CN1185347C - 用于改进体外核酸合成和扩增的提升热稳定dna聚合酶保真性的热稳定酶 - Google Patents

用于改进体外核酸合成和扩增的提升热稳定dna聚合酶保真性的热稳定酶 Download PDF

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Abstract

从嗜热古细菌闪烁古生球菌得到一种纯化的热稳定酶。该酶可以是天然或是重组的，在PCR条件下稳定，并且表现出双链特异性外切核酸酶活性。它是3’-5’外切核酸酶，切割产生5’单核苷酸。所述热稳定酶可用于许多重组DNA技术中，与一种热稳定DNA聚合酶如Tag结合尤其可用于通过聚合酶链式反应(PCR)进行核酸扩增。

Description

用于改进体外核酸合成和扩增的提升热稳定 DNA聚合酶保真性的热稳定酶
本发明涉及分子生物学领域，更具体地讲，涉及多核苷酸合成。本发明也涉及基本纯的热稳定外切核酸酶、在大肠杆菌中克隆和表达热稳定外切核酸酶III及其在扩增反应中的应用。本发明有利于在允许从遗留和合成的长产物中去杂质的条件下高保真性地扩增DNA。本发明可以用于许多工业、医学和法医目的。
使用DNA聚合酶加上或不加额外的多肽常规进行体外核酸合成。DNA聚合酶是一个参与DNA复制和修复的酶家族。已经在从中温微生物例如大肠杆菌中分离DNA聚合酶方面进行了广泛地研究。参见例如Bessman等(1957)J.Biol.Chem.223：171-177以及Buttin和Kornberg，(1996)J.Biol.Chem.241：5419-5427。
也已经在从嗜热菌例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离和纯化DNA聚合酶方面进行了研究。Chien，A.等，(1976)J.Bacteriol.127：1550-1557公开了从水生栖热菌YT1菌株中分离并纯化最适温度为80℃的DNA聚合酶。美国专利第4,889,818号公开了一种得自水生栖热菌的纯化的热稳定DNA聚合酶-Taq聚合酶，其分子量约为86,000-90,000道尔顿。另外，欧洲专利申请0 258 017公开了Taq聚合酶作为用于PCR方法中的优选酶。
研究已经表明，虽然Taq DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶依赖性外切核酸酶功能，但Taq DNA聚合酶不具有3’-5’外切核酸酶III功能(Lawyer，F.C.等，(1989)J.Biol.Chem.，264：6427-6437；Bernad A.等(1989)Cell 59：219)。DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性通常被称为“校正活性”。所述3’-5’外切核酸酶活性除去在引物-模板双链体3’端错配的碱基。存在3’-5’外切核酸酶活性可能是有利的，因为它导致核酸链复制的保真性提高并且延伸提前终止的产物。由于Taq DNA聚合酶不能除去错配的引物端，因此易出碱基掺入错误，使得在某些应用中其应用不合要求。例如，尝试克隆扩增的基因存在问题，因为所述基因的任何一个拷贝均可能含有一个由于随机错掺事件产生的错误。根据发生错误的循环(例如在早期复制循环中)，所扩增的整个DNA可能含有错误掺入的碱基，因此产生突变的基因产物。
在本领域中已知有几种表现出3’-5’外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶，如得自嗜热古细菌、用于高保真性DNA扩增的B型聚合酶。表现出3’-5’外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以分离或克隆自热球菌属(Pyrococcus)(纯化的热稳定激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，Mathur E.，Stratatgene，WO 92/09689，US 5,545,552；得自热球菌(Pyrococcus species)的纯化的热稳定DNA聚合酶，Comb D.G.等，New England Biolabs，Inc.，EP 0547 359；得自古细菌(archaeon)激烈热球菌的DNA聚合酶基因的组构和核苷酸序列，Uemori T.等(1993)Nucl.Acids Res.，21：259-265)、热网菌(Pyrodictium spec.)(热稳定核酸聚合酶，Gelfand D.H.，F.Hoffmann-La Roche AG，EP 0624 641；得自热网菌的纯化的热稳定核酸聚合酶和DNA编码序列，Gelfand D.H.，Hoffmann-La Roche Inc.，US 5,491,086)、热球菌属(Thermococcus)(例如得自热球菌的热稳定DNA聚合酶，TY，Niehaus F.等WO 97/35988；纯化的Thermococcus barossii DNA聚合酶，Luhm R.A.，Pharmacia Biotech，Inc.，WO 96/223 89；得自Thermococcus barossii、具有中等外切核酸酶活性并且在高温下有较好的长期稳定性、可用于DNA测序、PCR等的DNA聚合酶，Dhennezel O.B.，Pharmacia Biotech Inc.，WO 96/22389；得自Thermococcus litoralis、用于DNA操作的纯化的热稳定DNA聚合酶，Comb D.G.，New England Biolabs，Inc.，US 5,322,785，EP 0 455430；得自古细菌的重组热稳定DNA聚合酶，Comb D.G.，New EnglandBiolabs，Inc.，US 5,322,778，EP 0 547 920，EP 0 701 000；得自Thermococcus gorgonarius的新分离的热稳定DNA聚合酶，Angerer B.等Boehringer Mannheim GmbH，WO 98/14590。
在校正功能存在下提供PCR的另一种可能性是应用几种聚合酶的混合物，其中一种聚合酶表现出这样的校正活性(例如热稳定性增强和引物延伸长度和效力增强的热稳定DNA聚合酶，Barnes W.M.，US5,436,149，EP 0 693 078；新聚合酶组合物及其应用，Sorge J.A.，Stratagene，WO 95/16028)。通常的做法是应用热稳定DNA聚合酶制剂，其包含至少一种缺乏3’-5’外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶的大部分组分和表现出3’-5’外切核酸酶活性的小部分组分，例如Taq聚合酶和Pfu DNA聚合酶。在这些混合物中，加工性由pol I型酶如Taq聚合酶提供，而校正功能由热稳定B型聚合酶如Pfu提供。高保真性DNA合成是核酸扩增中的一个理想的参数，另一个重要的特征是去杂质的可能性。
聚合酶链式反应可以将一个分子扩增一万亿倍(billionfold)。因此，甚至微小量的污染物都可以被扩增，导致假阳性结果。这样的污染物通常是先前PCR扩增反应的产物(遗留污染物)。因此，研究人员已经开发出多种方法以避免这样的污染物。
所述方法依赖于在PCR扩增期间用dUTP取代TTP，以产生含尿嘧啶DNA(U-DNA)。在PCR扩增之前用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)处理随后的PCR反应混合物，所述污染性核酸被降解，而不适于扩增。dUTP可以容易地由pol I型热稳定聚合酶掺入，而不是由B型聚合酶掺入(G.Slupphaug等(1993)Anal.Biochem.211：164-169)。在通过PCR扩增重复分析同一类型模板时，B型聚合酶对dUTP的掺入低限制它们在实验室中的应用。
也从真细菌菌株如栖热袍菌属(Thermotoga)中分离出表现出3’-5’外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶(得自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的热稳定DNA聚合酶，Slater M.R.等Promega Corporation，WO 96/41014；得自那不勒斯栖热袍菌的克隆的DNA聚合酶及其突变体，Hughes A.J.等，Life Technologies，Inc.WO96/10640；得自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的纯化的热稳定核酸聚合酶，Gelfand D.H.等，GETUS Corporation，WO 92/03556)。这些酶具有强的能够去除错掺或错配碱基的3’-5’外切核酸酶活性。遗传工程形式的该酶以ULTma市售，这是一种可以不用额外的多肽而用于PCR过程的DNA聚合酶。该酶能够去除错掺碱基、掺入dUTP，但其保真性由于未知原因不高于Taq聚合酶的保真性(在聚合酶链式反应中的复制准确性。Diaz R.S.等Braz.J.Med.Biol.Res.(1998)31：1239-1242；Pfu DNA聚合酶和其它热稳定DNA聚合酶的PCR保真性，Cline J.等，Nucleic Acids Res.(1996)24：3546-3551)。
对于高保真性DNA合成，应用B型聚合酶或含其混合物的另一种替代方法是应用嗜热DNA聚合酶III全酶，这是一种18个多肽链的复合体。这些复合体与细菌染色体复制酶相同，包含合成数百个千碱基的DNA链或整个染色体所必需的所有因子。该酶的10个不同的亚基中某些亚基以多个拷贝存在，这10个不同的亚基可以通过重组技术产生，将其重新构建并且用于体外DNA合成中。作为这些复合体的可能用途，提出通过PCR扩增数千个千碱基对至数百个千碱基对的核酸。(得自嗜热生物、用作染色体复制酶的酶及其制备和应用，Yurieva O.等，The Rockfeller University，WO 98/45452；新型嗜热聚合酶III全酶，McHenry C.，ENZYCO Inc.，WO 99/13060)。
本发明的目标是开发优选同时能够掺入dUTP的高保真性PCR系统。按照本发明，提供表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的热稳定酶，而当将该酶加入表现出聚合酶活性的第二种酶中时，该酶增强扩增过程的保真性。所提供的酶可以切下错配引物端，使得在合成DNA的过程中表现出聚合酶活性的第二种酶例如Taq聚合酶能够重新组合并再进行延伸。本发明的酶能够作为校正酶与表现出聚合酶活性的第二种酶配合。发现适合于这一任务的酶是例如热稳定外切核酸酶III。最好使用从3’至5’方向作用、切割磷酸酯的5’、留下3’羟基并且理想的是仅对双链DNA作用的外切核酸酶III。DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性对双链和单链DNA均有活性。后一活性可能导致引物降解，这是在PCR测定中不希望有的。最好是，该酶于70-80℃有活性，足够稳定以经受住变性循环，并且在较低温度下无活性，以在PCR过程完成后使得PCR产物未被降解。表现出这些特征的酶可以来源于嗜热真细菌或得自嗜热古细菌(archaea)的相关酶。对三种热稳定古细菌的基因组进行测序，这三种古细菌是詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(产甲烷古细菌詹氏甲烷球菌的全基因组序列，Bult C.J.等，(1996)Science 273：1058-1072)、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(热自养甲烷杆菌ΔH的全基因组序列：功能分析和比较基因组，Smith D.R.等，J.of Bacteriology(1997)179：7135-7155)和闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(嗜高温硫酸盐还原古细菌闪烁古生球菌的全基因组序列，Klenk H.-P.等(1997)Nature 390：364-370)。
特别是，提供可得自闪烁古生球菌的热稳定酶，该酶在双链DNA中催化引物或多核苷酸的错配末端以3’-5’方向降解。克隆了编码可得自闪烁古生球菌(Afu)的热稳定外切核酸酶III的基因，将其在大肠杆菌中表达并进行分离。该酶在用于PCR反应中的温育和温度条件下有活性。在反应混合物中存在或不存在dUTP的情况下，该酶支持DNA聚合酶如Taq以低出错率进行DNA合成并且在基因组DNA上以良好的收率合成超过3kb的产物，3kb是由Taq聚合酶合成的产物的上限。优选每2.5U Taq聚合酶使用50-500ng可得自Afu的外切核酸酶III，以便得到最佳PCR性能。更优选在PCR反应中每2.5U Taq聚合酶使用67ng-380ng可得自Afu的外切核酸酶III。
因此，本发明的酶能够作为校正酶与Taq聚合酶配合。与其它酶相比应用本发明酶的优点是，本发明的酶优选对双链DNA有活性。本发明的热稳定酶可以用于必需或需要这种酶活性的任何目的。在一个特别优选的实施方案中，该酶结合热稳定DNA聚合酶一起用于称为PCR的核酸扩增反应中，以便去除导致提前终止的错配引物端，提供被所述聚合酶更有效地延伸的引物端，校正碱基掺入错误，并且使得所述聚合酶能够产生长PCR产物。
此外，本发明的主题是一种组合物，所述组合物包含一种第一种热稳定酶和一种第二种热稳定酶，所述第一种热稳定酶表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性，所述第二种热稳定酶表现出聚合酶活性，而与单独应用所述第二种热稳定酶相比，扩增过程的保真性由于应用该组合物而得到增强。本发明的表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的热稳定酶也包括表现出DNA聚合酶活性降低或根本无这种活性的合适的酶。按照本发明的DNA聚合酶活性降低是指低于表现出DNA聚合酶活性的酶的所述活性的50％。在一个优选实施方案中，本发明组合物中的第二种酶缺失校正活性。特别优选的是，所述第二种酶是Taq聚合酶。
本发明的另一个主题是一种DNA合成方法，该方法使用包含一种表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的第一种热稳定酶和一种表现出聚合酶活性的第二种酶的混合物。按照该方法，提前终止的链通过从3’至5’的降解作用而被修剪。按照该方法，或者引物或者生长中的链的错配端被去除。
本发明还包括一种按照上述描述的方法，但其中dUTP存在于所述反应混合物中，部分或全部取代TTP。最好是按照该方法，使用尿嘧啶糖基化酶(UDG或UNG)来降解污染性核酸。
最好是，按照该方法，以下酶的混合物
-第一种热稳定酶，表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性，和
-第二种酶，表现出聚合酶活性
产生出错率较低的PCR产物，其出错率低于在缺乏表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的所述第一种热稳定酶时由表现出聚合酶活性的所述第二种酶产生的PCR产物的出错率。在该方法中，表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的所述第一种热稳定酶和一种表现出聚合酶活性的第二种酶的混合物，产生的PCR产物的长度大于在缺乏表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的所述第一种热稳定酶时由表现出聚合酶活性的所述第二种酶产生的PCR产物的长度。此外，表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的所述第一种热稳定酶与大肠杆菌的外切核酸酶III相关，但按照该方法是热稳定的。上述方法的另一个实施方案是其中获得具有平端的PCR产物的方法。
本发明的主题也是获得表现出3’外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性的本发明热稳定酶的方法以及产生该酶的方法和材料例如载体和宿主细胞(例如DSM no.13021)。
提供以下实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。
优选实施方案的详细描述
附图简述
图1：
得自闪烁古生球菌的外切核酸酶III的DNA聚合酶的编码基因的DNA序列和推导的氨基酸序列。
图2：
如实施例V中描述的在大肠杆菌中表达的闪烁古生球菌的重组外切核酸酶III对热变性的抗性。
1道：于50℃温育
2道：于60℃温育
3道：于70℃温育
4道：于80℃温育
5道：于90℃温育
6道：未用Afu外切核酸酶III的编码基因转化的大肠杆菌宿主细胞提取物
7道：大肠杆菌的外切核酸酶III
8道：分子量标记
图3：
如实施例VI中描述的Afu外切核酸酶III对DNA片段的外切核酸酶活性。
1道：10单位大肠杆菌外切核酸酶III，于37℃温育
2道：50ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
3道：100ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
4道：150ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
5道：100ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
6道：200ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
7道：300ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
8道：250ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
9道：750ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
10道：1μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
11道：500ng Afu外切核酸酶III，于72℃温育
12道：1μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
13道：1.5μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
14道：1.5μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
15道：3μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
16道：4.5μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
17道：7.6μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
18道：15.2μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
19道：22.8μg Afu外切核酸酶III，于72℃温育
20道：不加入外切核酸酶
图4：
错配校正测定的原理。
图5：
如实施例VII中描述的在PCR中错配引物校正。
1道：DNA分子量标记V(ROCHE Molecular Biochemicals No.821705)
2道：G:A错配引物，用Taq DNA聚合酶扩增
3道：与2道相同，但随后用BsiEI切割
4道：G:A错配引物，用扩增HiFi PCR系统扩增
5道：与4道相同，但随后用BsiEI切割
6道：G:A错配引物，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III扩增
7道：与6道相同，但随后用BsiEI切割
8道：G:A错配引物，用Tgo DNA聚合酶扩增
9道：与8道相同，但随后用BsiEI切割
10道：G:T错配引物，用Taq DNA聚合酶扩增
11道：与10道相同，但随后用BsiEI切割
12道：G:T错配引物，用扩增HiFi PCR系统扩增
13道：与12道相同，但随后用BsiEI切割
14道：G:T错配引物，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III扩增
15道：与14道相同，但随后用BsiEI切割
16道：G:T错配引物，用Tgo DNA聚合酶扩增
17道：与16道相同，但随后用BsiEI切割
18道：DNA分子量标记V
19道：DNA分子量标记V
20道：G:C错配引物，用Taq DNA聚合酶扩增
21道：与20道相同，但随后用BsiEI切割
22道：G:C错配引物，用扩增HiFi PCR系统扩增
23道：与22道相同，但随后用BsiEI切割
24道：G:C错配引物，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III扩增
25道：与24道相同，但随后用BsiEI切割
26道：G:C错配引物，用Tgo DNA聚合酶扩增
27道：与26道相同，但随后用BsiEI切割
28道：CG:AT错配引物，Taq DNA聚合酶
29道：与28道相同，但随后用BsiEI切割
30道：CG:AT错配引物，扩增HiFi PCR系统
31道：与2道相同，但随后用BsiEI切割
32道：CG:AT错配引物，Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III
33道：与2道相同，但随后用BsiEI切割
34道：CG:AT错配引物，用Tgo DNA聚合酶扩增
35道：与2道相同，但随后用BsiEI切割
36道：DNA分子量标记V。
图6A：
在PCR中不同聚合酶的出错率
图6B：
如实施例VIII中描述，在PCR混合物中存在的Afu外切核酸酶III提高保真性。
将蓝色∶白色菌落之比作图，与Taq DNA聚合酶(Taq)、扩增HiFiPCR系统(HiFi)和Pwo DNA聚合酶(Pwo)相比，测试Taq DNA聚合酶和Afu外切核酸酶III的各种混合物(Taq/Exo 1∶30、Taq/Exo 1∶20、Taq/Exo 1∶15、Taq/Exo 1∶12.5、Taq/Exo 1∶10，分别相当于2.5单位Taq DNA聚合酶与125ng、175ng、250ng、375ng和500ng Afu外切核酸酶III混合)。
图7：
如实施例IX中所述，由Taq DNA聚合酶/Afu外切核酸酶III混合物掺入dUTP。
1道：DNA分子量标记XIV(Roche Molecular Biochemicals No.1721933)
2道：用2.5单位Taq DNA聚合酶扩增
3道：用2.5单位Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III扩增
4道：用2.5单位Taq DNA聚合酶和250ng Afu外切核酸酶III扩增
5道：用2.5单位Taq DNA聚合酶和375ng Afu外切核酸酶III扩增
6道：用2.5单位Taq DNA聚合酶和500ng Afu外切核酸酶III扩增
图8：
如实施例IX所述，由尿嘧啶-DNA糖基化酶降解含dUTP的PCR产物。
1道：DNA分子量标记XIV(Roche Molecular Biochemicals No.1721933)
2道：1μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
3道：2μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
4道：3μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
5道：4μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
6道：5μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
7道：5μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
8道：5μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及随后的UNG和热处理获得的扩增产物。
9道：DNA分子量标记XIV(Roche Molecular Biochemicals No.1721933)
图9：
Afu外切核酸酶III对PCR产物长度的影响。如实施例X中所述，利用人基因组DNA分析Taq DNA聚合酶/Afu外切核酸酶III混合物。
1道：9.3kb tPA片段，使用Taq/Exo III混合物
2道：        ”         Taq/Pol.
3道：12 kb tPA片段，使用Taq/Exo III混合物
4道：        ”         Taq-Pol.
3道：15 kb tPA片段，使用Taq/Exo III混合物
4道：        ”         Taq-Pol.
图10：
如实施例XI中所述，可以用聚合酶活性降低但3’外切核酸酶活性提高的聚合酶突变体取代热稳定外切核酸酶III。
1道：分子量标记
2道：反应1，Taq聚合酶，4.8kb片段
3道：反应2，Taq聚合酶加上Tag聚合酶突变体，4.8kb片段
4道：反应3，无Taq聚合酶，Tag聚合酶突变体，4.8kb片段
5道：反应4，Taq聚合酶加上Afu ExoIII，4.8kb片段
6道：反应5，Taq聚合酶，9.3kb片段
7道：反应6，Taq聚合酶加上Tag聚合酶突变体，9.3kb片段
8道：反应7，无Taq聚合酶，Tag聚合酶突变体，9.3kb片段
9道：反应8，Taq聚合酶加上Afu ExoIII，9.3 kb片段
10道：分子量标记
图11：
如实施例XII中所述，Afu外切核酸酶III对线性单链DNA无活性
1道：Afu Exo III，不温育
2道：Afu Exo III，于65℃1小时
3道：Afu Exo III，于65℃2小时
4道：Afu Exo III，于65℃3小时
5道：Afu Exo III，于65℃4小时
6道：Afu Exo III，于65℃5小时
7道：无酶的反应缓冲液，不温育
8道：无酶的反应缓冲液，于65℃5小时
9道：分子量标记
图12：
如实施例XIII中所述，Afu外切核酸酶III与热稳定B型聚合酶在引物降解活性方面的比较。
1道：分子量标记
2道：1u Tgo，预温育(反应1)
3道：1.5u Tgo，预温育(反应2)
4道：1u Tgo，无预温育(反应3)
5道：1.5u Tgo，无预温育(反应4)
6道：1u Tgo，在缺乏dNTP的情况下预温育(反应5)
7道：1.5u Tgo，在缺乏dNTP的情况下预温育(反应6)
8道：1u Tgo，在缺乏dNTP的情况下无预温育(反应7)
9道：1.5u Tgo，在缺乏dNTP的情况下无预温育(反应8)
10道：1u Tgo，在缺乏dNTP的情况下预温育，补充额外的引物(反应9)
11道：1.5u Tgo，在缺乏dNTP的情况下预温育，补充额外的引物(反应10)
12道：Taq聚合酶，预温育(反应11)
13道：Taq加上37.5ng Afu Exo III，预温育(反应12)
14道：Taq加上75ng Afu Exo III，预温育(反应13)
15道：Taq聚合酶，无预温育(反应14)
16道：Taq加上37.5ng Afu Exo III，无预温育(反应15)
17道：Taq加上75ng Afu Exo III，无预温育(反应16)
18道：分子量标记
实施例I
编码序列的分离
此中优选的热稳定酶是可得自闪烁古生球菌VC-16菌株(DSM No.4304)的热稳定非常高的外切脱氧核糖核酸酶。该菌株分离自意大利Vulcano island and Stufe di Nerone，Naples的海洋温湿系统(Stetter，K.O.等，Science(1987)236：822-824)。该生物是极强的嗜热、硫代谢古细菌，生长范围在60℃和95℃之间，最适温度为83℃。(Klenk，H.P.等，Nature(1997)390：364-370)。所述基因组序列保存在TIGR数据库中。推定编码外切核酸酶III的基因(xthA)的登录号为AF0580。当与已知分子量的蛋白标准相比时(SDS-PAGE)，可得自闪烁古生球菌的外切脱氧核糖核酸酶的表观分子量约为32,000道尔顿。本发明的热稳定酶的真正分子量可以由闪烁古生球菌外切脱氧核糖核酸酶III基因的编码序列来确定。
实施例II
得自闪烁古生球菌的外切核酸酶III编码基因的克隆
用约6ml DSM No.4304的细胞培养物，从闪烁古生球菌中分离染色体DNA。
设计以下引物，所述引物具有与所需表达载体多克隆位点匹配的限制位点，并且与闪烁古生球菌外切核酸酶III基因的N末端和C末端互补：
SEQ ID NO.：1  5‘-GAA ACG AGG ATC CAT GCT CAA AAT CGC CAC C-3′N末端(BamHI位点)：
SEQ ID NO.：2  5‘-TTG TTC ACT GCA GCT ACA CGT CAA ACA CAG C-3′C末端(PstI位点)：
首先通过在一个2ml eppendorf管中以5,000rpm重复离心，收集所述细胞。可以采用用于从细菌细胞进行分离的任一描述的方法进行DNA分离。在这种情况下，用High PureTM PCR模板制备试剂盒(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1796828)制备闪烁古生球菌基因组DNA。用这种方法，获得浓度为72ng/μl的约6μg染色体DNA。
在4个相同的制备中，用上述引物，在ExpandTM高保真性PCR系统(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1732641)和每管100ng闪烁古生球菌基因组DNA中进行PCR。采用以下条件进行PCR：
1 ×94℃，2分钟；
10×94℃10秒；54℃30秒；68℃30秒；
20×94℃10秒；54℃30秒；68℃3分钟，每个循环加
    上20秒的循环延伸；
1×68℃7分钟；
在加入MgCl2至终浓度为10mM后，用BamHI和PstI各10单位于37℃酶切PCR产物2小时。在低熔点琼脂糖凝胶上分离反应产物。在电泳后，切下合适的条带，将凝胶条合并、熔化，通过琼脂糖酶消化分离所述DNA片段，并用EtOH沉淀。将干燥的沉淀在30μl水中稀释。
用所述插入片段所用的相同的限制性酶消化合适的表达载体，在这里是pDS56 T，并用相同的方法进行提纯(clean)。
用快速DNA连接试剂盒(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1635379)连接插入片段和载体后，将质粒转化到表达宿主大肠杆菌392pUBS520(Brinkmann，U.等(1989)Gene 85：109-114)中。
用High PureTM质粒分离试剂盒(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1754777)分离转化子的质粒DNA，并通过用BamHI和PstI进行限制消化以及琼脂糖凝胶电泳进行表征。
阳性大肠杆菌pUBS520 ExoIII转化子在甘油培养物中贮存于-70℃。通过DNA测序确证外切核酸酶III的编码基因的序列。该序列示于图1中。
来自闪烁古生球菌或其它嗜热生物的外切核酸酶III的克隆和表达也可以用本领域技术人员常规使用的其它技术来进行(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold SpringHarbour Lab.，1989)。
实施例III
重组Afu外切核酸酶III的表达
在发酵罐中，在含有合适抗生素的丰富培养基中培养得自实施例I的转化子。在光密度为[A540]5.5时通过离心收获细胞，并且将其冷冻直至需要时，或通过用溶菌酶处理进行裂解，以产生含有闪烁古生球菌外切核酸酶III活性的粗制细胞提取物。
采用实施例IV中描述的方法，或采用其它纯化技术，例如亲和色谱、离子交换色谱或疏水相互作用色谱，纯化含有闪烁古生球菌外切核酸酶III活性的粗提取物。
实施例IV
重组Afu外切核酸酶III的纯化
在101发酵罐中，在含有胰胨(20g/l)、酵母提取物(10g/l)、NaCl(5g/l)和氨苄青霉素(100mg/l)的培养基中，于37℃培养得自实施例I的大肠杆菌pUBS520 ExoIII(DSM No.13021)，在指数生长中期用IPTG(0.3mM)诱导，并再温育4小时。通过离心收获约45g细胞，将其贮存于-70℃。将2g细胞解冻，悬浮于4ml缓冲液A(40mM Tris/HCl，pH 7.5；0.1mM EDTA；7mM 2-巯基乙醇；1mM Pefabloc SC)中。在搅拌下，通过加入1.2mg溶菌酶于4℃达30分钟，并且加入4.56mg脱氧胆酸钠于室温下达10分钟，然后于0℃20分钟，裂解所述细胞。将粗提取物调至750mM KCl，于72℃加热15分钟，并且离心去除变性蛋白。
高至90℃的加热温度也是可能的，在该温度下不破坏(变性)闪烁古生球菌外切核酸酶III。将上清液对调至10mM MgCl2的缓冲液B(含有10％甘油的缓冲液A)透析，然后加样于大小为1×7cm并且床体积为5.5ml、用缓冲液B平衡的Blue Trisacryl M柱(SERVA，No.67031)。用16.5ml缓冲液B洗涤该柱，用82ml缓冲液B中0-3M NaCl的线性梯度洗脱所述外切核酸酶蛋白。通过在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上电泳，分析所述柱流分(fraction)的闪烁古生球菌外切核酸酶蛋白。将16.5ml活性流分合并、用Aquacide II(Calbiochem No.17851)浓缩，并且对贮存缓冲液C(10mM Tris/HCl，pH7.9；10mM 2-巯基乙醇；0.1mM EDTA；50mM Kcl；50％甘油)透析。透析后，加入Thesit和NonidetP40至终浓度均为0.5％。将该制备物贮存于-20℃。
通过SDS凝胶电泳估计，所获得的闪烁古生球菌外切核酸酶III的纯度为95％。收率为每2.3g细胞量(cellmass)(湿重)50mg蛋白。
实施例V
得自闪烁古生球菌的重组外切核酸酶III的热稳定性
通过分析对热变性的抗性，测定如实施例II中所述克隆的闪烁古生球菌的外切核酸酶III的热稳定性。如实施例IV中所述裂解后，将100μl所述粗提取物在Eppendorf离心机中以15,000rpm离心10分钟。将上清液等份分装到5个新Eppendorf管中。将所述管于5个不同的温度50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下温育10分钟。在如上所述离心后，通过在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上电泳，分析等份的上清液。如图2中所示，于90℃温育后闪烁古生球菌外切核酸酶III蛋白的量与在较低温度下处理的样品一样。没有可测量的由于热变性引起的明显损失。根据这一结果，可以推断于90℃下半寿期超过10分钟。
实施例VI
Afu外切核酸酶III的活性
外切核酸酶III催化从双链体DNA的3’-羟基末端逐步去除单核苷酸(Rogers G.S.和Weiss B.(1990)Methods Enzymol.65：201-211)。在每个结合事件期间去除数目有限的核苷酸。优选的底物是3’平端或3’凹端。该酶对单链DNA无活性，3’突出端对酶切的抗性较强。DNA分子量标记VI(ROCHE Molecular Biochemicals，No.1062590)由BglI消化的pBR328与HinfI消化的pBR328混合而组成。所述HinfI消化产物具有3’凹端，预期是外切核酸酶III降解的优选底物，所述BglI酶切产物具有突出3个碱基的3’突出端，应该对外切核酸酶III酶切的抗性较强。
将得自实施例IV的闪烁古生球菌外切核酸酶III的连续稀释液与0.5μg DNA分子量标记VI(ROCHE Molecular Biochemicals，No.1062590)在25μl以下温育缓冲液：10mM Tris/HCl，pH 8.0；5mMMgCl2；1mM 2-巯基乙醇；100mM NaCl中，覆盖石蜡于72℃温育2小时。包括10单位大肠杆菌外切核酸酶III(ROCHE MolecularBiochemicals，No.779709)作为对照。对照反应于37℃下进行。在加入5μl终止溶液(0.2％琼脂糖，60mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.8，10％甘油，0.01％溴酚蓝)后，在1％琼脂糖凝胶上分离混合物。结果示于图3。Afu外切核酸酶III辨别出两种不同类型的底物。优选的底物是具有3’凹端的片段(例如1766bp片段)，3’突出端(例如2176bp、1230bp、1033bp片段)对降解更具抗性。对于较高分子量的蛋白，所述底物的降解程度与分析大肠杆菌外切核酸酶III的产物的1道相似。使用增加量的Afu外切核酸酶蛋白，仅留下少量DNA底物(15-19道)，剩余片段的再降解可能是由作为所述制备物的杂质的DNA结合蛋白引起的。
实施例VII
在具有Afu外切核酸酶III的PCR中错配引物的校正
用3’末端错配引物测试在PCR期间Afu外切核酸酶III/Taq聚合酶混合物的修复效率，该测定的原理示于图4。对于PCR扩增，使用其中正向引物在3’端具有一个或两个不能与模板DNA配对的核苷酸的引物组。切除错配的引物端并且扩增修复的引物，产生随后可以用限制性内切核酸酶BsiEI切割的产物，而由错配引物产生的产物抗切割。
所用的引物是：
1.反向：                5‘-GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3‘
                        (SEQ ID NO.：3)
2.正向1(g:a错配)：      5‘-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCA-3‘
                        (SEQ ID NO.：4)
3.正向2(g:t错配)：      5‘-TGG ATA CGT CTG AACTGG TCA CGG TCT-3‘
                        (SEQ ID NO.：5)
4.正向3(g:c错配)：      5‘-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCC-3‘
                        (SEQ ID NO.：6)
5.正向4(2个碱基错配)：  5‘-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TAT-3‘
                        (SEQ ID NO.：7)
用2.5单位Taq DNA聚合酶(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1435094)、0.25μg得自实施例IV的闪烁古生球菌外切核酸酶III、10ng噬菌体λ的DNA、0.4μM每种引物、200μM dNTP、1.5mMMgCl2、50mM Tris-HCl，pH 9.2、16mM(NH4)2SO4进行PCR。在50μl PCR体积中用以下条件进行PCR：
1 ×94℃2分钟；
40×94℃10秒；60℃30秒；72℃1分钟；
1 ×72℃7分钟。
将所述外切核酸酶/Taq聚合酶混合物的功能与2.5单位Taq DNA聚合酶、0.3单位Tgo DNA聚合酶(ROCHE Diagnostics GmbH)的两个对照以及与0.75μl ExpandTM高保真性PCR系统(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1732614)进行比较。正如用BsiEI成功消化所述PCR产物所表明的，闪烁古生球菌外切核酸酶III表现出对所有所述错配的校正活性，校正效率为90-100％(图5)。正如所预期的，Taq DNA聚合酶没有表现出校正活性，而具有3’-5’外切核酸酶活性的Tgo DNA聚合酶也完全进行了校正。ExpandTM高保真性PCR系统仅表现出对所述两个碱基的错配有100％校正活性。对其它错配以大约50％的效率修复。
实施例VIII
在PCR过程中Afu外切核酸酶III/Taq DNA聚合酶混合物的保真性
在一个基于含有一个功能lac Iq等位基因的pUC19衍生物pUCIQ17(Frey，B.和Suppmann B.(1995)Biochemica 2：34-35)的扩增、环化和转化的测定中，测定在PCR过程中Afu外切核酸酶III/Taq DNA聚合酶混合物的保真性。在lac I中的PCR衍生的突变导致lac Zα表达的去阻抑，并且随后形成可以在X-Gal指示平板上容易检测到的功能性β-半乳糖苷酶。与作为对照的Taq DNA聚合酶和Expand HiFi PCR系统(Roche Molecular Biochemicals)和Pwo DNA聚合酶(RocheMolecular Biochemicals)相比，测定用这种基于lac I的PCR保真性测定测量的Taq聚合酶/Afu外切核酸酶混合物的出错率。
通过用DraII消化将质粒pUCIQ17线性化，以用作以所测试的酶进行PCR扩增的底物。
所用的两种引物在其5引物端具有ClaI位点：
SEQ ID NO.：8
引物1：5′-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3′
SEQ ID NO.：9
引物2：5′-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3′
所产生的PCR产物的长度是3493bp。
在50μl终体积中，在1.5mM MgCl2、50mM Tris-HCl，pH8.5(25℃)、12.5mM(NH4)2SO4、35 mM KCl、200μM dNTP和2.5单位Taq聚合酶和分别为125ng、175ng、250ng、375ng和500ng的Afu外切核酸酶III存在下，进行PCR。
循环条件如下：
1× 将模板于95℃变性2分钟
Figure C0080305800241
Figure C0080305800242
在PCR后，将PCR产物进行PEG沉淀(Bames，W.M.(1992)Gene112：229)，用ClaI将所述DNA限制性消化，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。用快速DNA连接试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)连接所述分离的DNA，并且将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，接种到TN Amp X-Gal平板上。用所产生的质粒pUSIQ17(3632 bp)转化的α互补大肠杆菌菌株DH5α在含有氨苄青霉素(100μg/ml)和X-Gal(0.004％w/v)的TN平板(1.5％细菌培养用胰胨、1％NaCl、1.5％琼脂)上显示出白色(lacI+)菌落。突变产生蓝色菌落。
于37℃过夜温育后，对蓝色菌落和白色菌落计数。用Keohavong和Thilly(Keohavong，P.和Thilly，W.(1989)PNAS USA 86：9253)公布的重排公式计算每bp的出错率(f)：
f＝-lnF/d×b bp
其中F是白色菌落的分数：
F＝白色(lacI+)菌落/菌落总数；
d是DNA复制次数(the number of duplications)：
2d＝输出DNA/输入DNA；
而b是(1080bp)lac I基因的有效靶大小，按照Provost等(Provost等(1993)Mut.Res.288：133)，它为349bp。
示于图6A和图6B的结果证明，在反应混合物中存在热稳定外切核酸酶III导致出错率低。随着聚合酶与外切核酸酶之比的变化，所述出错率逐渐降低。用最适Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III混合物达到的保真度(4,44×10-6)在与Taq/Pwo混合物(Expand HiFi；2,06×10-6)相似的范围内。对最适缓冲液条件的评估将进一步提高保真度。必须优化聚合酶与外切核酸酶之间的比率。外切核酸酶的量大降低产物的收率，明显降低扩增效率(Taq/Exo 1∶10相当于2.5单位Taq聚合酶和500ng Afu外切核酸酶III)。
用本领域的常规技术，例如通过改变缓冲液组分、优化各个组分的浓度或改变循环条件，可以进一步优化该系统的保真性。
实施例IX
在PCR期间在Afu外切核酸酶III存在下dUTP的掺入
用dUTP完全取代TTP，测试Afu外切核酸酶/Taq聚合酶混合物的DNA合成。用2.5单位Taq DNA聚合酶，在0.125μg、0.25μg、0.375μg和0.5μg得自实施例IV的闪烁古生球菌外切核酸酶III存在下，用β-球蛋白基因作为靶，在PCR中根据作为模板的天然人基因组DNA确定或者TTP或者dUTP掺入的比较。使用以下引物：
正向：   5‘-TGG TTG AAT TCA TAT ATC TTA GAG GGA GGG C-3‘
         (SEQ ID NO.：10)
反向：   5‘-TGT GTC TGC AGA AAA CAT CAA GGG TCC CAT A-3‘
         (SEQ ID NO.：11)
在50μl体积中用以下循环条件进行PCR：
1 ×94℃2分钟；
40×94℃10秒；60℃30秒；72℃1分钟；
1 ×72℃7分钟。
在琼脂糖凝胶上分离等份的PCR反应物。如图7所示，用该模板/引物系统，用至多375ng Afu外切核酸酶III，在dUTP存在下DNA合成是可能的。可以通过用尿嘧啶-DNA糖基化酶(TOCHE DiagnosticsGmbH，No.1775367)于室温下处理等份的PCR反应产物30分钟，随后于95℃温育5分钟，以于无嘌呤位点切割多核苷酸，导致所述片段的完全降解，进一步证实dUTP掺入。对反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析示于图8中。
实施例X
Afu外切核酸酶III对PCR产物长度的影响
Taq聚合酶能够在基因组模板上合成长度至多为3kb的PCR产物。为了估计Taq聚合酶/Afu外切核酸酶混合物合成较长产物的能力，在作为模板的人基因组DNA上，用设计用于扩增长度为9.3kb、12kb和15kb的产物的3对引物，分析所述酶混合物。所用的缓冲液系统得自Expand长模板PCR系统(Roche Molecular Biochemicals Cat.No 1 681834)。在50μl体积中，用250ng人基因组DNA、220ng每种引物、350μM dNTPs和2.5单位Taq聚合酶和62.5ng Afu外切核酸酶，使用表1中概述的条件，进行反应：
表1：
  产物长度   引物  Expand长模板缓冲液编号：        PCR程序
  9.3kb   正向7反向14     1 1× 于94℃变性2分钟
10×于94℃变性10秒于65℃退火30秒于68℃延伸8分钟
20×于94℃变性10秒于65℃退火30秒于68℃延伸8分钟，每个循环加上20秒循环延伸
1× 于68℃延伸7分钟。
  12kb   正向1反向3     2 1× 于94℃变性2分钟
10×于94℃变性10秒于62℃退火30秒于68℃延伸12分钟
20×于94℃变性10秒于62℃退火30秒于68℃延伸12分钟，每个循环加上20秒循环延伸
1× 于68℃延伸7分钟。
  15kb   正向1反向2     3     与12kb相同
所用的tPA基因扩增的特异性引物是：
引物7a正向： 5′-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3′
             (SEQ ID NO.：12)
引物14a正向：5′-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C-3′
             (SEQ ID NO.：13)
引物1 正向： 5′-CCT TCA CTG TCT GCC TAA CTC CTT CGT GTG TCC C-3′
             (SEQ ID NO.：14)
引物2 反向： 5′-ACT GTG CTT CCT GAC CCA TGG CAG AAG CGC CTT C-3′
             (SEQ ID NO.：15)
引物3 反向： 5′-CCT TCT AGA GTC AAC TCT AGA TGT GGA CTT AGA G-3′
             (SEQ ID NO.：16)
如图9中所示，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶混合物可能合成长度至少为15kb的产物。
实施例XI
可以用聚合酶活性降低但3’外切核酸酶活性增加的聚合酶突变体取代热稳定外切核酸酶III
在Niehaus F.，Frey B.和Antranikian G.在WO97/35988或Gene(1997)204(1-2)，153-8中描述的得自Thermococcuss aggregans的DNA聚合酶(Tag)中于位置385有一个氨基酸交换，其中酪氨酸被天冬酰胺取代(Boehlke等，已送交待公布，和欧洲专利申请00105 155.6)，该聚合酶仅表现出6.4％的野生型DNA聚合酶的聚合酶活性，但表现出205％的野生型DNA聚合酶的外切核酸酶活性。用该酶证明，本发明不限于外切核酸酶III型酶，还包括其它类型的负责3’外切核酸酶活性的酶。
在50μl体积中，用200ng人基因组DNA、200μM dNTP、220ng每种引物以及对于反应1-4使用包含Mg++的Expand HiFi缓冲液，而对于反应5-8使用Expand长模板缓冲液1，进行反应(图10)。为了扩增4.8kb的tPA基因片段，在反应1-4中使用引物tPA 7a正向(5’-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3’，SEQID NO.：12)和tPA 10a反向(5’-GAT GCG AAA CTG AGG CTG GCTGTA CTG TCT C-3’，SEQ ID NO.：17)。为了扩增9.3kb的tPA基因片段，在反应5-8中使用引物tPA 7a正向和tPA 14a反向(5’-CAA AGTCAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C-3’，SEQ ID NO.：13)。向反应1、2、4、5、6和8中加入2.5单位Taq聚合酶，在用作阴性对照的反应3和7中不加Taq聚合酶。向反应2、3、6和7中加入11ng Tag聚合酶突变体，而向反应4和8中加入150ng Afu外切核酸酶III。
用于反应1-4的循环程序是：
1 ×94℃2分钟，
10×94℃10秒
    62℃30秒
    68℃4分钟
20×94℃10秒
    62℃30秒
    68℃4分钟，每个循环加上20秒循环延伸
1 ×68℃7分钟
    对于反应5-8：
1 ×94℃2分钟，
10×94℃10秒
    65℃30秒
    68℃8分钟
20×94℃10秒
    65℃30秒
    68℃8分钟，每个循环加上20秒循环延伸
1 ×68℃7分钟
在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上分析所述PCR产物(图10)。数据表明，Taq聚合酶能够扩增4.8kb片段，但收率低。Taq聚合酶和Tag聚合酶突变体或Afu Exo III的组合导致产物收率非常大的提高。Tag聚合酶突变体酶本身不能够合成该产物。
用9.3kb系统获得了相似的结果。单独用Taq聚合酶没有可检测到的产物。与Tag聚合酶突变体或Afu Exo III组合，以高收率获得了所预期的PCR产物。
这些结果表明，Taq聚合酶不能从基因组DNA扩增几个kb的DNA片段，这支持Barnes的假说(Barnes W.M.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：2216-2220)：PCR扩增的长度限制是由于在掺入错配碱基对的位置延伸效率低而引起的。在引物端去除错配的核苷酸后，Taq聚合酶能够再进行DNA合成。因此，在随后的循环中，作为全长产物的完整的核酸链可以用作引物结合的模板。
实施例XII
Afu Exo III对线性单链DNA无活性
在50μl体积中，用270ng Afu Exo III、5μg 49-mer寡核苷酸在具有MgCl2的Expand HiFi PCR缓冲液中进行反应，将反应物于65℃温育0、1、2、3、4和5小时。在加入10μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)后，将样品于37℃温育20分钟。在含有溴化乙锭的3.5％琼脂糖凝胶上分析反应产物。
结果描述于图11中。该图表明，在所有泳道中所述核酸的大小相同。在与Afu Exo III一起温育长达5小时后获得的产物(6道)的大小与对照(1、7和8道)相同。全长寡核苷酸的强度没有明显的降低，也不能观察到由降解产物所产生的成片条带。
实施例XIII
Afu Exo III与热稳定B型聚合酶在引物降解活性方面的比较
据报道热稳定B型聚合酶具有单链和双链核酸酶活性(Kong H.等(1993)Journal Biol.Chem.268：1965-1975)。无论引物分子是与模板杂交，还是单链分子，该活性都能够降解引物分子。在反应混合物中用一种热稳定外切核酸酶取代热稳定B型聚合酶可能在单链引物或所述反应混合物中存在的其它核酸的稳定性方面是有利的。
为了测试引物降解活性，将无模板DNA的反应混合物于72℃温育1小时，然后加入DNA，进行PCR。将所述结果与含作为热稳定B型聚合酶例子的Tgo聚合酶(Angerer B.等WO 98/14590)的反应物进行比较。作为对照，用相同混合物而不进行先前的温育。在表2中总结了所述结果。
表2：
  反应#  酶  在缺乏模板DNA的情况下预温育 在存在核苷酸的情况下预温育  在预温育后第二次加入引物
    1  Tgo     是     是
    2  Tgo     是     是
    3  Tgo     否
    4  Tgo     否
    5  Tgo     是     否
    6  Tgo     是     否
    7  Tgo     否
    8  Tgo     否
9 Tgo 是 否 是
    10  Tgo     是     否     是
    11  Taq     是     是
    12  Taq加上Afu Exo III     是     是
    13  Taq加上Afu Exo III     是     是
    14  Taq     否
    15  Taq加上Afu Exo III     否
    16  Taq加上Afu Exo III     否
作为扩增的靶，选择p53基因的一个片段，所用的引物是：p53I5’-GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3’(SEQ ID NO.：18)和p53II 5’-TGG AAA CTT TCC ACT TGA T-3’(SEQ ID NO.：19)。在50μl体积中进行PCR反应。反应1-10号含有200ng人基因组DNA、40pmole每种引物、10mM Tris-HCl，pH 8.5、17.5mM(NH4)2SO4、1.25mMMgCl2、0.5％Tween、2.5％DMSO、250μg/ml BSA和1单位(反应1、3、5、7和9号)或1.5单位(反应2、4、6、8和10号)Tgo聚合酶和200μM dNTP。反应11-16号含有2.5单位Taq聚合酶、含有Mg++的Expand HiFi缓冲液、40pmole每种引物、200μM dNTP、100ng人基因组DNA。反应12和15号含有37.5ng Afu Exo III，反应13和16号含有75ng Afu Exo III。
正如表2中所述，反应1、2、5、6和11-13在缺乏模板DNA的情况下于72℃温育1小时。在开始PCR之前加入模板DNA。反应5、6、9和10在缺乏核苷酸的情况下预温育，反应9和10在预温育步骤之后，补充额外的40pmol引物。因为Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性，在预温育后向反应11-13中加入所述酶。
PCR条件是：
1 ×94℃2分钟，
35×94℃10秒
    55℃30秒
    72℃4分钟
1 ×72℃10分钟
在琼脂糖凝胶上分析反应产物，并且用溴化乙锭染色(图12)。
当将Tgo聚合酶与所述引物在缺乏模板DNA的情况下温育(反应1、2、5和6)，并且与没有预温育的相应反应(3、4、7和8)进行比较时，观察到明显的差异。所述预温育导致PCR产物大大减少，明显影响至少一种基本组分，最可能是影响PCR引物。在预温育步骤之后额外加入40pmole PCR引物(反应9和10)产生强信号，其强度与没有预温育的对照反应相当。这表明，无论dNTP是否存在，热稳定B型聚合酶Tgo聚合酶在缺乏模板的情况下都降解PCR引物。
在反应12和13中，在加入模板DNA和Taq聚合酶之前所述引物与Afu外切核酸酶III一起预温育，反应12和13获得的PCR产物产生的条带与不使用预温育步骤的反应1 5和16获得的条带相似。根据相似的强条带强度，可以推断，很少或没有发生引物降解，并且单链寡核苷酸对于Afu外切核酸酶III而言是不良底物。根据PCR产物的强条带强度或增加的收率，可以推断，该酶增强扩增过程的保真性。
                        序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
<120>用于改进体外核酸合成和扩增的提升热稳定DNA聚合酶
     保真性的热稳定酶
<130>5304/OA/
<140>
<141>
<160>21
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
gaaacgagga tccatgctca aaatcgccac c                              31
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
ttgttcactg cagctacacg tcaaacacag c                             31
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
ggttatcgaa atcagccaca gcg                                 23
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
tggatacgtc tgaactggtc acggtca                             27
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
tggatacgtc tgaactggtc acggtct                             27
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
tggatacgtc tgaactggtc acggtcc                            27
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
tggatacgtc tgaactggtc acggtat                            27
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
agcttatcga tggcactttt cggggaaatg tgcg                    34
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
agcttatcga taagcggatg ccgggagcag acaagc                 36
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
tggttgaatt catatatctt agagggaggg c                      31
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
tgtgtctgca gaaaacatca agggtcccat a            31
<210>12
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
ggaagtacag ctcagagttc tgcagcaccc ctgc        34
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>13
caaagtcatg cggccatcgt tcagacacac c           31
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>14
ccttcactgt ctgcctaact ccttcgtgtg tccc        34
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>15
actgtgcttc ctgacccatg gcagaagcgc cttc                   34
<210>16
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>16
ccttctagag tcaactctag atgtggactt agag                   34
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>17
gatgcgaaac tgaggctggc tgtactgtct c                      31
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>18
gtcccaagca atggatgat                                    19
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>19
tggaaacttt ccacttgat                                    19
<210>20
<211>774
<212>DNA
<213>闪烁古生球菌(Archaeglobus fulgidus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(774)
<400>20
atg ctc aaa atc gcc acc ttc aac gta aac tcc atc agg agc aga ctg  48
Met Leu Lys Ile Ala Thr Phe Asn Val Asn Ser Ile Arg Ser Arg Leu
  1               5                  10                  15
cac atc gtg att ccg tgg ctg aag gag aac aag cct gac att cta tgc  96
His Ile Val Ile Pro Trp Leu Lys Glu Asn Lys Pro Asp Ile Leu Cys
             20                  25                  30
atg cag gag acg aag gtt gag aac agg aag ttt cct gag gcc gat ttt  144
Met Gln Glu Thr Lys Val Glu Asn Arg Lys Phe Pro Glu Ala Asp Phe
         35                  40                  45
cac cgc atc ggc tac cac gtc gtc ttc agc ggg agc aag gga agg aat  192
His Arg Ile Gly Tyr His Val Val Phe Ser Gly Ser Lys Gly Arg Asn
     50                  55                  60
gga gtg gcc ata gct tcc ctc gaa gag cct gag gat gtc agc ttc ggt  240
Gly Val Ala Ile Ala Ser Leu Glu Glu Pro Glu Asp Val Ser Phe Gly
 65                  70                  75                  80
ctc gat tca gag ccg aag gac gag gac agg ctg ata agg gca aag ata  288
Leu Asp Ser Glu Pro Lys Asp Glu Asp Arg Leu Ile Arg Ala Lys Ile
                 85                  90                  95
gct ggc ata gac gtg att aac acc tac gtt cct cag gga ttc aaa att  336
Ala Gly Ile Asp Val Ile Asn Thr Tyr Val Pro Gln Gly Phe Lys Ile
            100                 105                 110
gac agc gag aag tac cag tac aag ctc cag tgg ctt gag agg ctt tac  384
Asp Ser Glu Lys Tyr Gln Tyr Lys Leu Gln Trp Leu Glu Arg Leu Tyr
        115                 120                 125
cat tac ctt caa aaa acc gtt gac ttc aga agc ttt gct gtt tgg tgt  432
His Tyr Leu Gln Lys Thr Val Asp Phe Arg Ser Phe Ala Val Trp Cys
    130                 135                 140
gga gac atg aac gtt gct cct gag cca atc gac gtt cac tcc cca gac  480
Gly Asp Met Asn Val Ala Pro Glu Pro Ile Asp Val His Ser Pro Asp
145                 150                 155                 160
aag ctg aag aac cac gtc tgc ttc cac gag gat gcg aga agg gca tac  528
Lys Leu Lys Asn His Val Cys Phe His Glu Asp Ala Arg Arg Ala Tyr
                165                 170                 175
aaa aaa ata ctc gaa ctc ggc ttt gtt gac gtg ctg aga aaa ata cat  576
Lys Lys Ile Leu Glu Leu Gly Phe Val Asp Val Leu Arg Lys Ile His
            180                 185                 190
ccc aac gag aga att tac acc ttc tac gac tac agg gtt aag gga gcc  624
Pro Asn Glu Arg Ile Tyr Thr Phe Tyr Asp Tyr Arg Val Lys Gly Ala
        195                 200                 205
att gag cgg ggg ctg gga tgg agg gtt gat gcc atc ctc gcc acc cca  672
Ile Glu Arg Gly Leu Gly Trp Arg Val Asp Ala Ile Leu Ala Thr Pro
    210                 215                 220
ccc ctc gcc gaa aga tgc gtg gac tgc tac gca gac atc aaa ccg agg  720
Pro Leu Ala Glu Arg Cys Val Asp Cys Tyr Ala Asp Ile Lys Pro Arg
225                 230                 235                 240
ctg gca gaa aag cca tcc gac cac ctc cct ctc gtt gct gtg ttt gac  768
Leu Ala Glu Lys Pro Ser Asp His Leu Pro Leu Val Ala Val Phe Asp
                245                 250                 255
gtg tag                                                          774
Val
<210>21
<211>258
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌
<400>21
Met Leu Lys Ile Ala Thr Phe Asn Val Asn Ser Ile Arg Ser Arg Leu
  1               5                  10                  15
His Ile Val Ile Pro Trp Leu Lys Glu Asn Lys Pro Asp Ile Leu Cys
             20                  25                  30
Met Gln Glu Thr Lys Val Glu Asn Arg Lys Phe Pro Glu Ala Asp Phe
         35                  40                  45
His Arg Ile Gly Tyr His Val Val Phe Ser Gly Ser Lys Gly Arg Asn
     50                  55                  60
Gly Val Ala Ile Ala Ser Leu Glu Glu Pro Glu Asp Val Ser Phe Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Ser Glu Pro Lys Asp Glu Asp Arg Leu Ile Arg Ala Lys Ile
                 85                  90                  95
Ala Gly Ile Asp Val Ile Asn Thr Tyr Val Pro Gln Gly Phe Lys Ile
            100                  105                110
Asp Ser Glu Lys Tyr Gln Tyr Lys Leu Gln Trp Leu Glu Arg Leu Tyr
        115                 120                 125
His Tyr Leu Gln Lys Thr Val Asp Phe Arg Ser Phe Ala Val Trp Cys
    130                 135                 140
Gly Asp Met Asn Val Ala Pro Glu Pro Ile Asp Val His Ser Pro Asp
145                 150                 155                 160
Lys Leu Lys Asn His Val Cys Phe His Glu Asp Ala Arg Arg Ala Tyr
                165                 170                 175
Lys Lys Ile Leu Glu Leu Gly Phe Val Asp Val Leu Arg Lys Ile His
            180                 185                 190
Pro Asn Glu Arg Ile Tyr Thr Phe Tyr Asp Tyr Arg Val Lys Gly Ala
        195                 200                 205
Ile Glu Arg Gly Leu Gly Trp Arg Val Asp Ala Ile Leu Ala Thr Pro
    210                 215                 220
Pro Leu Ala Glu Arg Cys Val Asp Cys Tyr Ala Asp Ile Lys Pro Arg
225                 230                 235                 240
Leu Ala Glu Lys Pro Ser Asp His Leu Pro Leu Val Ala Val Phe Asp
                245                 250                 255
Val

Claims (5)

1.包含一种第一种热稳定酶和一种第二种酶的组合物，所述第一种热稳定酶表现出3′外切核酸酶活性、但基本上无DNA聚合酶活性可得自闪烁古生球菌(Archeoglobus fulgidus)，所述第二种酶表现出DNA聚合酶活性，而与应用单一的所述第二种酶相比，扩增过程的保真性由于应用所述组合物而得到增强。
2.按照权利要求1的组合物，而第二种酶缺失校正活性。
3.按照权利要求1的组合物，而所述第二种酶是Taq聚合酶。
4.一种使用按照权利要求1-3之任一的组合物制备或扩增DNA的方法，包括下列步骤：
将含有DNA模板、一套引物、dNTP和必需的盐和缓冲成分的混合物与所述的组合物混合；
于94-95℃变性模板约2分钟，然后进行至少10个循环的变性、退火和延伸；以及
分离制备的或扩增的DNA。
5.按照权利要求4的方法，其中表现出3′外切核酸酶活性的热稳定酶对线性单链DNA无延伸活性或仅有可忽略的延伸活性。
CNB008030588A 1999-09-28 2000-09-27 用于改进体外核酸合成和扩增的提升热稳定dna聚合酶保真性的热稳定酶 Expired - Lifetime CN1185347C (zh)

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