CN116515794A - 一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶及其应用 - Google Patents

一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶及其应用，涉及体外检测生物技术领域。本发明提供的基于蛋白定向进化的快速热启动酶，在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代：第59位、第339位、第459位、第507位、第515位、第626位、第638位、第688位、第707位、第708位、第743位、第749位。实验证明，本发明提供的基于蛋白定向进化的快速热启动酶在qPCR条件下扩增速度不低于1kb/3s，延伸5s的扩增性能不低于野生型延伸30s，解决了Taq酶在扩增时延伸时间长的问题，在不影响qPCRCt的情况下减少整体扩增时间；比市场上其他Taq酶能更快的完成诊断时间。

Description

一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶及其应用
技术领域
本发明涉及体外检测生物技术领域，尤其涉及一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶及其应用。
背景技术
DNA聚合酶在体内的主要作用是用于每个细胞周期复制基因组，以保存遗传信息，对所有物种的生长发育都起着至关重要的作用。但早期的DNA聚合酶不耐受高温，导致PCR(Polymerase Chain Reaction)需要每一步都补充酶，很大程度的限制了PCR反应的速率。直到科学家从水生栖热菌Thermus aquaticus中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶Taq，这极大的促进了PCR技术的推广应用。除了常规的科研应用，PCR还广泛的应用于疾病分子诊断、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物监测等众多领域。
由于Taq具有独特的5’-3’外切活性，没有3’-5’外切活性，结合Taqman等探针技术，具有良好的检测特异性，因此Taq酶是目前在分子诊断领域应用最广泛的DNA聚合酶。然而，Taq酶的扩增速度相对较慢，常规qPCR中延伸时间通常需要30s，普通PCR延伸时间通常为1min，使得最终检测时间通常需要1-2h，导致检测通量相对较低，速度远低于目前快速发展的RPA和环状扩增等恒温扩增技术。
因此，开发一款能快速扩增的Taq酶，若能够将检测时间能缩短到1h以内，甚至0.5h，将会大幅降低检测时间，增加检测通量，提高检测效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的Taq酶扩增速度较慢，效率较低，限制了其发展速度。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶，所述的快速热启动酶在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代：第59位、第339位、第459位、第507位、第515位、第626位、第638位、第688位、第707位、第708位、第743位、第749位，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有96％以上同一性，优选地，具有97％以上同一性，更优选地，具有99％以上同一性，并具有Taq DNA聚合酶活性。
进一步地，所述的快速热启动酶在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的任意两个氨基酸位置上的氨基酸取代：第59位、第339位、第459位、第507位、第515位、第626位、第638位、第688位、第707位、第708位、第743位、第749位，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有98％以上同一性，更优选地，具有99％以上同一性，并具有Taq DNA聚合酶活性。
进一步地，将上述各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：W59G、Y339R、M459L、P507K、R515S、K626E、F638I、D688E、G707I、Q708E、I749F、H743A。
进一步地，所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶，氨基酸序列如SEQ ID NO：2-11任一项所示，或与所示序列具有95％以上同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列，进一步优选，具有98％以上同一性，更优选地，具有99％以上同一性。
第二方面，本发明提供编码所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶的核苷酸序列。
进一步地，编码所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶的核苷酸序列，如SEQID NO.12-21任一项所示。需要说明的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码快速热启动酶的核苷酸序列也可以是SEQ ID NO.12-21任一项的同义序列。
第三方面，本发明提供一种重组表达载体，所述载体包含第二方面所述的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶、或包含第二方面所述的核苷酸序列或第三方面所述的重组表达载体。
第五方面，本发明提供一种RCR试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶。
第六方面，本发明提供一种筛选第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶的方法，包括如下步骤：
S1、对模板野生型TaqWT酶质粒进行随机突变与组合突变，得到突变的基因文库；
S2、将S1得到的基因文库构建到高通量筛选的载体上，利用数字油滴PCR法从扩增速度1kb/30s逐步降低到1kb/3s进行高通量筛选；
S3、将最后一轮高通量筛选得到的转化子进行表达纯化；
S4、将纯化得到的突变体用酶保存液稀释至不同浓度，通过比酶活法确定酶的最佳稀释度；抗体修饰后再用不同的引物探针鉴定突变体快速热启动的性能，记录不同模板浓度扩增下的Ct值；
S5、筛选出权利要求1-3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶。
在一具体实施例中，步骤S1的随机突变主要通过易错PCR体系进行。通过改变传统PCR体系的dNTPs，Mg2+浓度，Mn2+浓度，PH值或用低保真的Taq酶增加PCR的错配率从而得到序列多样性文库。活性中心饱和突变是在软件建模分析出的酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，如Arg457，在蛋白的活性位点上设计间并引物(gttgcctacctgnnkgctatgagcc)，多点饱和突变后从而得到活性位点附近的突变文库。
具体地，本发明的步骤S2的操作具体如下：
将突变的基因文库通过双酶切法分别在30℃，37℃条件下将基因片段与载体片段上切出粘性末端，再通过T4 DNA连接酶在16℃连接过夜，将连接产物电击转入大肠杆菌细胞中，一部分转化产物，涂板，挑单克隆，摇菌后提质粒二代测序，突变率达到要求并且库容达到106后，将另一部分菌液加入培养后过夜培养。然后利用数字油滴PCR法从扩增速度1kb/30s逐步降低到1kb/3s进行多轮高通量筛选。
具体地，本发明的步骤S3的操作具体如下：
将最后一轮高通量筛选得到的转化子电击转化到ER2566细胞后直接涂在含有氨苄抗性的固体培养基上，37℃过夜培养后，将板上的单克隆分别在5ml LB液体培养基中过夜37℃活化，将过夜活化的培养基以1：200的比例转接到400ml LB液体培养基中培养至OD600＝1时加入0.5mM的IPTG 20℃培养16h后收菌，将菌体重悬后超声破碎仪超声破碎后离心将上清进行PEI去核酸处理，去除沉淀后将上清加入硫酸铵沉淀蛋白以去除上清中多余的PEI。将沉淀的蛋白重悬后进行纯化。蛋白纯化主要采取亲和层析法，将上清过镍柱，将洗脱后的蛋白直接过肝素柱。样品从肝素柱洗脱下后透析至酶保存液中。
本发明中，蛋白纯化主要采取亲和层析法，上样前用30个柱体积平衡液(20mmTris+50mm NaCl+5mm βME+5％Glycerol，pH8.0)平衡镍柱，平衡后将上清过镍柱(GE NiSepharoseTM6FastFlow)，再用平衡液平衡镍柱后，加入20个柱体积的洗杂液(20mm Tris+50mm NaCl+5mm βME+5％Glycerol+20mM Imidazole，pH8.0)洗杂，洗杂后加入10个柱体积的洗脱液(20mm Tris+50mm NaCl+5mm βME+5％Glycerol+250mM Imidazole，pH8.0)洗脱，将洗脱后的蛋白直接过肝素柱(博格隆Heparin Bestarose FF)。上样前用30个柱体积的平衡液(20mm Hepes+50mm KCl+5％Glycerol，pH8.0)平衡肝素柱，平衡后将上清过柱，样品过完后用30个柱体积平衡液平衡肝素柱后，加入20个柱体积的洗杂液(20mm Hepes+100mmKCl+5％Glycerol，pH8.0)洗杂，洗杂后加入10个柱体积的洗脱液(20mm Hepes+500mm KCl+5％Glycerol，pH8.0)洗脱，样品从肝素柱洗脱下后透析至酶保存液(20mM Tris+100mM KCl+0.1mM EDTA+0.5％NP-40+0.5％Tween-20+1mM DTT+50％Glycerol，pH8.0)中。
本发明步骤S4的操作具体为：将透析后的Taq酶，标定酶活，根据标定的酶活将酶稀释至5U/ul，并进行抗体修饰，封闭酶在常温下的活性中心性能以保证酶能长期保存。对抗体修饰后的Taq酶用不同的引物探针鉴定酶快速热启动的性能，鉴定不同扩增下的Ct值。最后筛选出性能最佳的如第一方面所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶。
本发明还提供所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶、所述核苷酸序列、所述重组表达载体、所述重组细胞或所述的PCR试剂盒在PCR检测领域中的应用。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
本发明针对快速延伸效果对野生型TaqWT酶进行定向进化，获得的快速热启动酶在qPCR条件下扩增速度不低于1kb/3s，延伸5s的扩增性能不低于野生型延伸30s，解决了Taq酶在扩增时延伸时间长的问题，在不影响qPCR Ct的情况下减少整体扩增时间；比市场上其他Taq酶能更快的完成诊断时间。
本发明的筛选方法在Taq WT酶的随机突变和组合突变的基础上加入利用数字油滴技术进行高通量筛选，操作简单。筛选出的10个突变体与TaqWT氨基酸相似度为99.7％，延伸时间可以缩短到60℃1s，检测时间可以减少到15-25min，极大地提高了检测效率。
附图说明
图1为Taq M1酶和野生型TaqWT酶的QPCRFAM通路扩增曲线；
图2为Taq M1酶和野生型TaqWT酶的QPCRVIC通路扩增曲线；
图3为Taq M1酶和野生型TaqWT酶的QPCR CY5通路扩增曲线；
图4为TaqM1酶和野生型TaqWT酶的延伸1s快速PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中，1为野生型TaqWT酶，2为TaqM1酶；
图5为TaqM1酶和野生型TaqWT酶的延伸2s快速PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中，1为野生型TaqWT酶，2为TaqM1酶；
图6为Taq M1酶和野生型TaqWT酶分别扩增100pg，10pg，1pg模板的PCR琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为野生型Taq WT酶扩增1pg模板量，2为TaqM1酶扩增1pg模板量；3为野生型TaqWT酶扩增10pg模板量，4为TaqM1酶扩增10pg模板量；5为野生型Taq WT酶扩增100pg模板量，6为Taq M1酶扩增100pg模板量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供一种筛选基于蛋白定向进化的快速热启动酶的方法，包括如下步骤：
S1、对模板野生型TaqWT酶质粒进行随机突变与组合突变，得到突变的基因文库；
本实施例中，本发明步骤S1的随机突变主要通过易错PCR体系进行。通过改变传统PCR体系的dNTPs，Mg2+浓度，Mn2+浓度，PH值或用低保真的Taq酶增加PCR的错配率从而得到序列多样性文库。本发明的易错PCR采用了商业试剂盒Takara的PCR RandomMutagenesis Kit User Manual进行随机突变，每个克隆至少含有两个位点突变。其中，易错PCR的体系见表1，引物序列见表2，PCR程序见表3。
表1:
表2:
Primer Mix 序列(5’-3’)
Forward Primer ccgcgcggcagccatatgcgtggtatgctgccgc
Reverse Primer ggctgtctgctaaagaatgataagcttgcggcc
表3:
本实施例的组合突变是在软件建模分析出的酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，如Arg457，在蛋白的活性位点上设计间并引物(gttgcctacctgnnkgctatgagcc)，多点饱和突变后从而得到活性位点附近的突变文库。
S2、将S1得到的基因文库构建到高通量筛选的载体上，利用数字油滴PCR法从扩增速度1kb/30s逐步降低到1kb/3s进行高通量筛选；
具体地，将突变的基因文库通过双酶切法分别在30℃，37℃条件下将基因片段与载体片段上切出粘性末端，再通过T4 DNA连接酶在16℃连接过夜，将连接产物电击转入大肠杆菌细胞中，一部分转化产物，涂板，挑单克隆，摇菌后提质粒二代测序，突变率达到要求并且库容达到106后，将另一部分菌液加入培养后过夜培养。
利用数字油滴PCR法从扩增速度1kb/30s逐步降低到1kb/3s进行多轮高通量筛选：将达到库容的菌转接后37℃培养至OD600＝1时用0.5mM IPTG诱导后20℃过夜培养。将表达Taq酶的大肠杆菌和PCR体系以及油相混合，高速震荡形成油包水的油滴，将大肠杆菌包裹进油滴中，使每个油滴包裹约1个大肠杆菌细胞，然后进行PCR扩增：95℃裂解细胞释放Taq酶，同时编码对应Taq酶的DNA模板解链，60℃30s退火并延伸。将PCR后的产物取5ul跑DNA琼脂糖核酸电泳鉴定在目的基因出有无片段，有目的片段则将PCR产物进行DNA回收，回收产物双酶切后与载体T4 DNA连接酶连接后电击转化进行下一轮筛选；通过控制扩增速度，从1kb/30s逐步降低到1kb/3s，进行多轮油滴筛选。
S3、最后一轮高通量筛选得到了16个转化子，将这16个转化子分别电击转化到ER2566细胞后直接涂在含有氨苄抗性的固体培养基上，37℃过夜培养后，将板上的单克隆在5ml LB液体培养基中过夜37℃活化，将过夜活化的培养基以1：200的比例转接到400mlLB液体培养基中培养至OD600＝1时加入0.5mM的IPTG 20℃，160rpm，培养16h后收菌。将菌体用20ml裂解液(50mm Tris+50mm NaCl+10mmβME+5％Glycerol，pH8.0)重悬后用超声破碎仪55％功率(ON，3S；OFF，5S)超声30min，破碎后12000rpm，4℃，30min离心，75℃30min热处理上清。12000rpm，4℃，30min离心，收集上清，冰浴加入PEIpH8.0至终浓度为0.3％去核酸，冰上放置30min，12000rpm，4℃，30min离心后去除沉淀。将上清加入饱和硫酸铵pH7.4沉淀蛋白以去除上清中多余的PEI，室温搅拌1.5h后12000rpm，4℃，30min离心，弃上清，将沉淀的用重悬液(20mmTris+50mm NaCl+5mmβME+5％Glycerol，pH8.0)重悬蛋白后取40ul上清验证蛋白表达后，剩下的上清过0.22um滤膜后进行蛋白纯化。
本实施例中的蛋白纯化主要采取亲和层析法，上样前用30个柱体积平衡液(20mmTris+50mm NaCl+5mmβME+5％Glycerol，pH8.0)平衡镍柱，平衡后将上清过镍柱(GE NiSepharoseTM6Fast Flow)，用平衡液平衡镍柱后，加入20个柱体积的洗杂液(20mm Tris+50mm NaCl+5mm βME+5％Glycerol+20mM Imidazole，pH8.0)洗杂，洗杂后加入10个柱体积的洗脱液(20mm Tris+50mm NaCl+5mm βME+5％Glycerol+250mM Imidazole，pH8.0)洗脱，将洗脱后的蛋白直接过肝素柱(博格隆Heparin Bestarose FF)。上样前用30个柱体积的平衡液(20mm Hepes+50mm KCl+5％Glycerol，pH8.0)平衡肝素柱，平衡后将上清过柱，样品过完后用30个柱体积平衡液平衡肝素柱后，加入20个柱体积的洗杂液(20mm Hepes+100mmKCl+5％Glycerol，pH8.0)洗杂，洗杂后加入10个柱体积的洗脱液(20mm Hepes+500mm KCl+5％Glycerol，pH8.0)洗脱，样品从肝素柱洗脱下后透析至酶保存液(20mM Tris+100mM KCl+0.1mM EDTA+0.5％NP-40+0.5％Tween-20+1mM DTT+50％Glycerol，pH8.0)中。
S4、将纯化得到的突变体用酶保存液稀释至不同浓度，通过比酶活法确定酶的最佳稀释度；标定酶活，根据标定的酶活将酶稀释至5U/ul，并进行37℃，2h抗体修饰封闭酶在常温下的活性中心性能以保证酶能长期保存；再用不同的引物探针鉴定突变体快速热启动的性能，记录不同模板浓度扩增下的Ct值；
本实施例中，用于鉴定筛选突变体快速热启动的性能的引物探针5’端有荧光基团FAM修饰，3’端有猝灭基团BHQ1修饰，引物序列见表4:：
表4:
16个转化子编号为M1-M16，鉴定其在3000个拷贝质粒模版浓度条件下扩增的CT值，结果见表5。
表5:
S5、根据表5结果进一步选取编号为M1，M2，M3，M5，M7，M8，M11，M12，M15，M16的快速热启动酶进行二代测序，分别如SEQ ID NO：2-11所示的氨基酸序列，各突变体的突变位点见下表6。
表6:
为了进一步验证快速热启动酶的快速扩增情况，选取编号M1，M3，M7，M8，M11的突变体检测梯度减少延伸时间的扩增性能，结果如下表7：
表7:
可见，本实施例筛选到的快速热启动酶M1，M2，M3，M5，M7，M8，M11，M12，M15，M16具有良好的性能；通过将本实施例筛选得到的快速热启动酶M1，M2，M3，M5，M7，M8，M11，M12，M15，M16按常规方法进行克隆、表达和纯化可以实现批量化制备。
对比实验
选取编号M1的快速热启动酶与野生型热启动酶Taq WT分别进行qPCR反应检测，其中，QPCR FAM通路扩增的qPCR的引物探针5’端有荧光基团FAM修饰，3’端有猝灭集团BHQ1修饰，引物序列见表8，扩增结果见图1；QPCRVIC通路扩增的qPCR的引物探针5’端有荧光基团VIC修饰，3’端有猝灭集团BHQ1修饰，引物序列见表9，扩增结果见图2；QPCR CY5通路扩增的qPCR的引物探针5’端有荧光基团CY5修饰，3’端有猝灭集团BHQ2修饰，引物序列见表10，扩增结果见图3。
表8:
表9:
表10:
本实验中，qPCR体系和组分浓度见表11；反应程序见表12；检测结果见表13-15。
表11：
体系 终浓度
QPCR buffer 5×
dNTPs 0.2mMol/L
FMDV-OF2 0.2uMol/L
FMDV-OR2 0.2uMol/L
FMDV-OP2-FAM 0.16uMol/L
Taq酶 100U/ml
DNA Sample ≥10拷贝数/反应
ddH2O To25ul
表12：
表13:
表14:
表15:
检验实验一：检验快速热启动TaqM1酶的快速PCR扩增能力
快速热启动不仅适用于荧光PCR，同时适用于快速普通PCR，本实验从大肠杆菌菌液中提取目的质粒(OMEGA Plasmid Mini Kit I)，标定质粒浓度(ThermoScientificTMNanoDropTMOne Microvolume UV-Vis Spectrophotometers)后，将浓度稀释至1ng/ul并当作模板进行PCR反应，PCR反应体系为表16，引物序列为表17，反应程序为表18；将PCR产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，于电泳缓冲液中电泳，电泳结束后拍照即可。所述PCR产物与加样缓冲液的体积比为9：1，所述琼脂糖凝胶浓度为1％，所述电泳缓冲液为1×TE缓冲液，所述电泳电压为5V/cm。电泳结果见图4-5。
表16:
体系 终浓度
PCR buffer 5×
dNTPs 0.2mMol/L
PYX-F 0.2uMol/L
PYX-R 0.2uMol/L
Taq酶 100U/ml
DNA Sample 1ng
ddH2O To20ul
表17:
表18：
检验实验二：检测快速热启动酶TaqM1的快速PCR扩增性能
按表19的扩增程序分别对模版量为100pg，10pg，1pg的PCR体系进行扩增，结果见图6。
表19:
结果表明，本发明提供的快速热启动Taq酶不仅在1ng模板中扩增产物量多，在100pg，10pg，1pg模板下，均能扩增良好。
以上实验以编号为M1的快速热启动Taq酶为例，说明本发明筛选到的快速热启动酶的退火延伸时间短，具有良好的扩增效果，其他筛选的酶也同样具有上述相似效果，本发明对此不再赘述。
综上，本发明提供的基于蛋白定向进化技术高通量筛选到的快速热启动的Taq酶，延伸时间可以缩短到60℃1s，检测时间可以减少到15-25min，极大地提高了检测效率。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶，其特征在于，所述的快速热启动酶在SEQID NO.1所示的氨基酸序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代：第59位、第339位、第459位、第507位、第515位、第626位、第638位、第688位、第707位、第708位、第743位、第749位，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有96％以上同一性并具有TaqDNA聚合酶活性。
2.如权利要求1所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶，其特征在于，所述的快速热启动酶在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的任意两个氨基酸位置上的氨基酸取代：第59位、第339位、第459位、第507位、第515位、第626位、第638位、第688位、第707位、第708位、第743位、第749位，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有98％以上同一性并具有TaqDNA聚合酶活性。
3.如权利要求2所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：2-11任一项所示，或与所示序列具有95％以上同一性的具有TaqDNA聚合酶活性的氨基酸序列。
4.编码如权利要求3所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶的核苷酸序列。
5.编码如权利要求3所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶的核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO：12-21任一项所示。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4或5中所述的核苷酸序列。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1-3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶、包含权利要求4或5所述的核苷酸序列、或包含权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种RCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶。
9.筛选如权利要求1-3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对模板野生型TaqWT酶质粒进行随机突变与组合突变，得到突变的基因文库；
S2、将S1得到的基因文库构建到高通量筛选的载体上，利用数字油滴PCR法从扩增速度1kb/30s逐步降低到1kb/3s进行多轮高通量筛选；
S3、将最后一轮高通量筛选得到的转化子进行表达纯化；
S4、将纯化得到的突变体用酶保存液稀释至不同浓度，通过比酶活法确定酶的最佳稀释度；抗体修饰后再用不同的引物探针鉴定突变体快速热启动的性能，记录不同模板浓度扩增下的Ct值；
S5、筛选出权利要求1-3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶。
10.如权利要求1-3任一项所述的基于蛋白定向进化的快速热启动酶、权利要求4或5所述的核苷酸序列、权利要求6所述重组表达载体、权利要求7所述重组细胞或权利要求8所述的PCR试剂盒在PCR检测领域中的应用。
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