲液 5.0ul
AssII或HpaII或HhaI(10U/ul) 1.0ul
H2O 余量
总计 50ul
2.纯化消化过的DNA用琼脂糖中DNA回收试剂盒回收
1)向酶切产物加SN溶液
2)过柱
3)用洗涤缓冲液洗2次
4)用70℃20ul TE洗脱
3.PCR扩增目的基因
1)PCR反应(20-ul体积)
在PCR管中加入15ug石蜡油.和1ul消化过的DNA，1ul引物(4pmole)
10X缓冲液 1.5ul
dNTP 1.5ul
Taq酶(5u/ul) 0.2ul
模板(约10-20ng) 1ul
H2O 7ul
15ul
PCR反应条件如下：先94℃2分钟，然后是90℃15秒，55-60℃15秒，72℃15秒，共30个循环，最后是72℃延伸10分钟。PCR产物经2％琼脂糖(0.5X TBE)电泳后分析。
                           表5用于甲基化特异性限制性内切酶+PCR法的引物
靶基因 登录号  BstUI Hha I  HpaII           有义引物 SEQIDNO：     反义引物 SEQIDNO： PCR产物长度(bp)
  APAF   AB070829   9   7   4 gagtccggcattggtgggaac   81 agactccccacctctggttctatcc   82     301
  APC   U02509   0   2   0 gacctcccccgactctttac   83 atacagccacatgtcggtca   84     280
  ARF   L41934   4   7   1 tgggtcccagtctgcagttaagg   85 atcagcacgagggccacagc   86     247
  BRCA1   L78833   2   2   0 gtccctcccatcctctgatt   87 gcccagttatctgagaaacccc   88     192
  Caspase-8   AF210257   0   0   0 cacgtggagttaggcaggtt   89 aacggctcagagagaaacca   90     240
  CDH13   AB001090   3   1   1 ccaaagaagcaaatgggatg   91 agttctcggctgcattttgt   92     309
  DPAK   NM_004938   1   3 ggaggacagccggaccgagccaacgcc   93 ccgg cgcctgggagggatctg   94     106
  E-钙粘蛋白   L34545   2   1   3 agaccctagcaactccaggctagag   95 cgggctggagtctgaactgacttc   96     251
  hMLH1   AB017806   4   3   0 ccctgacgcagacgctccaccagggccgc   97 cgcgggtagctacgatgaggcggc   98     124
  p15   NM_004936   4   5   2 ccccactctgccagagcgag   99 cgtcgtccttctgcggcttg   100     217
  p16   NM_000077   2   3   3 accggaggaagaaagaggag   101 ggcctccgaccgtaacta   102     254
tt
  pten NM_000314     4     7     3 cggtcttccgaggcgcccg   103 agttgagccgctgtgaggcg  104   194
  RAR-B NM_016152     1     0     2 gaagtgagctgttcagaggcagg   105 ctggtgctctgtgtttcaattgc  106   274
  RASSF1a XM_040961     7     8     2 caaagccagcgaagcac   107 cggtagtggcaggtgaactt  108   307
  RASSF1c NT_006014.7     3     4     4 cggcacagagaggctaattc   109 acagaccccacctaccacag  110   225
  RB1 L11910     12     11     10 ccagtttaattcctcatgacttagc   111 gtcaagttgaagccgagacc  112   657
  Survivin U75285     5     4     1 gactacaactcccggcacac   113 tgtagagatgcggtggtcct  114   226
  TERT AF047386     2     1     4 ggtagtcgaggtgaaccgcgtc   115 aggcccaccctccgcaac  116   311
  TIMP3 NM_000362     0     3     3 ggcggcattattccctataa   117 aggagcaagaggaggaggag  118   264
  VHL AF010238     12     9     5 gcctccgttacaacagccta   119 tcttcagggccgtactcttc  120   289
注：在Bst UI、Hha I、Hpa II三栏中给出的酶切位点的数目。
结果汇总于表4。结果表明，上述各基因启动子CpG岛的甲基化状态与肝癌存在密切的相关性。
为了验证结果，将多数甲基化特异性的PCR产物均克隆到T载体中(Promega.USA)后送去测序。同时，采用半定量的RT-PCR对以下一些基因在正常肝和数例癌和癌旁肝组织中的水平作了一个评估(见图2)。结果证实了实施例3和4中的结果。
本发明人还对癌，癌旁正常组织及正常肝甲基转移酶I表达进行了半定量的RT-PCR分析，结果表明DMTS1在癌旁组织为高。
实施例5
试剂盒的制备
制备一肝癌检测试剂盒，它含有甲基化特异性限制性内切酶Hpa II、BstuI和HhaI各200单位，并且含有启动子CpG岛特异性引物对各100微升，所述引物对就是表5中各引物对SEQ ID NO：81-120。该试剂盒还含有使用说明。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (8)

1.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有：
(a)甲基化敏感性限制性内切酶，以及针对选自下组基因的启动子CpG岛特异性引物对：
APC、BRCA1、Caspase8、DAPK1、APAF、H-钙粘蛋白CDH13、hMLH1、06甲基鸟嘌呤甲基转移酶、P14/ARF、P15、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、Survivin、和PTEN：
或含有
(b)使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，以及针对选自下组基因的启动子CpG岛甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对：
APC、BRCA1、Caspase 8、DAPK1、APAF、H-钙粘蛋白、hMLH1、06甲基鸟嘌呤甲基转移酶、P14/ARF、P15、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、Survivin、和PTEN。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它还包括阳性对照和/或阴性对照。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的基因选自：H-钙粘蛋白CDH13、RASSF1a和c、Caspase 8和Survivin。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的启动子CpG岛特异性引物对长度为15-35bp，所扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它含有甲基化敏感性限制性内切酶，且所述的启动子CpG岛特异性引物对选自下组：
靶基因           有义引物                         SEQ ID      反义引物                    SEQ ID
                                                  NO：                                    NO：
APAF             gagtccggcattggtgggaac            81          agactccccacctctggttctatcc   82
APC              gacctcccccgactctttac             83          atacagccacatgtcggtca        84
ARF              tgggtcccagtctgcagttaagg          85          atcagcacgagggccacagc        86
BRCA1            gtccctcccatcctctgatt             87          gcccagttatctgagaaacccc      88
Caspase-8        cacgtggagttaggcaggtt             89          aacggctcagagagaaacca        90
CDH13            ccaaagaagcaaatgggatg             91          agttctcggctgcattttgt        92
DPAK             ggaggacag ccggaccgag ccaacgcc    93          ccgg cgcctgggag ggatctg     94
hMLH1            ccctgacgcagacgctccaccagggccgc    97          cgcgggtagctacgatgaggcggc    98
p15              ccccactctgccagagcgag             99          cgtcgtccttctgcggcttg        100
pten        cggtcttccgaggcgcccg       103      agttgagccgctgtgaggcg        104
RAR-B       gaagtgagctgttcagaggcagg   105      ctggtgctctgtgtttcaattgc     106
RASSF1a     caaagccagcgaagcac         107      cggtagtggcaggtgaactt        108
RASSF1c     cggcacagagaggctaattc      109      acagaccccacctaccacag        110
RB1         ccagtttaattcctcatgacttagc 111      gtcaagttgaagccgagacc        112
Survivin    gactacaactcccggcacac      113      tgtagagatgcggtggtcct        114
TERT        ggtagtcgaggtgaaccgcgtc    115      aggcccaccctccgcaac          116
TIMP3       ggcggcattattccctataa      117      aggagcaagaggaggaggag        118。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的甲基化敏感性限制性内切酶选自：Hpa II、BstuI和HhaI。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它含有使非甲基化胞嘧啶选择性地转化为尿嘧啶的试剂；且所述的启动子CpG岛的甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对选自下组：
名称                                        SEQ ID NO：
APC
M-上游引物：TATTGCGGAGTGCGGGTC              5
M-下游引物：TCGACGAACTCCCGACGA              6
U-上游引物：GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT        7
U-下游引物：CCAATCAACAAACTCCCAACAA          8
DAPK
M-上游引物：GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC        9
M-下游引物：CCCTCCCAAACGCCGA                10
U-上游引物：CAAATCCCTCCCAAACACCAA           11
U-下游引物：CAAATCCCTCCCAAACACCAA           12
RB1
M-上游引物：GGGAGTTTCGCGGACGTGAC            13
M-下游引物：ACGTCGAAACACGCCCCG              14
U-上游引物：GGGAGTTTTGTGGATGTGAT            15
U-下游引物：ACATCAAAACACACCCCA              16
APAF1
M-上游引物：AGGTTTAGTTACGTTTCGTTCG          17
M-下游引物：CGTCCACTCGCTACCTCTTC            18
U-上游引物：GAGGTTTAGTTATGTTTTGTTTGTGG      19
U-下游引物  CCACTCACTACCTCTTCTTCTCC         20
ARF
M-上游引物：GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC            21
M-下游引物：AAAACCCTCACTCGCGACGA            22
U-上游引物：TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT      23
U-下游引物：CACAAAAACCCTCACTCACAACAA        24
Brca1
M-上游引物：GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG       29
M-下游引物：TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG       30
U-上游引物：GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG       31
M-下游引物：TCAACAAACTCACACCACACAATCA       32
CDH13
M-上游引物：TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC            33
M-下游引物：GACGTTTTCATTCATACACGCG          34
U-上游引物：TTGTGGGGTTGTTTTTTGT             35
U-下游引物：AACTTTTCATTCATACACACA           36
P15-ink4b
M-上游引物：GCGTTCGTATTTTGCGGTT             41
M-下游引物：CGTACAATAACCGAACGACCGA          42
U-上游引物：TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT       43
U-下游引物：CCATACAATAACCAAACAACCAA         44
PTEN
M-上游引物：GGTTTTTCGAGGCGTTCG              45
M-下游引物：CGCCTCACAACGACTCAACT            46
U-上游引物：TGGTTTTTTGAGGTGTTTG             47
U-下游引物：TTCCATCATAACTACAACTTCCA         48
Rar-beta
M-上游引物：TCGAGAACGCGAGCGATTCG            49
M-下游引物  GACCAATCCAACCGAAACGA            50
U-上游引物  TTGAGAATGTGAGTGATTTGA           51
U-下游引物  AACCAATCCAACCAAAACAA            52
HTERT
M-上游引物：GACGTAAAGTTTTTTTCGGACG          53
M-下游引物：ACCCGATACGCTACCGAACG               54
U-上游引物：GTAAAGATGTAAAGTTTTTTTTGGATG        55
U-下游引物：CCACAACCCAATACACTACCA              56
TIMP3
M-上游引物：CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC       57
M-下游引物  CCGAAAACCCCGCCTCG                  58
U-上游引物  TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT    59
U-下游引物  CCCCCAAAAACCCCACCTCA               60
Rassf1a
M-上游引物：GTGTTAACGCGTTGCGTATC               61
M-下游引物：AACCCCGCGAACTAAAAACGA              62
U-上游引物：TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG            63
U-下游引物：CAAACCCCACAAACTAAAAACAA            64
Rassf1c
M-上游引物：AGTTTGGATTGTCGGTTTCG               65
M-下游引物：TCACAAACCCCACCTACCAC               66
U-上游引物：GGAGTTTGGATTGTTGGTTTTG             67
U-下游引物：CACCCCCAAAAATAACCTCAT              68
SURVIVIN
M-上游引物：GGCGGGAGGATTATAATTTTCG             69
M-下游引物：CCGCCACCTCTACCAACG                 70
U-上游引物：GGTGGGAGGATTATAATTTTTG             71
U-下游引物：CCACCACCACCACCTCTAC                72
Caspase-8
M-上游引物：TAGGGGATTCGGACATTGCGA              73
M-下游引物：CGTATATCTACATTCGAAACG              74
U-上游引物：TAGGGGATTTGGAGATTGTGA              75
U-下游引物：CCATATATATCTACATTCAAAACAA          76
hMLh1
M-上游引物：TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT      77
M-下游引物：ACCACCTCATCATAACTACCCACA           78
U-上游引物：ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC           79
U-下游引物：CCTCATCGTAACTACCCGCG               80。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的使甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂包括亚硫酸氢盐，联苯二酚和氢氧化钠。
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