CN107177568B

CN107177568B - Klenow酶及其表达纯化方法

Info

Publication number: CN107177568B
Application number: CN201710592821.2A
Authority: CN
Inventors: 周俊; 钟淑瑶; 章瑞程; 邓艳华
Original assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd; Fei Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd; Fei Peng Biological Co Ltd
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN107177568A

Abstract

本发明涉及一种Klenow酶及其表达纯化方法，通过对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(Klenow酶)的裂解液。在进行Ni离子亲和柱纯化之前，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，然后向聚合沉降反应后收集的上清液中加入蛋白沉淀剂盐析沉降目的蛋白，从而得到粗产物。粗产物中核酸残留少、杂质少，对Ni离子亲和柱纯化过程的影响较小。这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，表达纯化获得的Klenow酶纯度高，满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

Description

Klenow酶及其表达纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Klenow酶及其表达纯化方法。

背景技术

Klenow酶(又称Klenow片段、克列诺片段或称克列诺酶，英文名为Klenowfragment或Klenow enzyme)，是DNA聚合酶Ⅰ的大片段。Klenow酶由汉斯·克列诺于1970年用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。Klenow片段保留了DNA聚合酶I的5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’-3’外切酶活性，常用于填补DNA单链末端成为双链。

随着二代测序的发展与应用，Klenow酶作为二代测序建库的工具酶具有很高的市场价值。现阶段大部分的Klenow酶文献报道都停留在蛋白性质研究，通常是重组表达后进行纯化。一般的Klenow酶的纯化工艺需要经过破菌、硫酸铵盐析、MonoQ离子交换、phenyl疏水层析、Superose12凝胶层析、超滤以及透析共九步，该工艺比较繁琐，得率低，不适用于大规模工业化生产。有研究将纯化工艺缩短至破菌、多次重复硫酸铵盐析、NI-NTA、Sephacryl200凝胶层析五部，多次重复硫酸铵盐析对终产品纯度、比活及回收率上均有一定的提高，但纯度仍然无法满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

综上，传统的方法表达纯化的Klenow酶纯度较低，难以满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

发明内容

基于此，有必要提供一种纯度较高的Klenow酶及其表达纯化方法。

一种Klenow酶的表达纯化方法，包括以下步骤：

对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；

将所述菌体裂解，得到裂解液；

向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液；

向所述上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物；以及

利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。

在一个实施方式中，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1～1:100。

在一个实施方式中，所述向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括：

将所述阳离子聚合物溶解在溶剂中，配制形成阳离子聚合物溶液；以及

将所述阳离子聚合物溶液滴加到所述裂解液中，并搅拌混匀。

在一个实施方式中，还包括构建所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌的操作：

以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，所述上游引物带有EcoRI酶切位点，所述下游引物上带有Hindlll酶切位点；

将所述PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到所述Klenow酶表达片段；

将所述Klenow酶表达片段插入到经过EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理后的表达载体中，得到重组载体；以及

将所述重组载体转入基因工程菌中，得到所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。

在一个实施方式中，所述Klenow酶的基因编码序列的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ IDNo.3所示。

在一个实施方式中，所述将所述菌体裂解，得到裂解液的操作包括：

用裂解缓冲液重悬所述菌体，得到重悬液，其中所述裂解缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA和终浓度为40mmol/L～60mmol/L的NaCl，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为2～10：1；以及

对所述重悬液进行超声破碎，固液分离收集上清，得到所述裂解液。

在一个实施方式中，所述利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物的操作包括：

将所述粗产物溶解在结合缓冲液中，加入到所述Ni离子亲和柱中，所述结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris和终浓度为300mmol/L～600mmol/L的NaCl，所述结合缓冲液与所述粗产物的体积比为2～5：1；

用浓度梯度的咪唑溶液洗涤所述Ni离子亲和柱，收集含有Klenow酶的洗脱液。

在一个实施方式中，所述收集含有Klenow酶的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对所述含有Klenow酶的洗脱液进行缓冲液置换，所述平衡缓冲液中含有终浓度为30mmol/L～50mmol/L的Tris、终浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA和终浓度为1mmol/L～5mmol/L的DTT。

一种Klenow酶，通过上述任一项所述的Klenow酶的表达纯化方法制备获得。

在一个实施方式中，编码所述Klenow酶的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

上述Klenow酶的表达纯化方法，通过对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(Klenow酶)的裂解液。在进行Ni离子亲和柱纯化之前，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，通过阳离子聚合物中和或吸附裂解液中核酸等阴离子物质，固液分离后收集上清液中核酸等阴离子的物质残留较少。然后向聚合沉降反应后收集的上清液中加入蛋白沉淀剂沉降目的蛋白，从而得到粗产物。粗产物中核酸残留少、杂质少，对Ni离子亲和柱纯化过程的影响较小，再用Ni离子亲和柱纯化粗产物，除去杂蛋白，提高Klenow酶的纯度。这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，表达纯化获得的Klenow酶纯度高，满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

附图说明

图1为一实施方式的Klenow酶的表达纯化方法的流程图；

图2为实施例1表达纯化Klenow酶的过程中各阶段的样品的SDS-PAGE电泳结果比对图；

图3为实施例1中在Ni-NTA柱纯化前后的样品的SDS-PAGE电泳结果比对图；

图4为实施例1制备的Klenow酶与NEB对照酶的SDS-PAGE的比活电泳结果比对图；

图5为实施例1制备的Klenow酶DNA内切酶活性检测的琼脂糖凝胶电泳结果比对图；

图6为实施例1表达纯化Klenow酶的过程中各阶段的样品中大肠杆菌核酸残留检测的琼脂糖凝胶电泳结果比对图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

请参阅图1，一实施方式的Klenow酶的表达纯化方法，包括以下步骤S110～S190。

S110、以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，上游引物带有EcoRI酶切位点，下游引物上带有Hindlll酶切位点。

具体地，Klenow酶的基因编码序列可以从基因数据中筛选获得。

本实施方式中，Klenow酶的基因编码序列选自大肠杆菌的基因组。

具体地，上游引物带有EcoRI酶切位点，下游引物上带有Hindlll酶切位点，便于酶切PCR扩增产物从而构建重组载体。

进一步地，Klenow酶的基因编码序列的碱基序列如SEQ ID No.1所示，上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

S120、将S110中得到的PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到Klenow酶表达片段。

通过引物扩增后，将获得的PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，漏出粘性末端，得到Klenow酶表达片段。

S130、将S120中得到Klenow酶表达片段插入到经过EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理后的表达载体中，得到重组载体。

表达载体同样经过EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，便于Klenow酶表达片段正向插入表达载体中。

具体地，表达载体为pET28a载体，pET28a载体上含有6个组氨酸标签，Klenow酶表达片段插入pET28a表达载体后，得到重组载体pET-Klenow。

S140、将S130中得到的重组载体转入基因工程菌中，得到含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。

具体地，将重组载体转入基因工程菌株之前，还包括将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，扩增提取质粒，并测序。然后将测序正确的质粒转化基因工程菌，得到含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。

具体地，基因工程菌选自BL21、JM109和DH5α中的一种。

本实施方式中，基因工程菌为BL21。

发明人在酶切位点、表达载体以及基因工程菌方面进行了大量的探索研究，从而构建获得上述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。该重组工程菌能够高效的表达Klenow酶，产率高，能够实现大批量的生产。

S150、对S140中得到的含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。

重组工程菌中插入了Klenow酶表达片段，在特定的条件下诱导，能够表达获得Klenow酶。

具体地，对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体的操作包括以下步骤S151～S153。

S151、将重组工程菌接种到培养基中，在35℃～38℃的条件下培养2h～6h，得到活化菌液。

具体地，按体积比为1:500～1500的比例将重组工程菌接种到含有抗性的培养基中，35℃～38℃的条件下培养10h～14h，以使重组工程菌复苏。

具体地，抗性根据重组工程菌内含有抗性位点进行选择。本实施方式中含有抗性的培养基为含有卡那霉素的LB培养基，通过抗性筛选培养以确定培养出重组工程菌的正确性。然后按体积比为1:80～120的比例将复苏后的重组工程菌加入LB培养基中，在35℃～38℃的条件下培养2h～6h，以使重组工程菌扩增，得到活化菌液。

经过复苏和扩增后，得到的活化菌液中重组工程菌的生长活力较好。

S152、向S151中得到的活化菌液中加入终浓度为0.5mol/L～1.5mmol/L的IPTG，在25℃～30℃条件下培养2h～6h，得到诱导培养后的菌液。

诱导培养的温度为25℃～30℃，例如28℃，低于扩增培养重组工程菌的温度。研究过程中发现，诱导培养的温度较低，适宜Klenow酶的表达，提高表达效率。

具体地，以上复苏、扩增以及诱导培养的过程中，均在转速为150rpm～250rpm。

S153、对S152中诱导培养后的菌液固液分离，收集固体物，得到菌体。

具体地，诱导培养后，通过离心进行固液分离，收集固体物，得到菌体。

S160、将S150中得到的菌体裂解，得到裂解液。

诱导表达后，得到的菌体中表达了大量的Klenow酶(目的蛋白)，通过对菌体裂解，将目的蛋白释放是来。

具体地，将菌体裂解，得到裂解液的操作包括以下步骤S161～S162。

S161、用裂解缓冲液重悬菌体，得到重悬液，其中裂解缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA和终浓度为40mmol/L～60mmol/L的NaCl，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为2～10：1。

具体地，裂解缓冲液的pH值约为8.0，向菌体中加入裂解缓冲液，搅拌10min～30min以使菌体重悬。

S162、对S161中得到的重悬液进行超声破碎，固液分离收集上清，得到该裂解液。

具体地，超声破碎菌体，破碎的程度为使菌液不再粘稠、流动性良好为准。破菌后的混合液在10000rpm～15000rpm离心20min～40min，收集上清，得到裂解液。

S170、向S160中得到的裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液。

具体地，阳离子聚合物为能够吸附阴离子的一类物质，如聚乙烯亚胺、聚异丁烯等。

具体地，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺在裂解液中以聚合阳离子的形式存在，中和或吸附阴离子物质，使得核酸等阴离子物质在过Ni离子亲和柱纯化之前沉去除，得到的收集上清液中含有的核酸等阴离子物质较少，降低后续纯化过程中控制核酸残留的压力。

具体地，聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1～1:100，例如0.2～0.8:100、0.1～0.3:100、0.2～0.3:100等。向裂解液中加入少量的阳离子聚合物进行聚合沉降反应，通过阳离子聚合物中和或吸附裂解液中核酸等阴离子物质，除去杂质，提高纯化的目的蛋白的纯度。阳离子聚合物与裂解液的比例适宜，足以沉降裂解液中核酸等阴离子物质，又不会引入过多的阳离子聚合物。

具体地，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括以下步骤S171～S172。

S171、将阳离子聚合物溶解在溶剂中，配制形成阳离子聚合物溶液。

配制成溶液形式，有助于阳离子聚合物与裂解液充分混匀，从而快速扩增到裂解液中，吸附裂解液中核酸等阴离子物质。

具体地，将阳离子聚合物溶解在水中配制成阳离子聚合物溶液。阳离子聚合物与水的质量比为0.5～2:1，例如1:1。阳离子聚合物溶液的浓度适宜，便于计算滴加到裂解液中。

S172、将S171中得到的阳离子聚合物溶液滴加到S160中得到的裂解液中，并搅拌混匀。

阳离子聚合物溶液滴加到裂解液中，阳离子聚合物溶液加入速度缓慢，阳离子聚合物与裂解液接触表面积大，有利于吸附裂解液中核酸等阴离子物质。

滴加的过程中搅拌混匀，避免出现阳离子聚合物局部浓度过高。

阳离子聚合物结合核酸等阴离子物质发生聚合沉降反应，生成沉淀。固液分离后收集的上清液中杂质少。

具体地，聚合沉降反应后，在10000rpm～15000rpm离心10min～20min，得到该上清液。

S180、向S170中得到的上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物。

具体地，盐析沉降时间为20min～40min。盐析沉降后得到的沉淀中含有大量的目的蛋白，得到粗产物。

具体地，蛋白沉淀剂为终浓度为2mol/L～6mol/L的硫酸铵，加入硫酸铵后，硫酸铵的浓度合适，通过硫酸铵盐析沉降目的蛋白，从而得到粗产物。

具体地，沉降时温度控制在0℃～10℃条件下，避免蛋白沉降后发生变性。

具体地，盐析沉降后，在10000rpm～15000rpm离心10min～20min，收集沉淀得到粗产物。

S190、利用Ni离子亲和柱纯化S180中得到的粗产物，得到Klenow酶。

得到粗产物后，通过Ni离子亲和柱纯化，收集目的蛋白(Klenow酶)。

具体地，利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物的操作包括以下步骤S191～S192。

S191、将粗产物溶解在结合缓冲液中，加入到Ni离子亲和柱中，结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris和终浓度为300mmol/L～600mmol/L的NaCl，结合缓冲液与粗产物的体积比为2～5：1。

具体地，结合缓冲液的pH值约为8.0，将粗产物溶解在结合缓冲液中并加入到Ni离子亲和柱中，粗产物中的目的蛋白结合在Ni离子亲和柱上面。

S192、用浓度梯度的咪唑溶液洗涤Ni离子亲和柱，收集含有Klenow酶的洗脱液。

咪唑溶液能够竞争性的与Ni离子结合，从而将目的蛋白洗脱下来。

具体地，结合缓冲液的pH值约为8.0，将粗产物加入到Ni离子亲和柱中后，先用8倍～12倍柱床体积结合缓冲液平衡。再用3倍～6倍柱床体积的浓度梯度咪唑溶液依次洗涤。

梯度咪唑溶液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris和终浓度为300mmol/L～600mmol/L的NaCl和不同浓度的咪唑。具体地，浓度梯度的咪唑溶液中咪唑的浓度依次为15mmol/L、50mmol/L和250mM。

先用低浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，洗脱杂蛋白。然后用高浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，出现目的蛋白峰时，收集含有Klenow酶(目的蛋白)的洗脱液。

具体地，收集含有Klenow酶的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对含有Klenow酶的洗脱液进行缓冲液置换，平衡缓冲液中含有终浓度为30mmol/L～50mmol/L的Tris(三羟甲基氨基甲烷)、终浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)和终浓度为1mmol/L～5mmol/L的DTT(二硫苏糖醇)。

含有Klenow酶的洗脱液中还有部分咪唑，对Klenow酶的纯度以及稳定性产生影响。将Klenow酶置换到平衡缓冲液中，Klenow酶比较稳定，保存时间更长。

具体地，可以通过G25色谱柱对含有Klenow酶的洗脱液进行缓冲液置换。

进一步地，将含有Klenow酶的洗脱液置换成平衡缓冲液后，加入等体积的甘油，置于-80℃条件下待用。

需要说明的是，实际应用中，表达纯化Klenow酶时，不局限于上述步骤S110～S190的顺序。本领域技术人员可以根据需要进行调整。如当预先已经构建并保存了含有Klenow酶表达片段的重组工程菌时，步骤S110～S140可以省略。

一种Klenow酶，通过上述的Klenow酶的表达纯化方法制备获得。

进一步地，编码该Klenow酶的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

上述Klenow酶的表达纯化方法，通过对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(Klenow酶)的裂解液。在进行Ni离子亲和柱纯化之前，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，通过阳离子聚合物中和或吸附裂解液中核酸等阴离子物质，固液分离后收集上清液中核酸等阴离子的物质残留较少。然后向聚合沉降反应后收集的上清液中加入蛋白沉淀剂盐析沉降目的蛋白，从而得到粗产物。粗产物中核酸残留少、杂质少，对Ni离子亲和柱纯化过程的影响较小，再用Ni离子亲和柱纯化粗产物，除去杂蛋白，提高Klenow酶的纯度。这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，表达纯化获得的Klenow酶纯度高，提取的Klenow酶不仅能够用于常规的cDNA二链合成和双脱氧法DNA测序，也能够满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)构建含有Klenow酶表达片段的重组工程菌

以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列作为扩增模板，加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。将得到的PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到Klenow酶表达片段。然后将Klenow酶表达片段克隆到经EcoRI/HindIII双酶切的pET28a载体上，得到重组载体pET-KLENH。将重组载体pET-KLENH转入大肠杆菌DH5α后提取质粒测序，测序正确后将上述质粒转化到BL21(DE3)中，即获得含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。

(2)菌种活化及表达

取10μL上述重组工程菌接种到100mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡过夜培养。将活化好的菌种按1:100的比例转接到新鲜LB液体培养基中。37℃，200rpm震荡培养4h，加入终浓度1mmol/L的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，然后在28℃，200rpm条件下进行诱导培养4h，离心收集菌体。

(3)纯化Klenow酶

将冻存的菌体(从诱导后的6L培养液收集的菌体)置于37℃水浴锅中解冻，用120mL裂解缓冲液(20mmol/L Tris，pH 8.0，0.1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，1mmol/LDTT)重悬菌体，得到重悬液。通过超声(超声电流为70％安倍，每3s停歇)裂解菌体。每40mL重悬液实际超声时间10min。然后在13500rpm条件下离心30min，收集上清，获得120mL裂解液。

将裂解液(超声破碎后离心上清)装入一玻璃烧杯中。将预先配置的聚乙烯亚氨母液(浓度为8.5g/100mL)缓慢滴加到裂解液中，至聚乙烯亚氨与裂解液的质量比为0.265:100。滴加过程中同时搅拌至充分混匀，确保不会出现局部浓度过高。然后在13500rpm条件下离心15min。收集聚乙烯亚氨处理的上清液，一次性向聚乙烯亚氨处理的上清液中加入121.6g研磨碎的硫酸铵固体，使之终浓度为4mol/L，沉淀时温度为0℃，沉淀时间约30min。然后在0℃，12000rpm条下离心条件15min，收集离心沉淀，获得盐析沉降的粗产物。

取100mL结合缓冲液(20mmol/L Tris，pH 8.0，500mmol/L NaCl)将硫酸铵处理沉淀的复溶，加入已螯合NI²⁺的Ni-NTA柱，收集穿透液取样。先用10倍柱床体积结合缓冲液平衡，再用5倍柱床体积低浓度咪唑溶液(20mmol/L Tris，pH 8.0，500mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑)洗涤，再用稍高浓度的咪唑溶液(20mmol/L Tris，pH 8.0，500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑)洗涤。每次清洗和平衡的过程需使UV280吸收洗至基线，最后用洗脱目的蛋白的咪唑溶液(20mmol/L Tris，pH 8.0，500mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑)洗脱Ni-NTA柱，使目的蛋白流出，收集含有目的蛋白的洗脱液。上Ni-NTA柱时，上样流速为1cm/min，洗脱流速为2cm/min，上样量为每mL填料上样菌体蛋白100mg(经NP80测)，此步的回收率为95％(Ni洗脱样品占总蛋白量)，上柱过程中温度维持在4℃。

收集的含有Klenow酶的洗脱液用sephadexG25色谱柱进行缓冲液的置换。先用1CV～2CV(1～2倍柱体积)的NaOH(0.2mol/L)清洗sephadexG25色谱柱，填料、系统和管路，用NaOH清洗以确保所有接触蛋白的部位无菌。上样前色谱柱用无菌水平衡至pH中性，随后用2×storage buffer(40mmol/L Tris，pH 7.4，0.2mmol/L EDTA，2mmol/L DTT)平衡色谱柱，至UV280洗脱至基线，电导、PH稳定。取收集的含有Klenow酶的洗脱液上样(约1/5柱床体积)，上样流速1cm/min，收集UV280>150mAu的样品，此步回收率80％。收集容器及期间取样容器均需灭菌处理，上柱过程中温度维持在4℃。凝胶过滤层析收集的样品补加等体积的甘油，-80℃保存。

实施例2

实施例1的Klenow酶的表达纯化方法与实施例1表达纯化方法大致相同。采用实施例1中构建保存的含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行活化及表达，离心收集表达后的菌体，然后对菌体裂解获得裂解液。

与实施例1不同的是获得裂解液后，加入聚乙烯亚氨与裂解液的质量比为0.1:100。其余与实施例1相同。

实施例3

与实施例1不同的是获得裂解液后，加入聚乙烯亚氨与裂解液的质量比为1:100。其余与实施例1相同。

对比例1

对比例1的Klenow酶的表达纯化方法与实施例1表达纯化方法大致相同。不同的是获得裂解液后，不加聚乙烯亚氨。在裂解液中直接加入硫酸铵沉淀目的蛋白。

鉴定结果

1、表达纯化Klenow酶的过程中各阶段的样品的SDS-PAGE电泳结果比对图

分别取实施例1中表达后的菌体、超声破碎后上清(裂解液)、超声破碎后的沉淀、聚乙烯亚氨处理后的上清液、聚乙烯亚氨处理后的沉淀、硫酸铵处理后的上清以及硫酸铵处理后的沉淀(粗产物)进行SDS-凝胶电泳，结果如图2所示。泳道的上样样品从左到右依次为:

第1泳道：表达后的菌体，第2泳道：超声破碎后上清(裂解液)，第3泳道：超声破碎后的沉淀，第4泳道：聚乙烯亚氨处理后的上清液，第5泳道：聚乙烯亚氨处理后的沉淀，第6泳道：硫酸铵处理后的上清，第7泳道：硫酸铵处理后的沉淀(粗产物)，第8泳道：蛋白marker。蛋白marker的分子量从上到下依次为112KD、66KD、45KD、35KD、25KD。

从图2中可以看出菌体破碎后大量的目的蛋白存在于裂解液中(第2泳道)。聚乙烯亚氨处理后，裂解液中的部分杂质随沉淀被去除，减少聚乙烯亚氨处理后的上清液中的杂质(第4泳道)。目的蛋白大量存在经硫酸铵处理后的沉淀中(第7泳道)。

2、Klenow酶在Ni-NTA柱纯化前后样品的SDS-PAGE电泳结果

分别取实施例1中结合缓冲液复溶后的硫酸铵处理沉淀、穿透液样品、低浓度咪唑溶液洗涤收集的洗涤液、目的蛋白的洗脱液进行SDS-凝胶电泳，结果如图3所示。泳道的上样样品从左到右依次为:

第1泳道：结合缓冲液复溶后的硫酸铵处理沉淀，第2泳道：穿透液样品，第3泳道：低浓度咪唑溶液洗涤收集的洗涤液，第4泳道：目的蛋白的洗脱液、第5泳道：蛋白marker。蛋白marker的分子量从上到下依次为112KD、66KD、45KD、35KD、25KD。

从图3中可以看出，低浓度的咪唑溶液将杂蛋白去除(第3泳道)，最后收集的目的蛋白的洗脱液中条带纯净(第4泳道)，说明目的蛋白的洗脱液中目的蛋白(Klenow酶)纯度高。

3、Klenow酶的各项性能评价

DNA聚合酶活性标定

将实施例1中通过凝胶过滤层析收集的样品补加等体积的甘油后，用NP 80测定蛋白浓度，结果为1.2mg/mL。同时采用NEB Klenow片段说明书方法测定酶活，1单位指37℃条件下，30分钟使10nmol的dNTP掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。在标定完活性后，取等量的标定酶活均为5U/μL的实施例1制备的Klenow酶样和NEB对照酶样(NEB公司，货号M0210S)跑SDS-PAGE比活胶，结果如图4所示，第1泳道～第9泳道依次为：蛋白marker、2.5μL的NEB对照酶、5μL的NEB对照酶、7.5μL的NEB对照酶、10μL的NEB对照酶、10μL的实施例1制得的Klenow酶、7.5μL的实施例1制得的Klenow酶、5μL的实施例1制得的Klenow酶、2.5μL的实施例1制得的Klenow酶。检测结果表明，实施例1制备的Klenow酶具有很好的DNA聚合酶活性，纯化的Klenow酶纯度>98％，同等体积的条件下，纯化的比活略高于NEB比活。

DNA外切酶活性(3’→5’)和内切酶活性检测

将实施例1纯化的Klenow酶和具有正链3’突出的DNA双链在37℃共同孵育4h，针对常规的5’和突出3’设计引物进行qPCR。如果Klenow酶具备3’→5’外切酶活性的酶则可以对3’突出部分进行切除，导致有效模板量降低。通过比较有效模板量是否降低来判断外切酶活性。检测结果表明实施例1纯化的Klenow酶能够有效降低模板量，具备3’→5’外切酶活性(单链突出端)。

同样，将实施例1纯化的Klenow酶和平端的双链DNA模板，在37℃共同孵育4h，针对常规的5’和3’设计引物进行qPCR，进行检测。结果表明有效模板量浓度无变化，说明纯化的Klenow酶无双链外切酶活性。

DNA内切酶活性检测

将实施例1纯化的Klenow酶和大肠杆菌质粒DNA在37℃共同孵育，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带有没有降解来判断内切酶活性，检测结果如图5所示，泳道的样品分别为：

第1泳道：实施例1的制备的Klenow酶与质粒DNA孵育反应0h。第2泳道：实施例1的制备的Klenow酶与质粒DNA孵育反应4h。第3泳道：NEB对照酶与质粒DNA孵育反应0h。第4泳道：NEB对照酶与质粒DNA孵育反应4h。第5泳道：反应体系中加入HindIII限制性酶切酶，37℃反应4h(阳性对照)。第5泳道：反应体系中加入无菌水，37℃反应4h(阴性对照)。

实施例1纯化的Klenow酶与质粒DNA反应后，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带没有降解，表明实施例1纯化的Klenow酶无内切酶活性检出。

大肠杆菌核酸残留检测

将实施例1纯化的各阶段的Klenow酶取5μL变性后，针对大肠杆菌16S rDNA区域设计特异性的引物和探针，采用TaqMan qPCR进行纯化处理各阶段核酸残留。琼脂糖凝胶电泳后的结果如图6所示。泳道的样品分别为：

第1泳道：超声破碎后上清(裂解液)，第2泳道：聚乙烯亚氨处理后的上清液，第3泳道：硫酸铵处理后的沉淀(粗产物)，第4泳道：目的蛋白的洗脱液。实验结果表明，聚乙烯亚氨处理后(第2泳道)大肠杆菌核酸基本无残留。用已知浓度的大肠杆菌基因组作标准曲线，实施例1纯化的Klenow酶的核酸残留为0.79拷贝(<10拷贝)，符合二代测序建库工具酶的要求。

实施例2纯化的Klenow酶的核酸残留为0.54拷贝(<10拷贝)，符合二代测序建库工具酶的要求。

实施例3纯化的Klenow酶的核酸残留为0.39拷贝(<10拷贝)，符合二代测序建库工具酶的要求。

而同样的方法测试的对比例1的Klenow酶的核酸残留为>100拷贝。核酸残留较多，不适宜用作二代测序建库工具酶。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 菲鹏生物股份有限公司、广东菲鹏生物有限公司

<120> Klenow酶及其表达纯化方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1821

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

atggtgattt cttatgacaa ctacgtcacc atccttgatg aagaaacact gaaagcgtgg 60

attgcgaagc tggaaaaagc gccggtattt gcatttgata ccgaaaccga cagccttgat 120

aacatctctg ctaacctggt cgggctttct tttgctatcg agccaggcgt agcggcatat 180

attccggttg ctcatgatta tcttgatgcg cccgatcaaa tctctcgcga gcgtgcactc 240

gagttgctaa aaccgctgct ggaagatgaa aaggcgctga aggtcgggca aaacctgaaa 300

tacgatcgcg gtattctggc gaactacggc attgaactgc gtgggattgc gtttgatacc 360

atgctggagt cctacattct caatagcgtt gccgggcgtc acgatatgga cagcctcgcg 420

gaacgttggt tgaagcacaa aaccatcact tttgaagaga ttgctggtaa aggcaaaaat 480

caactgacct ttaaccagat tgccctcgaa gaagccggac gttacgccgc cgaagatgca 540

gatgtcacct tgcagttgca tctgaaaatg tggccggatc tgcaaaaaca caaagggccg 600

ttgaacgtct tcgagaatat cgaaatgccg ctggtgccgg tgctttcacg cattgaacgt 660

aacggtgtga agatcgatcc gaaagtgctg cacaatcatt ctgaagagct cacccttcgt 720

ctggctgagc tggaaaagaa agcgcatgaa attgcaggtg aggaatttaa cctttcttcc 780

accaagcagt tacaaaccat tctctttgaa aaacagggca ttaaaccgct gaagaaaacg 840

ccgggtggcg cgccgtcaac gtcggaagag gtactggaag aactggcgct ggactatccg 900

ttgccaaaag tgattctgga gtatcgtggt ctggcgaagc tgaaatcgac ctacaccgac 960

aagctgccgc tgatgatcaa cccgaaaacc gggcgtgtgc atacctctta tcaccaggca 1020

gtaactgcaa cgggacgttt atcgtcaacc gatcctaacc tgcaaaacat tccggtgcgt 1080

aacgaagaag gtcgtcgtat ccgccaggcg tttattgcgc cagaggatta tgtgattgtc 1140

tcagcggact actcgcagat tgaactgcgc attatggcgc atctttcgcg tgacaaaggc 1200

ttgctgaccg cattcgcgga aggaaaagat atccaccggg caacggcggc agaagtgttt 1260

ggtttgccac tggaaaccgt caccagcgag caacgccgta gcgcgaaagc gatcaacttt 1320

ggtctgattt atggcatgag tgctttcggt ctggcgcggc aattgaacat tccacgtaaa 1380

gaagcgcaga agtacatgga cctttacttc gaacgctacc ctggcgtgct ggagtatatg 1440

gaacgcaccc gtgctcaggc gaaagagcag ggctacgttg aaacgctgga cggacgccgt 1500

ctgtatctgc cggatatcaa atccagcaat ggtgctcgtc gtgcagcggc tgaacgtgca 1560

gccattaacg cgccaatgca gggaaccgcc gccgacatta tcaaacgggc gatgattgcc 1620

gttgatgcgt ggttacaggc tgagcaaccg cgtgtacgta tgatcatgca ggtacacgat 1680

gaactggtat ttgaagttca taaagatgat gttgatgccg tcgcgaagca gattcatcaa 1740

ctgatggaaa actgtacccg tctggatgtg ccgttgctgg tggaagtggg gagtggcgaa 1800

aactgggatc aggcgcacta a 1821

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggaattcgt gatttcttat gacaactacg tcac 34

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaagcttgt gcgcctgatc ccagtttt 28

Claims

1.一种Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述菌体裂解，得到裂解液；

向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1~1:100；

利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。

2.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括：

3.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，还包括构建所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌的操作：

4.根据权利要求3所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述Klenow酶的基因编码序列的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述将所述菌体裂解，得到裂解液的操作包括：

用裂解缓冲液重悬所述菌体，得到重悬液，其中所述裂解缓冲液中含有终浓度为15mmol/L~25 mmol/L的Tris、终浓度为0.05mmol/L~0.15 mmol/L的EDTA和终浓度为40mmol/L~60mmol/L的NaCl，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为2~10：1；以及

6.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物的操作包括：

将所述粗产物溶解在结合缓冲液中，加入到所述Ni离子亲和柱中，所述结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L~25mmol/L的Tris和终浓度为300mmol/L~600mmol/L的NaCl，所述结合缓冲液与所述粗产物的体积比为2~5：1；

7.根据权利要求6所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述收集含有Klenow酶的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对所述含有Klenow酶的洗脱液进行缓冲液置换，所述平衡缓冲液中含有终浓度为30mmol/L~50mmol/L的Tris、终浓度为0.1mmol/L~0.5mmol/L的EDTA和终浓度为1mmol/L~5mmol/L的DTT。