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近年来,世界上一些国家,特别是工业发达国家,肺癌发病率呈逐渐增高的趋势,尤其是女性肺癌发病率增高的幅度更为明显。每年因肺癌死亡的人数多于乳腺癌、前列腺癌和肠癌死亡人数的总和。2002年,全世界有超过130万人被确诊患有肺癌,超过110万人死于肺癌。在美国,肺癌居癌症首位,肺癌死亡约占全部癌症死亡的28.6%。在我国,肺癌也是第一大癌症。2004年9月24~26日召开的首届中国肺癌南北高峰论坛预测,2000~2005年间,我国肺癌的发病人数将增加12万,男性将从2000年的26万增加到2005年的33万,女性将从2000年的12万增至17万。到2025年,我国每年肺癌患者将超过100万,成为世界第一肺癌大国。
肺癌的病因比较复杂,如环境污染、吸烟和高温油烟等危险因素均是肺癌高发的主要元凶。肺癌按生物学类型可分为非小细胞肺癌(Non-small Cell LungCancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell LungCancer,SCLC)两大类。在临床中,NSCLC占80%左右,包括腺癌、鳞癌和大细胞癌三种类型。
肺癌的早期发现有一定难度。肺癌起病隐匿,症状和呼吸道其他疾患相仿,易造成耽搁和误诊,使癌细胞得以借机增值、外侵、转移。一旦察觉,病情多已进入中晚期和晚期,极大影响肺癌的整体治愈率。这是肺癌难治的主要原因之一。临床上所见的NSCLC中,约1/3处于早期和中期(I~IIIAN1),以手术为主要治疗方法;约1/3处于局部晚期(IIIAN2~IIIB),放射治疗是其主要治疗方法;另1/3已有远处转 移,治疗以全身化疗为主。但是手术治疗、放射治疗、全身化疗都有一定的局限性,因此生物治疗在肿瘤治疗领域中逐渐成为一个热点。在哺乳动物细胞中,细胞凋亡受两类蛋白家族调控:B细胞白血病/淋巴瘤2家族(B-cellLeukemia/Lymphoma 2,BCL2)和凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of Apoptosis Proteins,IAPs)。Survivin于1997年由耶鲁大学的Altieri等发现,是IAP家族的一个独特成员。人Survivin由142个氨基酸组成,分子量是16.5kDa,是哺乳动物IAP家族中最小的成员。survivin基因位于染色体17q25,全长1417kb。
Survivin的半衰期为30分钟,其表达具有明显的细胞周期依赖性。在有丝分裂过程中,Survivin分布于多种元件,如中心体、中期微管、后期纺锤体等。Survivin具有调控细胞有丝分裂并抑制细胞凋亡的功能。
研究认为,Survivin是细胞凋亡与细胞周期检查点之间的界面分子。Survivin主要通过直接抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程;以及与周期蛋白激酶cdk4、p34cdc2相互作用阻断凋亡信号转导通路这两条途径来抑制细胞凋亡(图1)。Survivin是周期蛋白激酶p34cdc2-cyclinB1的有丝分裂期底物,SurvivinThr34位点磷酸化后与caspase-9结合并抑制其活性,阻断caspase-9依赖性的细胞凋亡信号传导。Survivin进入核内与cdk4结合,导致Rb磷酸化和p21释放,分别加快G1→S期的转换和抑制caspase-3的活性,阻断线粒体释放细胞色素c从而抑制细胞凋亡。
survivin在胚胎和胎儿器官中广泛高度表达,在大多数结束分化的正常组织中未被检测,但在肿瘤组织中过量表达。经实验证实,Survivin基因在非小细胞肺癌中高效表达,在其它组织中的表达较少。
同时survivin在其他肿瘤组织中也同样存在过量表达,如乳腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、子宫癌、卵巢癌、何杰金氏症(Hodgkin’s Disease)、非何杰金氏(Non-Hodgkin’s)淋巴瘤、白血病、成神经细胞瘤、软组织瘤、神经胶质瘤以及黑素瘤。survivin在相应器官的正常组织中并不表达。同时,对表达survivin的肿瘤,肿瘤病人总体存活率降低,复发率升高,并对化疗等产生抗性。
survivin基因可能在癌变细胞中不受调控的广泛表达于细胞周期 的各个阶段,而不仅仅在有丝分裂期。同时Survivin的特异性表达使其成为肺癌治疗靶点,同时又是有效的诊断标记。
由于survivin在肿瘤组织与正常组织中的表达差异,及其对维持肿瘤细胞生存的需求趋向,Survivin被认为是癌症治疗的一个重要靶点。基于Survivin的治疗要求毒性低,同时能有效破坏肿瘤细胞独有的生存机制。同Survivin进行分子水平上的拮抗是促进肿瘤细胞死亡的途径之一,并且能同传统的化疗以及放疗相结合进行癌症治疗。
Hu,Jifan等报道了针对Igf2,bcl-2,MKP-I,cdc25a基因的基因沉默技术和核苷酸。该核苷酸含有导向元件(Guiding Element,GE)和DNA灭活元件(Inactivating Element,IE)。其中GE是一条短的正义寡核苷酸链,它可以与基因组DNA模板链互补,其作用是引导DNA灭活元件到基因组DNA特定的核苷酸序列,通常是靶基因的启动子附近区域。IE是一条独特的寡核苷酸链,在它的5’端含有一个CpG半甲基化的发夹结构。与GE于靶序列结合后,它可以诱导DNA甲基转移酶使邻近区域DNA的CpG二核苷酸甲基化,从而抑制转录的发生。由于IE/GE结构中的引导元件是一条正义链,因此该寡核苷酸不会与mRNA转录子结合。该结构的GE段与处于复制或转录状态的基因模板链结合,形成一个半甲基化的复制叉样结构,该结构是DNA甲基转移酶Dnmt1(DNA Methyltransferase)的最佳底物。它与DNA复制机制相结合,通过使细胞中新合成的DNA链甲基化来维持DNA的甲基化状态。
Marzia Pennati等报道了核酶介导的survivin表达抑制方法。该核酶以survivin mRNA的3’端外显子1中CUA110为靶点。实验证明,核酶介导的survivin表达抑制能引起caspase-9依赖的细胞凋亡和肿瘤生长抑制。
Vladimir Pisarev等报道了全长的显性负作用的survivin基因在癌症免疫治疗中的作用。在基因水平上将Survivin第34位的氨基酸Thr替换成Ala,这一改变去除了p34cdc2-cyclin B1磷酸化位点,从而使突变蛋白具有显性负作用。
Tsuruma T等同样报道了Survivin源的蛋白疫苗应用于结肠癌的I期临床研究。I期临床研究也表明了该疫苗是安全的。
Survivin在细胞存活以及有丝分钟裂正常进行中所起的至关重要的作用已经得到多个领域研究的论证,肿瘤细胞对Survivin的需求也得到了证实。这些都表明,Survivin是癌症治疗的一个合理的靶点。同时Survivin的研究现状提示我们,可以将Survivin作为靶点开发肺癌的生物治疗药物,通过抑制survivin基因的表达,起到抑制肿瘤生长、治疗肺癌的目的。
上述发明都没有报道以Survivin为靶点,采用寡核苷酸利用基因沉默技术达到治疗肺癌效果的研究。
Lilly公司和ISIS公司合作开发了以Survivin为靶点的第二代反义核酸药物LY2181308。但是该药物是与Survivin mRNA结合从而起到抑制的作用,对于来自于肺、结肠、乳腺、前列腺、卵巢、宫颈、皮肤以及大脑等多种细胞株,以及人黑素瘤细胞异种移植肿瘤模型,都显示出稳定的活性作用,能选择性抑制Survivin蛋白表达,诱导细胞凋亡,以及抑制肿瘤生长。
Chunyao Xia等报道的采用第二代合成工艺和一级高效液相纯化的含硫代磷酸酯的反义核酸,由20个核苷酸组成,以survivin mRNA232-251为靶点。该反义核酸在间皮瘤细胞株H28和MS-1以及肿瘤模型中能有效抑制survivin的表达并在体外引起细胞凋亡。该反义核酸同化学治疗相结合能提高间皮瘤临床治疗的效果,成为对付间皮瘤的一个有效的基因治疗方法。
但是由于上述两种药物是作用于mRNA survivin,所以用药量大,同时对于半衰期没有什么改变。而基因沉默(Gene Silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。这种现象是Peerbolte在1986年首先在转基因植物中发现的。后来,人们在线虫、真菌、昆虫、原生动物、果蝇、斑马鱼及老鼠中也陆续发现了基因沉默现象。发生沉默的基因可以是外源性转移基因,也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因。大量的研究表明,环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度转录等都与基因沉默有关。基因沉默一般发生在两种水平上:转录水平基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS)和转录后水平基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)。
基因及其启动子甲基化是转录水平基因沉默的一种。从所报道的基因沉默例子来看,几乎所有的基因沉默现象与基因及其启动子的甲基化有关。DNA甲基化是真核生物表观遗传调控的一种重要方式,通过影响基因转录水平而参与细胞分化的调控过程。甲基化导致某些区域DNA构象变化,从而影响了蛋白质与DNA的相互作用,抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。在脊椎动物中,DNA甲基化局限于染色体上富含CpG二核苷酸的短区域,即CpG岛。
在肺癌发生过程中,基因启动子区CpG岛发生异常甲基化是一种常见的现象,在NSCLC样本中,apc基因发生甲基化的频率高达94%,cdh13、rar、fhit、rassfla等基因甲基化的频率也都超过40%。基因甲基化可以通过去甲基化药物逆转,5-氮胞嘧啶(5-AZA-CR)自20世纪60年代就已被用于癌症治疗的临床实验。
抑癌基因的异常甲基化会造成肺癌的发生,而肿瘤治疗靶点survivin基因的甲基化或许能治疗肺癌。最新研究发现,siRNA(SmallInterfering RNA)和甲基化寡核苷酸(Methylated Oligonucleotide,MON)都能诱导基因DNA甲基化。Kevin等和Kawasaki等都报道了某些siRNA能诱导基因DNA甲基化,从而引起转录水平基因沉默;Yao等报道了利用MON诱导DNA甲基化造成igf2基因沉默,并在肝癌动物模型上达到抑制肿瘤的效果。
具体实施方式
实施例1:Survivin基因在NCI-H460细胞中高水平表达
将培养于RPMI-1640培养基(含10%FBS、100μg/ml氨基卞青霉素钠、40μg/ml硫酸链霉素)中的人非小细胞肺癌(Non-small CellLung Cancer,NSCLC)细胞株NCI-H460,在37℃、5%CO2的环境下生长至对数生长期(密度约75%,经台盼蓝排斥实验检测,活细胞率>95%),细胞经0.25%胰蛋白酶消化后,用无菌PBS(pH 7.4)收集,核酸抽提,用100 µ;1 DEPC-H2O溶解,于260nm下测其吸收值,计算RNA浓度(A260×40(μg/μl))。
反转录:用RNA抽提物(RNA浓度为0.025~0.125μg/μl)做模板,加缓冲液、Dnase I(5U/μl)、RNase抑制剂(40U/μl)和DEPC-H2O后,经37℃45分钟和75℃10分钟处理,冰上冷却后再依次加入缓冲液、DTT(100mM)、dNTP混合液(10mM each)、Oligo(dT)18引物(0.1μg/μl)、随机引物(0.1μg/μl)、RNase抑制剂和MMuLV反转录酶(200U/μl)。经37℃60分钟和90℃2分钟处理,冰上冷却。
PCR:以cDNA为模板,进行PCR扩增。扩增条件为:变性94℃2分钟钟;35个循环:94℃20秒,60℃20秒,72℃30秒;延伸72℃10分钟。
电泳及检测:1.4%的琼脂胶浓度,电泳检测PCR反应产物,实验结果如图(图3),结果显示,β-actin的PCR扩增产物在96bp处出现明显的条带,而survivin的PCR扩增产物在123bp处出现明显的条带。同时,由于β-actin和survivin基因的扩增使用的是同一样本等体积的cDNA,条带亮度进行初步对比显示,survivin基因的表达量略低于β-actin,而β-actin是恒定高表达的看家基因(House Keeping Gene),因此我们认为survivin基因在NCI-H460细胞中高水平表达。
实施例2:Surkex抑制NCI-H460中Survivin mRNA的表达
转染:将处于指数生长期(密度约75%,经台盼蓝排斥实验检测,活细胞率>95%)的NCI-H460细胞经0.25%胰蛋白酶消化后,用培养 液收集,在24孔板中以105个/孔的浓度铺板,37℃培养过夜。
将SurKex溶于无菌PBS(pH 7.4)中,并经针头式过滤器过滤。在Eppendorf管A中加入室温下的Opti-MEM培养基100μl,再加入3μl GeneJammer转染试剂,混匀后室温放置5分钟钟。在Eppendorf管B中加入室温下的Opti-MEM培养基135μl,加入15μl SurKex的PBS溶液,混匀。混合A、B两管,反复抽吸混匀,室温放置30分钟。SurKex转染浓度见表1。
吸去24孔板中的培养基,用500μl RPMI 1640洗涤细胞。每孔逐滴加入250μl A、B管混合液,轻微摇晃混匀。37℃培养12小时后,再向每孔加入250μl含20%FBS的RPMI 1640培养基,37℃继续培养48小时。
核酸抽提与反转录
移除24孔板中的培养基,每孔加入25μl TriBlue-E,抽吸混匀后将裂解液转移至Eppendorf管,用1ml注射器26号针头抽吸匀浆液两次。
氯仿加入体积为50μl,RNA用150μl 70%乙醇洗涤、20μlDEPC-H2O溶解。
其余操作同实施例1中的核酸抽提和反转录。
实时定量PCR(QRT-PCR):
实时定量PCR(Quantative Real-time PCR,QRT-PCR)能借助荧光标志检测系统(非特异的与双链DNA结合而发荧光的染料,如SYBRGreen I)检测每个循环PCR产物的总累积量,以达到很好的定量结果。
在PCR用96孔板中,向每孔依次加入:模板cDNA(反转录得到的)、正反向引物(5’-CTTGG TGAAT TTTTG AAACT GGACA,3’-CAGCT GCTCG ATGGC ACGGC GCACT)、SYBR Green SuperMix(SYBR Green qPCR试剂盒,Invitrogen公司)和石蜡油。每个样品平行3孔。覆盖贴膜,离心10秒后放入实时定量PCR仪进行扩增。PCR扩增条件为:50℃2分钟,95℃2分钟;40个循环:95℃15秒,60℃1分钟。
扩增效率曲线
在QRT-PCR中,通常使用扩增效率曲线来考察两个基因的扩增效率的差异,其制作方法如下:
取PBS对照组的cDNA,以2.16倍为梯度稀释4次,得到5个样品(表2),
表2扩增效率曲线的制作
每个样品分钟别用β-actin和survivin的引物进行扩增,各自平行3孔。以相对浓度对数log(Relative Quantity)为横坐标,survivin与β-actin的域值循环数的差值ΔCT为纵坐标,绘制扩增效率曲线(图4)。同PBS对照组的cDNA相比,在β-actin和survivin模板的相对浓度为0.046至1范围内,其域值循环数的差值ΔCT(Y)与模板相对浓度log(RelativeQuantity)(X)呈一定的线性关系,其斜率的绝对值<0.1,即β-actin和survivin域值循环数的差值ΔCT几乎不随模板浓度的变化而变化,表明样品中β-actin和survivin模板的扩增效率是相同的或几乎相同的。
回归方程为:Y=-0.0047X+7.7062,R2=0.4478。
融解曲线
在QRT-PCR中,通常使用融解曲线(DissociationCurve)来考察扩增的特异性。分钟别以PBS对照组的cDNA为模板,DEPC-H2O为阴性对照(Negative Control,NC),用β-actin和survivin的引物进行扩增,各自平行3孔,观察融解曲线。以cDNA为模板,用β-actin的引物进行扩增的3个平行样品的融解曲线只在83℃位置出现一个峰,用survivin的引物进行扩增的3个平行样品的融解曲线只在80℃位置出现一个峰,表明β-actin和survivin都无非特异性扩增出现;而以DEPC-H2O为阴性对照(NC),用β-actin和survivin的引物进行扩增的各3个平行样品的融解曲线在温度变化过程中都不出现峰,表明β-actin和survivin的引物在扩增过程中都无二聚体形成(图5)。
相对定量的数据处理
对于本实验,当β-actin和survivin的扩增效率相等,即EA=ES时,经内标β-actin归一化后,给药组survivin基因表达量可表示为其占对照组survivin基因表达量的百分钟比的形式,归一化计算方法如下:
ΔCT(0)=CT(S0)-CT(A0) ΔCT(1)=CT(S1)-CT(A1)
ΔΔCT=ΔCT(1)-ΔCT(0)
式中:survivin expression表示同对照组相比,给药组样品中survivin的表达率;CT(A0)和CT(S0)分钟别为对照组中β-actin和survivin的域值循环数;CT(A1)和CT(S1)分钟别为给药组中β-actin和survivin的域值循环数。
结果显示(见表3和图6),SurKex 1浓度从0.1μM升至5.0μM,相应survivin mRNA的表达率从103.77%降至4.07%;而SurKex 2浓度从0.1μM升至5.0μM,相应survivin mRNA的表达率从104.97%降至8.40%,表明SurKex对人NSCLC细胞株NCI-H460中survivin mRNA具有明显的抑制作用,并且随着剂量的增大,抑制作用更趋明显。在 5.0μM浓度下,SurKex 1和SurKex 2几乎完全抑制了survivin mRNA的表达。
表3 SurKex对survivin mRNA的影响
实施例3:Surkex抑制NCI-H460中Survivin蛋白的表达
转染
将处于指数生长期的NCI-H460细胞在6孔板中以5105个/孔的浓度铺板。
Eppendorf管A中加入200μl Opti-MEM培养基和6μl GeneJammer转染试剂,Eppendorf管B中加入270μl Opti-MEM培养基和30μlSurKex的PBS溶液。转染时,每孔加入500μl A、B管混合液,以及500μl Opti-MEM培养基。37℃培养12小时后,再向每孔加入1ml含20%FBS的RPMI 1640培养基,37℃继续培养60小时。
SurKex转染浓度见表4,其余操作同实施例2。
蛋白抽提
移除24孔板中的培养基,用PBS洗涤三次,用细胞刮铲刮下贴壁细胞,转移到Eppendorf管中,1,000rpm离心5分钟,弃上清。加入1ml裂解液(10mM Tris-HCl pH 7.4,1% Triton-100,150mM氯化钠,5mM EDTA,1mM PMSF,1μg/ml亮抑酶肽,1μg/ml抑蛋白酶肽),冰浴放置30分钟,每隔5分钟振荡一次。2,000rpm离心3分钟后将上清液转移至新Eppendorf管,Lorry法测定蛋白浓度,并调整至3mg/ml。分装出一部分用于Actin检测。
免疫沉淀
取750μl调整浓度后的蛋白溶液,加入250μl鼠抗人SurvivinIgG2a,室温孵育1小时。吸取0.4ml固定化的Protein A至分钟离柱套管(Spin Cup Column and Microcentrifuge Tube)中,离心(4,000rpm1分钟),弃滤过液。加入0.4ml结合/洗涤Buffer,加盖后上下颠倒10次,离心(4,000rpm 1分钟),弃滤过液,重复2次。然后加入333μl蛋白抗体孵育液,室温放置10分钟,离心(4,000rpm 1分钟),弃滤过液,重复3次。再加入400μl结合/洗涤缓冲液,加盖后上下颠倒10次,离心(4,000rpm 1分钟),弃滤过液,重复3次。最后加入190μl洗脱缓冲液,加盖后上下颠倒10次,离心(4,000rpm 1分钟),收集滤过液用于Survivin检测。
电泳与电转印:用4%的浓缩胶和12%的分离胶进行蛋白电泳。取待测蛋白样品20μl,加入5μl 5上样缓冲液和3μl 1M DTT,煮沸5分钟,离心10秒。用于检测。Actin、Survivin的样品及蛋白Marker的上样体积分别为10μl、20μl和3μl。
将Bio-Ice冷却装置装满水后放置于-20℃,PVDF膜先在甲醇中浸泡1分钟后,同转印滤纸、纤维衬垫以及电泳后的凝胶一起在转移缓冲液中浸泡1h。在凝胶支架转印夹的阴极面上依次放上纤维衬垫、转印滤纸、凝胶、PVDF膜、转印滤纸、纤维衬垫,用玻棒轻轻地辗去气泡,合上阳极面,插入到电转印模块中。在转印槽内放入电转印模块和Bio-Ice冷却装置。开启磁力搅拌,在电转印缓冲液中恒定电压100V电转印50分钟。
封闭与抗体孵育:将转印后的PVDF膜用PBS振荡洗涤两次,每次5分钟。将PVDF膜放入封闭缓冲液(2%BSA的PBS溶液)中,室温振荡1小时后转移至溶有鼠抗人Actin IgG1或鼠抗人SurvivinIgG2a(一抗)的孵育缓冲液(1%BSA的PBS溶液)中,4℃振荡过夜。一抗浓度为0.8μg/ml。将一抗孵育后的PVDF膜用洗涤液(0.5%Tween的PBS溶液)振荡洗涤三次,每次10分钟,然后转移至溶有羊抗鼠IgG-HRP(二抗)的孵育缓冲液中,室温振荡1小时。二抗浓度为0.5μg/ml。将二抗孵育后的PVDF膜用洗涤液振荡洗涤三次,每次10分钟。
显色:将PVDF膜用0.1M醋酸缓冲液(pH 5.2)振荡洗涤两次,每次10分钟。取一片AEC(20mg)加入到5ml DMF中,避光溶解后取1ml,用醋酸缓冲液1∶15稀释后加入20μl 30%过氧化氢,混匀。放入PVDF膜,避光显色20分钟,观察结果:PBS、SurKex 1和SurKex2处理组样品的Actin蛋白含量几乎相同,表明样品中细胞总蛋白的含量几乎相同;而SurKex 1和SurKex 2处理组样品的Survivin蛋白含量同PBS处理组样品相比显著降低,表明SurKex对人NSCLC细胞株NCI-H460中Survivin蛋白具有明显的抑制作用,在5.0μM浓度下,SurKex 1和SurKex 2几乎完全抑制了Survivin蛋白的表达(图7)。
实施例4:Surkex抑制NCI-H460肺癌裸鼠模型肿瘤的生长
NCI-H460肺癌裸鼠模型
随机设计寡核苷酸序列(Random,ATGCT mCGGAA CCTTTmCGVAG GA)(Syngen,美国),该序列与Surkex同为22个碱基组成并含2个mC,原则上不与任何基因及其mRNA,特别是Survivin基因及其mRNA互补。
应用毛细管电泳进行核酸药物SurKex 1和Random的纯度检测:分离试剂盒为ssDNA 100-R,其中毛细管柱为27cm×75μm,有效分离柱长20cm。样品采用10KV,15s电动进样。25℃,10ky电泳分离30min,在254nm波长下检测。结果见(图8)。根据峰面积计算,SurKex1和Random全序列的纯度都>99%。纯度检测后,将106个NCI-H460细胞悬浮于0.2ml无菌PBS中,皮下注射至裸鼠右侧腋窝部位。肿瘤 细胞接种7天后,皮下肿瘤即可明显触知。挑选出70只荷瘤裸鼠,随机分成7组(每组N=10),计为第1天,实验开始。
给药以PBS作为空白对照,18mg/Kg的Random作为阴性对照,1.5mg/Kg的Cisplatin作为阳性对照,SurKex 1采用3个剂量,分别为2mg/Kg、6mg/Kg和18mg/Kg,并将6mg/Kg SurKex 1同1.5mg/KgCisplatin联合给药(表5)。
给药方式均为腹腔注射(IP),体积均为5ml/Kg,连续给药14天。
肿瘤与体重的测量
从实验开始到结束,采用双盲方法,每3天测量一次肿瘤大小(0.5长(mm)宽2(mm2)),同时称一次体重。在实验的第14天,外部测量计算得到的体积为770.1±110.4mm3。在给药结束的第二天(第15天),将裸鼠用CO2处死后,从体内取出肿瘤组织,称量得到的重量为1.004±0.134g(得到的重量全部超过0.4克,均值超过1.0克),肿瘤生长良好,于-70℃保存。
数据分析
合成药的疗效以瘤重抑制百分率表示,计算公式为:
瘤重抑制百分率%=(1-T/C)100%
其中:T为用药组瘤重、C为对照组瘤重。合成药抑制率大于40%,并经统计学处理有显著差异,是药物有效的必要条件。
两药相互作用指数(coefficient of drug interaction,CDI)的计算公 式为:
CDI=AB/(A×B)
其中,AB为两药联用组与对照组瘤重的比值,A和B分别为各药物单独使用组与对照组瘤重的比值。当CDI<1时表明两药有协同作用,当CDI<0.7时表明协同作用非常显著。
动物体重变化可用于显示药物毒性,给药组动物去瘤后的平均体重下降自身对照超过15%,表示药物的毒性反应。
药物对裸鼠模型肿瘤体积的影响见图9。
药物对裸鼠模型肿瘤重量的影响见图10。
药物对裸鼠模型肿瘤体重的影响见图11。
实验结果表明:
同第一组(PBS组)相比,第二组(Random即随机寡核苷酸组)的肿瘤体积增长曲线略低于PBS组,肿瘤重量也略小,但瘤重抑制率为30.6%,且无统计学差异,认为无效。
第三组(Cisplatin组)对NCI-H460肺癌裸鼠模型肿瘤体积的增长以及实验结束时的肿瘤重量具有明显的抑制作用(P<0.05),且瘤重抑制率为82.6%。认为有效。
同第二组(Random组)相比,第四组(2mg/kg Surkex组)、第五组(6mg/kg Surkex组)对肿瘤体积的增长及肿瘤重量同PBS组相比无统计学差异,瘤重抑制率分别为22.1%和27.4%,认为无效。
第六组(18mg/kg Surkex组)对NCI-H460肺癌裸鼠模型肿瘤体积的增长以及实验结束时的肿瘤重量具有明显的抑制作用(P<0.05),且瘤重抑制率为44.9%。
虽然第五组(6mg/kg Surkex组)的SurKex 1单用已经被证实是无效的,但6mg/kg的SurKex 1与1.5mg/kg的Cisplatin合用(即第七组)是有效的;而且同1.5mg/kg的Cisplatin单独使用组(第三组)相比,对NCI-H460肺癌裸鼠模型肿瘤体积的增长以及实验结束时的肿瘤重量具有明显的抑制作用(P<0.05),且对应于第一组(PBS组)和第二组(Random组)的瘤重抑制率为92.1%和88.5%。同时第七组中6mg/kg的SurKex 1与1.5mg/kg的Cisplatin的相互作用指数CDI为0.63,小于0.7,体现出非常显著的协同作用。
药物的毒性结果:第三组(Cisplatin组)裸鼠的平均体重(去瘤后)下降(自身对照)18.9%,超过15%,显示出化疗药物顺铂的毒性反应。
第六组(18mg/kg Surkex组)裸鼠体重同PBS组相比,虽然存在统计学差异,但其去瘤后的平均体重下降自身对照1.9%,小于15%,可以认为不具有毒性反应。相对于化疗药物,SurKex 1对动物体造成的伤害要小的多。
合用组裸鼠的体重同Cisplatin单独使用组(第三组)相比,虽然不存在统计学差异,但其平均体重(去瘤后)下降(自身对照)13.2%,小于15%,可以认为不具有毒性反应,显示出合用组对化疗药物顺铂的毒性具有一定的降低作用。
所以,18mg/Kg剂量的寡核苷酸药物SurKex 1在能显著抑制裸鼠NCI-H460肺癌模型中肿瘤的生长;6mg/Kg剂量的寡核苷酸药物SurKex 1与1.5mg/Kg剂量的化疗药物顺铂联用具有显著的协同作用,且降低了顺铂的毒性。
序列表
<110>深圳市清华源兴生物医药科技有限公司
<120>一种抗肿瘤药物
<160>2
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AmCGGGTCCCG mCGATTCAAAT CT 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CmCGACGGCAC CCATGCmCGCmC GC 22