CN1154733C - 改进的热稳定dna聚合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了热稳定DNA聚合酶，其含有氨基酸序列Ser Gln Ile XaaLeu Arg Xaa(序列1)，其中该序列的第4位的“Xaa”是任意氨基酸残基，但不是谷氨酸残基(Glu)，优选为甘氨酸残基，该序列第7位的“Xaa”是一种缬氨酸残基(Val)或一种异亮氨酸(Ile)。本发明还提供了可编码所述聚合酶的核酸、含有上述核酸的载体和宿主细胞、以及用于DNA测序反应的组合物、包括上述聚合酶在内的试剂盒和测序方法。

Description

改进的热稳定DNA聚合酶
技术领域
本发明涉及热稳定DNA聚合酶，该酶已使掺入核苷三磷酸的效率增强。本发明提供了用于分离上述酶的方法和工具。本发明的酶可用于多种用途，尤其可用于核酸测序的用途。因而，本发明也提供了改进的用于核酸序列分析的方法。
背景技术
DNA测序一般涉及四组单链DNA片段的产生，该片段具有一个确定的末端和一个可变的末端。可变的末端通常终止于特殊的核苷酸碱基(或鸟嘌呤(G)，或腺嘌呤(A)，或胸腺嘧啶(T)，或胞嘧啶(C))。分别根据长度来分离这四组不同的片段。在一种这样的方法中，使用了高分辩聚丙烯酰胺凝胶。在这样的凝胶上，每一条带都与DNA序列中的一个特定的核苷酸相对应，因此能鉴定序列中的核苷酸位置。
通常使用的一种DNA测序方法是双脱氧或链终止测序法，该方法涉及DNA链的酶促合成(Sanger等，1977，“国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.)74：5463)。通常进行4种独立的合成，通过掺入一种合适的链终止核苷酸(如双脱氧核苷酸)，使每一种反应终止于一种特异的碱基(G，A，T或C)。由于每一泳道只与G，或A，或T，或C相对应，容易将反应产物译码。
在双脱氧链终止法中，使一个短的单链引物与一个单链模板退火。通过掺入脱氧核苷酸(dNTPs)使引物在3′端延伸，直至掺入双脱氧核苷酸(ddNTP)。掺入一个ddNTP时，延伸就于该碱基处终止。不过，为保证DNA复制的忠实性，DNA聚合酶强烈趋向于掺入其正常底物(即dNTPs)，而不趋向于被称作非常规核苷酸的核苷酸类似物。由于如ddNTPs一样，核糖核苷酸不是DNA聚合酶的正常体内底物，在合成DNA的情况下，认为rNTPs是非常规核苷酸。在细胞中，这一特征减少了将诸如脱氧次黄苷三磷酸(dITP)或rNTPs之类的不正常碱基掺入延伸中的DNA链。
通常应用的两种自动测序方法是染料引物和染料终止剂测序。这些方法适于和荧光标记部分一起使用。虽然也可用放射标记部分进行测序，但荧光法测序格外可取。简单地说，在染料引物测序中，把荧光标记引物连同未标记的ddNTP一起使用。该方法需进行4种合成反应，并且对于每一待测序的引物，需要在一块凝胶上有多达4个泳道(每一泳道对应于每一碱基特异性终止产物)。在引物延伸反应后，于DNA测序胶上电泳，对含有掺入了双脱氧核苷酸的终止产物的测序反应混合物作常规分析。电泳分离后，在凝胶的底部用激光器激活荧光标记产物，并用合适的检测器检测荧光。在自动进行的体系中，在电泳中反应混合物通过凝胶基质时，检测器扫描凝胶底部，来检测究竟使用了什么标记部分(Smith等，1986，“自然”(Nature)321：674-679)。在该方法的修改方法中，四种引物各用不同的荧光标记物标记。在四种独立的测序反应结束后，将反应混合物混合，并把该混合的反应混合物于单个泳道中进行凝胶分析，由此分别检测不同的荧光标记物(一种标记物和四种不同的碱基特异性终止产物中的一种相对应)。
或者，使用染料终止剂测序法。在该方法中，用DNA聚合酶来将dNTPs和荧光标记的ddNTPs掺入到DNA引物的正在延伸的末端上(Lee等，1992，“核酸研究”(Nucleic Acid Research)20：2471)。这一方法的优点在于勿须合成染料标记的引物。而且，染料终止剂反应更加方便，其中4种反应都可在同一试管中进行。对于修饰的热稳定DNA聚合酶已有描述，该酶对ddNTPs的识别排斥减少(参见欧州专利申请公开号EP-A-655,506和美国专利申请系列号08/448,223)。一种典型的修饰的热稳定性DNA聚合酶为来自栖热水生菌(T.aquaticus)的突变型DNA聚合酶，该酶在第667位置具有一个酪氨酸残基(而不是一个苯丙氨酸残基)，即该酶为所谓的F667Y突变型Taq DNA聚合酶。由Hoffmann-La Roche生产并由Perkin Elmer经销的AmpliTaqFS，使对目标进行高效的核酸测序所需的ddNTP的量减少了成百上千倍。AmpliTaqFS是来自栖热水生菌的突变型DNA聚合酶，该突变型具有F667Y突变，并且在第46位上另外有一个天冬氨酸残基(而不是甘氨酸残基；G46D突变)。
为了进行精确的和成本上有实效的核酸DNA序列分析，需要有热稳定DNA聚合酶，其使其他核酸合成方法成为可能。不需使用双脱氧核苷酸的荧光法会是合乎需要的。本发明满足了这些需要。
发明内容
本发明提供了依赖于模板的热稳定DNA聚合酶，该酶具有氨基酸序列基序SerGlnIleXaaLeuArgXaa(序列1)，因而该序列的第4位的“Xaa”是任何氨基酸残基，而不是谷氨酸残基(Glu)，并且该序列的第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)。如以氨基酸的单字母密码来表示的，这一序列基序可以表示为SQIXLRV/I，其中该系列的第4位的“X”是任何氨基酸残基，但不是谷氨酸残基。与以前已知的热稳定聚合酶相比，具有包含所述序列基序的氨基酸序列的热稳定DNA聚合酶(其中该序列基序的第4位的“X”不为谷氨酸残基)对掺入核糖核苷酸的识别排斥减少。在延伸的DNA链中，核糖核苷酸是非常规核苷酸。因此，在第一个方面，与在先鉴定的热稳定DNA合成酶相比，本发明的新酶把诸如核糖核苷酸之类的非常规碱基类似物掺入到正在延伸的DNA链中的效率高几个数量级。本发明还提供了编码这些酶的基因，也提供了重组表达载体和含有这些载体的宿主细胞。使用这样的转化缩主细胞，可产生大量的纯化的热稳定聚合酶。
利用本发明，鉴定了热稳定DNA聚合酶的氨基酸序列中的一个区域或序列基序，其在保持该聚合酶忠实地掺入脱氧核苷酸的能力同时，增加了能掺入核糖核苷酸的效率。这一区域的改变，如一个或多个氨基酸交换(如由位点特异性诱变所引起的)，产生了能在DNA模板上合成RNA或RNA/DNA嵌合或杂交链的热稳定聚合酶。
在另一方面，本发明提供了改进的用于测定靶核酸序列的方法和组合物，其中，排除了对链终止ddNTPs的需要。通过文中所提供的改进方法，核糖核苷酸(rNTPs)被掺入引物延伸产物中。由于该主题酶精确地并且高效地掺入rNTPs或dNTPs，测序反应可利用两种核苷酸的混合物。引物延伸反应以后，通过本领域已知的方法，即水解，可以在掺入的rNTPs处裂解新合成的寡核苷酸产物，从而产生一组适于分离和序列分析的片段，分离和序列分析是用诸如凝胶电泳之类的常规手段。这些方法使用本发明提供的新的热稳定聚合酶。因而，本发明在这一方面提供了热稳定DNA聚合酶，其特征在于：该聚合酶的关键基序为Ser Gln Ile Xaa LeuArg Xaa(序列1)，其中第4位的“Xaa”可以是任何氨基酸残基，但不是谷氨酸残基(Glu)，并且第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)。
在本发明的另一方面，本文中描述的改进的聚合酶为掺入核糖核苷酸或在2′位具有羟基或其他取代基的类似物提供了方法(比较起来，在常规脱氧核苷酸中的第2′位无羟基或其他取代基)。这些核苷酸可以进行不同地标记，这样为用于DNA测序用途的双脱氧核苷酸的常规使用提供了可选择的方法。
本发明的突变的热稳定聚合酶的特征是：与相应的野生型酶相比，其能更有效地掺入非常规的核苷酸，尤其是核糖核苷酸。在本发明的一个优选实施方案中，待掺入的非常规核苷酸可以是链终止碱基类似物，如2′-羟基-3′脱氧ATP(3′-脱氧腺苷三磷酸)(其为ATP的一种“核糖终止剂”类似物)，或是诸如rNTP之类的非链终止核苷酸。
在本发明的另一方面，提供了突变的热稳定聚合酶，其特征是：与相应的野生型酶相比，其能更有效地掺入非常规核苷酸，尤其是核糖核苷酸。因而，在这一方面，本发明提供了重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于：(a)在聚合酶的天然类型中，具有氨基酸序列Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa(序列2)，其中这一序列的第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)；(b)在重组酶中，该氨基酸序列被突变，突变优选在该序列的第4位，这样，第4位的谷氨酸残基成为另一个氨基酸残基，优选为甘氨酸残基；并且(c)与所述酶的天然类型相比，该重组酶对掺入核糖核苷酸和核糖核苷酸类似物的识别排斥减小。
在本发明的另一方面，本发明的聚合酶提供了一种简便的裂解扩增产物和引物延伸产物的方法，这些裂解产物可用于杂交方法和多种序列检测方法。
可将本发明的酶和编码它们的基因用来产生用于DNA测序反应的组合物，该组合物包含有常规核苷酸和至少一种核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物的混合酶。在本发明的一个优选实施方案中，这一非常规核苷酸是核糖核苷酸，并且该核糖核苷酸的浓度低于相应的脱氧核苷酸的浓度，即rNTP∶dNTP的比值为1∶1或更低。本发明的酶也适于以试剂盒形式商品化，该试剂盒也可以包括核酸测序反应所必需的任何以下辅助成份，如dNTPs、rNTPs、缓冲液和/或引物。
本发明提供了如附上的权利要求中所定义的新的和改进的修饰热稳定DNA聚合酶、组合物和试剂盒。与在先已知的聚合酶或相应的野生型聚合酶(由其衍生出这些新的聚合酶)相比，本发明的酶能更有效地掺入非常规的核苷三磷酸。还提供了编码这些修饰酶的DNA序列、用于表达这些酶的载体和用这些载体转化的细胞。本发明的酶使得能够应用新的DNA测序方法，该方法优于从现有技术所知的DNA测序方法。
为利于对本发明的理解，对一些术语定义如下。
在涉及到核酸碱基、核苷三磷酸或核苷酸时，“常规的”一词是指那些在所述多核苷酸中天然存在的核酸碱基、核苷三磷酸或核苷酸(即，对于DNA，这些分子是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。此外，在诸如测序之类的体外DNA合成反应中，常用c7dGTP和dITP来替代dGTP(虽然掺入效率较低)。总之，这些分子可以被称作脱氧核苷三磷酸(dNTPs)。
“表达系统”是指在可操作的连接中含有所需的编码序列和控制序列(使得用这些序列转化的宿主能产生所编码的蛋白)的DNA序列。为进行有效转化，该表达系统可以被包含在一个载体中，不过，有关的DNA也可能被整合到宿主染色体上。
“基因”一词是指含有产生可回收的具生物活性的多肽或前体所必需的控制和编码系列的DNA序列。该多肽可以由完全长度的基因序列或编码序列的任何一部分编码，只要能保持酶促活性就行。
“宿主细胞”一词是既指单细胞的原核生物体也指真核生物体，如细菌、酵母和放线菌，以及细胞培养中培养的高等植物或动物的单个细胞。
文中所用的“DNA测序反应混合物”是指含有DNA测序反应所必需的成份的混合物。因此，DNA测序反应混合物是适于用于测定靶核酸的核酸序列的DNA测序方法的，尽管该反应混合物最初可能是不完全的，这样测序反应的起始是由用户控制的。在这种方式中，一旦加入诸如该酶的最后成份以产生完全DNA测序反应混合物，就可以起始该反应。一种DNA测序反应物会典型地含有适于聚合反应活性的缓冲液、核苷三磷酸和至少一种非常规核苷酸。该反应混合物也可以含有适于通过聚合酶在靶上延伸的引物、聚合酶以及靶核酸。通常用诸如荧光标记物之类的可检测部分标记引物或其中的一种核苷酸。该反应物通常是含4种常规核苷酸和至少一种非常规核苷酸的混合物。在本发明的一个优选实施方案中，该聚合酶是一种热稳定DNA聚合酶，并且该非常规核苷酸是一种核糖核苷酸。
本文中所用的“寡核苷酸”一词被定义为一种分子，该分子含有2个或2个以上的脱氧核苷酸或核糖核苷酸，优选为3个以上，并且通常为10个以上。寡核苷酸的具体大小将取决于多种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。
可用任何适宜的方法来制备寡核苷酸，该方法包括克隆和限制酶切合适的序列以及用一种方法直接化学合成，这种方法如Narang等人的磷酸三酯法，1979，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)68：90-99；Brown等人的磷酸二酯法，1979，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)68：109-151；Beaucage等人的二乙基亚磷酰胺法，1981，“四面体通讯”(Tetrahedron Lett.)22：1859-1862；Matteucci等人的三酯法，1981，“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)103：3185-3191；自动合成法；或美国专利4,458,066的固体载体法。
文中所用的“引物”一词是指天然或合成的寡核苷酸，其在引物延伸反应起始的条件下放入时可以用作为合成的起始点。引物优选为单链寡脱氧核苷酸。引物的合适长度取决于预计的引物用途，但一般是15-35个核苷酸。短的引物分子通常需要较低的温度来和模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不必反映模板的确切序列，但必须是足够与模板互补，以便和模板杂交，使引物延伸反应发生。
如果需要的话，可通过掺入一种可用光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的标记物标记引物。可用的标记物包括：例如32P、荧光染料、电子密度剂、酶(如通常用于酶联免疫吸附测定(ELISAs)的酶)、生物素，或者可购得的抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。
“热稳定聚合酶”一词指一种酶，在经受高温并持续达到双链核酸变性所必需的时间时，该酶对热是稳定的、抗热的并保持足够的活性。文中所用的热稳定聚合酶适于用于诸如聚合酶链式反应(PCR)之类的温度循环反应。对于热稳定聚合酶，酶促活性指催化核苷酸以合适的方式结合以形成与模板核酸链互补的引物延伸产物。
核酸变性所必需的加热条件取决于，例如缓冲液盐浓度和变性的核酸的组成和长度，但通常在大约90℃-105℃的范围内变化，优选为90℃-100℃，持续时间主要取决于温度、核酸长度，一般为几秒，多至4分钟。
在涉及核酸碱基、核苷三磷酸或核苷酸时，“非常规的”或“修饰的”一词包括在DNA中天然存在的常规碱基或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。更为典型的是，与常规dNTPs相比，文中所用的非常规核苷酸在核糖的第2′位被修饰。因此，虽然对RNA说来，天然存在的核苷酸为核糖核苷酸(即，ATP、GTP、CTP、UTP，总称为rNTPs)，但由于这些核苷酸在糖的第2′位有一个羟基，相比较而言，在dNTPs中糖的第2′位没有羟基，文中所用的核糖核苷酸为非常规核苷酸。在第2′位含有诸如2′-氟-或2′-氨基-取代的类似物之类的取代基的核糖核苷酸类似物，是在本发明的范围之内。此外，核糖核苷酸类似物可以在第3′位被修饰，例如，通过由氢(3′脱氧)替代正常的羟基，产生核糖核苷酸类似物终止剂。这样的核苷酸也被包括在“非常规核苷酸”的范围之内。
由于按常规DNA是由dNTPs组成的，掺入rNTP会是非常规的，因而rNTP是非常规的碱基。所以，在本发明的一个优选实施方案中，对于包括DNA测序方法在内的DNA引物延伸方法来说，核酸产物既含常规的又含非常规的核苷酸的核酸，并且主要含有常规核苷酸，该常规核苷酸是dNTPs。
非常规的碱基可以，例如，用荧光素或罗丹明来荧光标记；如用生物素来非荧光标记；如用32P、33P或35S来同位素标记；或者可以不标记。
为进一步便于理解本发明，整个说明书均参考特异的热稳定聚合酶来说明本发明；不过，这些参考不意欲限制本发明的范围。虽然可将文中描述的新的热稳定聚合酶用于任何目的(其中，所述酶活性是必需的或需要的)，但在一个优选实施方案中，本发明的热稳定酶被用于各种核酸测序方法。所述酶也可以被用于诸如PCR之类的扩增反应。
本发明的热稳定聚合酶的特征在于：每一种酶均具有关键基序SerGlnIle Xaa Leu Arg Xaa(序列1)，因此，该序列第4位的“Xaa”是任意氨基酸残基，但不是谷氨酸残基(Glu)，并且第7位的“Xaa”是缬氨酸(Val)或异亮氨酸残基(Ile)。如文中所描述的，可以修饰编码在所述基序的第4位具有谷氨酸残基的热稳定聚合酶的基因，以产生合适的修饰聚合酶。所述修饰的热稳定聚合酶的特征在于：与相应的天然或野生型酶相比，其在氨基酸序列基序Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa(序列2)中有一个修饰(其中该序列的第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile))，即所述基序通过第4位的谷氨酸残基被另一氨基酸残基替代而被修饰。以下用常规的单字母氨基酸密码，表示由本发明提供的热稳定聚合酶的关键基序(Lehninger，“生物化学”(Biochemistry)，New York，Worth Publishers Inc.，1970，67页)。
序列1 Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa
其中，第4位的“Xaa”是任意氨基酸残基，但不是谷氨酸残基(Glu)，并且第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)。
编码基因序列和具有该决定性的氨基酸序列的蛋白质(其中第4位的Xaa不是谷氨酸残基(Glu))都产生对rNTPs识别排斥减少的聚合酶，它们都在本发明的范围之内。在该决定基序中，可对该基序中的其他氨基酸残基作另外的修饰，优选对选自谷氨酸(Gln或Q)、亮氨酸(Leu或L)或精氨酸(Arg或R)的氨基酸残基修饰。
本发明适用于通过对编码热稳定DNA聚合酶的基因序列进行特殊的修饰来制备具有优越性能的热稳定DNA聚合酶。在本发明的一个优选实施方案中，该基因序列和被编码的酶来自栖热菌属的一个种，尽管非栖热菌属的真细菌也被包括在如下详细描述的本发明的范围之内。同样地，就现已鉴定的关键基序的高度保守性来说，可以依据例如与Taq聚合酶的同源性，来鉴别新的热稳定DNA聚合酶。只要氨基酸序列具有SQIXLRV/I基序(其中x是任意氨基酸残基，但不是谷氨酸残基)，并且，只要与天然Taq聚合酶的所述序列相比，该氨基酸序列表现出至少大约39％、优选至少大约60％、更优选至少大约80％的总体同源性(序列鉴定)，则这样的热稳定聚合酶是在本发明的范围之内。在WO 89/06691中提供了所述Taq聚合酶的全长序列，这些序列可按基因序列(GENESEQ)专利序列数据库中的入藏登记号P90556，或按欧洲分子生物学(EMBL)序列数据库中的入藏登记号M26480，或按PIR序列信息库的入藏登记号A33530查到。
本发明的典型的热稳定DNA聚合酶是来自以下表1中所列生物的天然聚合酶的重组衍生物。表1说明该关键基序的特殊序列以及关于这些天然聚合酶的每一种的“X”残基的位置。由于每一种热稳定DNA聚合酶是单一的，对于每种酶来说，该关键基序的氨基酸位置是不同的。对于那些如下列出的聚合酶，关键的SQIXLRV/I基序的“X”位的氨基酸残基是谷氨酸残基。本发明的优选的聚合酶的分子量在85,000-105,000、更优选在90,000-95,000的范围内。这些聚合酶的氨基酸序列由大约750-950个氨基酸残基、优选800-850个氨基酸残基组成。本发明的聚合酶也可以由约540或更多的氨基酸残基组成，并且至少具有聚合酶结构域和相应于3′→5′外切核酸酶结构域的部分(产生的聚合酶可以或不具有3′→5′外切核酸酶活性)以及可能有5′→3′外切核酸酶结构域的部分，该部分被包含在很多全长热稳定聚合酶的氨基酸序列的头三分之一处。
对于未在表1中列出的热稳定DNA聚合酶来说，一旦鉴定了氨基酸序列中的关键基序或共有基序，则容易鉴定用来修饰的合适的谷氨酸残基。
不管在热稳定聚合酶中的具体位置如何，聚合酶结构域的序列基序中由另一氨基酸残基替代谷氨酸(Glu)残基的作用是产生具有有效掺入非常规核酸的能力的热稳定聚合酶，其中该基序为Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa(序列2)，其中序列第7位的“Xaa”为缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)。在一个优选的实施方案中，谷氨酸被诸如甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸之类的具不带电的极性R基团的氨基酸替代，或者被诸如丙氨酸之类的具有一个小的非极性R基的氨基酸替代。在最优选的实施方案中，谷氨酸残基被甘氨酸残基(G)取代。氨基酸和核酸序列联合程序可以方便地由Wisconsin，Madison，575 Science Drive的遗传计算机项目获得。这里给出鉴定的具体基序，例如包括“GAP”、“BESTFIT”和“PILEUP”在内的这些程序，可以用来帮助鉴别待修饰的确切的序列区域。
由以下表1可见，很显然，在来自嗜热生物的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域中必须有两种类型的保守序列基序Ser Gln Ile Glu Len ArgXaa(序列2)。在来自栖热菌属的种类以及栖热菌属的种类sps17和ZO5的天然热稳定聚合酶中存在有序列基序SerGlnIleGluLenArgVal(序列3)，这些栖热菌属种类如栖热水生菌(Thermus aquaticus)、亲硝卤水栖热菌(Thermuscaldophilus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus flavus和Thermusfiliformis。在其他热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域中也存在序列基序SerGln Ile Gln Leu Arg Val(序列3)，这些热稳定聚合酶来自Thermosiphoafricanus和诸如Bacillus caldotenax和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)之类的各种芽孢杆菌菌株。在来自例如Thermotogamaritima、Thermotoga neapolitana和Anaerocellum thermophilum的天然热稳定的聚合酶中存在有序列基序SerGln IleGluLeuArgIle(序列4)
                          表1
     生物体                 氨基酸共有基序      谷氨酸的位置
                               SQIXLRV/I
Thermus  aquaticus(Taq)       SQIELRV               615
Thermus  caldophilus(Tca)     SQIELRV               617
Thermus  thermophilus(Tth)    SQIELRV               617
Thermus  flavus(Tfl)          SQIELRV               616
Thermus  filiformis(Tfi)      SQIELRV               613
Thermus specie sps17             SQIELRV            613
Thermus specie ZO5               SQIELRV            617
Thermotoga  maritima(Tma)        SQIELRI            678
Thermotoga  neapolitana(Tne)     SQIELRI            678
Thermotoga  africanus(Taf)       SQIELRV            677
Anaercoellum                     SQIELRI            632
thermophilum(Ath)
Bacillus  cadotenax(Bca)         SQIELRV            659
Bacillus  stearothermophilus(Tst)SQIELRV            658，661，or736*
*取决于所选择的氨基酸序列(参见下文)
在美国专利5,466,591中已公布了Taq、Tth、ZO5、SPS17、Tma和Taf聚合酶中的每一种酶的全部核酸序列和氨基酸序列，文中将其收作参考。来自Tca、Tfl、Tne、Ath、Bca和Bst的的DNA聚合酶的序列已公布如下：在EMBL序列数据库中由入藏登记号U62584公布的Tca(也参见Kwon，1997，“分子细胞学”(Mol.Cells)7(2)：264-271)；Akhmetzjanov和Vakhitov的文章中的Tfl(1992，“核酸研究”(Nucleic Acicds Research)20(21)：5839)；WO97/09451和WO 96/41014中公布的Tne；EMBL序列数据库中入藏登记号X98575公布的Ath(关于Ath菌株的详细情况，参见Rainey等，1993，“细菌学杂志”(J.Bacterid.)175(15)：4772-2779)；在Uemori等人的文章(1993“生物化学杂志”(J.Biochem.113：401-410)和EMBL序列数据库入藏登记U23149公布的Bst(也参见Phang等，1995“基因”(Gene)163：65-68)。在日本专利公布JP05/304 964A、欧洲专利公布EP-A-699，760以及Aliotta等人的文章(1996，“遗传分析”(Genet.Anal.)12：185-195)中，也提供了在关键基序中第658位具有一个谷氨酸残基(E)的Bst聚合酶氨基酸序列，这一序列也可由EMBL序列数据库入藏登记号U33536获得。这一序列发表于“基因”(Gene)163：65-68(1995))，在残基661处具有关键基序的“E”。Bca公布于Uemori等人的文章(1993，“生物化学杂志”(J.Biochem.)113：401-410)和EMBL序列数据库入藏登记号D12982中。可以用美国专利4,889,818中提供的方法，也可根据表1中提供的系列资料，从Thermus filiformis中回收热稳定DNA聚合酶(参见“FEMS微生物学通讯”(FEMS Microbiol.Lett.)22：149-153，1994；也可从ATCC保藏号43280获得)。上述每一序列和出版物均收入本文作为参考。在如WO 89/06691中提供的Taq聚合酶的天然类型与以上提到的Tfl聚合酶之间的氨基酸序列的序列同源性(序列相同性)为87.4％。关于Tth聚合酶的相应的同源性为87.4％，相应的关于Tca聚合酶的为86.6％，关于Tca聚合酶的为86.8％，关于Bst聚合酶(入藏登记号U23149)的为42.0％，关于Bca聚合酶的为42.6％，并且关于Ath聚合酶的为39.7％。
如表I所证实的，在热稳定聚合酶中，该关键基序是非常保守的。在“X”是谷氨酸残基的聚合酶中，改变编码该聚合酶的基因提供了本发明的酶，例如与Taq聚合酶(其中该关键基序未被修饰)相比较，这一酶容易掺入rNTPs。因此，本发明涉及一类酶，这一类酶也包括，如由下述微生物而来、也可由ATCC入藏登记号35948获得的热稳定DNA聚合酶、相应的基因和表达载体，这些微生物如Thermus oshimai(Williams等人，1996“国际系统细菌学杂志”(Int.J.Syst.Bacteriol.)46(2)：403-408)；Thermus silvanus和Thermus Chliarophilus(Tenreiro等人，1995，“国际系统学杂志”(Int.J.Syst.Bacteriol.)45(4)：633-639)；Thermus scotoductus(Tenreiro等人，1995，“微生物学研究”(Res.Microbiol.)146(4)：315-324)；Thermus brockianus(Munster，1986“微生物遗传学”(Gen.Microbiol.)132：1677)和Thermus ruber(Loginov等，1984“国际系统细菌学”(Int.J.Syst.Bacteriol.)34：498-499)。此外，本发明也包括，例如，来自下述微生物的热稳定DNA聚合酶的修饰型、相应的基因和表达载体，这些微生物如Thermotoga elfii(参见Ravot等人，1995，“国际系统细菌学”(Int.J.Syst.Bacteriol.)45：312；也可由DSM入藏登记号9442获得)和Thermotoga thermarum(Windberger等人，1992“国际系统细菌学杂志”(Int.J.Syst.Bacteriol.)42：327；也可由DSM入藏登记号5069获得)。每一上述序列和出版物都收入本文作为参考。
在本发明的一个优选实施方案中，待修饰的关键基序是在氨基酸序列LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(序列5)中。因而，本发明的一个方面涉及产生热稳定DNA聚合酶突变型，该突变型表现出大大增强在依赖模板的方式中掺入非常规核苷酸的效率。在一个特别优选的实施方案中，这一聚合酶序列包含了Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu AlaHis Leu Ser(序列6)。这样的热稳定DNA聚合酶特别适用于诸如DNA测序、DNA指导的RNA合成，以及rNTP取代的DNA的体外合成等的一些方法。
可以通过诸如定点诱变的方法来产生能高效掺入非常规碱基的热稳定DNA聚合酶。例如，参见：Sambrook等人，“分子克隆：实验指南”(MolecularCloning：A Laboratory Manucal)，Cold Spring Harbor，1989第二版，第15.51章，“寡核苷酸介导的诱变”，该文收入本文作为参考。例如，在Thermusaquatics(Taq)DNA聚合酶基因序列(参见序列7)中编码615号残基的谷氨酸的第2位密码子上的“A”突变成“G”，导致掺入如文中定义的非常规核苷酸的效率增加500倍以上，同时在有常规核苷酸，即dNPTs存在下保留酶的介导PCR的能力。在Taq DNA聚合酶中，这一特殊的突变导致在一个氨基酸中E(谷氨酸)变成G(甘氨酸)。尽管这一特殊的氨基酸变化显著改变了酶掺入非常规氨基酸的能力，预计由诸如丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸之类的其他氨基酸残基取代谷氨酸残基会有同样的效果。因此，虽然E615G是一个优选实施方案，但其他替代E615的氨基酸取代物是在本发明的范围之内。因而，本发明的一个关键方面是序列1的基序中的第4氨基酸残基不是谷氨酸残基。
也可以通过位点特异性引物指导的诱变达到定点诱变。现在，这一技术在本领域中是标准的，并且是用一种合成的寡核苷酸引物来进行的，除有一个代表所需突变的限定的错配外，该引物与待突变的单链噬菌体DNA互补。合成的寡核苷酸主要用作引物来指导与质粒或噬菌体互补的链的合成，并且得到的双链DNA被转化到支持噬菌体的宿主细菌中。可以分析得到的该细菌，例如用DNA序列分析或探针杂交来鉴定那些带有所需的突变基因序列的噬菌斑。或者，可以用在下述文献中描述的“重组PCR”方法，这一文献是：“PCR方案”(PCR Protocols)(San Diego，Academic Press，Innis etal，editors，1990，第22章，题目是“重组PCR”，作者为Higuchi，第177-183页)。
如表1中证实的，在其他热稳定DNA聚合酶中，Taq聚合酶的关键基序中的谷氨酸是保守的，但可以是处于氨基酸序列中不同的但邻近的位置。与具有序列2中Taq聚合酶相比，Thermus属的种类的热稳定DNA聚合酶和有关的Thermotoga、Thermosipho以及Anaerocellum属的种类的DNA聚合酶的序列2中保守的谷氨酸的突变，对酶的有效掺入非常规核苷酸的能力有相同的增强效果。利用定点诱变所用的原理和技术，可以达到在其他热稳定DNA聚合酶的关键基序中谷氨酸残基的突变。Gene Bank和SwissProt/PIR数据库中有几种关于Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的序列提供。这些序列非常相近，但彼此多少有所不同，但是每一序列都具有相同的关键序列SerGlnIleGluLeuArgXaa(序列2)，其中这一序列的第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)，尽管其基序处于序列的不同位置。
根据文中所述的热稳定DNA聚合酶的氨基酸序列和核酸序列的公众可获得的信息，也可以通过常规重组方法来构建由来自不同的热稳定DNA聚合酶的结构域组成的嵌合聚合酶。美国专利5,466,591和5,374,553描述了用于改变诸如5′→3′外切酶结构域、3′→5′外切酶结构域和聚合酶结构域之类各种功能段的方法。优选的嵌合热稳定聚合酶含有5′→3′外切酶结构域、3′→5′外切酶结构域和聚合酶结构域，由此一个结构域是来自不同的聚合酶，并且由此，该聚合酶结构域含有关键基序序列Ser Gln Ile Xaa Leu ArgXaa(序列1)，其中，该序列第4位的“Xaa”是任何氨基酸残基，但不是谷氨酸残基，该序列第7位的“Xaa”是缬氨酸残基(Val)或异亮氨酸残基(Ile)。这样的嵌合分子的例子是Taq/Tma嵌合酶，其组成由表2中说明。如在该表中所指出的，这些Taq/Tma嵌合酶的聚合酶结构域包含着以上说明的关键基序中的突变。
                                           表2
5′→3′外切酶结构域 3′→5′外切酶结构域 聚合酶结构域
Taq 第1-289氨基酸 第290-422氨基酸 第423-834氨基酸
Tma 第1-291氨基酸 第292-284氨基酸 第485-893氨基酸(Tma)
Taq/Tma 第1-289氨基酸(Taq) 第292-484氨基酸(Tma) 具有E615G突变的423-832(Taq)氨基酸
Taq/Tma 第1-289氨基酸(Taq) 第292-484氨基酸(Tma) 具有E678G突变的485-893(Tma)氨基酸
质粒pCl已于1996年7月17日在ATCC根据Budapest Treaty保藏，入藏登记号为98107。质粒pCl具有编码热稳定DNA聚合酶的基因，其在编码天然Taq聚合酶的第615位的谷氨酸的密码子处被突变，产生在第615位具有甘氨酸残基的Taq聚合酶的突变型(E615G突变的Taq聚合酶)。这一保藏为得到具有高效掺入非常规核苷酸类似物的热稳定DNA聚合酶提供了可选择的方法。实施例1说明了将适于亚克隆E615G突变的旁侧限制酶切位点用来产生另外的热稳定DNA聚合酶。由于已知多种热稳定DNA聚合酶的完整的基因序列，所以本领域的技术人员可以容易地根据文中提供的关键基序的序列信息，利用诸如通过限制消化和片段替换或体外位点特异性诱变之类的其他方法，在编码E615的密码子处引入突变。
由定点诱变制备的修饰基因或修饰基因片段可以从该质粒或用常规方法得到的噬菌体回收，并将其连接入表达载体，以进行随后的培养以及纯化由此得到的酶。包括哺乳动物和细菌系统在内的多种克隆和表达载体适于用于本发明，并且描述于如Sambrook等人的文献中(“分子克隆：实验指南”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。为方便起见，本发明以应用来自λ质粒的PL启动子(Shimatake等人，1981，“自然”(Nature)，292：128)来举例说明。这一启动子的用途描述于美国专利4,711,845和5,079,352中。
本发明的热稳定DNA聚合酶通常是由某些已被转化的微生物(如大肠杆菌)纯化的，所用的表达载体操纵连接到编码野生型或修饰的热稳定DNA聚合酶的基因。合适的宿主微生物的例子是Lawyer等人描述的E.coli菌株DG116(1993，“PCR方法和应用”(PCR Methods andApplications)2：275-287)，这一菌株也可从美国典型培养物保藏中心入藏登记号ATCC 53601获得。用于纯化该热稳定聚合酶的方法也描述于Lawyer等人论文中(1993，“PCR方法和应用”(PCR Methods and Applications)2：275-287)。
本领域的技术人员会认识到，通过应用重组DNA技术的方法，最易制备以上具有高效和掺入非常规核苷酸的热稳定DNA聚合酶。在需要生产本发明的酶中的一种酶或这些酶的衍生物或同源物时，该酶的重组型的产生典型地涉及构建表达载体、用载体转化宿主细胞和在诸如发生表达之类的条件下培养该转化的宿主细胞。在本领域中用于制备表达载体、转化和培养转化的宿主细胞的方法是众所周知的，例如，在Sambrook等人的文章中(1989，同上)进行了详细描述。
本发明提供了适于和核糖核苷三磷酸一起用于包括核酸扩增、检测和DNA测序方法的热稳定DNA聚合酶。在测序中使用核糖核苷酸可避免诸如ddNTPs那样的链终止类似物的高耗费，并且重要的是，方便了新的扩增产物的制备，而勿需进行随后的DNA测序反应。这些新的扩增产物不仅适于DNA序列分析也适于诸如电泳或杂交之类的其他类型的分析。
用嗜热聚合酶和热稳定DNA聚合酶，通过随着延伸产物的积累的而焦磷酸解的量的减少已证明焦磷酸酶促进了测序结果。实际上，现有的循环测序法需要将另外的酶包括在测序反应内。不过，本发明的一个很有用的和有利的方面是DNA测序勿需焦磷酸酶。因此，使用本发明提供的新酶取消了将第二种酶加入到测序反应混合物中所需要的额外花费。
通过使用本发明的酶，将扩增反应和测序反应联合起来，这样节省了时间和原材料也简化了整个分析。这些优点和其他优点是可以达到的，这主要是因为既将常规核苷酸也将核糖核苷酸和核糖核苷酸类似物掺入引物延伸产物中，产生了对RNA水解敏感的RNA/DNA嵌合链。这一处理不影响DNA主链，并且提供了一组核酸片段，其中每一片段终止于插入核糖核苷酸而代替相应的dNTP的位置。通过包括碱(如用以下实施例4中所示的0.2M的终浓度的NaOH处理)、热或用RNase的酶促处理[Vogel等人，editors，“信息大分子”(Informational Macromelecular)，New York，Academic Press，1963，由Berg等人撰写的章节，题目为“通过E.coli DNA聚合酶的纯化制备合成含有核糖和脱氧核苷酸的混合多聚核苷酸”，467-483页]容易进行水解，但不限于这些方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了可用于测序方法的新的并改进了组合物。文中描述的新酶有利于使用染料终止剂或染料引物的核酸测序方法以及其他测序方法。如在先所描述的，链终止方法通常要求是依赖模板的引物在有链终止核苷酸存在下延伸，产生一类不完全片段，随后依据大小将这些不完全片段分离。标准的双脱氧测序法使用了用于终止链的双脱氧核苷三磷酸，和诸如E.coli PolI的Klenow片段之类的DNA聚合酶(参见Sanger等，同上)。
因此，基本的双脱氧测序方法包括：(i)使寡核苷酸引物与模板退火；(ii)在4种独立的反应中用DNA聚合酶使引物延伸，每一反应包括有一种标记了的核苷酸，或标记了的引物、未标记的dNTPs的混合物以及一种使链终止的ddNTP；(iii)用一些方法分离4组反应产物，这些方法如高分辩率变性聚丙烯酰胺/脲凝胶电泳、毛细管分离或其他分离方法；以及(iv)产生凝胶的放射自显影影像，可检测该影像来推断序列。或者，用荧光标记的引物或核苷酸，可将质谱法或杂交法用来推导DNA序列的信息。
利用抗热聚合酶(如Taq聚合酶)的结果，已经改进了对它们的测序方法(参见美国专利5,075,216)和修饰，所述的改进方法被称作为“循环测序”。在循环测序中，重复加热和冷却的循环，使得从每一靶分子产生大量的延伸产物(Murray，1989，“核酸研究”(Nucleic Acids Research)17：8889)。在有双脱氧链终止剂存在下，与模板序列互补的靶序列的不对称扩增，产生了具有全部可能的长度的一族延伸产物。
DNA模板的延伸反应产物在变性后，在有双脱氧终止剂存在下，发生引物退火和引物延伸的多次循环。在循环测序中，热稳DNA聚合酶有一些优点；其能耐受引物与靶核酸的特异杂交所需的严格的退火温度，也能耐受在每一循环中发生的高温变性(即90-95℃)的多次循环。由于这一原因，各种类型的Ampli TagDNA聚合酶已被包括在由Perkin Elmer，Norwalk，CT生产的Taq循环测序试剂盒之内。
不过，在用于循环测序时，Taq DNA聚合酶的排斥掺入诸如ddNTPs的非常规核苷酸的特征造成了一个困难，即必须掺入作为链终止剂的ddNTPs或荧光标记的ddNTPs。在本发明之前，使用热稳定DNA聚合酶的DNA测序通常必需有高浓度的链终止核苷酸(一般为双脱氧核苷酸)，以保证会产生一群延伸产物代表几百个碱基的长度范围内所有可能的片段长度。为解决成本问题，一些方案通常使用浓度很低的常规dNTPs，这样使反应效率降低。由于具有低的dNTP浓度和高的ddNTP浓度，在这样一些反应混合物所造成的环境中，实际上热稳定聚合酶极需核苷酸底物。
即使随着修饰的酶的出现，如使dNTPs浓度升高至更加适宜的浓度的Ampli TaqDNA聚合酶FS的出现，现有的酶仍然依赖于成本高的ddNTPs来进行DNA测序。相反，本发明提供的一些酶不仅使dNTPs的浓度增加，而且由于使用替代的rNTPs掺入到延伸的链中，避免了使用成本高的ddNTPs。新酶的有效作用于部分的核糖核苷酸替代物的能力，在不进行用来掺入终止核苷酸的单独反应时，有利于产生DNA测序的序列梯。
对适于DNA测序方法用的非常规核苷酸类似物的选择是由该热稳定DNA聚合酶掺入所述类似物的能力预先决定的。遗憾的是，所述核苷酸类似物太昂贵。例如，ddNTPs的价格比rNTPs或dNTPs的高大约25倍。由于在先的热稳定DNA聚合酶不能以模板介导方式有效地将rNTPs掺入到延伸的DNA链中，不选择这样的容易购买的并且价格不贵的核糖核苷酸在用热稳定性DNA聚合酶进行的DNA测序中使用。因此，在一个方面，本发明提供了用于DNA测序分析的方法，与现有链终止方法相比，这些经济得多。
引物延伸反应中存在有锰会影响聚合酶准确插入正确碱基配对的核苷酸的能力。可以用锰来促使碱基错配或使对插入核苷酸类似物的识别排斥减少。研究人员已用锰在DNA复制或扩增过程中引入诱变。因此，锰会影响聚合反应的保真性以及反应的产率。产生的序列可能是错误的，或者，在DNA测序方法中，得到的信息可能是模棱两可的。本方法勿需将作为二价阳离子的锰包括在测序反应混合物中以促使聚合酶插入非常规核苷酸。与现有DNA聚合酶相反，本发明鉴定聚合酶结构域中的关键基序，来控制不需锰的情况下酶辩别2′取代的和未取代的核苷酸的能力。
本发明的酶不需要有用于测序的高浓度的非常规碱基类似物。在本发明之先，关于链终止测序法，非常规碱基类似物和相应常规碱基通常是以某一比值(如，ddATP∶dATP)存在，该比值的范围是从大约1.3∶1到24∶1。(也参见Innis等人的美国专利5,075,216)。相比较而言，由本发明提供的热稳定聚合酶使非常规碱基类似物与常规碱基的比值能被减少一百至几千倍。1∶1或更少的rNTP∶dNTP的比值、连同本发明提供的新酶，足以满足DNA序列分析。在本发明的一个优选实施方案中，rNTP∶dNTP的比值被降低至少于1∶8。依据特定的实验设计和所需的片段长度，2′取代的核苷酸与相应的天然dNTP的比值可以低至1∶80或1∶200。
因此，由于本发明的酶容易掺入诸如2′取代的核苷酸之类的非常规核苷酸，不必通过使用高浓度的rNTP和限定浓度的相应的dNTP来促使掺入rNTP。因此，本方法能使用适宜浓度的dNTPs和少量的rNTPs.
在按照本发明把修饰聚合酶用于诸如染料-引物测序法的合适测序方法中时，以每种dNTP为50-500μM的范围内的dNTP浓度，得到了良好的测序结果。优选该dNTP浓度是在100和300μM之间。在这些范围时，相应的rNTP可以以和dNTP大约相同或更小的浓度存在。优选该rNTP以大约0.1μM-100μM的浓度存在，最优选rNTP以大约2.5μM-25μM存在。
适于和本发明修饰酶一起应用的rNTPs的浓度可以由本领域的普通技术人员很容易地通过滴定法和优化实验测定。所需的rNTP或类似物的量会受到实验类型的影响，并且可能会受靶核酸的大小和纯度以及对缓冲液的和特定酶种类选择的影响。
rNTP∶dNTP的比值会决定把rNTP插入伸长的寡核苷酸的频率。由于会在每一掺入的rNTP处发生水解，可以调整rNTP∶dNTP的比值来为用户提供增加或减少产生片段的大小的灵活度。
如完全理解的，DNA是由dNTPs合成的聚合物。每一脱氧核苷三磷酸都包含有一个核糖(残基)，该核糖在第3′位具有一个羟基，而在第2′位具有一个氢。核糖核苷酸在糖的3′位置也具有一个羟基。但是，rNTPs与dNTPs不同在于糖的第2′位，此处由第2个羟基替代了氢原子。在本文中，以rNTPs为例说明了本发明的酶的准确掺入2′取代的核苷酸的能力。但是，本发明的化合物不被限制在使用非常规核苷酸的范围之内，该非常规核苷酸是核糖核苷酸。对热稳定聚合酶序列在文中鉴定的在决定性的结构域处的修饰，使能以模板介导掺入其他2′取代核苷酸，如2′-羟基，3′-脱氧核苷酸和取代的2′-氟或氨基核苷酸的。
如在本文实施例中描述的，在热稳定性聚合酶中的第2个突变的存在，有利于掺入文中称作3′-脱氧腺苷三磷酸的3′-脱氧，2′-羟基-ATP，其中该热稳定聚合酶对掺入在核糖的第3′位有脱氧的核苷酸的识别排斥减少。例如，在先在EP-A-655506和1995年5月23日提交的美国专利申请08/448,223中曾描述过这样的酶，这些专利收入本文作为参考。按Budapest Treaty于1995年5月10日保藏的ATCC入藏号69820提供了编码Thermus aquaticus修饰的DNA聚合酶的基因，该基因对掺入诸如ddNTPs的类似物的识别排斥减少。与常规的dNTPs相比，双脱氧核苷酸有取代的第3′位。因此，连同本发明，其中以E615G、F667Y Taq聚合酶突变型举例说明的双突变，为使用核苷酸类似物提供了方法，与dNTPs相比，该核苷酸类似物在核糖的第3′和2′位被取代。(参见实施例III和V)。
本发明的一个特殊应用是一种rNTP测序法，其中，用可识别的荧光或放射性标记物来可检测地标记测序引物。与ddNTPs不同，未修饰的rNTP的掺入不导致链终止。既包含有rNTPs又包含dNTPs的DNA测序反应物和本发明的酶一起，产生随机取代的引物延伸产物的混合物，这些引物延伸产物在核糖和邻近的脱氧核糖核苷酸之间的3′-5′磷酸二酯键处易被裂解。例如，在PCR扩增或循环测序中的引物延伸反应后，并且，例如在通过凝胶电泳分离引物延伸产物之前，用碱、热、核糖核苷酸或其他方法处理反应混合物，在每一个出现核糖核苷酸之处水解延伸产物。对于每一标记引物的延伸产物来说，在测序胶上只能检测出大多数5′片段，这些片段是标记引物的直接延伸产物。对于一种给定的靶核酸，分析得到的测序胶，产生测序梯，即在G、A、T和C泳道中的一系列可辩别的信号，这些测序梯与靶核酸的核酸系列相对应。该方法是以常规方式使用ddNTPs还是使用rNTPs和文中所述的新的热稳定聚合酶，得到的测序梯提供的是相同的信息。因此，借助于本发明，DNA测序将不再需要昂贵的ddNTPs(参见实施例VI)。
在一种可供选择的测序方法中，使用了链终止核糖核苷酸。在本发明的这一实施方案中，用诸如3′-脱氧腺苷三磷酸之类的2′-羟基，3′-脱氧核苷酸作为终止剂。这些rNTP类似物可以被荧光标记，并用于DNA测序。Lee等人(同上)描述了染料终止剂ddNTPs的应用。EP-A-655,506和于1995年5月23日提交的美国专利申请系列号08/448,223描述了和ddNTPs一起使用的修饰的酶。如文中描述的，既具有于Ampli TaqDNA聚合酶FS(参见上文)中存在的修饰、又有序列1(其中X不是谷氨酸(E))中说明的那些修饰的热稳定DNA聚合酶，可用于在链终止测序反应中有效掺入标记的rNTP类似物。这一方法可以被自动控制，并且勿需合成染料标记引物。此外，由于染料终止剂反应使所有4种反应可在同一试管中进行，其比染料引物方法更为方便。2′-羟基，3′-脱氧核苷酸可由可购买到的3′核苷酸(3′dA，3dC，3′dG和3′dT，例如，可从Sigma Chemical Corporation，St.Louis，MO购得)和加入Ludwig的论文中所述的5′三磷酸酯来合成(Ludwig，“生物磷酸酯和其合成、结构、代谢和活性”(Biophosphates and Their Synthesis、Structure、Metabolism and Actility)，editors，Bruzik and Stec，Amsterdam，Elsevier SciencePublishers，1987，201-204页)。
除在新的测序方法中使用本发明的酶以外，也可将文中所述的修饰酶用于一些分子生物学用途。在一种实施方案中，把修饰酶用于扩增反应混合物，该混合物中既含有常规的又含有非常规的核苷酸，例如dNTPs和至少一种可检测标记过的rNTP。这一标记物包括，例如，荧光标记物或放射性标记物。模板介导的互补链的合成，产生一种DNA产物，该产物在其长度的多个位置具有核糖核苷单磷酸酯的。热和/或碱处理在每一核糖核苷酸处水解核酸延伸产物。因此，产生了一组DNA片段，其中每一片段在其3′末端均具有一个标记部分。可通过调节反应中包括的rNTP的比例和量来调整产生的核酸片段的大小。
使用rNTPs和本发明酶的靶核酸扩增反应，提供了很多优点，这些优点取决于特殊用途。在上述使用标记rNTP的方法中，产生的这族片段均以相同的强度标记：每一寡核苷酸片段有一个标记。诸如使用一排固定于硅芯片上的寡核苷酸探针来检测核苷酸的方法，选择地要求被扩增的靶核酸在固定的可复制的大小范围内被随机裂解，来限制有关控制杂交动力学的二级结构的形成。此外，为检测与芯片上的一组成千的探针杂交，以相同强度标记核酸片段可能是优选的。本发明提供了一种用来产生达到这一标准的几组片段的方法，因而有利于对诸如芯片法之类的其他检测形式的应用。例如，Cronin等人描述了芯片法(1996，“人类突变”(HumanMutation)7：244-253)。
在另一实施方案中，在扩增反应中使用一种标记引物和一种未标记引物提供了同时进行扩增和测序反应的方法，其中在该扩增反应物中具有本发明的热稳定聚合酶以及rNTPs和dNTPs。这一方法要求进行4种独立的扩增反应，其中，关于每一种rNTP有一种反应。因此，例如，由于本发明的酶适用于通过诸如PCR或其他扩增方法之类的靶核酸扩增，如果产生的产物存在的话，其可通过使用一部分反应产物、以诸如凝胶电泳或探针杂交之类的方法来检测。这些检测方法不会导致掺入的核苷酸的水解，并且该RNA/DNA嵌合链会起到如对常规核酸扩增产物所预计的作用。如果检测到所需的产物，可用碱处理并通过用于核酸序列测定的凝胶电泳来分析同一反应混合物的其余部分。因此，在对产物检测之后，勿需随后的测序反应。这一扩增方法节省了时间和原材料，并且通过去掉一些步骤(检测产物是测序产物)增加了准确度。
也可以使用类似的方法以及4种标记rNTPs和一种生物素标记的引物。在扩增后，用碱裂解产物，并通过与涂有链霉抗生物素蛋白的珠粒反应来除去连接在产物上的引物。随后于测序胶上分析收集的产物。这一改进使测序反应能于一个试管中进行，因而排除了对4种独立反应的需要。
在本发明的另一方面，文中所述的酶可用来由DNA模板制备RNA，或者为碱基介导的灭菌制备取代的DNA，而不使用诸如尿嘧啶-N-glycolsylase(UNG)(描述于国际专利公布WO/92/01814)的常规灭菌剂。
在一个典型的实施例中，该热稳定聚合酶还在5′→3′外切酶结构域中具有突变，该突变的作用是大大减弱这一外切酶活性。Taq聚合酶的修饰型描述于美国专利5,466,591中。在那一发明中，编码第46位的氨基酸处的甘氨酸(G)残基的密码已被编码天冬氨酸(D)的密码替代。由于5′→3′外切酶活性减弱，得到的酶在循环测序中的应用增多，并且该酶是应用本发明的优选背景技术。与野生型酶相比，该(G46D)突变不影响该聚合酶结构域的氨基酸序列和聚合酶活性。
在本发明的一个经济的实施方案中，用于核酸测序的包含本发明热稳定聚合酶的试剂盒体现了本发明的一个经济的实施方案。这样的试剂盒包括了诸如rNTPs、dNTPs和合适的缓冲液之类的用于DNA测序的添加剂。在rNTPs未被标记的情况下，也可以将标记的引物包括在内。
以下实施例仅为了说明本发明，决不是用来限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例I 对非常规核苷酸识别排斥减小的修饰Taq聚合酶基因的表达
Taq DNA聚合酶的C-末端氨基酸部分构成该聚合酶活性位点结构域(Lawyer等，1993“PCR方法和用途”(PCR Methods and Application)2：275-287，文中收作参考)。含有这一区域的DNA片段是从全长Taq基因分离，并通过在有锰存在下PCR扩增反应被诱变(Leung等人，1989“技术”(Technique)1(1)：11-15)。在此实施例中，所有限制酶由New England Biolabs，Beverly，MA购得。诱变的片段用PSI和BglII消化，并克隆入Taq表达质粒，此处为已用PstI和BglII消化的质粒pLK102。质粒pLK102是Taq表达质粒pSYC1578(Lawyer等人，同上)的修饰形式。使位于3′-聚合酶编码区的Hinc II/EcoRV片段缺失，产生质粒pLK101。然后从质粒pLK101上缺失一个898碱基对的Pst I-BglII片段，并用短的Pst I-EcoRV-Bgl II寡核苷酸双螺旋替代，产生质粒pLK 102。因此，这一缺失从Taq DNA聚合酶基因的3′端除去了900个碱基对，并用一段短的DNA替代了这一缺失。
把产生的表达质粒转化到E.coli菌株M624(由Gottesman描述于1993，“分子生物学杂志”(J.Mol.Biol.)77：531；也可由耶鲁大学E.coli GeneticStock Center的菌珠登记号CGSC#5066获得)中，并筛选其转化体与野生型酶相比的有效掺入rNTPs的能力。用这一方法，鉴定突变体C1具有更有效地掺入rNTPs的能力。
为确定Taq聚合酶基因的哪一部分是导至改变的表型，用各种限制酶消化从突变型C1分离的称作为pCl的经诱变的Taq表达质粒，并把产生的限制片段亚克隆至pLK101的野生型Taq DNA聚合酶基因中来替代未经诱变的限制片段。对产生的亚克隆的分析表明导致这一表型的突变被包括在由NheI至BamHI限制片段的265个碱基对中。
用由Applied Bios systems，Foster City，CA购得的ABI PRISMa染料终止剂循环测序核心试剂盒和Ampli TaqDNA聚合酶FS，以及应用生物系统模型373A DNA测序系统，对pCl这一区域进行DNA序列分析。序列分析鉴定了Taq聚合酶基因中NheI和BamHI位点之间的两个错义突变。第615位的氨基酸处的突变导致谷氨酸残基(E)被甘氨酸残基(G)替代，第653位的另一突变用苏氨酸(T)残基替代了丙氨酸(A)残基。如美国专利5,079,352中描述的于编码突变蛋白的第一个甲硫氨酸残基的密码处开始编号。E615G突变是由第615密码中GAC改变成GGG造成。E.coli宿主菌株N1624中的质粒C1根据Budapest Treaty在ATCC于1996年7月17日保藏，并给予入藏登记号98107。
用重组PCR(Innis等人编辑，“PCR方案”(PCR Protocols)，San Diego，Academic Press，1990，第22章，题目是“重组PCR”，作者是Higuchi，177-183页)，通过将两个点突变分别克隆至野生型Tag聚合酶基因，来分别分析这两个突变。分析产生的表达产物，来确定是否E615G或A653T或两个突变均会导致掺入核糖核苷酸的表型。这一实验的结果表明只有E615G突变导致该突变的表型。
为进一步对掺入核苷酸类似物的效率分析和定量，把包含有E615G的265个碱基对的BamHI-NheI PCR片段克隆至Taq表达载体pRDA3-2中。表达载体pRDA3-2具有操作地连接到噬菌体PL启动子上的全长Taq基因。这一载体中的Taq基因的外切酶结构域，在第46氨基酸残基处的编码甘氨酸的密码处有一个点突变，这一突变减弱了5′→3′外切酶活性。但是，在表达载体pRDA3-2的聚合酶结构域中的基因序列和野生型Taq基因序列相同。在美国专利5,466,591中充分描述了质粒RDA 3-2，此专利收入本文作为参考，其中该质粒被称作为“克隆3-2”。用BamHI和NheI消化质粒pRDA3-2，并用常规方法将该265个碱基对的PCR片段连接到载体上。
把产生的质粒pLK 108转化到E.coli菌株DG116中(Lawyer等人，1993，同上；也可由美国典型培养物收藏所的入藏登记ATCC 53606获得)。质粒pLK108编码文中称作G46D、G615G Taq的热稳定DNA聚合酶。G46D、E615G、F667Y Taq突变体通过重组PCR将E615G和F667Y重组至BamHI-NheI片段来产生。这一片段被克隆至质粒pRDA 3-2，产生质粒pLK109。虽然省去了色谱步骤，按照由Lawyer等人(1993，同上)描述的方法纯化来自质粒pLK 108和pLK 109的该表达的热稳定DNA聚合酶。通过DNA序列分析证实了插入的序列。在pLK 108插入中检测到了序列中的另一突变，但是，这一突变不改变蛋白质的氨基酸序列。
在部分纯化后，用Lawyer等人描述的活性分析测定修饰酶的活性(1989，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)264：6427-6437，收入本文作为参考)。如下来计算修饰酶的活性：一个酶活性单位相当于在30分钟内合成10nmole产物。野生型DNA聚合酶的活性与多至80-100pmole的掺入的脱氧胞苷-磷酸(dCMP)的酶浓度成线性比例(以0.12-0.15单位/反应来稀释的酶)。E615G、G46D和E615G，F667Y、G46D突变型的活性与多达0.25-3pmoles的掺入dCMP的酶浓度成线性比例。在实施例III-V中描述的掺入和测序反应中应用了这种酶制剂。例如实施例II和VI中，如Lawyer等人(同上)的论文中所述的来纯化酶。
实施例II   分析比较掺入效率
通过测定每种酶在限定的浓度下能向激活的鲑精DNA模板中掺入的[α-32P]rNTP的量，来测定G46D和G46D，E615G Taq掺入rNTPs的比较能力。为测定rATP的掺入，制备一种反应混合物，使得在50μl反应物中终浓度为：12.5μg如下述制备的激活的鲑精DNA，dCTP、dGTP和dTTP各200μM(Perkin Elmer，Norwalk，CT)，100μM[α-32P]rATP，1mM β-巯基乙醇，25mM N-三[羟甲基]甲基-3-氨基-丙磺酸(TAPS)，pH9.5，20℃，50mM KCl和2.25mMMgCl2。
制备同样的分析混合物来测量rCTP、rGTP和rUTP的掺入。在每种情况下，放射标记rNTP，并且其以100μM存在，其余dNTPs(对于rCTP为dAPT、dGTP和dTTP；对于dGTP为dATP、dCTP和dTTP；对于rUTP则为dATP、dCTP和dGTP)各以200μM存在。作为标准，也测量每种酶掺入相应的[α-32P]dNTP的浓度。除开每种[α-32P]rNTP由100μM的相应的[α-32P]dNTP替代外，用于这些测定的测试混合物与上述测定rNTP掺入的测试混合物相同。通过于2-8℃下在10mM Tris-HCl，pH 7.2，5mM MgCl2中温育96小时，将由Wothington Biochemical(Frechold，NJ)购得的1g/l的原鲑精DNA激活。然后分别加入EDTA和NaCl至12.5mM和0.1M。然后用酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀，并再悬浮于10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5中。再对同样的缓冲液渗析。
把每种45微升的反应混合物等分到5个0.5ml试管(如微量离心管)中，用于每种5′-标记核苷酸的前体。因而，一式二份分析每种G46D Taq和G46D、E615G Taq，并保留一管作为反对照。用5μl的G46D Taq聚合酶(0.02单位)或G46D、E615G Taq(0.002单位)引发每一测试混合物的两管中的聚合反应。向反对照反应物中加入5μl酶稀释的缓冲液而不是酶来作为用于背景水平的对照。
将每一反应物简单混合，并于75℃下温育10分钟。通过加入10μl 60mM的EDTA结束该反应，并存放于冰上。对于每一样品，用1ml 2mM EDTA、50μg/ml剪切过的鲑精DNA来稀释60μl反应物的各个50μl的等份。以标准方法，用三氯醋酸(TCA)沉淀DNA，并将其收集到GF/C滤纸片上(Whatman，Kent，England)。通过液体闪烁光谱测定法定量掺入[α-32P]标记核苷酸或核糖核苷酸的量，然后计算掺入的皮摩尔数。将由每种酶掺入的每种rNTP的皮摩尔数归一到由每一种酶掺入的相应的[α-32P]dNTP的皮摩尔数。将得到的数据表示如下。
关于G46D和G46D、E615G Taq酶的rNTP∶dNTP掺入比值
酶                          掺入的皮摩尔数(百分数)
        dATP     rATP   dCTP    rCTP    dGTP    rGTP    dTTP     rUTP
G46D    27.74    0.052    34.6     0.76     36.94    0.133    28.79      0
        (100％)  (0.18％) (100％)  (0.22％) (100％)  (0.36％) (100％)   (0)
G46D，  0.67     1.41     2.82     5.33     3.27     5.96     0.688      0.545
E615G
        (100％)  (210％)  (100％)  (189％)  (100％)  (181％)  (100％)   (79％)
结果表明，与G46D Taq酶相比，G46D、E615G Taq酶掺入核糖核苷酸的效率要高500倍以上(例如，对于rGTP，效率高181∶0.36＝502倍，对于rCTP，效率高189∶0.22＝859倍，以及对于rATP，效率高210∶0.18＝1166倍)。因此，聚合酶基因中第615位密码的错义突变，产生了新的表型：一种热稳定DNA聚合酶，除了掺入脱氧核苷酸外，其能有效掺入核糖核苷酸。
实施例III   分析比较掺入3′脱氧ATP(3′脱氧腺苷三磷酸)的效率
通过测量每种酶在限定的酶浓度下向激活的鲑精DNA模板中掺入的[α-32P]3′-脱氧腺苷三磷酸的量，来测定G46D；G46D，E615G；G46D，E615G，F667Y和G46D、F667Y Taq酶掺入-脱氧腺苷5′-三磷酸(3′-脱氧腺苷三磷酸)的相对能力。为测量[α-32P]3′-脱氧腺苷三磷酸的掺入，组成测试混合物，使得在50μl反应体积中终浓度为：12.5μg激活的鲑精DNA、200μM的每种dCTP、dGTP和dTTP，50μM dATP(Perkin Elmer)、50μM[α-32P]-3′dATP/3′dATP(New England Nuclear，Sigma)、1mM 3-巯基乙醇、25mMN-三[羟甲基]甲基-3′-氨基-丙磺酸(TAPS)(pH 9.5，20℃)、55mM KCl和2.25mM MgCl2。
把45μl的每一反应混合物等分到9个0.5ml的管中，然后一式二份用G46D；G46D，E615G；G46D，E615G，F667Y或G46D F667Y Taq酶处理每一反应物，并保留一管作为无酶对照。用5μl(0.058单位)的G46DTaq聚合酶引发两管测试混合物中的聚合反应。同样，用G46D，E615G Taq酶(0.0025单位)，G46D，E615G，F667Y Taq酶(0.0034单位)或G46D，F667YTaq酶(0.083单位)引发各反应。保留的一管用酶的稀释缓冲液而不用酶来引发反应，作为背景水平的对照。
将各种反应物简单混合，于75℃下温育10分钟。通过加入10μl 60mMEDTA结束该反应并存放反应物于冰上。对于每一样品，用1ml 2mM EDTA，50μg/ml剪切过的鲑精DNA稀释60μl反应物的50μl的那份。用标准方法，以TCA沉淀DNA，并收集到GF/C滤纸片上(Whatman，Kent，England)。通过液体闪烁光谱测定法定量掺入的[α-32P]标记核苷酸的量，然后计算掺入的皮摩尔数。用测定中所用的每种酶的单位数去除每种酶掺入的[α-32P]3′-脱氧腺苷三磷酸的皮摩尔数，得到每一单位的酶掺入的皮摩尔数。
数据表示如下。 由G46D；G46D，E615G；G46D，E615G，F667Y和
       G46D、F667Y Taq酶掺入[α- 32 P]-3′脱氧腺苷三磷酸
      酶                        每单位酶掺入的皮摩尔数
      G46D                             0.221
      G46D，E615G                      1.56
      G46D，E615G，F667Y               893.6
      G46D、F667Y                      0.74
这些结果表明E615G和F667Y突变都是把3′-脱氧腺苷三磷酸分子有效掺入到DNA中所必需的。
实施例IV 使用G46D，E615G Taq DNA聚合酶的碱裂解DNA测序
这一实施例利用rNTP部分替代的DNA证实了本发明的修饰聚合酶对于碱裂解测序的用途。反应混合物中的rNTP∶dNTP的比值在1∶80和1∶8之间。引物延伸反应在一种缓冲液中进行，该缓冲液的组成为：50mM N-二(羟乙基)甘氨酸(N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸；pH8.3)、25mM KOAc和2.5mMMgCl2。进行4种独立的反应，关于4种rNTPs中的每一种有一种反应。每一反应物(50μl)含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP(Perkin-Elmer)各200μM，并含有0.09皮摩尔的与5′[α-32P]标记的DG48(Lawyer等人，1993，“PCR方法和用途”(PCR Methods and Applications)，2：275-287)退火的MBm18的单链DNA模板(Perkin-Elmer)。这些反应物中还分别含有2.5，2.5，2.5或25μM的rATP、rCTP、rGTP或rUTP。
通过加入7个单位的G46D E615G Taq DNA聚合酶引发4种反应中的每一种反应，并于75℃下温育10分钟。通过加入10μl 60mMEDTA来结束各反应，并存放于冰上。将每一反应物的20μl加入80μl缓冲液中，该缓冲液中有50mM N-二(羟乙基)甘氨酸(pH8.3)，25mM KOAc，和2.5mM MgCl2。通过加入7μl的1N NaOH，产生裂解产物，于98℃下温育15分钟。加入7μl 1N的HCl中和这些反应。以加入312μl 95％乙醇和10μl 3M醋酸钠(pH4.8)沉淀各反应物。将反应物微量离心15分钟以收集沉淀，除去上清液，将所得颗粒用500μl 70％乙醇洗涤并干燥。把每颗粒重悬浮于5μl的0.5倍终止缓冲液(可由Perkin Elmer，Norwalk CT购得，其含有95％甲酰胺，20mMEDTA和0.05％溴酚兰)中，于98℃下加热3分钟，并直接加样到已经预电泳的6％聚丙烯酰胺/8M脲DNA测序胶上并电泳。将凝胶干燥并对x射线胶片曝光。得到的胶片显示出清晰的测序梯，其提供了超过100个碱基的正确序列。
实施例V   用G46D，E615G，F667Y Taq DNA聚合酶和3′脱氧核苷三 磷酸进行DNA测序
这一实施例证实了通过用3′脱氧核苷三磷酸将修饰的聚合酶G46D，E615G，F667Y Taq酶用于DNA测序的用途。这一实验是通过用3′脱氧腺苷三磷酸进行的，但是也可以将其推广至使用其他3′脱氧核苷酸。引物延伸反应在缓冲液中进行，该缓冲液含有50mM N-二(羟乙基)甘氨酸(pH 8.3)，25mM KOAc和2.5mM MgCl2。每一反应物(50μl)具有dATP、dCTP、dGTP和dTTP(Perkin-Itmer)各200μM，并具有0.09皮摩尔的与5′-[α-32P]标记DG48(Lawytr等人，1993，“PCR方法和用途”(PCR Methods and Application)，2：275-287)退火的MB mp18的单链DNA模板(Perkin-Elmer)。这些反应物中还具有0，0.1，0.25，0.5，1或5μM的3′脱氧腺苷三磷酸。
通过加入7个单位的G46D，E615G F667Y Taq DNA聚合酶来引发各反应，并于75℃下温育10分钟。通过加入10μl 60mM EDTA来终止反应，并置于冰上。把每种反应物的30μl用乙醇沉淀，并将沉淀重悬于终止缓冲液，于98℃下加热3分钟，直接加样到经预电泳的6％聚丙烯酰胺/8M脲DNA测序胶上，并电泳。将胶干燥，对X射线胶片曝光。反应物中有3′-脱氧腺苷三磷酸的泳道含有可看清楚的终止梯。含有最多的(即5μM)3′-脱氧腺苷三磷酸的泳道显示出的终止梯中，平均来说，该泳道中的区带长度比3′-脱氧腺苷三磷酸浓度低的泳道中的区带长度要短。反应物中没有3′-脱氧腺苷三磷酸的泳道几乎全部显示出全长度产物而无终梯。这些结果表明，突变的酶能掺入3′-脱氧腺苷三磷酸，并且这种分子掺入到引物延伸产物中导致终止。也可以用3′脱氧胞苷三磷酸、3′脱氧鸟苷三磷酸和3′脱氧脲苷三磷酸，来将这一方法用来产生DNA测序梯。
实施例VI   使用G46D，E615G，Taq DNA聚合酶的染料引物PCR测序
这一实施例证实了通过在PCR中以rNTP∶dNTP比值不大于1∶30使用核糖核苷三磷酸(rNTPs)来将本发明的修饰聚合酶用于染料引物测序的用途。进行4种独立的反应，对于每种rNTP有一种反应。在含有25mMTris-HCl(pH9)，5.0mM MgCl2和10％甘油(V/V)的缓冲液中，进行PCR测序反应。每一反应物还含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各500μM(Perkin Elmer)、5×106拷贝/μl的用XmnI限制内切酶线性化的pBSM 13+质粒(Stratagene)模板、和0.05单位/μl G46D E615G Taq DNA聚合酶。腺嘌呤核糖核苷三磷酸反应物(10μl)中有2.5μM腺苷三磷酸(Pharmacia Biotech)、0.1μM JOE M13反向染料引物(Perkin Elmer)和0.1μM ASC46(5′-CGCCATTCGCCATTCAG)。胞嘧啶核糖核苷三磷酸反应物(10μl)含有2.5μM胞苷三磷酸(PharmaciaBiotech)、0.1μM FAM M13反向染料引物(Perkin Elmer)、和0.1μM引物ASC46。鸟嘌呤核糖核苷三磷酸反应物(20μl)中含有2.5μM鸟苷三磷酸(Pharmacia Biotech.)、0.1μM的TAMRA M13反向染料引物(Perkin Elmer)和0.1μM引物ASC46。尿嘧啶核糖核苷三磷酸反应物(20μl)中含有16μM尿苷三磷酸(Pharmacia Biotech)、0.1μM ROX MB反向染料引物(Perkin Elmer)和0.1μM引物ASC 46。
将4种反应物中的每一种置于预热(75℃)的Perkin Elmer Gene AmpPCR System 9600热循环控制装置中，使之处于95℃下10秒钟，55℃下10秒钟，1分钟直线上升至65℃，65℃下5秒钟，循环30次。腺嘌呤核糖核苷三磷酸和胞嘧啶核糖三磷酸反应各产生6×1011拷贝的染料标记的300个碱基对的扩增产物，鸟嘌呤核糖核苷三磷酸和尿嘧啶核糖核苷三磷酸反应各产生1.2×1012拷贝的染料标记的300个碱基对的扩增产物。
为测定扩增的PCR产物的DNA序列，同时又不需单独的酶促DNA测序反应，如下所述将反应物混合、用碱和热处理，中和并沉淀。将腺苷三磷酸和胞苷三磷酸反应物各4μl和鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸反应物各8μl混合。向混合的反应物中加入2μl的0.25μM EDTA(pH8.0)(10mM终浓度)、10μl 1M NaOH(200mM终浓度)和14μl H2O，并于95℃下于Gene AmpPCRSystem 9600热循环控制装置中温育5分钟，用10μl 1M HCl中和。通过加入150μl 95％乙醇，再于4℃下温育15分钟沉淀混合的反应物。然后于4℃下微量离心收集沉淀，通过抽气除去上清液。用300μl 70％乙醇洗涤沉淀，微量离心5分钟，抽气除去上清液，并干燥沉淀。将沉淀重悬于6μl甲酰胺50mg/ml蓝色葡聚糖(于25mM EDTA中)5∶1(V/V)，并于90℃下加热3分钟。将1.5μl重悬浮的沉淀直接加样至预电泳的5％Long Ranger(FMCBioproducts)，6M脲测序胶上。然后电泳，并根据生产商的说明书于PerkinElmer ABI Prism TM 377DNA Sequencer上分析。通过Porkin Elmer ABI PrismTM序列分析软件的自动碱基调度，结果是对PCR扩增的300碱基对产物的DNA序列测定的准确度大于99％。
                           序列表
(1)一般信息
    (i)申请人
         (A)名称：F.Hoffmann-La Roche Ltd
         (B)街道：Grenzacherstrasse 124
         (C)城市：Basel
         (D)洲：BS
         (E)国家：Switzerland
         (F)邮编：(zip)：CH-4070
         (G)电话：(0)61 688 24 03
         (H)传真：(0)61 688 13 95
         (I)电报：962292/965512 hIr ch
    (ii)发明名称：改进的热稳定DNA聚合酶
    (iii)序列数目：8
    (iv)计算机可读形式：
         (A)媒介类型：软盘
         (B)计算机：IBM PC兼容
         (C)操作系统：PC-DOS/Ms-DOS
         (D)软件：Patent In Release#1.0，#1.30版(EPO)
    (vi)在先申请资料：
         (A)申请号：US 60/023,376
         (B)申请日：06-AUG-1996
(2)序列1的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：7个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (ix)特征：
         (A)名称/关键词：肽
         (B)位置：4
         (D)其他资料：/标记＝Xaa
                /提示＝“其中Xaa是任何氨基酸而不是Glu”
    (ix)特征：
         (A)名称/关键词：肽
         (B)位置：7
         (D)其他信息：/标记＝Xaa
               /提＝“其中Xaa是Ile或Val”
    (xi)序列描述：序列1
Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa
1                 5
(2)序列2的信息
    (i)序列特征：
         (A)长度：7个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (ix)特征：
         (A)名称/关键词：肽
         (B)位置：7
         (D)其他信息：/标记＝Xaa
                /提示＝“其中Xaa是Ile或者Val”
    (xi)序列描述：序列2
Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa
1               5
(2)序列3的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：7个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：序列3
Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val
1               5
(2)序列4的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：7个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：序列4
Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile
1               5
(2)序列5的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：15个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：序列5
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser
1                5                   10                  15
(2)序列6的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：15个氨基酸
         (B)类型：氨基酸
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：序列6
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser
1                5                   10                  15
(2)序列7的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：2626碱基对
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓朴结构：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假定结构：无
    (iv)反义链：无
    (Vi)来源：
         (A)微生物：栖热水生菌(Thermus aquaticus)
    (ix)特征：
         (A)名称/关键词：CDS
         (B)位置：121..2616
    (xi)序列描述：序列7
AAGCTCAGAT CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC GAGGGGGAGA    60
GGGAGGCGTT TCTAAAAGCC CTTCAGGACG CTACCCGGGG GCGGGTGGTG GAAGGGTAAC    120
ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC CTG      168
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
  1               5                  10                  15
GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG AAG GGC      216
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
             20                  25                  30
CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC      264
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
         35                  40                  45
AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC GCG GTG ATC GTG      312
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
     50                  55                  60
GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GGG GGG      360
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
 65                  70                  75                  80
TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG GAC TTT CCC CGG CAA CTC      408
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
                 85                  90                  95
GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG      456
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
            100                 105                 110
GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG      504
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
        115                 120                 125
GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC      552
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
    130                 135                 140
CTT TAC CAG CTC CTT TCC GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG      600
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145                 150                 155                 160
TAC CTC ATC ACC CCG GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC      648
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
                165                 170                 175
GAC CAG TGG GCC GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC      696
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
            180                 185                 190
CTT CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG      744
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
        195                 200                 205
GAG GAG TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG      792
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
    210                 215                 220
AAG CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG      840
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225                 230                 235                 240
CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG       888
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
                245                 250                 255
GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG AGG CTT AGG GCC TTT       936
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
            260                 265                 270
CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG       984
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
        275                 280                 285
GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG       1032
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
    290                 295                 300
GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG CCC ATG TGG GCC GAT       1080
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305                 310                 315                 320
CTT CTG GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC CGG GTC CAC CGG GCC CCC       1128
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
                325                 330                 335
GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC       1176
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
            340                 345                 350
GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC CTG AGG GAA GGC CTT GGC CTC CCG       1224
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
        355                 360                 365
CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC       1272
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
    370                 375                 380
ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG       1320
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385                 390                 395                 400
GAG GCG GGG GAG CGG GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG       1368
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
                405                 410                 415
TGG GGG AGG CTT GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG       1416
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
            420                 425                 430
GTG GAG AGG CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG       1464
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
        435                 440                 445
GTG CGC CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC       1512
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
    450                 455                 460
GAG GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC      1560
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465                 470                 475                 480
CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT GAC      1608
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
                485                 490                 495
GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC AAG CGC      1656
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
            500                 505                 510
TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC CAC CCC ATC      1704
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
        515                 520                 525
GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG CTG AAG AGC ACC      1752
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
    530                 535                 540
TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC AGG ACG GGC CGC CTC      1800
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545                 550                 555                 560
CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGC AGG CTA AGT AGC      1848
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
                565                 570                 575
TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG      1896
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
            580                 585                 590
AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC      1944
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
        595                 600                 605
CTG GAC TAT AGC CAG ATA GGG CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC      1992
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
    610                 615                 620
GAC GAG AAC CTG ATC CGG GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG      2040
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625                 630                 635                 640
GAG ACC GCC AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC      2088
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
                645                 650                 655
CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC      2136
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
            660                 665                 670
ATG TCG GCC CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG      2184
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
        675                 680                 685
GCC CAG GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG      2232
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
    690                 695                 700
GCC TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG      2280
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705                 710                 715                 720
GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC CGG      2328
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
                725                 730                 735
GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC      2376
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
            740                 745                 750
GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT ATG GTG AAG CTC      2424
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
        755                 760                 765
TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC CTT CAG GTC CAC      2472
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
    770                 775                 780
GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG GCG GAG GCC GTG GCC      2520
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785                 790                 795                 800
CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG TAT CCC CTG GCC GTG CCC      2568
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
                805                 8l0                 815
CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG      2616
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
            820                 825                 830
TGATACCACC                                                           2626
(2)序列8的信息：
    (i)序列特征：
          (A)长度：832个氨基酸
          (B)类型：氨基酸
          (D)拓朴结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (vi)序列描述：序列8
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
  1               5                  10                  15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
             20                  25                  30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
         35                  40                  45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
     50                  55                  60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
                 85                  90                  95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
            100                 105                 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
    130                 135                 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
                165                 170                 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
            180                 185                 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
        195                 200                 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
    210                 215                 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225                 230                 235                 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
                245                 250                 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
            260                 265                 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
        275                 280                 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
    290                 295                 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305                 310                 315                 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
                325                 330                 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
            340                 345                 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
        355                 360                 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
    370                 375                 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385                 390                 395                 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
                405                 410                 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
            420                 425                 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
        435                 440                 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
    450                 455                 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465                 470                 475                 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
                485                 490                 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
            500                 505                 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
        515                 520                 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
    530                 535                 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545                 550                 555                 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
                565                 570                 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
            580                 585                 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
        595                 600                 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
    610                 615                 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625                 630                 635                 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
                645                 650                 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
            660                 665                 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
        675                 680                 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
    690                 695                 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705                 710                 715                 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
                725                 730                 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
            740                 745                 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
        755                 760                 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
    770                 775                 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785                 790                 795                 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
                805                 810                 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
            820                 825                 830

Claims (41)

1.一种重组热稳定DNA聚合酶，其特征在于该聚合酶是天然产生的热稳定DNA聚合酶的突变体形式，其中所述天然产生的热稳定DNA聚合酶含有序列2所示的氨基酸序列基序SerGlnIleGluLeuArgXaa，其中这一序列基序中第7位的“Xaa”是缬氨酸残基Val或异亮氨酸残基Ile；其中所述突变体形式在所述序列基序的第4位包含除谷氨酸残基Glu以外的氨基酸；并且其中所述突变体形式与所述天然产生的热稳定DNA聚合酶相比，表现出对掺入的非常规核苷酸的识别排斥减少。
2.权利要求1的热稳定DNA聚合酶，其中所述除谷氨酸残基Glu以外的氨基酸选自：甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，亮氨酸或丙氨酸。
3.权利要求1的热稳定DNA聚合酶，其特征在于：与所述的相应天然类型聚合酶相比，所述聚合酶掺入非常规核苷酸的能力增加了20倍或20倍以上。
4.权利要求1-3任一项的热稳定DNA聚合酶，其特征在于：所述聚合酶有足够的用于DNA测序反应的活性，该测序反应包括有一种非常规核苷酸和相应常规核苷酸，它们的比例为1∶1或小于1∶1。
5.权利要求4的热稳定DNA聚合酶，其中所述非常规核苷酸为核糖核苷三磷酸。
6.权利要求1-3任一项的热稳定DNA聚合酶，其特征在于所述聚合酶有足够的用于DNA测序反应的活性，该反应中有一种非常规核苷酸，该非常规核苷酸是以0.1-100μM的浓度存在的核糖核苷三磷酸；该反应中还有一种相应的常规核苷酸，该常规核酸以50-500μM的浓度存在。
7.权利要求6的热稳定DNA聚合酶，其中所述非常规核苷酸的浓度为2.5-50μM。
8.权利要求7的热稳定DNA聚合酶，其中所述非常规核苷酸的浓度为2.5-25μM。
9.权利要求6的热稳定DNA聚合酶，其中所述常规核苷酸的浓度为100-500μM。
10.权利要求9的热稳定DNA聚合酶，其中所述常规核苷酸的浓度为100-300μM。
11.权利要求1-3任一项的热稳定DNA聚合酶，该酶为一种微生物的天然产生的热稳定DNA聚合酶的重组衍生物，该微生物选自栖热水生菌(Thermus aquaticus)、亲硝卤水栖热菌(Thermus caldophilus)、Thermuschliarophilus、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermus flavus)、Thermus oshimai、红色栖热菌(Thermus ruber)、Thermus scotoductus、Thermussivlanus、栖热菌种ZO5(Thermus species ZO5)、栖热菌种Sps17(Thermusspecies sps17)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermotoga maritima、Thermotoga neopolitana、Thermosipho africanus、嗜热厌氧菌(Anaerocellumthermophilum)、Bacillus caldotenax和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。
12.权利要求4的热稳定DNA聚合酶，该酶为一种微生物的天然产生的热稳定DNA聚合酶的重组衍生物，该微生物选自栖热水生菌(Thermusaquaticus)、亲硝卤水栖热菌(Thermus caldophilus)、Thermus chliarophilus、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermus flavus)、Thermusoshimai、红色栖热菌(Thermus ruber)、Thermus scotoductus、Thermus sivlanus、栖热菌种ZO5(Thermus species ZO5)、栖热菌种Sps17(Thermus speciessps17)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermotoga maritima、Thermotoganeopolitana、Thermosipho africanus、嗜热厌氧菌(Anaerocellumthermophilum)、Bacillus caldotenax和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。
13.权利要求6的热稳定DNA聚合酶，该酶为一种微生物的天然产生的热稳定DNA聚合酶的重组衍生物，该微生物选自栖热水生菌(Thermusaquaticus)、亲硝卤水栖热菌(Thermus caldophilus)、Thermus chliarophilus、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermus flavus)、Thermusoshimai、红色栖热菌(Thermus ruber)、Thermus scotoductus、Thermus sivlanus、栖热菌种ZO5(Thermus species ZO5)、栖热菌种Sps17(Thermus speciessps17)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermotoga maritima、Thermotoganeopolitana、Thermosipho africanus、嗜热厌氧菌(Anaerocellumthermophilum)、Bacillus caldotenax和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。
14.权利要求1-3任一项的热稳定DNA聚合酶，其为栖热菌属(Thermus)的天然热稳定DNA聚合酶的重组衍生物。
15.权利要求14的热稳定DNA聚合酶，其中所述天然热稳定DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或其同源聚合酶。
16.权利要求14的热稳定DNA聚合酶，其中所述天然热稳定DNA聚合酶为具有序列5所示氨基酸序列LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer的热稳定DNA聚合酶。
17.权利要求4的热稳定DNA聚合酶，其为栖热菌属(Thermus)的天然热稳定DNA聚合酶的重组衍生物。
18.权利要求17的热稳定DNA聚合酶，其中所述天然热稳定DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或其同源聚合酶。
19.权利要求17的热稳定DNA聚合酶，其中所述天然热稳定DNA聚合酶为具有序列5所示氨基酸序列LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer的热稳定DNA聚合酶。
20.权利要求6的热稳定DNA聚合酶，其为栖热菌属(Thermus)的天然热稳定DNA聚合酶的重组衍生物。
21.权利要求20的热稳定DNA聚合酶，其中所述天然热稳定DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或其同源聚合酶。
22.权利要求20的热稳定DNA聚合酶，其中所述天然热稳定DNA聚合酶为具有序列5所示氨基酸序列LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer的热稳定DNA聚合酶。
23.一种核酸序列，其编码权利要求1的热稳定DNA聚合酶。
24.一种载体，其含有权利要求23的核酸序列。
25.一种宿主细胞，其含有权利要求23的核酸序列。
26.一种用于制备热稳定DNA聚合酶的方法，其包括：
(a)于促进该热稳定DNA聚合酶表达的条件下培养权利要求25的宿主细胞；并且
(b)从该宿主细胞或培养基中分离热稳定DNA聚合酶。
27.一种热稳定DNA聚合酶，其通过权利要求26的方法制备。
28.权利要求1的热稳定DNA聚合酶在核酸扩增反应或测序反应中的用途。
29.一种用于DNA测序反应的组合物，其包含有：一种核酸模板、一种与所述模板互补的寡核苷酸引物、一种如权利要求1要求的热稳定DNA聚合酶、常规dNTPs的混合物以及至少一种非常规核苷酸，其中所述非常规核苷酸与所述相应常规核苷酸的比值为1∶1或小于1∶1。
30.权利要求29的组合物，其中所述非常规核苷酸是一种核糖核苷酸，由此所述核糖核苷酸以0.1-100μM的浓度存在，并且相应常规核苷酸以50-500μM的浓度存在。
31.权利要求30的组合物，其中所述非常规核苷酸的浓度为2.5-50μM。
32.权利要求31的组合物，其中所述非常规核苷酸的浓度为2.5-25μM。
33.权利要求30的组合物，其中所述常规核苷酸的浓度为100-500μM。
34.权利要求33的组合物，其中所述常规核苷酸的浓度为100-300μM。
35.权利要求29-34任一项的组合物，其特征还在于所述非常规核苷酸是未标记的。
36.一种用于对靶核酸测序的方法，该方法包括步骤：
(a)在DNA测序反应中，提供一种非常规核苷酸和一种相应的常规核苷酸，其中所述非常规核苷酸和相应的常规核苷酸以小于大约1∶1的比例存在；
(b)在有权利要求1的热稳定DNA聚合酶存在下，在用于引物延伸的条件下处理步骤(a)的反应物，以产生含有所述非常规核苷酸的引物延伸产物；
(c)在用于杂交所述引物延伸产物的条件下，处理步骤(b)的引物延伸产物；
(d)分离步骤(c)的反应产物；并且
(e)测定靶核酸的序列。
37.权利要求36的测序方法，其中所述非常规核苷酸是一种核糖核苷酸。
38.权利要求37的测序方法，其中所述核糖核苷酸以大约0.1μM-100μM的浓度存在。
39.权利要求36的测序方法，其中所述相应的常规核苷酸以大约50μM-500μM的浓度存在。
40.一种用于核酸测序的试剂盒，其含有权利要求1的热稳定DNA聚合酶，并且含或不含可用于上述测序方法的反应剂，该反应剂如一种或多种寡核苷酸引物、常规dNTPs的混合物和至少一种非常规核苷酸。
41.权利要求40的试剂盒，其中其中所述非常规核苷酸与所述相应常规核苷酸的比值小于1。
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