CN108913700B - gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及应用。一种gp32单链结合蛋白的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。上述gp32单链结合蛋白的表达基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的gp32单链结合蛋白的纯度大于95％。

Description

gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及应用。

背景技术

T4噬菌体基因32编码蛋白(T4gene 32protein)是一种单链DNA(ssDNA)结合蛋白，简称为gp32单链结合蛋白。gp32单链结合蛋白为T4噬菌体DNA复制和修复所必需，它协调性地结合并稳定瞬时形成的ssDNA区域，在T4噬菌体DNA复制过程中起着重要的结构性作用。该gp32单链结合蛋白也被广泛地用于稳定和标记ssDNA区域，以便用电子显微镜观察细胞内DNA的结构。最新报道表明，gp32单链结合蛋白可以促进限制性内切酶的消化反应、RT-PCR中反转录的效率、增强T4DNA聚合酶的活性和提高PCR的产量。

目前，国内生产的gp32单链结合蛋白普遍存在纯度较低的问题，不利于gp32单链结合蛋白的推广使用。

发明内容

基于此，有必要提供一种纯度较高的gp32单链结合蛋白的制备方法。

此外，还提供一种gp32单链结合蛋白的表达基因、重组表达载体及应用。

一种gp32单链结合蛋白的表达基因，序列如SEQ ID No.1所示。

上述gp32单链结合蛋白的表达基因通过在氨基酸序列不变的前提下，把密码子换成了大肠杆菌偏爱的密码子，而使gp32单链结合蛋白在大肠杆菌中实现大量表达，且表达的gp32单链结合蛋白的纯度大于95％。

一种gp32单链结合蛋白的表达载体，包括空载体和插入在所述空载体中的目的基因表达片段，所述目的基因表达片段中含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述表达载体能够表达所述目的基因表达片段。

一种gp32单链结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将目的基因表达片段导入空载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；

对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述gp32单链结合蛋白。

在其中一个实施例中，所述将目的基因表达片段导入空载体中的步骤之前，还包括以下步骤：

以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

将所述PCR扩增产物插入到PMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；

使用限制性内切酶对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。

在其中一个实施例中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在其中一个实施例中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

在其中一个实施例中，所述对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述gp32单链结合蛋白的步骤具体为：

在所述重组工程菌的菌落OD值达到0.4～0.8后，加入终浓度为0.05mM/L～0.15mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～25℃下诱导表达20h～24h，固液分离收集上清，得到粗产物；

将所述粗产物纯化，得到所述gp32单链结合蛋白。

在其中一个实施例中，所述将所述粗产物纯化的步骤具体为：将所述粗产物使用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化。

一种gp32单链结合蛋白，采用上述的gp32单链结合蛋白的制备方法获得。

上述的gp32单链结合蛋白在制备DNA复制和修复试剂或药物中的应用。

附图说明

图1为实施例1的克隆载体的正向测序图；

图2为实施例1的克隆载体的部分反向测序图；

图3为实施例1的克隆载体的另一部分反向测序图；

图4为实施例1的重组工程菌的平板培养物与阴性对照及阳性对照的对比图；

图5为实施例1的重组工程菌的菌落PCR电泳图；

图6为实施例1的重组工程菌诱导后菌体的SES-PAGE电泳图；

图7为实施例1的重组工程菌诱导后菌体、诱导且超声破碎后离心上清及诱导且超声破碎后离心沉淀的SDS-PAGE电泳图；

图8为实施例1的重组工程菌诱导后超声破碎的上清在Ni柱纯化前后的SDS-PAGE电泳结果对比图；

图9为实施例1的gp32单链结合蛋白的凝胶电泳图；

图10为实施例1的gp32单链结合蛋白和单链DNA经处理后的凝胶电泳图；

图11为实施例1的gp32单链结合蛋白与NEB公司生产的gp32单链结合蛋白的经过灭活处理后的凝胶电泳对比图；

图12为实施例1的gp32单链结合蛋白加入PCR buffer后的凝胶电泳图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的gp32单链结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤S110：以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

具体地，步骤S110包括以下步骤：

步骤S111：获得gp32单链结合蛋白的基因编码序列。

进一步地，gp32单链结合蛋白的基因编码序列可以从基因数据库中筛选获得。更进一步地，gp32单链结合蛋白的基因编码序列从NCBI数据库中获得。具体地，gp32单链结合蛋白的genbank序列号为：NC_000866.4。

步骤S112：重新设计编码gp32单链结合蛋白的核苷酸序列，得到如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

具体地，选取T4噬菌体编码gp32单链结合蛋白的基因序列，并对该基因序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化，得到优化之后的序列如SEQ ID No.1所示。如SEQ ID No.1所示的序列中含有BamHI酶切位点和SalI酶切位点，以便于酶切。

步骤S113：将如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

具体地，构建包括如SEQ ID No.1所示序列、上游引物及下游引物的PCR体系，然后进行PCT扩增，得到PCR扩增产物。其中，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括SalI酶切位点，以便于酶切PCR扩增产物从而构建克隆载体。更进一步地，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

步骤S120：将PCR扩增产物插入到PMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体。

具体地，将PCR扩增产物用用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI双酶切处理漏出黏性末端，插入同样经过限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI双酶切处理的PMD19-T Simple载体中，并转化至大肠杆菌感受态细胞中，然后扩增提取制粒，并测序验证序列的正确性，得到插入序列正确的克隆载体。更具体地，大肠杆菌感受态细胞为TOP10。

步骤S130：使用限制性内切酶对克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。

具体地，使用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对克隆载体进行双酶切，并将双酶切的片段产物进行纯化回收，得到目的基因表达片段。得到的目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，且目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端，以便于构建重组表达载体。更具体地，采用试剂盒进行纯化回收。

步骤S140：将目的基因表达片段导入空载体中，得到重组表达载体。

具体地，将目的基因表达片段导入经限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI双酶切处理的pET-28a载体中，得到重组表达载体。pET-28a载体经限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI双酶切处理，以便于目的基因表达片段的插入。

具体地，重组表达载体包括空载体和插入在空载体中的目的基因表达片段。更具体地，重组表达载体包括pET-28a载体和插入在pET-28a载体中的目的基因表达片段。其中，pET-28a载体包括pET-28a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点。

步骤S150：将重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌。

具体地，将重组表达载体转入具有抗性标记的大肠杆菌，然后在抗性平板上培养得到转化子。然后随机挑选一定数量的转化子进行菌落PCR以验证转化子的正确性，确保重组工程菌的成功转化。

进一步地，抗性标记的大肠杆菌为BL21(DE3)，抗性平板上为含Kan^r的平板。进行菌落PCR的引物如SEQ ID No.2所示和SEQ ID No.3所示。

更进一步地，菌落PCR之后进行琼脂糖凝胶电泳，若琼脂糖凝胶电泳的条带与目的基因表达片段预期的大小一致，则转化成功，反之则转化失败。

具体地，将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kan^r的平板上，培养12h～16h，观察是否有单克隆生长，若有生长，则初步判定转化成功。然后挑去转化子进行菌落PCR进一步验证。

上述重组工程菌能够高效表达gp32单链结合蛋白，产率高，能够实现大批量生产。

步骤S160：对重组工程菌进行诱导培养得到gp32单链结合蛋白。

具体地，将重组工程菌加入含有Kan^r的LB液体培养基中培养，待菌体正常生长后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导培养，得到粗产物。其中，重组工程菌与含有Kan^r的LB液体培养基的接种体积比为1:100～1:1000。

进一步地，重组工程菌在含有Kan^r的LB液体培养基中的培养温度为25℃～37℃，培养时间为2h～3h，以使重组工程菌复苏和扩增，得到OD值为0.5左右的生长活力较好的重组工程菌。

具体地，在重组工程菌的菌落OD值达到0.4～0.8后，加入终浓度为0.05mM/L～0.15mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～25℃下诱导表达20h～24h。更具体地，在重组工程菌的菌落OD值达到0.5后，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷，并在20℃下诱导表达22h。

进一步地，诱导培养之后，进行gp32单链结合蛋白是否表达的验证。

具体地，取诱导培养后的菌液，离心得到菌体，加入loading buffer，煮沸，离心，冷却，取上清。进行SDS-PAGE电泳。若上清的SDS-PAGE电泳条带在gp32单链结合蛋白预期处，则有表达，反之则无表达。当然，也可以采用其他方法确定gp32单链结合蛋白是否表达。需要说明的是，在确定gp32单链结合蛋白在重组工程菌中能够表达时，验证gp32单链结合蛋白是否表达的步骤可以省略。

进一步地，确定gp32单链结合蛋白是表达后，进行gp32单链结合蛋白的表达方式的确认，以确定gp32单链结合蛋白是可溶性表达还是包涵体表达，还是两者皆是。具体地，取一定量诱导培养后的菌液，进行固液分离，收集菌体，并超声破碎，得上清及沉淀，将上清和沉淀经SDS-PAGE电泳。若在上清及沉淀具有与目的蛋白大小相近的条带，则可溶性表达及包涵体表达均有，若只上清具有与目的蛋白大小相近的条带，则为可溶性表达，若只沉淀具有与目的蛋白大小相近的条带，则为包涵体表达。当然，可以理解的是，在确定表达方式之后，确认gp32单链结合蛋白的表达方式的步骤可以省略，直接收集所需的含有gp32单链结合蛋白的溶液。

本实施方式中，gp32单链结合蛋白均有表达，为进一步简化后续蛋白纯化的工艺，取超声破碎后的上清作为粗产物进行下一步纯化。

步骤S170：将粗产物纯化，得到gp32单链结合蛋白。

进一步地，将粗产物使用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到gp32单链结合蛋白。更进一步地，将粗产物纯化，得到gp32单链结合蛋白的步骤具体为：

步骤S171：将粗产物硫酸铵盐析沉降，得到盐析产物。

具体地，盐析沉降时温度控制在0℃～10℃条件下，避免蛋白沉降后发生变性。

具体地，硫酸铵的终浓度为2mol/L～6mol/L，加入硫酸铵后，硫酸铵的浓度合适，通过硫酸铵盐析沉降目的蛋白，从使得粗产物得到纯化。

具体地，盐析沉降时间为20min～40min。盐析沉降后得到的沉淀中含有大量的目的蛋白。

具体地，盐析沉降后，在10000rpm～15000rpm离心10min～20min，收集沉淀得盐析产物。

步骤S172：将盐析产物通过Ni离子亲和柱纯化，得到gp32单链结合蛋白。

其中，将盐析产物通过Ni离子亲和柱纯化，得到gp32单链结合蛋白的步骤具体为：

步骤S1721：将盐析产物溶解在结合缓冲液中，加入到Ni离子亲和柱中，结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L～300mmol/L的NaCl，结合缓冲液与盐析产物的体积比为2～5:1。

具体地，结合缓冲液的pH值约为8，将盐析产物溶解在结合缓冲液中并加入到Ni离子亲和柱中，粗产物中的目的蛋白结合在Ni离子亲和柱上面。

步骤S1722：用浓度梯度的咪唑溶液洗涤Ni离子亲和柱，收集gp32单链结合蛋白的洗脱液。

咪唑溶液能够竞争性的与Ni离子结合，从而将目的蛋白洗脱下来。

具体地，结合缓冲液的pH值约为8，将盐析产物加入到Ni离子亲和柱中后，先用8倍～12倍柱床体积结合缓冲液平衡。再用3倍～6倍柱床体积的浓度梯度咪唑溶液依次洗涤。

梯度咪唑溶液中含有终浓度为10mmol/L～30mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L～300mmol/L的NaCl和不同浓度的咪唑。具体地，浓度梯度的咪唑溶液中咪唑的浓度依次为15mmol/L、40mmol/L和240mmol/L。

先用低浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，洗脱杂蛋白。然后用高浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，出现目的蛋白峰时，收集含有gp32单链结合蛋白(目的蛋白)的洗脱液。

具体地，收集含有gp32单链结合蛋白的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对含有gp32单链结合蛋白的洗脱液进行缓冲液置换，平衡缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl、终浓度为0.1mmol/L～0.4mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)和终浓度为0.5mmol/L～2mmol/L的DTT(二硫苏糖醇)，pH为8。

含有gp32单链结合蛋白的洗脱液中还有部分咪唑，对gp32单链结合蛋白的纯度以及稳定性产生影响。将gp32单链结合蛋白置换到平衡缓冲液中，使得gp32单链结合蛋白比较稳定，保存时间更长。

进一步地，将含有gp32单链结合蛋白的洗脱液置换成平衡缓冲液后，加入等体积的甘油，置于-80℃条件下待用。

需要说明的是，实际应用中，表达纯化gp32单链结合蛋白时，不局限于上述步骤S110～S170。本领域技术人员可以根据需要进行调整。例如当预先已经构建并保存了含有gp32单链结合蛋白的表达片段的重组工程菌时，步骤S110～S150可以省略。

上述gp32单链结合蛋白的制备方法通过在氨基酸序列不变的前提下，把密码子换成了大肠杆菌偏爱的密码子得到gp32单链结合蛋白的表达基因，然后对含有gp32单链结合蛋白的表达基因的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体；然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(gp32单链结合蛋白)的裂解液；然后向裂解液中加入硫酸铵进行盐析，Ni离子亲和柱纯化，除去杂蛋白，提高gp32单链结合蛋白的纯度。这种制备gp32单链结合蛋白的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，获得的gp32单链结合蛋白纯度高，可达95％以上。

一种gp32单链结合蛋白，采用上述的gp32单链结合蛋白的制备方法获得。具体地，编码上述gp32单链结合蛋白的基因序列包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

上述gp32单链结合蛋白在制备DNA复制和修复的试剂或药物中的应用。

以下为具体实施例部分：

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

本实施例的gp32单链结合蛋白(gp32)的制备步骤如下：

(1)构建克隆载体

在NCBI上查找T4噬菌体基因32编码蛋白的基因序列，GenBank序列号为NC_000866.4。对该基因序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化，优化后的序列如SEQ ID No.1所示。再将如SEQ ID No.1所示的序列通过PCR的方法拼接，然后克隆入PMD19-T SIMPLE载体并转化至感受态细胞TOP10，测序验证克隆载体中插入序列是否与要求相一致，得到插入序列正确的克隆载体。

本实施方式的克隆载体的部分测序结果如图1～图3所示。其中，图1为克隆载体的部分正向测序图，图2～图3为克隆载体插入序列的反向测序图，图2～图3的序列依次连续衔接。由图可知，如SEQ ID No.1所示的序列从图1中的25开始，至942结束；与如SEQ IDNo.1所示的序列互补链的核苷酸序列从图2的34开始，至图3的951结束。如SEQ ID No.1所示的序列正确插入了PMD19-T SIMPLE载体。

(2)构建重组表达载体

酶切：将插入序列正确的克隆载体中的如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列从克隆载体PMD19-T SIMPLE双酶切切下，pET-28a载体也使用BamHI酶及SalI酶酶切，上述两种载体的酶切体系如下表1。

表1

酶切的条件为：先30℃酶切2h，再37℃酶切2h。并且将双酶切后的pET-28a载体采用试剂盒进行纯化回收，目的片段进行切胶回收，具体按照试剂盒的说明书进行操作，得到纯化的均带有BamHI酶切位点黏性末端及SalI酶切位点黏性末端的pET-28a载体和目的片段。

连接：将纯化回收的pET-28a载体和目的基因表达片段按照表2的体系连接，得到重组表达载体，其中，连接反应条件为4℃连接过夜。

表2

(3)构建重组工程菌

将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kan^r平板上，培养12h～16h，观察是否有单克隆生长。

结果如图4所示，由左向右依次是阴性对照组、阳性对照组、实验组，其中阴性对照组为空质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，阳性对照组为含有PET-28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，实验组为将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)的重组工程菌。从图4中可以看出实验组平板长满了克隆，表明含有目的基因表达片段的重组工程菌构建成功。

随机挑取7个转化子编号8～14，分别溶于20μL的生理盐水，取1μL用于菌落PCR验证。其中，菌落PCR引物如表3所示，GGATCC代表BamHI的酶切位点，CTCGAG代表XhoI的酶切位点。

表3

菌落PCR的扩增体系如表4，扩增条件为：1)94℃，5min；2)94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，循环30次；3)72℃，4min。然后将PCR扩增结果进行1％的琼脂糖凝胶电泳。

菌落PCR电泳结果如图5所示，其中，图5的第八泳道为Maker，Maker的分子量从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。第一至七泳道分别为挑取的7个转化子。图5中，除第二泳道的编号9的转化子外，其他泳道的转化子的PCR结果的条带与目的基因片段预期的大小一致(目的基因片段的理论大小为1294bp)。进一步表明了目的基因片段成功地导入了大肠杆菌BL21(DE3)中。

表4

(4)诱导重组工程菌表达及纯化

确认是否表达成功：随机挑取10个转化子编号1～10，分别溶于20μL的生理盐水，取10μL加入1L含有Kan^r的LB液体培养基中培养3h，加入IPTG诱导(1:1000)，培养2h，收取菌液，离心，去上清，加入60ul 1Xloading buffer，煮沸10min，离心，冷却，取上清，上样10ul。先恒压100V，电泳30min，再恒压200V，电泳20min。取下胶，用考马斯亮蓝染色5min，高温加热脱色5min。

SDS-PAGE结果如图6所示，图6中第一泳道为蛋白maker，蛋白marker的分子量从上到下依次为250KD、150KD、100KD、70KD、50KD、40KD；第二泳道为未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)处理的菌体；第三泳道为编号1的转化子诱导后的菌体；第四泳道为编号2的转化子诱导后的菌体；第五泳道为编号3的转化子诱导后的菌体；第六泳道为编号4的转化子诱导后的菌体；第七泳道为编号5的转化子诱导后的菌体；第八泳道为编号6的转化子诱导后的菌体；第九泳道为编号7的转化子诱导后的菌体；第十泳道为编号8的转化子诱导后的菌体；第十一泳道为编号9的转化子诱导后的菌体；第十二泳道为编号10的转化子诱导后的菌体。由图6可以看出除编号4和6的转化子所在的泳道外，其他转化子所在的泳道在40KD附近的蛋白表达量较多(根据各酶序列以及SnapGene软件计算，28a-gp32(指gp32单链结合蛋白与载体蛋白的结合)的理论大小是36KD)。表明按照上述步骤制备的重组工程菌能够诱导表达gp32单链结合蛋白。

确认表达方式：将10μL重组工程菌接种到1L的LB培养基中，37℃培养6h，使其菌落OD值达到0.5后，加入0.1mM的IPTG，低温20℃，诱导表达22h，10000rpm离心收集菌体，并且对其菌体进行超声破碎，然后SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE结果如图7所示，图7中第一泳道为诱导后的菌体；第二泳道为诱导后超声破碎离心的上清；第三泳道为诱导后超声破碎离心的沉淀。由图7可以看出，gp32单链结合蛋白在大肠杆菌中存在可溶性表达和包涵体表达。

盐析及Ni离子亲和柱纯化：取诱导表达后的菌体进行超声破碎后，取上清，在4℃加入终浓度为的4mol/L硫酸铵，盐析沉降时间为30min，10000rpm离心10min，收集沉淀得盐析产物。将盐析产物Ni离子亲和柱纯化，收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果如图8所示。

合并洗脱液，测定蛋白浓度，测定结果显示按照上述制备方法制备的gp32单链结合蛋白纯度大于95％。

然后将gp32单链结合蛋白保存在缓冲液中，缓冲液的成分包括：20mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.2mM EDTA、1mmol/L DTT及50％甘油。具体地，缓冲液的pH值为8.0。

(5)gp32单链结合蛋白活性的测定

原理：根据epibio公司SSB蛋白(单链结合蛋白)活性鉴定方法如下，可以使SSB蛋白与1μg M13mpDNA(单链DNA)37℃，反应30min，根据凝胶电泳，各DNA迁移的速度来鉴定SSB蛋白活性。

方法：

1)按照25μL体系加入1μL SSB蛋白与2μL M13mpDNA，2.5μL 10X buffer，剩余用PBS添加到50μL 37℃孵育30min，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示。

从图9可以看出，经透析后的gp32单链结合蛋白(gp32)有活性，并且能够特异性的结合单链DNA(ssDNA)。

2)按1)中的体系，分别将ssDNA、未处理蛋白control、在37℃下处理4h的gp32、在65℃下灭活20min的gp32及在75℃下灭活20min的gp32进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图10所示。

从图10可以看出，gp32在37℃中处理4h，蛋白活性与未处理蛋白control的活性一样。根据NEB T4Gene 32protein的procotol可知，蛋白control的灭活条件为：在65℃下灭活20min。所以，本实验也将gp32在65℃灭活20min，同时在75℃也灭活了20min。根据电泳迁移率可知，gp32在65℃灭活20min后，仍有较强的活性，但在75℃灭活20min后，失去了活性。

3)按1)中的体系，分别将实施例1得到的gp32(简称IVD gp32)与NEB(美国NEB公司)生产的gp32(简称NEB gp32)进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图11所示，其中，各泳道的测试对象和灭活条件如下：1号泳道为M13mp ssDNA，2号泳道为IVD gp32+M13mpssDNA(37℃30min)，3号泳道为NEB gp32+M13mp ssDNA(37℃30min)，4号泳道为IVD gp32+M13mp ssDNA(65℃20min)，5号泳道为NEB gp32+M13mp ssDNA(65℃20min)，6号泳道为IVDgp32+M13mp ssDNA(75℃20min)，7号泳道为NEB gp32+M13mp ssDNA(75℃20min)。

从图11可以看出，相对于NEB生产的gp32，IVD gp32在65℃还有部分活性，两者在75℃都全部失去活性。

4)按照1)中的体系，分别将1μL、2μL、3μL、4μL的浓度为0.5mmol/L的IVD生产的gp32加入到PCR buffer中，混匀后，分别用该buffer进行PCR扩增uvsY片段，用KAPA商品化的PCR buffer做对照，扩增体系与条件同表4，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

凝胶电泳图12结果显示：相对于KAPA的buffer扩增，加入IVD gp32的buffer扩增比较单一，说明实施例1得到的gp32可以显著提高扩增特异性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司

<120> gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatgt ttaaacgtaa aagcaccgca gaactggcag cacagatggc aaaactgaat 60

ggtaataaag gttttagcag cgaggataaa ggtgagtgga aactgaaact ggataatgca 120

ggtaatggtc aggcagttat tcgttttctg ccgagcaaaa atgatgaaca ggcaccgttt 180

gcaattctgg tgaatcatgg tttcaaaaag aacggcaaat ggtacattga aacctgtagc 240

agcacccatg gtgattatga tagctgtccg gtttgtcagt atatcagcaa aaacgatctg 300

tacaacaccg ataacaaaga atacagcctg gttaaacgca aaaccagcta ttgggcaaat 360

attctggttg ttaaagatcc ggcagcaccg gaaaatgaag gtaaagtttt caaatatcgc 420

tttggcaaga agatctggga taaaatcaat gccatgattg ccgttgatgt ggaaatgggt 480

gaaacaccgg ttgatgttac ctgtccgtgg gaaggtgcaa attttgttct gaaagttaaa 540

caggtgagcg gcttcagcaa ttatgatgaa agcaaatttc tgaaccagag cgccattccg 600

aatatcgatg atgaatcatt tcagaaagaa ctgttcgagc agatggttga tctgagcgaa 660

atgaccagca aagataaatt caagagcttc gaagaactga acacgaaatt tggtcaggtt 720

atgggcaccg cagttatggg tggtgcagca gcaaccgcag caaaaaaagc agataaagtt 780

gcagatgatc tggatgcctt taacgtggat gattttaaca ccaaaaccga ggatgatttc 840

atgagcagca gcagcggtag cagcagctca gcagatgata ccgatctgga cgatctgctg 900

aatgatctgt aagtcgac 918

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggatccat gtttaaacgt aaaagca 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctcgagca gatcattcag cagatcg 27

Claims (3)

1.一种gp32单链结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将目的基因表达片段导入空载体pET-28a中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

将所述重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组工程菌；

对所述重组工程菌进行诱导培养；

确定gp32单链结合蛋白表达后，取所述重组工程菌超声破碎后的上清作为粗产物进行下一步纯化；

将粗产物使用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到gp32单链结合蛋白；

其中，硫酸铵盐析的步骤具体为：在4℃条件下加入终浓度为4mol/L的硫酸铵，盐析沉降时间为30min，10000rpm离心10min，收集沉淀得盐析产物；

其中，所述Ni亲和纯化的步骤具体为：

将盐析产物溶解在结合缓冲液中，加入到Ni离子亲和柱中，结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L~25mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L~300mmol/L的NaCl，结合缓冲液与盐析产物的体积比为2~5:1；

用浓度梯度的咪唑溶液洗涤Ni离子亲和柱，收集gp32单链结合蛋白的洗脱液；

所述结合缓冲液的pH值为8，将盐析产物加入到Ni离子亲和柱中后，先用8倍~12倍柱床体积结合缓冲液平衡；再用3倍~6倍柱床体积的浓度梯度咪唑溶液依次洗涤；

所述梯度咪唑溶液中含有终浓度为10mmol/L~30mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L~300mmol/L的NaCl和不同浓度的咪唑；浓度梯度的咪唑溶液中咪唑的浓度依次为15mmol/L、40mmol/L和240mmol/L；

所述收集gp32单链结合蛋白的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对含有gp32单链结合蛋白的洗脱液进行缓冲液置换，平衡缓冲液中含有终浓度为15mmol/L~25mmol/L的Tris-HCl、终浓度为0.1mmol/L~0.4mmol/L的EDTA和终浓度为0.5mmol/L~2mmol/L的DTT，pH为8；

其中，所述重组工程菌进行诱导培养的步骤具体为：

将重组工程菌加入含有Kan^r的LB液体培养基中培养，在重组工程菌的菌落OD值达到0.5后，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷，并在20℃下诱导表达22h，得到粗产物；

其中，所述重组工程菌与含有Kan^r的LB液体培养基的接种体积比为1:100~1:1000；所述重组工程菌在含有Kan^r的LB液体培养基中的培养温度为25℃~37℃，培养时间为2h~3h。

2.根据权利要求1所述的gp32单链结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将目的基因表达片段导入空载体中的步骤之前，还包括以下步骤：

以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

将所述PCR扩增产物插入到PMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；

使用限制性内切酶对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。

3.根据权利要求2所述的gp32单链结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

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