CN111269969B - 基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对 - Google Patents

基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。该恒温扩增方法，结合具有链置换活性的DNA聚合酶和常规引物(即引物结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构)即可实现指数级恒温扩增重复DNA序列。

Description

基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方 法及常规引物对
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对。
背景技术
恒温扩增方法多种多样，其中主要的方法有依赖核酸序列的扩增反应(nucleicacid sequence-based amplification，NASBA)、依赖解链酶的扩增反应(helicasedependent amplification，HDA)、环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、链置换扩增反应(strand displacement amplification，SDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)。这些方法的主要特征是反应体系中含有链置换活性的核酸聚合酶和特殊设计的引物，特殊设计的引物结合到模板DNA后需要折叠成特定的二级结构，便于后续的恒温扩增。
但是，上述恒温扩增方法体系都需要根据扩增模板以及具体其恒温扩增原理或技术要求设计特殊引物，而不只是符合互补配对原理就可以，需要考虑很多因素，对实验人员的专业知识和操作水平有一定的要求。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对。
本发明的目的是通过以下方案实现的：
本发明的第一方面是提供一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。
优选地，所述具有串联重复序列的DNA模板为重复DNA序列rDs7或结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA；
当重复DNA序列rDs7为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5'GAACTTCACCAGCACACTGA 3'
反向引物：5'AGCCACGATCTTTGACTTGT 3'
当结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
反向引物：5'GCGCCGCTCCTCCTCATCG 3'；
或
正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
反向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'。
优选地，所述重复DNA序列rDs7由7个高度同源DNA序列rDs7-1～rDs7-7按照先后顺序拼接而成；rDs7-1的序列如SEQ ID NO：1所示；rDs7-2的序列如SEQ ID NO：2所示；rDs7-3的序列如SEQ ID NO：3所示；rDs7-4的序列如SEQ ID NO：4所示；rDs7-5的序列如SEQID NO：5所示；rDs7-6的序列如SEQ ID NO：6所示；rDs7-7的序列如SEQ ID NO：7所示。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶。
优选地，当进行实时恒温扩增时，需在反应体系中另加入终浓度为0.8×的SYBRGold核酸荧光染料。
本发明的第二方面，是提供一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增方法，包括以下步骤：
(1)获取含有串联重复序列的DNA模板；
(2)按照Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶的说明书准备恒温扩增体系；
(3)结合引物的Tm值和聚合酶的工作温度范围，设定扩增温度，然后开始恒温扩增；
(4)对恒温扩增产物进行检测。
优选的，所述扩增温度为59℃-65℃，恒温扩增时间为1h-3h。
本发明的第三方面，是提供一种用于串联重复序列恒温扩增的常规引物对，所述串联重复序列的DNA模板为重复DNA序列rDs7或结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA；
当重复DNA序列rDs7为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5'GAACTTCACCAGCACACTGA 3'
反向引物：5'AGCCACGATCTTTGACTTGT 3'
当结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
反向引物：5'GCGCCGCTCCTCCTCATCG 3'；
或
正向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
反向引物：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、相比于其它恒温扩增方法需要特殊设计的引物，即结合到模板DNA后需要折叠成特定的二级结构，才可实现恒温扩增的目的，本发明只需针对串联重复序列模板设计互补的两条常规引物，即正向和反向引物，便可实现恒温扩增，基于本发明可以尝试设计针对串联重复序列的常规引物并恒温扩增，达到检测该生物的目的。
2、本发明的恒温扩增体系及扩增方法，结合具有链置换活性的DNA聚合酶(即Bst2.0)和常规引物(即引物结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构)即可实现指数级恒温扩增重复DNA序列。
3、本发明的恒温扩增体系及扩增方法中，常规引物设计简单，只需针对重复序列模板序列设计完全互补配对的引物即可，而现有技术中特殊设计引物则需要具体根据其恒温扩增原理/技术要求特殊设计。
4、本发明的恒温扩增体系及扩增方法，用常规引物即可针对串联重复序列进行恒温扩增。常规引物结合到模板后，无需折叠成特定的二级结构，丰富了针对串联重复序列的扩增方法种类。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1的凝胶电泳图；
图2为实施例1中实时荧光恒温扩增的实时荧光曲线图；
图3为实施例1中rDs7-1～rDs7-7的同源比对表；
图4为实施例1中正向引物和反向引物与模板rDs7的结合位点示意图；
图5为实施例1中模板rDs7的测序比对图；
图6为实施例2的凝胶电泳图一；
图7为实施例2的凝胶电泳图二；
图8为实施例2中，采用II_MIRU-F/II_MIRU-R作为正反向引物恒温扩增后所得核酸的一个代表性克隆/测序图；
图9为实施例2中，采用II_MIRU-F作为正反向引物恒温扩增后所得一个核酸的克隆/测序图；
图10为本发明的扩增机制原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构。
表1、恒温扩增和PCR所用引物
表中引物的Tm值作为一个参考值，指导后续PCR或者恒温扩增的温度选择，最终会比Tm值高或者低几摄氏度。
实施例1、以重复DNA序列rDs7为模板的恒温扩增
一、重复DNA序列rDs7的获取
采用常规方法，对应模板rDs7通过全基因合成并连接入载体pUC57，所得载体被命名为pUC57-rDs7。用限制性内切酶Afl II将含有完整rDs7的DNA片段从pUC57-rDs7切下，并连接至另一个载体，所构建新载体命名为p5-4-rDs7。对新载体的rDs7的测序比对(包括正向测序和反向测序)结果如图5所示，结果表明rDs7的序列完全正确，也间接的说明pUC57-rDs7的rDs7序列完全正确。
重复DNA序列rDs7由7个高度同源DNA序列，即rDs7-1～rDs7-7(7个高度同源DNA序列之间的区别主要在46、47、58-60位碱基的位置)按照先后顺序拼接而成。
如图3所示，序列rDs7-1和rDs7-3完全相同；序列rDs7-2和序列rDs7-5完全相同；序列rDs7-4和序列rDs7-7完全相同。也就是说重复DNA序列rDs7含有四种彼此高度同源的DNA序列。这四种同源DNA的序列来自一个参考文献(PMID：27118836)，这四种同源DNA序列在该文献中被称为Pumby模块，其所翻译四种蛋白能够特异结合四种不同的RNA碱基。本申请所用重复DNA序列rDs7通过全基因合成手段获得。
rDs7-1的序列如SEQ ID NO：1所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatccggcatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7-2的序列如SEQ ID NO：2所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatcgaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7-3的序列如SEQ ID NO：3所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatccggcatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7-4的序列如SEQ ID NO：4所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggaactatgtcatccaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7-5的序列如SEQ ID NO：5所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatcgaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7-6的序列如SEQ ID NO：6所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtgctatgtcatccaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7-7的序列如SEQ ID NO：7所示(引物rDs7-F作为正向引物，其结合位点为1-20bp、引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其结合位点为89-108bp，引物延伸方向为反向)：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggaactatgtcatccaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
rDs7的序列如SEQ ID NO：8所示：
gaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatccggcatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggctgaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatcgaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggctgaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatccggcatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggctgaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggaactatgtcatccaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggctgaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtcctatgtcatcgaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggctgaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggtgctatgtcatccaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggctgaacttcaccagcacactgaacaactcgtgcaagaccagtatgggaactatgtcatccaacatgtccttgagcacggacgccccgaagacaagtcaaagatcgtggct。
如图4所示，其中，引物rDs7-F作为正向引物，其7个结合位点为1-20bp、109-128bp、217-236bp、325-344bp、433-452bp、541-560bp、649-668bp，引物延伸方向为正向；引物rDs7-R作为反向引物，其7个结合位点为89-108bp、197-216bp、305-324bp、413-432bp、521-540bp、629-648bp、737-756bp，引物延伸方向为反向。
二、恒温扩增(以pUC57-rDs7为模板)
常规引物对为：
rDs7-F的序列如SEQ ID NO：9所示：5'GAACTTCACCAGCACACTGA 3'
rDs7-R的序列如SEQ ID NO：10所示：5'AGCCACGATCTTTGACTTGT 3'。
表2、以pUC57-rDs7为模板的PCR扩增和恒温扩增
实施例1.1至1.4中，DNA聚合酶为Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(简称Bst 2.0)(NEB，美国)，并按照其说明书进行恒温扩增；
对比例1.1至1.4中DNA聚合酶为PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(简称PrimeSTAR，不具有链置换能力)(TaKaRa，日本)，并按照其说明书进行恒温扩增；
PCR：所用聚合酶为PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(简称PrimeSTAR，不具有链置换能力)(TaKaRa，日本)，并按照其说明书进行PCR。PCR具体步骤为：首先94℃预变性5min；之后进入循环扩增步骤(每个循环步骤按照顺序包括94℃变性30s，59℃退火10s，68℃延伸10s)，共循环扩增35轮；之后再68℃总延伸5min；最后扩增样本保持于4℃。
表3、以pUC57-rDs7为模板的实时荧光恒温(65℃)扩增
实施例1.5 对比例1.5 对比例1.6
DNA聚合酶 Bst 2.0 Bst 2.0 Bst 2.0
常规引物对 rDs7-F和rDs7-R rDs7-F rDs7-R
扩增温度(℃) 65℃ 65℃ 65℃
是否有扩增产物 得到扩增产物 无法得到扩增产物 无法得到扩增产物
。
实施例1.5以及对比例1.5、1.6中，DNA聚合酶为Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶(简称Bst 2.0)(NEB，美国)，并按照其说明书进行恒温扩增；温度为65℃2.5h，体系中亦加入终浓度为0.8×的SYBR Gold核酸荧光染料(ThermoFisher SCIENTIFIC，美国)。
三、检测结果分析
从图1及表2中数据可以得出：
(1)以重复DNA序列rDs7为模板，用其常规正反向引物(即rDs7-F和rDs7-R)进行PCR扩增(所用DNA聚合酶为不具有链置换能力的PrimeSTAR)时，所得产物高度弥散。(2)从实施例1.1至1.4实验结果分析得出，以具有链置换能力的DNA聚合酶Bst 2.0进行恒温扩增可以得到高度弥散的扩增产物。同时，也发现95℃这个变性温度对后续59℃或者65℃恒温扩增没有明显影响。(3)从对比例1.1至1.4实验结果分析得出，因为PrimeSTAR不具有链置换能力，以其进行的恒温(59℃或65℃)扩增无法得到扩增产物。
从图2及表3中数据可以得出：以rDs7为模板，用Bst 2.0进行的恒温扩增需要正反向引物rDs7-F和rDs7-R的同时参与，且扩增具有指数增长特性。所用机器为Mastercycleep realplex4实时荧光PCR仪(Eppendorf，德国)。
综上所述，重复DNA区段可用与其配对的常规正反向引物进行恒温扩增。
实施例2、以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板的恒温扩增
分枝杆菌散在重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units，MIRUs)是散布于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)复合物基因组的串联重复DNA序列，其单个重复DNA序列长度一般为40-100bp。根据序列特征，MIRUs可分为I型、II型、和III型。结核分枝杆菌H37Rv基因组共有41个MIRUs位点，其中22个位点含有II型MIRUs。因为结核分枝杆菌基因组中含有MIRUs，因此我们设计了针对II型MIRUs保守序列的上下游特异常规引物，即II_MIRU-F和II_MIRU-R，并以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板进行恒温扩增和PCR。
一、结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的获取
1.1细菌培养
结核分枝杆菌H37Rv菌株(来自27294TM，American Type CultureCollection，美国菌种保藏中心)培养于添加了10％OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase enrichment)(BD Difco，美国)、0.5％甘油、0.05％吐温-80的Middlebrook 7H9液体培养液中(BD Difco，USA)。待所培养H37Rv光密度(opitical density，OD)约为0.8时，离心收集菌体(5000rpm/min，10min)用于基因组DNA提取。
1.2基因组DNA的提取
结核分枝杆菌H37Rv菌液在80℃水浴灭活30min后用于基因组DNA的提取。后续基因组DNA的提取参考自《分子医学方法·结核分枝杆菌程序》。
具体步骤如下：
(a)离心(5000rpm，10min)收集3mL OD≈0.8的菌液，并将所收集菌体沉淀重悬于200μL TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)中；
(b)加入50mg/mL的溶菌酶100μL，10mg/mL的RNase A 3μL，TE 200μL，37℃孵育过夜；
(c)再加入10％SDS溶液(w/v)至终浓度0.5％，而后加入20mg/mL的蛋白酶K 50μL，56℃孵育1h；
(d)加入200uL 5M的NaCl并混匀，再加入160μL 65℃预热的CTAB溶液并混匀，65℃孵育10min；(CTAB溶液的配置方法为：2g NaCl溶于45mL水，边搅拌边加入5g CTAB粉末，65℃水浴溶解。)
(e)小心吸取上清至另一干净1.5mL离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀，12,000rpm离心5min，取上清。重复本步骤一次；
(f)小心吸取上清至另一干净1.5mL离心管，加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，12,000rpm离心5分钟；
(g)小心倒弃上清，沉淀用500μL 70％乙醇离心洗涤1次，置于超静台室温吹干。最后将其溶解于适量TE缓冲液，测浓度纯度，-20℃保存备用。
二、恒温扩增
常规引物对为：
II_MIRU-F的序列如SEQ ID NO：11所示：5'GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
II_MIRU-R的序列如SEQ ID NO：12所示：5'GCGCCGCTCCTCCTCATCG 3'。
表4、以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板的PCR扩增和恒温扩增
实施例2.1至2.2：DNA聚合酶为Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(简称Bst 2.0)(NEB，美国)，并按照其说明书进行恒温扩增；
实施例2.3至2.4：DNA聚合酶为Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(简称Bst 2.0)(NEB，美国)，并按照其说明书进行恒温扩增；
对比例2.1：DNA聚合酶为Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(简称Bst 2.0)(NEB，美国)，并按照其说明书进行恒温扩增；
PCR对照组：所用聚合酶为PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(简称PrimeSTAR，不具有链置换能力)(TaKaRa，日本)，并按照其说明书进行PCR。PCR具体步骤为：首先94℃预变性5min；之后进入循环扩增步骤(每个循环步骤按照顺序包括94℃变性30s，65℃退火10s，68℃延伸10s)，共循环扩增35轮；之后再68℃总延伸5min；最后扩增样本保持于4℃。
三、检测结果分析
3.1、琼脂糖凝胶电泳
由图6和表4中数据可以得出，(1)实施例2.1、2.2以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，用II_MIRU-F作为正向引物，II_MIRU-R作为反向引物，进行恒温扩增1h，可能扩增时间不够，无法得到扩增产物，恒温扩增3h则可以得到扩增产物；(2)用II_MIRU-F作为正向引物，II_MIRU-R作为反向引物，进行PCR亦可得到PCR产物。
我们进一步发现；由图8和表4中数据可以得出，(1)实施例2.4以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，单用引物II_MIRU-F(即正反向引物均采用SEQ ID NO:11的序列)进行恒温扩增亦可得到扩增产物，且其扩增产物产量高于实施例2.3中II_MIRU-F/II_MIRU-R恒温扩增产物的产量；(2)对比例2.1中，单用引物II_MIRU-R(即正反向引物均采用SEQ ID NO:12的序列)进行恒温扩增无法得到扩增产物。
3.2、TA克隆和测序
3.2.1、用AxyPrep PCR Clean-up试剂盒(Axygen，美国)并按照其说明书回收恒温扩增的DNA产物；
3.2.2、所回收的恒温扩增的DNA产物进一步用Taq DNA聚合酶(TaKaRa，日本)并按照其说明书在72℃处理10min，以便在DNA 3'末端添加碱基A；
3.2.3、将添加碱基A的DNA产物连接入载体pMD19-T(TaKaRa，日本)(连接反应按照该载体说明书进行)、转化大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Top10感受态细胞(42℃水浴热击30s，之后冰浴2min)，所转化E.coli Top10培养于含有0.1mg/mL氨苄青霉素、0.024mg/mL IPTG、0.04mg/mL X-Gal的LB固体培养基；
3.2.4、细菌培养温度为37℃。挑取白色克隆小量(200μL)培养于含有0.1mg/mL氨苄青霉素的LB培养基；待菌液肉眼可见浑浊后，吸取100μL菌液于无菌管并快递至苏州金唯智生物科技有限公司用于后续测序。
3.3、测序结果分析
将II_MIRU-F/II_MIRU-R或II_MIRU-F的恒温扩增产物分别克隆/测序。对于用II_MIRU-F/II_MIRU-R作为正反向引物的恒温扩增产物，29个单克隆中有22个单克隆可成功测序，其中一个代表性克隆的测序结果序列如SEQ ID NO：13所示：
gattgcgccgctcctcctcatcgctgcgctctgcatcgtcgccggcaccaaccatctgcgccgctcctcctcatcgctgcgctctgcatcgtcgccggcaccaaccatctgcgccgctcctcctcatcgctgcgctctgcatcgtcgccggcaccaaccatctgcgccgctcctcctcatcgctgcgctctgcatcgtcgccggcaatc；
如图8所示，其中，1-4bp、206-209bp为pMD19-T的插入位点，II_MIRU-R的结合位点为：5-23bp、58-76bp、111-129bp、164-182bp，引物延伸方向为正向；II_MIRU-F的结合位点为：28-46bp、81-99bp、134-152bp、187-205bp，引物延伸方向为反向。
对于用II_MIRU-F同时作为正反向引物的恒温扩增产物，33个单克隆中仅有1个单克隆可成功测序，其测序结果，序列如SEQ ID NO：14所示：
gattgccggcgacgatgcagagcgcagcgatgaggaggagcggcacacatgattgatgaggctctcttcgacgccgaagagagcctcatcaatcatctgcgccgctctgcatcgtcgccggcaatc；
如图9所示，引物II_MIRU-F在该序列的5’和3’各有一个结合位点(5-23bp，引物延伸方向为正向；104-122bp，引物延伸方向为反向)，且方向相反，即II_MIRU-F同时扮演了正向引物和反向引物。1-4bp、123-126bp为pMD19-T的插入位点。综上所述，结核分枝杆菌H37Rv II型MIRUs可用其常规引物II_MIRU-F/II_MIRU-R或者II_MIRU-F进行恒温扩增。
从实施例1中可知，基于rDs7的恒温扩增发现，当正反向引物同时使用时才可成功扩增，而单独使用正向或者反向引物时则不能成功扩增(如图2)。
从实施例2中可知，(1)基于II型MIRUs的恒温扩增发现，除过同时使用正反向引物可成功扩增之外，单独使用引物II_MIRU-F亦可成功扩增，而单独使用反向引物II_MIRU-R则不能成功扩增(如图7)。(2)对单独使用II_MIRU-F的扩增产物的测序发现，II_MIRU-F既扮演了正向引物，又扮演了反向引物。另外，在结核分枝杆菌H37Rv基因组有22个包含II型MIRUs的位点，其中有7个位点在基因组反向排列(见参考文献PMID：10844663)，因此正向和反向II型MIRUs一起可以满足II_MIRU-F既扮演正向引物又扮演反向引物。也就是说，基于rDs7和II型MIRUs的恒温扩增结果是一致的，即需要正反向引物的同时参与。
扩增机制解释如下：
如图10所示，以rDS7的恒温扩增为例，对于常规引物便可实现恒温扩增重复DNA序列，其具体机制可以解释为：
(1)因为引物rDs7-F和rDs7-R在rDs各有7个结合位点，因此引物rDs7-F/rDs7-R首先可以扩增出49个不同的DNA片段，长度可能是108bp、216bp、324bp、432bp、540bp、648bp、或者756bp；
(2)所扩增的49个不同的DNA片段彼此高度同源，其可以扮演彼此的模板和/或引物，再加之rDs7-F/rDs7-R的持续参与，之后会恒温扩增出更加复杂多样的彼此高度同源的不同长度的DNA产物；
(3)扩增反应不断重复类似第(1)和第(2)步的反应。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海公共卫生临床中心
<120> 基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系、扩增方法及常规引物对
<130> DD08615
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtccta tgtcatccgg 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 2
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtccta tgtcatcgaa 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 3
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtccta tgtcatccgg 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 4
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggaacta tgtcatccaa 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 5
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtccta tgtcatcgaa 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 6
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtgcta tgtcatccaa 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 7
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggaacta tgtcatccaa 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggct 108
<210> 8
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtccta tgtcatccgg 60
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggctga acttcaccag 120
cacactgaac aactcgtgca agaccagtat gggtcctatg tcatcgaaca tgtccttgag 180
cacggacgcc ccgaagacaa gtcaaagatc gtggctgaac ttcaccagca cactgaacaa 240
ctcgtgcaag accagtatgg gtcctatgtc atccggcatg tccttgagca cggacgcccc 300
gaagacaagt caaagatcgt ggctgaactt caccagcaca ctgaacaact cgtgcaagac 360
cagtatggga actatgtcat ccaacatgtc cttgagcacg gacgccccga agacaagtca 420
aagatcgtgg ctgaacttca ccagcacact gaacaactcg tgcaagacca gtatgggtcc 480
tatgtcatcg aacatgtcct tgagcacgga cgccccgaag acaagtcaaa gatcgtggct 540
gaacttcacc agcacactga acaactcgtg caagaccagt atgggtgcta tgtcatccaa 600
catgtccttg agcacggacg ccccgaagac aagtcaaaga tcgtggctga acttcaccag 660
cacactgaac aactcgtgca agaccagtat gggaactatg tcatccaaca tgtccttgag 720
cacggacgcc ccgaagacaa gtcaaagatc gtggct 756
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaacttcacc agcacactga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agccacgatc tttgacttgt 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccggcgacg atgcagagc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgccgctcc tcctcatcg 19
<210> 13
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gattgcgccg ctcctcctca tcgctgcgct ctgcatcgtc gccggcacca accatctgcg 60
ccgctcctcc tcatcgctgc gctctgcatc gtcgccggca ccaaccatct gcgccgctcc 120
tcctcatcgc tgcgctctgc atcgtcgccg gcaccaacca tctgcgccgc tcctcctcat 180
cgctgcgctc tgcatcgtcg ccggcaatc 209
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gattgccggc gacgatgcag agcgcagcga tgaggaggag cggcacacat gattgatgag 60
gctctcttcg acgccgaaga gagcctcatc aatcatctgc gccgctctgc atcgtcgccg 120
gcaatc 126

Claims (1)

1.一种基于常规引物的针对串联重复序列的恒温扩增体系，其特征在于，所述恒温扩增体系包括具有串联重复序列的DNA模板、DNA聚合酶和常规引物对，所述DNA聚合酶为具有链置换活性的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，所述常规引物对是指在恒温扩增时，常规引物对结合到模板DNA后无需折叠成特定的二级结构，只需针对串联重复序列模板设计互补的两条常规引物，即正向和反向引物；
所述具有串联重复序列的DNA模板为重复DNA序列rDs7或结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA；
当重复DNA序列rDs7为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5' GAACTTCACCAGCACACTGA 3'
反向引物：5' AGCCACGATCTTTGACTTGT 3'
当结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板时，所述常规引物对为：
正向引物：5' GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
反向引物：5' GCGCCGCTCCTCCTCATCG 3'；
或
正向引物：5' GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'
反向引物：5' GCCGGCGACGATGCAGAGC 3'；
所述重复DNA序列rDs7由7个高度同源DNA序列rDs7-1～rDs7-7按照先后顺序拼接而成；rDs7-1的序列如SEQ ID NO：1所示；rDs7-2的序列如SEQ ID NO：2所示；rDs7-3的序列如SEQ ID NO：3所示；rDs7-4的序列如SEQ ID NO：4所示；rDs7-5的序列如SEQ ID NO：5所示；rDs7-6的序列如SEQ ID NO：6所示；rDs7-7的序列如SEQ ID NO：7所示；
当进行实时恒温扩增时，需在恒温扩增体系中另加入终浓度为0.8×的SYBR Gold核酸荧光染料。
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