CN102597257A - 包含来自靶基因的序列的连接dna片段的特异性制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供：对于任意的靶基因，无论包含靶基因序列的DNA片段是否纯化，都可以选择性地得到仅使靶基因片段与其他目标DNA片段结合的“连接DNA片段”的方法。本发明涉及使包含序列A和/或序列B的连接用双链DNA片段选择性地与靶基因片段的各末端侧连接的方法。使用处于规定的关系的3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段，将上述3’端突出双链基因片段和上述连接用双链DNA片段的混合物供给至少两个循环的热变性、再缔合和DNA合成反应，得到包含一个以上的连接有上述序列A、上述靶基因的序列和上述序列B的一个单元的序列的双链DNA片段即“连接DNA片段”。通过类似的方法，还可得到“单侧连接DNA片段”。

Description

包含来自靶基因的序列的连接DNA片段的特异性制作方法

相关申请的相互参照

本申请主张2009年9月4日申请的日本特愿2009-205308号的优先权，其全部内容作为公开而特别引用于此。

技术领域

本发明涉及包含来自靶基因的序列的连接DNA片段的特异性制作方法，更详细而言，涉及用于在非特异性扩增生成DNA片段共存下，使靶基因片段特异性地与其他目标DNA片段进行特异性连接的制造方法。详细而言，本发明涉及：(1)使用由包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段、和其两末端侧包含靶基因的各末端侧所固有的核苷酸序列的连接用双链DNA片段组成的共计两种DNA片段，使连接用双链DNA片段特异性地与靶基因片段的各末端侧连接以制造“连接DNA片段”的方法；(2)使用由包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段、和各一方的末端侧包含靶基因的各末端侧所固有的核苷酸序列的两种双链DNA片段组成的共计三种DNA片段，使各连接用双链DNA片段特异性地与靶基因片段的各末端侧连接以制造“连接DNA片段”的方法；以及(3)使用由包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段、和一方的末端侧包含靶基因的一方的末端侧所固有的核苷酸序列的连接用双链DNA片段组成的共计两种DNA片段，使连接用双链DNA片段特异性地与靶基因片段的一方的末端侧连接以制造“单侧连接DNA片段”的方法。

背景技术

DNA克隆通常是指，使靶基因片段与质粒、噬菌体、黏粒等具有自身复制能力的载体结合，之后导入大肠杆菌等宿主中使其增殖，从而制作出相同的基因集团的技术。大肠杆菌中的克隆和亚克隆通过下述方法进行：使用DNA连接酶，将通过聚合酶链反应(PCR)的方法等扩增的靶基因片段与具有复制起点和抗生素的选择标记的载体结合，再将其导入大肠杆菌细胞中，之后通过研究抗生素耐性，分选所克隆的菌体。

在已有的DNA克隆法中，存在着以下限制：要求用相同的识别位点的限制酶切断插入的DNA和载体、或者选择即使在选择限制酶时也不会切断插入的DNA或载体的内部的限制酶等。

近年来，使用识别特定的核苷酸序列以促进DNA片段间的重组的序列特异性基因重组酶的位点特异性重组技术或同源重组技术被用于靶基因片段的克隆，不必进行限制酶等的处理，就开始广泛用于大量基因的快速克隆和蛋白的表达。

但是，即使在使用同源重组技术的情况下，使用大肠杆菌等微生物进行的质粒的扩增和纯化步骤也是必需的，操作依然繁杂，经济性也差。

作为不必使用大肠杆菌等微生物进行质粒的扩增和纯化步骤，使靶基因片段与靶基因以外的具有特定功能的一个或多数DNA片段在能够发挥上述功能的状态下连接，制造具有相同的核苷酸序列的基因集团的方法，已知有连接PCR法(参照专利文献1、以及非专利文献1和2)。这里，“靶基因以外的具有特定功能的DNA片段”是指启动子序列和poly A添加序列。

在专利文献1所述的方法中，使用RNA-DNA嵌合引物对独立地包含启动子序列、靶基因序列和poly A添加序列的三种DNA片段进行PCR扩增。然后，通过用RNase处理所扩增的DNA片段，除去RNA引物部位，再利用在各DNA片段末端产生的3’突出区的彼此的互补性，使用DNA连接酶使3种DNA片段结合。通过进行以其为模板的PCR，可以大量制造使启动子序列、靶基因序列和poly A添加序列依次进行功能性连接的连接DNA片段(参照专利文献1的图1)。

在非专利文献1和2中记载着下述方法：使用在用于基因扩增的引物的5’端侧添加有与所连接的对方的DNA片段的末端区相同的序列的引物，分别独立扩增启动子序列、靶基因序列和poly A添加序列。通过使用这3种DNA片段进行连接PCR，制造使启动子序列、靶基因序列和poly A添加序列进行功能性连接的连接DNA片段(参照非专利文献1的图2和非专利文献2的图1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO 03/091440号公报

非专利文献

非专利文献1：Nikolai A.Shevchuk等人，Nucleic Acids Research，2004，第32卷，No.2e19

非专利文献2：H.-X.Liao等人，Journal of Virological Methods，158，(2009)，第171-179页

专利文献1以及非专利文献1～2的全部内容作为公开而特别引用于此。

发明内容

发明所要解决的课题

靶基因片段通常以PCR产物的形式制备，但在PCR时的引物与模板的结合特异性低的情况下、或模板中存在多数与引物序列类似的序列的情况下等，会发生非特异性扩增反应，结果两端的引物序列所夹持的区会生成并不是克隆的对象即靶基因的非特异性扩增生成DNA片段。

在以往的连接PCR法中，在为了扩增各DNA片段而使用的引物中添加有用于连接的序列。在使用所述引物扩增的各DNA片段中，用于与不同的DNA片段杂交的序列被导入到DNA片段末端侧。接下来，通过混合所扩增的DNA片段进行连接PCR，形成两种以上的DNA片段结合的“连接DNA片段”。

但是，在上述方法中，关于通过基因扩增反应得到的PCR产物的引物序列所夹持的区并不是来自靶基因的序列的片段，也与靶基因片段一样形成“连接DNA片段”。

即使是暂且通过基因扩增反应仅靶基因片段被扩增的情形，反应液中也残留有用于基因扩增的引物，若不将其除去就进行连接PCR反应，则作为“连接DNA片段”的构成要素的各DNA片段的扩增较“连接DNA片段”的扩增优先发生，因此难以形成包含来自目标靶基因的序列的“连接DNA片段”。

因此，在上述专利文献和非专利文献所述的方法中，在靶基因片段的PCR扩增后，必须将PCR扩增产物纯化至可以忽略引物和包含非靶基因序列的DNA片段的混入所带来的影响的程度。

如上所述，按照以往的方法制造结合有两条以上的双链DNA片段的“连接DNA片段”时，作为与靶基因以外的具有特定功能的一个或多数DNA片段连接之前的步骤之一，要求将PCR扩增产物中所含的包含靶基因序列的DNA片段纯化至可以忽略包含非靶基因序列的DNA片段和用于靶基因扩增的引物的混入对连接反应的影响的程度。但是，当靶基因片段的长度与非靶基因片段的长度接近时，难以分离靶基因片段。因此，在这种情况下，不可能只得到包含来自目标靶基因的序列的“连接DNA片段”。

于是，本发明的目的在于提供：使一个以上的双链DNA片段与包含靶基因序列的PCR扩增产物结合，制作包含来自目标靶基因的序列的“连接DNA片段”的方法，该方法无需纯化上述PCR扩增产物，即可特异性地制作上述“连接DNA片段”。

解决课题的方法

本发明人等反复进行深入研究，结果在连接包含靶基因序列的双链基因片段和包含用于与该双链基因片段连接的连接用DNA区的连接用双链DNA片段时，通过下述(1)～(4)：

(1)作为上述双链基因片段，准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在中央部分包含靶基因，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因中所含的固有序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)作为上述双链DNA片段，准备连接用双链DNA片段，其中央部分包含至少一个连接用DNA区，两末端侧分别具有可缔合区；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的上述一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的另一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的上述另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)使用上述3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段，进行至少两次的热变性、再缔合和DNA合成反应，

即使在上述双链基因片段中共存包含非靶基因的基因片段或用于通过PCR扩增上述双链基因片段的引物的情况下，也可抑制在非靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的非特异性生成，成功的特异性地得到了在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的目标连接DNA片段，完成了本发明的第1方案(权利要求1所述的发明)。

这里，以其中一方可缔合区为“区1”、以另一方可缔合区为“区2”时，3’端突出双链基因片段具有用“区1-靶基因-区2”示意性地表示的序列，连接用双链DNA片段具有用“区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列，连接DNA片段具有至少一个用“区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列。

并且，当连接用DNA区包含两个连接用DNA区1和2、具有用“区2-连接用DNA区2-连接用DNA区1-区1”示意性地表示的序列时，形成具有至少一个用“区2-连接用DNA区2-连接用DNA区1-区1-靶基因-区2-连接用DNA区2-连接用DNA区1-区1”示意性地表示的序列的片段。

并且，本发明人等通过将上述本发明的第1方案中的连接用双链DNA片段分成具有用“区1-连接用DNA区1”和“连接用DNA区2-区2”各自示意性地表示的序列的两个连接用双链DNA片段1和2，也抑制了在非靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、在另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的非特异性生成，成功地特异性地得到了在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、在另一侧连接有连接用DNA区2的目标连接DNA片段，完成了本发明的第2方案(权利要求9所述的发明)。

这里得到的连接DNA片段具有用“连接用DNA区1-区1-靶基因-区2-连接用DNA区2”示意性地表示的序列。

而且，本发明人等通过使用上述本发明的第2方案中的分成两个片段的其中任一个连接用双链DNA片段、用“区1-连接用DNA区1”或“连接用DNA区2-区2”示意性地表示的序列，抑制了在非靶基因的一侧连接有连接用DNA区1或2的连接DNA片段的非特异性生成，成功地特异性地得到了在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1或2的目标单侧连接DNA片段，完成了本发明的第3方案(权利要求16所述的发明)。

本发明还包含上述本发明的第1方案～第3方案中使用的3’端突出双链基因片段、连接用双链DNA片段和它们的组合体、以及包含这些片段的试剂盒。

本发明如下。

[1]连接DNA片段的制造方法，是制造在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法，该方法包括：

(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)准备连接用双链DNA片段，其中央部分包含连接用DNA区，两末端侧分别具有可缔合区；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的另一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)通过使用上述3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段，进行至少两次热变性、再缔合和DNA合成反应，得到上述连接DNA片段。

[2][1]所述的制造方法，其中，以上述一方可缔合区为“区1”、以另一方可缔合区为“区2”时，上述连接DNA片段具有至少一个用“区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列。

[3][1]所述的制造方法，其中，

连接用DNA区包含序列A和序列B作为两个连接用DNA区；

上述3’端突出双链基因片段的可缔合区，其中一方从末端侧起具有序列P1和T1，另一方从末端侧起具有序列P2和T2，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列；

上述连接用双链DNA片段的可缔合区，其中一方从末端侧起具有序列VP1和VT1，另一方从末端侧起具有序列VP2和VT2，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列，序列VP2和VT2、与序列P2和T2分别具有相同的核苷酸序列。

[4][3]所述的制造方法，其中，

上述3’端突出双链基因片段用“P1-T1-靶基因-T2-P2”表示，

上述连接用双链DNA片段用“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”表示，

上述连接DNA片段是具有至少一个“VT2-VP2(T2-P2)-序列B-序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因-VT2-VP2(T2-P2)-序列B-序列A-VP1-VT1(P1-T1)”的DNA片段，其中，VT2-VP2(T2-P2)是指与T2-P2相同的VT2-VP2，而VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1相同的VT1-VP1。

[5][3]或[4]所述的制造方法，其中，位于序列P2的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列B的VP2相邻的序列不同的序列，而位于序列P1的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列A的VP1相邻的序列不同的序列。

[6][1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，上述突出末端是在3’端包含双脱氧核苷酸的序列。

[7]DNA片段的制造方法，是以按照[1]～[6]中任一项所述的方法制造的连接DNA片段为模板，以扩增连接DNA片段中所含的至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的方式，使用在连接DNA片段中所含的不同的连接用DNA区发挥作用的正向引物和反向引物进行PCR，制造包含至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的DNA片段。

[8]DNA片段的制造方法，该方法包括：以按照[3]所述的方法制造的连接DNA片段为模板，使用3’端朝向靶基因包含序列A的一部分核苷酸序列的正向引物和3’端朝向靶基因包含序列B的一部分核苷酸序列的反向引物进行PCR，得到连接有序列A、靶基因的序列和序列B的DNA片段。

[9]连接DNA片段的制造方法，是制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的方法，该方法包括：

(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列是靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)准备包含连接用DNA区1且末端侧具有可缔合区的连接用双链DNA片段1、以及包含连接用DNA区2且末端侧具有可缔合区的连接用双链DNA片段2；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段1的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段1的可缔合区是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段2的末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段2的可缔合区是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)通过使用上述3’端突出双链基因片段以及连接用双链DNA片段1和2，进行至少两次的热变性、再缔合和DNA合成反应，得到上述连接DNA片段。

[10][9]所述的制造方法，其中，

连接用DNA区1包含序列A，连接用DNA区2包含序列B；

上述3’端突出双链基因片段的可缔合区，其中一方自末端侧起具有序列P1和T1，另一方自末端侧起具有序列P2和T2，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列；

上述连接用双链DNA片段1的可缔合区自末端侧起具有序列VT1和VP1，连接用双链DNA片段2的可缔合区自末端侧起具有序列VT2和VP2，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列，而序列VP2和VT2、与序列P2和T2分别具有相同的核苷酸序列。

[11][10]所述的制造方法，其中，

上述3’端突出双链基因片段用“P1-T1-靶基因-T2-P2”表示；

上述连接用双链DNA片段1用“序列A-VP1-VT1”表示，上述连接用双链DNA片段2用“VT2-VP2-序列B”表示；

上述连接DNA片段是具有至少一个“序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因-VT2-VP2(T2-P2)-序列B”的DNA片段，其中，VT2-VP2(T2-P2)是指与T2-P2相同的VT2-VP2，VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1相同的VT1-VP1。

[12][10]或[11]所述的制造方法，其中，位于序列P2的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列B的VP2相邻的序列不同的序列，而位于序列P1的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列A的VP1相邻的序列不同的序列。

[13][9]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，上述突出末端是在3’端包含双脱氧核苷酸的序列。

[14]DNA片段的制造方法，是以按照[9]～[13]中任一项所述的方法制造的连接DNA片段为模板，以扩增连接DNA片段所含的至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的方式，使用在连接DNA片段所含的不同的连接用DNA区中发挥作用的正向引物和反向引物进行PCR，制造包含至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的DNA片段。

[15]DNA片段的制造方法，该方法包括：以按照[10]所述的方法制造的连接DNA片段为模板，使用3’端朝向靶基因包含序列A的一部分核苷酸序列的正向引物和3’端朝向靶基因包含序列B的一部分核苷酸序列的反向引物进行PCR，得到连接有序列A、靶基因的序列和序列B的DNA片段。

[16]单侧连接DNA片段的制造方法，是制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的方法，该方法包括：

(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在上述靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区，并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)准备包含连接用DNA区、且末端侧具有可缔合区的连接用双链DNA片段；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)使用上述3’端突出双链基因片段以及连接用双链DNA片段，进行一次热变性、再缔合和DNA合成反应，得到异源双链DNA产物，然后通过以该异源双链DNA产物为模板进行聚合酶链反应，得到上述单侧连接DNA片段。

[17][16]所述的制造方法，其中，

连接用DNA区包含序列A；

上述3’端突出双链基因片段的可缔合区自末端侧起具有序列P1和T1，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列；

上述连接用双链DNA片段的可缔合区自末端侧起具有序列VT1和VP1，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列；

以上述异源双链DNA产物为模板的聚合酶链反应，使用3’端朝向上述靶基因的突出末端侧包含上述异源双链DNA产物的一部分靶基因的引物和3’端朝向上述靶基因侧包含上述异源双链DNA产物的一部分序列A的引物。

[18][17]所述的制造方法，其中，

上述3’端突出双链基因片段用“P1-T1-靶基因”表示；

上述连接用双链DNA片段用“序列A-VP1-VT1”表示；

上述单侧连接DNA片段是具有至少一个“序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因”的DNA片段，其中，VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1相同的VT1-VP1。

[19][17]或[18]所述的制造方法，其中，位于序列P1的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列A的VP1相邻的序列不同的序列。

[20][16]～[18]中任一项所述的制造方法，其中，上述突出末端为3’端包含双脱氧核苷酸的序列。

[21][3]、[4]、[10]或[11]所述的制造方法，其中进一步包括：使脱氧核苷酸末端转移酶与包含靶基因的序列的双链DNA片段和多脱氧核苷酸作用，得到包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段(其中，上述包含靶基因的序列的双链DNA片段在各末端具有序列P1和序列P2，在上述序列P1的内侧的一部分具有序列T1，在上述序列P2的内侧的一部分具有序列T2，并且上述序列T1和T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列)。

[22][17]或[18]所述的制造方法，其中进一步包括：使脱氧核苷酸末端转移酶与包含靶基因的序列的双链DNA片段和多脱氧核苷酸作用，得到包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段(其中，上述包含靶基因的序列的双链DNA片段在一个末端具有序列P1，在上述序列P1的内侧的一部分具有序列T1，并且上述序列T1具有靶基因所固有的核苷酸序列)。

[23][3]、[4]、[10]或[11]所述的制造方法，其中，上述序列T1和序列T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。

[24][3]、[4]、[10]或[11]所述的制造方法，其中，上述序列P1和序列P2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。

[25][3]、[4]、[10]、[11]、[17]或[18]所述的制造方法，其中，上述序列P1和P2独立地为10个碱基以上。

[26][1]～[25]中任一项所述的制造方法，其中，

上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的序列；以及

上述连接用双链DNA片段或具有上述序列A的连接用双链DNA片段中的上述区VP1和区VT1具有来自或不是来自抗体基因或T细胞受体基因的序列。

[27][26]所述的制造方法，其中，

上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的序列；以及

上述连接用双链DNA片段或具有上述序列B的连接用双链DNA片段中的上述区VP2和区VT2为来自或不是来自抗体基因或T细胞受体基因的序列。

[28]使用按照[26]或[27]所述的方法制造的连接DNA片段来制造抗体或T细胞受体的方法。

[29]3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端。

[30]连接用双链DNA片段，其中央部分包含连接用DNA区，两末端侧分别具有可缔合区。

[31]组合体，是下述(1)和(2)的组合体：

(1)3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)连接用双链DNA片段，其中央部分包含连接用DNA区，两末端侧分别具有可缔合区；

该组合体在制造靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法中使用。

[32][31]所述的组合体，其中，

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的另一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

[33]连接用双链DNA片段1，其中包含连接用DNA区1、且末端侧具有可缔合区；或者连接用双链DNA片段2，其中包含连接用DNA区2、且末端侧具有可缔合区。

[34]组合体，是下述(1)和(2)的组合体：

(1)3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)连接用双链DNA片段1，其中包含连接用DNA区1、且末端侧具有可缔合区；或者连接用双链DNA片段2，其中包含连接用DNA区2、且末端侧具有可缔合区；

该组合体在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的方法中使用。

[35][34]所述的组合体，其中，

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段1的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段1的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段2的末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段2的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

[36]3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，在上述靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区，并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端。

[37]连接用双链DNA片段，其中包含连接用DNA区、且末端侧具有可缔合区。

[38]组合体，是下述(1)和(2)的组合体：

(1)3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，在上述靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区，并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)连接用双链DNA片段，其中包含连接用DNA区、且末端侧具有可缔合区；

该组合体在制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的方法中使用。

[39][38]所述的组合体，其中，

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

[40][30]～[35]、[37]～[39]中任一项所述的连接用双链DNA片段或组合体，其中，上述连接用DNA区为选自内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列、或者在菌或动物细胞内可以抑制各种基因的表达的启动子、增强子序列、poly A添加序列等的至少一种序列。

[41]试剂盒，其中包含[29]所述的3’端突出双链基因片段、[30]所述的连接用双链DNA片段、或者[31]或[32]所述的组合体，该试剂盒在制造靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法中使用。

[42]试剂盒，其中包含[29]所述的3’端突出双链基因片段、[33]所述的连接用双链DNA片段、或者[34]或[35]所述的组合体，该试剂盒在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的方法中使用。

[43]试剂盒，其中包含[36]所述的3’端突出双链基因片段、[37]所述的连接用双链DNA片段、或者[38]或[39]所述的组合体，该试剂盒在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的方法中使用。

[44][41]～[43]中任一项所述的试剂盒，其中，上述连接用DNA区为选自内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列、或者在菌或动物细胞内可以控制各种基因的表达的启动子、增强子序列、poly A添加序列等的至少一种序列。

发明效果

根据本发明的方法，可以在通过非特异性扩增得到的基因扩增产物共存下，使靶基因扩增产物特异性地与连接用DNA片段连接。根据本发明的方法，对于靶基因，不管包含靶基因序列的DNA片段是否被纯化，例如，可以特异性地制造将连接用DNA片段中所含的序列A和序列B按照“序列A-靶基因序列-序列B”的顺序进行功能性连接的连接DNA片段。

并且，根据本发明，通过以序列A作为启动子序列、以序列B作为poly A添加序列，将“序列A-靶基因序列-序列B”依次功能性连接的连接DNA片段导入宿主细胞中时，可以使靶基因序列表达。虽然后面会详述，但象如上所述使启动子序列和poly A添加序列进行功能性连接得到的序列那样，当具有上述序列依次功能性连接得到的序列的双链DNA单元由该靶基因序列的表达所必需的最小构成的双链DNA片段组成时，在本发明中有时将其称作表达单元。

上述表达单元与使用大肠杆菌制备的环状型载体不同，其是在试管内合成的线状双链DNA片段，所以不会混入内毒素等的来自菌体的有害物质。其结果，可以在不受有害物质影响的状态下使用宿主细胞特异性且大量地生产靶基因所编码的蛋白。

附图说明

图1是用于说明本发明的第1方案的反应图解。

图2是用于说明本发明的第1方案的一个实施方式的反应图解。

图3是用于说明在本发明的第1方案的一个实施方式中，在热变性、再缔合和DNA合成反应中未生成核酸延伸产物、未得到连接DNA片段的情形的反应图解。

图4是用于说明用于由根据本发明的第1方案的一个实施方式得到的连接DNA片段得到所期望的双链DNA片段的方法的反应图解。

图5是用于说明在用于由根据本发明的第1方案的一个实施方式得到的连接DNA片段得到所期望的双链DNA片段的方法中，未得到所期望的双链DNA片段的情形的反应图解。

图6是用于说明本发明的第2方案的一个实施方式的反应图解。

图7是用于说明本发明的第3方案的一个实施方式的反应图解。

图8是通过琼脂糖凝胶电泳确认将人γ链基因连接用双链DNA片段和靶基因片段及非靶基因片段的混合物供给该选择性连接方法而得到的扩增产物的图。泳道1：通过使3’端多核苷酸添加靶基因片段1与人γ链基因连接用双链DNA片段连接得到的、由启动子-人γ链基因-poly A添加序列组成的连接单元(人γ链基因表达单元)；泳道2：通过使3’端多核苷酸添加非靶基因片段2与人γ链基因连接用双链DNA片段连接得到的连接单元；泳道3：通过使靶基因片段1与人γ链基因连接用双链DNA片段连接得到的人γ链基因表达单元；泳道4：通过将非靶基因片段2与人γ链基因连接用双链DNA片段连接得到的连接单元。

图9是通过琼脂糖凝胶电泳确认使用错配引物或普通引物将通过3’端多核苷酸添加靶基因片段1与人γ链基因连接用双链DNA片段的结合产生的人γ链基因表达单元的聚合物供给PCR后所扩增的DNA的图。泳道1和2：使用引物E和F扩增人γ链基因表达单元；泳道3和4：使用引物G和H扩增人γ链基因表达单元。

图10是靶基因片段1的核苷酸序列的说明图。

图11是非靶基因片段2的核苷酸序列的说明图。

图12是人γ链基因连接用双链DNA片段的核苷酸序列的说明图。

图13是使用磁珠的cDNA合成法(免疫球蛋白可变区扩增法)的说明图。

图14是人γ链基因连接用双链DNA片段的制造方法的示意图。

图15是显示在例3中由人浆细胞1和2扩增γ链和κ链可变区的结果的图。

图16是人κ链基因连接用双链DNA片段的核苷酸序列的说明图。

图17是显示在例3中将所扩增的γ链和κ链可变区变换成表达单元的结果的图。

图18是显示在例3中利用ELAISA法测定分泌到细胞培养液中的重组人免疫球蛋白的结果的图。

具体实施方式

[用语的定义]

在本说明书中，以下用语具有以下所示的含义。

在本发明的方法中，“靶基因序列”是指想要特异性地得到连接有连接用双链DNA片段的连接DNA片段的基因的序列。靶基因序列的例子后面叙述。

“双链基因片段”是指包含靶基因序列的双链基因片段。

“3’端突出双链基因片段”是指在双链基因片段的两方的3’端具有突出末端的基因片段。

在本发明的方法中，“连接用双链DNA片段”是指与靶基因序列连接以得到连接DNA片段的DNA片段。

“可缔合区”是指，在后述的“热变性、再缔合和DNA合成反应”中的再缔合(退火)中，能够与连接用双链DNA片段所具有的两个“可缔合区”中的一方缔合的区。

“靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列”是指靶基因序列中所含的、靶基因本来具有的核苷酸序列。

“连接DNA片段”是指在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的双链连接DNA片段。

“单侧连接DNA片段”是指在靶基因的一侧连接有连接用DNA区的双链连接DNA片段。

“连接单元”是指“序列A-靶基因-序列B”。

“连接单元聚合物”是指多数连接单元连接而成的DNA片段。

“有义链”是指双链DNA的任意一方的单链DNA链，“反义链”是指任意一方的单链DNA链为“有义链”时的双链DNA的另一方的单链DNA链。

“区”是指由相应位置的有义链的序列和反义链的序列组成的部分。

关于上述以外的用语，以下的说明书中定义的用语以其定义的含义使用。

[本发明的第1方案]

以下，对本发明的第1方案进行详细说明。

本发明的第1方案为：由“3’端突出双链基因片段”和“连接用双链DNA片段”制造在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的“连接DNA片段”的方法。(参照图1)

“3’端突出双链基因片段”

在本发明的第1方案中，(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备“3’端突出双链基因片段”。如图1的最上段所示，“3’端突出双链基因片段”在中央部分包含靶基因序列，在两方的末端侧分别具有可缔合区(可缔合的区1和可缔合的区2)。

对本发明中的“靶基因序列”没有特别限定。“靶基因序列”例如可以是抗体基因序列，位于抗体基因序列的一个末端的序列可以是来自抗体基因的恒定区的序列。“靶基因序列”除抗体基因序列外还可以是T细胞受体基因、剪接变体等的虽然引物区和与其相邻的内侧的序列恒定但内部具有可变部位的DNA序列。

“可缔合区”是指，在后述的“热变性、再缔合和DNA合成反应”中的再缔合(退火)中，能够与连接用双链DNA片段所具有的两个“可缔合区”中的一方缔合的区。3’端突出双链基因片段的“可缔合区”与连接用双链DNA片段的“可缔合区”的缔合关系后面阐述。

“3’端突出双链基因片段”的两末端的可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列。“彼此不缔合的核苷酸序列”是指，其中一方“可缔合区”的有义链和反义链均不与另一方“可缔合区”的有义链和反义链中的任一个缔合的核苷酸序列。

并且，3’端突出双链基因片段的“可缔合区”的一方或两方的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列。“靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列”是指靶基因序列中所含的、靶基因本来具有的核苷酸序列。“可缔合区”所包含的靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，当由包含靶基因序列的双链基因片段准备“3’端突出双链基因片段”时，是指包含靶基因序列的双链基因片段中所含的核苷酸序列被原样保存下来的残留的序列。“3’端突出双链基因片段”中，除“可缔合区”的上述核苷酸序列以外，当然还保存、残留有靶基因序列。换言之，“可缔合区”的上述核苷酸序列可以说是靶基因序列的一部分。由按照本发明的第1方案的方法制造的“连接DNA片段”，经由进一步追加的步骤(关于进一步追加的步骤后面阐述)，最终由目标靶基因序列，使该靶基因序列所编码的蛋白表达时，上述“可缔合区”中所含的“靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列”所编码的部分有时也成为将要表达的蛋白的一部分。

3’端突出双链基因片段在其两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端。该突出末端由核苷酸的单链组成，分别是一方末端与“可缔合区”的3’端结合、而另一方末端即3’端呈未结合的开放状态。

上述突出末端与连接用双链DNA片段所具有的可缔合区之间具有以下(3-2)和(3-4)的关系。

(3-2)起自3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

(3-4)起自3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

本发明中，“在DNA合成反应中不具有链延伸功能”的序列是指，不与对方侧(相手側)的单链杂交，其结果，以对方侧的单链为模板，在DNA合成反应中不发生链延伸。例如，当彼此为DNA同伴时，至少一个核苷酸与对方侧的单链不互补的序列是“在DNA合成反应中不具有链延伸功能”的序列。其中，杂交条件为第1循环的热变性、再缔合和DNA合成反应中的再缔合的条件。第1循环的再缔合的条件后面阐述。或者，3’端为具有在DNA合成反应中无法添加以下的核苷酸的结构的核苷酸、例如双脱氧核苷酸的序列是“在DNA合成反应中不具有链延伸功能”的序列。

通过突出末端与连接用双链DNA片段所具有的可缔合区具有上述(3-2)和(3-4)的关系，即使在共存用于通过PCR扩增在相当于靶基因的区包含非靶基因的非靶3’端突出双链基因片段或作为上述3’端突出双链基因片段的来源的双链基因片段的引物的情况下，在进行两个循环的热变性、再缔合和DNA合成反应中，也可以抑制在通过PCR制备的3’端突出双链基因片段中生成以非靶3’端突出双链基因片段为模板的、在非靶基因的两侧连接有连接用DNA区的非靶连接DNA片段。其结果，可以抑制非靶基因的两侧连接有连接用DNA区的非靶连接DNA片段的非特异性生成。更具体的说明后面阐述。

“连接用双链DNA片段”

(2)在本发明中，准备中央部分包含连接用DNA区、两末端侧分别具有可缔合区的连接用双链DNA片段。如图1的上起第2个片段所示，连接用双链DNA片段在连接用DNA区的两方的末端侧分别具有可缔合区(可缔合的区1和可缔合的区2)。

连接用DNA区只要是与靶基因的两侧连接、可以赋予连接DNA片段追加的功能的DNA区即可，没有特别限定。连接用DNA区例如可以列举：内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列、或者在菌或动物细胞内可以控制各种基因的表达的启动子、增强子序列、poly A添加序列等。

如上所述，若以其中一方可缔合区作为“区1”、以另一方可缔合区作为“区2”，则3’端突出双链基因片段具有用“区1-靶基因-区2”示意性地表示的序列，连接用双链DNA片段具有用“区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列，连接DNA片段具有至少一个用“区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列。因此，例如当连接用DNA区为荧光蛋白基因时，连接DNA片段具有至少一个“区2-荧光蛋白基因-区1-靶基因-区2-荧光蛋白基因-区1”所示的序列。

另外，使靶基因在宿主细胞中表达、欲以制备靶基因所编码的蛋白时，作为连接用DNA区，使用包含poly A添加序列及启动子的两个连接用DNA区1和2的连接用双链DNA片段。此时，连接用双链DNA片段具有用“区2-poly A添加序列-启动子-区1”示意性地表示的序列。若使用该连接用双链DNA片段，则连接DNA片段具有至少一个用“区2-poly A添加序列-启动子-区1-靶基因-区2-poly A添加序列-启动子-区1”示意性地表示的序列。

接下来，对3’端突出双链基因片段的可缔合区与连接用双链DNA片段的可缔合区的关系进行说明。

首先，在本说明书中，双链基因片段和连接用双链DNA片段中的“可缔合区”是指，在后述的“热变性、再缔合和DNA合成反应”中的再缔合中，在再缔合之前的热变性中，解离成单链的DNA(基因)片段与具有互补的核苷酸序列的单链基因(DNA)片段杂交可以形成双链的区。其中，虽然是否可以缔合还取决于具有彼此互补的核苷酸序列的二条单链DNA(基因)片段的长度或核苷酸序列，但再缔合的条件是指，当形成单链的可缔合区的长度为11个核苷酸以上、且再缔合时的退火温度较所计算的Tm值低0℃～20℃时能够缔合。

在本发明的第1方案中，3’端突出双链基因片段的可缔合区与连接用双链DNA片段的可缔合区具有以下(3-1)和(3-3)的关系。

(3-1)3’端突出双链基因片段的一方可缔合区(图1中的可缔合区1)由与连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区(图1中的可缔合区1v)相同的核苷酸序列组成，但与3’突出末端结合的末端侧在连接用双链DNA片段的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧。即，3’端突出双链基因片段的一方可缔合区(可缔合区1)和连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区(可缔合区1v)由相同的核苷酸序列组成。但是，3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的末端侧在连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区中位于与连接用DNA区结合的一侧(内侧)。

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区(图1中的可缔合区2)由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区(图1中的可缔合区2v)相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧。与上述(3-1)一样，3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区(可缔合区2)与连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区(可缔合区2v)由相同的核苷酸序列组成。但是，3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的末端侧在连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区中位于与连接用DNA区结合的侧(内侧)。

在本发明的第1方案中，由于3’端突出双链基因片段的可缔合区和连接用双链DNA片段的可缔合区具有上述(3-1)和(3-3)的关系，通过进行两个循环的热变性、再缔合和DNA合成反应，得到具有至少一个靶基因的两侧被“区2-连接用DNA区-区1”夹持的、用“区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列的连接DNA片段。在后述的具体例子中进行更具体的说明。“热变性、再缔合和DNA合成反应”

本发明的第1方案中包括：(4)使用上述3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段，通过进行至少两次的热变性、再缔合和DNA合成反应，得到上述连接DNA片段。图1显示进行两次热变性、再缔合和DNA合成反应的例子。关于热变性、再缔合和DNA合成反应的详细条件后面阐述。通过该方法制造的连接DNA片段，如图1的最下段所示，若以上述一方可缔合区(可缔合区1)为“区1”、以另一方可缔合区(可缔合区2)为“区2”，则成为具有至少一个用“区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列的DNA片段。

“第1方案的实施方式”

参照图2，进一步详细说明本发明的第1方案的一个实施方式。

在图2所示的实施方式中，

(i)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区1自末端侧起具有序列P1和T1、另一方可缔合区2自末端侧起具有序列P2和T2。而且，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，优选序列T1和序列T2两方均具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列。并且，3’端突出双链基因片段在一条链的序列P2的3’端具有一个核苷酸以上的序列NNNNN作为突出末端，并且在另一条链的上述序列P1的3’端具有一个核苷酸以上的序列NNNNN作为突出末端。尚需说明的是，NNNNN是指一个核苷酸以上的序列，并不是指5个核苷酸。

(ii)上述连接用双链DNA片段的连接用DNA区包含序列A和序列B作为连接用DNA区；

(iii)上述连接用双链DNA片段的一方可缔合区1v自末端侧起具有序列VT1和VP1、另一方可缔合区2v自末端侧起具有序列VT2和VP2，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列，序列VP2和VT2、与序列P2和T2分别具有相同的核苷酸序列。

并且，在上述具体方案中，

3’端突出双链基因片段以“P1-T1-靶基因-T2-P2”表示(其中，这里3’端突出末端未表示。若将3’端突出末端记作NNNNN，则可以记作NNNNN-P1-T1-靶基因-T2-P2-NNNNN)。连接用双链DNA片段以“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”表示。而且，连接DNA片段为具有至少一个“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1-靶基因-VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”所示序列的DNA片段。其中，VT2-VP2和T2-P2是相同的序列，而VP1-VT1和P1-T1是相同的序列，所以连接DNA片段可以说是具有至少一个“T2-P2-序列B-序列A-P1-T1-靶基因-T2-P2-序列B-序列A-P1-T1”所示序列的DNA片段。

<实施方式中的3’端突出双链基因片段>

对3’端突出双链基因片段进一步进行详细说明。

序列P1和P2只要是与应该引导(priming)的引物特异性杂交的序列和长度即可，没有特别限定，关于长度，例如是10个碱基以上，优选为10～100个碱基，更优选为15～50个碱基，进一步优选为15～30个碱基。区P1和P2的一方或两方可以具有靶基因所固有的核苷酸序列。另外，区P1和P2的一方或两方的所有序列可以是靶基因的序列的一部分序列。需要说明的是，如后所述，区P1和P2分别由与连接用双链DNA片段的区VP1和VP2相同的核苷酸序列组成。

3’端突出双链基因片段在序列P1的内侧具有序列T1，在序列P2的内侧具有序列T2。这些序列T1和T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。在序列P1与序列T1之间、序列P2与序列T2之间、序列T2具有靶基因所固有的序列时的序列T1与靶基因的序列之间、序列T1具有靶基因所固有的序列时的序列T2与靶基因的序列之间，在热变性、再缔合和DNA合成反应中，在不妨碍3’端突出双链基因片段的各链与“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的各链形成双链的范围内，可以具有间隔序列等序列。序列T1和T2的详细内容后面阐述。

3’端突出双链基因片段的3’突出末端例如是不同于设在序列P1和序列P2的各自的3’末端的连接用双链DNA片段的序列的、由至少一个以上的核苷酸组成的序列。如上所述，在与“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的热变性、再缔合和DNA合成反应中，该3’突出末端是为了防止以3’端突出双链基因片段的各链的两3’末端为基点的核酸延伸而设。

因此，设在记作3’端突出双链基因片段的反义链的链的3’末端的核苷酸或核苷酸链NNNNN只要是与记作连接用双链DNA片段“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的有义链的链的序列VP1的5’侧(序列A侧)的序列是不互补的核苷酸或至少一部分是不互补的序列的核苷酸链即可，没有特别限定，关于长度，例如是1个碱基以上，优选为2～100个碱基，更优选为5～50个碱基。

同样，设在记作3’端突出双链基因片段的有义链的链的3’末端的核苷酸或核苷酸链NNNNN只要是与连接在连接用双链DNA片段“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的反义链的区VP2的5’侧(序列B侧)的序列不互补的核苷酸或至少一部分是不互补的序列的核苷酸链即可，没有特别限定，关于长度，例如是1个碱基以上，优选为2～100个碱基，更优选为5～50个碱基。

另外，设在序列P1(P2)的3’突出末端的核苷酸或核苷酸链的3’端的核苷酸，还可以是如双脱氧核苷酸那样可以抑制自序列P1(P2)的3’端起的DNA延伸反应的化合物。此时，设在序列P1的3’末端的核苷酸或核苷酸链NNNNN还可以是与记作连接用双链DNA片段“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的有义链的链的序列VP1的5’侧(序列A侧)的序列互补的核苷酸。同样，设在序列P2的3’末端的核苷酸或核苷酸链NNNNN还可以是与记作连接用双链DNA片段“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的反义链的链的序列VP2的5’侧(序列A侧)的序列互补的核苷酸。

对3’端突出双链基因片段的制造方法没有特别限定，例如可以通过使用靶基因作为模板的PCR来制造。以下，以具有免疫球蛋白基因的可变区和恒定区的一部分的双链DNA片段作为靶基因片段的情形为例，根据图13进行说明。图13所示的引物2的序列(的一部分)相当于具有3’突出末端的靶双链DNA片段的序列T1，引物4和3相当于具有3’突出末端的双链DNA片段的序列P1和P2。另外，与引物3的上游侧连接的来自恒定区的序列相当于3’端突出双链基因片段的序列T2。

首先，使用磁珠回收编码靶基因的mRNA，然后通过使用逆转录酶的逆转录反应合成cDNA。然后，使用末端脱氧核苷酸转移酶在合成的cDNA的3’末端添加poly dG。然后以3’末端添加有poly dG的免疫球蛋白cDNA(在磁珠上合成的cDNA)为模板，使用引物1(免疫球蛋白基因恒定区)和2(用于与poly dG缔合以进行DNA合成的引物)进行第1次PCR。

第1次PCR结束后，将其例如稀释至100倍左右后作为第2次PCR的模板。使用的引物为4和3。引物4的3’末端侧的序列设计成与第1次PCR中使用的引物2的5’末端侧重叠，使引物4与该区结合。引物3位于恒定区，设计成位于第1次PCR中使用的引物1的内侧。其中，引物3可以具有一部分与引物1重叠的序列，但还可以具有不与引物1重叠的序列。通过第1次PCR使包含免疫球蛋白的恒定区的DNA片段扩增时，通过使用引物3和4，可以进一步扩增包含免疫球蛋白的恒定区的DNA片段、即包含免疫球蛋白的恒定区作为靶基因序列的双链DNA片段。上述方法是被称作RACE(RAPIDAMPLIFICATION OF cDNA END，cDNA末端快速扩增)法的PCR法之一。需要说明的是，引物4+2序列是通过两次PCR利用引物2和4合成的人工序列，不具有模板序列所特有(固有)的序列。

在第2次PCR中，引物4特异性地与通过第1次PCR扩增的DNA片段的3’端区结合(由于具有引物2的序列)、引物3与引物1的更内侧的免疫球蛋白恒定区结合。其结果，进行了特异性的扩增。此时，在PCR产物的单侧必然存在4+2的序列。但是，实际上所使用的引物与具有与其类似的核苷酸序列的非靶基因结合，结果有时还合成非特异性的PCR产物。例如，当引物4非特异性地与其他DNA片段结合时，在所合成的DNA片段中，引物4的序列存在于其末端，但在其内侧不存在引物2的序列、即序列T1。

另外，如果引物3与具有与其类似的核苷酸序列的非靶基因结合，进行DNA扩增时，该DNA片段中不存在恒定区的序列、即序列T2。由引物3形成的序列是模板序列所特有(固有)的序列。

对在通过上述第2次PCR得到的PCR产物、即包含靶基因(抗体基因)的序列的双链DNA片段的3’突出末端设置至少一个核苷酸的方法没有特别限定，例如可以列举下述方法，该方法包括：使脱氧核苷酸末端转移酶与包含该靶基因的序列的双链DNA片段和多脱氧核苷酸作用，得到具有3’突出末端的双链DNA片段。通过该方法，可以在两3’末端设置至少一个核苷酸，以得到3’端突出双链基因片段。

<实施方式中的连接用双链DNA片段>

“连接用双链DNA片段”(VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1)，其具有任意的序列A和序列B，在上述序列A的末端侧具有由与上述序列P1相同的核苷酸序列组成的区VP1，在上述序列B的末端侧具有由与上述序列P2相同的核苷酸序列组成的区VP2，在上述区VP1的末端侧具有由与上述3’端突出双链基因片段中的序列P1的内侧的一部分序列T1相同的核苷酸序列组成的区VT1，并且在上述区VP2的末端侧具有由与上述3’端突出双链基因片段中的序列P2的内侧的一部分序列T2相同的核苷酸序列组成的区VT2。其中，上述3’端突出双链基因片段中的序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因所固有的核苷酸序列，上述3’端突出双链基因片段中的位于序列P2的3’端的突出末端的序列是与包含双脱氧核苷酸的序列或上述连接用双链DNA片段的一条链的序列B不同的序列，并且，上述3’端突出双链基因片段中的位于序列P1的3’端的突出末端的序列是与包含双脱氧核苷酸的序列或上述连接用双链DNA片段的另一条链的序列A不同的序列。需要说明的是，本说明书中所说的“区”由相应部位的有义链的序列和反义链的序列组成。

由图2～3所示的图解可知：3’端突出双链基因片段的序列T1和T2相对于作为“连接用双链DNA片段”的“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的VT1和VT2发挥内部序列的作用，促进包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段与“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的选择性再缔合和其后继续的DNA合成反应的进行。这里，“内部序列”是靶基因序列所特有的序列，是指具有与位于靶基因序列的末端的扩增用引物序列相同的序列的P1和P2的内侧序列(T1和T2)，具有与连接用双链DNA片段的VT1和VT2相同的序列。因此，非靶基因片段用“P1-非靶基因片段-P2或P1-T1-非靶基因片段-P2或P1-非靶基因片段-T2-P2”示意性地表示。“内部序列的作用”是指，具有促进连接用双链DNA片段与靶双链基因片段的特异性再缔合和其后的DNA合成反应的进行、且抑制与非靶双链基因片段的再缔合和其后的DNA合成反应的进行的作用的序列。

3’端突出双链基因片段的序列T1与“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的区VT1、以及3’端突出双链基因片段的序列T2与“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的区VT2只要各自由彼此相同的核苷酸序列组成即可，没有特别限定。VT1和VT2的长度分别例如为1个碱基以上，优选为2～100个碱基，更优选为5～50个碱基。序列P1+T1、序列P2+T2、区VP1+VT1、和区VP2+VT2优选Tm值为60℃以上，进一步优选为约68℃～70℃。

对“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的序列A没有特别限定，可以列举如：靶基因片段的上游序列、或内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列、或者在菌或动物细胞内可以控制各自基因的表达的启动子、增强子序列等。对“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的序列B没有特别限定，可以列举如：靶基因片段的下游序列、或内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列或poly A添加序列等。

在序列A和序列B中分别使用启动子序列、poly A添加序列时，在不妨碍靶基因在宿主细胞内的表达的范围内，在各序列之间、序列A的上游、序列B的下游可以存在间隔序列等序列。

对基因连接用双链DNA片段中的序列A和序列B之间的长度没有特别限定。另外，对序列A和区VP1之间、序列B和区VP2之间的长度没有特别限定。在区VP1和VT1之间、区VP2和VT2之间，在不妨碍与具有3’突出末端的双链DNA片段的退火的范围内，可以存在适当长度的间隔序列等序列。

对作为“连接用双链DNA片段”的“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的制造方法没有特别限定，可以组合公知的方法来制造。以下，根据图14来具体说明“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的制造方法的一个例子。

用限制酶1处理具有由限制酶1(Bam HI)和限制酶2(Not I)识别的位点的载体(pCMV-EGFP)，之后将依次包含已知序列(poly dG/dC)和由限制酶3(EcoRV)识别的位点的接头(poly dG/dC-EcoRV接头)插入限制酶1识别位点。然后将所得的插入有接头的载体用限制酶2和3处理，用上游具有限制酶3切断面、且下游具有限制酶2切断面的靶基因的一部分序列(通过PCR由人末梢血淋巴细胞cDNA得到的人免疫球蛋白恒定区)取代限制酶3识别位点～限制酶2识别位点的序列。向所得载体的限制酶3位点插入氨苄青霉素耐性基因以及复制起点。接下来，通过从所述载体中除去卡那霉素耐性基因-复制起点，获得插入有人免疫球蛋白重链基因连接用双链DNA片段的载体(pMiniCMV-hIgG)。以所述载体为模板，使用包含poly dG/dC区以及靶基因的一部分序列(免疫球蛋白恒定区)的引物进行PCR，从而得到人免疫球蛋白重链基因连接用双链DNA片段即“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”。

此时，poly dG/dC相当于区VT1，并且人免疫球蛋白恒定区的一部分相当于区VT2、序列A相当于CMV启动子、序列B相当于免疫球蛋白恒定区的剩余部分和poly A添加序列。另外，多克隆位点(MCS)与poly dG/dC之间的序列的至少一部分相当于区VP1，且人免疫球蛋白恒定区的至少一部分序列相当于区VP2。

(1)热变性、再缔合和DNA合成反应(1)

对第1循环的热变性、再缔合和DNA合成反应进行说明。图2中表示热变性、再缔合和DNA合成(1)。

将包含“P1-T1-靶基因-T2-P2”所示的“3’端突出双链基因片段”和“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”所示的“连接用双链DNA片段”的试样供给热变性、再缔合和DNA合成反应时，首先通过热变性后的再缔合(退火)，在“3’端突出双链基因片段”的一条链(反义链)的区P1+T1和“连接用双链DNA片段”的一条链(有义链)的区VP1+VT1之间形成稳定的双链。同样，在“3’端突出双链基因片段”的有义链的区P2+T2和“连接用双链DNA片段”的反义链的区VP2+VT2之间形成稳定的双链。然后将如此得到的两种双链供给利用DNA聚合酶进行的DNA合成反应。通过该DNA合成反应(核酸延伸反应)，以“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的有义链的区VT1为起点进行核酸延伸，合成核酸延伸物(2)，另外，以“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”的反义链的区VT2为起点进行核酸延伸，合成核酸延伸物(1)。

“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”通过具有由与3’端突出双链基因片段所固有的序列即内部序列T1和/或T2相同的核苷酸序列组成的区VT1和/或VT2，可以进行与具有3’突出末端的DNA片段的选择性再缔合和其后的DNA合成反应。其中，在准备3’端突出双链基因片段时，图13所示的引物4非特异性地与包含非靶基因的序列的DNA片段结合的结果，生成在序列P1的内侧不存在序列T1的双链DNA片段，而且引物3与具有与其类似的核苷酸序列的非靶基因结合的结果，生成在序列P2的内侧不存在序列T2的双链DNA片段。如图3所示，将“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”和在序列P1的内侧不存在序列T1、且在序列P2的内侧不存在序列T2的双链DNA片段供给热变性-再缔合后的DNA合成反应时反应未进行，无法得到连接产物。

并且，在“3’端突出双链基因片段”中，在区P1和P2的两个3’端具有以NNNNN表记的3’端突出末端，并且该突出末端(单链核苷酸)在DNA合成反应中不具有链延伸功能。即，在图2左侧的提供核酸延伸物(1)的图解中，紧随3’端突出双链基因片段的有义链的T2-P2之后的NNNNN不与和紧随缔合的对方侧的链(连接用双链DNA片段的反义链)的VT2-VP2之后的序列B的VP2相邻的序列或与VP2和序列B之间的VP2相邻的序列杂交。这样，由于紧随T2-P2之后的NNNNN不与和紧随VT2-VP2之后的序列B的VP2相邻的序列杂交，所以没有看到以区P1和P2为起点的核酸延伸。在图2右侧的提供核酸延伸物(2)的图解中也同样，紧随3’端突出双链基因片段的反义链的T1-P1之后的NNNNN不与和紧随连接用双链DNA片段的有义链的VT1-VP1之后的序列A的VP1相邻的序列或与VP1和序列A之间的VP1相邻的序列杂交，所以没有看到以区P1和P2为起点的核酸延伸。

第1循环的热变性的条件可以和普通PCR中采用的条件相同，例如可以在90～98℃下进行20～60秒。第1循环的再缔合的条件可以和普通PCR中采用的条件相同，例如可以在60～72℃下进行30秒～6分钟。第1循环的DNA合成反应可以和普通PCR中采用的条件相同，例如可以在68～72℃下进行30秒～6分钟。根据所用DNA聚合酶的酶活性的最适温度，在同一温度下进行退火和核酸延伸，可以作为一个步骤实施。

通过第1循环的热变性、再缔合和DNA合成反应，得到含有核酸延伸物(1)和(2)的反应产物。该反应产物中有可能含有包含图2中未显示而图3中有显示的非靶基因的片段。

(2)热变性、再缔合和DNA合成反应(2)

对第2循环的热变性、再缔合和DNA合成反应进行说明。图2中表示热变性、再缔合和DNA合成(2)。

通过将第1循环的反应产物进行热变性、然后进行再缔合(退火)，使上述核酸延伸物(1)和(2)的一条链不具有“3’端突出双链基因片段”的3’端突出序列即NNNNN，并且“3’端突出双链基因片段”的NNNNN以外的序列相同，所以在该部分形成双链。然后，在该双链中，通过DNA合成反应，以彼此的链为模板，自两链的3’末端起进行核酸延伸，得到在靶基因的两端分别连接有连接用双链DNA片段的连接DNA片段(VT2-VP2-序列B-序列A-靶基因-序列B-序列A-V+P1-VT1)。另一方面，由于来自具有3’端突出序列即NNNNN的核酸延伸物(1)和(2)的单链DNA片段在3’端具有NNNNN，所以在再缔合(退火)中无法形成双链，结果，没有生成以该单链DNA片段为模板的核酸延伸物。

通过第2循环的热变性、再缔合和DNA合成反应，虽然得到了上述连接DNA片段(VT2-VP2-序列B-序列A-靶基因-序列B-序列A-V+P1-VT1)，但在该反应产物中，除了包含未图示但通过第1循环的热变性、再缔合和DNA合成反应产生的非特异性DNA片段以外，还包含(残留)具有未被用作核酸延伸物(1)和(2)的模板的3’端突出序列即NNNNN的单链DNA片段。

尚需说明的是，后面会阐述，上述连接DNA片段(VT2-VP2-序列B-序列A-靶基因-序列B-序列A-V+P1-VT1)中的序列A-靶基因-序列B为连接单元。

(3)热变性、再缔合和DNA合成反应(3)

虽然图2中没有显示，但在本发明的第1方案中，在第2循环的热变性、再缔合和DNA合成反应后，还可以实施第3循环以后的热变性、再缔合和DNA合成反应。

在第3循环的热变性、再缔合和DNA合成反应中，通过第2循环的核酸合成产物即“VT2-VP2-序列B-序列A-靶基因-序列B-序列A-VP1-VT1”的热变性生成的单链中的任意两条在相同的区杂交，以该杂交的双链为模板，通过DNA合成反应进行核酸延伸时，得到含有两个由第2循环的核酸合成产物中的“序列A-靶基因-序列B”组成的连接单元的双链DNA片段。

在第4循环以后，通过反复进行操作，得到包含3个以上的上述连接单元的连接单元聚合物(以下有时称作连接单元聚合物)。因此，在第3循环以后的连接反应中，即使是在连接用双链DNA片段或靶基因片段或两者枯竭的情况下，只要反应液中存在DNA合成用的底物、并维持DNA聚合酶的活性，就可进行连接单元的扩增。即，在第3循环以后，在残留有靶基因和连接用DNA片段的情况下，在发生相当于第1循环和第2循环的反应的同时，聚合反应也同时进行。但是，当没有残留靶基因和连接用DNA片段时，通过聚合产物彼此之间的重复单元边错位边进行再缔合，来进行连接单元的扩增。其结果，与后述的使用靶基因片段、“序列A-VP1-VT1”以及“VT2-VP2-序列B”的“序列A-靶基因-序列B”依次结合的连接单元的制造方法相比，可以更高效地制造连接单元。

尚需说明的是，在热变性、再缔合和DNA合成反应的系统中，除“3’端突出双链基因片段”和连接用双链DNA片段(VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1)以外，还可以包含后述的用于由连接单元聚合物特异性扩增连接单元的错配引物。此时，优选在高温(例如65～72℃)下实施再缔合(退火)，以使这些错配引物不会引导到通过热变性形成单链的连接用双链DNA片段的各单链中。并且，还可以在反应系统中包含错配引物，并在同一温度下实施退火和核酸延伸，此时的热变性、再缔合和DNA合成反应例如可以在90～98℃实施热变性20～60秒，在65～72℃下实施再缔合和DNA合成反应30秒～6分钟，可以进行该循环达2～10个循环。优选可以在93～95℃下实施热变性30～50秒，在68～70℃下实施再缔合和DNA合成反应1～5分钟，进行该循环达4～8个循环。这里的循环是指第1循环的热变性、再缔合和DNA合成反应的循环数。

通过上述反应得到的连接DNA片段是，由序列A-靶基因-序列B组成的连接单元，根据热变性、再缔合和DNA合成反应的循环数，将多数该连接单元连接成直链状而包含的聚合物。该聚合物除上述连接单元以外还在末端包含“序列A-VP1-VT1”或“VT2-VP2-序列B”。“连接单元的制备步骤”

在本发明的第1方案中以核酸合成产物的形式得到的连接DNA片段，根据热变性、再缔合和DNA合成反应的循环数，包含一个上述连接单元。当热变性、再缔合和DNA合成反应的循环数为3次以上时，得到多数连接单元连接而成的连接单元聚合物。本发明的最终目的在于得到“序列A-靶基因-序列B”所表示的连接单元。于是，本发明的第1方案优选进一步具有根据连接单元聚合物制备由序列A-靶基因-序列B组成的连接单元的步骤。

对制备连接单元的步骤没有特别限定，例如可以采用：对连接单元聚合物使用特异性地切断连接单元的上游和下游的限制酶的方法；或以连接单元聚合物为模板，选择性地扩增连接单元的方法等。在使用限制酶的方法中，可以通过向连接单元聚合物中的序列A-靶基因-序列B的序列A的外侧和序列B的外侧的序列中导入限制酶切断序列来实施。

以连接单元聚合物为模板选择性地扩增连接单元的方法，例如通过使用在3’侧包含连接用双链DNA片段(VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1)的有义链的序列A或与其上游的序列相同的序列的错配正向引物、和在3’侧包含序列B或与其下游的序列互补的序列的错配反向引物的PCR可以实施。使用该错配引物用于选择性地扩增连接单元的PCR的图解见图4。如图4所示，使用错配引物时，可以选择性地高效率地扩增从连接单元聚合物中分离的连接单元。在以连接单元聚合物为模板，使用错配正向引物和错配反向引物、通过最少两个循环的PCR反应合成的连接单元中，在其两末端侧添加有与作为模板的连接用双链DNA片段不同的序列。

对使用错配引物的PCR的条件没有特别限定，可以采用通常已知的PCR条件，例如可以实施90～98℃下20～60秒、55～65℃下20～60秒、70～74℃下3～5分钟的反应达25～50个循环左右。

尚需说明的是，使用在其5’侧不具有错配区的引物的PCR的图解见图5。如图5所示，当所用引物不是错配引物时，连接单元和连接单元聚合物同时被扩增，难以选择性地仅扩增连接单元。即，通过以连接单元聚合物为模板、使用正向引物和反向引物的最少两个循环的PCR反应合成的连接单元与作为模板的连接单元聚合物相同。在第3次以后的PCR中，两种模式的反应平行进行。一个是在所合成的连接单元中正向引物和反向引物退火、而连接单元被扩增的反应。另一个是连接单元在连接单元聚合物中退火，结果形成异源双链DNA，连接单元聚合物被扩增的反应。当后一种反应较前一种反应优先进行时，难以有效率地扩增连接单元。相对于此，图4所示的使用错配引物由连接单元聚合物合成的连接单元由于在其两末端侧具有与模板不同的序列，所以即使其在连接单元聚合物中退火形成异源双链DNA，也不能引发DNA延伸反应，其结果连接单元聚合物没有被扩增。

[本发明的第2方案]

本发明的第2方案为：将上述本发明的第1方案中的连接用双链DNA片段分成具有用“连接用DNA区1-区1”和“区2-连接用DNA区2”各自示意性地表示的序列的两个连接用双链DNA片段1和2后再使用的方法。根据该方法，可以抑制在非靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、在另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的非特异性生成，特异性地得到在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、在另一侧连接有连接用DNA区2的目标连接DNA片段。这里得到的连接DNA片段具有用“连接用DNA区1-区1-靶基因-区2-连接用DNA区2”示意性地表示的序列。本发明的第2方案中使用的“3’端突出双链基因片段”与本发明的第1方案中的相同。

本发明的第2方案中使用的连接用双链DNA片段是如上所述用“连接用DNA区1-区1”示意性地表示的连接用双链DNA片段1和具有“区2-连接用DNA区2”所示序列的两个连接用双链DNA片段2。以下，对用“连接用DNA区1-区1”示意性地表示的序列为“序列A-VP1-VT1”、“区2-连接用DNA区2”所示的序列为“VT2-VP2-序列B”的实施方式进行说明。

在该实施方式中，将3’端突出双链基因片段、“序列A-VP1-VT1(连接用双链DNA片段1)”和“VT2-VP2-序列B(连接用双链DNA片段2)”供给至少两个循环的热变性、再缔合和DNA合成反应，作为核酸合成产物，得到具有一个由“序列A-靶基因-序列B”组成的连接单元的连接DNA片段。

利用图6的图解来说明上述方法。需要说明的是，关于3’端突出双链基因片段和至少两次的热变性、再缔合和DNA合成反应，与上述本发明的第1方案的实施方式中说明的相同。

“序列A-VP1-VT1”依次具有任意的序列A、区VP1和区VT1，区VT1位于一方的末端，区VP1和区VT1分别由与3’端突出双链基因片段的序列P1相同的核苷酸序列和与序列T1相同的核苷酸序列组成。“VT2-VP2-序列B”依次具有区VT2、区VP2和任意的序列B，区VT2位于一方的末端，区VP2和区VT2分别由与3’端突出双链基因片段的序列P2相同的核苷酸序列和与序列T2相同的核苷酸序列组成。

<序列A-VP1-VT1>

“序列A-VP1-VT1”依次具有任意的序列A、区VP1和区VT1。其中，区VT1配置在连接用双链DNA片段的一方的末端。关于“序列A-VP1-VT1”中的序列A、区VP1和VT1，可以参照上述第1方案的实施方式的描述。“序列A-VP1-VT1”中，在序列A的上游、序列A与区VP1之间、区VP1与VT1之间，在参与热变性、再缔合和DNA合成反应时不影响与具有3’突出末端的双链DNA片段的退火的范围内，还可以具有间隔序列等序列。对“序列A-VP1-VT1”没有特别限定，例如，通过限制酶处理，从含有“序列A-VP1-VT1”作为插入片段的质粒中分离“序列A-VP1-VT1”，即可得到。另外，关于“序列A-VP1-VT1”，以含有基因连接用双链DNA片段A作为插入片段的质粒为模板，供给使用包含与序列A的上游序列相同的一部分序列的正向引物和包含与区VT1的一方的末端侧的序列互补的一部分序列的反向引物的PCR，也可得到。

<VT2-VP2-序列B>

“VT2-VP2-序列B”依次具有序列B、区VP2和区VT2。其中，区VT2被配置在“VT2-VP2-序列B”的一方的末端。关于“VT2-VP2-序列B”中的序列B、区VP2和VT2，可以参照上述第1方案的实施方式的描述。在“VT2-VP2-序列B”中，在序列B的上游、序列B与区VP2之间、区VP2与VT2之间，在供给热变性、再缔合和DNA合成反应时不妨碍与具有3’突出末端的双链DNA片段的退火的范围内，还可以具有间隔序列等序列。对“VT2-VP2-序列B”没有特别限定，例如通过限制酶处理，从含有“VT2-VP2-序列B”作为插入片段的质粒中分离“VT2-VP2-序列B”，即可得到。另外，关于“VT2-VP2-序列B”，以含有“VT2-VP2-序列B”作为插入片段的质粒为模板，通过供给使用包含与序列A的上游的序列相同的一部分序列的正向引物和包含与区VT2的一方的末端侧的序列互补的一部分序列的反向引物的PCR，也可得到。

(1)热变性、再缔合和DNA合成反应(1)

在第1循环的热变性、再缔合和DNA合成反应中，使用3’端突出双链基因片段、“序列A-VP1-VT1”和“VT2-VP2-序列B”进行热变性、再缔合和DNA合成反应。通过热变性后的退火，在3’端突出双链基因片段的反义链的序列P1+T1与“序列A-VP1-VT1”的一条链(有义链)的区VP1+VT1之间形成稳定的双链。同样，在3’端突出双链基因片段的有义链的序列P2+T2与“VT2-VP2-序列B”的一条链(反义链)的区VP2+VT2之间形成稳定的双链。通过之后的利用DNA聚合酶进行的DNA合成反应，合成以“序列A-VP1-VT1”的区VT1为起点进行核酸延伸的核酸延伸物(4)。另外，合成以“VT2-VP2-序列B”的区VT2为起点进行核酸延伸的核酸延伸物(3)。另一方面，如上所述，在3’端突出双链基因片段中，由于在序列P1和P2的3’端添加有至少一个核苷酸，所以并没有以序列P1和P2为起点进行核酸延伸。

(2)热变性、再缔合和DNA合成反应(2)

在第2循环的热变性、再缔合和DNA合成反应中，若通过热变性后的退火在上述核酸延伸物(3)和(4)之间形成双链，则通过接下来的DNA合成反应，以彼此为模板，从两方的3’末端起进行核酸延伸，以核酸合成产物的形式得到包含一个“序列A-靶基因-序列B”依次结合的连接单元的连接DNA片段。

(3)热变性、再缔合和DNA合成反应(第3循环以后)

图6的图解中虽然没有显示，但在第3循环以后也可以实施热变性、再缔合和DNA合成反应，通过实施第3循环以后的热变性、再缔合和DNA合成反应，以核酸合成产物的形式得到包含一个“序列A-靶基因-序列B”依次结合的连接单元的连接DNA片段。在本发明的第2方案中，如本发明的第1方案中那样，作为连接用双链DNA片段，不使用“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”那样的序列B和序列A连接的序列的片段，所以没有合成包含多数“序列A-靶基因-序列B”依次结合的连接单元的连接单元聚合物。

<由“序列A-靶基因-序列B”组成的连接单元>

在本发明的第2方案中，与本发明的第1方案一样，优选设有根据以核酸合成产物的形式得到的连接DNA片段制备由“序列A-靶基因-序列B”组成的连接单元的步骤。对制备这样的连接单元的步骤没有特别限定，例如可以通过使用特异性识别序列A和B的上游和下游的限制酶的方法、或选择性地扩增连接单元的方法等来实施。

将利用上述方法从连接DNA片段中分离的连接单元作为表达单元导入宿主细胞中，使靶基因所编码的蛋白在宿主细胞内选择性地表达时，在序列A中可以使用启动子序列，在序列B中可以使用poly A添加序列。制备表达单元时，在不妨碍宿主细胞内的靶基因的表达的范围内，在各序列之间、序列A的上游、序列B的下游也可以具有间隔序列等序列。

[本发明的第3方案]

本发明的第3方案为：使用上述本发明的第2方案中的分成两个的任一个连接用双链DNA片段、用“区1-连接用DNA区1”或“连接用DNA区2-区2”示意性地表示的序列的方法。在该方法中，抑制在非靶基因的一侧连接有连接用DNA区1或2的单侧连接DNA片段的非特异性生成，可以特异性地得到在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1或2的目标单侧连接DNA片段。本发明的第3方案中使用的“3’端突出双链基因片段”还可以是与本发明的第1方案中的片段相同的在靶基因序列的两方的末端侧具有可缔合区和突出末端的片段，但也可以是只在靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区、并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列、而且在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端的3’端突出双链基因片段。在本发明的第3方案中，由于只利用3’端突出双链基因片段所具有的一方的末端侧的可缔合区和突出末端，所以优选使用后者的3’端突出双链基因片段。

如上所述，本发明的第3方案中使用的连接用双链DNA片段是具有用“区1-连接用DNA区1”示意性地表示的序列或“连接用DNA区2-区2”所示序列的两个片段。以下，对用“区1-连接用DNA区1”示意性地表示的序列为“序列A-VP1-VT1”的实施方式进行说明。“连接用DNA区2-区2”所示的序列为“VT2-VP2-序列B”的实施方式可以和用“区1-连接用DNA区1”示意性地表示的序列为“序列A-VP1-VT1”的实施方式一样实施。

在本发明的第3方案的上述实施方式中，提供使具有序列A的连接用双链DNA片段(序列A-VP1-VT1)选择性地与靶基因片段的一方的末端侧连接的方法。该方法使用上述3’端突出双链基因片段(其中，3’突出末端只要位于其中一条链的上述序列P1的3’末端侧即可)和上述具有序列A的DNA片段，将上述3’端突出双链基因片段和上述具有序列A的连接用双链DNA片段的混合物在热变性和再缔合后供给核酸合成反应。通过该操作，得到在其中一条链的上述序列P1的3’端具有作为突出末端的一个核苷酸以上的序列、在该链的5’端具有来自序列P2的序列的单链DNA(双链DNA片段的反义链)与在另一条链的5’端侧具有来自上述序列A的序列以及在其3’端具有来自序列VT1的序列的单链DNA(连接用双链DNA的有义链)缔合的异源双链DNA产物。然后，以该异源双链DNA产物为模板，进行使用具有双链基因片段的反义链的5’末端侧的序列的反向引物和具有连接用双链DNA片段的有义链的5’末端侧的序列的正向引物的聚合酶链反应。由此，得到连接有序列A和靶基因的序列的双链DNA片段(单侧连接DNA片段)(参照图7的图解)。

关于热变性、再缔合和DNA合成反应，与在上述本发明的第1方案的实施方式中说明的相同。“序列A-VP1-VT1”与在上述本发明的第2方案的实施方式中说明的相同。

“连接用DNA区2-区2”所示的序列为“VT2-VP2-序列B”的实施方式可以和用“区1-连接用DNA区1”示意性地表示的序列为“序列A-VP1-VT1”的实施方式一样实施。另外，“VT2-VP2-序列B”与上述本发明的第2方案的实施方式中说明的一样。

在本发明的连接DNA片段的制造方法中，如上所述，上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的序列，以及上述连接用双链DNA片段或具有上述序列A的连接用双链DNA片段中的上述区VP1和区VT1可以具有来自或不是来自抗体基因或T细胞受体基因的序列。并且，上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的序列，以及上述连接用双链DNA片段或具有上述序列B的连接用双链DNA片段中的上述区VP2和区VT2可以是来自或不是来自抗体基因或T细胞受体基因的序列。本发明中还包含：使用利用这样的靶基因制造的连接DNA片段来制造抗体或T细胞受体的方法。

使用靶基因为抗体基因或T细胞受体基因的连接DNA片段来制造抗体或T细胞受体的方法，可以通过常规方法、例如将包含靶基因的连接DNA片段导入宿主细胞中，培养该宿主细胞使产生抗体等来实施。

如上所述，本发明包括：上述本发明的第1方案～第3方案中使用的3’端突出双链基因片段、连接用双链DNA片段及它们的组合体、以及包含它们的试剂盒。本发明的第1方案～第3方案中使用的3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段如上所述。并且，组合体包括：第1方案中使用的3’端突出双链基因片段与连接用双链DNA片段的组合体、第2方案中使用的3’端突出双链基因片段与连接用双链DNA片段的组合体、以及第3方案中使用的3’端突出双链基因片段与连接用双链DNA片段的组合体。

在第1方案中使用的3’端突出双链基因片段与连接用双链DNA片段的组合体中，从良好地制造在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的角度考虑，优选：

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的另一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

在第2方案中使用的3’端突出双链基因片段与连接用双链DNA片段的组合体中，从良好地制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、在另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的角度考虑，优选：

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段1的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段1的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段2的末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段2的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

在第3方案中使用的3’端突出双链基因片段与连接用双链DNA片段的组合体中，从良好地制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的角度考虑，优选：

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

本发明的试剂盒包含上述本发明的第1方案中使用的3’端突出双链基因片段、连接用双链DNA片段或它们的组合体；或者包含上述本发明的第2方案中使用的3’端突出双链基因片段、连接用双链DNA片段或它们的组合体；或者包含上述本发明的第3方案中使用的3’端突出双链基因片段、连接用双链DNA片段或它们的组合体。本发明的试剂盒中，除上述外，还可以包含为了使用3’端突出双链基因片段以及连接用双链DNA片段进行热变性、再缔合和DNA合成反应以得到连接DNA片段而使用的缓冲液、DNA聚合酶等DNA合成用酶或含酶的缓冲液、以及试剂盒的使用说明书。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受限于这些实施例。

实施例

[例1]

1.未纯化靶基因片段向表达单元的特异性变换

靶基因片段1(参照图10)为具有人免疫球蛋白γ链的可变区和一部分恒定区的683bp的DNA片段，在其两端具有用于PCR扩增的引物A：5’-CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA-3’以及引物B：5’-AGCCGGGAAGGTGTGCACGCCGCTG-3’的序列。作为内部序列，在引物A的内侧具有poly dC序列、在引物B序列的内侧具有来自免疫球蛋白γ链恒定区的序列。图10中以箭头显示用于扩增的引物A、B的位置。

非靶基因片段2(参照图11)为628bp的来自GPF基因的DNA片段，在其两端具有用于PCR扩增的引物A序列和引物B序列。在两引物序列的内侧不存在内部序列，而存在来自GFP基因的序列。

以分别插入有靶基因片段1和非靶基因片段2的质粒pUC 119为模板，使用引物A和B进行PCR反应，分别扩增靶基因片段1和非靶基因片段2。在PCR反应中，向50μl的反应系统中加入2ng模板质粒DNA、10pmol各引物、10nmol dNTP，使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶，进行30个循环的94℃30秒-68℃40秒的反应。

2.PCR产物的3’端多核苷酸添加反应

向管中分别注入1μl PCR后的反应液，向其中加入10单位的末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)，在37℃下反应30分钟，之后通过在94℃下加热5分钟使酶反应停止。通过该反应，在DNA片段的两3’端添加多核苷酸。作为阴性对照，对靶基因片段1和非靶基因片段2分别同样实施未加入末端脱氧核苷酸转移酶的反应。

3.人γ链基因连接用双链DNA片段的制作

pMiniCMV-hIgG为具有CMV启动子、多克隆位点、poly dC/dG序列、pUC119复制起点、氨苄青霉素耐性基因、人免疫球蛋白γ链恒定区、SV40 poly A添加信号的全长3533bp的质粒。

将pMiniCMV-hIgG用EcoRV切断，之后以其为模板，通过使用引物C：5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGATCCCGG-3’和引物D：5’-CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG-3’的PCR法，制备人γ链基因连接用双链DNA片段。在PCR反应中，使用タカラバイオ的PrimeSTAR DNA聚合酶，通过进行30次94℃40秒、60℃40秒、72℃5分钟的循环来进行扩增反应。所扩增的DNA片段通过核酸纯化柱(Spin column)法进行纯化，并调整成10ng/μl的浓度。关于人γ链基因连接用双链DNA片段，在其一端具有作为只与通过5’-RACE PCR法扩增的人免疫球蛋白γ链形成特异性的互补链的区的、来自人免疫球蛋白γ链恒定区的内部序列，在其下游具有与用于基因扩增的引物B序列形成互补链的序列(参照图12)。

在另一端存在作为只与来自通过末端脱氧核苷酸转移酶反应添加有poly dC序列的cDNA的5’-RACE扩增产物特异性地形成互补链的区的poly dC/dG序列，在其上游存在与用于5’-RACE PCR法的引物A序列形成互补链的序列(参照图13)。靶基因片段1能够与图12中的网纹部全体形成互补链，而非靶基因片段2只能够与图12中的网纹部中引物B以及引物A互补链形成序列形成互补链。

4.人γ链基因表达单元的扩增

向上述制备的添加有3’端多核苷酸的DNA片段1和2中加入10ng人γ链基因连接用双链DNA片段、10pmol引物、10nmol dNTP，以25μl包含タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶的反应液进行5个循环的94℃40秒、70℃4分钟的反应，接着进行30个循环的94℃40秒、60℃40秒、72℃4分钟的反应。所使用的引物中，引物E：5’-AGAGAAGATCTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG-3’在其5’端具有错配序列，在人γ链基因连接用双链DNA片段的CMV启动子上游附近退火。引物F：5’-AAGGAAGATCTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3’在其5’端具有错配序列，在人γ链基因连接用双链DNA片段的SV40poly A添加序列下游附近退火。

同样，向作为阴性对照而制备的未进行3’端多核苷酸添加的靶基因片段1和非靶基因片段2中加入10ng人γ链基因连接用DNA片段、10pmol引物E和F、10nmol dNTP，使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶，以25μl的反应液进行5个循环的94℃40秒、70℃4分钟的反应，接着进行30个循环的94℃40秒、60℃40秒、72℃4分钟的反应。从PCR反应液中分别取出2μl，通过琼脂糖凝胶电泳法确认表达单元的扩增(参照图1)。

其结果，添加有3’端多核苷酸的靶基因片段1特异性地转换成表达单元，确认到约2.5kb的PCR产物的扩增。相对于此，添加有3’端多核苷酸的非靶基因片段2没有转换成表达单元。另外，虽然未进行3’端多核苷酸添加反应的靶基因片段1转换成了表达单元，但非靶基因片段2也与人γ链基因连接用双链DNA片段连接。由以上结果判明：通过使用对于靶基因片段具有内部序列的基因连接用双链DNA片段和进行了3’端多核苷酸添加反应的基因片段，可以将具有目标人免疫球蛋白可变区和恒定区的一部分的DNA片段不经纯化即可转换成表达单元。

[例2]

使用5’端错配引物进行的有效率的连接单元(表达单元)的扩增

向[例1]之2中制备的添加有3’端多核苷酸的靶基因DNA片段1中加入3中制备的人γ链基因连接用DNA片段，进行5个循环的94℃40秒、70℃4分钟的反应，合成连接双链DNA聚合物。向其中加入引物E和F、或G和H，进行30个循环的94℃40秒、60℃40秒、72℃4分钟的反应，尝试着进行表达单元的扩增。引物G：5’-TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG-3’和引物H：5’-TGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3’与作为模板的人γ链基因连接用双链DNA片段具有100％的同源性。

PCR的结果：使用引物G和H的情形下，除确认到目标表达单元的扩增外，还确认到连接单元聚合物的扩增(参照图2)。相对于此，使用5’端具有错配序列的引物E和F的情形下，确认到有效率的表达单元的扩增。

[例3]

使用由人末梢血浆细胞扩增的未纯化的人γ、κ链免疫球蛋白基因片段、以及人γ和κ链基因连接用DNA片段，制作人免疫球蛋白表达单元，并将其导入培养细胞中制作人抗体。

1.利用5’-RACE PCR法进行的人免疫球蛋白γ和κ链可变区基因片段的扩增

各分离1个由人的末梢血调整的浆细胞到两个管中，向其中加入3μl添加有3μg的结合有寡dT25的磁珠(ダイナピ一ズ)的细胞溶解液(100mM的TrisHCl(pH7.5)，500mM的LiCl，1％十二烷基硫酸锂(LiDS)，5mM的二硫苏糖醇)，使细胞内的mRNA与磁珠结合。接下来，用3μl的mRNA清洗用溶液A(10mM的TrisHCl(pH7.5)，0.15M的LiCl，0.1％的LiDS)、再用3μl的mRNA清洗用溶液B(75mM的KCl，3mM的MgCl₂，0.1％的TritonX，0.5mM的dNTP，5mM的DTT，2单位的RNase抑制剂)清洗磁珠1次，之后进行cDNA合成。向清洗后的磁珠中加入3μl的cDNA合成用溶液(50mM的Tris HCl(pH8.3)，75mM的KCl，3mM的MgCl₂，0.1％的TritonX-100，0.5mM的dNTP，5mM的DTT，2单位RNase抑制剂，10单位SuperScriptlll逆转录酶(Invitrogen))，在50℃下反应1小时。接下来，用3μl的3’加尾清洗溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)，0.5mM的dGTP，0.1％的TritonX-100，4mM的氯化镁)清洗磁珠，重新加入3μl的3’加尾反应溶液(50mM的磷酸钾(pH7.0)，0.5mM的dGTP，0.1％的TritonX-100，4mM的氯化镁，10U末端脱氧核苷酸转移酶)，在37℃下反应30分钟。

用3μl的TE溶液(10mM的TrisHCl(pH7.5)，1mM的EDTA，0.1％的TritonX-100)清洗磁珠，之后利用5’-RACE PCR法进行人免疫球蛋白γ链和κ链基因的扩增。在第1次PCR反应中，向磁珠中加入25μl的PCR反应溶液(含有各10pmol的引物I、J和K，10nmol的dNTP，1U的タカラバイオPrimeSTAR耐热性DNA聚合酶)，进行35个循环的94℃30秒-68℃40秒的反应。引物I的序列为：5’-CGGTACCGCGG GCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’，通过TdT与添加在cDNA的3’端的poly G退火。引物J的序列为：5’-ACGCTGCTGAGGGA GTAGAGTCCTGAG-3’，来自人免疫球蛋白γ链基因的恒定区。引物K的序列为：5’-CTTTGGCCTCTCTGGGATAGAAGTT-3’，来自人免疫球蛋白κ链基因的恒定区。

反应后，向PCR溶液中加入225μl水，以1μl稀释至10倍的溶液为模板，使用引物A和引物B，在与第1次PCR相同的条件下进行人免疫球蛋白γ链基因的可变区的扩增反应。同样，使用引物A和引物L：5’-ACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTCAA CTGC-3’，进行人免疫球蛋白κ链基因的可变区的扩增反应。

其结果确认到：由实验中使用的两个形质细胞(细胞1和细胞2)分别扩增了约800bp的γ链的可变区和一部分恒定区、以及约600bp的κ链的可变区和一部分恒定区(参照图15)。

2.PCR产物的3’端多核苷酸添加反应

向1μl的1.中制备的各PCR产物中加入10单位末端脱氧核苷酸转移酶，在37℃下反应30分钟，之后通过在94℃下加热5分钟，使酶反应停止。

3.人γ链基因和κ链基因连接用双链DNA片段的制备

人γ链基因连接用双链DNA片段使用例1中制备的双链DNA片段。

pMiniCMV-hIgK是具有CMV启动子、多克隆位点、poly dC/dG序列、pUC119复制起点、氨苄青霉素耐性基因、人免疫球蛋白κ链恒定区、SV40poly A添加信号的全长2976bp的质粒。

将pMiniCMV-hIgK用EcoRV切断，之后以其为模板，通过使用引物C和引物M：5’-CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG-3’的PCR法，制备人κ链基因连接用DNA片段(参照图16)。在PCR反应中，通过使用タカラバイオ的PrimeSTAR DNA聚合酶进行30次94℃40秒、60℃40秒、72℃5分钟的循环，进行扩增反应。所扩增的DNA片段通过核酸纯化柱法进行纯化，并调整成10ng/μl的浓度。

4.人γ和κ链表达单元的扩增

向上述制备的3’端多核苷酸添加人γ链基因溶液中加入10ng 3.中制备的人γ链基因连接用双链DNA片段、10pmol引物、10nmoldNTP，使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶，以25μl的反应液进行5个循环的94℃40秒、70℃4分钟的反应，接着进行30个循环的94℃40秒、60℃40秒、72℃4分钟的反应。使用的引物为引物E和引物F。

同样，向上述制备的3’端多核苷酸添加人κ链基因溶液中加入10ng 3.中制备的人κ链基因连接用双链DNA片段、10pmol引物、10nmol dNTP，使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶，以25μl的反应液进行5个循环的94℃40秒、70℃4分钟的反应，接着进行30个循环的94℃40秒、60℃40秒、72℃4分钟的反应。使用的引物为引物E和引物F。

所扩增的DNA片段通过乙醇沉淀来纯化，之后用25μl的PBS溶解。从中各取出1μl，利用琼脂糖凝胶电泳法确认到由细胞1和细胞2得到的κ和γ链免疫球蛋白基因片段向表达单元的转换(参照图17)。

5.通过向培养细胞中导入人免疫球蛋白表达单元来进行抗GFP抗体的表达

向各5μl(约0.25μg)的4.中制备的人κ和γ链表达单元中加入90μl的DMEM培养基以及2μl的FuGENE HD转染试剂，在室温下放置20分钟，之后向在24孔培养皿中培养的293FT细胞中进行基因导入。回收培养3天后的培养上清，利用夹层ELISA法测定人抗体的产生(参照图18)。在ELISA中，将1μg绵羊抗人抗体固定在96孔板底面上，向其中加入100μl细胞上清，在室温下进行3小时的抗原抗体反应。使用结合有辣根过氧化物酶的绵羊抗人抗体检测与板结合的重组人抗体。其结果，在导入有来自细胞1的人γ和人κ链基因表达单元(柱1)、以及来自细胞2的人γ和人κ链基因表达单元(柱2)的293FT细胞的培养上清中检测到重组人抗体。另一方面，在作为阴性对照的未进行基因导入的细胞上清中(柱3)没有检测到重组人抗体。

实施例中使用的各DNA片段与序列表SEQ ID NO 1的关系如下。序列表的SEQ ID NO 1：靶基因片段1

CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCGACATAACAACCAGAATC

CTCCTCTAAAGAAGCACCTGGGAGCACAGCTCATCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGG

TGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTG

GGTCCTCGGTGAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATACTTTCACCTGGGTGC

GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCCAATGTCGGTATAGCAAACTACG

CACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGCTTATCGCGGACAAATTCACGAATTCAACGTACATGGAGCTGA

GCAGCCTGAGATCTGATGAGACGGCCGTTTATTTTTGTGCCGGAGACCCCTCGGGCCACTCACATGACT

ACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCAGCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGG

CGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG

AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT

序列表的SEQ ID NO 2：引物A

序列表的SEQ ID NO 3：引物B

序列表的SEQ ID NO 4：非靶基因片段2

CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGC

GAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTC

AGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC

GGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGC

TACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGC

ACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG

GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAG

TACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTC

AAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCGGCGTGCACACCTT

CCCGGCT

序列表的SEQ ID NO 5：pMiniCMV-hIgG

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATA

ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTA

TGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATG

GCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT

AGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTC

ACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGA

CTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGT

CTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTC

AAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCGATATCTAAATACA

TTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

TATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGC

TCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGA

ACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC

TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCG

CATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCAT

GACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC

AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA

TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAAT

GGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGA

CTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGC

TGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC

CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGC

TGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGAT

TGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAA

AATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTG

AGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTG

TTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA

TACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCT

CGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTC

AAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT

GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGA

AGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCC

AGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT

GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGC

CGATATCACGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC

AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTG

CAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC

TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA

ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA

AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG

GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA

TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA

AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA

CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA

TGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA

CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGA

GGGTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCGGCC

GCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACA

CCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAA

TGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTG

TGGTTTGTCCAAAC

序列表的SEQ ID NO 6：引物C

序列表的SEQ ID NO 7：引物D

序列表的SEQ ID NO 8：人γ链基因连接用双链DNA片段

CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT

ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGA

ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAT

GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG

ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG

AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC

AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG

AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG

GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCA

GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC

CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC

TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGGTCTGC

ACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCGGCCAAGTCGAC

TTGGCCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCC

CACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTT

ATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTA

GTTGTGGTTTGTCCAAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATAT

GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT

GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGA

GTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA

CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCG

TGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG

GCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG

GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCG

GACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCC

CCC

序列表的SEQ ID NO 9：引物E

序列表的SEQ ID NO 10：引物F

序列表的SEQ ID NO 11：引物G

序列表的SEQ ID NO 12：引物H

序列表的SEQ ID NO 13：引物I

序列表的SEQ ID NO 14：引物J

序列表的SEQ ID NO 15：引物K

序列表的SEQ ID NO 16：引物L

序列表的SEQ ID NO 17：引物M

序列表的SEQ ID NO 18：pMiniCMV-hIgK

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATA

ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTA

TGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC

CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATG

GCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT

AGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTC

ACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGA

CTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGT

CTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTC

AAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCGATATCTAAATACA

TTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

TATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGC

TCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGA

ACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC

TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCG

CATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCAT

GACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC

AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA

TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAAT

GGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGA

CTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGC

TGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC

CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGC

TGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGAT

TGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAA

AATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTG

AGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTG

TTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAA

TACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCT

CGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTC

AAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT

GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGA

AGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCC

AGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT

GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGC

CGATATCACGTGCGCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC

CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT

AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG

CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCG

CCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCGGCCAAGTCGACTTGGCCGAC

TCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCC

CCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTT

ACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTT

TGTCCAAAC

序列表的SEQ ID NO 19：人κ链基因连接用双链DNA片段

CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT

CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG

TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA

CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAG

CTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCGGCCAAGTCGACTTGGCCGACTCTAGATCATAATC

AGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAA

CATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAAT

AGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTAGTT

ATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTC

CCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACT

TGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG

CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCA

TCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGG

GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTC

CAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATA

TAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCT

TCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCC

Claims (44)

1.连接DNA片段的制造方法，是制造在靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法，该方法包括：

(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在中央部分包含靶基因序列，在两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)准备连接用双链DNA片段，其中央部分包含连接用DNA区、两末端侧分别具有可缔合区；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的另一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)通过使用上述3’端突出双链基因片段和连接用双链DNA片段，进行至少两次热变性、再缔合和DNA合成反应，得到上述连接DNA片段。

2.权利要求1所述的制造方法，其中，以上述的一方可缔合区为“区1”、以另一方可缔合区为“区2”时，上述连接DNA片段是具有至少一个用“区2-连接用DNA区-区1-靶基因-区2-连接用DNA区-区1”示意性地表示的序列的DNA片段。

3.权利要求1所述的制造方法，其中，

连接用DNA区包含序列A和序列B作为两个连接用DNA区；

上述3’端突出双链基因片段的可缔合区，其中一方自末端侧起具有序列P1和T1，另一方自末端侧起具有序列P2和T2，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列；

上述连接用双链DNA片段的可缔合区，其中一方自末端侧起具有序列VP1和VT1，另一方自末端侧起具有序列VP2和VT2，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列，序列VP2和VT2、与序列P2和T2分别具有相同的核苷酸序列。

4.权利要求3所述的制造方法，其中，

上述3’端突出双链基因片段用“P1-T1-靶基因-T2-P2”表示；

上述连接用双链DNA片段用“VT2-VP2-序列B-序列A-VP1-VT1”表示；

上述连接DNA片段是具有至少一个“VT2-VP2(T2-P2)-序列B-序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因-VT2-VP2(T2-P2)-序列B-序列A-VP1-VT1(P1-T1)”的DNA片段，其中，VT2-VP2(T2-P2)是指与T2-P2相同的VT2-VP2，而VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1相同的VT1-VP1。

5.权利要求3或4所述的制造方法，其中，位于序列P2的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列B的VP2相邻的序列不同的序列，而位于序列P1的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列A的VP1相邻的序列不同的序列。

6.权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，上述突出末端是在3’端包含双脱氧核苷酸的序列。

7.DNA片段的制造方法，其中，

以按照权利要求1～6中任一项所述的方法制造的连接DNA片段为模板，

以扩增连接DNA片段中所含的至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的方式，

使用在连接DNA片段中所含的不同的连接用DNA区发挥作用的正向引物和反向引物进行PCR，

制造包含至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的DNA片段。

8.DNA片段的制造方法，该方法包括：

以按照权利要求3所述的方法制造的连接DNA片段为模板，

使用3’端朝向靶基因包含序列A的一部分核苷酸序列的正向引物和3’端朝向靶基因包含序列B的一部分核苷酸序列的反向引物进行PCR，得到连接有序列A、靶基因的序列和序列B的DNA片段。

9.连接DNA片段的制造方法，是制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的方法，该方法包括：

(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在中央部分包含靶基因序列，在两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列是靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)准备包含连接用DNA区1、且末端侧具有可缔合区的连接用双链DNA片段1，以及包含连接用DNA区2、且末端侧具有可缔合区的连接用双链DNA片段2；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段1的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段1的可缔合区是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段2的末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段2的可缔合区是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)通过使用上述3’端突出双链基因片段以及连接用双链DNA片段1和2，进行至少两次热变性、再缔合和DNA合成反应，得到上述连接DNA片段。

10.权利要求9所述的制造方法，其中，

连接用DNA区1包含序列A，连接用DNA区2包含序列B；

上述3’端突出双链基因片段的可缔合区，其中一方自末端侧起具有序列P1和T1，另一方自末端侧起具有序列P2和T2，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列；

上述连接用双链DNA片段1的可缔合区自末端侧起具有序列VT1和VP1，连接用双链DNA片段2的可缔合区自末端侧起具有序列VT2和VP2，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列，而序列VP2和VT2、与序列P2和T2分别具有相同的核苷酸序列。

11.权利要求10所述的制造方法，其中，

上述3’端突出双链基因片段用“P1-T1-靶基因-T2-P2”表示；

上述连接用双链DNA片段1用“序列A-VP1-VT1”表示，上述连接用双链DNA片段2用“VT2-VP2-序列B”表示；

上述连接DNA片段是具有至少一个“序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因-VT2-VP2(T2-P2)-序列B”的DNA片段，其中，VT2-VP2(T2-P2)是指与T2-P2相同的VT2-VP2，VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1相同的VT1-VP1。

12.权利要求10或11所述的制造方法，其中，位于序列P2的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列B的VP2相邻的序列不同的序列，而位于序列P1的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列A的VP1相邻的序列不同的序列。

13.权利要求9～11中任一项所述的制造方法，其中，上述突出末端是在3’端包含双脱氧核苷酸的序列。

14.DNA片段的制造方法，其中，

以按照权利要求9～13中任一项所述的方法制造的连接DNA片段为模板，

以扩增连接DNA片段所含的至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的方式，

使用在连接DNA片段所含的不同的连接用DNA区中发挥作用的正向引物和反向引物进行PCR，

制造包含至少一个的至少一部分连接用DNA区和靶基因的全部序列的DNA片段。

15.DNA片段的制造方法，该方法包括：

以按照权利要求10所述的方法制造的连接DNA片段为模板，

使用3’端朝向靶基因包含序列A的一部分核苷酸序列的正向引物和3’端朝向靶基因包含序列B的一部分核苷酸序列的反向引物进行PCR，得到连接有序列A、靶基因的序列和序列B的DNA片段。

16.单侧连接DNA片段的制造方法，是制造在靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的方法，该方法包括：

(1)由包含靶基因序列的双链基因片段准备3’端突出双链基因片段，所述3’端突出双链基因片段在上述靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区，并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)准备包含连接用DNA区、且末端侧具有可缔合区的连接用双链DNA片段；

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(4)使用上述3’端突出双链基因片段以及连接用双链DNA片段，进行一次热变性、再缔合和DNA合成反应，得到异源双链DNA产物，然后通过以该异源双链DNA产物为模板进行聚合酶链反应，得到上述单侧连接DNA片段。

17.权利要求16所述的制造方法，其中，

连接用DNA区包含序列A；

上述3’端突出双链基因片段的可缔合区自末端侧起具有序列P1和T1，序列T1和序列T2中的至少一方具有靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列；

上述连接用双链DNA片段的可缔合区自末端侧起具有序列VT1和VP1，序列VP1和VT1、与序列P1和T1分别具有相同的核苷酸序列；

以上述异源双链DNA产物为模板的聚合酶链反应，使用3’端朝向上述靶基因的突出末端侧包含上述异源双链DNA产物的一部分靶基因的引物和3’端朝向上述靶基因侧包含上述异源双链DNA产物的一部分序列A的引物。

18.权利要求17所述的制造方法，其中，

上述3’端突出双链基因片段用“P1-T1-靶基因”表示；

上述连接用双链DNA片段用“序列A-VP1-VT1”表示；

上述单侧连接DNA片段是具有至少一个“序列A-VP1-VT1(P1-T1)-靶基因”的DNA片段，其中，VP1-VT1(P1-T1)是指与T1-P1相同的VT1-VP1。

19.权利要求17或18所述的制造方法，其中，位于序列P1的3’端的突出末端的在DNA合成反应中不具有链延伸功能的序列是和与上述序列A的VP1相邻的序列不同的序列。

20.权利要求16～18中任一项所述的制造方法，其中，上述突出末端为3’端包含双脱氧核苷酸的序列。

21.权利要求3、4、10或11所述的制造方法，其中进一步包括：使脱氧核苷酸末端转移酶与包含靶基因的序列的双链DNA片段和多脱氧核苷酸作用，得到包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段，

其中，上述包含靶基因的序列的双链DNA片段在各末端具有序列P1和序列P2，在上述序列P1的内侧的一部分具有序列T1，在上述序列P2的内侧的一部分具有序列T2，并且上述序列T1和T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。

22.权利要求17或18所述的制造方法，其中进一步包括：使脱氧核苷酸末端转移酶与包含靶基因的序列的双链DNA片段和多脱氧核苷酸作用，得到包含靶基因的序列的3’端突出双链基因片段，

其中，上述包含靶基因的序列的双链DNA片段在一侧末端具有序列P1，在上述序列P1的内侧的一部分具有序列T1，并且上述序列T1具有靶基因所固有的核苷酸序列。

23.权利要求3、4、10或11所述的制造方法，其中，上述序列T1和序列T2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。

24.权利要求3、4、10或11所述的制造方法，其中，上述序列P1和序列P2的一方或两方具有靶基因所固有的核苷酸序列。

25.权利要求3、4、10、11、17或18所述的制造方法，其中，上述序列P1和P2独立地为10个碱基以上。

26.权利要求1～25中任一项所述的制造方法，其中，

上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的序列；以及

上述连接用双链DNA片段或具有上述序列A的连接用双链DNA片段中的上述区VP1和区VT1具有来自或不是来自抗体基因或T细胞受体基因的序列。

27.权利要求26所述的制造方法，其中，

上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，上述3’端突出双链基因片段包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的序列；以及

上述连接用双链DNA片段或具有上述序列B的连接用双链DNA片段中的上述区VP2和区VT2为来自或不是来自抗体基因或T细胞受体基因的序列。

28.使用按照权利要求26或27所述的方法制造的连接DNA片段来制造抗体或T细胞受体的方法。

29.3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端。

30.连接用双链DNA片段，其中央部分包含连接用DNA区，两末端侧分别具有可缔合区。

31.组合体，是下述(1)和(2)的组合体：

(1)3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)连接用双链DNA片段，其中央部分包含连接用DNA区，两末端侧分别具有可缔合区；

该组合体在制造靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法中使用。

32.权利要求31所述的组合体，其中，

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的另一方末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的另一方可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

33.连接用双链DNA片段1，其中包含连接用DNA区1、且末端侧具有可缔合区；或者连接用双链DNA片段2，其中包含连接用DNA区2、且末端侧具有可缔合区。

34.组合体，是下述(1)和(2)的组合体：

(1)3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，中央部分包含靶基因序列，两末端侧分别具有可缔合区，上述可缔合的两个区具有彼此不缔合的核苷酸序列，并且其中一方或两方的区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在两方的可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)连接用双链DNA片段1，其中包含连接用DNA区1、且末端侧具有可缔合区；或连接用双链DNA片段2，其中包含连接用DNA区2、且末端侧具有可缔合区；

该组合体在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的方法中使用。

35.权利要求34所述的组合体，其中，

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段1的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段1的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能；

(3-3)上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段2的末端的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段2的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-4)起自上述3’端突出双链基因片段的另一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

36.3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，在上述靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区，并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端。

37.连接用双链DNA片段，其中包含连接用DNA区、且末端侧具有可缔合区。

38.组合体，是下述(1)和(2)的组合体：

(1)3’端突出双链基因片段，其中，从包含靶基因序列的双链基因片段起，在上述靶基因序列的一方的末端侧具有可缔合区，并且上述区的至少一部分核苷酸序列为靶基因序列中所含的固有的核苷酸序列，在上述可缔合区的3’端具有一个核苷酸以上的突出末端；

(2)连接用双链DNA片段，其中包含连接用DNA区、且末端侧具有可缔合区；

该组合体在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的方法中使用。

39.权利要求38所述的组合体，其中，

(3-1)上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区由与上述连接用双链DNA片段的可缔合区相同的核苷酸序列组成，但添加有3’突出端的末端侧的序列在连接用双链DNA片段的可缔合区中是与连接用DNA区结合的一侧；

(3-2)起自上述3’端突出双链基因片段的一方可缔合区的突出末端在DNA合成反应中不具有链延伸功能。

40.权利要求30～35、37～39中任一项所述的连接用双链DNA片段或组合体，其中，上述连接用DNA区为选自内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列、或者在菌或动物细胞内可以抑制各种基因的表达的启动子、增强子序列、poly A添加序列等的至少一种序列。

41.试剂盒，其中包含权利要求29所述的3’端突出双链基因片段、权利要求30所述的连接用双链DNA片段、或者权利要求31或32所述的组合体，该试剂盒在制造靶基因的两侧连接有连接用DNA区的连接DNA片段的方法中使用。

42.试剂盒，其中包含权利要求29所述的3’端突出双链基因片段、权利要求33所述的连接用双链DNA片段、或者权利要求34或35所述的组合体，该试剂盒在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区1、另一侧连接有连接用DNA区2的连接DNA片段的方法中使用。

43.试剂盒，其中包含权利要求36所述的3’端突出双链基因片段、权利要求37所述的连接用双链DNA片段、或者权利要求38或39所述的组合体，该试剂盒在制造靶基因的一侧连接有连接用DNA区的单侧连接DNA片段的方法中使用。

44.权利要求41～43中任一项所述的试剂盒，其中，上述连接用DNA区为选自内含子、外显子、荧光蛋白基因、His标签等的各种标签序列、或者在菌或动物细胞内可以控制各种基因的表达的启动子、增强子序列、poly A添加序列等的至少一种序列。

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