CN116355931A - 一种快速分子克隆方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种基于T7 DNA聚合酶的快速不依赖于序列和连接酶的分子克隆（T7‑rSLIC）方法及应用。传统不依赖于序列和链接酶的克隆方法过程长并且步骤复杂，此方法设计简洁，成本低廉，过程简单，耗时短并且可用于多片段组装。

Description

一种快速分子克隆方法

技术领域

本发明涉及分子克隆方法，尤其是采用了T7 DNA聚合酶的不依赖于序列和连接酶的分子克隆(T7-rSLIC)方法。

背景技术

分子克隆对于生物医学、生物技术和合成生物学的研究至关重要。基于短同源末端序列的DNA体外组装是目前广泛使用的DNA组装技术。这类方法能够在体外酶促混合物中将DNA片段无缝组装到所需的环状质粒中，例如常用的Gibson组装。Gibson组装方法是在多酶混合物中利用T5核酸外切酶从5’端消化DNA片段，生成用于退火的ssDNA，利用Phusion高保真DNA聚合酶填充DNA缺口，利用Taq DNA连接酶修复DNA缺口。尽管其能够有效进行DNA克隆，但需要昂贵的酶试剂，另外反应过程较为耗时，例如一般需要在50℃条件下持续0.5-3小时。本领域仍亟需简单、快速和低成本的分子克隆方法。

发明内容

在一方面，本文提供了一种分子克隆方法，包括：

1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5’端的第一部分I5’和位于3’端的第二部分I3’，所述DNA片段II包括位于5’端的第一部分II5’和位于3’端的第二部分II3’，其中所述第二部分I3’和所述第一部分II5’包括同源序列；

2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及

3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生线性核酸分子，其中所述线性核酸分子从5’端到3’端依次包括所述第一部分I5’、所述同源序列以及所述第二部分II3’。

在一些实施方案中，所述同源序列的长度为15-25个碱基。

在一些实施方案中，所述第二部分I3’由所述同源序列和位于所述同源序列3’端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分II5’由所述同源序列和位于所述同源序列5’端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。

在一些实施方案中，所述第一冗余序列和/或第二冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。

在一些实施方案中，所述反应混合物中不包括DNA连接酶。

在一些实施方案中，所述反应混合物中还包括白蛋白。

在一些实施方案中，所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。

在另一方面，本文提供了一种分子克隆方法，包括：

1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5’端的第一部分Ia、位于3’端的第二部分Ib以及位于所述第一部分Ia和所述第二部分Ib之间的第三部分Ic， 所述DNA片段II包括位于5’端的第一部分IIa、位于3’端的第二部分IIb以及位于所述第一部分IIa和所述第二部分IIb之间的第三部分IIc，其中所述第二部分Ib和所述第一部分IIa包括第一同源序列，所述第二部分IIb和所述第一部分Ia包括第二同源序列；

2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及

3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生环形核酸分子，其中所述环形核酸分子包括依次连接的所述第三部分IIc、所述第二同源序列、所述第三部分Ic以及所述第一同源序列。

在一些实施方案中，所述第一同源序列和/或所述第二同源序列的长度为15-25个碱基。

在一些实施方案中，所述第二部分Ib由所述第一同源序列和位于所述第一同源序列3’端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分IIa由所述第一同源序列和位于所述第一同源序列5’端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。

在一些实施方案中，所述第二部分IIb由所述第二同源序列和位于所述第二同源序列3’端的第三冗余序列组成，和/或所述第一部分Ia由所述第二同源序列和位于所述第二同源序列5’端的第四冗余序列组成，其中所述第三冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第四冗余序列。

在一些实施方案中，所述第一冗余序列、第二冗余序列、第三冗余序列、和/或第四冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。

在一些实施方案中，所述反应混合物中不包括DNA连接酶。

在一些实施方案中，所述反应混合物中还包括白蛋白。

在一些实施方案中，所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。

在另一方面，本文提供了一种分子克隆方法，包括：

1) 提供三个或三个以上的DNA片段，其中待连接的任意两个DNA片段的临近末端包括同源序列；

2) 让所述DNA分子在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及

3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生组装了所述DNA片段的组装核酸分子。

在一些实施方案中，所述同源序列的长度为15-25个碱基。

在一些实施方案中，所述DNA片段在所述DNA片段在所述同源序列的末端方向还包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基的冗余序列。

在一些实施方案中，所述反应混合物中不包括DNA连接酶。

在一些实施方案中，所述反应混合物中还包括白蛋白。

在一些实施方案中，所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。

在一些实施方案中，所述组装核酸分子为线性DNA分子或环形DNA分子。

附图说明

图1本文提供的T7-rSLIC方法示意图。

图2单片段与线性化的载体骨架组装示意图。

图3通过电泳和测序显示单片段组装结果。(A) 电泳图，其中泳道M表示100 bpPlus DNA ladder；泳道1显示目的序列菌落PCR产物(2998 bp)；泳道2显示了载体骨架菌落PCR产物(阴性样本)；(B) 菌落PCR结果呈阳性的质粒测序比对结果。

图4通过电泳和测序显示单片段组装结果。(A) 电泳图，泳道M表示100 bp PlusDNA ladder；泳道1/3/6表示目的序列菌落PCR产物(1123 bp)；泳道2/4/5显示载体骨架菌落PCR产物(阴性样本)；(B) 菌落PCR结果呈阳性的质粒测序比对结果。

图5T7-rSLIC与Gibson比较结果。(A) 操作时间比较；(B) 阳性克隆数比较。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

“分子克隆”在本文中指两个或更多个DNA分子之间的连接，尤其是一个或更多个DNA片段与载体DNA分子之间的连接，任选地还可包括连接后产物(也称为组装核酸分子)的扩增，例如通过诸如PCR的扩增方法或通过引入宿主细胞后在其中复制。

“DNA片段”在本文中指待连接的(如待插入载体DNA分子中的)双链DNA分子，其本身可为任何长度。

DNA片段的“5’端”和“3’端”在本文中用于描述DNA分子中某部分序列的相对位置。应意识到，这里的“5’端”和“3’端”是对DNA片段中的一条链而言，对于其互补链来说，“5’端”和“3’端”正好位于与该“一条链”的“5’端”和“3’端”相反的位置。

当描述“位于DNA片段的5’端的某部分(如第一部分)”时，该某部分指包括5’端核苷酸在内的任意长度(但短于该DNA片段)的连续核苷酸序列。类似地，当描述“位于DNA片段的3’端的某部分(如第二部分)”时，该某部分指包括3’端核苷酸在内的任意长度(但短于该DNA片段)的连续核苷酸序列。当同时描述位于DNA片段的5’端的一部分和位于该DNA片段的3’端的另一部分时，这两部分之间可以存在重叠的序列，但优选不存在重叠的序列。

“同源序列”在本文中指在核苷酸序列上相同的DNA片段或部分。其长度优选在10-30个碱基，例如15-25个碱基，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24个碱基。

“宿主细胞”在本文中指可吸收或可引入外源核酸分子的细胞，包括真核细胞和原核细胞，例如细菌，如大肠杆菌。宿主细胞可具有DNA分子缺陷修复机制，例如进入宿主细胞内的外源核酸分子如含有缺口等缺陷时，宿主细胞可利用聚合酶和/或连接酶进行修复。但该外源核酸分子包括宿主细胞可识别的复制起点时，该外源核酸分子可在该宿主细胞中复制扩增。

本发明至少部分地基于发明人意外发现，在T7 DNA聚合酶存在下，末端具有同源序列的两DNA片段经T7 DNA聚合酶处理后引入宿主细胞，可组装为单一DNA分子；末端依次具有同源序列的多个DNA片段也可组装为单一DNA分子；两末端具有同源序列的单一DNA分子则可形成环形DNA分子。在一些实施方案中，同源序列位于待组装DNA片段的末端，即同源序列包括末端核苷酸。在另一些实施方案中，同源序列不位于待组装DNA片段的末端，例如与末端核苷酸有数个或数十个核苷酸(例如，1、5、10、20、30或更多核苷酸)距离。这种情况下，所形成的组装分子不包括该末端核苷酸到同源序列之间的核苷酸序列，即冗余末端碱基(或称为冗余序列)。在提及冗余序列时，所用的术语“末端方向”指同源序列所靠近的一末端(如3’或5’端)的方向。例如在所提及的同源序列相对位于一DNA片段的3’末端时，则末端方向指3’方向；在所提及的同源序列相对位于一DNA片段的5’末端时，则 末端方向指5’方向。在至少一个待组装片段具有复制起点的情况下，培养宿主细胞后，可获得该组装分子的扩增产物。在该过程中，DNA片段的组装不依赖于具体的序列，也不使用连接酶，发明人将其命名为T7-rSLIC分子克隆方法。

该方法的组装过程和原理可参见图1。具有同源序列的两DNA片段在T7 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性作用下均产生5’端突出，其带有同源序列产生的粘性末端，随后将反应产物引入细菌中，利用细菌自身的DNA同源重组和缺口修复机制形成单一DNA分子。

该方法相对于Gibson组装方法更为省时便捷。

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。

实验方法

1. 实验材料及设计

1.1 材料

LB液体培养基（无抗生素），北京擎科生物科技有限公司

LB液体培养基（Amp 100 µg/mL），北京擎科生物科技有限公司

LB琼脂培养基平皿（Amp 100 µg/ mL），北京擎科生物科技有限公司

2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司

Trans5α化学感受态工程菌，北京全式金生物技术有限公司

SOC培养基（无抗生素），北京全式金生物技术有限公司

高纯度质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司

T7 DNA聚合酶，New England Biolabs

限制性内切酶，New England Biolabs

重组白蛋白, 分子生物学级（10×，不含动物成分），New England Biolabs

琼脂糖，分子生物学级，Biowest

100 bp Plus DNA ladder，Biomed

1.2 实验方法

a. 分子克隆设计，如图2所示，T7-rSLIC设计方法如下：

1) 在材料载体上选择合适的限制性内切酶位点，确定载体骨架序列；

2) 基于载体骨架序列，按照预期的插入方向及顺序，在需要被插入的片段两段增加长度为20~40 bp的同源重组序列；

3) 利用材料载体，通过酶切、DNA片段回收获得克隆所需载体骨架片段；

4) 通过基因合成、PCR或酶切方法，获得克隆所需插入片段。

b. 分子克隆反应体系：

1) 利用T7 DNA聚合酶、10×重组白蛋白溶液，配制10×T7 DNA聚合酶Mix；

2) 分子克隆反应体系配置如下表所示，最终使T7 DNA聚合酶的浓度在0.05~0.3U/μL之间。

c. 操作步骤：

1) 按照b中所述配制反应体系；

2) 将配制好并混合均匀的反应混合物置于37 ℃，放置2 min；

3) 将反应混合物放回冰上，冷却2 min；

4) 取5 μL反应混合物，与50 μL Trans5α感受态工程菌充分混合，于冰上静置5min；

5) 将加入了反应混合物的Trans5α感受态工程菌置于42 ℃，热激45 s；

6) 将完成热激的Trans5α感受态工程菌放回冰上，静置冷却2-10 min；

7) 向转化产物中加入200~400 μL SOC无抗性培养基，37 ℃，220 rpm复苏30min；

8) 将复苏后的转化产物均匀涂于带有抗生素的LB琼脂培养基平皿上，于37 ℃培养箱中倒置培养14~18 h；

9) 用无菌牙签挑取阳性单菌落，进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶电泳初步判断克隆是否成功；

10) 将菌落PCR阳性的单菌落进行过夜培养及质粒小提，通过DNA测序及比对确认目的片段是否成功插入。

实施例1单片段组装

本实施例描述单片段组装过程。

1.1 载体骨架制备：长度为4322 bp的材料质粒经过EcoRV单酶切线性化获得（线性化后的材料质粒序列（其中粗体碱基表示冗余末端碱基，小写斜体表示同源重组序列，带有下划线的表示插入序列，下文序列也以类似方式表示）：

ATCatgctttatttgtgaaaTTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCTTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTGTTGGAAGGGGAAAGGAGTATTTAAAGTGATGGAGGAGAGGAGCTCAAGATGGCTGAGATCTGGGCCTGTCCAACATTGAGAAATTTGGGAGGGGAGCCATCAAAGAAGCCTGGGAGCAGCAGTTCCAGGGAAAAAGGAGAATGTGATGGCCAGAGAGCCAAAAGAAAAAGTAGTTGAAGGAGTGCTCAGCACTAGGCATCTGAACTGAATGCTGTGGCAGGCTCACTGGCCACAAACAATAGGGAGCTGGTGGAGGCCTTGACGAGGACCATTTCAACAAACTGGTGGGCTTAAAATCCGGAAGAAACAGTTGAACAAATCATTTTGACGCCTTTTATAAACCACACAAGCTTATTCCAAACCCGTTACTGGCCTAACTGATTTAAGTCCCTTTCCCATCTGATCCTCAGAGATTCTAAGGGACTTAGCCTATCCATGACTCTTCGTCCTGCTTCTCACCTCCCATGATTGCCCTAACGATGTGAAAGTGCTTTCAAACAAAGATGCCCAAGAAAGAAGGTAGGCAAATGTGCAAGCATTAGTTTGTAGTACGCTATTACTGTATTTCACCTTGCACTCTCTAGTTTCCTTCGTGCTCCCTCAATATCCAACTCTTAATAAATTCATGGCTCCCGGTGAGCATTCATCAATTCTCATTCCACGCCTTTAGCCCTTCCCGTTCCCGCCCAACTCTCGCTCCCTCCCCTGGCCAAATCTCTAACCTGCAAGGCTAATTCCGAATTCCAAATCGGAAGCAAGAGGGCGGGGCCCCGTGAGAGGCGATGGATTGCTCCAGTCCGTTCCCGACGCACTGTGCGCATGCGCTGGTCCTCCGCGGACCGTTCGTGCTGCCCGCCTAGAAAGGGTGAAGTGGTTGTTTCCGTGACGGACTGAGTACGGGTGCCTGTCAGGCTCTTGCGGAAGTCCATGCGCCATTGGGAGGGCCTCGGCCGCGGCTCTGTGCCCTTGCTGCTGAGGGCCACTTCCTGGGTCATTCCTGGACCGGGAGCCGGGCTGGGGCTCACACGGGGGCTCCCGCGTGGCCGTCTCGGCGCCTGCGTGACCTCCCCGCCGGCGGGATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCTGGTAAGTGCAGGCTCTAATCTGGCCCCGTTAATTCTGGGGCCTCTTGAGAGTGGGGCTGTCTTATCTCTATCTCCAAAAATGTGCAGGTGACTCTCAGGCCGTATGGGGCTGTGTTTCCTTTAGTATATTGCTCTTTTAATGTCATTTCCTTTGTACTGTTACCCTCTCTGATCTTTCTTCcatattcatttttctttcagAT）(SEQ ID NO: 1)

1.2 插入片段制备：用PCR的方法从DNA模板中获得带有上/下游重组同源序列的插入片段，片段长度为2883 bp；上游同源重组序列：CATATTCATTTTTCTTTCAG (SEQ ID NO:2)；下游同源重组序列：ATGCTTTATTTGTGAAA (SEQ ID NO: 3)；

通过实验方法部分描述的过程制备带有插入片段的目的质粒。

目的质粒全序列：

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTGTTGGAAGGGGAAAGGAGTATTTAAAGTGATGGAGGAGAGGAGCTCAAGATGGCTGAGATCTGGGCCTGTCCAACATTGAGAAATTTGGGAGGGGAGCCATCAAAGAAGCCTGGGAGCAGCAGTTCCAGGGAAAAAGGAGAATGTGATGGCCAGAGAGCCAAAAGAAAAAGTAGTTGAAGGAGTGCTCAGCACTAGGCATCTGAACTGAATGCTGTGGCAGGCTCACTGGCCACAAACAATAGGGAGCTGGTGGAGGCCTTGACGAGGACCATTTCAACAAACTGGTGGGCTTAAAATCCGGAAGAAACAGTTGAACAAATCATTTTGACGCCTTTTATAAACCACACAAGCTTATTCCAAACCCGTTACTGGCCTAACTGATTTAAGTCCCTTTCCCATCTGATCCTCAGAGATTCTAAGGGACTTAGCCTATCCATGACTCTTCGTCCTGCTTCTCACCTCCCATGATTGCCCTAACGATGTGAAAGTGCTTTCAAACAAAGATGCCCAAGAAAGAAGGTAGGCAAATGTGCAAGCATTAGTTTGTAGTACGCTATTACTGTATTTCACCTTGCACTCTCTAGTTTCCTTCGTGCTCCCTCAATATCCAACTCTTAATAAATTCATGGCTCCCGGTGAGCATTCATCAATTCTCATTCCACGCCTTTAGCCCTTCCCGTTCCCGCCCAACTCTCGCTCCCTCCCCTGGCCAAATCTCTAACCTGCAAGGCTAATTCCGAATTCCAAATCGGAAGCAAGAGGGCGGGGCCCCGTGAGAGGCGATGGATTGCTCCAGTCCGTTCCCGACGCACTGTGCGCATGCGCTGGTCCTCCGCGGACCGTTCGTGCTGCCCGCCTAGAAAGGGTGAAGTGGTTGTTTCCGTGACGGACTGAGTACGGGTGCCTGTCAGGCTCTTGCGGAAGTCCATGCGCCATTGGGAGGGCCTCGGCCGCGGCTCTGTGCCCTTGCTGCTGAGGGCCACTTCCTGGGTCATTCCTGGACCGGGAGCCGGGCTGGGGCTCACACGGGGGCTCCCGCGTGGCCGTCTCGGCGCCTGCGTGACCTCCCCGCCGGCGGGATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCTGGTAAGTGCAGGCTCTAATCTGGCCCCGTTAATTCTGGGGCCTCTTGAGAGTGGGGCTGTCTTATCTCTATCTCCAAAAATGTGCAGGTGACTCTCAGGCCGTATGGGGCTGTGTTTCCTTTAGTATATTGCTCTTTTAATGTCATTTCCTTTGTACTGTTACCCTCTCTGATCTTTCTTCcatattcattt ttctttcag TGAGGTCTGCCAGTCTTTAGTGAAACACAGCTCTGGAATAAAAGGAAGTTTACCACTACAAAAACTA CATCTGGTTTCACGAAGCATTTATCATTCACATCATCCTACCTTAAAGCTTCAACGACCCCAATTAAGGACATCCT TTCAGCAGTTCTCTTCTCTGACAAACCTTCCTTTACGTAAACTGAAATTCTCTCCAATTAAATATGGCTACCAGCC TCGCAGGAATTTTTGGCCAGCAAGATTAGCTACGAGACTCTTAAAACTTCGCTATCTCATACTAGGATCGGCTGTT GGGGGTGGCTACACAGCCAAAAAGACTTTTGATCAGTGGAAAGATATGATACCGGACCTTAGTGAATATAAATGGA TTGTGCCTGACATTGTGTGGGAAATTGATGAGTATATCGATTTTGAGAAAATTAGAAAAGCCCTTCCTAGTTCAGA AGACCTTGTAAAGTTAGCACCAGACTTTGACAAGATTGTTGAAAGCCTTAGCTTATTGAAGGACTTTTTTACCTCA GGTTCTCCGGAAGAAACGGCGTTTAGAGCAACAGATCGTGGATCTGAAAGTGACAAGCATTTTAGAAAGGTGTCAG ACAAAGAGAAAATTGACCAACTTCAGGAAGAACTTCTGCACACTCAGTTGAAGTATCAGAGAATCTTGGAACGATT AGAAAAGGAGAACAAAGAATTGAGAAAATTAGTATTGCAGAAAGATGACAAAGGCATTCATCATAGAAAGCTTAAG AAATCTTTGATTGACATGTATTCTGAAGTTCTTGATGTTCTCTCTGATTATGATGCCAGTTATAATACGCAAGATC ATCTGCCACGGGTTGTTGTGGTTGGAGATCAGAGTGCTGGAAAGACTAGTGTGTTGGAAATGATTGCCCAAGCTCG AATATTCCCAAGAGGATCTGGGGAGATGATGACACGTTCTCCAGTTAAGGTGACTCTGAGTGAAGGTCCTCACCAT GTGGCCCTATTTAAAGATAGTTCTCGGGAGTTTGATCTTACCAAAGAAGAAGATCTTGCAGCATTAAGACATGAAA TAGAACTTCGAATGAGGAAAAATGTGAAAGAAGGCTGTACCGTTAGCCCTGAGACCATATCCTTAAATGTAAAAGG CCCTGGACTACAGAGGATGGTGCTTGTTGACTTACCAGGTGTGATTAATACTGTGACATCAGGCATGGCTCCTGAC ACAAAGGAAACTATTTTCAGTATCAGCAAAGCTTACATGCAGAATCCTAATGCCATCATACTGTGTATTCAAGATG GATCTGTGGATGCTGAACGCAGTATTGTTACAGACTTGGTCAGTCAAATGGACCCTCATGGAAGGAGAACCATATT CGTTTTGACCAAAGTAGACCTGGCAGAGAAAAATGTAGCCAGTCCAAGCAGGATTCAGCAGATAATTGAAGGAAAG CTCTTCCCAATGAAAGCTTTAGGTTATTTTGCTGTTGTAACAGGAAAAGGGAACAGCTCTGAAAGCATTGAAGCTA TAAGAGAATATGAAGAAGAGTTTTTTCAGAATTCAAAGCTCCTAAAGACAAGCATGCTAAAGGCACACCAAGTGAC TACAAGAAATTTAAGCCTTGCAGTATCAGACTGCTTTTGGAAAATGGTACGAGAGTCTGTTGAACAACAGGCTGAT AGTTTCAAAGCAACACGTTTTAACCTTGAAACTGAATGGAAGAATAACTATCCTCGCCTGCGGGAACTTGACCGGA ATGAACTATTTGAAAAAGCTAAAAATGAAATCCTTGATGAAGTTATCAGTCTGAGCCAGGTTACACCAAAACATTG GGAGGAAATCCTTCAACAATCTTTGTGGGAAAGAGTATCAACTCATGTGATTGAAAACATCTACCTTCCAGCTGCG 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atgctttatttgtgaaaTTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCTTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT (SEQ ID NO: 4)。

克隆结果如图3A和3B所示。

图3A中，泳道1的2998 bp条带是以目的质粒为模板，使用下列引物对进行扩增的PCR产物，长度符合预期；泳道2为使用1.1中线性化载体骨架作为模板，使用相同引物对进行扩增的PCR产物，没有得到扩增片段，符合预期：

F：GTCATTTCCTTTGTACTG (SEQ ID NO: 5)；

R：ATGCAATTGTTGTTGTTA (SEQ ID NO: 6)；

图3B中展示了对插入片段全长的Sanger测序结果，序列比对结果表明目的质粒片段与预期完全一致，说明成功获得了目的质粒。

实施例2 多片段组装

2.1 载体骨架制备：长度为4200 bp的材料质粒经过AgeI、XbaI双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收3850 bp片段（回收片段序列：

CCGGTGCCACCatggtgtctaagggcgaagaGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAAAACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAGCGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTGAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACAGAAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTTAATTAAGAATTCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGAAGCCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAggggttcctgcggcctctag）(SEQ ID NO: 7)。

2.2 插入片段制备：3个插入片段均来自以pUC57为插入骨架的基因合成及亚克隆产物，通过EcoRI、XmaI双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳胶回收获得；

待插入片段信息：

a片段全序列：

AATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAgggttcctgcggcctctag AGATCTCCAGATGGCTA AACTTTTAAATCATGAATGAAGTAGATATTACCAAATTGCTTTTTCAGCATCCATTTAGATAATCATGTTTTTTGC CTTTAATCTGTTAATGTAGTGAATTACAGAAATACATTTCCTAAATCATTACATCCCCCAAATCGTTAATCTGCTA AAGTACATCTCTGGCTCAAACAAGACTGGTTGACCGGTTAAAGGCAGTCTAGGGGAGAAGCAGACCCAGGGAGTCA GAGAGGCAGAGAGAGAAGAGAGCCCTTCCTCCACTCTCAAGCTCTGGAGGGGGTCTCTGCCCTCACCCTCATCCCT CCCCAGAATCCTTAAATCCTCTAGACTGTAGCTCTGATTTTACAGCTGTCACAGACTCGTCCTACTAGCCAGAGGT TGGCTCAGGTAAGCACCACTGGGGAGGTAGCCTAGGGTGCGCTGGGGTGGGTCCAGAGGAAGAGCTGCCCAGAACT GTGGGGGAAGGAGCGGGACCGACCATCAACAGGGGGACTTTTCAGGGAGAATGAGAGCAATCCTCTGGAGGCCTGG GAGAGGCTGCTGAGTTGCTGGTGCGCGAGTCACCAACTTTTCCTGCGCTCTCGGTGTCCGGCCAGAATCCCGAAGT GGCAGCTGAGCACGGGGTGGCAGCTTCGTCCGCCGGCTCTCAAGGCGTCCCGGTAACTTCCTTTCCCGCAGTCCAG GAGCACTCT ggctaactctcgaggccaccGGATCCCGG(SEQ ID NO: 8)；

长度：790 bp；

上游同源重组序列：GGGTTCCTGCGGCCTCTAGA (SEQ ID NO: 9)；

下游同源重组序列：GGCTAACTCTCGAGGCCACC (SEQ ID NO: 10)；

b片段全序列：

AATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAggctaactctcgaggccacc ATGGGCTGTACCCTGT CTGCCGAGGAACGCGCCGCCCTGGAAAGATCTAAGGCCATCGAAAAGAACCTGAAGGAGGATGGCATCAGCGCCGC CAAAGATGTGAAACTGCTGCTTCTCGGCGCGGGCGAGTCTGGTAAATCCACCATCGTGAAGCAGATGAAAATTATC CACGAGGACGGATTTAGCGGAGAAGATGTGAAGCAATACAAGCCTGTGGTGTACAGCAACACCATCCAGAGCCTGG CCGCTATCGTGCGGGCCATGGACACCCTGGGCATCGAGTATGGCGATAAGGAAAGAAAGGCCGACGCCAAGATGGT GTGCGACGTGGTGTCCAGGATGGAAGATACAGAGCCCTTCAGCGCCGAGCTGCTGTCAGCTATGATGAGACTGTGG GGCGACAGCGGCATCCAGGAGTGCTTCAACCGGTCCAGAGAGTATCAGCTCAACGACTCTGCTAAGTACTACCTGG ATAGCCTGGACAGAATCGGCGCTGCCGACTACCAGCCTACCGAGCAGGACATCCTGAGAACCAGAGTGAAGACCAC CGGCATCGTGGAAACACACTTCACCTTCAAGAATCTGCACTTCCGGCTGTTCGACGTTGGCGGACAGCGGAGCGAG CGGAAGAAGTGGATCCACTGTTTTGAGGACGTGACCGCCATCATTTTCTGCGTGGCTCTGAGCGGCTACGACCAGG TGCTGCACGAGGACGAGACAACAAACAGAATGCATGAAAGCCTGATGCTGTTCGACAGCATCTGTAACAACAAGTT CTTCATCGATACCAGCATCATCCTGTTTCTGAACAAAAAAGACCTGTTCGGCGAAAAGATCAAGAAGTCTCCACTG ACAATCTGCTTCCCCGAGTACACCGGACCTAATACCTACGAGGACGCCGCCGCCTACATCCAGGCCCAGTTCGAGA GCAAGAACAGAAGCCCTAACAAGGAAATCTACTGCCACATGACATGCGCCACCGACACTAACAATATCCAAGTCGT CTTTGATGCCGTGACAGATATCATCATCAAGGAAAACC tgaaggactgcggcctgttcGGATCCCGG(SEQ IDNO: 11)；

长度：1123 bp；

上游同源重组序列：GGCTAACTCTCGAGGCCACC (SEQ ID NO: 10)；

下游同源重组序列：TGAAGGACTGCGGCCTGTTC (SEQ ID NO: 12)；

c片段全序列：

AATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAtgaaggactgcggcctgttc AGAAAACGGAGAGGAA GCGGCGAGGGCAGGGGCTCCCTGCTGACCTGTGGCGATGTGGAAGAAAATCCTGGCCCTATGAACGGCACAGAGGG CCCTAATTTTTACGTGCCCTTCAGCAACGCCACCGGCGTGGTGAGAAGCCCTTTCGAGTACCCCCAGTACTACCTG GCCGAGCCTTGGCAGTTTAGCATGCTGGCCGCCTACATGTTCCTGCTGATCGTGCTGGGATTTCCAATCAACTTCC TCACCCTGTATGTGACCGTGCAACACAAGAAACTGCGGACACCTCTGAATTACATCCTGCTGAACCTGGCCGTGGC CGACCTGTTCATGGTGCTGGGAGGCTTCACCAGCACCCTGTACACCTCTCTGCACGGATACTTCGTGTTCGGCCCA ACAGGCTGCAACCTGGAAGGCTTCTTCGCCACACTGGGCGGCGAAATTGCCCTGTGGAGCTTGGTGGTGCTGGCCA TCGAGAGATATGTTGTGGTCTGCAAGCCCATGAGCAATTTCAGATTCGGCGAGAACCACGCCATCATGGGCGTGGC TTTTACATGGGTGATGGCTCTGGCTTGTGCCGCCCCTCCACTGGCAGGCTGGTCTAGATACATCCCCGAGGGCCTG CAATGTTCCTGCGGCATCGACTACTACACCCTGAAGCCTGAGGTGAACAACGAGAGCTTCGTGATTTATATGTTCG TGGTTCATTTCACCATCCCTATGATCATCATCTTCTTCTGCTACGGCCAGCTGGTGTTCACCGTGAAGGAAGCCGC TGCCCAGCAGCAGGAGTCTGCCACCACACAGAAGGCCGAGAAGGAAGTGACCAGAATGGTTATCATCATGGTCATC GCCTTCCTGATCTGCTGGGTCCCTTACGCCAGCGTGGCCTTCTACATCTTCACCCACCAGGGCAGCAACTTTGGAC CTATCTTTATGACAATCCCCGCCTTTTTCGCTAAGAGCGCCGCTATCTACAACCCTGTGATCTACATCATGATGAA CAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTGACAACAATCTGCTGCGGAAAAAACCCCCTGGGGGATGACGAGGCTTCTGCC ACCGTGTCCAAGACCGAAACCAGCCAGGTGGCCCCTGCCAGAAAGAGACGGGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGATCCC TGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAAAACCCCGGCCCA atggtgtctaagggcgaagaGGATCCCGG(SEQ IDNO: 13)；

长度：1275 bp；

上游同源重组序列：TGAAGGACTGCGGCCTGTTC (SEQ ID NO: 12)；

下游同源重组序列：ATGGTGTCTAAGGGCGAAGA (SEQ ID NO: 14)。

通过实验方法部分描述的过程制备带有插入片段的目的质粒。

目的质粒全序列：

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGgggttcctgcggcctctaga GA TCTCCAGATGGCTAAACTTTTAAATCATGAATGAAGTAGATATTACCAAATTGCTTTTTCAGCATCCATTTAGATA ATCATGTTTTTTGCCTTTAATCTGTTAATGTAGTGAATTACAGAAATACATTTCCTAAATCATTACATCCCCCAAA TCGTTAATCTGCTAAAGTACATCTCTGGCTCAAACAAGACTGGTTGACCGGTTAAAGGCAGTCTAGGGGAGAAGCA GACCCAGGGAGTCAGAGAGGCAGAGAGAGAAGAGAGCCCTTCCTCCACTCTCAAGCTCTGGAGGGGGTCTCTGCCC TCACCCTCATCCCTCCCCAGAATCCTTAAATCCTCTAGACTGTAGCTCTGATTTTACAGCTGTCACAGACTCGTCC TACTAGCCAGAGGTTGGCTCAGGTAAGCACCACTGGGGAGGTAGCCTAGGGTGCGCTGGGGTGGGTCCAGAGGAAG AGCTGCCCAGAACTGTGGGGGAAGGAGCGGGACCGACCATCAACAGGGGGACTTTTCAGGGAGAATGAGAGCAATC CTCTGGAGGCCTGGGAGAGGCTGCTGAGTTGCTGGTGCGCGAGTCACCAACTTTTCCTGCGCTCTCGGTGTCCGGC CAGAATCCCGAAGTGGCAGCTGAGCACGGGGTGGCAGCTTCGTCCGCCGGCTCTCAAGGCGTCCCGGTAACTTCCT TTCCCGCAGTCCAGGAGCACTCT ggctaactctcgaggccacc ATGGGCTGTACCCTGTCTGCCGAGGAACGCGCC GCCCTGGAAAGATCTAAGGCCATCGAAAAGAACCTGAAGGAGGATGGCATCAGCGCCGCCAAAGATGTGAAACTGC TGCTTCTCGGCGCGGGCGAGTCTGGTAAATCCACCATCGTGAAGCAGATGAAAATTATCCACGAGGACGGATTTAG CGGAGAAGATGTGAAGCAATACAAGCCTGTGGTGTACAGCAACACCATCCAGAGCCTGGCCGCTATCGTGCGGGCC ATGGACACCCTGGGCATCGAGTATGGCGATAAGGAAAGAAAGGCCGACGCCAAGATGGTGTGCGACGTGGTGTCCA GGATGGAAGATACAGAGCCCTTCAGCGCCGAGCTGCTGTCAGCTATGATGAGACTGTGGGGCGACAGCGGCATCCA GGAGTGCTTCAACCGGTCCAGAGAGTATCAGCTCAACGACTCTGCTAAGTACTACCTGGATAGCCTGGACAGAATC GGCGCTGCCGACTACCAGCCTACCGAGCAGGACATCCTGAGAACCAGAGTGAAGACCACCGGCATCGTGGAAACAC ACTTCACCTTCAAGAATCTGCACTTCCGGCTGTTCGACGTTGGCGGACAGCGGAGCGAGCGGAAGAAGTGGATCCA CTGTTTTGAGGACGTGACCGCCATCATTTTCTGCGTGGCTCTGAGCGGCTACGACCAGGTGCTGCACGAGGACGAG ACAACAAACAGAATGCATGAAAGCCTGATGCTGTTCGACAGCATCTGTAACAACAAGTTCTTCATCGATACCAGCA TCATCCTGTTTCTGAACAAAAAAGACCTGTTCGGCGAAAAGATCAAGAAGTCTCCACTGACAATCTGCTTCCCCGA GTACACCGGACCTAATACCTACGAGGACGCCGCCGCCTACATCCAGGCCCAGTTCGAGAGCAAGAACAGAAGCCCT AACAAGGAAATCTACTGCCACATGACATGCGCCACCGACACTAACAATATCCAAGTCGTCTTTGATGCCGTGACAG ATATCATCATCAAGGAAAACC tgaaggactgcggcctgttc AGAAAACGGAGAGGAAGCGGCGAGGGCAGGGGCTC CCTGCTGACCTGTGGCGATGTGGAAGAAAATCCTGGCCCTATGAACGGCACAGAGGGCCCTAATTTTTACGTGCCC TTCAGCAACGCCACCGGCGTGGTGAGAAGCCCTTTCGAGTACCCCCAGTACTACCTGGCCGAGCCTTGGCAGTTTA GCATGCTGGCCGCCTACATGTTCCTGCTGATCGTGCTGGGATTTCCAATCAACTTCCTCACCCTGTATGTGACCGT GCAACACAAGAAACTGCGGACACCTCTGAATTACATCCTGCTGAACCTGGCCGTGGCCGACCTGTTCATGGTGCTG GGAGGCTTCACCAGCACCCTGTACACCTCTCTGCACGGATACTTCGTGTTCGGCCCAACAGGCTGCAACCTGGAAG GCTTCTTCGCCACACTGGGCGGCGAAATTGCCCTGTGGAGCTTGGTGGTGCTGGCCATCGAGAGATATGTTGTGGT CTGCAAGCCCATGAGCAATTTCAGATTCGGCGAGAACCACGCCATCATGGGCGTGGCTTTTACATGGGTGATGGCT CTGGCTTGTGCCGCCCCTCCACTGGCAGGCTGGTCTAGATACATCCCCGAGGGCCTGCAATGTTCCTGCGGCATCG ACTACTACACCCTGAAGCCTGAGGTGAACAACGAGAGCTTCGTGATTTATATGTTCGTGGTTCATTTCACCATCCC TATGATCATCATCTTCTTCTGCTACGGCCAGCTGGTGTTCACCGTGAAGGAAGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCT GCCACCACACAGAAGGCCGAGAAGGAAGTGACCAGAATGGTTATCATCATGGTCATCGCCTTCCTGATCTGCTGGG TCCCTTACGCCAGCGTGGCCTTCTACATCTTCACCCACCAGGGCAGCAACTTTGGACCTATCTTTATGACAATCCC CGCCTTTTTCGCTAAGAGCGCCGCTATCTACAACCCTGTGATCTACATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGC ATGCTGACAACAATCTGCTGCGGAAAAAACCCCCTGGGGGATGACGAGGCTTCTGCCACCGTGTCCAAGACCGAAA CCAGCCAGGTGGCCCCTGCCAGAAAGAGACGGGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGATCCCTGCTGACCTGCGGCGACGT GGAAGAAAACCCCGGCCCA 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(SEQ IDNO: 15)。

结果如图4A和4B所示。以挑取的多个阳性菌落为模板，使用下列引物对进行扩增得到的PCR产物，其中能够得到长度为1123 bp的泳道可初步判定为正确的构建产物(图4A)，并进行Sanger测序：

F：GCAGTCCAGGAGCACTC (SEQ ID NO: 16)；

R：TCGCCGCTTCCTCTCCG (SEQ ID NO: 17)。

测序结果显示：长度分别为790 bp、1123 bp及1275 bp的三个插入片段片段按照预先设计的方案，按照正确的插入顺序及方向与载体骨架完成了分子组装，在每个发生DNA同源重组的位点均为精确重组，没有发生碱基突变、删除或插入，获得了与预期完全一致的克隆产物(图4B)。

实施例3 与Gibson Assembly比较

1) 载体单酶切：由于Gibson Assembly试剂中含有Taq DNA连接酶，所以在反应过程中会导致单酶切获得载体骨架的粘性末端自连，产生假阳性结果，因此不适合用于单酶切制备载体骨架的分子构建实验；T7-rSLIC试剂中不含有任何DNA连接酶成分，能够排除载体骨架自连造成的假阳性干扰，因此可以用于单酶切制备载体骨架的分子构建实验。

2) 载体双酶切

T7-rSLIC法与Gibson拼装法的性能比较：将分别使用T7 DNA聚合酶法和Gibson拼装法完成的同方案分子克隆实验结果进行统计学分析， p≥0.5，ns；p<0.5，*；p<0.05，**；n≥3。统计结果显示，T7-rSLIC法在单、多片段插入的分子克隆实验中，操作耗时均显著低于Gibson拼装法，是相对更为省时便捷的克隆方法。此外，T7-rSLIC法在单、多片段插入的分子克隆实验中均能获得阳性克隆，其中单片段插入实验中获得的阳性菌落数低于Gibson拼装法，三片段插入实验中获得的阳性菌落数与Gibson拼装法相比没有显著差异。综上，T7-rSLIC法在单、多片段分子克隆实验中均能有效获得阳性产物，且在多片段插入实验中具有与Gibson拼装法相近的反应效率（如图5A和5B所示）。

Claims (22)

1.分子克隆方法，包括：

1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5’端的第一部分I5’和位于3’端的第二部分I3’，所述DNA片段II包括位于5’端的第一部分II5’和位于3’端的第二部分II3’，其中所述第二部分I3’和所述第一部分II5’包括同源序列；

2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及

3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生线性核酸分子，其中所述线性核酸分子从5’端到3’端依次包括所述第一部分I5’、所述同源序列以及所述第二部分II3’。

2.如权利要求1所述的分子克隆方法，其中所述同源序列的长度为15-25个碱基。

3.如权利要求1或2所述的分子克隆方法，其中所述第二部分I3’由所述同源序列和位于所述同源序列3’端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分II5’由所述同源序列和位于所述同源序列5’端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。

4.如权利要求3所述的分子克隆方法，其中所述第一冗余序列和/或第二冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。

5.如权利要求1所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中不包括DNA连接酶。

6.如权利要求3所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中还包括白蛋白。

7. 如权利要求4所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。

8.分子克隆方法，包括：

1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5’端的第一部分Ia、位于3’端的第二部分Ib以及位于所述第一部分Ia和所述第二部分Ib之间的第三部分Ic， 所述DNA片段II包括位于5’端的第一部分IIa、位于3’端的第二部分IIb以及位于所述第一部分IIa和所述第二部分IIb之间的第三部分IIc，其中所述第二部分Ib和所述第一部分IIa包括第一同源序列，所述第二部分IIb和所述第一部分Ia包括第二同源序列；

2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及

3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生环形核酸分子，其中所述环形核酸分子包括依次连接的所述第三部分IIc、所述第二同源序列、所述第三部分Ic以及所述第一同源序列。

9.如权利要求8所述的分子克隆方法，其中所述第一同源序列和/或所述第二同源序列的长度为15-25个碱基。

10.如权利要求8所述的分子克隆方法，其中所述第二部分Ib由所述第一同源序列和位于所述第一同源序列3’端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分IIa由所述第一同源序列和位于所述第一同源序列5’端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。

11.如权利要求8所述的分子克隆方法，其中所述第二部分IIb由所述第二同源序列和位于所述第二同源序列3’端的第三冗余序列组成，和/或所述第一部分Ia由所述第二同源序列和位于所述第二同源序列5’端的第四冗余序列组成，其中所述第三冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第四冗余序列。

12.如权利要求10或11所述的分子克隆方法，其中所述第一冗余序列、第二冗余序列、第三冗余序列、和/或第四冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。

13.如权利要求8所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中不包括DNA连接酶。

14.如权利要求8所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中还包括白蛋白。

15. 如权利要求8所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。

16.分子克隆方法，包括：

1) 提供三个或三个以上的DNA片段，其中待连接的任意两个DNA片段的临近末端包括同源序列；

2) 让所述DNA分子在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及

3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生组装了所述DNA片段的组装核酸分子。

17.如权利要求16所述的分子克隆方法，其中所述同源序列的长度为15-25个碱基。

18.如权利要求16所述的分子克隆方法，其中所述DNA片段在所述DNA片段在所述同源序列的末端方向还包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基的冗余序列。

19.如权利要求16所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中不包括DNA连接酶。

20.如权利要求16所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中还包括白蛋白。

21. 如权利要求16所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。

22.如权利要求16所述的分子克隆方法，其中所述组装核酸分子为线性DNA分子或环形DNA分子。

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