CZ229997A3 - Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje - Google Patents
Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ229997A3 CZ229997A3 CZ972299A CZ229997A CZ229997A3 CZ 229997 A3 CZ229997 A3 CZ 229997A3 CZ 972299 A CZ972299 A CZ 972299A CZ 229997 A CZ229997 A CZ 229997A CZ 229997 A3 CZ229997 A3 CZ 229997A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- leu
- dna polymerase
- sequence
- thermostable dna
- glu
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 title claims abstract description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 92
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 85
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 60
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 47
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 45
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 39
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims abstract description 19
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims abstract description 13
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 66
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 43
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 42
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 26
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 25
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 20
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 15
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 14
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 claims description 6
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 claims description 5
- 241001455623 Anaerocellum Species 0.000 claims description 4
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 4
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 241000589496 Meiothermus ruber Species 0.000 claims description 2
- 241000508289 Meiothermus silvanus Species 0.000 claims description 2
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 claims description 2
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 claims description 2
- 241000557726 Thermus oshimai Species 0.000 claims description 2
- 241001522143 Thermus scotoductus Species 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims 2
- 241000508310 Meiothermus chliarophilus Species 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 abstract description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 14
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 abstract description 4
- 102200023384 rs587777213 Human genes 0.000 description 44
- 239000002585 base Substances 0.000 description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 11
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 10
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 9
- OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N cordycepin Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)C[C@H]1O OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N 0.000 description 8
- OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N cordycepine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)CC1O OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 8
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KQLDDLUWUFBQHP-UHFFFAOYSA-N Cordycepin Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OCC(CO)C1O KQLDDLUWUFBQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- NLIHPCYXRYQPSD-VGIXGZPDSA-N cordycepin triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1O[C@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)C[C@@H]1O NLIHPCYXRYQPSD-VGIXGZPDSA-N 0.000 description 7
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 7
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N Leu-Ala-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 6
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 5
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- -1 ribonucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 5
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- LPXHYGGZJOCAFR-MNXVOIDGSA-N Ile-Glu-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N LPXHYGGZJOCAFR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 4
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SUPVSFFZWVOEOI-UHFFFAOYSA-N Leu-Ala-Tyr Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SUPVSFFZWVOEOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 3
- JAGGEZACYAAMIL-CQDKDKBSSA-N Tyr-Lys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N JAGGEZACYAAMIL-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N dITP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N Ala-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 2
- YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 2
- SBVJJNJLFWSJOV-UBHSHLNASA-N Arg-Ala-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SBVJJNJLFWSJOV-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N Arg-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N Arg-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 2
- PPCORQFLAZWUNO-QWRGUYRKSA-N Asn-Phe-Gly Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PPCORQFLAZWUNO-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ZSVJVIOVABDTTL-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZSVJVIOVABDTTL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N Asp-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- PBFGQTGPSKWHJA-QEJZJMRPSA-N Glu-Asp-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O PBFGQTGPSKWHJA-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- HZISRJBYZAODRV-XQXXSGGOSA-N Glu-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HZISRJBYZAODRV-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- SFKMXFWWDUGXRT-NWLDYVSISA-N Glu-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O SFKMXFWWDUGXRT-NWLDYVSISA-N 0.000 description 2
- HMHRTKOWRUPPNU-RCOVLWMOSA-N Gly-Ile-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O HMHRTKOWRUPPNU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- SYMSVYVUSPSAAO-IHRRRGAJSA-N His-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SYMSVYVUSPSAAO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- VYUXYMRNGALHEA-DLOVCJGASA-N His-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VYUXYMRNGALHEA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- LVXFNTIIGOQBMD-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LVXFNTIIGOQBMD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 2
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SUPVSFFZWVOEOI-CQDKDKBSSA-N Leu-Ala-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SUPVSFFZWVOEOI-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- LAGPXKYZCCTSGQ-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LAGPXKYZCCTSGQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N Leu-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N Leu-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PKKMDPNFGULLNQ-AVGNSLFASA-N Leu-Met-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O PKKMDPNFGULLNQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- ZXFRGTAIIZHNHG-AJNGGQMLSA-N Lys-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ZXFRGTAIIZHNHG-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- YORIKIDJCPKBON-YUMQZZPRSA-N Met-Glu-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YORIKIDJCPKBON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- KRLKICLNEICJGV-STQMWFEESA-N Met-Phe-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRLKICLNEICJGV-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026123 Pirin Human genes 0.000 description 2
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 2
- HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N Ser-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CC=CC=C1 JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 2
- HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- WVRUKYLYMFGKAN-IHRRRGAJSA-N Tyr-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WVRUKYLYMFGKAN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- QHLIUFUEUDFAOT-MGHWNKPDSA-N Tyr-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QHLIUFUEUDFAOT-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 2
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 108010001271 arginyl-glutamyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- SMYNOPZGCCLROM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[1-hydroxy-4-[4-[hydroxy(diphenyl)methyl]piperidin-1-yl]butyl]phenyl]-2-methylpropanal Chemical compound CC(C)(C=O)c1ccc(cc1)C(O)CCCN1CCC(CC1)C(O)(c1ccccc1)c1ccccc1 SMYNOPZGCCLROM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJHOBIUAJLDRDQ-UUOKFMHZSA-N 2-hydroxy-ATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(O)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O DJHOBIUAJLDRDQ-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FSBCNCKIQZZASN-GUBZILKMSA-N Ala-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FSBCNCKIQZZASN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NYDBKUNVSALYPX-NAKRPEOUSA-N Ala-Ile-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NYDBKUNVSALYPX-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- WZGZDOXCDLLTHE-SYWGBEHUSA-N Ala-Trp-Ile Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 WZGZDOXCDLLTHE-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 1
- XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N Arg-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YUIGJDNAGKJLDO-JYJNAYRXSA-N Arg-Arg-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YUIGJDNAGKJLDO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- QAODJPUKWNNNRP-DCAQKATOSA-N Arg-Glu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QAODJPUKWNNNRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NKBQZKVMKJJDLX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SYAUZLVLXCDRSH-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N SYAUZLVLXCDRSH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- FLYANDHDFRGGTM-PYJNHQTQSA-N Arg-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FLYANDHDFRGGTM-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JOADBFCFJGNIKF-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JOADBFCFJGNIKF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WCZXPVPHUMYLMS-VEVYYDQMSA-N Arg-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WCZXPVPHUMYLMS-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WSOKZUVWBXVJHX-CIUDSAMLSA-N Asp-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WSOKZUVWBXVJHX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WBDWQKRLTVCDSY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N Asp-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HCOQNGIHSXICCB-IHRRRGAJSA-N Asp-Tyr-Arg Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)O HCOQNGIHSXICCB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102100037293 Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710150192 Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100505076 Caenorhabditis elegans gly-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N Glu-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N Glu-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QYPKJXSMLMREKF-BPUTZDHNSA-N Glu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QYPKJXSMLMREKF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZWABFSSWTSAMQN-KBIXCLLPSA-N Glu-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZWABFSSWTSAMQN-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- QMOSCLNJVKSHHU-YUMQZZPRSA-N Glu-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O QMOSCLNJVKSHHU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FUTAPPOITCCWTH-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FUTAPPOITCCWTH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N Gly-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N Gly-Thr-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- UVTSZKIATYSKIR-RYUDHWBXSA-N Gly-Tyr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UVTSZKIATYSKIR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSLXGYMEHVAJBH-DLOVCJGASA-N His-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VSLXGYMEHVAJBH-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- TVQGUFGDVODUIF-LSJOCFKGSA-N His-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N TVQGUFGDVODUIF-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N Leu-His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HNDWYLYAYNBWMP-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N Leu-Phe-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HWMQRQIFVGEAPH-XIRDDKMYSA-N Leu-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 HWMQRQIFVGEAPH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N Leu-Thr-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 101001090725 Leuconostoc gelidum Bacteriocin leucocin-A Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- DTUZCYRNEJDKSR-NHCYSSNCSA-N Lys-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN DTUZCYRNEJDKSR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RQILLQOQXLZTCK-KBPBESRZSA-N Lys-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O RQILLQOQXLZTCK-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- TUSOIZOVPJCMFC-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TUSOIZOVPJCMFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UYAKZHGIPRCGPF-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N UYAKZHGIPRCGPF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- TUZSWDCTCGTVDJ-PJODQICGSA-N Met-Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 TUZSWDCTCGTVDJ-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N Phe-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- RFEXGCASCQGGHZ-STQMWFEESA-N Phe-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RFEXGCASCQGGHZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 241000252565 Pseudothermotoga thermarum Species 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000589501 Thermus caldophilus Species 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N Thr-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- GYUUYCIXELGTJS-MEYUZBJRSA-N Thr-Phe-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O GYUUYCIXELGTJS-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C([O-])=O)=CNC2=C1 OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- OETOOJXFNSEYHQ-WFBYXXMGSA-N Trp-Ala-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 OETOOJXFNSEYHQ-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- OBAMASZCXDIXSS-SZMVWBNQSA-N Trp-Glu-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N OBAMASZCXDIXSS-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- HQJOVVWAPQPYDS-ZFWWWQNUSA-N Trp-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQJOVVWAPQPYDS-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- NXQAOORHSYJRGH-AAEUAGOBSA-N Trp-Gly-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 NXQAOORHSYJRGH-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N Tyr-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- NQJDICVXXIMMMB-XDTLVQLUSA-N Tyr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NQJDICVXXIMMMB-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- OLWFDNLLBWQWCP-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OLWFDNLLBWQWCP-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 241000193758 [Bacillus] caldotenax Species 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062266 glycyl-glycyl-argininal Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N leu-asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010012988 lysyl-glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- UPWHZOYYXHKXLQ-BGPJRJDNSA-N nucleoside triphosphate Chemical compound C[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UPWHZOYYXHKXLQ-BGPJRJDNSA-N 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Description
(57) Anotace:
Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SerGlnlleXaaLeuArgXaa /SEQ ID No:l/, kde Xaa v poloze 4 je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však Glu, a Xaa v poloze 7 zbytek Val nebo Ile. Tyto tepelně stálé DNA polymerázy mají zlepšenou účinnost v začleňování neobvyklých nukleotidů, jako jsou ribonukleotidy do produktů DNA a jsou výhodné v mnoha aplikacích syntézy in vitro. Obzvlášť se hodí pro protokoly sekvenční analyzy nukleových kyselin a poskytují nové prostředky pro sekvenční analyzy DNA s cenovými a účinnostními přednostmi. Nukleové kyseliny kódující takové polymerázy, vektory a hosticí buňky obsahující takové nukleové kyseliny i prostředky k použití v sekvenčních reakcích DNA, kity a způsoby sekvencování včetně takových polymer áz.
• · ·
- 1 • ·· ·· ····
Ol-1649-97-Ho
Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje
Ob1ast techni ky
Vynález se týká tepelně stálých polymeráz DNA, které mají zlepšenou schopnost začleňovat ribonukleosidové trifosfáty. Vynález se týká způsobu izolování takových polymeráz a zařízení k provádění tohoto způsobu. Enzymy podle vynálezu se hodí pro četná použití a zejména pro sekvencován! nukleových kyselin. Vynález se také týká způsobu analyzování sekvencí nukleových kyselin.
Dosavadní stav techniky
Sekvencování DNA obecně zahrnuje vytváření čtyř populací jednořetězcových fragmentů DNA, majících jedno vymezené zakončení a jedno proměnlivé zakončení. Proměnlivé zakončení končí obvykle u specifických nukleotidových bází (buď guaninu ( G1 , adeninu (Al, thymidinu (TI, nebo cytosinu (Cil. Každý ze čtyř rozdílných souborů fragmentů je oddělen na základě své délky. V jednom takovém postupu se používá polyakry1amidového gelu. Každý pruh takového gelu odpovídá specifickému nukleotidu v sekvenci DNA a tím identifikuje polohu v sekvenci.
Často používaným způsobem sekvencování DNA je dideoxy, nebo řetězec ukončující způsob sekvencování, který zahrnuje enzymatickou syntesu řetězce DNA (Sanger a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. 74, str. 5463, 19771. Obvykle probíhají čtyři oddělené syntesy, přičemž každá reakce končí na specifické bázi (G, A, T nebo Cl cestou začlenění jednohoho nukleotidu zakončujícího řetězec, jako je dideoxynukleotid. Produkty reakce lze snadno interpretovat, jelikož každá linie odpovídá pouze jedné z G, A, T nebo C.
Při způsobu sekvencování dideoxy ukončováním řetězce je • · · · · ·
- 2 teplotně připojen k jednoprovazcové matici krátký jednoprovazcový primer. Primer je prodloužen na svém 3 -konci začleněním deoxynukleotidů (dNTP), dokud se nezačlení dideoxynukleotid (ddNTP). Jakmile se začlení ddNTP, prodlužování v této bázi ustane. K zaručení věrnosti replikace DNA, mají polymerázy velmi silný sklon začleňovat své normální substráty, tedy dNTP, a oproti začleňování nukleotidových analogů se označují jako neobvyklé nukleotidy. V případě syntes DNA se považují ribonukleotidy (rNTP) za neobvyklé nukleotidy, jelikož podobně jako ddNTP nejsou rNTP normálním substrátem polymerázy DNA in vivo. V buňce tlumí tato vlastnost začleňování abnormálních bázi jako jsou deoxyinosintri fosfát (dITP) nebo rNTP v rostoucím řetězci DNA.
Dvěma často používanými automatizovanými způsoby sekvěncování jsou sekvencování dye-primer a dye-term inator . Tyto způsoby se hodí k použití s fluorescenčně značenými podíly. Ačkoli lze sekvencování provádět také s radioaktivně značenými podíly, dává se zvýšenou měrou přednost sekvencování založenému na f1uorescenci. Stručně řečeno, při sekvencování způsobem dye-primer se používá fluorescenčně značeného primeru v kombinaci s neznačeným ddNTP. Postup vyžaduje čtyři syntesní reakce a sekvencování až 4 linií gelu pro každou matrici (z nichž jedna odpovídá každému koncovému produktu pro specifickou bázi). Po rozšíření primeru se rutinním způsobem analyzují sekvencující reakční směsi obsahující dideoxynukleotidy začleněné koncové produkty elektroforézou na gelu sekvencujícím DNA. Po separaci elektroforézou, se laserem vybudí fluorescenčně značené produkty na dně gelu a fluorescence se detekuje vhodným monitorem. V automatizovaných systémech detektor snímá dno gelu v průběhu e1ektroforézy ke zjištění, jak velkého množství značeného podílu bylo použito, když reakční směs prochází gelovou matricí (Smith a kol. Nátuře 321 str. 674 až 679, 1986). V modifikaci tohoto způsobu se každý ze čtyř primerů značí odlišným fluorescenčním značením. Když se ukončí • · • · ··· · · · ····
- 3 čtyři oddělené sekvenční reakce, reakční směs se spojí a spojené reakční směsi se podrobí analyse gelu v jediné linii, přičemž se indivi duelně detekují rozdílné fluorescenční značky (z nichž jedna přísluší každému ze čtyř různých, pro bázi specifických koncových produktů).
Alternativně so používá způsobu dye - term inator” . Při tomto způsobu se používá polymerázy DNA k začlenění do dNTP a fluorescenčně značených ddNTP do rostoucího konce primeru DNA (Lee s kol. Nucleic Acid Research 20, str. 2471, 1992). Tento způsob má tu výhodu, že se nemusejí syntetizovat barevně značené primery. Kromě toho jsou dye-terminátové reakce výhodnější v tom, že všechny čtyři reakce lze provádět v téže zkumavce. Modifikované tepelně stálé polymerázy DNA se sníženou diskriminací vůči ddNTP byly popsány (zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo EP-A-655 506 a americká přihláška vynálezu číslo 08/448 223). Příkladně modifikovaná tepelně stálá polymeráza DNA je mutovanou formou polymerázy DNA od T. aquaticus mající tyrosinový zbytek v poloze 667 (místo fenylalaninového zbytku), je to tak zvaná F667Y mutovaná forma polymerázy Taq DNA. Ampli TaqRFS, vyráběná firmou Hoffmann-La Roche, obchodní produkt společností Perkin Elmer, redukuje množství ddNTP potřebné k účinnému sekvencovánf nukleové kyseliny se sto- až tisíci-násobným cílem. Ampli TaqRFS je mutovanou formou polymerázy DNA od T. aquaticus mající mutaci F667Y a přídavně zbytek asparagové kyseliny v poloze 46 (místo glyci nového zbytku; mutace G46D).
Existuje tedy potřeba tepelně stálých polymeráz DNA, které umožní alternativní způsoby syntesy nukleovych kyselin a levnou analysu sekvence nukleových kyselin DNA. Žádoucí by byly fluorescenční způsoby, které nevyžadují použití dideoxynukleotidů. Vynález je zaměřen na tyto potřeby.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je enzym tepelně stálé polymerázy DNA, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SerGlni1eXaaLeuftrgXaa (SEQ ID No:1), kden Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a “Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).
Vynález se týká na matrici závislých tepelně stálých DNA polymerázových enzymu, které zahrnují motiv aminokyselinové sekvence SerGlni1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:1), kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile). Při použití jednopísměnového kódu můše být tento sekvenční motiv zapsán jako SQ I XLRV/I, kde X v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny. Tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, mající aminokyselinovou sekvenci zahrnující tento sekvenční motiv, kde X v poloze 4 této sekvence není zbytek glutamové kyseliny, mají sníženou diskriminaci oproti začlenění ribonukleotidu v porovnání s dříve známými tepelně stálými polymerázami. V rostoucím řetězci DNA jsou ribonukleotidy neobvyklými nukleotidy. Tudíž, z prvního pohledu, začleňují nové enzymy podle vynálezu neobvyklé základní analogy, jako ribonukleot idy, do rostoucího řetězce DNA o několik řádů účinněji než dříve identifinované tepeně stálé DNA syntetizující enzymy. Vynález se také t^fká genů kódujících tyto enzymy, stejně jako rekombinantních expresních vektorů a hostících buněk obsahujících tyto vektory. U takových transformovaných hostících buněk mohou být zajištěna velká množství vyčištěných tepelně stálých polymerázových enzymů.
Vynálezem je definována oblast nebo sekvenční motiv • · · · · · · ·
- 5 v aminokyselinové sekvenci tepelně stálých DNA polymeráz, která zlepšuje účinnost schopnosti polymerázy začleňovat ribonukleotidy při zachování schopnosti spolehlivě začleňovat deoxyríbonukleotidy. Změny v této oblasti, například výměny jedné nebo několika kyselin (například zavedených mutagenesou specifickou pro místa), poskytují tepelně stálý polymerázový enzym, který je schopen syntetizovat chimérický nebo hybridní řetězec RNA nebo RNA/DNA na matrici DNA.
Vynález se dále týká zkepšených způsobu a prostředků k určování sekvence cílové nukleové kyseliny, přičemž je vyloučena potřeba ddNTP k ukončeni řetězce. Zde poskytovaným způsobem jsou ribonukleotidy (rNTP) začleňovány do produktů primerní extense. Jelikož subjektové enzymy začleňují přesně a účinně rNTP nebo dNTP, mohou sekvenční reakce využít směsí obou nukleotidů. Po primerní extensi se mohou vklínit nově syntetizované oligonukleotidové produkty u začleněných rNTP způsoby známými ze stavu techniky, například hydrolysou, čímž vytvoří populaci fragmentů, vhodných pro fraktionaci a sekvenční analysu konvenčními prostředky, jako je gelová e1ektroforéza. Tyto způsoby využívají zde poskytovaných nových enzymů tepelně stálé polymerázy. Z tohoto hlediska se vynález týká tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, které se vyznačují tím, že polymeráza obsahuje rozhodující motiv SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:1), kde Xaa v poloze 4 této sekvence může být jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).
Podle vynálezu poskytuje zde popsaná modifikovaná polymeráza prostředky k začleňování ribonukleotidů nebo analogů obsahujících hydroxylovou skupinu nebo jinou substituci v poloze 2 , která chybí v běžných deoxyribonuk1eotidech. Tyto nukleotidy mohou být odlišně značeny, což zajistí alternativy vůči běžnému použití dideoxynuk1eotidň pro aplikace sekvencování DNA.
- 6 • ·
Mutantní tepelně stálé polymerázové enzymy podle vynálezu se vyznačují schopností účinněji začleňovat nekonvenční nukleotidy, zejména ribonukleotidy, než odpovídající enzymy divokého typu. Ve výhodném provedení vynálezu, muže být nekonvenčním začleňovaným nukleotidem analog báze zakočující řetězec, jako je 2 -hydroxy-3 -deoxy ATP (kordycepin tri fosfát! riboterminátorový analog ATP, nebo řetězec nezakončující nukleotid jako je rNTP.
Vynález se dále týká mutantních tepelně stálých polymerázových enzymů, které se vyznačují schopností účinněji začleňovat nekonvenční nukleotidy, zejména ribonukleotidy, než odpovídající enzymy divokého typu. Z tohoto hlediska poskytuje vynález rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, z nichž každý se vyznačuje tím, že (a) ve své nativní formě obsahuje polymeráza aminokyseli novou sekvenci SerGlni1eGluLeuArgXaa (SEQ ID No=2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val! nebo isoleucinový zbytek (Hel; (b) aminokyselinová sekvence je mutována na rekombinantní enzym, s výhodou v poloze 4 této sekvence, takže zbytek glutamové kyseliny v poloze 4 je jiným aminokyselinovým zbytkem, s výhodou glycinovým zbytkem; ( c) rekombinantní enzym má sníženou diskriminaci vůči začleňování ribonukleotidu a ribonukleotidových analogů v porovnání s nativní formou uvedeného enzymu.
Vynález se dále týká tepelně stálé polymerázy jako vhodného prostředku k fragmentování produktů zesílení a příměrových extensních produktů; takové fragmentované produkty mohou být užitečné při metodologiích založených na hybridizaci a při řadě strategií detekce sekvencí.
Enzymy podle vynálezu a geny, které je kódují, mohou sloužit k zajištění prostředků pro použití v reakcích sekvencujícich DNA, které představují směs běžných nukleotidů a nejméně jednoho ribonukleotidu nebo ribonukleotidového
- 7 analogu. Ve výhodném provedení vynálezu je nekonvenčním nukleotidem ribonukleotid a koncentrace ribonuklotidu je nižší než odpovídající koncentrace deoxyribonukleotidu, tedy poměr rNTP:dNTP = 1=1 nebo menší. Enzymy podle vynálezu se hodí také ke komercializaci v podobě kitů, přičemž kity mohou také obsahovat kterýkoli z následujících prvků potřebných pro sekvenční reakce nukleové kyseliny, jako jsou například dNTP, rNTP, pufry a/nebo primery.
Vynález se týká nových a zlepšených tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, prostředků a kitů dále definovaných. Enzymy podle vynálezu daleko účinněji začleňují nekonvenční nukleosidové tri fosfáty než dosud známé polymerázy nebo odpovídající polymerázové enzymy divokého typu odvozené z těchto nových polymeráz. Poskytovány jsou také sekvence DNA kódující tyto modifikované enzymy, vektory k expresování modifikovaných enzymů a buňky transferované takovými vektory. Enzymy podle vynálezu umožňují provádění způsobů sekvencování nových DNA, což je pokrok oproti sekvenčním postupům DNA známým ze stavu techn i ky.
Pro usnadnění pochopeni vynálezu, jsou jednotlivé pojmy def i novány.
Pojem konvenční (obvyklý!, použitý ve vztahu k bázím nukleových kyselin, nuk1eosidovým tri fosfátům, nebo nukleosidům se vztahuje k přírodně se vyskytujícím v popsaných polynukleotidech (například pro DNA to jsou dATP, dGTP, dCTP a dTTP). Přídavně se používají často v 7dGTP a dITP místo dGTP (ačkoli začleňované s nižší účinností) u in vitro DNA syntesních reakcí, jako je sekvencování. Souborně je lze nazývat jako deoxyribonukleotidové tri fosfáty (d(NTP)).
Pojem expresní systém se týká DNA sekvencí, obsahujících požadované kódovací sekvence v operativní vazbě, takže hostící
buňky, transformované těmito sekvencemi, jsou schopné produkovat zakódované proteiny. K provádění transformace může být expresní systém zahrnut ve vektoru, avšak relevantní DNA muže být též integrována v chromosomu hostící buňky.
Pojem gen se vztahuje k sekvenci DNA, která obsahuje řídicí a kódující sekvence, potřebné pro produkci získate1ného bioaktivního polypeptidu nebo prekurzoru. Polypeptid muže být zakódován genovou sekvencí plné délky nebo částí kódovací sekvence, tak dlouhé jak je zachována enzymatická aktivita.
Pojem hostující buňka (nebo buňky! se týká jak jednobuněčného prokaryotového tak eukaryotovébo organismu, jako jsou bakterie, kvasinky, a aktinomycetes, tak jednotlivých buněk rostlin nebo živočichů vyššího řádu, pěstovaných v buněčné kultuře.
Zde používané označení DNA sekvencující reakční směs se týká reakční směsi, jež obsahuje prvky potřebné pro sekvenční reakci DNA. DNA sekvencující reakční směs je tedy vhodná k použití v sekvenční metodě DNA k určení sekvence nukleovýcb kyselin cíle, ačkoli reakční směs může být zpočátku neúplná, takže iniciaci sekvenční reakce ovládá uživatel. Při tomto způsobu může být reakce iniciována, jakmile se přidá koncový element, například enzym, k zajištění úplnosti DNA sekvencující reakční směsi. DNA sekvencující reakce obsahuje zpravidla pufr, vhodný pro polymerizačni aktivitu, nukleosidové trifosfáty a alespoň jeden neobvyklý nukleotid. Reakční směs může také obsahovat primer vhodný k extensi cíle polyfflerázovým enzymem, polymerázu a cílovou nukleovou kyselinu. Buď primer nebo jeden z nukleotidů je obvykle značen detekovate1ným podílem jako je fluorescenční značení. Obecně je reakční směs směsí obsahující čtyři obvyklé nukleotidy a alespoň jeden neobvyklý nukleotid. Ve vhodném provedení vynálezu je polymeráza tepelně stálá polymeráza DNA a neobvyklým nukleotidem je ribonukleotid
- 9 Zde používaný pojem oligonukleotid je definován jako molekula sestavená ze dvou nebo z několika deoxyribonukleotidú nebo ribonukleotidů, s výhodou z více než tří a obvykle z méně než 10. Přesná velikost oligonuk1eotidu závisí na mnoha činitelích, včetně koncové funkce nebo použití oligonukleotidu.
igonukleotidy se mohou připravovat vhodným způsobem, včetně například klonováním, nebo restrikcí příslušných sekvencí a přímou chemickou syntešou způsobem, jako je fosfotriesterový způsob (Narang a kol. Meth.Enzymol. 68, str. 90 až 99, 1979), fosfodiesterový způosb (Broun a kol. Meth. Enzymol.
68, str. 109 až 151, 1979), způsob diethylfosforamiditový (Beaucage a kol. Tetrahedron Lett.22, str. 1859 až 1862, 1981), tri esterový způsob (Mateucci a kol. J. Am. Chem. Soc. 103,str. 3185 až 3191, 1981) způsob automatizované syntézy nebo způsob pevné podložky (americký patentový spis číslo 4 458 066).
Zde používané označení primer se vztahuje k oligonukleotidu, ať přírodnímu nebo syntetickému, který je schopen působit jako místo iniciace syntesy, je-li umístěn za podmínek, ve kterých se extense primeru iniciuje. Primerem je s výhodou o1 igodeoxyribonuk1eotid s jedním řetězcem. Přiměřená délka primeru závisí na záměru použití primeru, avšak obvykle je 15 až 35 nukleotidů. Krátké primerové molekuly vyžadují obvykle nižší teploty k vytvořeni dostatečně stabilního komplexu hybridů s matricí. Primer nemusí reflektovat přesnou sekvenci matrice, avšak musí být dostatečně komplementární k vytváření hybridů s matricí, aby mohlo nastat prodloužení primeru.
Primer může být popřípadě značen vnesením značkovacího činidla detekovatelného spektroskopicky, fotochemicky, biochemicky, imunochemicky, nebo chemicky. Vhodným značkovacím činidlem jsou například 32P, fluorescenční barviva, reakční činidla s hustými elektrony, enzymy (jako běžně používané v ELISA), biotin nebo hapteny a proteiny, pro něž jsou k disposici
- 10 antiséra nebo monoklonální protilátky.
Označení tepelně stálá polymeráza se vztahuje k enzymu, který je stálý za tepla, je odolný vůči teplu a zachovává si postačující aktivitu k ovlivnění reakcí extense primeru pokud je podroben zvýšeným teplotám po dobu potřebnou k ovlivnění denaturace nukleovýcb kyselin se dvěma řetězci. Jak je zde použita, je tepelně stálá polymeráza vhodná k použití v reakcích cyklicky měnících teplotu, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR = polymerase chain reaction). U tepelně stálé polymerázy enzymatická aktivita znamená katalysu kombinace nukleotidu správným způsobem k vytvoření produktu extense primeru, které jsou komplementární s řetězcem matricové nukleové kyse1 i ny.
Tepelné podmínky nutné k denaturaci nukleové kyseliny závisejí například na koncentraci soli v pufru a na složení a délce nukleovýcb kyselin, jež jsou denaturovány, avšak typickým rozmezím teplot je přibližně 90 až přibližně 105 C, s vyβ bodou 90 až i 00 C po dobu závisející hlavně na teplotě a na délce nukleové kyseliny, obvykle několik sekund až čtyři minutv.
xylovou skupinu v poloze 2
Výrazy jako neobvyklý“ nebo modifikovaný, jsou-li použit.y k definování báze nukleové kyseliny, nukl eos i dového tri fosfátu, nebo nukleotidu, zahrnují modifikaci, derivaci nebo analogy obvyklých bází, nebo nukleotidu, které se přirozeně vyskytují v DNA. Blíže, jak je zde použito, jsou neobvyklé nukleotidy modifikovány v poloze 2 ribosového cukru v porovnání s obvyklými dNTP. Tudíž, ačkoli pro RNA jsou přírodně se vyskytujícími nukleotididy ribonukleotidy (například ATP, GTP, CTP, UTP kolektivně rNTP), jelikož tyto nukleotidy mají hydrocukru, která pro porovnání v dNTP chybí, jak zde použito, jsou ribonukleotidy neobvyklými nukleotidy. Do rozsahu vynálezu spadají ribonukleidové analogy ma-
• ·
-lijící substituce v poloze 2 , jako jsou 2 -fluoro- nebo 2 -aminosubstituované analogy. Přídavně mohou být ribonukleotidové analogy modifikovány v poloze 3 , například nahražením normální hydroxylové skupiny vodíkovou skupinou (3 -deoxy) , poskytující terminátor ribonukleového analogu. Takové nukleotidy jsou do rozsahu vynálezu také zahrnuty pod pojmem neobvyklé nukleotidy.
Jelikož DNA se obvykle skládá z dNTP, začlenění rNTP by bylo neobvyklé a tudíž rNTP by byla neobvyklá báze. V důsledku toho, ve vhodném provedení vynálezu, pro metody extense primeru DNA včetně metod sekvencování DNA, obsahují produkty nukleových kyselin jak obvyklé, tak neobvyklé nukleotidy, kterými jsou rNTP.
Neobvyklé báze mohou být fluorescenčně značeny, například f1uoresceinem nebo rhodaminem; nefluorescenčně značené, například biotinem; isotopicky značené například 33P,33P nebo 35S; nebo neznačené.
K lepšímu pochopení vynálezu je dále pojednáno o specifických tepelně stálých DNA polymerázovýcb enzymech, kterých se vynález týká; avšak toto pojednání rozsah vynálezu nijak neovlivňuje. Polde výhodného provedení vynálezu je tepelně stálých enzymů použito v různých způsobech sekvencování nukleových kyselin, ačkoli je možno zde popsaných nových tepelně stálých polymeráz použít k jakémukoli účelu, kdy je aktivita takového enzymu nutná nebo žádoucí. Enzymů lze také použít v zesilovacích reakcích, jako je PCR.
Tepelně stálé polymerázy podle vynálezu se vyznačují tím, že každá obsahuje rozhodující motiv SerGlηϊ1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:11, kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a “Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek • · • · · • · ·
(Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile). Geny kódující tepelně stálé polymerázy, které mají zbytek glutamové kyseliny v poloze 4 uvedeného motivu, mohou být modifikovány, jak je zde popsáno k zajištění vhodně modifikovaných polymerázovýcb enzymu. Uvedené tepelně stálé polymerázové enzymy se vyznačují tím, že ve srovnání s odpovádajícími nativními enzymy nebo s enzymy divokého typu, mají modifikaci v motivu aminokyselin SerGlnI1eGluLeuArgXaa (SEQ ID No:2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile), tedy motiv byl modifikován nahrašením zbytku glutamové kyseliny v poloze 4 jiným aminokyselinovým zbytkem. Rozhodující motiv tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu je vyznačen dále pomocí konvenčního jednopisměnkového kódu (Lehninger, Biochemistrv, New York, New York, Worth Publishers, lne. str. 67, 1970).
SEQ ID No:l SerGlni1eXaaLeuArgXaa kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).
Jak kódující genové sekvence, tak proteiny obsahujíc! tuto rozhodující aminokyselinovou sekvenci, kde “Xaa v poloze 4 této sekvence není zbytek glutamové kyseliny (Glu), poskytují polymerázu mající klesající diskriminaci vůči rNTP a jsou v rozsahu vynálezu. Uvnitř rozhodujícího motivu mohou být provedeny další modifikace, pokud jde o jiné aminokyse1 i nové zbytky v tomto rozhodujícím motivu, s výhodou vzhledem k aminokyselinovým zbytkům ze skupiny glutaminu (Glu neboli Q), leucinu (Leu neboli L), nebo argininu (Arg neboli R).
Vynález se hodí k přípravě tepelně stálých DNA polymerázovýcb enzymů s vynikajícími vlastnostmi příslušnou modifikací genové sekvence kódující tepelně stálou DNA polymerázu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou genová sekvence a zakódovaný ·· » · · 4 k · ·· » · · · ι • · 4 ·· ··
- 13 ·· ···· enzym odvozeny od druhů Thermus, ačkoli vynález zahrnuje eubakterie non-Thermus, jak bude dále popsáno. Obdobně s ohledem na vysoce konzervovanou povahu nyní identifikovaného rozhodujícího motivu, se mohou identifikovat nové tepelně stálé DNA polymerázy na základě své homologie, například polymeráza Taq. Takové tepelně stálé polymerázy jsou v rozsahu vynálezu, pokud jejich sekvence obsahuje motiv SQIXLRV/I, kde X je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek kyseliny glutamové a jejichž aminokyselinové sekvence činí nejméně přibližně 39 %, s výhodou nejméně přibližně 60 %, výhodněji alespoň přibližně 80 % celkové homologie (sekvencové identity) ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí nativní polymerázy Taq. Úplná délka sekvence uvedené polymerázy Taq je uvedena ve WO 89/06691 a je dostupná pod číslen P90556 v databance patentovaných sekvencí GENESCO nebo pod číslem M26480 v databance patentovaných sekvencí EMBL a pod číslem 133530 v databance patentovaných sekvencí PIR.
Příkladně jsou tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu rekombinantními deriváty nativních polymeráz organismů, jejichž seznam je v tabulkce I. Tabulka I vyznačuje jednotlivé sekvence rozhodujícího motivu a polohu zbytku X pro každou z těchto nativních polymeráz. Jelikož každá tepelně stálá polymeráza DNA je jedinečná, je poloha aminokyseliny v rozhodujícím motivu odlišná pro každý enzym. U polymeráz, jejichž seznam je dále uveden, je aminokyselinovým zbytkem v poloze X rozhodujícího motivu SQIXLRV/I glutamová kyselina. Výhodné polymerázy podle vynálezu mají molekulovou hmotnost 85 000 až 105 000, s výhodou 90 000 až 95 000. Aminokyselinová sekvence těchto polymeráz sestává přibližně ze 750 až 950 aminokyselinových zbytku, s výhodou z 800 až 850 aminokyselinových zbytků. Polymerázy podle vynálezu mohou také sestávat z 540 nebo z více aminokyselin a zahrnovat nejméně polymerázovou doménu a část odpovídající 3 až 5 exonukleázové domény (výsledná polymeráza může mít popřípadě exonukleázovou aktivitu 3 až 5 ) a případně části 5 až 3 exonukleázové domény, • ·
- 14 která je obsažena v první třetině aminokyselinové sekvence mnoha tepelně stálých polymerázových enzymů s plnou délkou.
U tepelně stálých DNA polymeráz, jež nejsou uvedeny v tabulce I, je identifikace příslušné glutamové kyseliny pro modifikaci snadná, jakmile je identifikován rozhodující motiv nebo dohodnutý motiv aminokyselinové sekvence.
Bez ohledu na přesné umístění uvnitř tepelně stálé polymeráty DNA, slouží nahražování zbytku glutamové kyseliny (Glu) zbytkem jiné kyseliny v sekvenčním motivu SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je váli nový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile) polymerázové domény, k zajištění tepelně stálých polymeráz majících schopnost účinně začleňovat neobvyklé nukleotidy. Ve výhodném provedení je glutamová kyselina nahražena aminokyselinou mající nenabitou polární skupinu R, jako je serin, glycin, cystein, threonin nebo aminokyselinou mající malou nepolární skupinu R, jako například alanin. V nejvýhodnějším provedení je zbytek glutamové kyseliny nahražen glycinovým zbytkem (G). Programy seřazení aminokyselin a nukleových kyselin jsou k dostání od Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Visconsin. Při daném zvláštním, zde identifikovaném motivu, slouží tyto programy, včetně například GAP, BESTFIT a PILEUP“ k nápomoci při identifikaci přesného úseku sekvence, který má být modifikován.
Jak vyplývá z tabulky I, jsou v podstatě dvě formy konzervovaného sekvenčního motivu SerGlni1eGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2) v polymerázové doméně enzymů tepelně stálých polymeráz DNA z termofilních organismů. Sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID N0‘-3) je přítomen v nativních tepelně stálých polymerázách z druhu Thermus, jako například Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus thermophilus, Thermus flavus a Thermus filiformis stejně jako z druhů Thermus sps 17 a Z05.
- 15 • * • · · ·
Sekvenční mot i v SerGlni1eGluLeuArgVa1 (SEQ ID N0:3) je obsažen v doméně polymeráz jiných tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, například z Thermosipho africanus a z různých kmenů Bacillus, jako je Bači 11us caldotenax a Bacillus stearothermophilus. Sekvenční motiv SerGlni1eGluLeuArgl1e (SEQ ID NO;4) je obsažen v nativních tepelně stálých polymerázách z Thermotoga maritima, z Thermotoga neapolitana a z Anaerocellum thermophi1 um .
Tabulka I
| Organ i smus | Am i nokyse1 i nový dohodnutý motiv | Poloha gluta- mové kyseliny |
| Thermus aquaticus (Taq) | S Q I X L R V/I SQIELRV | 615 |
| Thermus caldoohilus (Tca) | S QIELRV | 617 |
| Thermus thermoqhilus (Tth) | SQIELRV | 617 |
| Thermus flavus (Tfl) | SQIELRV | 616 |
| Thermus filiformis (Tfi) | SQIELRV | 613 |
| Thermus specie spsl7 | SQIELRV | 613 |
| Thermus specie Z05 | SQIELRV | 617 |
| Thermotoga maritima (Tma) | S QIELRI | 678 |
| Thermotoga neaDolitana (Tne) | S QIELRI | 678 |
| Thermosioho africanus (Taf) | SQIELRV | 677 |
| Anaerocellum thermoDhilum (Ath) | S QIELRI | 632 |
| Bacillus caldotenax (Bca) | SQIELRV | 659 |
| Bacillus stearothermophilus (Bst) | SQIELRV | 658, 661, oř 736* |
x v závislosti na zvolené aminokyselinové sekvenci (viz dále)
Úplné sekvence nukleových a aminokyselin pro každou polymerázu Taq, Tth, Z05, spsl7, Tma a Taf byly publikovány v americkém patentovém spise čislo 5 466 591. Sekvence DNA po- 16 • ·· ····· • · · · · · · ··· • ··· · ·· ···· · lymerázy z Tca, Tfl, Tne, Ath, Bca a Bst byly publikovány takto: Tca v bance sekvencí EMBL pod číslem U62584 (viz též Kvon, Mol. Cells 7(2), str. 264 až 271, 1971), Tfl v článku Akmetzjanov a Vakhinov (Nucleic Acids Research 20 (21), str. 5839, 1992), Tne ve WO 97/09451 a WO 96/41014, Ath v bance sekvencí pod číslem X98575 (podrobnosti o řetězci Ath viz Rainey a kol. J. Bacteriol. 175 (15), str. 4772 až 2779, 1993), Bst (Uemori a kol. J.Biochem. 113, str. 401 až 410, 1993) a pod číslem U23149 v bance sekvencí EMBL (viz též Phang a kol. Gene 163, str. 65 až 68, 1995). Aminokyselinové sekvence polymerázy Bst, obsahující E v rozhodujícím motivu v poloze 658 jsou též popsány (japonský patentový spis číslo JP 05/3P4 964A, evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP-A-699 760 a Aliott a kol. Genet. Anal. 12, str. 185 až 195, 1996); sekvenci lze také získat v bance sekvencí EMBL pod číslem U 533536. Sekvence publikovaná v Gene 163, str.65 až 68 (1995) obsahuje E rozhodujícího motivu ve zbytku čísle 661. Bca v článku Uemori a kol. (J. Biochem. 113, str. 401 až 410, 1993) a v bance sekvencí EMBL pod číslem D 12982. Tepelně stálé DNA polymerázy od Thermus filiformis (FEMS Microbiol. Lett. 22, str. 149 až 153, 1994, také k dostání od ATCC depositní číslo 43280) lze získat způsobem podle amerického patentového spisu číslo 4 889 818 i na základě informace o sekvencích v tabulce I. Homologie sekvencí (identita sekvencí) mezi aminokyselinovou sekvencí nativní formy polymerázy Taq, jak je popisována ve W0 89/06691 u shora zmíněné polymerázy Tfl je nad 87,4 %. Odpovídající homologie vzhledem k polymeráze Tth je 87,4 %, vzhledem k polymeráze Tca je 86,6 %, vzhledem k polymeráze Bst (číslo U 23149) je 42 %, vvzhledem k polymeráze Bca je 42,6 % a vzhledem k polymeráze Ath je 39,7 %.
Jak tabulka I ukazuje, je rozhodující motiv pozoruhodně konzervován mezi tepelně stálými polymerázami. V případě, kdy znamená “X” zbytek glutamové kyseliny, poskytuje záměna genu kódujícího polymerázový enzym podle vynálezu, který právě za•· «· ·· ··
- 17 čleňuje rNTP v porovnání například s polymerá2ou Taq, kde rozhodující motiv není modifikován. Vynález se tedy týká tříd enzymů, které zahrnuj í například tepelně stálou DNA polymerázu a odpovídající genové a expresní vektory od Thermus oshimai (Williams a kol. Int. J. Sys. Bacteriol. 46 (2), str. 403 aš
408, 1996); Thermus silvanus a Thermus chliarophi1us (Tenreiro a kol., Inst. J. Syst. Bacteriol. 45 (4),str.633 aš 639, 1995); Thermus scotoductus (Tenreiro a kol., Res. Microbiol. 146 (4), str.315 aš 324, 1986) a Thermus ruber, Loginov a kol. (Int. J.
Sys. Bacteriol. 34, str. 498 aš 499, také k dostání od ATCC deposit č. 35948). Přídavně vynález zahrnuje například modifikované formy tepelně stálých DNA polymeráz a odpovídající genové a expresní vektory od Thermotoga elf i i (Ravot a kol., Inst. J. Syst. Bacteriol. 45 str. 312, 1995, také k dostání od ATCC deposit 9442) a Thermotoga thermarum (Windberger a kol. Inst. J. Syst. Bacteriol. 42 str. 327, 1992, také k dostání od
ATCC deposit č.5069).
Ve výhodném provedení vynálezu je rozhodující motiv modifikován uvnitř aminokyselinové sekvence LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ UD N0:5). Vynález se tedy týká také generování mutantú tepelně stálé DNA polymerázy majících značně zvýšenou účinnost k začleňování neobvyklých nukleotidů způsobem závislým na matrici. V obzvlášť výhodném provedení zahrnuje polymerázová sekvence LeuAspTyrSerGlnlleGlyLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ UD N0=6). Takové tepelně stálé DNA polymerázy se hodí obzvláště pro procesy jako je sekvencování DNA, syntesa RNA, řízení DNA, a in vitro syntesa rNTP substituované DNA.
Produkce tepelně stálých DNA polymeráz se zlepšenou účinností k začleňování neobvyklých bází se můše uskutečnit procesy, jako je místně cílená mutageneze (například Sambrok a kol., Molecular cl oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, druhé vydání, kapitola 15.5101 igonucleotide-Médiated Mutagenesis 1989). Například mutace A“ na G” ve druhé poloze • · • · · · • · «· β
- 18 kodon kódující glulamové kyseliny u zbytku 615 v genové sekvenci polymerázy DNA Thermus aquaticus (Taq) (viz SEQ ID NO: 7) vede k více než 500-násobnému zvýšení účinnosti při začleňování neobvyklých nukleotidů, jak jsou 2de definovány, při zachování schopnosti enzymu zprostředkovat PCR v přítomnosti obvyklých nukleotidů, například dNTP. Polymeráza DNA Taq této příslušné mutace vede ke změně aminokyseliny E (glutamové kyseliny) na G (glycin). Ačkoli tato příslušná změna aminokyseliny mění významně schopnost enzymu začleňovat neobvyklé nukleotidy, má se zato, še nahrazeni 2bytku glutamové kyseliny jinými zbytky aminokyselin jako například šeřinu, cysteinu, threoninu, alaninu, val inu nebo leucinu, má stejný účinek. Jiné substituce aminokyselin, které nahrašujί E615 jsou proto v rozsahu vynálezu, ačkoli E615G představuje výhodné provedení. Rozhodujícím význakeffl vynálezu tedy je, še ve čtyřech aminokyselinových zbytcích v motivu SEQ ID NO:1 není zbytek glutamové kyseliny.
Místně cílená mutageneze se může provádět také mutagenezí cílenou na primer specifický pro místo. Tato technika je nyní v oboru standardní a provádí se použitím syntetického oligonuk1eotidového primeru komplementárního s jednořetězcovým fágem DNA podrobeným mutagenezi s výjimkou omezeného chybného uspořádání představujícího požadovanou mutaci. Stručně řečeno, syntetického oligonukleotidu se použije jako primeru k zacílení syntesy řetězce komplementárně na plasmid nebo fág a výsledná dvouřetězcová DNA je transformována na bakteriofág podporující hostující bakterie. Výsledné bakterie lze pak zkoumat například analysou sekvencí DNA nebo sondovou hybridizací k identifikování destiček nesoucích požadované sekvence mutovaného genu. Alternativně lze použít metod genového inženýrství, které jsou popsány v PCR Protocols, San Diego, Academie Press, vydavatelé Innis a kol. 1990 v kapitole 22 s názvem Recombinant PCR“, Higuchi, str. 166 až 183.
• 4
4·4 4 4 4 *44·
4444 4 4 4 4 444 • 4 444 4 44 4444 4
444 4 · 4 · 444
444 44 44 ·· 4« 4 4
- 19 Jak je v tabulce I ukázáno, je glutamová kyselina v rozhodujícím motivu polymerázy Taq konzervována v jiných tepelně stálých DNA polymerázách, muže však být umístěna v jiné, avšak sousední aminokyselinové sekvenci. Mutace konzervovené glutamové kyseliny uvnitř SEQ ID NO ’ 2 druhu Thermus tepelně stálých polymeráz DNA a příbuzných druhu Theromotoga, Thermospipho a Anaerocellum polymeráz DNA, bude mít stejný zlepšující účinek na schopnost polymerázy účinně začleňovat neobvyklé nukleotidy ve srovnání s polymerázou Taq obsahující SEQ ID NO:2.
Mutace zbytku glutamové kyseliny s rozhodujícím motivem, aby mohlo být dosaženo tepelně stálých polymeráz DNA, využívají principů a technik používaných v místně cílené mutagenese.
Pro polymerázu DNA Bacillus stearothermophi1us je několik sekvencí v databázích GeneBank a SwissProt/PIR. Tyto sekvence jsou vysoce příbuzné, avšak poněkud se od sebe odlišují, avšak každá obsahuje identický rozhodující motiv sekvence SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (lle), ačkoli v jiném místě sekvence.
Na základě veřejně dostupné informace o sekvencích aminokyselin a nukleových kyselin pro tepelně stálé DNA polymerázy, je možno běžnými rekombinantními metodami konstruovat chimérické polymerázy, které sestávají z domén odvozených od odlišných tepelně stálých polymeráz DNA. V amerických patentových spisech číslo 5 466 591 a 5 374 553 jsou popsány metody k zaměňování různých funkčních segmentů tepelně stálých polymeráz, jako 5 až 3 exonukleázovou doménu a 3 až 5 exonukleázovou doménu a po1ymerázovou doménu k vytváření nových enzymů. Výhodné enzymy chimérických tepelně stálých polymeráz obsahují 5 až 3 exonukleázovou doménu a 3 až 5 exonukleázovou doménu. přičemž jedna doména je odvozena od odlišné polymerázy a polymerázová doména obsahuje rozhodující motiv sekvence SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO:1), kde Xaa” v poloze 4 této • · · · • · • · · • 9 · · · · · • · · · · · · • · · · · ·« · « · · * • · * · ♦ · · » · ·· · · · · · · ··
- 20 sekvence není glutamový zbytek (Glu! a Xaa v poloze 7 této sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile). Příklady takových chimérických molekul jsou chimérické enzymy Taq/Tma, které jsou složeny jak uvedeno v tabulce II. Jak z této tabulky vyplývá, obsahuje polymerázová doména těchto chimérických enzymů Taq/Tam mutaci v rozhodujícím shora uvedeném motivu.
Tabulka II
| 5 až 3' exonuk1e ázová doména | 3 až 5' exonukleázová doména | polymerázová doména | |
| Taq | aa. 1-289 | aa. 290-422 | aa. 423-832 |
| Tma | aa. 1-291 | aa. 292-484 | aa. 485-893 |
| Taq/Tma | aa. 1-289(Taq) | aa .292-484( Tma) | aa.423-632(Taq) s mutací E615G |
| Taq/Tma | aa. 1-289(Taq) | aa.292-484( Tma) | aa.485-893( Tma) s mutací E678G |
Plasmid pCl byl uložen podle Budapešťské dohody s ATCC 17. července 1996 a bylo mu přiděleno depositní číslo 98107. Plasmid pCl obsahuje tepelně stálou DNA polymerázu kódující gen, která je mutována u kodonu kódujícím zbytek glutamové kyseliny v poloze 615 aminokyselinové sekvence nativní polymeráty Taq, vedoucí k mutované formě polymeráty Taq mající glycinový zbytek v poloze 615 (E615G mutovaná polymeráza Taq). Tento deposit poskytuje alternativní prostředky k zajištění tepelně stálých DNA polymeráz majících zlepšenou účinnost k začleňování analogů neobvyklých nukleotidů. Příklad 1 objasňuje použití lemovacích restrikčních míst, vhodných k subklonování mutace E615G k vytvářeni jiných enzymů tepelně stálých DNA polymeráz. Jelikož úplné genové sekvence četných tepelně stálých DNA polymeráz jsou známy, jsou pro pracovníky v oboru, na základě zde poskytnuté sekvenční informace o rozhodujícím motivu, • ·
snadno dostupné jiné prostředky k zavádění mutací kodonu kódujícího E615, jako je restrikční digesce a přemisťování fragmentu nebo specificky místně cílená mutagenese in vitro.
Modifikovaný gen nebo genový fragment, připravený specificky místně cílenou mutagenesí, muže být získán z plasmidu nebo bakteriofágu konvenčními prostředky a ligací zaveden do expresního vektoru k další kultivaci a čištění výsledného enzymu. K provádění vynálezu se hodí četné klonovací a expresní vektory, včetně savčích a bakteriálních systému a jsou popsány například v knize Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor 1989. Pro pohodlí je vynález doložen příkladem používajícím 1ambda-derivovaného promotoru PL (Shimatake a kol. Nátuře 292, str. 128, 1981). Použití tohoto promotoru je specificky popsáno v amerických patentových spisech číslo 4 711 845 a 5 079 352.
Tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu se obvykle čistí od mikroorganismů, jako jsou například E.coli, které byly transformovány expresním vektorem operativně vázaným na gen kódující tepelně stálou polymerázu DNA divokého typu nebo modifikovanou tepelně stálou polymerázu DNA. Příkladem vhodného hostícího mikroorganismu je kmen E.coli DG116, který popsal Lavyer a kol. (PCR Methods and Application 2, str. 275 až 287, 1993), a který lze získat od American Type Culture Collection pod Číslem ATCC 53601. Způsoby čištění tepelně stálé polymerázy jsou také popsal Lavyer a kol. (PCR Methods and Application 2, str. 275 až 287, 1993.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že uvedené tepelně stálé DNA polymerázy se zlepšenou účinností začleňování neobvyklých nukleotidů se nejsnáze připraví způsoby rekombinantní technologie DNA. Pokud je snahou připravit některý enzym podle vynálezu, derivát nebo homolog těchto enzymů, zahrnuje produkce rekombinantní formy zpravidla konstrukci expresního vektoru, • · · ·
- 22 • ·· ·«··· • · · · · * · · ·» • · · · · · · ···· · ·· · · · · · · · • · · · · · ·» ·· transformaci hostící buňky tímto vektorem a kultivaci transformované hostící buňky za podmínek, při kterých se exprese uskuteční. Prostředky k přípravě expresních vektorů, transformování a kultivaci transformovaných hostících buněk jsou v oboru dobře známy a podrobně je popsal například Sambrook a kol. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, druhé vydání, kapitola 15.51,01igonucleotide-Mediated Mutagenesis” 1989, jak shora uvedeno).
Vynález poskytuje tepelně stálé polymerázy DNA vhodné k použití s ribonukleosidovými trifosfáty pro četné aplikace, včetně zesilování nukleových kyselin, způsobů detekce a sekvencování DNA. Použití ribonukleotidů při sekvencování vylučuje velmi nákladné koncové analogy v řetězcích, jako jsou ddNTP a především usnadňuje přípravu nových zesilovacích produktů, vhodných nejenom pro analysu sekvencí DNA, ale také pro analysy jiného typu, jako je elektroforéza nebo hybridizace bez nutnosti zavádění následných reakcí sekvencujících DNA.
Ukázalo se, že pyrofosfatáza zlepšuje výsledky sekvencování za použití jak mesofi 1 ickýcb polymeráz, tak tepelně stálých DNA polymeráz snižováním množství pyrofosforolysy při akumulaci produktů extense. Dosavadní cyklus sekvencující metody vyžadují, aby byl do sekvenční reakce zahrnut přídavný enzym. Avšak velmi užitečná a pokroková je možnost sekvencování DNA bez použití pyrofosfatázy. Použití nových enzymů podle vynálezu tudíž eliminuje nutnost přídavných nákladů, souvisejících s přidáváním druhého enzymu do sekvenční reakční směsi.
Při použití enzymů podle vynálezu se zesilovací a sekvencující reakce kombinují, což spoří čas i materiál a zjednodušuje celou analysu. Tyto a další přednosti se uplatňují, jelikož začleňování jak obvyklých nukleotidii, tak ribonukleotidů a analogů ribonukleotidů do primerního extensníbo produktu zajišťuje chimérický řetězec RNA/DNA, který je schopen hydrolysy • ·
- 23 • · · · ···· • · · · · · • · · · · · · ······ · • · · · · · · • · · · · · · ··
RNA. Postup neovlivňuje kostru DNA a poskytuje populaci fragmentu nukleových kyselin, z nichž každý končí v poloze, kde je místo odpovídající dNTP vsazen ribonukleotid. Hydrolysa se snadno uskuteční různými prostředky včetně alkalií (například zpracováním hydroxidem sodným například s konečnou koncentrací O,2M, jak uvedeno dále v příkladě 6), tepelným nebo enzymatickým zpracováním RNase (Vogel a kol. Informati ona1 Macromolecular, New York, Academie Press, kapitola, kterou zpracoval Berg a kol. s názvem The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- and Deoxyribonukleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E.eoli“, str. 467 až 483).
Ve výhodném provedení poskytuje vynález nové a zlepšené sloučeniny obzvlášť užitečné pro způsoby sekvencování DNA. Nové, zde popisované enzymy jsou pokrokové ve způsobech sekvencování nukleových kyselin používajících buď barevných terminátorů nebo barevných primerů stejně jako jiných metod sekvencování. Jak bylo výše popsáno, vyžadují způsoby zakončování řetězců obecně extensí primeru závislou na matrici v přítomnosti nukleotidů zakončujících řetězec, což vede k rozdělení parciálních fragmentů, které se pak oddělí velikostí. Standardní dideoxy sekvencování používá dideoxynukleosidových tri fosfátů k ukončování řetězců DNA polymerázy, jako je Klenowův fragment E.eoli Pol I (Sanger a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. 74, str. 5463, 1977)
Základní dideoxy sekvenční potup tedy zahrnuje (i) tepelné připojení ribonuk1eotidového primeru k matrici; (i i) rozšíření primeru polymerázou DNA ve čtyřech oddělených reakcích, z nichž každá obsahuje jeden značený nukleotid, nebo značený primer, směs neznačených dNTP, jeden řetězec zakončující ddNTP; (iii) rozlišení čtyř souborů reakčních produktů například e1ektroforézou denaturačního gelu polyakrylamid/močovina s vysokým rozlišením, kapilární separací nebo jinými rozlišujícími prostředky; a (iv) vyt.voření autoradiografického obrazce gelu,
- 24 který může být zkoumán k posouzení sekvence. Alternativně lze k odvození informace o sekvenci DNA použít metod hmotové spektroskopie nebo metod založených na hybridizaci, za použití značených primerň nebo nukleotidů
Dostupnost tepelně stálých polymeráz, jako jsou Taq polymerázy vedla ke zlepšeným metodám sekvecování (americký patentový spis číslo 5 075 216) a k jejich modifikaci nazývanou cycle sequencing (cyklové sekvecování). Při cyklovém sekvencování se opakuje ohřev a ochlazení, což umožňuje vytvoření četných extensních produktů z každé cílové molekuly (Murray Nucleic Acids Research 17, str. 8889, 1989). Toto asymetrické zesilování cílových sekvencí komplementárních s matricovou sekvencí v přítomnosti dideoxy řetězcových terminátorů produkuje populaci produktů extense všech možných délek.
Po denaturaci produktů ext.ensní reakce od matrice DNA nastane několik cyklů teplotní hybridizace a extense primeru v přítomnosti dideoxy terminátorů. Tepelně stálé DNA polymerázy mají četné přednosti v cyklovém sekvencování; vymezují přísné teploty teplotní hybridizace, jež jsou požadovány pro specifickou hybridizaci primeru na cíle nukleové kyseliny stejně jako vymezují několikeré cykly vysokoteplotní denatura0 ce, ke které dochází v každém cyklu, například 90 až 95 C. Z toho důvodu byly do kitů sekvencujících cyklus Taq prodávaných společností Perkin Elmer, Norvalk, CT, zařazeny různé formy AmpliTaqR DNA polymerázy.
Nicméně vlastnosti Taq polymerázy DNA, k odlišení od začleňování neobvyklých nukleotidů, jako jsou ddNTP, představují problém, použije-li se jí k cyklovému sekvencování, kde ddNTP nebo fluorescenčně značené ppNTP mmuseji být začleněny jako terminátory řetězců. Před vynálezem vyžadovalo obecně dříve sekvencování DNA tepelně stálými DNA polymerázami směs řetězec ukončujících nukleotidů ve velké koncentraci k zajištění vy-
- 25 tvoří populace extensních produktů představující všechny možné délky fragmentů v délce několika set bází. Často, k provedení tohoto nákladného postupu, činily protokoly používající velmi nízkých koncentrací obvyklých dNTP, reakce neúčinnými. Tyto reakční směsi mající nízkou koncentraci dNTP a vysokou koncentraci ddNTP, vytvářejí prostředí, ve kterém je tepelně stálá polymeráza v podstatě spotřebována na nukleotidové substráty.
I s příchodem modifikovaných enzymů, jako je AmpliTaqRDNA polymeráza FS, které umožňují zvyšováni koncentrace dNRP na optimálnější úrovně, spoléhají dřívější enzymy stále na přítomnost nákladných ddNTP pro sekvencování DNA. Na rozdíl od toho poskytuje vynález enzymy, které umožňují nejenom zvyšování koncentrace dNRP, ale zabraňují používání nákladných ddNTP používáním místo toho rNTP k začleňování do rostoucího řetězce. Schopnost nových enzymu účinně ovlivňovat částečnou ribonukleidovou substituci usnadňuje generaci sekvencujícícb žebříku DNA při vyloučení separátní reakce k začlenění koncového nukleot i du.
Volba analogu neobvyklých nukleotidů vhodných pro použití v sekvenčních metodách DNA byla dříve diktována schopností tepelně stálé DNA polymerázy začleňovat takové analogy. Naneštěstí jsou takové nukleotidové analogy dosti drahé. Například cena ddNTP je přibližně 25x vyšší než cena rNTP nebo dNTP. Jelikož dřívější tepelně stálé polymerázy DNA nebyly schopny účinně začleňovat rNTP do rostoucí DNA způsobem řízeným matricí, nebyly takové ribonuk1eotidy, které jsou snadno dostupné a jsou levné, možností pro použití v sekvencování DNA tepelně stálou polymerázou. Vynález vylučuje potřebu ddNTP v sekvenčních reakcích DNA. Vynález tedy také poskytuje metodu pro analysu sekvencí DNA, která je podstatně levnější než dřívější metody ukončování řetězců.
Přítomnost manganu v extensní reakci primeru může ovliv-
- 26 nit schopnost polymerázy vložit přesně správně založený pár nukleotidů. Manganu lze použít k vynucení nesprávného párování bází nebo k usnadnění diskriminace proti začlenění nukleotidového analogu. Manganu bylo použito při výzkumech k zavedení mutageneze v procesech replikace nebo zesilování DNA. Mangan může tudíž ovlivnit věrnost polymerizační reakce i výtěžek reakce. Výsledná sekvence může být nesprávná, nebo může být v sekvenční metodě DNA výsledná informace dvojznačná. Způsoby podle vynálezu nepotřebují zavádění manganu jako dvojmocného kationtů v sekvenční reakční směsi k přinucení polymerázy, aby začlenila neobvyklý nukleotid. Na rozdíl od dosavadních DNA polymeráz, identifikuje vynález rozhodující motiv v polymerázové doméně k ovládání schopnosti enzymu rozlišit mezi 2 -substituovanými a nesubstituovanými nukleotidy bez potřeby manganu .
Enzymy podle vynálezu nevyžadují k sekvencování vysoké koncentrace nekonvenční báze analogii. Před vynálezem byly obecně obsaženy báze nekonvenčních analogů a odpovídající neobvyklé báze v poměru (například ddATP:dATP) od 1,3:1 do 24:1 pro sekvenční metody terminálů řetězců DNA (viz též americký patentový spis číslo 5 175 216, Innis a kol.i. V porovnání umožňují tepelně stálé polymerázy podle vynálezu snížení poměru nekonvenční báze analogů k obvyklým bázím z několika stonásobkň na několik tisícinásobků. Poměr rNTP:dNTP 1:1 nebo menší, v konmbinaci s novými enzymy podle vynálezu je postačující pro analysu sekvence DNA. Ve výhodném provedení vynálezu je poměr rNTP:dNTP snížen na méně než 1:8. Poměr 2 -substituovaného nukleotidu k odpovídajícímu přírodnímu dNTP může být 1:80 až 1=200, v závislosti na příslušné experimentální konstrukci a na požadované délce fragmentů.
Jelikož tedy enzymy podle vynálezu pohotově začleňují neobvyklé nukleotidy, jako jsou 2 -substituované nukleotidy, není nutné vynucovat začlenění rNTP pomocí vysoké koncentrace • * • ·· · · ···· • · · ·· · · · · · • · · · · · « · ··· ·· · · · · · · ···· · ··· ···· ··· Ht ·· 99 94 ·· 99
- 27 rNTP a omezováníém koncentrace odpovídajících dNTP. Proto způsob podle vynálezu umožňuje použití optimálních koncentrací dNTP v kombinaci s nízkým množstvím rNTP.
Jestliže se módifikovaných polymerázových enzymů podle vynálezu použije ve vhodné sekvencovací metodé, jako je například dye-primer sequvencing, dosahuje se dobrých sekvenčních výsledků s koncentrací dNTP v rozsahu 50 až 500 uM každého dNTP. S výhodou je koncentrace dNTP 10 až 300 uM. Při tomto rozsahu mohou být příslušné rNTP obsaženy v koncentraci přibližně stejné jako dNTP nebo menší. S výhodou je rNTP obsažen v koncentraci 0,1 u až 10 uM, nejvýhodněji přibližně 2,5 až 25 14M.
Koncentraci rNTP, vhodnou pro použití s enzymy podle vynálezu, lze snadno zjistit titrací a optimalizací experimentů pracovníky v oboru. Potřebné množství rNTP nebo analogu se určí při typu experimentu a může být ovlivněno cílovou velikostí a čistotou i volbou pufru a jednotí ivými druhy enzymů.
Poměr rNTP:dNTP určuje frekvenci, se kterou se rNTP začleňují do rostoucího oligonukleotidu. Jelikož při každém začleněném rNTP nastane hydrolysa, může se poměr rNTP:dNTP nastavit tak, aby uživatele vybavila flexibilitou ke zvyšování nebo snižování velikosti výsledných fragmentů.
Jak známo, je DNA polymer syntetizovaný z dNTP. Každý deoxynukleosidový tri fosfát představuje ribosový cukr, který obsahuje hydroxylovou skupinu v poloze 3 a atom vodíku v poloze
Ribonukleotidy obsahují také hadroxylovou skupinu v podílu cukru. Avšak rNTP se odlišují od dNTP v poloze 2 cukru, kde druhá hydroxylová skupina nabražuje atom vodíku. V této souvislosti je rNTP příkladem schopnosti enzymů podle vynálezu přesně začleňovat nukleotidy substituované v poloze 2 . Sloučeniny podle vynálezu nejsou však omezeny na použití neobvyk·· · ·
- 28 •·· · φ ·· φφ lýcb nukleotidů, kterými jsou ribonukleotidy. Modifikace sekvence tepelně stálé polymerázy v rozhodující doméně, zde identifikovné, umožňuje matricí cílené začlenění alternativy v poloze 2 substituovaných nukleotidů, jako jsou 2 -hydroxylová skupina a 3 -deoxynukleotidy a v poloze 2 substituované fluoronukleotidy nebo aminonukleotidy.
Jak je popsáno v příkladech, začlenění 3 -deoxy, 2 -hydroxy ATP, zde označované jako cordycepintrifosfát, je usnadněno obsahem druhé mutace v tepelně stálé polymeráze, která redukuje diskriminaci proti začlenění nukleotidu obsahující deoxyskupinu v poloze 3 ribosy. Takové enzymy byly už popsány například v evropském patentovém spise číslo EP-A-655506 a americké přihlášce vynálezu čéslo 08/448 223 z 23.května 1995. ATCC deposit No.69820, uložený podle Budapešťské konvence Í0. května 1995, poskytuje gen kódující modifikovanou tepelně stálou DNA polymerázu Thermus aauaticus, která má sníženou diskriminaci vůči začleňování analogu, jako jsou ddNTP. Dideoxynukleotidy mají substituovanou polohu 3 na rozdíl od obvyklých dNTP. Tudíž v kombinaci s vynálezem, poskytuje dvojitá mutace, jejímž příkladem je zde polymerázový mutant E615G,F667YTaq, prostředek k využití analogů nukleotidů, jež jsou substituovány v poloze 3 a 2 ribosy, ve srovnání s dNTP (viz příklady 3 a 5).
Zvláštní aplikaci vynálezu je způsob sekvencování rNTP, kde sekvencující primer je detekovate1 ně označen rozlišitelnou fluorescenční nebo radioaktivní značkou. Na rozdíl od ddNTP, začleňování nemodifikovaného rNTP nevede k ukočení řetězce. Sekvenční reakce DNA zahrnující jak rNTP, tak dNTP v kombinaci s enzymem podle vynálezu, vytváří směs stát. isticky substituovaných primer rozšiřujících produktů schopných rozštěpit v poloze 3 -5 fosfodiestrovou vazbu mezi ribo- a sousedním deoxynukl eot i dem. Po extensi primeru. například PCR zesílením nebo cyklickým sekvencováním a před rozlišením produktů extense primeru, například gelovou e1ektroforézou, se reakční směs • ·
- 29 zpracuje buď alkalií, teplem, ribonukleázou nebo jinými prostředky k hydrolyzování produktů extense primeru u každého výskytu ribonukleotidu. Pro každý značený produkt extense primeru, je detekovatelný pouze nejvýše 5 fragment, který je bezprostředním produktem extense značeného primeru, na sekvenčním gelu. Pro daný cíl, představuje analysa výsledných sekvenčních gelu sekvenční žebřík, tedy sérii neidentifikovatelných signálu v drahách G, A, T a C odpovidajicich sekvenci nukleové kyseliny cíle. Výsledný sekvenční žebřík poskytuje stejnou informaci, ať metoda použije ddNTP konvenčními prostředky, nebo rNTP a nových zde popsaných tepelně stálých polymeráz. Použitím vynálezu tedy už se k sekvencování DNA nemusí používat drahých ddNTP (viz příklad 6) .
V alternativní sekvenční analyse se používá ribonukleoti du zakončujících řetězec. Při tomto provedení vynálezu se jako terminátorů používá 2 -hydroxy,3 -deoxynuk1eotidú, jako je kordycepintri fosfát. Tyto analogy rNTP mohou být fluorescenčně označeny a použity k sekvenční analyse DNA. Lee a kol.(Nucleic Acid Research 20, str. 2471, 1992) popsal použití dye-termináLoru ddMTP. V evropském patentovém spise číslo EP-A-655506 a v americké přihlášce vynálezu číslo 08/448 223 z 23.května
1995 jsou popsány modifikované enzymy pro použití s ddNTP.
K účinnému začleňování značených analogů rNTP v sekvenční reakci zakončující řetězec je možno použít tepelně stálé polymerázy DNA obsahující jak modifikaci obsaženou v AmpliTaqR DNA polymeráze FS (viz shora) a spécifi kovaných v SEQ ID NO:1, kde X není glutamová kyselina (Ε), jak zde popsáno. Tento proces může být automatizován a nevyžaduje syntesu barevně značených primerů. Kromě toho, jelikož reakce s barveným terminátorem umožňují provádění všech čtyř reakcí v téže zkumavce, jsou výhodnější než způsoby s barveným primerem. 2 -Hydroxy.3 -deoxynuk 1 eot idy mohou být syntetizovány z obchodně dostupných 3 nukleotidů (3 dA, 3 dC, 3 dG a 3 dT například od Sigma Chemical Corporation, St.Louis, M0) a přidáním 5 -tri fosfátu (Ludvig,
- 30 Biophosphates and Their Synthesis Structure, Hetabolism and Activity, vydavatelé Bruzik a Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, str. 201 až 204, 19871.
Kromě využití enzymů podle vynálezu v nových metodách sekvenční analysy, hodí se zde popsané modifikované enzymy v řadě aplikací molekulární biologie. V jednom provedení je modifikovaných enzymů použito v zesilovací reakci směsi obsahující obvyklé i neobvyklé nukleotidy, například dNTP a alespoň jeden detekovate1ně značený rNTP, přičemž značky mohou být například fluorescenční značky nebo radiosiotopy. Syntesa řízená matricí komplementárního řetězce poskytuje produkt DNA obsahující ribonuk1eosidmonofosfáty v různých polohách po své délce. Tepelné a nebo alkalické zpracování hydrolyzuje produkt extense nukleové kyseliny na každém ribonukleotidu. Získá se tak populace segmentů DNA, kde každý fragment obsahuje jeden značený podíl na konci 3 Velikost výsledných fragmentů nukleové kyseliny může být modifikována nastavením poměru a množství rNTP zahrnutých v reakci.
Zesilování štítu pomocí rNTP a enzymů podle vynálezu poskytuje četné přednosti v závislosti na jejich příslušné aplikaci. Ve shora popsaném způsobu se značenými rNTP, je výsledná populace fragmentů celá značená se stejnou intenzitou: jedna značka pro oligonukleotidový fragment. Postupy, jako detekce nukleových kyselin pomocí řady oligonuk1eotidové sondy fixované na křemíkový čip, optimálně vyžaduje, aby zesílený štít byl statisticky fragmentován v pevně reproduklovatelném rozmezí velikosti k omezení vytváření sekundárních struktur pro ovládání hybridizační kinetiky. Dále k detekci hybridizace na řadě tisíců sond na čipu, může být výhodné, jsou-li fragmenty nukleové kyseliny značeny se stejnou intenzitou. Vynález poskytuje prostředky k produkování popuplací fragmentů, které tomuto standardu vyhovují a tím usnadňuje použití alternativních detekčních forem jako jsou metody založené na čipu, které popsal • · ···« ·· · ·«·· » · · · · · ·· ···· · • · · ···· · · · • · · ·t · · 9 9 ♦· 9 9
- 31 například Corin a kol. (Human Mutation 7, str. 244 až 255, 1996).
V jiném provedení poskytuje použití značených a neznačených primeru v zesilovací reakci, která obsahuje tepelně stálou polymerázu podle vynálezu a jak rNTP, tak dNTP, prostředky k současnému provádění zesilovacích a sekvenčních reakcí. Tento způsob vyžaduje provádění 4 oddělených zesilovacích reakcí, jedné pro každý rNTP. Tedy, jelikož například enzym podle vynálezu je vhodný k cílenému zesílení například pomocí PCR, nebo jinými zesilovacími prostředky, může být výsledný produkt, pokud je obsažen, detekován konvenčními metodami jako je gelová elektroforéza nebo sondová hybridizace pomocí části produktu reakce. Tyto detekční metody se neprojeví v hydrolyse začleněných ribonuk1eotidů a chimérické řetězce RNA/DNA se budou chovat podle očekávání u běžných produktů zesílených nukleových kyselin. Je-li žádaný produkt detekován, může se zbývající část téže reakční směsi zpracovat alkalií a analyzovat elektroforézou gelu ke stanovení sekvence nukleové kyseliny.
Po detekci produktu je tudíž následná sekvenční rekace zbytečná. Tento zjednodušený postup šetří čas a materiály a přináší zvýšenou přesnost odstraněním kroků: detekovaný produkt je sekvencovaný produkt.
Podobného způsobu se čtyřmi značenými rNTP a jedním biotinylováným primerem lze také použít. Po zesílení se produkt rozštěpí alkalií a s primerem spojené produkty se odstraní reakcí s kuličkami povlečenými střepav idinem. Zachycené produkty se pak analyzují na sekvenčním gelu. Tato modifikace umožňuje provádět sekvenční reakci v jedné zkumavce, čímž se vylučuje nutnost čtyř samostatných zesílení.
Podle jiného význaku vynálezu se hodí zde popsané enzymy k přípravě RNA z matrice DNA nebo k vytváření substituovaných DNA pro alkalií zprostředkovanou sterilizaci bez použití
- 32 • ·· ·· ···· r· tt ·· · · * · · · · e ···« * · · «··· • · · · · · ·· *··· · ··· ···· ··· • »4 ·· Ί · »t «· ·· konvenčních steri 1 izačních činidel jako je uraci 1 -N-glykolsy1 áza (UNG) popsaná ve světovém patentovém spise číslo WO 92/ 01814.
V příkladném provedení obsahuje tepelně stálá polymeráza také mutaci v 5 -3 -exonukleázové doméně, která slouží k silnému utlumení exonukleázové aktivity. Modifikované formy Taq polymerázy jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 5 466 591. V jednom provedení vynálezu byl nahražen kodon kódující glycinový ( G) zbytek v poloze 46 aminokyseliny kodonem kódujícím asparagovou kyselinu (Dl. Získaný enzym má podpořenou účinnost v cyklických sekvenčních reakcích v důsledku snížené 5 -3 -exonukleázové aktivity a je výhodným základem pro účely vynálezu. Polymerázová doména aminokyselinové sekvence a polymerázovou aktivita jsou nedotčeny přítomností (G46D) mutantu ve srovnání s divokým typem enzymu.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Exprese modifikovaného Taq polymerázového genu se sníženou diskriminací vůči neobvyklým nukleotidům
C-Koncová aminokyselinová část Taq DNA polymerázy DNA polymerázové aktivní místo domény (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 19931. Fragment DNA, který obsahuje tento úsek, byl izolován z genu Taq plné délky a mutagenizován zesílením PCR v přítomnosti manganu (Leung a kol. Technique 1 (1), str. 11 až 15, 1989). Pro tento příklad byly opatřeny všechny restrikční enzymy od New England Biolabs, Beverly, MA. Mutagenizované fragmenty byly digestovány Pstl a • · · ·
I · · 4 > · · · • · ·
- 33 BglII a klonovány do expresního plasmidu Taq, zde plasmidu pLK102, který byl digestován Pstl a BglII. Plasmid pLK102 je modifikovanou formou Taq expresního plasmidu pSYC1578 (Lavyer a kol.). Fragment HincII/EcoRV umístěný v poloze 3 k úseku kódujícím polymerázu se vyjme k vytvoření plasmidu pLKlOl. Pak se od pLKlOl oddělí fragment 898 páru báze Pstl-BglII a nahradí se krátkým oligonukleidovým duplexem Pstl-EcoRV-BglII k vytvoření plasmidu pLK102. Toto vymizení odstraní základový pár 900 z konce 3 genu TaqDNA pol a nahradí ho krátkým kusem DNA.
Výsledné expresní plasmidy se transformují do kmene E.coli N1624, který popsal Gottesman (J. Mol. Biol. 77, str. 531, 1973: též k dostání od E.coli Genetic Stock Center at Yale líni verš i ty pod číslem kmene CGSCW5066) a produkt výsledné transformace se skrínují se zřetelem na schopnost účinně začleňovat rNTP v porovnání s enzymem divokého typu. Tímto způsobem se identifikuje mutant Cl jako mající schopnost účinněji začleňovat rNTP.
Ke zjištění, která část genu Taq polymerázy byla zodpovědná za změněný fenolyp, byl digestován mutagenizovaný Taq expresní plasmid, pojmenovaný pCl, izolovaný z mutantu Ct s různými restrikčními enzymy a výsledné restrikční fragmenty byly subklonovány do genu pLKlOl TaqDNA polymerázy divokého typu, k nahrazení nemutagenizovaných restrikčních fragmentů. Analysa výsledných subklonů ukázala, že mutace, zodpovědná za fenotyp, je obsažena uvnitř restrikčního fragmentu páru báze 265 Nhel až BamHI.
Sekvenční analysa DNA byla provedena v tomto úseku pCl pomocí ABI PRISMa Dye Terminátor s AmpliTaqR polymerázy DNA ES od City, CA a pomocí DNA sekvenčního
Cycle Sequencing Core Kit Applied Biosystems, Foster systému Applied Biosystems model 373A. Sekvenční analysa identifikovala dvě mutace v genu polymerázy Taq mezi místy Nhel a BamHI. Mutace na aminokyselikyše1 i ny v poloze
- 34 nové pozici 615 způsobila, še zbytek glutamové (E) byl nahraěen glycinovým (G) zbytkem a druhá mutace
653 nahradila alaninový (A) zbytek threoninem (T). Číslování začíná u kodonu kódujícího první methioninový zbytek přírodního proteinu jako v americkém patentovém spise číslo 5 079 352. Mutace E615G byla způsobena změnou GAG aš GGG v kodonu 615. Mutace A653T byla způsobena změnou GCC na ACC u kodonu 653. Plasmid Cl v hostícím kmenu E.eoli N1624 byl uložen podle Budapešťské konvence s ATCC 17. července 1996 a bylo mu přiděleno číslo dostupnosti 98107.
Dvoubodové mutace byly odděleně analyzovány subklonováním každé zvlášť do genu Taq polymerázy divokého typu, pomocí rekonmbinantní PCR (Innis a kol., PCE Protocols San Diego, Academie Press kapitola 22 s názvem Recombinant PCR, Higuchi, str. 177 až 183, 1990). Výsledné expresní produkty byly analyzovány ke zjištění, zda mutace E615G nebo A653T nebo obě mutace jsou zodpovědné za začleněný ribonukleotidový fenotyp. Výsledky těchto pokusů ukázaly, še za mutantový fenotyp zodpovídá pouze mutace E615G.
K další analyse a ke kvantifikování začleňovací účinnosti nukleotidových analogů, byl základní párový fragment PCR 265 BamHT-Nhel obsahující E615G klonován do Taq expresního vektoru pRDA3-2. Expresní vektor pRDA3-2 obsahuje v plné délce gen Taq operativně ligovaný na fág lambda PL promotor. Exonukleázová doména Taq genu v tomto vektoru obsahuje bodovou mutaci na kodonu kódujícím glycin, aminokyselinový zbytek 46, který snižuje aktivitu 5 -3 exonukleázy. Avšak genová sekvence uvnitř polymerázové domény expresního vektoru pRDA3-2 je totožná s Taq genovou sekvencí divokého typu. Plasmid pRDA3-2 je úplně popsán v americkém patentovém spise číslo 5 466 591, kde je plasmid nazýván klon 3-2. Palsmid pRDA3-2 byl digestován s BamHI a Nhel a základní párový fragment PCR 265 byl ligován do vektoru obvyklými prostředky.
• · · · · · · • · ·· ·· ··
- 35 Výsledný plasmid pLK108 byl transformován do kmene E.coli DG116 (Lavyer a kol., 1993, též k dostání od American Type
Culture Collection pod číslem ATCC 53606). Plasmid pLK108 kóduje tepelně stálou DNA polymerázu, zde nazývanou G46D,E615G Taq. Mutant G46D,E615G,F667Y Taq se vytvoří kombinováním mutací E615G a F667Y rekombinantní PCR do fragmentu BamHI-Nhel.
Tento fragment byl klonován do plasmidu pRDA3-2 k vytvoření plasmidu pLK109. Expresovaný protein tepelně stálé polymerázy DNA z plasmidu pLK108 a pLK109 se čistí způsobem, který popsal Lavyer 1993, ačkoli chromatografie byla vynechána. Sekvence insertů byla potvrzena sekvenční analysou DNA. Další mutace v sekvenci byla detekována v insertu pLK108; tato mutace nemění aminokyselinovou sekvenci proteinu.
Po částečném vyčištění se zjistí aktivita modifikovaného enzymu zkouškou aktivity, kterou popsal Lavyer a kol.íJ. Biol.
Chem. 264, str. 6427 až 6437, 1989). Aktivita modifikovaného enzymu se vypočte takto: jedna jednotka enzymu odpovídá 10 nmol produktu syntetizovaného během 30 minut. Aktivita enzymu polymerázy DNA divokého typu je přímo úměrná koncentraci enzymu do 80 až 100 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym s 0,12 až 0, 15 jednotek na reakci) . Aktivita mutantů E615G, G46D a E615G, F667Y, G46D je přímo úměrná koncentraci enzymu do 0,25 až 3 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym při 6xlO“4 až 5xl03 jednotek na reakci). Tento enzymový prostředek byl využit k začlenění a k sekvenčním reakcím popsným v příkladech 3 až 5. Pro příklady 2 a 6 byl enzym čištěn jak popsáno v literatuře Lavyer a kol. (J. Biol. Chem. 264, str. 6427 až 6437, 1989).
Příklad 2
Test k porovnání účinnosti začleňování
Relativní schopnost G46D a G46D,E615G Taq začleňovat rNTP zjistí měřením množství [alfa-32P]rNTP, které je schopen se • · · ·
- 36 • · • ·
každý enzym začlenit při omezené koncentraci enzymu do aktivované matrice DNA lososového sperma. K měření začlenění rATP se připraví reakční směs tak, že konečná koncentrace v 50 yl reakční směsi je: 12,5 yg aktivované DNA lososího sperma, připravené jak déle uvedeno, 200 yM každé dCTP, dGTP a dTTP (Perkin Elmer Norvalk, CTI, 100 yM [alfa-32P]rATP, 1 mM betamerkaptoethanolu, 25 mM N-tris[hydroxymethyl]methy1 -3-aminopropansulfonové kyseliny (TAPS) pH 9,5, 20 C, 50 mM JC1 a 2,25 mM chloridu hořečnatého.
Podobné testovací směsi se připraví k měření začlenění rCTP, rGTP a rUTP. V každém případě se rNTP označí radioizotopem a je obsažen ve 100 yM a tři zbývající rNTP (dATP, dGTP a dTTP pro rCTP, dATP, dCTP a dTTP pro rGTP a dATP, dCTP a dGTP pro rUTP) jsou obsaženy každý při 200 yM. Jako standard se také změří začlenění odpovídajícího [alfa-32P]dNTP každým enzymem. Testovací směs pro tyto testy je podobná se shora uvedeným testem začleňování rNTP, s tou výjimkou, že každý [alfa32P]rNTP, je nahrazen odpovídajícím [alfa-32P]dNTP. Surová DNA lososového mlíčí 1 g/1 od Worthington Biochemical, (Freehold, NJ) se aktivuje inkubací v 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 5 mM MgCl2, při teplotě 2 až 8 C po dobu 96 hodin. Přidá se pak EDTA 12,5 mM a NaCl 0,lM. DNA se pak extrahuje systémem fenol/chloroform a pak se vysráží ethanolem a resuspenduje se v 10 mM Tris, lmM EDTA, pH 7,5. Aktivovaný prostředek DNA se dialyzuje proti stejnému pufru.
Do pěti 0,5 ml zkumavek (například Eppendorf) se vnese podíl 45 yl každé reakční směsi pro každý 5 -značený nukleotidový prekurzor. Testuje se tak každý G46D Taq a G46D, E615G Taq dvojmo, přičemž jedna zkumavka je ponechána pro negativní kontrolu. Polymerizační reakce ve dvou zkumavkách každé testované směsi se iniciuje 5 yl každé polymerázy G46D Taq (0,02 jednotek) nebo G46D,E615G Taq (0,002 jednotek). Do negativní kontrolní reakce se přidá jako kontrola na úroveň základu, 5 • ·
- 37 ul enzym ředicího pufru spíše než enzymu.
Každá reakční směs se krátce odstředí a inkubuje se 10 o
minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 ul 60 mM EDTA a uloží se k ledu. Pro každý vzorek se 50 ul alikvot. ze 60 u,l reakční směsi zředí 1 ml 2 mM EDTA. 50 ug/ml DNA míchaného losového mlíčí. DNA se vysráží TCA standardním způsobem a zfiltruje se na filtračník kotoučcích GF/C (Vhatman, Kent, Anglie) . Množství začleněného nukleotidu nebo ribonukleotidu, značeného [alfa-32Pl se kvantifikuje kapalnou scintilační spektrometrií a pak se vypočte množství začleněných pmol. Počet pmol každého rNTP začelněného každým enzymem se nornaali zuje k počtu pmolů odpovídajícího [a1fa-32P1dNTP začleněného každým enzymem Výsledky obsahuje následující tabulka.
Poměr začlenění rNTP do dNTP pro G46D a G46D,E6Í5G Tag
| Enzym | Počet | zač1eněnýcb | pmolů (procento) | |||||
| dATP | rATP | dGTP | rGTP | dGTP | rGTP | dTTP | rUTP | |
| G46D | 27,74 1 | 0,052 | 34,6 | 0ý76 | 36,94 | 0,133 | 28,79 | 0 |
| (100%) | (0.18%) | (100%) | (0.22%) | (100%) | (0,36%) | (100%) | (0) | |
| G46D, E615G | 0.67 | 1.41 | 2,82 | 5,33 | 3;27 | 5.96 / | 0.688 / | 0,545 |
| (100%) | (210%) | (100%) | (189%) | (100%) | (181%) | (100%) | (79%) |
Tyto výsledky ukazují, leotidy více než. 500x účinněji než G46D 181:0,36 =502x, u rCTP 189=0,22 =859x = 1166x úč i nně ji). Tud í ž chybě jící mutace u kodonu 615 poskytuje nový fenotyp: tepelně stálou polymerázu DNA schopnou účinně začleňovat ribonukleotidy přídavně k deoxyr i bonuk1eot i dum.
;e G46D, E615G začleňují ribonuk(například u rDTP a u rATP 210=0,18 v genu polymerázy
Příklad 3
Test porovnání účinnosti začleňování 3 -deoxyATP (kordycepin) • · · ·
- 38 Relativní schopnost G46D; G46D.E615G; G46D,E615G,F667Y a G46D.F667Y Taq začleňovat 3 -deoxyadenosin-5 -trifosfát (kordycepintrifosfát), se zjišťovala měřením [alfa-32P]kordycepintrifosfátu, který každý enzym mohl začlenit v omezené koncentraci enzymu do aktivované matrice DNA lososového mlíčí. K měření začlenění [alfa-32P]kordycepintrifosfátu probíhal test tak, že konečné koncentrace v 50 ql byly: 12,5 ug aktivovaného DNA lososového mlíčí, po 200 qM dCTP, dGTP a dTTP, 50 qM dATP (Perkin Elmer), 50 qM [alfa-32P]-3 -dATP/3 -dATP (New England Nuclear, Sigma), 1 mM beta-merkaptoethanolu, 25 mM N-tris[hydroxymethyl]methy1-3-aminopropansulfonové kyseliny (TAPS) pH 9,5, 20 'c, 55 mM KC1 a 2,25 mM MgCl2.
Do devíti 0,5 ml zkumavek se vnese podíl 45 ql každé reakční směsi, takže do každé reakce se vnese G46D; G46D,E615G; G46D,E615G,F667Y a G46D,F667Y Taq dvojmo, přičemž jedna zkumavka je ponechána pro kontrolu bez enzymu. Polymerizační reakce ve dvou zkumavkách testované směsi se iniciuje 5 ql (0,058 jednotek) polymerázy G46D Taq. Totéž se provede s G46DE615G Taq (0,0025 jednotek), G46D,E615G,E667Y Taq (0,0034 jednotek) nebo G46D.F66.Y Taq (0,083 jednotek). Jako kontrola na základní úroveň začala jedna zkumavka s enzym ředicím pufrem místo s enzymem.
Každá reakční směs se krátce odstředí a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 ql 60 mM EDTA a uloží se k ledu. Pro každý vzorek se 50 ql podíl ze 60 ql reakční směsi zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 qg/ml DNA míchaného losového mlíčí. DNA se vysráží TCA standardním způsobem a zfiltruje se na filtračních kotoučcích GE/C (Whatman, Kent, Anglie). Množství začleněného značeného [alfa-32P] se kvantifikuje kapalnou scintilační spektrometrií a pak se vypočte množství začleněných pmol . Počet, pmolů [alfa-32P] kordycepintrifosfátu, začleněného každým enzymem, se podělí počtem jed- 39 -
notek každého v testu použitého enzymu k získání pmol začleněných na jednotku enzymu. Výsledky obsahuje následující tabulka.
Začlenění [alfa-32P]kordycepinu G46D: G46D,E615G: G46D.E615G,
F667Y a G46D.F667Y Taq
Enzym_______Počet pmol začleněných na_jednotku enzymu
G46D 0,221
G46D,E615G 1,560
G46D,E615G,F667Y 893,6
G46D,F667Y 0,740
Výsledky ukazují, že k účinnému začleňování molekuly kordycepi nu do DNA jsou zapotřebí mutace E615 G a F667Y.
Příklad 4
Sekvencování DNA alkalickým štěpením pomocí G46D, E615G Taq
DNA polymerázy
Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy podle vynálezu k sekvencování alkalickým štěpením pomocí DNA částečně substituované rNTP. Poměr rNTP k dNTP v reakčních směsích byl 1:80 až 1=8. Reakce extense primeru se provádějí v pufru sestávajícím z 50 mM Bicinu (N,N-bis)-2-hydroxyethy1)glycin, pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCl2. Provedou se čtyři reakce, jedna pro každý ze čtyř rNTP. Každá reakční směs (50 ul) obsahuje po 200 UM dATP, dCTP, dGTP, a dTTP (Perkin-Elmer) a 0,09 pmol M13mpl8 jednořetězcové matrice DNA (Perkin-Elmer) teplotně hybridizované na 5 -[32P] značenou dG48 (Layxer a kol. PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993).
Reakční směsi také obsahují 2,5 uM rATP, 2,5 uM rCTP, 2,5M rGTP a 2,5 qM rUTP.
Každá ze čtyř reakcí se iniciuje přidáním 7 jednotek po• ·
- 40 lymerázy DNA G46D E615 Taq a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 ul 60 mM EDTA a směs se dá k ledu. Přidá se 20 u reakční směsi do 80 ul 50 mM bicinu (pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCl2· Produkty štěpení se vytvoří přidáním 7 ul IN HCI. Každá reakční směs se vysráží přísadou 312 ul 95% ethanolu a 10 ul 3M acetátu sodného (pH 4,8). Reakční směs se mikroodstřeďuje 15 minut ke shromáždění přecipitátu, supernatant se odstraní, pelety se promyjí 500 ul 70% ethanolu a vysuší se. Každá peleta se resuspenduje v 5 ul 0,5X stop-pufru (k dostání od Perkin-Elmer, Norvalk CT, který obsahuje 95 % formamidu, 20 mM EDTA a 0,05 % bromfenolové modře), o
zahřeje se na 98 C s výdrží 3 minuty a přímo se vnese do předběžně e1ektroforezovaného 6% sekvenčního gelu DNA polyakrylamid/8M močovina a podrobí se elektroforéze. Gel se vysuší a exponuje se na rentgenovém film. Výsledný film ukazuje zřetelný sekvenční žebřík, který poskytuje v nadbytku 100 bází správné sekvence.
Příklad 5
Sekvencování DNA pomocí G46D,E615G,F667Y Taq DNA polymerázy a 3 -deoxy nuk 1 eot i dt.r i f osf át.u
Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy G46D,E615G,F667Y Taq k sekvencování DNA pomocí 3 -deoxynukleotidtrifosfátu. Tento pokus byl proveden s 3 -eoxyATP; bylo by však možno rozšířit jeho použití stejně dobře na jiné 3 -deoxynukeotidy. Reakce extense primeru byly provedeny v pufru obsahujícím 50 mM bicinu, ( pb 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCl2·
Každá reakční směs (50 ul) obsahovala po 200 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer) teplotně hybridizovanýcb na 5 -[32P] značené DG48 (Lavyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Reakční směsi obsahovaly také 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 nebo 5 uM 3 -deoxyATP.
Každá reakce se iniciuje přidáním 7 jednotek G46D, E615G,
9
F667Y Taq DNA polymerázy a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 ql 60 mM EDTA a dá se k ledu.
Třicet ql každé reakční směsi se vysráží ethanolem a resuspenβ duje se ve stop pufru. zahřeje se na teplotu 98 C s výdrží 3 minuty a přímo se vnese do předběžně elektroforezovaného 6% sekvenčního gelu DNA polyakrylamid/8M močovina a podrobí se e1ektroforéze. Gel se vysuší a exponuje se na rentgenový film. Dráhy, obsahující rekce provedené v přítomnosti kordycepinu, obsahují zřetelně rozeznatelné terminační žebříky. Dráhy obsahující nejvíce kordycepinu, například 5 uM vykázaly terminační žebříky, ve kterých, v průměru, byly pásy kratší než dráhy, ve kterých byly úrovně kordycepinu nižší. Dráha, obsahující reakci provedenou v nepřítomnosti kordycepinu, vykazovaly většinou produkt v plné délce a žádný terminačné žebřík. Tyto výsledky naznačují, že mutantní enzym je schopen začleňovat kordycepin a začlenění této molekuly do produktu extense primeru způsobuje terminaci. Tohoto způsobu by mohlo být použito také k vytváření sekvenčního žebříku NA s 3 -deoxyCTO, 3 -deoxyGTP a 3 -deoxy UTP.
Příklad 6
Sekvencování barvou značeného primeru PCR G46D E615G Taq DNA polymerázou
Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy podle vynálezu na sekvencování značeného primeru, použitím ribonukleosidových tri fosfátů (rNTP) v PCR při poměru rNTP:dNTP nepřesahujícím 1:30. Provedou se čtyři individuální reakce, jedna pro každý rNTP. Sekvenční reakce PCR se provedou v pufru sestávajícím z 25 mM Tris -HC1 (pH 9), 5,0 mM MgCl2 a objemově 10 % glycerolu. Každá reakční směs obsahuje po 500 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer) , matrici 5xl06 copy/ql pBSMl3 + plasm id (Stratagene) 1inearizovanou restrikční endonukleázou XmnI a 0,05 jednotek/ql DNA polymerázy G46D E615 G Taq. Reakce ribo-ATP (10 ql) obsahovaly 2,5 qM ATP (Pharmacia « t · · · • · • »
I · · « • · · • · · · I • · « ·· ··
- 42 Biotech), 0,1 yM JOE M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 yM primeru ASC46 (5 -CGCCATTCGCCATTCAG). Rekace ribo-CTP (10 yl) obsahovaly 2,5 uM CTP (Pharmacia Biotech), 0,1 yM FAM M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a O,1 yM primeru ASC46. Rekace ribo-GTP (20 l?1 ) obsahovaly 2,5 yM GTP (Pharmacia Biotech), 0,1 yM TAMRA M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 yM primeru ASC46. Rekace ribo-UTP (20 yl) obsahovaly 16 yM UTP (Pharmacia Biotech), 0,1 yM ROX Ml3 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 yM primeru ASC46.
Každá ze čtyř reakčních směsí byla umístěna do předehřátého (75 C) tepelného cyklovače Perkin Elmer GenaAmpRPCR systém 9600 a podrobena 30 cyklům po 95 C 10 sekund, 55 C o o sekund, 1 minutu na 65 C a 65 C 5 minut. Každá reakce rATP a rCTP vytvořila 6x1011 kopií značeného zesíleného produktu 300 páru bází a každá reakce rGTP a UTP l,2xl012 kopií značeného zesíleného produktu 300 páru bází a teplem, neutralizují se a z každé reakční směsi ATP a
K určení sekvence DNA zesílených produktů PCR bez požadování separátní enzymatické reakce sekvencující DNA, se reakční směsi shromáždí, zpracují se bází vysrážejí se. Shromáždí se 4 yl
CTP a 8 yl z každé reakční směsi GTP a UTP. Do spojené reakční směsi se přidají 2 y 0,25 M EDTA (pH 8,0) (10 mM konečné),
ÍO yl IM NaOH (200 mM konečné) a 14 yl vody a inkubují se 5 minut při teplotě 95 C v tepelném cyklovači GenaAmpRPCR systém 9600 a neutrálizjí se 10 yl IM HC1. Spojené reakční směsi se pak vysrážejí přísadou 150 yl 95% ethanolu s následnou inkubací 15 minut při teplotě 4 C. Pak se provede 15-minutové mikroodstředění při teplotě 4 C ke shromáždění sraženiny a supernatant se odsaje. Pelety se promyjí 300 yl 70% ethanolu, mikroodstředí se 5 minut, supernatant se odsaje vysuší. Pelety se resuspendují v 6 yl formamidu, a pelety se mg/ml dextranové modři (ve 25 mM EDTA) 5:1 (objemově) a 3 minuty se udršuj í na teplotě 90 C. ííí yl resuspendovaných pelet se pří·» Β··· • · · · • · ·· • * ♦
♦ ···
« « · β · »· ·« mo naloží na předem elektroforezovaný 5% Long Ranger 6M močovinový sekvenční gel f FMC BioProducts). Pak se provede elektroforéza a analýza na sekvenceru DNA Perkin Elmer ABI Prism™ podle výrobcových pokynů. Výsledkem softveru automatizovaného vyvolávání bází je větší než 99% přesnost k určení sekvence DNA PCR zesíleného 300 páru bází.
EfLŮmyslPVÁ.. vyuě i telnost
Enzym tepelně stálé DNA polymerázy vykazující sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou do řetězců DNA různé sekvence se zvýšenou účinností a výhodný v mnoha aplikacích syntesy in vitro.
• · • ·
- 44 • · · · A · · ··· ····· ·· ·· · · · · (1) Obecná informace
| Přihlašovatel ·' |
| (A) F. Hoffmann-La Roche Ltd |
| (B) ulice: Grenzacherstrasse 124 |
| (C) město: Basel |
| (D) stát: BS |
| (E) země: BS |
| (F) poštovní kód (ZIP): CH-4070 |
| (G) telefon: (0)61 688 24 03 |
| (H) telefax: (0)61 688 13 95 |
| (I) telex: 962292/965512 hlr ch |
(ii) Název vynálezu: Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje (iii) Počet sekvenci: 13 ( iv) Počítačem čitelná forma:
(A) typ prostředí: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: PatentInRe1ease tt 1,0, verse # 1,30 ( EPO) (vi) Současné údaje o přihlášce vynálezu'· (A) číslo přihlášky vynálezu: US 60/023,376 (B) datum podání: 06-AUG-1996 (2) Informace pro SEQ ID NO:1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: peptid (Β) 1okace: 4
- 45 ( D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka= kde Xaa je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Glu (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: paptid (B) lokace'· 7 ( D) jiná i nf ormace '/ označen í = Xaa /poznámka= kde Xaa je Ile nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:
Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa (2) Informace pro SEQ ID NO:2:
(i) Charakteristiky sekvence'· (A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: peptid (Β) 1okace: 7 (D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka^ kde Xaa je Ile nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:
Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO:3 (i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence'· SEQ ID NO: 3: Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val
- 46 • · · · · · • · · 9 9 9 9 9 • ··· 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 • · · · · ·· · · (2) Informace pro SEQ ID NO ·'4:
(i) Charakteristiky sekvence'· (A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie'· lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO '· 4: Ser Gin Ile Glu Leu Arg Ile 1 5 ( 2) Informace pro SEQ ID NO'· 5 :
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (Dl topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:
Leu Asp Tyr Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser (2) Informace pro SEQ ID NO : 6 '· (i) Charakter istiky sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina ( D) topologie: lineární ( i i) Typ moleku1y pept i d (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:
Leu Asp Tyr Ser Gin Ile Giy Leu Arg Val Leu Ala His Leu ς 15 10 2 (2) Informace pro SEQ ID NO7 (i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka·' 2626 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (D) topologie'· lineární Typ molekuly' DNA (genomická) • · • · · · « · • · · · · · · ·· · ·· «· · ·
| ( i i i) | Hypotetická: ne | ||
| ( iv) | Antisens: ne | ||
| ( vi) | Originální zdroj: | ||
| ÍA) organ ismusThermus aqnaticus | |||
| ( i X ) | Charakter i st i ky | ||
| (A) jméno/klíč: CDS | |||
| (B) 1okace: 121..2616 | |||
| ( xi ) | Popis sekvence: SEQ ID NO:7: | ||
| aagctcagat | CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC | GAGGGGGAGA | 60 |
| GGGAGGCGTT | TCTAAAAGCC CTTCAC-GACG CTACCCGGGG GCGGGTGGTG | GAAGGGTAAC | 120 |
| ATG Met 1 | AGG GGG | ATG Met | CTG Leu 5 | CCC Pro | CTC Leu | TTT Phe | GAG Glu | CCC Pro 10 | AAG Lys | GGC Gly | CGG Arg | GTC Val | CTC Leu 15 | CTG Leu | 168 | |
| Arg | Gly | |||||||||||||||
| GTG | GAC | GGC | CAC | CAC | CTG | GCC | TAC | CGC | ACC | TTC | CAC | GCC | CTG | AAG | GGC | 216 |
| Val | Asp | Gly | His | His | Leu | Ala | Tyr | Aro | Thr | Phe | His | Ala | Leu | Lys | Gly | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| CTC | ACC | ACC | AGC | CGG | GGG | GAG | CCG | GTG | CAG | GCG | GTC | TAC | GGC | TTC | GCC | 264 |
| Leu | Thr | Thr | Ser | Arg | Gly | Glu | Pro | Val | Gin | Ala | Val | Tyr | Gly | Phe | Ala | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| AAG | AGC | CTC | CTC | AAG | GCC | CTC | AAG | GAG | GAC | GGG | GAC | GCG | GTG | ATC | GTG | '312 |
| Lys | Ser | Leu | Leu | Lys | Ala | Leu | Lys | Glu | Asp | Gly | Asp | Ala | Val | Ile | Val | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GTC | TTT | GAC | GCC | AAG | GCC | CCC | ^^C | TTC | CGC | CAC | GAG | GCC | TAC | GGG | GGG | 360 |
| Val | Phe | Asp | Ala | Lys | Ala | Pro | Ser | Phe | Arg | His | Glu | Ala | Tyr | Gly | Gly | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| TAC | AAG | GCG | GGC | CGG | GCC | CCC | ACG | CCG | GAG | GAC | TTT | CCC | CGG | CAA | CTC | 408 |
| Tyr | Lys | Ala | Gly | Arg | Ala | Pro | Th | P ro | Glu | Asp | Phe | Pro | Arg | Gin | Leu | |
| 85 | 90 | 55 | ||||||||||||||
| GCC | CTC | ATC | AAG | GAG | CTG | GTG | GAC | CTC | CTG | GGG | CTG | GCG | CGC | CTC | GAG | 456 |
| Ala | Leu | Ile | Lys | Glu | Leu | Val | Asp | Leu | Leu | Gly | Leu | Ala | Arg | Leu | Glu | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GTC | CCG | GGC | TAC | GAG | GCG | GAC | GAC | GTC | CTG | GCC | AGC | CTG | GCC | AAG | AAG | 504 |
| Val | Pro | Gly | Tyr | Glu | Ala | Asp | Asp | Val | Leu | Ala | Ser | Leu | Ala | Lys | Lys | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| GCG | GAA | AAG | GAG | GGC | TAC | GAG | GTC | CGC | ATC | CTC | ACC | GCC | GAC | AAA | GAC | 552 |
| Ala | Glu | Lys | Glu | Gly | Tyr | Glu | Val | Arg | Ile | Leu | Thr | Ala | Asp | Lys | Asp | |
| 130 | 135 | 140 |
- 48 • · · · • · · ·· · ···· ···· · · · · ··· • · ··· · · · ···· · ··· ···· · · · ····· ·· ·· · · · ·
| CTT Leu 145 | TAC Tyr | CAG Gin | CTC Leu | CTT Leu | TCC Ser 150 | GAC Asp | CGC Arg | ATC Ile | CAC His | GTC Val 155 | CTC Leu | CAC His | CCC Pro | GAG Glu | GGG Gly 160 | 600 |
| TAC | CTC | ATC | ACC | CCG | GCC | TGG | CTT | TGG | GTA | TAG | TAC | GGC | CTG | AGG | CCC | 648 |
| Tyr | Leu | Ile | Thr | Pro 165 | Ala | Trp | Leu | Trp | Glu 170 | Lys | Tyr | Gly | Leu | Arg 175 | Pro | |
| GAC | CAG | TGG | GCC | GAC | TAC | CGG | GCC | CTG | ACC | GGG | GAC | GAG | TCC | GAC | AAC | 696 |
| Asp | Gin | Trp | Ala 180 | Asp | Tyr | Arg | Ala | Leu 185 | Thr | Gly | Asp | Glu | Ser 190 | Asp | Asn | |
| CTT | CCC | GGG | GTC | TAG | GGC | ATC | Ucvj: | GAG | AAG | ACG | GCG | AGG | AAG | CTT | CTG | 744 |
| Leu | Pro | Gly 195 | Val | Lys | Gly | Gly 2 '' 0 | Glu | Lys | Thr | Ala | Arg 205 | Lys | Leu | Leu | ||
| GAG | GAG | TGG | LjVJVa | λ Γ r' .-.O A- | CTG | (— *. υΛΛ | CTC | CTC | AAG | AAC | CTG | GAC | CGG | 792 | ||
| Glu | Glu 210 | Trp | Gly | Ser | Leu | Glu 215 | Ala | Leu | Leu | Lys | Asn 220 | Leu | Asp | Arg | Leu | |
| AAG | CCC | GCC | ATC | CGG | GAG | AAC- | •Λ | CTG | GCC | CAC | ATG | GAC | GAT | CTG | AAG | 840 |
| Lvs 225 | Pro | Ala | 116 | Arg | Glu 23C | Lys | __e | Leu | Ala | His 235 | Ker | Asp | Asp | Leu | Lys $ / o |
| CTC Leu | TCC Ser | TGG Trp | GAC Asp | CTG Leu 245 | GCC Ala | AAG Lys | GTG v a 1 | CGC Arg | ACC Thr 250 | GAC Asp | CTG Leu | CCC Pro | CTG Leu | GAG Glu 255 | GTG Val | δδδ |
| GAC | TTC | GCC | AAA | AGG | CGG | GAG | CCC | GAC | CGG | GAG | AGG | CTT | AGG | GCC | TTT | 936 |
| Asp | Phe | Ala | Lys 260 | Arg | Arg | Glu | Pro | Asp 2 6*5 | Arg | Glu | Arg | Leu | Arg 270 | Ala | Phe | |
| CTG | GAG | AGG | CTT | GAG | TTT | GGC | AGC | CTC | CTC | CAC | GAG | TTC | GGC | CTT | CTG | 984 |
| Leu | Glu | Arg 275 | Leu | Glu | Phe | Gly | Ser 280 | Leu | Leu | His | Glu | Phe 285 | Gly | Leu | Leu | |
| GAA | AGC | CCC | AAG | GCC | CTG | GAG | GAG | GCC | CCC | TGG | CCC | CCG | CCG | GAA | GGG | 1032 |
| Glu | Ser | Pro | Lys | Ala | Leu | Glu | Glu | Ala | Pro | Trp | Pro | Pro | Pro | Glu | Gly |
290 295 300
| GCC Ala 305 | TTC Phe | GTG Val | GGC Gly | TTT Phe | GTG CTT | TCC Ser | CC-C Arg | AAG Lys | GAG Glu 315 | CCC ATG | TGG Trp | GCC Ala | GAT Asp 320 | 1030 | ||
| Val 310 | Leu | Pro | Met | |||||||||||||
| CTT | CTG | CCC | CTG | GCC | GCC | GCC | AGG | GGG | GGC | CGG | GTC | CAC | CGG | GCC | CCC | 1128 |
| Leu | Leu | Ala | Leu | Ala 325 | Ala | Ala | Arg | Gly | Gly 330 | Arg | Val | His | Arg | Ala 335 | Pro | |
| GAG | CCT | TAT | AAA | GCC | CTC | AGG | GAC | CTG | AAG | GAG | GCG | CGG | GGG | CTT | CTC | 117 6 |
| Glu | Pro | Tyr | Lys 340 | Ala | Leu | Arg | Asp | Leu 345 | Lys | Glu | Ala | Arg | Gly 350 | Leu | Leu |
- 49 • · · · ·· · ···· • · ··· · ·· · · · · · * · · « · · · ··· ··· ·· ·· ·· ·· «·
| GCC Ala | AAA GAC | CTG Leu | AGC Ser | GTT Val | CTG GCC CTG | AGG Arg | GAA Glu | GGC Gly | CTT Leu 365 | GGC Gly | CTC Leu | CCG Pro | 1224 | |||
| Lys | Asp 355 | Leu | Ala 360 | Leu | ||||||||||||
| CCC | GGC | GAC | GAC | CCC | ATG | CTC | CTC | GCC | TAC | CTC | CTG | GAC | CCT | TCC | AAC | 1272 |
| Pro | Gly | Asp | Asp | Pro | Met | Leu | Leu | Ala | Tyr | Leu | Leu | Asp | Pro | Ser | Asn | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| ACC | ACC | CCC | GAG | GGG | GTG | GCC | CGG | CGC | TAC | GGC | GGG | GAG | TGG | ACG | GAG | 1320 |
| Thr | Thr | Pro | Glu | Gly | Val | Ala | Arg | Arg | Tyr | Gly | Gly | Glu | Trp | Thr | Glu | |
| 385 | 390 | 395 | 4 00 | |||||||||||||
| GAG | GCG | GGG | GAG | CGG | GCC | GCC | CTT | TCC | GAG | AGG | CTC | TTC | GCC | AAC | CTG | 1368 |
| Glu | Ala | Gly | Glu | Arg | Ala | Ala | Leu | Ser | Glu | Arg | Leu | Phe | Ala | Asn | Leu | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| TGG | GGG | AGG | CTT | GAG | GGG | GAG | GAG | AGG | CTC | CTT | TGG | CTT | TAC | CGG | GAG | 1416 |
| Trp | Gly | Arg | Leu | Glu | Gly | Glu | Glu | Arg | Leu | Leu | Trp | Leu | Tyr. | Arg | Glu | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| GTG | GAG | AGG | CCC | CTT | TCC | GCT | C-TC | CTG | GCC | CAC | ATG | GAG | GCC | ACG | GGG | 1464 |
| Val | Glu | Arg | Pro | Leu | S θ 27 | Ala | \ 31 | Leu | Ala | His | Met | Glu | Ala | Thr | Gly | |
| 435 | 445 | |||||||||||||||
| GTG | CGC | CTG | GAC | GTG | TAT | c?C | AGG | GCC | TTG | TCC | CTG | GAG | GTG | GCC | 1512 | |
| Val | Arg | Leu | Asp | Val | Ala | Tyr | ’ ro; * | Arg | Ala | Leu | Ser | Leu | Glu | Val | Ala | |
| 4 50 | 4 55 | 460 |
| GAG Glu 4 65 | GAG Glu | ATC Ile | GCC Ala | CGC Arg | CTC Leu 47 0 | GAG Glu | GCC Ala | GAG Glu | C-TC Val | TTC Phe 475 | CC-C Arg | CTG Leu | GCC Ala | GGC Gly | CAC His 480 | |
| CCC | TTC | AAC | CTC | AAC | TCC | /“'Ζ-’Ζ- | Z“* Z~> | Cit | GAA | AGG | GTC | CTC | TTT | GAC | 160 8 | |
| Pro | Phe | Asn | Leu | Asn 485 | Ser | Arg | Aso | C-ln | Leu 490 | Glu | Arg | Val | Leu | Phe 495 | Asp | |
| GAG | CTA | GGG | CTT | CCC | GCC | ATC | AAG | ACG | C-AG | AAG | ACC | GGC | AAG | CGC | 165 6 | |
| Glu | Leu | C-ly | Leu 500 | Pro | Ala | Ile | Gly | Lys 505 | Thr | Glu | Lys | Thr | Gly 510 | Lys | Arg | |
| TCC | ACC | AGC | GCC | GCC | C-TC | CTG | GAG | GCC | LiCz | CGC | GAG | GCC | CAC | CCC | ATC | 17 0 4 |
| Ser | Thr | Ser 515 | Ala | Ala | Val | Leu | Glu 520 | Ala | Leu | Arg | Glu | Ala 525 | His | Pro | Ile | |
| GTG | GAG | AAG | ATC | CTG | CAG | TAC | CC-G | GAG | CTC | ACC | AAG | CTG | AAG | AGC | ACC | 1752 |
| Val | Glu 530 | Lys | Ile | Leu | Gin | Tyr 535 | Arg | C-iu | Leu | Thr | Lys 540 | Leu | Lys | Ser | Thr | |
| TAC | ATT | GAC | CCC | TTG | CCG | GAC | CTC | ATC | CAC | CCC | AGG | ACG | GGC | CGC | CTC | 1800 |
| Tyr 545 | Ile | Asp | Pro | Leu | Pro 550 | Asp | Leu | I le | His | Pro 555 | Arg | Thr | Gly | Arg | Leu 560 |
• · · • · · « ·
| CAC His | ACC Thr | CGC Arg | TTC Phe | AAC Asn 565 | CAG Gin | ACG Thr | GCC Ala | ACG Thr | GCC Ala 570 | ACG Thr | GGC Gly | AGG Arg | CTA Leu | AGT Ser 575 | AGC Ser | 184 8 |
| TCC | GAT | CCC | AAC | CTC | CAG | AAC | ATC | CCC | GTC | CGC | ACC | CCG | CTT | GGG | CAG | 1896 |
| Ser | Asp | Pro | Asn 580 | Leu | Gin | Asn | Ile | Pro 585 | Val | Arg | Thr | Pro | Leu 590 | Gly | Gin | |
| AGG | ATC | CGC | CGG | GCC | TTC | ATC | GCC | GAG | GAG | GGG | TGG | CTA | TTG | GTG | GCC | 194 4 |
| Arg | Ile | Arg 595 | Arg | Ala | Phe | Ile | Ala 600 | Glu | Glu | Gly | Trp | Leu 605 | Leu | Val | Ala | |
| « CTG | GAC | TAT | AGC | CAG | ATA | GGG | CTC | AGG | GTG | CTG | GCC | CAC | CTC | TCC | GGC | 1992 |
| Leu | Asp 610 | Tyr | Ser | Gin | Ile | Gly 615 | Leu | Arg | Val | Leu | Ala 620 | His | Leu | Ser | Gly | |
| GAC | GAG | AAC | CTG | ATC | CGG | GTC | TTC | CAG | GAG | GGG | CGG | GAC | ATC | CAC | ACG | 2040 |
| Asp 625 | Glu | Asn | Leu | Ile | Arg 630 | Val | Phe | Gin | Glu | Gly 635 | Arg | Asp | Ile | His | Thr 640 | |
| GAG | ACC | GCC | AGC | TGG | ATG | TTC | GGC | GTC | CCC | CGG | GAG | GCC | GTG | GAC | CCC | 2088 |
| Glu | Thr | Ala | Ser | Trp 645 | Met | Phe | Gly | Val | Pro 650 | Arg | Glu | Ala | Val | Asp 655 | Pro | |
| CTG | ATG | CGC | CGG | GCG | GCC | AAG | l rg | AAC | TTC | GGG | GTC | CTC | TAC | GGC | 2136 | |
| Leu | Met | Arg | Arg 650 | Ala | Ala | Lys | Tr.r | I le 665 | Asn | Phe | Gly | Val | Leu 690 | Tyr | Gly | |
| ATG | TCG | GCC | CAC | ' CGC | CTC | TCC | -2 3 | a a g | Ο1 ~ | GCC | ATC | CCT | TAC | GAG | GAG | 2184 |
| Met | S? r | Ala 69 5 | His | Arg | Leu | Ser | Glr. β ς 0 | Clu | Le u | Ala | Ile | Pro 685 | Tyr | Glu | Glu | |
| GCC | CAG | GCC | TTC | ATT | GAG | CGC | — Γ | -_T | CAG | AGC | TTC | CCC | AAG | GTG | CGG | 2232 |
| Ala | (Z 1 | Ala | Phe | Ile | Glu | Arg | . . V- | Pne | Gin | Ser | Phe | Pro | Lys | Val | Arg |
590 595 900
| C-CC Ais 705 | (z | ATT Ile | GAG Glu | AAG Lys | ACC Thr 710 | CTG Leu | GAG Glu | GAG Glu | AGG Ar a 715 | AGG Arg | CGG Arg | GGG Gly | TAC Tyr | GTG Val 720 | 2250 | |
| GAG | ΐ-'Γ' | CTC | TTC | GGC | CGC | CGC | CGC | TAC | GTG | CCA | GAC | CTA | GAG | GCC | CGG | 2328 |
| Gru | Thr | Leu | Phe | Gly 725 | Arg | Arg | Arg | Tyr | Val 730 | Pro | Asp | Leu | Glu | Ala 735 | Arg | |
| GTG | AAG | AGC | GTG | CGG | GAG | GCG | GCC | GAG | CGC | ATG | GCC | TTC | AAC | ATG | CCC | 2376 |
| Val | Lys | Ser | Val 740 | Arg | Glu | Ala | Ala | Glu 745 | Arg | Met | Ala | Phe | Asn 750 | Met | Pro | |
| GTC | CAG | GGC | ACC | GCC | GCC | GAC | CTC | ATG | AAG | CTG | GCT | ATG | GTG | AAG | CTC | 2424 |
| Val | Gin | Gly 755 | Thr | Ala | Ala | Asp | Leu 760 | Met | Lys | Leu | Ala | Met 765 | Val | Lys | Leu | |
| TTC | CCC | AGG | CTG | GAG | GAA | ATG | GGG | GCC | AGG | ATG | CTC | CTT | CAG | GTC | CAC | 2472 |
| Phe | Pro 770 | Arg | Leu | Glu | Glu | Met 775 | Gly | Ala | Arg | Met | Leu 780 | Leu | Gin | Val | His |
• · • ·· ·· ···· • · « · · · • · · · · · · • · · · · · · » · · · · · • · · ···· · · · • · · · · · · · A « · « «
| GAC Asp 785 | GAG Glu | CTG Leu | GTC Val | CTC Leu | GAG Glu 790 | GCC Ala | CCA Pro | AAA Lys | GAG Glu | AC-G Arg 795 | GCG Ala | GAG Glu | GCC Ala | GTG Val | GCC Ala 800 | 2520 |
| CGG | CTG | GCC | AAG | GAG | GTC | ATG | GAG | GGG | GTG | TAT | CCC | CTG | GCC | GTG | CCC | 2568 |
| Arg | Leu | Ala | Lys | Glu 805 | Val | Met | Glu | Gly | Val 810 | Tyr | Pro | Leu | Ala | Val 815 | Pro | |
| CTG | GAG | GTG | GAG | GTG | GGG | ATA | GGG | GAG | GAC | TGG | CTC | TCC | GCC | AAG | GAG | 2616 |
| Leu | Glu | Val | Glu | Val | Gly | Ile | Gly | Glu | Asp | Trp | Leu | Ser | Ala | Lys | Glu |
820 825 830
TGATACCACC 2626 (2) Informace pro SEQ ID NO:8:
( i) Charakteristiky sekvence:
(A) délka: 832 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární
| ( | i i) | Typ molekuly: | prote i n | ||||||||||||
| (xi) | Popis | sekvence | -: SEQ ID NO | : 8 : | |||||||||||
| Meu 1 | Arg | Gly | Met | Leu 5 | Pro | Leu | Phe | Glu | Pro 10 | Lys | Gly | Arg | Val | Leu 15 | Leu |
| Val | Asp | Gly | His 20 | His | Leu | Ala | Tyr | Arg 2 5 | Thr | ?h° | His | Ala | Leu 30 | Lys | Gly |
| Leu | Thr | Thr 35 | Ser | Arg | Gly | Glu | Pro r\ -i v | Val | C-ln | Ala | Val | Tyr 45 | Gly | Phe | Ala |
| Lys | Ser | Leu | Leu | Lys | Ala | Leu 55 | Lys | Glu | Asp | Gly | Asp 60 | Ala | Val | Ile | Val |
| Val 65 | Pire | Asp | Ala | Lys | Ala 70 | Pro | Ser | Phe | Arg | His 7 | Glu | Ala | Tyr | Gly | Gly 80 |
| Tyr | Lys | Ala | Gly | Arg 85 | Ala | Pro | Thr | P ro | Glu 90 | As o | Phe | Pro | Arg | Gin 95 | Leu |
| Ala | Leu | Ile | Lys 100 | Glu | Leu | Val | Asp | Leu 105 | Leu | Gly | Leu | Ala | Arg 110 | Leu | Glu |
| Val | Pro | Gly 115 | Tyr | Glu | Ala | Asp | Asn 120 | Val | Leu | Ala | Ser | Leu 125 | Ala | Lys | Lys |
| Ala | Glu 130 | Lys | Glu | Gly | Tyr | Glu 135 | Val | Arg | Ile | Leu | Thr 140 | Ala | Asp | Lys | Asp |
• ·
| Leu 145 | Tyr | - 52 | Val 155 | Leu | • · · His | • · Pro | • · Glu | * · Gly 160 | |||||||
| Gin | Leu | Leu | Ser Asp 150 | Arg | Ile | His | |||||||||
| Tyr | Leu | Ile | Thr | Pro | Ala | Trp | Leu | Trp | Glu | Lys | Tyr | Gly | Leu | Arg | Pro |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asp | Gin | Trp | Ala | Asp | Tyr | Arg | Ala | Leu | Thr | Gly | Asp | Glu | Ser | Asp | Asn |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Leu | Pro | Gly | Val | Lys | Gly | Ile | Gly | Glu | Lys | Thr | Ala | Arg | Lys | Leu | Leu |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Trp | Gly | Ser | Leu | Glu | Ala | Leu | Leu | Lys | Asn | Leu | Asp | Arg | Leu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Pro | Ala | Ile | Arg | Glu | Lys | Ile | Leu | Ala | His | Met | Asp | Asp | Leu | Lys |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Leu | Ser | Trp | Asp | Leu | Ala | Lys | Val | Arg | Thr | Asp | Leu | Pro | Leu | Glu | Val |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Asp | Phe | Ala | Lys | Arg | Arg | Glu | Pro | Asp | Arg | Glu | Arg | Leu | Arg | Ala | Phe |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Leu | Glu | Arg | Leu | Glu | Phe | Gly | Ser | Leu | Leu | His | Glu | Phe | Gly | Leu | Leu |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Glu | Ser | Pro | Lys | Ala | Leu | Glu | Glu | Ala | Pro | Trp | Pro | Pro | Pro | Glu | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Ala | Phe | Val | Gly | Phe | Val | Leu | Ser | Arg | Lys | Glu | Pro | Met | Trp | Ala | Asp |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Leu | Leu | A.l a | Leu | Ala | Ala | Ala | Arg | Gly | Gly | Arg | Val | His | Arg | Ala | Pro |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| C-lu | Pr: | Tyr | Lys | Ala | Leu | Arg | Asp | Leu | Lys | Glu | Ala | Arg | Gly | Leu | Leu |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ala | Asp | Leu | Ser | Val | Leu | Ala | Leu | Arg | Glu | Gly | Leu | Gly | Leu | Pro | |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| ?r: | Asp | Aso | Pro | Met | Leu | Leu | Ala | Tyr | Leu | Leu | Asp | Pro | Ser | Asn | |
| 373 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Thr | Thr | Pro | Glu | Gly | Val | Ala | Arg | Arg | Tyr | Gly | Gly Glu | Trp Thr Glu | |||
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Glu | Ala | Gly | Glu | Arg | Ala | Ala | Leu | Ser Glu | Are | Leu Phe | Ala Asn Leu | ||||
| 405 | 410 | 415 |
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 • · • · · · • ·
| • · · | • · | • · | • · | ||||||||||||
| - | 53 | - | |||||||||||||
| Val | Glu | Arg 435 | Pro | Leu | Ser | Ala | Val 440 | Leu | Ala | His | Met | Glu 445 | Ala | Thr | Gly |
| Val | Arg 450 | Leu | Asp | Val | Ala | Tyr 455 | Leu | Arg | Ala | Leu | Ser 460 | Leu | Glu | Val | Ala |
| Glu 465 | Glu | Ile | Ala | Arg | Leu 470 | Glu | Ala | Glu | Val | Phe 475 | Arg | Leu | Ala | Gly | His 480 |
| Pro | Phe | Asn | Leu | Asn 485 | Ser | Arg | Asp | Gin | Leu 490 | Glu | Arg | Val | Leu | Phe 495 | Asp |
| Glu | Leu | Gly | Leu 500 | Pro | Ala | Ile | Gly | Lys 505 | Thr | Glu | Lys | Thr | Gly 510 | Lys | Arg |
| Ser | Thr | Ser 515 | Ala | Ala | Val | Leu | Glu 520 | Ala | Leu | Arg | Glu | Ala 525 | His | Pro | Ile |
| Val | Glu 530 | Lys | Ile | Leu | Gin | Tyr 535 | Arg | Glu | Leu | Thr | Lys 540 | Leu | Lys | Ser | Thr |
| Tyr 545 | Ile | Asp | Pro | Leu | Pro 550 | Asp | Leu | Ile | His | Pro 555 | Arg | Thr | Gly | Arg | Leu 560 |
| His | Thr | Arg | Phe | Asn 565 | Gin | Thr | Ala | Thr | Ala 570 | Thr | Gly | Arg | Leu | Ser 575 | Ser |
| Ser | Asp | Pro | Asn 580 | Leu | Gin | Asn | Ile | Pro 585 | Val | Arg | Thr | Pro | Leu 590 | Gly | Gin |
| Arg | Ile | Arg 595 | Arg | Ala | Phe | Ile | Ala 600 | Glu | Glu | Gly | Trp | Leu 605 | Leu | Val | Ala |
| Leu | Asp 610 | Tyr | Ser | Gin | Ile | Gly 615 | Leu | Arg | Val | Leu | Ala 620 | His | Leu | Ser | Gly |
| Asp 625 | Glu | Asn | Leu | Ile | Arg 630 | Val | Phe | Gin | Glu | Gly 635 | Arg | Asp | Ile | His | Thr 640 |
| Glu | Thr | Ala | Ser | Trp 645 | Met | Phe | Gly | Val | Pro 650 | Arg | Glu | Ala | Val | Asp 655 | Pro |
| Leu | Met | Arg | Arg 660 | Ala | Ala | Lys | Thr | Ile 665 | Asn | Phe | Gly | Val | Leu 670 | Tyr | Gly |
| Met | Ser | Ala 675 | His | Arg | Leu | Ser | Gin 680 | Glu | Leu | Ala | Ile | Pro 685 | Tyr | Glu | Glu |
| Ala | Gin 690 | Ala | Phe | Ile | Glu | Arg 695 | Tyr | Phe | Gin | Ser | Phe 700 | Pro | Lys | Val | Arg |
• · • · • ·
| Ala | Trp | Ile | Glu | Lys | Thr | Leu | Glu | Glu | Gly | Arg | Arg | Arg | Gly | Tyr | Val |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Glu | Thr | Leu | Phe | Gly | Arg | Arg | Arg | Tyr | Val | Pro | Asp | Leu | Glu | Ala | Arg |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| Val | Lys | Ser | Val | Arg | Glu | Ala | Ala | Glu | Arg | Met | Ala | Phe | Asn | Met | Pro |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| Val | Gin | Gly | Thr | Ala | Ala | Asp | Leu | Met | Lys | Leu | Ala | Met | Val | Lys | Leu |
| 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| Phe | Pro | Arg | Leu | Glu | Glu | Met | Gly | Ala | Arg | Met | Leu | Leu | Gin | Val | His |
| 770 | 775 | 780 | |||||||||||||
| Asp | Glu | Leu | Val | Leu | Glu | Ala | Pro | Lys | Glu | Arg | Ala | Glu | Ala | Val | Ala |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| Arg | Leu | Ala | Lys | Glu | Val | Met | Glu | Gly | Val | Tyr | Pro | Leu | Ala | Val | Pro |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| Leu | Glu | Val | Glu | Val | Gly | Ile | Gly | Glu | Asp | Trp | Leu | Ser | Ala | Lys | Glu |
| 820 | 825 | 830 |
Claims (22)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, který obsahuje sekvenci aminokyselin SerGlni1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:1), kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).
- 2. Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, podle nároku 1, který je rekombinantním derivátem přírodně se vyskytující tepelně stálé polymerázy DNA, kde přírodně se vyskytující tepelně stálá DNA polymeráza obsahuje motiv aminokyselinové sekvence SerGlni1eGluLeuArgXaa (SEQ ID No:2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je valinnový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).
- 3. Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, podle nároku 2, vykazující sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou.
- 4. Tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 3, vykazující schopnost začleňovat neobvyklé nukleotidy je oproti schopnosti odpovídající nativní formy polymerázy začleňovat takové neobvyklé nukleotidy zvýšenou nejméně 20x.
- 5. Tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 4, mající postačující aktivitu k použití v sekvenční reakci DNA, která obsahuje neobvyklý nukleotid, kterým je s výhodou ribonuk1eosidtrifosfát a odpovídající obvyklý nukleotid v poměru 1:1 nebo menším.
- 6. Tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 4, mající postačující aktivitu k použití v sekvenční reakci DNA,4 4 4- 56 která obsahuje neobvyklý nukleotid, kterým je s výhodou ribonukleosidtrifosfát obsažený v koncentraci méně než 100 qM a odpovídající obvyklý nukleotid, který je obsažen v koncentaci vyšší než 100 qM.
- 7. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym podle nároku 1 až 4, který je rekombinantním derivátem enzymu přírodně se vyskytující tepelně stálé DNA polymerázy z organismu voleného ze souboru zahrnujícího Thermus aquaticus, Thermus caldophlilus, Thermus chliarophi 1us, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophi1um, Bačilus caldotenax a Bacílus stearothermophi1us.
- 8. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym podle nároku 2 až 6, který je rekombinantnim derivátem přírodně se vyskytující tepelně stálé Thermus species DNA polymerázy, s výhodou Taq DNA polymerázy DNA nebo její homologické polymerázy, nejvýhodněji tepelně stálé DNA polymerázy obsahující aminokyselinovou sekvenci LeuAspTyrSerG1 ni1eGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO:5).
- 9. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym podle nároku 1 aě 6, mající nejméně 39 %, výhodně 60 %, výhodněji alespoň 80 % homologu sekvence k aminokyselinové sekvenci Taq DNA polymerázy (SEQ ID NO:7).
- 10. Sekvence nukleové kyseliny kódující enzym tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 aě 9.
- 11. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující enzym tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 9.··· • · · · • · · · ·- 57
- 12. Hostící buňka obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující enzym tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 aě 9.
- 13. Způsob přípravy tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 aě 9, vyznačující se tím, že (a) se kultivuje hostící buňka podle nároku 12 za podmínek, které podporují expresi enzymu tepelně stálé DNA polymerázy a (b) se izoluje enzym tepelně stálé DNA polymerázy z hostící buňky nebo z kultivačního prostředí.
- 14. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym připravítelný způsobem podle nároku 13.
- 15. Použití tepelně stálého DNA polymerázového enzymu podle nároku 1 aě 9 k zesilování nukleových kyselin nebo v sekvenčních reakcích.
- 16. Prostředek pro použití v DNA sekvenční reakci, v yznačující se tím, že ho tvoří matrice nukleové kyseliny, oligonukleotidový primer komplementární k uvedené matrici, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 az 9, směs obvyklých dNTP a alespoň jeden neobvyklý nukleotid, kde poměr neobvyklého nukleotidu k obvyklému nukleotidu je 1:1 nebo menší.
- 17. Prostředek podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, že neobyklým nukleotidem je ribonukleotid, přičemž je tento ribonukleotid s výhodou obsažen v koncentraci nižší než 100 qM a odpovídající obvyklý nukleotid je obsažen v koncentraci vyšší než 100 qM.
- 18. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že neobvyklý nukleotid je neznačený.
- 19.Způsob sekvenční analysy terčové nukleové kyseliny,9 9 999 9 9 9 • · · • 9 9 9 9 W • » vyznačující se tím, še se (a) zajišťuje neobvyklý nukleotid a příslušný obvyklý nukleotid v sekvenční reakci DNA, kde neobvyklý nukleotid a odpovídající obvyklý nukleotid jsou v poměru nižším než 1 1 , (b) zpracovává se reakční směs ze stupně (a) v přítomnosti tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 9 za podmínek extense primeru k zajištění produktu extense primeru obsahujících neobvyklý nukleotid, (cl zpracovávají se produkty extense primeru ze stupně (b) za podmínek pro hydrolysu produktu extense primeru, (dl štěpí se produkty reakce ze stupně (cl a (el stanoví se sekvence terčové nukleové kyseliny.
- 20. Způsob sekvenční analysy podle nároku 19, vyznačující se tím, že neobvyklým nukleotidem je ribonukl eot i d, obsažený s výhodou v koncentraci 0,1 qM až 100 qM.
- 21 Způsob sekvenční analysy podle nároku 19, vyznáčující se tím, še odpovídající obvyklý nukleotid je obsažen v koncentraci 50 qM až 500 qM.
- 22. Kit pro sekvenční analysu nukleové kyseliny obsahující tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 9, vyznačující se tím, že obsahuje další reakční činidla užitečná při takové sekvenční analyse, jako je například několik oligonukleotidových primerů, směs obvyklých dNTP a alespoň jeden neobvyklý nukleotid, kde poměr neobvyklého nukleotidu k obvyklému nukleotidu je s výhodou menší než 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2337696P | 1996-08-06 | 1996-08-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ229997A3 true CZ229997A3 (cs) | 1998-06-17 |
| CZ293215B6 CZ293215B6 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=21814728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19972299A CZ293215B6 (cs) | 1996-08-06 | 1997-07-18 | Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5939292A (cs) |
| EP (1) | EP0823479B1 (cs) |
| JP (1) | JP3170229B2 (cs) |
| KR (1) | KR100510619B1 (cs) |
| CN (1) | CN1154733C (cs) |
| AT (1) | ATE278020T1 (cs) |
| AU (1) | AU714929B2 (cs) |
| BR (1) | BR9704260B1 (cs) |
| CA (1) | CA2210951C (cs) |
| CZ (1) | CZ293215B6 (cs) |
| DE (1) | DE69730926T2 (cs) |
| DK (1) | DK0823479T3 (cs) |
| ES (1) | ES2227640T3 (cs) |
| HU (1) | HUP9701341A3 (cs) |
| IL (1) | IL121441A (cs) |
| MX (1) | MX9705961A (cs) |
| NO (1) | NO322135B1 (cs) |
| PL (1) | PL321478A1 (cs) |
| RU (1) | RU2235773C2 (cs) |
| TW (1) | TW528802B (cs) |
| UA (1) | UA47423C2 (cs) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998023733A2 (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-04 | University Of Washington | Thermostable polymerases having altered fidelity |
| US20030215857A1 (en) * | 1996-12-20 | 2003-11-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| JP3435416B2 (ja) * | 1997-03-12 | 2003-08-11 | ピーイー コーポレイション（エヌワイ） | 改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼ |
| US6346379B1 (en) * | 1997-09-11 | 2002-02-12 | F. Hoffman-La Roche Ag | Thermostable DNA polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes |
| US6994998B1 (en) | 1998-10-01 | 2006-02-07 | Sequenom, Inc. | Base-modified nucleotides and their use for polymorphism detection |
| US6566059B1 (en) | 1998-10-01 | 2003-05-20 | Variagenics, Inc. | Method for analyzing polynucleotides |
| US6458945B1 (en) | 1998-10-01 | 2002-10-01 | Variagenics, Inc. | Method for analyzing polynucleotides |
| US6777188B2 (en) | 1998-10-01 | 2004-08-17 | Variagenics, Inc. | Genotyping by mass spectrometric analysis of allelic fragments |
| US6500650B1 (en) | 1998-10-01 | 2002-12-31 | Variagenics, Inc. | Method for identifying polymorphisms |
| US6610492B1 (en) | 1998-10-01 | 2003-08-26 | Variagenics, Inc. | Base-modified nucleotides and cleavage of polynucleotides incorporating them |
| US6440705B1 (en) | 1998-10-01 | 2002-08-27 | Vincent P. Stanton, Jr. | Method for analyzing polynucleotides |
| US6855500B2 (en) | 1998-10-01 | 2005-02-15 | Sequenom, Inc. | Fluorescence-based genotyping |
| EP1175501A4 (en) * | 1999-05-12 | 2002-11-27 | Invitrogen Corp | COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF A NUCLEIC ACID SYNTHESIS |
| GB9921318D0 (en) * | 1999-09-09 | 1999-11-10 | Kristensen Tom | Chimeric molecules |
| US6329178B1 (en) | 2000-01-14 | 2001-12-11 | University Of Washington | DNA polymerase mutant having one or more mutations in the active site |
| US7179590B2 (en) * | 2000-04-18 | 2007-02-20 | Roche Molecular Systems, Inc | High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases |
| US6214557B1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-04-10 | Washington University | Cold sensitive mutant DNA polymerases |
| WO2002010358A2 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-07 | Maxygen, Inc. | Nucleotide incorporating enzymes |
| US6811979B2 (en) * | 2000-10-11 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| IL155450A0 (en) * | 2000-10-20 | 2003-11-23 | Expression Diagnostics Inc | Leukocyte expression profiling |
| WO2002073504A1 (en) * | 2001-03-14 | 2002-09-19 | Gene Logic, Inc. | A system and method for retrieving and using gene expression data from multiple sources |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6887690B2 (en) * | 2001-06-22 | 2005-05-03 | Pe Corporation | Dye-labeled ribonucleotide triphosphates |
| US20050042629A1 (en) | 2002-09-13 | 2005-02-24 | Applera Corporation | Thermus scotoductus nucleic acid polymerases |
| JP2005508630A (ja) * | 2001-09-14 | 2005-04-07 | インヴィトロジェン コーポレーション | Ｄｎａポリメラーゼとその変異体 |
| US7052877B2 (en) | 2001-11-30 | 2006-05-30 | Applera Corporation | Thermus brockianus nucleic acid polymerases |
| US6723546B2 (en) * | 2002-03-26 | 2004-04-20 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of BsaI restriction endonuclease and BsaI methylase in E. coli |
| US7148049B2 (en) | 2002-04-02 | 2006-12-12 | Roche Molecular Systems, Inc. | Thermostable or thermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3′-5′ exonuclease activity |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7947817B2 (en) * | 2003-06-30 | 2011-05-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Synthesis and compositions of 2'-terminator nucleotides |
| US7572581B2 (en) * | 2003-06-30 | 2009-08-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator nucleotide-related methods and systems |
| EP1493824A1 (en) * | 2003-07-02 | 2005-01-05 | Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) | Method for detection of mutations in DNA |
| JP4127204B2 (ja) * | 2003-12-17 | 2008-07-30 | セイコーエプソン株式会社 | 液晶表示装置の製造方法 |
| EP1781813B1 (en) * | 2004-06-17 | 2010-01-27 | Epigenomics AG | Compositions and methods for preventing carry-over contamination in nucleic acid amplification reactions |
| US7745125B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-06-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization |
| WO2006029184A2 (en) | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| US7890268B2 (en) * | 2004-12-28 | 2011-02-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | De-novo sequencing of nucleic acids |
| US7645866B2 (en) * | 2005-06-28 | 2010-01-12 | Life Technologies Corporation | Methods of producing and sequencing modified polynucleotides |
| US20060292578A1 (en) * | 2005-06-28 | 2006-12-28 | Weidong Zheng | DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases |
| EP1762629B1 (en) | 2005-09-12 | 2009-11-11 | Roche Diagnostics GmbH | Detection of biological DNA |
| US20070154894A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-05 | Affymetrix, Inc. | Labeling and non-enzymatic fragmentation of cDNA using a ribonucleoside triphosphate analog |
| US7993832B2 (en) | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| US8148067B2 (en) | 2006-11-09 | 2012-04-03 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| US20080242560A1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-10-02 | Gunderson Kevin L | Methods for generating amplified nucleic acid arrays |
| US10150990B2 (en) | 2008-04-21 | 2018-12-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Ribonucleotide tag nucleic acid detection |
| WO2011123246A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Illumina, Inc. | Solid-phase clonal amplification and related methods |
| SG190377A1 (en) | 2010-11-24 | 2013-06-28 | Kaneka Corp | Amplified nucleic acid detection method and detection device |
| WO2012146260A1 (de) | 2011-04-23 | 2012-11-01 | Biolytix Ag | Herstellung und verwendung von proteinen in der molekularbiologie |
| EP2843058B1 (en) * | 2012-04-27 | 2019-12-18 | Kaneka Corporation | Method for amplifying nucleic acid and method for detecting amplified nucleic acid |
| TWI487789B (zh) | 2012-12-24 | 2015-06-11 | Ind Tech Res Inst | 單離的脫氧核糖核酸聚合酶、套組與其應用 |
| EP2970366B1 (en) | 2013-03-15 | 2019-01-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleotide analogs for sequencing |
| US20150050697A1 (en) | 2013-08-19 | 2015-02-19 | Abbott Molecular Inc. | Nucleotide analogs |
| JP6691380B2 (ja) | 2013-11-22 | 2020-04-28 | 株式会社カネカ | 短鎖ｒｎａの検出方法 |
| CN103966182A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-08-06 | 厦门安普利生物工程有限公司 | 一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法 |
| KR102154812B1 (ko) * | 2014-09-29 | 2020-09-11 | 박진우 | 광고 및 태양광 충전 기능을 가진 가방 |
| CN106117288B (zh) | 2015-05-08 | 2019-10-15 | 生捷科技控股公司 | 二硫键连接的可逆终止子 |
| WO2019014359A2 (en) * | 2017-07-12 | 2019-01-17 | The Scripps Research Institute | POLYMERASE CHAIN TRANSCRIPTION (PCT): EXPONENTIAL SYNTHESIS OF RNA AND MODIFIED RNA |
| SG11202002282TA (en) | 2017-09-20 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Immunotherapy methods for patients whose tumors carry a high passenger gene mutation burden |
| CN108130318B (zh) * | 2018-02-28 | 2020-07-14 | 深圳市艾伟迪生物科技有限公司 | 突变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用 |
| EP3856753A4 (en) | 2018-09-28 | 2022-11-16 | Centrillion Technology Holdings Corporation | DISULFIDE CROSSLINKED REVERSIBLE TERMINATORS |
| CN110093410A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-06 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种dna测序反应试剂及其制备方法 |
| GB202007428D0 (en) | 2020-05-19 | 2020-07-01 | Fabricnano Ltd | Polynucleotide synthesis |
| CN112322715B (zh) * | 2020-11-17 | 2022-11-25 | 清华大学 | 一种核酸测序方法 |
| GB202114105D0 (en) | 2021-10-01 | 2021-11-17 | Fabricnano Ltd | Nucleotide synthesis |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4889818A (en) * | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US5466591A (en) * | 1986-08-22 | 1995-11-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases |
| US5912155A (en) * | 1994-09-30 | 1999-06-15 | Life Technologies, Inc. | Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana |
| US5614365A (en) * | 1994-10-17 | 1997-03-25 | President & Fellow Of Harvard College | DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
| EP0655506B1 (en) * | 1994-10-17 | 1996-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
-
1997
- 1997-07-18 CZ CZ19972299A patent/CZ293215B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-07-29 TW TW086110793A patent/TW528802B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-07-31 AT AT97113182T patent/ATE278020T1/de active
- 1997-07-31 EP EP97113182A patent/EP0823479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-31 DE DE69730926T patent/DE69730926T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-31 ES ES97113182T patent/ES2227640T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-31 DK DK97113182T patent/DK0823479T3/da active
- 1997-07-31 IL IL12144197A patent/IL121441A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 CA CA002210951A patent/CA2210951C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-01 HU HU9701341A patent/HUP9701341A3/hu unknown
- 1997-08-04 UA UA97084100A patent/UA47423C2/uk unknown
- 1997-08-05 CN CNB971153922A patent/CN1154733C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-05 NO NO19973595A patent/NO322135B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-08-05 BR BRPI9704260-9A patent/BR9704260B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-08-05 MX MX9705961A patent/MX9705961A/es active IP Right Grant
- 1997-08-05 KR KR1019970037399A patent/KR100510619B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-08-05 PL PL97321478A patent/PL321478A1/xx unknown
- 1997-08-05 US US08/906,484 patent/US5939292A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-06 RU RU97113529/13A patent/RU2235773C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-08-06 AU AU33197/97A patent/AU714929B2/en not_active Ceased
- 1997-08-06 JP JP21235097A patent/JP3170229B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ229997A3 (cs) | Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje | |
| AU741366B2 (en) | Altered thermostable DNA polymerases for sequencing | |
| MXPA97005961A (en) | Thermostable dna polymerase, modification | |
| EP0738779B1 (en) | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids | |
| US7501237B2 (en) | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof | |
| CA2240570C (en) | Mutant chimeric dna polymerase | |
| EP0866868B1 (en) | Thermostable dna polymerase from thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus and mutant enzymes thereof with exonuclease activity removed | |
| JPH08511684A (ja) | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼ | |
| IE62579B1 (en) | A method for the amplification of nucleotide sequences | |
| WO1998035060A9 (en) | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof | |
| CA2052827A1 (en) | Increased production of thermus aquaticus dna polymerase in e.coli | |
| JPH11151087A (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 | |
| IL103039A (en) | A method for amplifying the detection and / or cloning of specific sequences of nucleic acids by using an enzyme that was heat stable | |
| JPH05284971A (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140718 |