CN102242200B - 一种用于诊断vhl病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于诊断VHL病的试剂盒。该用于诊断VHL病的试剂盒，包括如下引物对，引物对1：SEQ ID No：1所示DNA分子和SEQ ID No：2所示DNA分子；引物对2：SEQ ID No：3所示DNA分子和SEQ ID No：4所示DNA分子；引物对3：SEQ ID No：5所示DNA分子和SEQ ID No：6所示DNA分子。实验证明，本发明的试剂盒的PCR扩增产物条带专一，几乎无杂带，测序结果专一，清晰准确，没有不确定的碱基。说明本发明试剂盒中的引物特异性好，杂带少。本发明便于VHL病家族成员筛查，为达到早发现、早诊断、早治疗的目的奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于诊断VHL病的试剂盒。
背景技术
von Hippel-Lindau(希佩尔-林道)病是一种罕见的常染色体显性遗传病，发病率为1/36000，由于生殖细胞VHL基因改变，导致多脏器良恶性病变。主要临床表现为视网膜血管瘤、中枢神经系统血管母细胞瘤、肾癌、肾囊肿、胰腺肿瘤或囊肿、嗜铬细胞瘤、附睾肿瘤或囊肿等病变。肾癌和中枢神经系统成血管细胞瘤是VHL病的致死主要原因。目前临床诊断标准是具有明确家族史的单发的视网膜血管瘤或中枢神经系统血管母细胞瘤，同时伴有嗜铬细胞瘤，肾癌、胰腺、附睾等部位损害之一的，即可诊断；对于散发性患者至少有两个视网膜血管瘤或中枢神经系统血管母细胞瘤，或一个血管母细胞瘤伴内脏实质肿瘤，即可诊断。VHL病中肾癌的发生率为28％～45％，几乎所有的病理类型为肾透明细胞癌。患者发病年龄早，常在20～50岁时发病，呈双侧多发性肾癌，进展较慢，发生转移晚，预后相对良好。与散发性肾癌治疗原则不同。手术以保留肾单位和维持治愈率为目的，小于3cm时，密切随访，大于3cm时，尽量多的保留肾组织，尽可能减少手术次数。VHL病临床表现复杂，临床特征结合影像资料诊断准确性不高，而且国内许多医生并不认识这种病，因此许多患者被误诊误治，过早的切除双肾，只能靠透析维持生命，患者的生活质量严重下降。明确诊断是合理治疗的关键，而基因诊断是确诊的金标准。
VHL基因是一种抑癌基因，定位于3p25～26区域，它有三个外显子，两个内含子，转录形成长约4.5kb的mRNA，可翻译为含有213个氨基酸残基的蛋白质。主要功能是调节细胞对于局部微环境氧含量的反应，所编码的蛋白质可以与elongin B、elonginC和Cullin2(Cul-2)形成E3-泛素连接蛋白酶复合体，靶向降解缺氧诱导因子-1(HIF-1)。VHL基因的失活或突变导致HIF-1调节异常，引起HIF-1在细胞内的蓄积，转移到细胞核，结合缺氧反应相关顺式作用元件，上调血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转换生长因子-α(TGF-α)、促红细胞生成素(EPO)、葡萄糖转运体-1(GLUT-1)以及作为肾透明细胞癌的一种特异性肿瘤相关抗原的碳酸酐酶-9(CA-9)等。VHL基因的失活导致HIF-1包胞内蓄积，引起上述细胞因子的表达失控，促进肿瘤细胞生长转移。
几乎所有VHL病患者的VHL基因发生改变，基因种系突变的类型包括：错义突变、无义突变、微小基因片段的缺失或插入，基因大片段缺失或插入甚至整个VHL基因的完全缺失。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于诊断VHL病的试剂盒。
本发明所提供的用于诊断VHL病的试剂盒，包括如下引物对：
引物对1：SEQ ID No：1所示DNA分子和SEQ ID No：2所示DNA分子；
引物对2：SEQ ID No：3所示DNA分子和SEQ ID No：4所示DNA分子；
引物对3：SEQ ID No：5所示DNA分子和SEQ ID No：6所示DNA分子。
上述试剂盒还可包括：10×PCR buffer、dNTPs、Tag DNA聚合酶和ddH2O。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断VHL病的PCR试剂。
本发明所提供的用于诊断VHL病的PCR试剂，由如下PCR试剂1、PCR试剂2和PCR试剂3组成：
PCR试剂1：每25ul PCR试剂1由5pmol SEQ ID No：1所示引物、5pmol SEQ ID No：2所示引物、2.5ul10×PCR buffer、0.25U Tag DNA聚合酶、15pmol dGTP、15pmol dATP、15pmol dTTP、15pmol dCTP和水组成，水补足体积；
PCR试剂2：每25ul PCR试剂2由5pmol SEQ ID No：3所示引物、5pmol SEQ ID No：4所示引物、2.5ul10×PCR buffer、0.25U Tag DNA聚合酶、15pmol dGTP、15pmol dATP、15pmol dTTP、15pmol dCTP和水组成，水补足体积；
PCR试剂3：每25ul PCR试剂3由5pmol SEQ ID No：5所示引物、5pmol SEQ ID No：6所示引物、2.5ul10×PCR buffer、0.25U Tag DNA聚合酶、15pmol dGTP、15pmol dATP、15pmol dTTP、15pmol dCTP和水组成，水补足体积。
上述任一PCR试剂中，10×PCR buffer按照如下方法制备：将100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液、KCl和MgCl2混合，得到10×PCR buffer；KCl在10×PCR buffer中的浓度为500nM，MgCl2在10×PCR buffer中的浓度为15nM。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断VHL病的试剂盒。
本发明所提供的用于诊断VHL病的试剂盒，由如下引物对组成：
引物对1：SEQ ID No：1所示DNA分子和SEQ ID No：2所示DNA分子；
引物对2：SEQ ID No：3所示DNA分子和SEQ ID No：4所示DNA分子；
引物对3：SEQ ID No：5所示DNA分子和SEQ ID No：6所示DNA分子；
引物对4：SEQ ID No：7所示DNA分子和SEQ ID No：8所示DNA分子；
引物对5：SEQ ID No：9所示DNA分子和SEQ ID No：10所示DNA分子；
引物对6：SEQ ID No：11所示DNA分子和SEQ ID No：12所示DNA分子；
引物对7：SEQ ID No：13所示DNA分子和SEQ ID No：14所示DNA分子。
实验证明，本发明的试剂盒的PCR扩增产物条带专一，几乎无杂带，测序结果专一，清晰准确，没有不确定的碱基。说明本发明试剂盒中的引物特异性好，杂带少。本发明便于VHL病家族成员筛查，为达到早发现、早诊断、早治疗的目的奠定了基础。
附图说明
图1为点突变的测序结果。
图2为正常人群基因扫描图。
图3为Exon 1缺失基因扫描图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述中的取血均经过供血者的同意。
实施例1、VHL病的诊断
步骤1：PCR克隆待测者的外周血基因组DNA的VHL基因的三个外显子编码序列，然后测序，与正常VHL基因序列比较，分析待测者的VHL基因突变，若存在目的突变，则认为待测者患有VHL病，若不存在目的突变，则进行如下步骤2；
步骤2：利用通用引物荧光定量PCR的方法扩增内参基因(β-globin)和VHL基因三个外显子，采用基因扫描的方法检测VHL基因缺失或插入，若存在缺失或插入，则认为待测者患有VHL病；若不存在插入或缺失，则确认待测者不患有VHL病。
具体如下：
一、PCR克隆VHL基因编码序列并测序
取临床诊断患有VHL病的患者的新鲜外周血5ml，EDTA抗凝，提取基因组DNA，测浓度，稀释成100ng/ul。以外周血DNA为模板，分别用如下三对引物进行PCR扩增，分别对扩增产物进行测序。
根据VHL基因三个外显子设计以下三对引物：
引物对1：
外显子1上游引物：5’-ggtggtctggatcgcgga-3’(SEQ ID No：1)
外显子1下游引物：5’-ggcttcagaccgtgctatcg-3’(SEQ ID No：2)
引物对2：
外显子2上游引物：5’-gtggctctttaacaacctttgc-3’(SEQ ID No：3)
外显子2下游引物：5’-cctgtacttaccacaacaaccttatc-3’(SEQ ID No：4)
引物对3：
外显子3上游引物：5’-gcaaagcctcttgttcgttc-3’(SEQ ID No：5)
外显子3下游引物：5’-caaaaatgccaccaccttct-3’(SEQ ID No：6)。
PCR扩增反应体系(25ul)如下：(如下的mol值、U值均是在25ul体系中的用量)
10×PCR buffer：将100mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液、KCl和MgCl2混合，得到10×PCR buffer；KCl在10×PCR buffer中的浓度为500nM，MgCl2在10×PCRbuffer中的浓度为15nM。
PCR扩增条件，94℃10min预变性；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃复性5min；4℃保存。
PCR产物纯化后送公司测序。
结果，PCR扩增产物条带专一，无杂带，测序结果专一，清晰准确。说明本发明方法中的引物特异性好。测序结果如图1所示。与正常的VHL基因相比，该扩增产物在基因的第3个外显子的第500bp处存在由C至T的突变，即R167W——Arg(精氨酸)-Trp(色氨酸)。表明该待测者患有VHL病，与临床诊断结果一致，说明本发明方法结果可靠。
同时实验还表明，当在上述引物的5′端或3′端增加或减少几个碱基、或改变引物中的几个碱基时，PCR扩增产物出现杂带多、不特异的现象。这增加了测序的难度，使测得的峰不易辨认，出现多处兼并碱基的情况，难以保证测序结果的准确度，还增加了测序的工作量。以上证明本发明的引物及体系的扩增特异性好。
二、利用通用引物荧光定量PCR基因扫描方法检测VHL基因缺失或插入
分别取临床诊断患有VHL病且步骤一检测未出现VHL基因点突变的患者的外周血、和正常人的外周血，分别提取DNA，再进行如下实验。
(1)第一次PCR：
用带有通用引物片段的特异引物对扩增患者VHL基因三个外显子，将得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物1-1、1-2、1-3；
用带有通用引物片段的特异引物对扩增正常VHL基因三个外显子，将得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物2-1、2-2、2-3；所述正常VHL基因为不存在任何突变的VHL基因即正常人的VHL基因；
用带有通用引物片段的特殊引物对扩增患者的内参基因-β-globin，将得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物3；
(2)第二次PCR：
用带有荧光标记的通用引物对分别扩增PCR扩增产物1-1、1-2、1-3，将得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物1′-1、1′-2、1′-3；
用带有荧光标记的通用引物对扩增PCR扩增产物2-1、2-2、2-3，将得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物2′-1、2′-2、2′-3；
用带有荧光标记的通用引物对扩增PCR扩增产物3，将得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物3′；
(3)毛细管电泳基因扫描
将PCR扩增产物1′-1、1′-2、1′-3、PCR扩增产物2′-1、2′-2、2′-3、PCR扩增产物3′分别进行毛细管电泳基因扫描，再分别得出PCR扩增产物1′-1、1′-2、1′-3与PCR扩增产物3′的峰面积比值，记作待测比值；再分别得出PCR扩增产物2′-1、2′-2、2′-3与PCR扩增产物3′的峰面积比值，记作正常比值；
(4)比值比较
分别比较各个外显子的待测比值，若至少一个外显子的待测比值比正常比值增加50％以上，则确认所述待测目标基因存在插入；若至少一个外显子的待测比值比正常比值减少50％以上，则确认所述待测目标基因存在缺失。
步骤(1)中所用的引物如下：
引物对A：产物大小：321bp；
VHL-1F：5’-tccgtcttagctgagtggcgtatacggccctgaagaagacg-3’(SEQ ID No：7)
VHL-1R：5’-aggcagaatcgactcaccgctatacctcggtagctgtggatg-3’(SEQ ID No：8)
引物对B：产物大小：396bp；
VHL-2F：5’-tccgtcttagctgagtggcgtaagacgaggtttcaccacgtt-3’(SEQ ID No：9)
VHL-2R：5’-aggcagaatcgactcaccgctagggcttaatttttcaagtggtc-3’(SEQ ID No：10)
引物对C：产物大小：364bp；
VHL-3F：5’-tccgtcttagctgagtggcgtatactgagaccctagtctgtcactg-3’(SEQ ID No：11)
VHL-3R：5’-aggcagaatcgactcaccgctactaaggaaggaaccagtcctgtat-3’(SEQ ID No：12)
引物对D：产物大小：304bp。
β-globin F：5’-tccgtcttagctgagtggcgtacacaccctagggttggccaa-3’(SEQ ID No：15)
β-globin R：5’-aggcagaatcgactcaccgctaacctgtcttgtaaccttgatac-3’(SEQ ID No：16)；
步骤(2)中所用的引物如下：
UnivF：5’-tccgtcttagctgagtggcgta-3’(SEQ ID No：13)
UnivR：5’-aggcagaatcgactcaccgcta-3’(SEQ ID No：14)(标有FAM荧光)
PCR反应体系如下：
VHL-1、VHL-2、VHL-3、β-globin、Univ五对引物分别稀释为5pmol，2pmol，1.5pmol，2pmol，4pmol。按照以下分别配制反应体系：
第一次PCR反应体系：
第二次PCR反应体系：
第一次PCR反应条件：94℃10min预变性；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，9个循环；72℃复性5min；4℃保存。
第二次PCR反应条件：94℃10min预变性；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃复性5min；4℃保存。
结果如图2和图3所示。结果显示，患者的外显子1与内参的峰面积比值比正常人的减少50％。表明，本发明方法可靠。
Claims (1)
1.一种用于诊断VHL病的试剂盒，由如下引物对组成：
引物对1：SEQ ID No:1所示DNA分子和SEQ ID No:2所示DNA分子；
引物对2：SEQ ID No:3所示DNA分子和SEQ ID No:4所示DNA分子；
引物对3：SEQ ID No:5所示DNA分子和SEQ ID No:6所示DNA分子；
引物对4：SEQ ID No:7所示DNA分子和SEQ ID No:8所示DNA分子；
引物对5：SEQ ID No:9所示DNA分子和SEQ ID No:10所示DNA分子；
引物对6：SEQ ID No:11所示DNA分子和SEQ ID No:12所示DNA分子；
引物对7：SEQ ID No:13所示DNA分子和SEQ ID No:14所示DNA分子；
引物对8：SEQ ID No:15所示DNA分子和SEQ ID No:16所示DNA分子。
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