CN109957029B - 一种重组蛋白gp32-UvsX、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白gp32‑UvsX，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。同时还提供了一系列重组蛋白gp32‑UvsX的突变体。本发明通过将蛋白酶gp32与UvsX的基因拼接，形成新的重组蛋白gp32‑UvsX，该系列重组蛋白同时具备结合单链和重组的功能，可以与Bst、Taq等DNA聚合酶实现核酸体外扩增。本发明将重组酶和gp32结合单链的功能聚合到同一个酶上，只需一对引物即可进行扩增；而且本发明的酶不但可以应用到恒温扩增，还可以用到普通PCR上，扩大了酶的用途，提高了酶的耐受温度。经过本发明的改进，提高了酶的活力，改良了酶的性能，使酶具有高效性和专一性；可加速化学反应，快速达到平衡点；达到改善实验进程、保留实验效果的目的，给核酸体外扩增带来新方法。

Description

一种重组蛋白gp32-UvsX、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组蛋白gp32-UvsX、其制备方法及应用。

背景技术

恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。均可在23-45℃下连续进行反应，反应时间为15-30min，它们都具有共同的特点：特异性强、灵敏度高，不需要特殊的仪器设备。

UvsX是一种重组酶，在恒温PCR过程中与上游引物或下游引物相结合形成重组酶引物复合体，上游引物与重组酶复合体可以正向扫描DNA模板，下游引物重组酶复合体反向扫描双链DNA模板。一旦找到，重组酶就可以使此位置的靶序列双链DNA解链，并发生链置换反应，形成D形环结构。这时，单链结合蛋白gp32与被置换单链结合，防止置换的单链被进一步替换。

gp32蛋白是一种单链DNA(ssDNA)结合蛋白，在恒温基因扩增过程中结合单链DNA，协调性地结合并稳定瞬时形成的ssDNA区域。由于恒温技术不需要高温解链，而是通过gp32的单链结合作用，使DNA双链被打开时继续保持单链状态，从而降低非特异。普通PCR主要是通过高温裂解，降低非特异，所以gp32在恒温PCR中是必不可少的蛋白。

而恒温基因扩增技术仅适用于恒温扩增，主要原因是gp32的最适反应温度受限，例如

DNA扩增试剂盒适用温度在37℃-42℃范围内，过低或过高的温度会使制剂中的酶温度的影响而逐渐地失去全部活性，对反应体系产生不利的影响。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明通过把UvsX(重组)和gp32蛋白(单链结合)两个酶的功能合并在一起，减少了加入物质的繁琐程序，降低了成本，减少了酶的定标过程，有助于酶在生产上放大。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种重组蛋白gp32-UvsX的编码氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。本发明将重组酶和gp32单链结合的功能聚合到同一个酶上，只需一对引物即可进行扩增，而且本发明的酶不但可以应用到恒温扩增，还可以用到普通PCR上，扩大了酶的用途，提高了酶的耐受温度。

优选地，重组蛋白gp32-UvsX的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种重组蛋白gp32-UvsX的制备方法，包括以下步骤：

(1)将重组蛋白gp32-UvsX的基因表达片段导入载体，得到重组表达载体，所述重组基因片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)将所述载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；

(3)对所述重组工程菌进行诱导培养后进行分离纯化，得到所述重组蛋白gp32-UvsX，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

进一步地，在所述重组蛋白gp32-UvsX的制备方法步骤(1)之前还包括以下步骤：

(1)通过PCR分别获得单独蛋白gp32与UvsX基因的片段，其中gp32的PCR正向引物如SEQ ID No.2所示，反向引物如SEQ ID No.3所示；UvsX的PCR正向引物如SEQ ID No.4所示，反向引物如SEQ ID No.6所示；

(2)将gp32基因与UvsX基因进行拼接，以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入正向引物和反向引物后进行PCR扩增，其正向引物如SEQ ID No.2所示，反向引物如SEQ ID No.5所示，所得PCR扩增产物即为重组蛋白gp32-UvsX的基因片段。

进一步地，所述重组蛋白gp32-UvsX的制备方法步骤(2)中的载体通过以下方法获得：

(1)将重组基因片段导入T载体后，转化到大肠杆菌中，通过诱导培养，提取T载体质粒，并对其测序，然后提取T载体中的重组基因片段；

(2)将从T载体中提取的重组基因片段导入质粒PUC57，再转化到肠杆菌中诱导培养，得到重组工程菌。

进一步地，所述重组蛋白gp32-UvsX的制备方法步骤(3)重组蛋白gp32-UvsX通过以下方法获得：将带有所述质粒PUC57的重组工程菌培养至一定浓度，收集菌体，进行重组蛋白gp32-UvsX的表达以及分离与纯化。

本发明还提供一种重组蛋白gp32-UvsX的突变体，该突变体为gp32b、gp32c、或者gp32d，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。需要这里指出的是，本发明所提供的重组蛋白gp32-UvsX及其突变体gp32b、gp32c、gp32d均具有活性。

优选地，突变体gp32b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；突变体gp32c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；突变体gp32d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明的另一目的在于还提供一种重组蛋白gp32-UvsX或其突变体在体外核酸扩增反应体系中的应用。

根据本发明另一具体实施方式，恒温PCR条件下，以突变体gp32b或者gp32d替代gp32蛋白和UvsX重组酶。

根据本发明另一具体实施方式，恒温PCR条件下，以重组蛋白gp32-UvsX替代gp32蛋白和Bst酶。

根据本发明另一具体实施方式，荧光定量PCR条件下，以突变体gp32d替代Taq酶。这里需要指出的是，Taq酶价格较高，使用gp32d不仅成本更低、无须外购，而且比Taq酶扩增效果更好(图6)。另外需要指出的是，突变体gp32d既可用在荧光定量PCR又可用在恒温PCR中(在荧光定量PCR中效果更好)，即突变体gp32d的性能更高，应用范围更广。

本发明通过将蛋白酶gp32与UvsX的基因拼接，形成新的重组蛋白gp32-UvsX，同时对其进行多碱基定点突变，得到一系列具有双功能或新功能的重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c和gp32d。该系列重组蛋白同时具备结合单链和重组的功能，可以与Bst、Taq等DNA聚合酶实现核酸体外扩增。具体而言，该系列重组蛋白或具备解开双链DNA与单链DNA结合的功能，或具备聚合酶功能，可以在较低温(恒温)以及较高温(恒温)条件下结合到模板双链区解旋、稳定单链并使引物可以和目的区段发生替换，从而替代传统PCR变性、退火步骤，直接进行核酸体外扩增。本发明将重组酶和gp32结合单链的功能聚合到同一个酶上，只需一对引物即可进行扩增；而且本发明的酶不但可以应用到恒温扩增，还可以用到普通PCR上，扩大了酶的用途，提高了酶的耐受温度。经过本发明的改进，增加了酶的功能，提高了酶的活力，改良了酶的性能，拓宽了使用范围，使酶具有高效性和专一性；克服了成本高、要求严、敏感性强等缺点，并且简化组分，降低成本，可加速化学反应，快速达到平衡点；进而可以简单便捷的开展相关课题研究，同时达到改善实验进程、保留实验效果的目的，给核酸体外扩增带来新方法。

附图说明

图1为分子筛纯化重组蛋白gp32a(重组蛋白gp32-UvsX)峰图。

图2为重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c和gp32d的SDS-PAGE电泳图(图中gp32a为重组蛋白gp32-UvsX；gp32b、gp32c和gp32d为重组蛋白gp32-UvsX的突变体)。

图3为重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c和gp32d与DNA的结合特性SDS-PAGE电泳图。

图4为重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c和gp32d分别替代UvsX和gp32在较低温度(恒温)下进行体外核酸扩增的比较示意图。

图5为重组蛋白gp32a和gp32c分别替代Bst酶和gp32在较高温度(恒温)下进行体外核酸扩增的比较示意图。

图6为重组蛋白gp32c和gp32d分别替代Taq酶在变温条件下进行体外核酸扩增的比较示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。

实施例1重组蛋白gp32-UvsX的制备，其操作步骤如下：

一、获得gp32与UvsX基因的片段：

(1)分别取含有T4-gp32和T4-UvsX的大肠杆菌Escherichia Coil.1ml，12000rpm离心3min，去除上清液，用800ul生理盐水悬浮菌液，置于100℃水中10min；将其取出12000rpm离心5min；取上清液(含有大肠杆菌基因组DNA)即可作为PCR扩增模板。

(2)将上述提取的基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增，扩增引物如下：

gp32引物：

正向(F1)：ATGTTCAAGAGGAAGAGCAC

反向(R1)：AGAACAGGCACACCTCGGTCTTGGTG

UvsX引物：

正向(F2)：CAAGACCGAGGTGTGCCTGT

反向(R2)：GTACCAGCCGTTCTTGGGCTTC

反应条件为：

(3)PCR产物用2％琼脂糖电泳初步确认。

二、gp32基因与UvsX基因的连接

(1)将gp32基因与UvsX基因PCR产物按照胶回收纯化试剂盒进行纯化扩增。

(2)引物R1和F2作为扩增gp32基因和UvsX基因拼接的正反向引物，各取步骤(1)的扩增产物稀释10万倍，分别取稀释后的产物2.5ul加入反应体系，连接体系反应条件如下：

正向引物：F1：ATGTTCAAGAGGAAGAGCAC

反向引物：R2：GTACCAGCCGTTCTTGGGCTTC

注意：此处应用高保真DNA聚合酶(如：pfu，Q5)，或者与taq酶混用，高保真DNA聚合酶：taq酶＝10:1。

(3)上述步骤得到的产物即为重组蛋白gp32-UvsX的核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示。

三、构建大肠杆菌重组gp32-UvsX基因的T载体

(1)电泳确认之后，将重组的gp32-UvsX基因PCR产物用胶回收试剂盒进行纯化。

(2)构建BAC克隆载体，与步骤(1)的PCR产物拼接起来，重组gp32-UvsX基因与T载体的连接反应体系如下：

上述体系共计10ul，体系轻轻混匀、离心后，置于14℃恒温环境中反应12-14h。

(3)分别取5ul步骤(2)的连接后产物(DNA含量不超过100ng)，加入到100ul Trans5α化学感受态细胞，轻轻摇匀之后放在42℃进行热激3min，迅速放置冰上静置4min，再加入300ul LB培养基，置于摇床37℃、1h。

(4)取步骤(3)的菌液加入含Amp的培养基上划平板，再滴入适量的X-gal和IPTG，挑选阳性克隆，碱裂解法提取质粒DNA，测序得到的DNA确保序列和NCBI网站一样。

四、表达质粒gp32-UvsX-PUC57的构建

(1)将上述T载体中gp32-UvsX基因片段用限制性内切酶BamH I、EcoR I酶切，形成粘性末端，2％琼脂糖凝胶电泳，回收重组gp32-UvsX基因片段。

(2)将步骤(1)重组基因片段与含有相同酶切位点的PUC57载体连接，所需反应体系如下：

以上混合物16℃反应12～14h。

(3)把步骤(2)的反应产物转化至DH5α感受态细胞，涂布四环素和氨苄青霉素LB平板上，挑选阳性克隆；然后用SDS法提取质粒，将质粒DNA用相同的内切酶剪切，确定PUC57载体质粒含有重组gp32-UvsX基因片段。

五、重组gp32-UvsX基因在大肠杆菌内的表达

(1)筛选出带有重组质粒的PUC57-gp32-UvsX基因的菌落，转接在5ml LB培养基上(含有四环素和氨苄青霉素)，37℃，摇床培养过夜培养至菌液OD值在0.7±0.1范围内。

(2)取步骤(1)的菌液5ml倒入600ml LB培养基上(含有四环素和氨苄青霉素)，按照步骤(1)的方法进行培养，至OD值在0.7±0.1范围内，向菌液内加入IPTG诱导，使其终浓度为0.8mM，继续培养5h。

(3)收集所得菌株，以12000rpm离心10min，收集沉淀，用1×TE溶解菌液，并立即加入PMSF使其终浓度是1mM，置于-20℃±5℃保存。

六、大肠杆菌重组gp32-UvsX蛋白的分离与纯化

(1)细胞破碎：先加入6ml Lysis buffer(50Mm Tris-Cl Ph8.0，0.1％Triton X-100，10％glycerol，100ug/ml lysozyme，1mM PMSF)，悬浮沉淀，将液体转移至15ml管，吹打均匀的菌液冰浴超声破碎，超声条件为：功率350W，超声1s、间隙1.5s、总共6min；。

(2)亲和纯化：采用不同百分比的咪唑洗脱蛋白，分别收集每一个峰，每个峰进行SDS-PAGE电泳鉴定，纯化结束；将亲和纯化后所得的目的上清用合适的超滤离心管超滤浓缩，5000rpm 4℃离心20-30分钟。

(3)分子筛纯化：往柱子的上端口缓慢的加入步骤(2)浓缩后的样品，分别收集每一个峰，以收集蛋白的gp32a蛋白作为示例(如图1所示)，每个峰进行SDS-PAGE电泳鉴定；将分子筛纯化后所得的目的上清用合适的超滤离心管超滤浓缩，5000rpm 4℃离心20-30分钟，再用分子筛buffer稀释4-8倍后测蛋白浓度和电泳，置于4℃冰箱保存，所得重组蛋白gp32-UvsX命名为重组蛋白gp32a，其氨基酸序列如SEQ No.9所示。

实施例2将重组gp32-UvsX基因序列进行突变

1、将gp32基因第101位碱基A变为G，第701位碱基A突变为G；以及将UvsX基因第158位碱基A突变为G，此突变交给生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将突变的序列按照实施例1中“三至六”步骤的操作获得新的重组蛋白gp32b，其氨基酸序列如SEQ No.10所示，核苷酸序列如SEQ No.6所示。

2、将gp32基因第231位碱基C突变为T，UvsX基因第318位碱基C突变为A，此突变交给生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将突变的序列按照实施例1中“三至六”步骤的操作获得新的重组蛋白gp32c，其氨基酸序列如SEQ No.11所示，核苷酸序列如SEQ No.7所示。

3、将gp32基因第244位碱基G突变为C，第418位碱基G突变为C；以及将UvsX基因第360位碱基C突变为A，此突变交给生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将突变的序列按照实施例1中“三至六”步骤的操作获得新的重组蛋白gp32d，其氨基酸序列如SEQ No.12所示，核苷酸序列如SEQ No.8所示。

将实施例1、2中获得的重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c、gp32d进行检测

1、使用BCA蛋白浓度检测法测定所得蛋白浓度，结果见表1：

表1：重组蛋白的浓度及质量

2、使用SDS-PAGE电泳进行鉴定，结果见图2：

由图2可知，重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，通过SDS-PAGE电泳结果，重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c、gp32d的在凝胶上具有明显的条带，且分子量在50～60kDa之间。

实施例3重组蛋白与DNA的结合特性

采用300ngλDNA作为模板，分别加入gp32(5-30U，最优10U)和UvsX(1-15U，最优5U)作为对照组，重组gp32a(5-20Uul)，重组gp32b(5-20U)，重组gp32c(5-20U)与重组gp32d(5-20U)，10ul小牛血清蛋白，不加任何物质(只有λDNA)，30-45℃孵育20-50min。

结果如图3所示，电泳结果显示对照组的gp32和UvsX可以与DNA结合(电泳通道1)；重组蛋白gp32a、gp32b、gp32c、gp32d(电泳通道2～5)也可以和DNA结合，使DNA的迁移速率降低；加入小牛血清蛋白与不加任何物质，电泳的迁移速率一致(电泳通道6～7)；另外在电泳孔中只加入重组蛋白，不加入DNA，在电泳通道8～11中未观察到DNA条带。

实验结果说明重组蛋白gp32a，gp32b，gp32c，gp32d与DNA可以紧密结合，形成比λDNA大得多的片段，使其不能迁出电泳槽，进一步说明人工合成的蛋白具有活性。

实施例4本发明的重组蛋白能在较低温度(恒温)下进行体外核酸扩增

常规体外核酸扩增反应体系(50ul)如下：60-90mMTris缓冲液，60-100mM醋酸钾(最优60mM)，1％-5％聚乙二醇(分子量为30000-40000,最优3％)，5-20mMATP(最优10mM)，磷酸肌酸20-50ug/ul(最优30ug/ul)，200-500mM dNTPs，40-80ng/ulUvsX蛋白(最优60ng/ul)，500-1200ng/ulgp32(最优800ng/ul)，20-80ng/ulBsu(最优50ng/ul)，50-100ng/ul核酸外切酶(最优85ng/ul)，5-30ng/ulRecQ蛋白(最优10ng/ul)，5-30mM二硫苏糖醇(最优10mM)。

较低温度(恒温)下体外核酸扩增反应体系是将上述体系中的UvsX和gp32蛋白分别替换为重组300-100ng/ulgp32a(最优500ng/ul)、300-100ng/ulgp32b(400ng/ul)、200-800ng/ulgp32c(300ng/ul)、300-100ng/ulgp32d(500ng/ul)。将其混匀，加入2ul疟原虫DNA，10-40mM醋酸镁(最优20mM)，最优反应条件为39℃、30min。

结果如图4所示，在图4中，曲线1代表在体系中加入重组gp32b；曲线2代表在体系中加入UvsX蛋白和gp32；曲线3代表在体系中加入重组gp32a；曲线4代表在体系中加入重组gp32c；曲线5代表在体系中加入重组gp32d。由图4可知，在体系中加入重组蛋白gp32b，可以和对照体系相当，说明重组gp32b蛋白同时具备gp32和UvsX蛋白的功能。

实施例5本发明的重组蛋白能在较高温度(恒温)下进行体外核酸扩增

常规体外核酸扩增反应体系(50ul)如下：60-80mM的Tris缓冲液(最优65mM)，10-35mM醋酸钠(最优20mM)，5-30mM二硫苏糖醇(最优10mM)，6％聚乙二醇，12ul Bst酶(Bst3.0DNAPolymerase)，gp32(800ng/ul)，500nM dNTPs，400nM引探混合液，20mM醋酸镁。

较高温度(恒温)下体外核酸扩增反应体系是将gp32a(20ul)、gp32c(20ul)，分别替换原有组分中的Bst和gp32，最优反应条件为60℃，20min。

结果如图5所示，在图5中，曲线1代表在体系中加入重组蛋白gp32a；曲线2代表在体系中加入Bst和gp32；曲线3代表在体系中加入重组蛋白gp32c。由图5可知，在体系中加入重组蛋白gp32a，可以和对照体系相当，说明重组蛋白gp32a同时具备gp32和Bst酶的功能。

实施例6比拟荧光定量PCR的核酸扩增技术(变温)，实现高效核酸体外扩增

扩增反应体系(50ul)如下：40-90mM的Tris缓冲液(最优65mM)，10-30mM硫酸铵(最优20mM)，5-20mM乙酸镁(最优10mM)，5-15U Taq酶(最优10U)，400mM dNTPs(最优400mM)，500nM引物混合液。

另外的反应体系是将重组蛋白5-20Ugp32c(最优8U)、5-20Ugp32d(最优8U)分别与Taq酶替换，进行qPCR扩增。

结果如图6所示，图6中曲线1代表在体系中加入重组gp32d；曲线2代表在体系中加入Taq酶；曲线3代表在体系中加入重组gp32c。由图6可知，在体系中加入重组gp32d蛋白，可以和对照体系相当，说明重组gp32d蛋白产生新的酶活位点，具备被替换酶的功能，通过重组获得的蛋白可以产生新的酶活位点，为qPCR技术带来新的革命。

由实施例4-6说明，本发明中的重组蛋白gp32a同时具备gp32和Bst酶的功能，能在较高温度下进行体外核酸扩增；重组蛋白gp32b同时具备gp32和UvsX蛋白的功能，能在较低温度下进行体外核酸扩增；重组蛋白gp32d产生了新的酶活位点，具备Taq酶的功能，能实现高效核酸体外扩增。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种重组蛋白gp32-UvsX，其特征在于，所述重组蛋白gp32-UvsX的氨基酸序列如SEQID No.9所示。

2.如权利要求1所述的重组蛋白gp32-UvsX，其特征在于，所述重组蛋白gp32-UvsX的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种重组蛋白gp32-UvsX的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将重组蛋白gp32-UvsX的基因表达片段导入载体，得到重组表达载体，所述重组基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将所述载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；

(3)对所述重组工程菌进行诱导培养后进行分离纯化，得到所述重组蛋白gp32-UvsX，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述重组蛋白gp32-UvsX的制备方法步骤(1)之前还包括以下步骤：

(1)通过PCR分别获得单独蛋白gp32与UvsX基因的片段，其中gp32的PCR正向引物如SEQID No.2所示，反向引物如SEQ ID No.3所示；UvsX的PCR正向引物如SEQ ID No.4所示，反向引物如SEQ ID No.5所示；

(2)将gp32基因与UvsX基因进行拼接，以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入正向引物和反向引物后进行PCR扩增，其正向引物如SEQ ID No.2所示，反向引物如SEQ ID No.5所示，所得PCR扩增产物即为重组蛋白gp32-UvsX的基因片段。

5.一种重组蛋白gp32-UvsX的突变体，其特征在于，所述突变体为gp32b、gp32c、或者gp32d，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。

6.如权利要求5所述的重组蛋白gp32-UvsX的突变体，其特征在于，所述突变体gp32b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述突变体gp32c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述突变体gp32d的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

7.权利要求1所述重组蛋白gp32-UvsX或权利要求5所述重组蛋白gp32-UvsX的突变体在体外核酸扩增反应体系中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，恒温PCR条件下，以突变体gp32b或者gp32d替代gp32蛋白和UvsX重组酶。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，恒温PCR条件下，以重组蛋白gp32-UvsX替代gp32蛋白和Bst酶。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR条件下，以突变体gp32d替代Taq酶。

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