CN114438073A - 一种噬菌体酶辅助的体内dna片段组装方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种噬菌体酶辅助的体内dna片段组装方法、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114438073A CN114438073A CN202111601141.5A CN202111601141A CN114438073A CN 114438073 A CN114438073 A CN 114438073A CN 202111601141 A CN202111601141 A CN 202111601141A CN 114438073 A CN114438073 A CN 114438073A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- assembly
- exonuclease
- vivo
- reca
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 claims abstract description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 23
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 6
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims abstract description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 55
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 55
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 claims description 29
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 5
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 abstract description 6
- 102000009788 Exodeoxyribonucleases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010009832 Exodeoxyribonucleases Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 241000320117 Pseudomonas putida KT2440 Species 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 4
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 4
- 244000185256 Lactobacillus plantarum WCFS1 Species 0.000 description 4
- 235000011227 Lactobacillus plantarum WCFS1 Nutrition 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 241000201640 Yarrowia lipolytica PO1f Species 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 2
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 2
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 description 1
- SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrate Chemical compound O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 101710156804 DNA ligase A Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101150104425 T4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150049604 T5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 101100215634 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) XPR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000673 dextrose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010011035 endodeoxyribonuclease DpnI Proteins 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y605/00—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5)
- C12Y605/01—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5) forming phosphoric ester bonds (6.5.1)
- C12Y605/01001—DNA ligase (ATP) (6.5.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y605/00—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5)
- C12Y605/01—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5) forming phosphoric ester bonds (6.5.1)
- C12Y605/01002—DNA ligase (NAD+) (6.5.1.2)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用，属于合成生物学技术领域。本发明通过组合表达噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶，报告了一种有效的体内DNA组装方法。在测试了来自不同噬菌体的各种DNA外切酶和连接酶后，最终确定T5DNA外切酶与T4DNA连接酶组合在所有组合中具有最佳的体内DNA组装效率。该方法不仅能够在大肠杆菌细胞中组装短至5bp的同源序列的DNA片段，还可以用于其他细菌，如假单胞菌、乳杆菌、产碱杆菌，甚至是低效同源重组的解脂耶氏酵母，同时，本发明还提供了用于上述方法的试剂盒，具有可观的应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学技术领域，具体涉及一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
分子克隆对于生物医学、生物技术和合成生物学的研究至关重要。随着基因组序列数据的可用性增加和低成本DNA化学合成技术的发展，DNA片段的组装变得比以前更加必要，并且对可靠、简单和高效的DNA组装方法的需求也在不断增长。
基于短同源末端序列的DNA体外组装是目前最广泛使用的DNA组装技术。这类方法能够在体外酶促混合物中将DNA片段无缝组装到所需的环状质粒中，例如LIC(不依赖连接的克隆)、SLIC(不依赖序列和连接的克隆)、In-Fusion,Gibson组装和TEDA(T5核酸外切酶DNA组装)。LIC、SLIC和In-Fusion方法都是利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性形成单链DNA(ssDNA)，再根据同源序列进行退火，然后DNA聚合酶填充剩余的DNA缺口。更高效的Gibson组装方法是在多酶混合物中利用T5核酸外切酶从5’端消化DNA片段，生成用于退火的ssDNA，利用Phusion高保真DNA聚合酶填充DNA缺口，利用Taq DNA连接酶修复DNA缺口。
尽管体外DNA组装能够有效进行DNA克隆，但这些方法都需要昂贵的酶试剂。相比之下，考虑到成本效益和节省时间的优点，直接在细胞内进行DNA片段的组装更具吸引力。实际上，由于固有的高效同源重组，酿酒酵母细胞已被广泛用于在DNA人工合成过程中将短寡核苷酸在体内组装成大DNA片段。近年来，基于同源重组的体内DNA组装方法在酿酒酵母中迅速扩展。然而，对于大多数微生物，例如实验室常用的大肠杆菌菌株，细胞内重组不如酿酒酵母有效。尽管在大肠杆菌细胞中报道了一些体内DNA组装方法，但它们都没有流行起来，主要原因是效率低并且机制不明确。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用。本发明通过组合表达噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶，报告了一种有效的体内DNA组装方法(图1)，并将其命名为“噬菌体酶辅助的体内DNA组装(PEDA)”。在测试了来自不同噬菌体的各种DNA外切酶和连接酶后，最终确定T5 DNA外切酶与T4 DNA连接酶组合在所有组合中具有最佳的体内DNA组装效率。该方法不仅能够在大肠杆菌细胞中组装短至5bp的同源序列的DNA片段，还可以用于其他细菌，如假单胞菌、乳杆菌、产碱杆菌，甚至是低效同源重组的解脂耶氏酵母，同时，本发明还提供了用于上述方法的试剂盒，因此具有良好的实际应用之价值。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明的第一个方面，提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法，所述方法包括：使用噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶对两个或两个以上核酸分子进行处理，并使之发生同源重组，从而实现在宿主细胞体内的DNA组装。
所述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
所述方法还包括：使用RecA和λ-gam蛋白进行处理以进一步提高上述体内DNA组装效率。
需要说明的是，上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶、DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白是重组表达的，从而实现在宿主细胞内的表达或过表达。
经试验证明，本发明的DNA组装方法适用于多种微生物，具有普适性。
本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶或者编码上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶的核酸。
其中，所述DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；
所述试剂盒还包含RecA和λ-gam蛋白或者编码上述RecA和λ-gam蛋白的核酸；
进一步的，所述试剂盒包括表达或过表达上述T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞中包含编码T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白的核酸。
所述宿主细胞包括但不限于细菌和真菌，其中所述细菌可以为革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌、(植物)乳杆菌等；革兰氏阴性细菌，如(恶臭)假单胞菌、(真养)产碱杆菌等；所述真菌可以为酵母菌，如酿酒酵母、解脂耶氏酵母等。
所述试剂盒还可以包括一个或多个预先制备的线性载体。
本发明的第三个方面，提供上述方法或试剂盒在DNA合成中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案公开了一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装技术，其中组装的关键酶为T5核酸外切酶和T4DNA连接酶，另外过表达促进退火的RecA和抑制大肠杆菌核酸外切酶RecBCD的λ-gam蛋白，可以进一步提高体内组装效率。相对于其他组装方法，上述技术方案具有效率高、成本低、操作简单等特点。本发明最低仅需5bp同源臂就能实现DNA片段克隆，与目前常用的40～80bp同源臂相比，降低了引物的设计难度和合成成本。本发明可以在恶臭假单胞菌等多种宿主中实现直接克隆。
综上，上述技术方案建立了一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装技术，其中组装的关键酶为T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶，另外过表达促进退火的RecA和抑制大肠杆菌核酸外切酶RecBCD的λ-gam蛋白，体内组装效率提高到了接近105CFU/μg vector DNA。该技术利用最短5bp的同源臂就可以实现DNA片段组装，为目前报道的使用同源臂最短的组装方法，降低了引物合成成本。该技术适用于革兰氏阴性细菌恶臭假单胞菌和真养产碱杆菌、革兰氏阳性细菌植物乳杆菌和真核微生物解脂耶氏酵母等多种微生物，能够在这些微生物中直接进行DNA片段克隆，降低了基因克隆的难度；因此所述工程菌具有可观的应用价值和前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明PEDA组装过程。首先，引入的线性DNA片段的5'端被T5核酸外切酶降解，此时λ-gam抑制细胞内主要核酸外切酶RecBCD对线性DNA的过度降解。然后，RecA蛋白纤丝的组装促进了同源ssDNA的退火。最后，宿主的DNA聚合酶填补DNA缺口，T4 DNA连接酶修复DNA缺口，生成的环状目的DNA。
图2为本发明用于组装的重组酶的选择。用两种DNA外切酶(T5 Exo和Exo III)和三种DNA连接酶(T3 Lig、T4 Lig和T7 Lig)在大肠杆菌细胞内组装含有40bp同源序列的DNA片段的效率。
图3为本发明同源序列长度对组装效率的影响。利用5、10、20、40、80bp的同源序列，检测T4 Lig与T5 Exo组合的DNA组装效率。为了获得误差线，进行了三次平行实验。
图4为本发明片段长度对组装效率的影响。PEDA在体内组装1273～6081bp不同长度DNA片段的效率。用40bp的同源序列进行DNA组装。所有实验都重复三次，以获得误差棒。
图5为本发明宿主菌株对PEDA效率的影响。将DNA片段F-CmR和含有20或40bp同源序列的质粒骨干共电切到含有PEDA系统的不同大肠杆菌宿主中进行体内DNA组装。数据为三个平行实验的平均值。
图6为本发明重组酶在不同宿主中整合到基因组时PEDA的效率。标记为“*”的菌株表明T4 Lig和T5 Exo已整合到其基因组中。
图7为本发明重组相关组分对PEDA效率的影响。过表达RecA、DH5α的RecA突变体(RecA*)和噬菌体lamda的Gam时，PEDA在DH5α中的效率。所有实验都重复三次，以获得误差棒。
图8为本发明比较PEDA与其他三种在大肠杆菌细胞内的体内DNA组装方法(RecET,iVEC和RAIR)的效率。DNA片段F-CmR与质粒骨架的同源序列分别为5、10、20、40、80bp。所有实验都重复三次，以获得误差棒。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，尽管体外DNA组装能够有效进行DNA克隆，但这些方法都需要昂贵的酶试剂。相比之下，考虑到成本效益和节省时间的优点，直接在细胞内进行DNA片段的组装更具吸引力。实际上，由于固有的高效同源重组，酿酒酵母细胞已被广泛用于在DNA人工合成过程中将短寡核苷酸在体内组装成大DNA片段。近年来，基于同源重组的体内DNA组装方法在酿酒酵母中迅速扩展。然而，对于大多数微生物，例如实验室常用的大肠杆菌菌株，细胞内重组不如酿酒酵母有效。尽管在大肠杆菌细胞中报道了一些体内DNA组装方法，但它们都没有流行起来，主要原因是效率低并且机制不明确。
最近，越来越多的研究提供了证据表明DNA片段将通过单链退火机制在体内组装。在该模型中，ssDNA是由细胞内核酸外切酶从线性DNA末端生成的，不同的ssDNA可以通过短同源区域发生退火。然后，DNA聚合酶I和连接酶LigA在间隙填充和切口修复中发挥关键作用。此外，表达来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶可以显著促进细胞内DNA双链断裂(DSBs)的修复，表明DNA连接酶的活性对于DNA的体内组装非常重要。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法，所述方法包括：使用噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶对两个或两个以上核酸分子进行处理，并使之发生同源重组，从而实现在宿主细胞体内的DNA组装。
本发明的又一具体实施方式中，所述核酸分子可以为两个，包括目标DNA片段和线性克隆载体，所述目标DNA片段和线性克隆载体之间至少存在一段同源臂；
本发明的又一具体实施方式中，所述同源臂的长度为至少5bp、至少10bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少60bp、至少80bp、至少100bp，优选为10～80bp，随着同源臂长度的增加，组装效率逐渐提高。但本发明利用最短5bp的同源臂就可以实现DNA片段组装，为目前报道的使用同源臂最短的组装方法，显著降低了引物合成成本和难度。
本发明的又一具体实施方式中，所述核酸分子长度可以为1-6kb，从而证明上述组装方法非常适合实验室的常规克隆。
在测试了来自不同噬菌体的各种DNA外切酶和连接酶后，最终确定T5 DNA外切酶与T4 DNA连接酶组合在所有组合中具有最佳的体内DNA组装效率。
因此，本发明的又一具体实施方式中，所述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
本发明的又一具体实施方式中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；
本发明的又一具体实施方式中，所述DNA组装采用单链退火机制完成。通过过表达单链DNA结合蛋白会抑制体内组装，而敲除RecA后，过表达单链DNA结合蛋白不再抑制体内组装，证明RecA在噬菌体酶辅助的体内DNA组装中发挥重要作用。在过表达T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶的基础上，过表达RecA，大幅提高体内组装效率。在此基础上，过表达抑制大肠杆菌核酸外切酶RecBCD的λ-gam蛋白，将体内组装效率提高到了接近105CFU/μg vectorDNA。
因此，所述方法还包括：使用RecA和λ-gam蛋白进行处理以进一步提高上述体内DNA组装效率。
需要说明的是，上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶、DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白是重组表达的，从而实现在宿主细胞内的表达或过表达。
经试验证明，本发明的DNA组装方法适用于多种微生物，具有普适性，因此所述宿主细胞包括但不限于细菌和真菌，其中所述细菌可以为革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌、(植物)乳杆菌等；革兰氏阴性细菌，如(恶臭)假单胞菌、(真养)产碱杆菌等；所述真菌可以为酵母菌，如酿酒酵母、解脂耶氏酵母等。采用本发明的DNA组装方法在恶臭假单胞菌和解脂耶氏酵母中内组装效率高于104CFU/μg vector DNA；特别地，即使对于转化效率极低的植物乳杆菌和真养产碱杆菌等，采用本发明的DNA组装方法仍可获得目标DNA产物，且具有100％的DNA组装准确性，充分显示了本发明DNA组装方法的优越性。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶或者编码上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶的核酸。
其中，所述DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；
所述试剂盒还包含RecA和λ-gam蛋白或者编码上述RecA和λ-gam蛋白的核酸；
本发明的又一具体实施方式中，所述试剂盒包括表达或过表达上述T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞中包含编码T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白的核酸。
所述宿主细胞包括但不限于细菌和真菌，其中所述细菌可以为革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌、(植物)乳杆菌等；革兰氏阴性细菌，如(恶臭)假单胞菌、(真养)产碱杆菌等；所述真菌可以为酵母菌，如酿酒酵母、解脂耶氏酵母等。
本发明的又一具体实施方式中，所述试剂盒还可以包括一个或多个预先制备的线性载体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法或试剂盒在DNA合成中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。实施例所用菌种Eschrichia coli DH5α，其基因组序列号为NZ_CP025520.1；Ralstonia eutropha H16基因组序列号为AM260479.1；Pseudomonas putida KT2440基因组序列号为NC_002947.4；Lactobacillus plantarumWCFS1基因组序列号为NC_004567.2；Yarrowia lipolytica Po1f(ATCC编号MYA-2613；基因型MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2，购自ATCC)。
实施例所用天根质粒小提试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，DNA聚合酶PrimeSTAR购自TAKARA公司；质粒pUC19，pAcyc184，pE，p15A，pBBR1-MCS2,pSip411，pBac购买自Addgene。质粒pKD46、Ylep-Hyg-ET为实验室保存质粒。
实施例1噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装技术建立
(1)组装酶的筛选
根据Genbank公布的T5核酸外切酶(NC_005859.1)、T3 DNA连接酶(NC_003298.1)T4 DNA连接酶(NC_000866.4)、T7 DNA连接酶(NC_001604.1)基因序列由通用生物系统(安徽)有限公司安排合成，以及设计合成引物：
ara-T4-F：
5’-GAGCTCTCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGAACGAATGATTCTTAAAATTCTGAACGAAATAGCAT-3’(SEQ ID NO.1)
T5-T4-R：5’-CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGATTAGGTCATAGACCAGTTACCTCATGAAAATCAC-3’(SEQ ID NO.2)
B-T5-F：5’-CCTAATCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCAAAAGCTGGGGCAAAT-3’(SEQID NO.3)
pk-T5-R：5’-CCGGATATTATCGTGAGGATGCGTTACTGTTCGGCGATTTCCAGGATATCT-3’(SEQID NO.4)
B0034-T7-R：5’-CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGATTAGGTTACATTTTTTCCTGCGGATTATCTTCGG-3’(SEQ ID NO.5)
pbad-T7-F：5’-GAGCTCTCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGAACGAATGATGAACATCAAGACCAATCC-3’(SEQ ID NO.6)
ara-T3-F：5’-GAGCTCTCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGAACGAATGAACATCTTCAACACCAATCC-3’(SEQ ID NO.7)
T5-T3-R：5’-CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGATTAGGTTACATTTTTTCCTGCGGGTTATCTTCT-3’(SEQ ID NO.8)
E3-F：5’-TAATCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAAATTTGTCTCTTTTAATATCAACGGCC-3’(SEQ ID NO.9)
pk-E3-R：5’-CCGGATATTATCGTGAGGATGCGTTAGCGGCGGAAGGTCGC-3’(SEQ ID NO.10)
B0034-ara-R：5’-TTCTCCTCTTTCTCTAGAGAGCTCGAATTCCCAAAAAAACGGGTATG-3’(SEQID NO.11)
pk-F：5’-CGCATCCTCACGATAATATCCGG-3’(SEQ ID NO.12)
40-CM-F：5’-ATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTGATCGGCACGTAAGAGGT-3’(SEQ ID NO.13)
40-CM-R：5’-AATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCGAATTTCTGCCATTCATCCGCT-3’(SEQ ID NO.14)
PUC19-F：5’-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATAC-3’(SEQ ID NO.15)
PUC19-R：5’-GTGCCACCTGACGTCTAAGAAAC-3’(SEQ ID NO.16)
以密码子优化合成的T5核酸外切酶、T3DNA连接酶、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶基因以及Eschrichiacoli DH5α基因组、质粒pkd46、pAcyc184和PUC19为模板，使用引物B-T5-F/pk-T5-R、ara-T3-F/T5-T3-R、ara-T4-F/T5-T4-R、pbad-T7-F/B0034-T7-R、E3-F/pk-E3-R、pk-F/B0034-ara-R、40-CM-F/40-CM-R和PUC19-F/PUC19-R进行PCR(聚合酶链式反应)扩增得到片段T5、T3、T4、T7、E3、pk、40-CM和PUC。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸1min/kb，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
通过DpnI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒(New EnglandBiolabs(NEB),England)将上述片段产物连接，构建质粒pk-T5-T3、pk-T5-T4、pk-T5-T7、pk-E3-T3、pk-E3-T4和pk-E3-T7并转化入Eschrichia coli DH5α菌株中。将40-CM和PUC片段以等摩尔比电转入表达上述蛋白的菌株中。
电转化感受态细胞的制备：
1)挑取单菌落加入到含有5mL LB液体培养基和100μg/mL氨苄青霉素的试管中，30℃220rpm过夜培养(约12小时)。
2)吸取100μL过夜培养物，加入到含有5mL LB和100μg/mL氨苄青霉素的试管中，添加2g/L阿拉伯糖，30℃220rpm培养至OD600为0.6-0.8左右。
3)吸取1.5mL菌液加入到灭过菌的1.5mL离心管中，室温12000rpm离心1分钟，倒掉上清。重复三次。
4)向离心管中加入1mL灭过菌的超纯水，重悬菌体，室温12000rpm离心1分钟，倒掉上清。重复三次。
5)向离心管中加入100μL灭过菌的超纯水，重悬菌体，大肠杆菌电转感受态制备完成。
电转化：
1)向电转化感受态中加入40-CM和PUC片段，充分混匀。
2)将感受态加入灭过菌的2mm电转杯中,震动使感受态进入电转杯底部。
3)打开Bio-Rad电转仪，参数调节至2mm 2.5kv 25μF 200Ω
4)将擦干净的电转杯放入电转槽内，电极接触电转槽电极。
5)按下“PULSE”按钮，听到“滴”声音后，观察显示屏出现电转常数(5.0左右最佳)，迅速向电转杯中加入mL SOC培养基，混合均匀后吸取至灭过菌的1.5mL离心管中放置在30℃恒温振荡器中，300rpm培养1小时。
6)，12000rpm离心，倒掉大部分上清，留下100μL液体重悬菌体，涂布至含有17μg/mL氯霉素的LB固态平板上，倒置放入37℃或30℃恒温培养箱中过夜培养。
上述LB培养基为：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠。
上述LB固体平板为：含有2％琼脂的LB固体培养基。
上述SOC培养基为：5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，0.5g/L氯化钠，0.186g/L氯化钾，1.2g/L硫酸镁，20g/L葡萄糖。
使用菌落计数仪统计氯霉素(17μg/mL)抗性平板上长出的菌落数量，其中使用T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶进行组装时获得了最多的菌落，达到了3×104(图2)。将使用T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶进行体内组装的方法命名为PEDA。
(2)不同同源臂长度下PEDA组装效率的表征
设计合成引物：
5-CM-F：5’-GGCACTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC-3’(SEQ ID NO.17)
5-CM-R：5’-GACAGCGAATTTCTGCCATTCATCCGCT-3’(SEQ ID NO.18)
10-CM-F：5’-CAGGTGGCACTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC-3’(SEQ ID NO.19)
10-CM-R：5’-GGTCTGACAGCGAATTTCTGCCATTCATCCGCT-3’(SEQ ID NO.20)
20-CM-F：5’-TCTTAGACGTCAGGTGGCACTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC-3’(SEQ IDNO.21)
20-CM-R：5’-GAGTAAACTTGGTCTGACAGCGAATTTCTGCCATTCATCCGCT-3’(SEQ IDNO.22)
40-CM-F：5’-ATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTGATCGGCACGTAAGAGGT-3’(SEQ ID NO.23)
40-CM-R：5’-AATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCGAATTTCTGCCATTCATCCGCT-3’(SEQ ID NO.24)
80-CM-F：
5’-AGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACG-3’(SEQ ID NO.25)
80-CM-R：
5’-ATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACA-3’(SEQ ID NO.26)
以质粒pAcyc184为模板，使用引物5-CM-F/5-CM-R、10-CM-F/10-CM-R、20-CM-F/20-CM-R、40-CM-F/40-CM-R和80-CM-F/80-CM-R进行PCR扩增，得到片段5-CM、10-CM、20-CM、40-CM和80-CM。将这些片段分别与PUC片段等摩尔比电转化入表达T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶的Eschrichia coli DH5α菌株中，使用菌落计数仪统计氯霉素(17μg/mL)抗性平板上长出的菌落数量。其中，随着同源臂长度的增加，组装效率逐渐提高(图3)。
(3)不同片段长度下PEDA组装效率的表征
设计合成引物：
PUC19-F2：CTCACATTAATTGCGTTGCGCTCA(SEQ ID NO.27)
PUC19-R2：GGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC(SEQ ID NO.28)
PUC19-NeuB-F：
CACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAAT(SEQID NO.29)
PUC19-NeuB-R：
ACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTATTCAAAATCATCCCAGGTCAGCTGG(SEQ ID NO.30)
PUC19-AGE-R：
ACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAACTCAGTGCTTCAAACTGCTGCC(SEQ ID NO.31)
PUC19-GNA1-R：
ACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC(SEQ ID NO.32)
PUC19-GlmS-R：
GACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCG(SEQID NO.33)
以质粒PUC19为模板，使用引物PUC19-F2/PUC19-R2 PCR扩增出片段PUC2。以质粒pAcyc184为模板，使用引物PUC19-NeuB-F/PUC19-NeuB-R、PUC19-NeuB-F/PUC19-AGE-R、PUC19-NeuB-F/PUC19-GNA1-R、PUC19-NeuB-F/PUC19-GlmS-R PCR扩增出片段A、AB、ABC、ABCD。将这些片段分别与PUC2片段等摩尔比电转化入表达T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶的Eschrichia coli DH5α菌株中，使用菌落计数仪统计氯霉素(17μg/mL)抗性平板上长出的菌落数量。其中，不同片段长度下片段的组装效率基本不变(图4)。
实施例2PEDA在不同大肠杆菌及不同表达方式下的组装
将质粒pk-T5-T4分别转化入大肠杆菌菌株DH5α、Top10、GB05-dir、XL1-Blue和Turbo中，在使用阿拉伯糖诱导T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶表达后，将片段将40-CM和PUC以等摩尔比电转入上述菌株中，使用菌落计数仪统计氯霉素(17μg/mL)抗性平板上长出的菌落数量。所有被测试的菌株都能通过PEDA在体内组装DNA片段，尽管与DH5α相比效率有不同程度的下降(图5)。而Top10、GB05-dir和XL1-Blue菌株均获得了超过1.5×104的菌落，而同源序列仅为20bp，足以满足大多数DNA克隆实验的需要。对于Turbo菌株，使用40bp的同源序列，虽然只能培养出约5×103菌落，但转化后单个菌落的可视化仅需要6小时，大大缩短了体内DNA克隆的时间。将T4 Lig和T5 Exo使用位点特异性整合方法整合到基因组后，DNA片段组装效率无明显变化(图6)。
位点特异性整合：
设计合成下列引物。
araC-F：5’-TTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCAC-3’(SEQ ID NO.34)
araC-pHK-R：5’-GTGAATGATGTAGCCGTCAAGTTGTCATAACTAAAGAGCTTGTCGTTATGCGCAC-3’(SEQ ID NO.35)
pHK-test-F：5’-ATCGGAAGTACACCGACGTATTTCC-3’(SEQ ID NO.36)
pHK-test-R：5’-GATAGTATTAGTGACCTGAGACAGAGC-3’(SEQ ID NO.37)
tL3-pHK-F：5’-GAATCAGGTTTGTGCCAATACCAGTAGAAACAGACGAAGAAGCTAGCTAATGCTC-3’(SEQ ID NO.38)
tL3-R：5’-CTACTGGTATTGGCACAAACCTGATTC-3’(SEQ ID NO.39)
P1：5’-GGAATCAATGCCTGAGTG-3’(SEQ ID NO.40)
P2：5’-ACTTAACGGCTGACATGG-3’(SEQ ID NO.41)
P3：5’-ACGAGTATCGAGATGGCA-3’(SEQ ID NO.42)
P4：5’-GGCATCAACAGCACATTC-3’(SEQ ID NO.43)
以质粒pHK为模板，使用引物tL3-pHK-F/araC-pHK-R PCR扩增出片段phk。以质粒pk-T5-T4为模板，使用引物araC-F/tL3-R PCR扩增出片段T4T5。将两个片段进行Gibson组装，并转化入BW25141菌株中。使用引物pHK-test-F/pHK-test-R进行菌落PCR和测序，构建出质粒pHK-T4T5。将该质粒使用下面方法整合在大肠杆菌菌株DH5α、Top10和Turbo基因组上。
1)将辅助质粒PAH69转化入要整合的菌株中，接种到5mL新鲜培养基中，30℃220rpm过夜培养。
2)以2％的接种量转接到5mL新鲜LB培养基中，将菌液培养至，将质粒pHK-T4T5转化入大肠杆菌中，
3)37℃恢复培养1小时，42℃恢复培养半个小时，涂布含有卡那霉素的LB固体平板，37℃恒温培养。
4)待平板长出单菌落后，使用引物P1、P2、P3和P4进行菌落PCR验证。
实施例3重组相关组分对PEDA组装效率的影响
设计合成下列引物。
B0034-T5-R：5’-CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGATTACTGTTCGGCGATTTCCAGGATATCT-3’(SEQ ID NO.44)
pk-F：5’-CGCATCCTCACGATAATATCCGG-3’(SEQ ID NO.45)
pk-recA-R：5’-CCGGATATTATCGTGAGGATGCGTTAAAAATCTTCGTTAGTTTCTGCTACGCC-3’(SEQ ID NO.46)
T5-recA-F：5’-CGAACAGTAATCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGGCTATCGACGAAAACAAACAG-3’(SEQ ID NO.47)
Gam-recA-R：5’-CCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGATTAAAAATCTTCGTTAGTTTCTGCTACGCC-3’(SEQ ID NO.48)
pk-Gam-R：5’-CCGGATATTATCGTGAGGATGCGTTATACCTCTGAATCAATATCAACCTGGTGG-3’(SEQ ID NO.49)
RecA-Gam-F：5’-TCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGGATATTAATACTGAAACTGAGATCAAGC-3’(SEQ ID NO.50)
以质粒pk-T5-T4、大肠杆菌MG1655基因组和大肠杆菌DH5α基因组为模板，使用引物pk-F/B0034-T5-R、T5-recA-F/pk-recA-R和T5-recA-F/pk-recA-R分别进行PCR扩增，得到片段pk45、recA、recA*。将pk45分别与recA和recA*片段等摩尔比电转化入表达T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶的Eschrichia coli DH5α菌株中，通过菌落PCR和测序验证构建正确的质粒，分别命名为pk-T5T4-recA和pk-T5T4-recA*。
以质粒pk-T5T4-recA和pkd46为模板，使用引物pk-F/Gam-recA-R和RecA-Gam-F/pk-Gam-R分别进行PCR扩增出片段pk45A和Gam片段，将pk45A与Gam片段等摩尔比电转化入表达T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶的Eschrichia coli DH5α菌株中，通过菌落PCR和测序验证构建正确的质粒，命名为pk-T5T4-recA-Gam。
将质粒pk-T5T4-recA、pk-T5T4-RecA*和pk-T5T4-recA-Gam分别转化入大肠杆菌菌株DH5α中，在使用阿拉伯糖诱导T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶表达后，将片段40-CM和PUC以等摩尔比电转入上述菌株中，使用菌落计数仪统计氯霉素(17μg/mL)抗性平板上长出的菌落数量。RecA和RecA*的引入都使PEDA的组装效率显著提升。在引入RecA的基础上引入来自噬菌体的Gam蛋白，抑制胞内核酸外切酶降解用于组装的片段，使PEDA的组装效率提高到了1×105(图7)。
实施实例4PEDA与其他体内DNA组装方法的比较
将优化后的PEDA与3种常用的大肠杆菌体内DNA组装方法进行了比较。在这些方法中，PEDA对10～80bp不同长度的DNA片段的效率最高，与体外DNA组装的效率非常接近(图8)。同源序列仅为10bp，获得近5×103菌落。短的同源序列大大降低了引物合成的成本和难度。这些结果表明，优化后的PEDA比现有的体内DNA组装方法更适合常规克隆。
实施例5PEDA在其他微生物中的体内组装
对于大多数微生物来说，通常需要将基因克隆到大肠杆菌的穿梭质粒中，然后将质粒转移到宿主菌株中。为了简化这一过程，我们尝试在多种微生物中使用PEDA直接组装DNA片段。选择两株革兰氏阴性菌株R.eutrophu和P.putida，一株革兰氏阳性菌株L.plantarum和重组低效的真核微生物Y.lipolytica来测试PEDA的有效性。在这些微生物,单一DNA片段以及两个DNA片段在体内被成功地组装,在使用一个DNA片段组装时，P.putida和Y.lipolytica中甚至获得了超过104个菌落(表1)。我们发现的组装效率与宿主的转化效率显著是相关的。尽管L.plantarum和R.eutrophu的DNA转化效率低，但我们仍然获得了目标DNA产物，这是其他方法无法获得的(表1)。而且，PEDA在所有被测试的细菌宿主中显示了近100％的DNA组装准确性。对于Y.polytica，无论单个或两个DNA片段，70％以上的产物是准确组装的，这是大多数DNA克隆实验可以接受的。
表1利用PEDA在各种微生物体内组装DNA片段
a.用1μg环状质粒转化后形成的菌落数量来估算转化效率。
b.用1μg同源序列为40bp的线性DNA片段转化后的菌落数量来估计PEDA的效率。
c.准确度为序列正确的菌落的百分比。
(1)Ralstonia eutropha H16和Pseudomonas putida KT2440中的体内组装
设计并合成引物：
araC-F:5’-TTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCAC-3’(SEQ ID NO.51)
araC-repC-R2:5’-GTGAATGATGTAGCCGTCAAGTTGTCATAATGTAAGTTAGCGCGAATTGCAAGCT-3’(SEQ ID NO.52)
oriV-F:5’-AACCAATCAGCAGGGTCATCGCTA-3’(SEQ ID NO.53)
oriV-kan-R:5’-TAGCGATGACCCTGCTGATTGGTTTTCAAGATCCCCTCACGCTGCC-3’(SEQID NO.54)
tL3-kan-F:5’-GAATCAGGTTTGTGCCAATACCAGTAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT-3’(SEQ ID NO.55)
tL3-R:5’-CTACTGGTATTGGCACAAACCTGATTC-3’(SEQ ID NO.56)
pBBR1-F:5’-CGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTG-3’(SEQ ID NO.57)
pBBR1-R:5’-GCGCATCGCCTTCTATCGCCTT-3’(SEQ ID NO.58)
pBBR1-TcR-F:
5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCCTAGAGCGGCCTATCGTTTCCA-3’(SEQ ID NO.59)
pBBR1-TcR-R:
5’-ATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCGTGAAACCCAACATACCCCTGATCG-3’(SEQ ID NO.60)
以质粒pRL1342、pBBR1-MCS2和pk-T5-T4为模板，使用引物oriv-F/araC-repC-R2、tL3-kan-F/oriV-kan-R和araC-F/tL3-R分别PCR扩增出片段PRL、kan和T4T5，利用Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolabs(NEB),England)将上述片段产物连接，构建出质粒PRL-kan-T4T5。
以质粒pBBR1-MCS2和pme6032为模板，使用引物pBBR1-F/pBBR1-R和pBBR1-TcR-F/pBBR1-TcR-R分别PCR扩增出片段pBBR1和TcR。将质粒PRL-kan-T4T5分别转化入Ralstoniaeutropha H16和Pseudomonas putida KT2440中，在使用阿拉伯糖诱导T5核酸外切酶和T4DNA连接酶表达后，将片段pBBR1和TcR以等摩尔比电转入上述菌株中，使用菌落计数仪统计四环素抗性平板上长出的菌落数量。
Ralstonia eutropha H16电转化
1)将真养产碱杆菌接种到5mL LB中，30℃、220rpm过夜培养。
2)取2mL接种到含有48mL LB的锥形瓶中。培养物在30℃、250rpm培养1小时。
3)将25mL在4℃、7000g离心35分钟，使用5mL预冷的0.3M蔗糖溶液洗涤三次。离心后，重悬OD600至5左右。
4)100μL感受态细胞中加入2-5μL DNA，转移至电转杯中。2.5KV/mm 200Ω25μF电击，电转后立即加入0.9mL的SOC。30℃恢复培养2h，涂布含有25μg/mL四环素的固体LB平板。
Pseudomonas putida KT2440电转化
1)从保存恶臭假单胞菌KT2440甘油管中以1％的接种量转接到含有5mL LB培养基试管中，30℃ 220rpm摇床振荡过夜培养。
2)以1％的接种量转接到含有50mL LB培养基的300mL广口摇瓶中，添加2g/L阿拉伯糖，30℃ 220rpm摇床振荡培养2-3小时。
3)将菌液培养至OD600达到0.6-0.8，将1.5mL菌液转移到1.5mL灭过菌的离心管中，12000rpm离心1分钟，倒掉上清，重复三次。
4)向离心管中加入1mL 10％甘油，使用移液枪吹打均匀，12000rpm离心1分钟，倒掉上清，重复三次。
5)使用100μL电转缓冲液重悬菌体，向其中加入待转化的片段或质粒，静置10分钟。
6)将上述混合的感受态转移到2mm电转杯，使用电穿孔仪，1200V 25μF 200Ω进行电击，电转常数5.0左右，加入1mL SOC培养基，30℃恢复培养1小时，涂布含有25μg/mL四环素的固体LB平板，30℃恒温培养，待平板长出单菌落后，使用相应引物进行菌落PCR验证，然后进行测序验证。
(2)Lactobacillus plantarum WCFS1中的体内组装
411-F:5’-TAACTCGAGGAATTCGGTACCCC-3’(SEQ ID NO.61)
411-PUC-R:5’-GGGGTACCGAATTCCTCGAGTTACCACAGAATCAGGGGATAACGCAG-3’(SEQID NO.62)
411-T4-F:5’-AGATTCGCAAGTAAGGAGTTTATATATCATGATTCTTAAAATTCTGAACGAAATAGCAT-3’(SEQ ID NO.63)
PUC-F3:5’-AAAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATC-3’(SEQ ID NO.64)
PUC-T5-R:5’-GATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTTTACTGTTCGGCGATTTCCAGGATATCT-3’(SEQ ID NO.65)
T4-411-R:5’-CATGATATATAAACTCCTTACTTGCGAATCTGTTAGGCTAAAATCTCCTTGTAATAGTA-3’(SEQ ID NO.66)
CMR-F(PC):5’-ATATCGGTACCCAAATTACATGCCACTCATCGCAGTACTGTTG-3’(SEQ IDNO.67)
CMR-R(PC):5’-TCAATCAAAGCAACACGTGCCGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAAT-3’(SEQ IDNO.68)
PE-F:5’-CGAAGTGATCTTCCGTCACGGCACGTGTTGCTTTGATTGATAGCC-3’(SEQ IDNO.69)
PE-R:5’-CAGTACTGCGATGAGTGGCATGTAATTTGGGTACCGATATCGTCG-3’(SEQ IDNO.70)
以PUC-F3和411-PUC-R为引物，以质粒PUC19为模板，PCR扩增出片段ColEI。以411-T4-F和PUC-T5-R为引物，以质粒pk-T5-T4为模板，PCR扩增出片段araC-T4T5(411)。以411-F和T4-411-R为引物，以质粒pSip411为模板，PCR扩增出片段411。利用Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolabs(NEB),England)将上述片段产物连接，构建出质粒411-T4T5。
以质粒PC和PE为模板，使用引物CMR-F(PC)/CMR-R(PC)和PE-F/PE-R分别PCR扩增出片段C和E。将质粒411-T4T5转化入Lactobacillus plantarum WCFS1中，在使用诱导肽IP诱导T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶表达后，将片段C和E以等摩尔比电转入上述菌株中，使用菌落计数仪统计氯霉素(5μg/mL)抗性MRS平板上长出的菌落数量。
Lactobacillus plantarum WCFS1电转化
1)取0.5mL-20℃保存的菌液转接到含有5mL MRS的试管中，37℃静置过夜培养。
2)以2％接种量将过夜培养的菌液转接到5mL溶液I中，37℃静置培养至OD600达到0.6-0.8。
3)将菌液置于冰上冰浴10分钟。
4)将菌液转移至灭过菌的10mL离心管中，4℃5000rpm离心10分钟。
5)收集菌体，使用1mL SM Buffer重悬菌体，冰上放置10分钟，4℃12000rpm离心10分钟。
6)重复步骤5)三次。
7)收集菌体，使用100μL SM Buffer重悬菌体，加入5μL质粒，冰上放置10分钟。
8)将感受态细胞转入2mm电转杯中，使用电穿孔仪，2000V 25μF 200Ω进行电击，电转常数7.0左右，加入1mL MRSSM培养基，30℃静置恢复培养1小时，涂布含有相应抗生素的固体MRS平板，37℃恒温培养，待平板长出单菌落后，使用相应引物进行菌落PCR验证，然后进行测序验证。
MRS培养基配方:22g/L一水葡萄糖、2g/L柠檬酸钠、1mL吐温80、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰、10g/L蛋白胨、8g/L牛肉膏、5g/L乙酸钠、4g/L酵母粉、2g/L磷酸氢二钾。
MRS固体培养基配方：MRS培养基的基础上添加20g/L的琼脂粉。
(3)Yarrowia lipolytica Po1f中的体内组装
设计合成引物：
ylep-T4-F：5’-TATTCATTCTTGAATTAAACACACATCAACAGATGATCCTGAAGATTCTGAACGAGATC-3’(SEQ ID NO.71)
ylep-T4-R：5’-CGGCAACGTGGGGACAGGCCATGGAGGTACGTCGATTAGACCTTTCGCTTCTTCTTGGG-3’(SEQ ID NO.72)
ylep-T5-F：5’-TCCGACCAGCACTTTTTGCAGTACTAACCGCAGATTTATGTCTAAGTCTTGGGGCAAGT-3’(SEQ ID NO.73)
ylep-T5-R：5’-GAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGAATTTTTAGACCTTTCGCTTCTTCTTGGG-3’(SEQ ID NO.74)
LEU-F：5’-TTCCATTATCTACGAAAAGCGAATTCCGTCGTCGCCTGAGT-3’(SEQ ID NO.75)
LEU-R：5’-CTTGAATATACAGTAGTATGTTCATGTCACACAAACCGATCTTCGC-3’(SEQ IDNO.76)
ylep-F：5’-ATCGGTTTGTGTGACATGAACATACTACTGTATATTCAAGCAAGTATATCCG-3’(SEQID NO.77)
ylep-R：5’-CTCAGGCGACGACGGAATTCGCTTTTCGTAGATAATGGAATACAAATGG-3’(SEQ IDNO.78)
在解脂耶氏酵母中密码子优化并合成T4 DNA连接酶和T5核酸外切酶。使用引物ylep-T4-F和ylep-T4-R为引物，以合成的T4基因为模板，扩增片段T4(ylep)。使用限制性内切酶DpnI去除模板，PCR回收后测量片段浓度。使用引物ylep-T5-F和ylep-T5-R为引物，以合成的T5基因为模板，扩增片段T5(ylep)。使用限制性内切酶SwaI和SalI剪切质粒ylep-hyg-ET，将得到的两个片段胶回收。将四个片段按照摩尔比1:1:1:1，使用Gibson进行组装，转化DH5α感受态，涂布含有氨苄青霉素的LB固态平板，37℃过夜培养。待平板长出单菌落后，进行菌落PCR和测序验证，构建出ylep-T4T5。
以质粒ylep-leu为模板，使用引物LEU-F/LEU-R和ylep-F/ylep-R分别PCR扩增出片段leu和ylep。将质粒ylep-T4T5转化入Yarrowia lipolytica Po1f中，然后将片段leu和ylep以等摩尔比电转入上述菌株中，使用菌落计数仪统计SD-leu平板上长出的菌落数量。
解脂耶氏酵母转化
1)从-80℃保存的甘油管中吸取100μL菌液，涂布到YPD平板上，30℃培养24小时。
2)刮取适量的菌体，悬于含有1mL TE的灭过菌的1.5mL离心管中，10000rpm离心2分钟。
3)倒掉上清，将菌体重悬于600μL醋酸锂(0.1M PH 6.0)中,30℃恒温静置培养1小时。
4)3000rpm离心5分钟，弃掉上清，用80-120μL醋酸锂重悬菌体。
5)取40μL上述菌液，加入2μL鲑鱼精DNA，3μL片段，充分混匀后，30℃恒温静置培养15分钟。
6)加入350μL PEG4000-醋酸锂和16μL 1M DTT，30℃恒温静置培养1小时。
7)加入40μL DMSO，39℃热激10分钟。
8)加入600μL醋酸锂，室温静置1小时后涂布平板。
YPD培养基配方：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。
YPD固体培养基配方：在YPD培养基基础上添加20g/L琼脂粉。
SD-leu固体培养基：26.7g/L Minimal SD base、0.69g/L DO Supplement-leu、20g/L琼脂粉。
本发明未尽事宜为公知技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用
<130>
<160> 78
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagctctcta gagaaagagg agaaatacta gaacgaatga ttcttaaaat tctgaacgaa 60
atagcat 67
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctagtatttc tcctctttct ctagattagg tcatagacca gttacctcat gaaaatcac 59
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctaatctag agaaagagga gaaatactag atgagcaaaa gctggggcaa at 52
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggatatta tcgtgaggat gcgttactgt tcggcgattt ccaggatatc t 51
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctagtatttc tcctctttct ctagattagg ttacattttt tcctgcggat tatcttcgg 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagctctcta gagaaagagg agaaatacta gaacgaatga tgaacatcaa gaccaatcc 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagctctcta gagaaagagg agaaatacta gaacgaatga acatcttcaa caccaatcc 59
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctagtatttc tcctctttct ctagattagg ttacattttt tcctgcgggt tatcttct 58
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taatctagag aaagaggaga aatactagat gaaatttgtc tcttttaata tcaacggcc 59
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccggatatta tcgtgaggat gcgttagcgg cggaaggtcg c 41
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttctcctctt tctctagaga gctcgaattc ccaaaaaaac gggtatg 47
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgcatcctca cgataatatc cgg 23
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac tgatcggcac gtaagaggt 59
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag cgaatttctg ccattcatcc 60
gct 63
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctgtcagacc aagtttactc atatatac 28
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtgccacctg acgtctaaga aac 23
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggcactgatc ggcacgtaag aggttcc 27
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gacagcgaat ttctgccatt catccgct 28
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
caggtggcac tgatcggcac gtaagaggtt cc 32
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggtctgacag cgaatttctg ccattcatcc gct 33
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcttagacgt caggtggcac tgatcggcac gtaagaggtt cc 42
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gagtaaactt ggtctgacag cgaatttctg ccattcatcc gct 43
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac tgatcggcac gtaagaggt 59
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag cgaatttctg ccattcatcc 60
gct 63
<210> 25
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 60
tcttagacg 69
<210> 26
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 60
gagtaaactt ggtctgaca 79
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ctcacattaa ttgcgttgcg ctca 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggtttcttag acgtcaggtg gcac 24
<210> 29
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc cgacatcata acggttctgg 60
caaat 65
<210> 30
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttattcaaaa tcatcccagg 60
tcagctgg 68
<210> 31
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttaactcagt gcttcaaact 60
gctgcc 66
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ctattttcta atttgcattt 60
ccacgcctgc 70
<210> 33
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gtacggcgtt tcacttctga 60
gttcg 65
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ttatgacaac ttgacggcta catcattcac 30
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gtgaatgatg tagccgtcaa gttgtcataa ctaaagagct tgtcgttatg cgcac 55
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atcggaagta caccgacgta tttcc 25
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gatagtatta gtgacctgag acagagc 27
<210> 38
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gaatcaggtt tgtgccaata ccagtagaaa cagacgaaga agctagctaa tgctc 55
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ctactggtat tggcacaaac ctgattc 27
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggaatcaatg cctgagtg 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
acttaacggc tgacatgg 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
acgagtatcg agatggca 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ggcatcaaca gcacattc 18
<210> 44
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctagtatttc tcctctttct ctagattact gttcggcgat ttccaggata tct 53
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cgcatcctca cgataatatc cgg 23
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ccggatatta tcgtgaggat gcgttaaaaa tcttcgttag tttctgctac gcc 53
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
cgaacagtaa tctagagaaa gaggagaaat actagatggc tatcgacgaa aacaaacag 59
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ccatctagta tttctcctct ttctctagat taaaaatctt cgttagtttc tgctacgcc 59
<210> 49
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ccggatatta tcgtgaggat gcgttatacc tctgaatcaa tatcaacctg gtgg 54
<210> 50
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
tctagagaaa gaggagaaat actagatgga tattaatact gaaactgaga tcaagc 56
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ttatgacaac ttgacggcta catcattcac 30
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gtgaatgatg tagccgtcaa gttgtcataa tgtaagttag cgcgaattgc aagct 55
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
aaccaatcag cagggtcatc gcta 24
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tagcgatgac cctgctgatt ggttttcaag atcccctcac gctgcc 46
<210> 55
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gaatcaggtt tgtgccaata ccagtagtca gaagaactcg tcaagaaggc gat 53
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ctactggtat tggcacaaac ctgattc 27
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttg 26
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gcgcatcgcc ttctatcgcc tt 22
<210> 59
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc ctagagcggc ctatcgtttc 60
ca 62
<210> 60
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc gtgaaaccca acatacccct 60
gatcg 65
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
taactcgagg aattcggtac ccc 23
<210> 62
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ggggtaccga attcctcgag ttaccacaga atcaggggat aacgcag 47
<210> 63
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
agattcgcaa gtaaggagtt tatatatcat gattcttaaa attctgaacg aaatagcat 59
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
aaagcgtcag accccgtaga aaagatc 27
<210> 65
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gatcttttct acggggtctg acgctttact gttcggcgat ttccaggata tct 53
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
catgatatat aaactcctta cttgcgaatc tgttaggcta aaatctcctt gtaatagta 59
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
atatcggtac ccaaattaca tgccactcat cgcagtactg ttg 43
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tcaatcaaag caacacgtgc cgtgacggaa gatcacttcg cagaat 46
<210> 69
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
cgaagtgatc ttccgtcacg gcacgtgttg ctttgattga tagcc 45
<210> 70
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
cagtactgcg atgagtggca tgtaatttgg gtaccgatat cgtcg 45
<210> 71
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
tattcattct tgaattaaac acacatcaac agatgatcct gaagattctg aacgagatc 59
<210> 72
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
cggcaacgtg gggacaggcc atggaggtac gtcgattaga cctttcgctt cttcttggg 59
<210> 73
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tccgaccagc actttttgca gtactaaccg cagatttatg tctaagtctt ggggcaagt 59
<210> 74
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gaatgtaagc gtgacataac taattacatg aatttttaga cctttcgctt cttcttggg 59
<210> 75
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
ttccattatc tacgaaaagc gaattccgtc gtcgcctgag t 41
<210> 76
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
cttgaatata cagtagtatg ttcatgtcac acaaaccgat cttcgc 46
<210> 77
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
atcggtttgt gtgacatgaa catactactg tatattcaag caagtatatc cg 52
<210> 78
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ctcaggcgac gacggaattc gcttttcgta gataatggaa tacaaatgg 49
Claims (10)
1.一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述方法包括：使用噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶对两个或两个以上核酸分子进行处理，并使之发生同源重组，从而实现在宿主细胞体内的DNA组装；
所述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
2.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述核酸分子为两个，包括目标DNA片段和线性克隆载体，所述目标DNA片段和线性克隆载体之间至少存在一段同源臂；
所述同源臂的长度为至少5bp、至少10bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少60bp、至少80bp、至少100bp，优选为10～80bp；
所述核酸分子长度为1-6kb。
3.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述DNA组装采用单链退火机制完成。
4.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述方法还包括：使用RecA和λ-gam蛋白进行处理。
5.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，噬菌体衍生的DNA外切核酸酶、DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白是重组表达的，从而实现在宿主细胞内的表达或过表达。
6.如权利要求1-5任一项所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述宿主细胞包括细菌和真菌；
优选的，所述细菌为革兰氏阳性细菌，包括大肠杆菌、(植物)乳杆菌；或，革兰氏阴性细菌，包括(恶臭)假单胞菌、(真养)产碱杆菌；
优选的，所述真菌为酵母菌，包括酿酒酵母、解脂耶氏酵母。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶或者编码噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶的核酸；
其中，所述DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
所述DNA连接酶为T4 DNA连接；
优选的，所述试剂盒还包含RecA和λ-gam蛋白或者编码上述RecA和λ-gam蛋白的核酸。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表达或过表达T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白的宿主细胞；
优选的，所述宿主细胞中包含编码T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ-gam蛋白的核酸；
所述宿主细胞包括细菌和真菌；
优选的，所述细菌为革兰氏阳性细菌，包括大肠杆菌、(植物)乳杆菌；或，革兰氏阴性细菌，包括(恶臭)假单胞菌、(真养)产碱杆菌；
优选的，所述真菌为酵母菌，包括酿酒酵母、解脂耶氏酵母。
9.如权利要求7或8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还可以包括一个或多个预先制备的线性载体。
10.权利要求1-6任一项所述的体内DNA片段组装方法或权利要求7-9任一项所述试剂盒在DNA合成中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111601141.5A CN114438073B (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种噬菌体酶辅助的体内dna片段组装方法、试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111601141.5A CN114438073B (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种噬菌体酶辅助的体内dna片段组装方法、试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114438073A true CN114438073A (zh) | 2022-05-06 |
| CN114438073B CN114438073B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=81363709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111601141.5A Active CN114438073B (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种噬菌体酶辅助的体内dna片段组装方法、试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114438073B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116355931A (zh) * | 2023-05-29 | 2023-06-30 | 北京因诺惟康医药科技有限公司 | 一种快速分子克隆方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180200342A1 (en) * | 2015-07-13 | 2018-07-19 | Institut Pasteur | Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair |
| CN109593783A (zh) * | 2017-09-30 | 2019-04-09 | 中国科学院动物研究所 | 一种体外产生环状核酸分子的方法 |
| CN110551797A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-12-10 | 临沂大学 | 基于t5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法 |
| CN110982834A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-10 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用 |
-
2021
- 2021-12-24 CN CN202111601141.5A patent/CN114438073B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180200342A1 (en) * | 2015-07-13 | 2018-07-19 | Institut Pasteur | Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair |
| CN109593783A (zh) * | 2017-09-30 | 2019-04-09 | 中国科学院动物研究所 | 一种体外产生环状核酸分子的方法 |
| CN110551797A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-12-10 | 临沂大学 | 基于t5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法 |
| CN110982834A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-10 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 苏春: "微生物次生代谢产物合成机制的相关研究方法", 吉林大学出版社, pages: 18 - 22 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116355931A (zh) * | 2023-05-29 | 2023-06-30 | 北京因诺惟康医药科技有限公司 | 一种快速分子克隆方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114438073B (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | Development of a RecE/T‐assisted CRISPR–Cas9 toolbox for Lactobacillus | |
| WO2018170614A1 (zh) | 基因组大片段直接克隆和dna多分子组装新技术 | |
| CN111607594B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法 | |
| CN110791468B (zh) | 一种分枝杆菌基因工程菌的构建方法与应用 | |
| CN102703424B (zh) | 一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法 | |
| CN111518806B (zh) | 巴氏醋酸杆菌启动子及其应用 | |
| CN108220219B (zh) | 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用 | |
| CN114438073B (zh) | 一种噬菌体酶辅助的体内dna片段组装方法、试剂盒及其应用 | |
| CN112375695A (zh) | 铜离子诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法 | |
| CN108841901A (zh) | 一种依赖t5核酸外切酶和peg8000完成dna组装的试剂盒及其应用 | |
| US11976270B2 (en) | Optimization of circular single stranded DNA using M13 phage | |
| JP2022524044A (ja) | 微生物のプール型ゲノム編集 | |
| Aliu et al. | CRISPR RNA‐guided integrase enables high‐efficiency targeted genome engineering in Agrobacterium tumefaciens | |
| CN109929788A (zh) | 一种具有ccdB负筛作用的菌株及其构建方法 | |
| WO2024041031A1 (zh) | 一种细菌连续进化系统、正交易错dna聚合酶及连续进化方法 | |
| CN110305892B (zh) | 一种验证CRISPR-Cas9系统介导目标基因插入产朊假丝酵母的可行性的方法 | |
| CN111004813A (zh) | 一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用 | |
| CN115948402A (zh) | 产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用 | |
| EP2548957B1 (en) | Method for producing kluyveromyces marxianus transformant | |
| Yang et al. | TraA is required for megaplasmid conjugation in Rhodococcus erythropolis AN12 | |
| CN110846331B (zh) | 一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用 | |
| Papagianni et al. | Cloning and functional expression of the mitochondrial alternative oxidase gene (aox1) of Aspergillus niger in Lactococcus lactis and its induction by oxidizing conditions | |
| CN115948450B (zh) | 一种莱茵衣藻叶绿体-酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体及其构建方法与应用 | |
| CN115976058B (zh) | 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用 | |
| CN111394349B (zh) | 一种圆红冬孢酵母rna聚合酶iii型启动子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |