CN103966182A - 一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种提取纯化TthDNA聚合酶的方法。包括如下步骤：取TthDNA聚合酶工程菌进行活化和IPTG诱导表达；用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20，冰上处理一段时间，离心得到粗蛋白；粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，最后用洗脱液洗脱目的蛋白，接收含目的蛋白的洗脱液；脱盐后即得到纯化的TthDNA聚合酶；得到的TthDNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。本发明的方法简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法。
背景技术
Tth DNA Polymerase（Tth DNA聚合酶）是一种热稳定性酶，分子量为94kDa，原始酶的来源是从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB-8中分离得到。该酶在74℃是可进行DNA复制。Tth DNA聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核苷酸5’-3’方向发生聚合反应，形成双链DNA，也可在锰离子存在的条件下，以RNA为模板沿5’-3’方向发生核苷酸聚合反应。该酶也具有5’-3’外切酶活性。Tth DNA聚合酶可用于PCR、逆转录、RT-PCR和较高温度条件下的引物延伸反应。特别适合应用于一步法qRT-PCR试剂盒的开发。
最初Tth DNA聚合酶的来源是从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB-8中分离得到，由于嗜热栖热菌培养所需要的设备昂贵、培养基配置复杂、培养温度高、培养周期长，在培养过程中容易出现误差导致培养效率低下，不易于大规模培养，再加上纯化过程中需要漫长的层析过程，导致酶活性大量下降，因此酶的产能极其有限。
目前，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件下进行（冰上操作），常规纯化Tth DNA聚合酶方法采用低温超声破碎，反复通过硫酸铵沉淀、离子交换、层析和脱盐进行纯化，不仅高达50%的蛋白会在纯化初期就会损失，而且部分基因组蛋白很难完全去除，再加上基因组蛋白的存在会导致上柱速度缓慢，延长纯化时间，纯化得到的蛋白酶活降低，影响了后期酶的扩增和逆转录活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。
为实现上述目的， 本发明提供一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其步骤为，
1）工程菌的活化和表达：取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；
2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，再加入吐温-20，冰上处理一段时间，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白；
3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；
4）上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡；所述结合缓冲液为20mM Tris-HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，所述洗涤缓冲液为20mM
Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑；最后用洗脱液洗脱目的蛋白，所述洗脱液为20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脱液；含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B： 10mM Tris-HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脱盐后即得到纯化的Tth DNA聚合酶；
任选的，得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。
所述Tth DNA聚合酶工程菌为从嗜热栖热菌HB-8中PCR扩增得到PCR产物，所得PCR产物经NdeⅠ、SalⅠ双酶切后克隆入经NdeⅠ、SalⅠ双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-taq，将上述质粒转化表达菌BL21(DE3)，即获得生产重组Tth DNA聚合酶的工程菌株。
所述PCR扩增所用的引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
所述步骤1）为取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37℃，250 转/分振荡培养4小时后加入1M IPTG至终浓度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培养8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；12000rpm,4℃离心5分钟收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，12000rpm，4℃离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；所述缓冲液A为20mM
Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0。
所述步骤2）为将所述表达的工程菌用4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟后加入DTT使终浓度为1mM，加入吐温-20使体积百分比为0.5%，冰上处理45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白。
所述步骤3）为粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟，15000g，4℃离心20分钟，去除沉淀。
所述步骤4）为上清液补足NaCl至终浓度为0.5M。
本发明生产工艺合理简单，仅需要溶菌酶破碎菌体，二氧化硅吸附杂蛋白和核酸，亲和层析进行纯化，避免了常规耐热聚合酶纯化中加热处理、反复通过离子交换，层析和脱盐进行纯化。保证酶活性得到很好的保持，保证了产品产量和纯度，后期使用过程中基因扩增和逆转录效果良好。
1.产品的确认
（1）基因来源
Tth DNA聚合酶基因为从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB-8中扩增得到。
扩增引物为：
Tth F：ataCATATGATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTG
SEQ ID NO:1
Tth R：ataGTCGACCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC
SEQ ID NO:2
基因序列信息：Thermus thermophilus gene
for DNA polymerase I, complete cds, strain: M1
GenBank:
AB744210.1 SEQ ID NO:3；
（2）载体来源
PET-28a表达质粒购自美国Novagen公司。该质粒在克隆位点前有1个T7启动子，在T7启动子前有1个6×His-Tag coding序列，是T7的增强子，多克隆位点上有NcoI—Xhol11个酶切位点，载体上还有1个卡那霉素(Kan)的筛选标记；
（3）宿主菌
宿主菌为BL21(DE3)菌株，即宿主菌BL21经噬菌体DE3溶源化后，DE3的lacUV5强启动子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。宿主菌在非代谢性乳糖类似物IPTG的诱导作用下能产生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特异性地识别Pet-28a表达载体中的T7启动子序列，从而高效地表达目的重组蛋白。由于IPTG不会被宿主菌利用，因此向培养液中加入少量的IPTG 就能对lacUV5强启动子产生持久的诱导作用；
（4）Tth DNA聚合酶工程菌株
Tth DNA聚合酶基因的pcr产物经NdeⅠ、SalⅠ双酶切经NdeⅠ、SalⅠ双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-taq，将上述质粒转化表达菌BL21(DE3)，即获得生产重组Tth DNA聚合酶的工程菌株。
2.产品的制备
①用50ml缓冲液A（20mM
Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0）重悬菌体(生产重组Tth DNA聚合酶的工程菌株)，4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，冰上处理45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白；
②粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟（吸附基因组DNA和杂蛋白），15000g/4℃/20分钟，去除沉淀；
③上清液补足NaCl至终浓度为0.5M，流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mM
Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0, 5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mM
Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑）洗脱目的蛋白。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B：（10mM Tris-HCl (pH 7.5 at
25°C), 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA）。脱盐后加入甘油使体积分数为50%,-20℃保存备用。
3.产品的用途
本酶具有在Mn2+离子存在的条件下显示逆转录活性的独有的特性。利用该特性，可用同一酶在同一管中进行逆转录反应与PCR(one-STEP RT-PCR
)反应。
特点1：扩增高GC含量具有高效率
与 Taq DNA polymerase 相比，对GC-rich目的片段及粗样品的扩增效率更出色。
特点2：可用单酶完成RT-PCR
由于本酶在Mn2+离子存在条件下显示RTase活性，优化反应缓冲液后只用本酶即可完成 RT-PCR 并且本酶在55-60℃时可进行RT反应，因此适用于容易形成高级结构的目的片段的逆转录及后续扩增。
有益效果：
1.和传统DNA聚合酶提取方法对比，本发明只需要亲和层析柱和脱盐柱，步骤少，操作简单，避免反复使用离子交换柱和层析柱，容易在普通实验室进行蛋白纯化并且有效保障蛋白回收率。
2.和传统DNA聚合酶提取方法对比，提取纯化过程不需要75℃加热步骤，最大限度降低Tth DNA聚合酶提取过程的酶活性损失，保障后续的逆转录和基因扩增效果。
3. 和传统DNA聚合酶提取方法对比，提取纯化过程加入二氧化硅进行基因组和杂杂蛋白的吸附，去除大部分核酸和杂蛋白，上柱速度快，有效减少亲和层析柱中核酸和杂蛋白的非特异性吸附机会，有利于保证回收蛋白的纯度和回收量。
附图说明
图1是SDS-PAGE 纯度检测电泳图。
图2是Tth DNA聚合酶活性检测结果图。
图3是不加Tth DNA聚合酶的活性检测对照实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
一、主要试剂准备
1.LB液体培养基（1000 mL）
NaCl：10g
蛋白胨：10g
酵母粉：5g
2.缓冲液A （20mM Tris-HCl，0.2M NaCl，pH 8.0）（1000 mL）
Trizma-HCl：1.7651g
Trizma-Base：1.066g
NaCl：11.688g
3.缓冲液B （20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.0）（1000 mL）
Trizma-HCl：1.7651g
Trizma-Base：1.066g
NaCl：29.22g
4.洗涤缓冲液C：（20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM 咪唑，0.5%Tween-20 ，pH 8.0）（100 mL）
缓冲液B：100mL
3M咪唑：167uL
Tween-20：500 uL
5.洗涤缓冲液D：（20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM 咪唑，pH 8.0）（100 mL）
缓冲液B：100mL
3M咪唑：167uL
二、Tth DNA聚合酶工程菌的构建和表达
1、Tth DNA聚合酶工程菌的构建
模板为含嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB-8DNA聚合酶 （Tth）基因质粒。（Invitrogen全基因人工合成，序列见SEQ ID NO:3。
扩增引物为：
Tth F：ataCATATGATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTG
SEQ ID NO:1
Tth R：ataGTCGACCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC
SEQ ID NO:2
PCR反应体系配置见表1
| 物料 | 浓度 | 用量（μL） |
| H2O | 纯化水 | 43 |
| 10×Pyrobest Buffer II | 5 | |
| dNTPs | 25 mM | 0.4 |
| Tth F | 50 μM | 0.1 |
| Tth R | 50μM | 0.1 |
| Pyrobest DNA Polymerase | 5U/μL | 0.4 |
| 含TaqDNA聚合酶基因质粒 | 10ng/μL | 1 |
| 总计 | 50.0 |
PCR反应程序：
95℃5分钟，1个循环；95℃30秒，55℃30秒，72℃120秒,32个循环；72℃10分钟1个循环；25℃1分钟。
Tth DNA聚合酶基因的pcr产物经NdeⅠ、SalⅠ双酶切，然后克隆入同样经NdeⅠ、SalⅠ双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-taq，将上述质粒转化表达菌BL21(DE3)，即获得生产重组Tth DNA聚合酶的工程菌株；
2、菌种活化
取Tth DNA聚合酶工程菌200uL接种到20mL含卡那霉素（50µg/mL）LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；
3.扩大培养
取3mL活化好的菌液转接到200 mL同样的LB液体培养基中，37℃，250 转/分振荡培养4小时后。
4.诱导表达
加入表达诱导剂200uL 1M IPTG至终浓度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培养8小时。
5.菌体回收
（1）取12支50mL离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；
（2）12000rpm,4℃离心5分钟收集菌体；
（3）收集的菌体平均分成4管，用缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl，0.2 mol/L NaCl，pH8.0）洗涤一次，12000rpm，4℃离心5分钟。再用缓冲液A重悬（约35mL）；－20℃保存过夜。
三、重组Tth DNA聚合酶的纯化
1.将冻存的菌悬液置于37℃水浴锅中解冻至完全融化，4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟，加入DTT使终浓度为1mM,加入吐温-20使体积百分比为0.5%，冰上处理45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即粗蛋白；
2.粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟（吸附基因组DNA和杂蛋白），15000g/4℃/20分钟，去除沉淀；
3.上清液补足NaCl至终浓度为0.5M，流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液（20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0, 5mM咪唑）平衡；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液（20mM
Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑）依次洗涤；最后用洗脱液（20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑）洗脱目的蛋白。含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B：（10mM Tris-HCl (pH 7.5 at
25°C), 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA）。脱盐后加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存备用。
四、Tth DNA聚合酶检测
1.SDS-PAGE 纯度检测，结果见图1，从图1可以看出纯化得到的Tth DNA聚合酶具有较好的纯度，基本没有杂蛋白。
2.活性检测
纯化得到的Tth DNA聚合酶用丙型肝炎病毒（HCV）RNA检测。
（1）HCV反应缓冲液配置（30μL /人份）
1）HCV反应缓冲液A
分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma®Base 336μL，1 mol/L MgCl215μL，1 mol/L MnCl2
10μL ，1mol/L KCl 500μL，0.5mol/L EDTA2Na 2μL，dNTPs 90μL，HCV特异性上下游引物（上游：atttgggcgtgcccc；见SEQ ID NO:4，下游：gcactcgcaagcacccta, 见SEQ ID NO,5）（50μmol/L）83.3µL，HCV探针（5′FAM-aaaggccttgtggtactgcctga-3′TAMRA, 序列见SEQ ID NO:6）25μL，167μL Tth DNA聚合酶，用双重蒸馏水补足体积到10mL。
2）HCV反应缓冲液B
分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma®Base 336μL，1 mol/L MgCl215μL，1 mol/L MnCl2
10μL ，1mol/L KCl 500μL，0.5mol/L EDTA2Na 2μL，dNTPs 90μL，HCV特异性上下游引物（同上）（50μmol/L）83.3µL，HCV探针（同上）25μL，用双重蒸馏水补足体积到10mL；
（2）按30μL/支将HCV反应缓冲液A和B分别分装至PCR反应管中，依次加入2µL梯度稀释的HCV RNA（HCV RNA由厦门市中医院临床阳性样本经过提纯纯化后用DEPC水进行梯度稀释），混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内；
（3）循环条件设置
55℃ 30分钟，95℃ 2分钟；95℃ 15秒，58℃ 40秒，5循环不读荧光；95℃ 15秒，58℃ 40秒，40循环；
（4）结果从计算机直接分析。
Tth DNA聚合酶活性检测结果图2，其中从左至右分别为5.0×107IU/mL、5.0×106IU/mL、5.0×105IU/mL、5.0×104IU/mL、5.0×103IU/mL5个浓度的扩增曲线，从图中可以看出，浓度为5.0×103-5.0×107 IU/mL5个浓度的阳性样本在含有Tth DNA聚合酶的反应体系中得到良好的扩增，梯度均匀，线型良好。
不加Tth DNA聚合酶对照实验结果见图3，其中从左至右分别为5.0×107IU/mL、5.0×106IU/mL、5.0×105IU/mL、5.0×104IU/mL、5.0×103IU/mL5个浓度的扩增曲线，从图中可以看出，浓度为5.0×103-5.0×107 IU/mL5个浓度的阳性样本在不含有Tth DNA聚合酶的反应体系中没有扩增。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门安普利生物工程有限公司
<120> 一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法
<130> P9492
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atacatatga tggaggcgat gcttccgctc
tttg
34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atagtcgacc taacccttgg cggaaagcca
gtcc
34
<210> 3
<211> 2505
<212> DNA
<213> Thermus thermophilus
<400> 3
atggaggcga tgcttccgct ctttgaaccc aaaggccggg tcctcctggt
ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg
gggcgaaccg 120
gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga
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ggcctacgag 240
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cgccctcatc 300
aaggagctgg tggacctcct ggggtttacc cgcctcgagg tccccggcta
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cccaacctgc agaacatccc cgtccgcacc cccttgggcc agaggatccg
ccgggccttc 1800
gtggccgagg cgggttgggc gttggtggcc ctggactata gccagataga
gctccgcgtc 1860
ctcgcccacc tctccgggga cgaaaacctg atcagggtct tccaggaggg
gaaggacatc 1920
cacacccaga ccgcaagctg gatgttcggc gtccccccgg aggccgtgga
ccccctgatg 1980
cgccgggcgg ccaagacggt gaacttcggc gtcctctacg gcatgtccgc
ccataggctc 2040
tcccaggagc ttgccatccc ctacgaggag gcggtggcct ttatagagcg ctacttccaa
2100
agcttcccca aggtgcgggc ctggatagaa aagaccctgg aggaggggag
gaagcggggc 2160
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ccgggtgaag 2220
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caccgccgcc 2280
gacctcatga agctcgccat ggtgaagctc ttcccccgcc tccgggagat
gggggcccgc 2340
atgctcctcc aggtccacga cgagctcctc ctggaggccc cccaagcgcg
ggccgaggag 2400
gtggcggctt tggccaagga ggccatggag aaggcctatc ccctcgccgt
gcccctggag 2460
gtggaggtgg ggatggggga ggactggctt tccgccaagg
gttag
2505
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
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15
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
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tga
23
Claims (7)
1.一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其步骤为，
1）工程菌的活化和表达：取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；
2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，再加入吐温-20，冰上处理一段时间，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白；
3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；
4）上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡；所述结合缓冲液为20mM Tris-HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，所述洗涤缓冲液为20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑；最后用洗脱液洗脱目的蛋白，所述洗脱液为20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脱液；含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B： 10mM
Tris-HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脱盐后即得到纯化的Tth DNA聚合酶；
任选的，得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。
2.权利要求1所述的提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述Tth DNA聚合酶工程菌为从嗜热栖热菌HB-8中PCR扩增得到PCR产物，所得PCR产物经NdeⅠ、SalⅠ双酶切后克隆入经NdeⅠ、SalⅠ双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-taq，将上述质粒转化表达菌BL21(DE3)，即获得生产重组Tth DNA聚合酶的工程菌株。
3.权利要求2所述的提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述PCR扩增所用的引物为SEQ ID
NO:1和SEQ ID NO:2所示序列。
4.权利要求1或2所述的提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步骤1）为取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37℃，250 转/分振荡培养4小时后加入1M IPTG至终浓度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培养8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；12000rpm,4℃离心5分钟收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，12000rpm，4℃离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；所述缓冲液A为20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0。
5.权利要求1或2所述的提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步骤2）为将所述表达的工程菌用4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟后加入DTT使终浓度为1mM，加入吐温-20使体积百分比为0.5%，冰上处理45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白。
6.权利要求1或2所述的提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步骤3）为粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟，15000g，4℃离心20分钟，去除沉淀。
7.权利要求1或2所述的提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步骤4）为上清液补足NaCl至终浓度为0.5M。
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2014
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